автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Получение рекомбинантных штаммов Aspregillus awamori - продуцентов ферментов для эффективной конверсии полисахаридов зернового сырья при производстве спирта

На правах рукописи

Середа Анна Сергеевна

ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ

АБРИБаНШ А \VAMORI- ПРОДУЦЕНТОВ ФЕРМЕНТОВ ДЛЯ ЭФФЕКТИВНОЙ КОНВЕРСИИ ПОЛИСАХАРИДОВ ЗЕРНОВОГО СЫРЬЯ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ СПИРТА

Специальность 05.18.07 - Биотехнология пищевых продуктов и

биологически активных веществ (алкогольная и безалкогольная промышленность)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата технических наук

1 9 МАЙ 2011

Москва - 2011

4847220

Работа выполнена в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИПБТ Россельхозакадемии)

Научный руководитель: чл.- корр. Россельхозакадемии,

доктор технических наук, профессор Л.В. Римарева

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор

А.Ю. Кривова

кандидат биологических наук, доцент Е.Ф. Шаненко

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии

микроорганизмов РАН, г. Пущино

Защита состоится « » июня 2011 года в 11 часов на заседании объединенного Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций ДМ 006.025.01 по специальности 05.18.07 при ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт пивоваренной, безалкогольной и винодельческой промышленности» Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИПБиВП) по адресу: 119021, г. Москва, ул. Россолимо, д. 7.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУВНИИПБТ Россельхозакадемии.

Автореферат разослан ««$» апреля 2011 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета, //

доктор технических наук, профессора___—ус^Су/^ А.Л.Панасюк

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Основным направлением развития спиртовой промышленности является внедрение ресурсосберегающих технологий, основанных на повышении эффективности переработки зернового сырья, увеличении выхода целевого продукта и снижении образования отходов. По традиционной технологии при производстве спирта для разжижения и осахаривания крахмала зерна применяют ферментные препараты амилолитического действия: се-амилазы и глюкоамилазы. Рядом исследователей (Гернет М.В., Синициным А.П., Мазур Н.С., Оверченко М.Б., Римаревой JI.B., Родзевич В.И. и др.) было показано, что применение ферментов, катализирующих гидролиз некрахмальных полисахаридов и фитина зерна, способствует более эффективному использованию полимеров растительного сырья, повышению выхода спирта и интенсификации процессов брожения.

Одним из перспективных продуцентов гидролитических ферментов для осахаривания крахмалсодержащего сырья является штамм Aspergillus awamori М-2002, полученный на основе низкопродуктивного промышленного продуцента Aspergillus awamori БУД-Т2. Данный штамм синтезирует уникальный комплекс ферментов, в состав которого входят глюкоамилаза, га-амилаза и небольшое количество ферментов целлюлолитического и гемицеллюлолитического действия. Тем не менее, промышленный выпуск ферментных препаратов на основе данного штамма нерентабелен - в первую очередь, из-за нестабильности продуцента.

В связи с этим, актуальной задачей является увеличение уровня стабильной экспрессии глюкоамилазы штамма A. awamori М-2002 и создание на его основе рекомбинантных штаммов - продуцентов ферментов, гидролизующих некрахмальные полисахариды (НПС) и фитин зерна. Выполнение этой задачи позволит получить конкурентоспособные ферментные препараты для эффективной конверсии зернового сырья, снизит их себестоимость и повысит рентабельность производства ферментных препаратов.

Цели и задачи исследования. Целью работы является получение рекомбинантных штаммов - продуцентов ферментов для эффективной конверсии зернового сырья на основе промышленного штамма Aspergillus awamori М - 2002 (ВКМ F-3771D).

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

• Получить стабильный реципиентный штамм для проведения дальнейших генно-инженерных работ по повышению его биосинтетической способности.

• Создать универсальную систему экспрессии генов.

• Получить высокоэффективные рекомбинантные штаммы с заданными свойствами и разработать методики поддержания полученных рекомбинантных штаммов.

• На основе полученных рекомбинантных штаммов наработать опытные образцы ферментных препаратов (ФП).

• Изучить компонентный и биохимический состав полученных ФП и их гидролитическую способность по отношению к полисахаридам зернового сырья.

• Исследовать эффективность применения новых ФП в спиртовом производстве.

Научная новизна. Методами селекции с применением индуцированного мутагенеза получен новый стабильный штамм А. <татоп 6804. Впервые создана универсальная система экспрессии генов для штамма А. аматоп 6804 на основе промотора и терминатора гена глюкоамилазы А. статоп 6804. С использованием этой системы получены новые рекомбинантные штаммы, обладающие повышенной биосинтетической способностью по отношению к ферментам, необходимым для эффективной конверсии зернового сырья. Впервые созданы рекомбинантные штаммы, способные наряду с глюкоамилазой экспрессировать ферменты, катализирующие гидролиз некрахмальных полисахаридов и фитина зерна. На основе установленных закономерностей выявлена возможность направленной регуляции биосинтеза отдельных ферментов у штаммов А. статоп при использовании в качестве индукторов продуктов расщепления полимерных субстратов (например, мальтодекстрина). Установлена взаимосвязь между составом ферментативных комплексов, синтезируемых рекомбинантными штаммами А.статоп, их гидролитической способностью по отношению к полисахаридам зернового сырья и эффективностью сбраживания зернового сусла.

Практическая_значимость_работы. Получены новые

высокоэффективные рекомбинантные штаммы А.сматоп атуК-Т-19, А.сматоп Т-14, А.ам'атоп Ху1-Т-15, А.акатоп Ев-73 и А.статоп РЬу-7 - продуценты глюкоамнлазы, кснланазы, эндоглюканазы и фитазы, биосинтетическая способность которых превышает уровень активности исходного промышленного штамма по глюкоамилазе на 30%, по ксиланазе - в 3 раза, по Р-глюканазе - в 4-6 раз, по фитазе в 300 раз. Штаммы А.статоп атуИ-Т-19 и А.аматоп Ху1-Т-15 депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ ¥-Л211и, Р-42780). Разработаны паспорта на штаммы, составлены «Методические рекомендации по поддержанию рекомбинантных штаммов и ведению посевного материала».

Проведены производственные испытания полученных рекомбинантных штаммов А. статоп в условиях ОАО «Спиртовый комбинат» г. Мариинск. Подтверждено, что практическая реализация результатов исследований позволяет получать на основе новых рекомбинантных штаммов А. стхипоп высокоактивные комплексные ферментные препараты без изменения основного технологического процесса, обеспечивая повышение выхода целевых ферментов. Производство ферментных препаратов на основе новых высокоактивных рекомбинантных штаммов А. акатоп повысит экономические показатели за счет сокращения количества ферментаций и расхода фермента на осахаривание. Разработаны «Технологическая инструкция» и «Технические условия» на новые ферментные препараты.

Показана высокая эффективность использования комплексных ферментных препаратов глюкоамнлазы, полученных на основе высокоактивных рекомбинантных штаммов, в спиртовом производстве. Их применение позволило повысить степень конверсии полисахаридов зернового сырья с образованием дополнительного количества сбраживаемых углеводов, исключить введение дополнительных источников гемицеллюлаз, улучшить реологические свойства зернового сусла и снизить его вязкость в 1,3 раза, интенсифицировать процесс брожения и повысить выход спирта на 1,2 %. Экономическая эффективность от производства 100 т комплексного ферментного препарата глюкоамнлазы на основе новых рекомбинантных штаммов составит порядка 15-20 млн. руб.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: International Conference «BIOCATALYSIS 2009: Fundamentals&Applications» (Arkhangelsk, 2009), Пятый Московский Международный Конгресс «Биотехнология: Состояние и перспективы развития» (Москва, 2009), Научно-практическая конференция «Современные биотехнологии переработки сельскохозяйственного сырья и вторичных ресурсов» (Углич, 2009). Международная научная конференция студентов и молодых ученых «Экологически безопасные ресурсосберегающие технологии и средств переработки сельскохозяйственного сырья и производства продуктов питания» (Москва, 2009), Международная научно-практическая конференция «Инновационные технологии в пищевой промышленности» (Минск, 2009), Международный симпозиум "Перспективные биокатализаторы для перерабатывающих отраслей АПК» (Москва, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (262 источника). Диссертация содержит 210 страниц печатного текста, включает 32 рисунка и 48 таблиц.

2. Экспериментальная часть

2.1. Материалы и методы исследования

Исследования проводили в лабораторных условиях на базе ГНУ ВНИИПБТ Россельхозакадемии, ИНБИ им. А.Н.Баха РАН, кафедры химической энзимологии МГУ им. М.В. Ломоносова, НИФХИ им. Л.Я.Карпова, в производственных условиях ОАО «Спиртовый комбинат», г. Мариинск.

Объектом исследования являлся штамм A. awamori М-2002 (ВКМ, F-3771D). В работе использовали общепринятые микробиологические, биохимические и физико-химические методы исследования, а также популярные методы генной инженерии, в т.ч. ПЦР, инверсный ПЦР, сайт-независимое лигирование.

Определение глюкоамилазной и амилолитической активности проводили в соответствии с ГОСТ 20264.4-89. Определение ксиланазной, ß-глюканазной и эндоглюканазной активности основывали на измерении скорости образования восстанавливающих Сахаров методом Шомоди-Нельсона при гидролизе: ксилана из древесины березы, ß-глюкана ячменя и Na-соли карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), соответственно (Синицын А.П. и др., 1995, Полыгалина и др., 2003). Для определения фитазной активности использовали метод, основанный на измерении скорости образования свободных фосфат-ионов (Pj) при гидролизе фитата Na из зерен риса с использованием аммоний-молибденового реагента (13 мМ FeS04-7H20, 8,1 мМ (NH^iVU^Oi^l 120 и 0,533 М II2SO4). За единицу фитазной активности принимали такое количество фермента, которое приводит к образованию 1 мкмоль Pj из 1,4 мМ раствора фитата Na за 1 мин при 37°С и pH 5,0 (Синицына O.A. и др., 2006).

Содержание растворимого белка определяли методом Лоури.

Статистическую обработку результатов, полученных не менее чем в 3-х повторностях, проводили по программе Excel Microsoft Word.

2.2 Результаты исследований и их обсуждение

2.2.1 Получение стабильного штамма A. awamori 6804 методом селекции с применением ионизирующего гамма-излучения

Работа по получению стабильного штамма Л. awamori 6804 проводилась с использованием кобальтового источника ионизирующего у-излучения в НИФХИ им. Карпова. В качестве исходного штамма в селекционной работе был использован нестабильный Л. awamori М-2002, уровень его глюкоамилазной активности колебался от 350 до 620 ед/см3 культуральной жидкости (ЮК). Для выделения наиболее активных вариантов после у-облучения использовали следующие схемы селекции:

- рассев вегетативных клеток из культуральной жидкости в процессе культивирования продуцента на селективные среды, обогащенные селектирующими добавками;

- глубинный рассев спор продуцента на бедные селективные среды с последующим наслаиванием на проросшие споры среды Чапека.

С использованием указанных схем селекции был выбран наиболее стабильный штамм A. awamori 6804, который при глубинной ферментации

обеспечивал активность глюкоамилазы 580±20 ед/см3 КЖ (рис.1). Отобранный штамм проверен на стабильность продукции глюкоамилазы в нескольких генерациях и в отличие от штамма А. ам/аупоп М-2002 сохранил уровень активности целевого фермента в 5 генерациях, что свидетельствует о высокой стабильности данного штамма по признаку биосинтеза глюкоамилазы (рис.1).

Ш 1-ый пассаж □ 2-ой пассаж □ 3-ий пассаж £3 4-ый пассаж ® 5-ый пассаж

A. awamori М-2002

Л. awamori 6804 Кобальтовый мутант

Рисунок I - Сравнение активности глюкоамилазы штаммов А.сматоп в процессе хранения при пересевах

Штамм A. awamori 6804 использовали для получения рекомбинантных штаммов - продуцентов глюкоамилазы и сопутствующих ферментов, применяя стандартные методы генной инженерии.

2.2.2 Получение ауксогрофных мутантов штамма A. awamori 6804, обладающих признаками niaD-

Для работы с грибами рода Aspergillus широко используется трансформационная система метаболического пути ассимиляции азота. Метод основан на получении мутантов niaD", дефектных по ферменту нитратредуктазе, и, вследствие этого, неспособных расти на минимальной среде, где в качестве единственного источника азота используется нитрат натрия. Вторым признаком, отличающим niaD" мутанты, является их устойчивость к хлорату натрия. При этом должна сохраняться способность к биосинтезу всех секретируемых ферментов как у исходного штамма. Опыты по получению niaD" мутантов штамма A. awamori 6804 выполнялись в соответствии со следующей схемой:

Рисунок 2 - Схема получения шаО~ мутантов А. аматоп 6804

Из популяции обработанных клонов было выделено 2 варианта с фенотипом таО~ (табл. 1). Полученные штаммы после хранения в течение двух месяцев были проверены на реверсию к прототрофному типу и на способность к биосинтезу глюкоамилазы при глубинном культивировании (табл. 1).

Таблица 1 - Глюкоамилазная активность в КЖ шаБ~ мутантов А. ататоп

Штаммы ГлА, ед/см3

А. статоп 6804 контроль 550

А. тштог1 6804-19 {тай-) 600

А. ам/атоп 6804-27 (таИ-) 520

В качестве реципиента выбран клон А.аматоп 6804-19 (ша£Г), при ферментации которого на стандартной среде получена стабильная глюкоамилазная активность до 600 ед/см3 КЖ, что позволяет использовать этот штамм как реципиент для получения высокоэффективных штаммов продуцентов глюкоамилазы и НПС-гидролизующих ферментов методом плазмидной трансформации.

2.2.3 Создание экспрессионной системы

Ключевую роль в регуляции синтеза ферментов у грибов играет белок активатор транскрипции, который взаимодействуя со специфическими нуклеотидными последовательностями в промоторных областях регулируемых генов вблизи старта транскрипции, способствует ее инициации, обеспечивая увеличение синтеза целевых ферментов. Была сконструирована плазмида рАШ2.4»у'Я, несущая ген амилолитического активатора атуК А. т%ег (рис. 3).

ЕсоМ

Рисунок 3 - Схема плазмиды рА№2ату11, несущей ген амилолитического активатора атуЯ А. niger

Наиболее продуктивным подходом к увеличению экспрессии целевых белков является создание экспрессионных систем на основе регуляторных элементов генов мажорных белков. Для создания экспрессионных конструкций были амгатифицированы промотор и терминатор гена glaA, кодирующего глюкоамилазу А.ажатоп 6804, и получена плазмида рРгОА-ОАЛиад, содержащая ген глюкоамилазы (рис. 4). На основе нуклеотидных последовательностей, соответствующих регуляторным областям гена глюкоамилазы, сформирован вектор рОА, обеспечивающий встраивание целевого гена в хромосому А.ау^атоп по принципу гомологичной рекомбинации (рис. 4). На основе вектора рвА получены экспрессионные плазмиды, обеспечивающие экспрессию гетерологичных ксиланазы Р. сапехсет, эндоглюканазы I Т. гееяег и фитазы А. niger (рис. 4).

Л'!Г»*р«и«Н ачйью №: аШт

¡Ш<1 (ИГ/

ВмШРЩ

ОА

1_<г«яг-иС ■ ДтрЙ)

МаММШ)

Прямйуор О А

Уррег-ис

Г«« Сй фа дм») (я А.т&юп

"идею-до

»м&тзрСА ДО} х:

Рисунок 4 - Схема получения плазмид для обеспечения гетерологичной экспрессии в рекомбинантном штамме А.сматоп 6804

2.2.4 Создание трансформационной системы

Процесс трансформации реципиентного штамма плазмидой, несущей целевой ген, заключается во встраивании в клетку экзогенной ДНК, вызывающей наследуемые изменения. Поэтому необходимым шагом в отработке методики трансформации грибов является подбор условий для перевода клеток реципиентного штамма в компетентное состояние, в котором они способны поглощать ДНК из окружающей среды. Традиционно для получения компетентных клеток используется ферментативный гидролиз клеточных стенок, приводящий к удалению физического барьера на пути проникновения молекул ДНК в клетку.

В результате проведенных исследований были подобраны такие параметры, как состав жидкой минимальной среды для получения мицелия с определенными свойствами, продолжительность культивирования на данной среде и условия лизиса клеточной стенки (табл.2).

Таблица 2 - Условия получения компетентных клеток штамма А. статоп 6084-19№аБ"

Штамм Среда для культивирования Время роста, ч Температура роста, °С Время лизиса, ч Расход ли-зирующего фермента, мг/см3

А. ам>атоп 6084-19 №аО" Чапек - Доке + 2% глюкозы 16 30 3 5

2.2.5 Получение высокоэффективных рекомбинантных штаммов А.ап'атоп - продуцентов глюкоамилазы

Для получения высокоэффективных рекомбинантных штаммов продуцентов глюкоамилазы были проведены трансформации штамма А.статоп 6804 шаР" плазмидами, несущими ген амююлитического активатора и ген глюкоамилазы. В результате проведенных экспериментов была создана коллекция рекомбинантных штаммов с увеличенной продукцией глюкоамилазы (рис. 5).

A.avvamori A.awamori A.awamori A.awamori A.awamori A.awamori A.awamori M-2002 6804 6804-19- amyR-T-19 T-64-niaD- T-29 T-14 nial)-

Рисунок 5 - Активность глюкоамилазы в рекомбинантных штаммах A.awamori

Ш Min уровень ГлА штамма

Мах уровень ГлА нггамма

После трансформации стабильного штамма A.awamori 6804 niaD' плазмидой pAN52öw>'R и плазмидой pPrGA-GA4wa отобраны трансформанты A.awamori £ifl7j;R-T-19 и A.awamori Т-14 с уровнем активности глюкоамилазы, превышающим контрольный штамм примерно на 30%.

Таким образом, увеличение глюкоамилазной активности, вызванное, видимо, умножением числа копий гена, кодирующего глюкоамилазу, не превышало эффект от увеличения уровня белка активатора гена amyR. Лучший трансформант, полученный в экспериментах с включением гена активатора, был подвергнут вначале мутационному превращению в ауксотрофный штамм A.awamori Т-64 niaD' и далее трансформирован плазмидой pPrGA-GA4wa. В результате получен штамм A.awamori Т-29. Выполнение этих экспериментов было осуществлено для проверки результатов по котрансформации, в которых вероятность получения желаемого эффекта от включения одновременно двух разных плазмид была заведомо меньше. Как видно из данных, увеличения глюкоамилазной активности в результате проведенных процедур не наблюдали.

Результаты проведенных серий экспериментов по трансформации различных вариантов производственного штамма A. awamori М-2002 генами amyR и glaA глюкоамилазы позволяют заключить, что, вероятно, увеличение продуктивности на 30% является пределом, допускаемым механизмом регуляции амилолитических генов в грибах рода Aspergillus при включении добавочных копий этих генов.

2.2.6 Получение высокоэффективных штаммов А. аюатоп -продуцентов ферментов, гидролизующих некрахмальные полисахариды и фитин

Используя аналогичный подход, в результате проведенных трансформаций реципиентного штамма А. статоп 6804-19 шаБ- плазмидами, несущими гетерологичные гены ксиланазы, эндоглюканазы и фитазы, получены перспективные рекомбинантные штаммы с увеличенной продукцией целевых ферментов (табл. 3).

Уровень экспрессии секретируемой ксиланазы, эндоглюканазы и (5-глюканазы повысился примерно в 3, 6 и 8 раз, соответственно. Максимальный эффект был получен при трансформации штамма плазмидой рвЛ-РНуЛ — фитазная активность штамма была увеличена в 300 раз.

Таблица 3 - Сводные данные по активности глюкоамилазы и целевых ферментов в КЖ рекомбинантных штаммов А. акатоп

Активность, ед/см3

Штамм Белок, мг/см3 Глюко-амилаза Ксила-наза кмц- аза Р- Глюка-наза Фитаза

А. статоп 6804 25 460 35 17 10 1,1

А. ач'атоп Ху 1-15 22 390 105 18 10 нет

А.аттоп Ху1-21 20 394 104 19 9 нет

А.статоп ЕС1-46 22 283 32 120 82 нет

А.статоп ЕС1-47 23 280 33 103 65 нет

А.амгатоп Е01-73 23 290 34 104 76 нет

А.ач'атоп РЬу-7 22 407 36 18 8 347

А.статоп РЬу-39 21 396 37 17 9 241

2.2.7 Компонентный состав комплексных ферментных препаратов, полученных на основе рекомбинантных штаммов Ампатоп

Целесообразным являлось определение компонентного состава секретируемого ферментного комплекса новыми рекомбинантными штаммами. Для этого проведено аналитическое фракционирование полученных экспериментальных образцов концентрированных ферментных препаратов (рис. 6).

щ «легкая» форма глюкоамилазы д «тяжелая» форма глюкоамилазы (80 кДа) (140 кДа)

|~] ксиланаза д эндоглюканаза щ фитаза г^ другие белки

А.ап'атоп ЕС1-46

А.аи>атог'1 РЬу-7

А. иштоп 6804

15%

46%

А.аштоп ХуМ 5

Рисунок 6 - Содержание индивидуальных ферментов в ферментных препаратах

На хроматограммах во всех случаях наблюдали два основных белковых пика: первый соответствовал «легкой» форме глюкоамилазы (80 кДа), второй -ее «тяжелой» форме (140 кДа). В контрольном препарате, полученном на основе штамма А. сматоп 6804, преобладающей являлась "тяжелая" форма глюкоамилазы - ее содержание составило 39% от общего пула белка, "легкой" формы - 32%. Отметим, что контрольный препарат характеризовался наличием «собственной» ксиланазы - ее содержание составило 0,15% от общего пула белка.

При фракционировании препарата А.сматоп Ху1-15 содержание общей ксиланазной фракции составляло 3 % от общего пула белка. Для препарата А.а\уатоп ЕИ-46 содержание рекомбинантной эндоглюканазы Т. геевег составило 14% от общего пула белка. При фракционировании препарата А.ам>атоп РЬу-7 содержание рекомбинантной фитазы^. я/^ег составило 2,4% от общего пула белка. Ни в одной фракции контрольного препарата А. ст/атоп 6804 не было обнаружено заметной фитазной активности. Содержание «легкой» и «тяжелой» формы глюкоамилазы не изменялось.

2.2.8 Поддержание коллекции рекомбинатных штаммов А.ауттоп

Коллекцию полученных высокоактивных рекомбинатных штаммов А.статоп - продуцентов глюкоамилазы и сопутствующих ферментов периодически тестировали на способность к продукции целевых ферментов при глубинном культивировании в течение 9 суток. В качестве контроля использовали штамм А. аматоп 6804. Полученные данные по стабильности продукции целевых ферментов в процессе хранения рекомбинантных штаммов А. стагпоп в нескольких генерациях были статистически обработаны. Результаты проверки стабильности биосинтеза глюкоамилазы показали, что штаммы сохраняют высокий уровень активности глюкоамилазы в течение полугода при хранении на скошенном агаре при пяти пересевах (рис.7).

Результаты проверки стабильности рекомбинантных штаммов продуцентов ферментов, катализирующих гидролиз НПС и фитина, также показали, что штаммы стабильны и сохраняют высокий уровень активности целевых ферментов в течение полугода при четырех пересевах (рис. 8) при глубинном культивировании в течение 7 суток.

Таким образом, все полученные методом плазмидной трансформации рекомбинатные штаммы А.сшатоп сохраняли высокий уровень активности целевых ферментов, что говорит о стабильности интегративной встройки ДНК в хромосому гриба, и целесообразности их применения в спиртовой промышленности.

@ 1-ый пассаж ■ 2-ой пассаж □ 3-ий пассаж Ш 4-ый пассаж Ш 5-ый пассаж

900

А.а\уатоп Л.л\\атоп А.аууатоп Л.алуатоп

6804 Т-14 Т-29 ашуЯТ-19

Рисунок 7 - Проверка стабильности биосинтеза глюкоамилазы высоактивными рекомбинантными штаммами А. ам>атоп - продуцентами глюкоамилазы в

процессе хранения

О

В s

е2 О

а "а

5 щ <

И Эндоглюканаза □ Ксиланаза □ Глюкоамилаза

□ Ксиланаза □ Глюкоамилаза

1-ый 2-ой 3-ий 4-ий

Пассажи

A. arvamori 6804 Ш Фитаза □ Глюкоамилаза

1-ый 2-ой 3-ий 4-ий

A. awamori Xvl-15 Пассажи

0 Ксиланаза Ш Эндоглюканаза

□ Глюкоамилаза

1-ый 2-ой 3-ий 4-ий 1-ый 2-ой 3-ий 4-ий

а • » I п Пассажи * • 1?/~ч т Пассажи

A. awamori Fhy-7 A. awamori EGI-73

Рисунок 8 - Проверка стабильности биосинтеза целевых ферментов у рекомбинантных штаммов A.awamori - продуцентов ферментов для гидролиза НПС и фитина в процессе хранения

2.2.9 Биоконверсия некрахмальиых полисахаридов зернового сусла комплексными ферментными препаратами, полученными на основе рекомбинантных штаммов Aspergillus awamori

Комплексные ферментные препараты получали при глубинном культивировании высокоактивных рекомбинантных штаммов A. awamori на производственной питательной среде (24% пшеничной муки) с последующим выделением ФП методом осаждения. Ферментные препараты использовались в спиртовом производстве на стадии осахаривания крахмалсодержащего сырья как источники глюкоамилазы и ферментов, катализирующих гидролиз некрахмальных полисахаридов.

Сравнительный анализ уровня активности опытных образцов ферментных препаратов показывает, что практически все исследуемые препараты проявляют более высокий уровень активности по основному ферменту - глюкоамилазе и

содержат комплекс ферментов ксиланазного, глюканазного и целлюлазного действия (табл. 4).

Таблица 4 - Сравнительная характеристика уровня активности целевых ферментов в исследуемых ферментных препаратах

Ферментный препарат Ферментативная активность, ед/г (см3)

ГлА КсА КМЦ Р-ГкС

A. awamori 6804 7353 308 131 148

A. awamori Т-14 9041 228 104 215

A. awamori Т-29 11442 309 107 216

A. awamori Xyl-15 9641 808 122 286

A. awamori EGI-73 3766 375 951 350

Глюкаваморин Г18х 5000 нет нет нет

Брюзайм BGX нет 3500 1500 900

В связи с этим, применение новых комплексных ФП глюкоамилазы перспективнее, поскольку существующие промышленные ФП (Глюкаваморин Г18х) требуют дополнительного введения ФП целлюлаз и гемицеллюлаз. Например, при производстве спирта широко используется ФП Брюзайм BGX (Dyadic International). Кроме того; при использовании новых высокоактивных комплексных препаратов из рекомбинантных штаммов снижается и общий расход ФП, т.к. их дозируют по глюкоамилазной активности.

2.2.9.1 Гидролитическая способность ФП рекомбинантных штаммов A.awantori по отношению к полисахаридам зернового сырья

Различные виды зерна кроме крахмала содержат некрахмальные полисахариды - ксиланы, р-глюканы, целлюлозу, причем содержание НПС может различаться в зависимости от вида сырья (табл.5).

Таблица 5 - Содержание полисахаридов в основных видах зерна

Полисахариды Содержание компонентов, % СВ

кукуруза ячмень рожь пшеница

Крахмал 65-72 52-64 55-65 67-70

Арабиноксилан 4,0-5,0 4,0-5,0 8,7-10,0 6,0-6,6

Р-глюкан 0 5,7-7,0 2,2-2,8 0,7-0,8

Целлюлоза 2,6 6,3 3,0 2,5-3,0

Ферментные препараты - источники ксиланаз и Р-глюканаз эффективны при переработке ржи, тогда как для ячменя целесообразно применять

ферментные препараты, содержащие наряду с (3-глюканазной и ксиланазной активностью высокий уровень целлюлолитических ферментов.

Исследовали гидролитическую способность комплексных ФП глюкоамилазы по отношению к полисахаридам пшеницы, кукурузы, ржи и ячменя в процессе осахаривания зернового сусла. При одинаковом расходе глюкоамилазы - 6 ед/г крахмала, доза расхода ферментов, гидролизующих НПС, варьировалась (табл. 6). В качестве контроля использовали ферментный препарат исходного штамма А.ам'атоп 6804.

Таблица 6 - Соотношение целевых активностей в используемых ФП

Ферментный препарат Дозировка фермента, ед/г

Глюкоамилаза Ксиланаза КМЦ-аза (З-Глюканаза

А. алттоп 6804 6 0,25 од 0,12

А. ач?атоп Т-14 6 0,15 0,07 0,14

А. статоп Т-29 6 0,16 0,06 0,12

А. акатоп Ху1-15 6 0,5 0,08 0,18

А. ан'атоп Е01-73 6 0,6 1,5 0,56

Как видно из табл. 6 при одинаковой вносимой дозировке глюкоамилазы наибольшее содержание ксиланазы было отмечено в ферментных препаратах А. статоп Ху 1-15 и А. статоп Е01-73, что позволяет наиболее эффективно использовать эти препараты при переработке ржи и пшеницы. В ФП А.статоп Е01-73 содержание КМЦ-азы увеличено в 15 раз, а [3-глюканазы в 5 раз, что позволяет применять этот препарат при осахаривании ячменного сусла. ФП А. статоп Т-14 и А. аштит Т-29 с повышенным содержанием глюкоамилазы целесообразнее использовать для осахаривания пшеничного и кукурузного сусла.

Результаты исследования степени осахаривания зернового сусла подтверждают эффективность использования новых комплексных ФП глюкоамилазы (рис. 9). Осахаренное сусло исследуемых субстратов содержало, в основном, глюкозу и мальтозу. Причем, концентрация глюкозы в опытных пробах при осахаривании ферментными препаратами трансформантов была в 1,5 раза выше, чем при осахаривании ФП исходного штамма А.статоп 6804. Данный эффект наблюдается за счет гидролиза НПС.

Ячмень Н Глюкоза, г/мЗ Ш Мальтоза, г/мЗ

200 150 100 50

о

6804 Т-14 Т-29 Xyl-15 EGI-73

Рожь

250 200 150 100 50 О

I Глюкоза, г/мЗ ! Мальтоза, г/мЗ

6804 Т-14 Т-29 ХуН 5 EGI-73

Пшеница ® Глюкоза, г/мЗ Кукуруза И Глюкоза, г/мЗ

■ Мальтоза, г/мЗ * ' ' И Мальтоза, г/мЗ

250 0

6804 Т-14 Т-29 ХуМ5 ЕС1-73 Ш4 Т-14 Т-29 ХуМ5 ЕС1-73

250 200 150 100 -50 0

Рисунок 9 - Состав продуктов гидролиза ржаного, кукурузного, ячменного и пшеничного замесов под действием комплексных ФП рекомбинантных штаммов А.статоп на стадии осахаривания

2.2.9.2 Использование комплексных ферментных препаратов рекомбинантных штаммов А. ататоп при сбраживании ржаного сусла

Подготовку ржаного сусла осуществляли по механико-ферментативной схеме. Комплексные ФП применяли на стадии осахаривания, дозируя их по глюкоамилазе из расчета 6 ед. ГлА/г крахмала. В контрольном варианте в качестве источника глюкоамилазы использовали ФП Глюкаваморин Г18х, в качестве ФП - источника ферментов для гидролиза НПС - импортный препарат Брюзайм ВвХ, который дозировали по ксиланазе из расчета 0,25 ед. КсА/г крахмала.

Увеличение доли гемицеллюлаз в составе комплекса ФП, полученных на основе рекомбинантных штаммов А. сматоп Ху!-15 и А. статоп ЕС1-73, способствовало улучшению реологических свойств сусла, вязкость которого снижалась в 1,2-1,3 раза по сравнению с действием препарата, полученного на основе родительского штамма А.аматоп 6804, и увеличению выхода спирта на 1,2% (рис.10).

Гидролитическая способность экспериментальных образцов ферментных препаратов в сравнении с промышленными препаратами также показала

преимущество их использования. Применение препаратов А.сматоп ЕС1-73 и А.сматоп Ху1-15 обеспечивало не только снижение вязкости сусла, но и повышение выхода спирта на 0,7-1,2% по сравнению с показателями бражки, где использовали ФП Брюзайм ВОХ как один из лучших препаратов импортного производства.

120 f too | 80 | 60

2« S= 20

о

Рисунок 10 - Влияние ферментных препаратов на вязкость ржаного сусла и на

выход спирта

Таким образом, применение комплексных ферментных препаратов глюкоамилазы, полученных на основе высокоактивных рекомбинантных штаммов A.awamori, на стадии осахаривания зернового сусла позволяет исключить использование ФП - источников ферментов гемицеллюлазного и целлюлазного действия, осуществив импортозамещение.

2.2.10 Технологии получения и применения новых комплексных ферментных препаратов глюкоамилазы в спиртовом производстве

Проведены производственные испытания по получению комплексных ферментных препаратов глюкоамилазы на основе новых рекомбинантных штаммов Aspergillus awamori amyR-T-19 и Aspergillus awamori Xyl-T-15 -продуцентов глюкоамилазы и ксиланазы в условиях ферментного цеха «Спиртового комбината» (г. Мариинск) в ферментерах объемом 16 м3.

Максимальный уровень активности глюкоамилазы в культуральной жидкости при культивировании рекомбинантного штамма A. awamori amyR-T-

■ Вязкость И РВ □ Концентрация спирта

1 1 и И * [J шл --' ■¡¡¡ян г pi 1 1 1 1 1 « _iiii

A.awamori Контроль A.awamori A.awamori A.awamori A.awamori

6804 Глюкаваморин T-14 Т-29 Xyl-15 EGI-73 Г18Х + Брюзайм

19 был достигнут на 216 ч роста и составил 685 - 730 ед/см3 КЖ, что в 3 раза выше уровня глюкоамилазной активности промышленного штамма A. awamori ВУДТ-2. При культивировании штамма A. awamori Xyl-T-15 - продуцента комплекса ферментов, активность глюкоамилазы составила 480-520 ед/см3, что в 2 раза превышало активность штамма A. awamori ВУДТ-2, а уровень синтеза ксиланазы увеличился до 180-230 ед/см3 (в 8 - 10 раз выше контроля).

Полученные результаты свидетельствуют об успешном внедрении технологии производства ферментных препаратов глюкоамилазы и ксиланазы на основе рекомбинантных штаммов в промышленных условиях.

Проведены производственные испытания по применению полученного высокоактивного ферментного препарата глюкоамилазы - Глюкаваморина Гх (710 ед. ГлА/см3) на основе штамма A. awamori amyR-T-19 на стадии осахаривания пшенично-ржаного и пшеничного сусла. Технологическая схема производства спирта осуществлялась согласно «Производственно-технологического регламента получения спирта из крахмалосодержащего сырья» ОАО «Спиртовый комбинат» ПТР 10-40107-04. Применение ФП глюкоамилазы - Глюкаваморина Гх на основе штамма A.awamori amyR-T-19 позволило получить сусло с высокой концентрацией сухих веществ (21-22%) и сократить расход ферментных препаратов на осахаривание сырья в 2-3 раза (по товарной продукции) по сравнению с ранее применяемым ФП глюкоамилазы с активностью 200-250 ед/см3. В результате сбраживания полученного сусла к 58-60 ч брожения достигнуты нормативные показатели бражки: несброженные углеводы - 0,37-0,43 г/100 см3, концентрация спирта - 11,4-11,5 %об., кислотность бражки - 0,38 град.

Таким образом, проведенные производственные испытания подтвердили результаты лабораторных исследований и эффективность разработанных технологий.

2.2.11 Сравнение технологии применения новых рекомбинантных штаммов A.awamori с существующими технологиями

Основные разработанные способы повышения эффективности технологии производства и применения новых ферментных препаратов на основе высокоактивных рекомбинантных штаммов A. awamori по сравнению с существующими технологиями представлены в таблице 7.

Таблица 7 - Технологии применения рекомбинантных штаммов A.awamori

Штамм Достигнутый результат при получении ФП Достигнутый результат и рекомендации по применению ФП в спиртовом производстве

Существующая технология

A. awamori ВУДТ-2 Исходный промышленный штамм -продуцент глюкоамилазы Технология глубинного культивирования позволяет получать ФП с активностью глюкоамилазы до 250 сд/см3 Большой расход фермента на осахаривание, требует дополнительного использования ФП -источников целлюлаз и гемицеллюлаз

Разработанные технологии

//. awamori amyR-T-19 и A. awamori Т-29 Новые рекомбинантные штаммы -продуценты глюкоамилазы Технология глубинного культивирования позволяет получать ФП с активностью глюкоамилазы до 700 ед/см3, что превышает активность исходного штамма в 2,8 раза, без изменения основного технологического процесса. Сокращение количество ферментаций продуцента Сокращение расхода фермента на осахаривание в 2-3 раза; повышение степени осахаривания сусла, получение сусла с высокой концентрацией сухих веществ Рекомендуется для биоконверсии полимеров пшеничного сырья в производстве спирта

A. awamori Т-14 Новый рекомбинантный штамм -продуцент гтокоамилазы Технология глубинного культивирования позволяет получать ФП с активностью глюкоамилазы до 800 ед/см3, что превышает активность исходного штамма в 3,2 раза, без изменения основного технологического процесса. Сокращение количества ферментаций продуцента

A. awamori Xyl-lS Новый рекомбинантный штамм -продуцент глюкоамилазы и ксилаиазы Технология глубинного культивирования позволяет получать комплексные ФП с активностью глюкоамилазы и ксиланазы до 500 и 200 ед/см3, соответственно, что в 2 раза и в 9 раз превышает уровень соответствующих активностей исходного штамма, без изменения основного технологического процесса Повышение степени осахаривания сусла, снижение вязкости, гидролиз ксилана, увеличение выхода спирта, возможность приготовления сусла с высоким содержанием сухих веществ, сокращение образование барды, снижение технологических потерь сырья. Рекомендуется для биоконверсии полимеров ржаного и пшеничного сырья в производстве спирта

Продолжение таблицы 7

А. аюатоп ЕС1-73 Новый рекомбинантный штамм -продуцент глюкоамилазы и эпдоглюканазы Технология глубинного культивирования позволяет получать комплексные ФП с активностью глюкоамилазы, КМЦ и р-глюканазы 400,100 и 80 ед/см3, соответственно, что в 1,6; 7 и в 8 раз превышает уровень, соответствующих активностей исходного штамма, без изменения основного технологического процесса Повышение степени осахаривания сусла, снижение вязкости, гидролиз целлюлозы и гемицеллюлозы, увеличение выхода спирта, возможность приготовления сусла с высоким содержанием сухих веществ, сокращение образование барды, снижение технологических потерь сырья. Рекомендуется для биоконверсии полимеров ржаного и ячменного сырья в производстве спирта

А. ап'атоп РЬу-7 Новый рекомбинантный штамм -продуцент глюкоамилазы и фитазы Технология глубинного культивирования позволяет получать комплексные ФП с активностью глюкоамилазы и фитазы 600 и 350 ед/см3, соответственно, что в 2,4 и 350 раз превышает соответствующих активностей исходного штамма, без изменения основного технологического процесса Интенсификация процессов брожения за счет превращения фосфора в доступную для дрожжей форму и высвобождения микроэлементов; продукт-гидролиза фитина - мио-инозит способствует росту дрожжевых клеток. Рекомендуется для повышения эффективности спиртового брожения

Выводы

1. Комбинацией методов селекции и индуцированного мутагенеза получен стабильный мутантный штамм А.ажатоп 6804 с уровнем активности глюкоамилазы в культуральной жидкости 580±20 ед/см3.

2. На основе штамма А.амгатоп 6804 получен ауксотрофный штамм-реципиент А. аматоп 6804-19 для проведения плазмидной трансформации с целью получения рекомбинантных штаммов - продуцентов глюкоамилазы и НПС-гидролизующих ферментов.

3. Разработана методика протопластирования и трансформации штамма-реципиента А.статоп 6804-19. Создана универсальная система экспрессии генов для А.статоп на основе промотора и терминатора гена глюкоамилазы &аА) А.тттоп 6804.

4. Методами генной инженерии получены рекомбинантные штаммы, обладающие повышенной активностью целевых ферментов, необходимых для эффективной конверсии полисахаридов зернового сырья:

А.т/атоп ату11-Т-19, А.аыатоп Т-14 и А.сюатоп Т-29 с увеличенной продукцией глюкоамилазы на 30 %;

А.а\\>атоп Ху1-15 и А.см'атоп Ху1-21, ксиланазная активность которых увеличена в 3 раза по сравнению с исходным штаммом;

А.сматоп ГО1-46 и А.сматоп Е01-73, у которых уровень синтеза эндоглюканазы увеличился в 4-6 раз;

А.а\ттоп РЬу-7 и А.а\гатоп РЬу-39, фитазная активность которых увеличена в 300 раз при сохранении глюкоамилазной активности на уровне контроля.

5. На основе новых рекомбинантных штаммов А.аыатоп 6804, А.сматоп Т-14, А.ам'атоп Т-29, А.статоп Ху1-15 и А.спуатоп Е01-73 наработаны опытные образцы концентрированных ферментных препаратов и проведены сравнительные исследования их гидролитической способности по отношению к полисахаридам зернового сырья. Установлено, что концентрация глюкозы при использовании ферментных препаратов, полученных из рекомбинантных штаммов А.статоп Ху1-15 и А.аиатоп ЕС1-73, в 1,5 раза выше, чем при использовании препарата из родительского штамма А.ам>атоп 6804. Данный эффект связан с гидролизом некрахмальных полисахаридов ферментами целлюлолитического и гемицеллюлолитического действия, синтезируемыми рекомбинантными штаммами.

6. Исследовано влияние новых комплексных ферментных препаратов глюкоамилазы, полученных на основе рекомбинантных штаммов, на реологические и биохимические свойства зернового сусла и бражки. Показано, что их применение способствует улучшению реологических свойств сусла, обеспечивая снижение вязкости в 1,2 - 1,3 раза, повышению выхода целевого продукта на 1,2 %, по сравнению с ферментным препаратом, полученным на основе родительского штамма.

7. Проведены производственные испытания технологии культивирования высокоэффективных рекомбинантных штаммов А.статоп атуЯ-Т-19 и А.акатоп Ху1-15 - продуцентов глюкоамилазы и ксиланазы. Полученные

результаты свидетельствует об успешном масштабировании технологии получения препаратов глюкоамилазы и ксиланазы в промышленных условиях.

8. Применение комплексных ферментных препаратов глюкоамилазы, полученных на основе новых высокоактивных рекомбинантных штаммов, положительно влияет на экономические показатели процесса производства спирта за счет снижения расхода фермента на осахаривание, повышения выхода спирта на 0,7-1,2% и снижения технологических потерь сырья. Экономическая эффективность от производства 100 т комплексного ферментного препарата глюкоамилазы на основе новых рекомбинантных штаммов составит порядка 15-20 млн. руб.

Список работ по теме диссертации

1. Середа A.C., Цурикова Н.В., Римарева JI.B., Рожкова A.M., Винецкий Ю.П., Синицын А.П. Создание универсальной системы экспрессии генов для повышения эффективности промышленного штамма Aspergillus awamori. Сборник научных трудов. VIII Международная научно-практическая конференция «Инновационные технологии в пищевой промышленности». Минск, 2009, с.88-10.

2. Винецкий Ю.П., Рожкова A.M., Середа A.C., Цурикова Н.В„ Нуртаева А.К., Семенова М.В., Зоров И.Н., Синицын А.П. Увеличение продуктивности глюкоамилазы штамма Aspergillus awamori комбинацией методов радиационного мутагенеза и плазмидной трансформации // Прикладная биохимия и микробиология. - 2010,Т.46, № 6, с.685-692.

3. Рожкова A.M., Середа A.C., Цурикова Н.В., Римарева JI.B., Нуртаева А.К., Семенова М.В., Рубцова Е.А., Зоров И.Н., Синицына О.А, Синицын А.П. Создание системы экспрессии гетерологичных генов на основе штамма гриба Aspergillus awamori //Прикладная биохимия и микробиология. - 2011,Т.47, № 3, с.308-317.

4. Середа A.C., Игнатова Н.И., Оверченко М.Б., Цурикова Н.В., Римарева JI.B., Рожкова A.M., Зоров И.Н., Синицын А.П. Исследование гидролитической способности комплексных ферментных препаратов, полученных на основе высокоэффективных рекомбинантных штаммов Aspergillus awamori, по отношению к полисахаридам зернового сырья // Хранение и переработка сельхозсырья. -2011, №3.

5. Screda A.S., Tsurikova N.V., Rimareva L.V., Rozhkova A.M., Sinitsyn A.P. Creation of the strain-producer with increased expression level of homologous glucoamylase in the fungus Aspergillus. Abstracts of International Conference «BIOCATALYSIS 2009: Fundamentals&Applications». 19-24 June, Arkhangelsk, 2009, p. 109.

6. Середа A.C., Цурикова H.B., Римарева JI.В., Рожкова A.M., Синицын А.П. Получение штаммов-реципиентов и повышение уровня экспрессии гомологичных белков в грибах рода Aspergillus. Сборник трудов Пятого Московского Международного Конгресса «Биотехнология: Состояние и перспективы развития». 16-20 марта, Москва, 2009, с. 312-313.

7. Середа A.C., Рожкова A.M., Цурикова Н.В., Римарева Л.В. Создание системы экспрессии гетерологичных генов в штамме Aspergillus awamori. Сборник научных трудов научно-практической конференции «Современные биотехнологии переработки сельскохозяйственного сырья и вторичных ресурсов». Углич: ВНИИМС, 2009, с. 204-206.

8. Середа A.C., Цурикова Н.В., Костылева Е.В., Римарева Л.В., Рожкова A.M., Синицын А.П. Получение высокоактивных штаммов - продуцентов ферментов для конверсии крахмалосодержащего сырья на основе мицелиалыюго гриба Asp.awamori с использованием технологии рекомбинантных ДНК. Материалы международной научной конференции студентов и молодых ученых «Экологически безопасные ресурсосберегающие технологии и средств переработки сельскохозяйственного сырья и производства продуктов питания», 10-11 декабря, Москва, 2009, с.62-64.

9. Середа A.C., Цурикова Н.В., Костылева Е.В., Римарева Л.В., Рожкова A.M., Синицын А.П. Получение высокоактивных штаммов - продуцентов ферментов для конверсии крахмалосодержащего сырья на основе мицелиального гриба Aspergillus awamori с использованием технологии рекомбинантных ДНК. 5-ый Международный симпозиум «Перспективные биокатализаторы для перерабатывающих отраслей АПК». М.:ВНИИПБТ, 2010, с.12-16.

10. Середа A.C., Цурикова Н.В., Костылева Е.В., Римарева Л.В., Рожкова A.M., Зоров И.Н., Синицын А.П. Осахаривание крахмалосодержащего сырья комплексными ферментными препаратами, полученными на основе рекомбинантных штаммов Aspergillus awamori. 5-ый Международный симпозиум «Перспективные биокатализаторы для перерабатывающих отраслей АПК». М.:ВНИИПБТ, 2010, с.256-260.

Выражаю глубокую и искреннюю признательность д.х.н., проф. Синицыну Аркадию Пантелеймоновичу, к.т.н. Цуриковой Нине Васильевне и к.х.п. Рожковой Александре Михайловне за помощь и руководство в выполнении диссертационной работы.

Глубокую благодарность выражаю сотрудникам сектора «Биотехнологии продуцентов новых гидролитических ферментов» ГНУ ВНИИ пищевой биотехнологии Россельхозакадемии, лаборатории «Физико-химической ферментативной трансформации биополимеров» МГУ им. М.В. Ломоносова и лаборатории «Биотехнологии ферментов» ИНБИ им. А.Н.Баха РАН за неоценимую помощь при получении экспериментальных данных для диссертационной работы.

Подписано в печать 18 апреля 2011 г. Объем 1,2 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 301 Отпечатано в Центре оперативной полиграфии ООО «Ол Би Принт» Москва, Ленинский пр-т, д.37

Оглавление

Список сокращений

Введение

1. Литературный обзор

1.1 Технология производства пищевого спирта

1.2 Ферменты, участвующие в гидролизе зернового сырья при производстве спирта

1.3 Продуценты глюкоамилаз

1.4 Методы получения штаммов-продуцентов промышленных ферментов

2. Материалы и методы исследования

2.1 Штаммы грибов - продуцентов глюкоамилазы

2.2 НГ-мутагенез и выделение niaD" мутантов как реципиентов для плазмидной трансформации

2.3 Селекционные и ферментационные среды

2.4 Получение штаммов-реципиентов A. awamori

2.5 Плазмидные конструкции

2.6 Получение протопластов, трансформация и селекция

2.7 Условия облучения

2.8 Тесты на стабильность продукции глюкоамилазы

2.9 Определение активности ферментов

2.10 Анализ состава ферментных препаратов

2.11 Вискозиметрический метод определения общей эндодеполимеразной активности ксиланаз

2.12 Исследования по биокатализу некрахмальных полисахаридов зернового сусла комплексными ферментными препаратами, полученными на основе рекомбинантных штаммов Aspergillus awamori

2.13 Структура теоретических и экспериментальных исследований

3. Результаты и их обсуждение

3.1 Выделение стабильного варианта штамма A. awamori

3.2 Получение высокоэффективных штаммов A. awamori - продуцентов глюкоамилазы методом плазмидной трансформации

3.3 Получение высокоэффективных штаммов A. awamori — продуцентов ферментов, гидролизующих НПС и фитиевую кислоту методом плазмидной трансформации

3.4 Влияние индуктора на продуктивность рекомбинантных штаммов А. awamori

3.5 Поддержание коллекции рекомбинатных штаммов A. awamori

3.6 Исследование биоконверсии некрахмальных полисахаридов зернового сусла комплексными ферментными препаратами, полученными на основе высокоэффективных рекомбинантных штаммов Aspergillus awamori

3.7 Масштабирование процесса культивирования рекомбинантных штаммов Aspergillus awamori в промышленных условиях

3.8 Испытания ферментного препарата глюкоамилазы в спиртовом производстве

По традиционной технологии производства спирта для разжижения крахмала зернового сырья применяют ферментные препараты амилолитического действия: а-амилазы и глюкоамилазы. Для повышения выхода конечного продукта и более полноценного использования растительного сырья активно применяют ферменты целлюлолитического комплекса, гидролизующие некрахмальные полисахариды [1].

На российском рынке представлены в основном импортные ферментные препараты, это связано с отсутствием в России современного рентабельного биотехнологического производства из-за недостаточного уровня активности имеющихся промышленных штаммов. I

В мировой практике высокоактивные технические ферментные препараты получают на основе генно-модифицированных рекомбинантных штаммов. Генно-инженерные технологии позволяют не только увеличивать продуктивность микроорганизмов, но и получать ферментные препараты с заданными свойствами [2]. Концепция получения рекомбинантных штаммов методом генетической инженерии состоит из трех основных этапов:

• Получение стабильного штамма-реципиента;

• Создание универсальной трансформационной и экспрессионной системы;

• Получение высокоэффективных рекомбинантных штаммов.

С целью создания импортозамещающей, конкурентоспособной технологии промышленного производства технических ферментов для конверсии зернового сырья в ГНУ ВНИИПБТ совместно с кафедрой химической энзимологии Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, рядом институтов РАН и частных компаний был получен высокоактивный мутантный штамм А. статоп М-2002 (ВКМ Р-377Ш). Данный штамм является промышленным продуцентом глюкоамилазы, обладающей а-(1-4) и а

1-6) активностью, что делает этот фермент ключевым в процессах осахаривания крахмалсодержащего сырья и мальтодекстринов в спиртовой и крахмалопаточной промышленности [3]. Штамм А. статоп М-2002 в настоящее время является наиболее продуктивным из штаммов, используемых для получения глюкоамилазы в России.

Увеличение уровня стабильной экспрессии глюкоамилазы штамма А. сматоп М-2002 и создание на его основе рекомбинантных штаммов -продуцентов ферментов, гидролизующих НПС, позволит получить конкурентоспособные ферментные препараты для эффективной конверсии зернового сырья. Это снизит их себестоимость и приведет к повышению рентабельности производства ферментных препаратов.

Целыо исследований являлось получение рекомбинантных штаммов -продуцентов ферментов для эффективной конверсии зернового сырья на основе промышленного штамма А аматоп М-2002 (ВКМ Р-377Ш).

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

• Получить стабильный реципиеитный штамм для проведения дальнейших генно-инженерных работ по повышению его биосинтетической способности.

• Создать универсальную систему экспрессии генов.

• Получить высокоэффективные рекомбинантные штаммы с заданными свойствами и разработать методики поддержания полученных рекомбинантных штаммов.

• На основе полученных рекомбинантных штаммов наработать опытные образцы ферментных препаратов (ФП).

• Изучить компонентный и биохимический состав полученных ФП и их гидролитическую способность по отношению к полисахаридам зернового сырья.

• Исследовать эффективность применения новых ФП в спиртовом производстве.

4. Выводы

1. Комбинацией методов селекции и индуцированного мутагенеза-получен стабильный мутантный. штамм A. awamori 6804 с уровнем активности* глюкоамилазы в культуральной жидкости 580+20 ед/см-3.

2. На основе штамма A. awamori 6804 получен ауксотрофный штамм-реципиент A. awamori 6804-19 для проведения плазмидной трансформации с целью получения рекомбинантных штаммов - продуцентов глюкоамилазы и НПС-гидролизующих ферментов.

3. Разработана методика протопластирования и трансформации штамма-реципиента A. awamori 6804-19. Создана универсальная система экспрессии генов для A. awamori на основе промотора и терминатора гена глюкоамилазы (glaA) A. awamori 6804.

4. Методами генной инженерии получены рекомбинантные штаммы, обладающие повышенной активностью целевых ферментов, необходимых для эффективной конверсии полисахаридов зернового сырья:

A. awamori amyR-T-19, A. awamori Т-14 и A. awamori Т-29 с увеличенной продукцией глюкоамилазы на 30 %;

A. awamori Xyl-15 и A. awamori Xyl-21, ксиланазная активность которых увеличена в 3 раза по сравнению с исходным штаммом;

A. awamori EGI-46 и A. awamori EGI-73, у которых уровень синтеза эндоглюканазы увеличился в 4-6 раз;

A. awamori Phy-7 и A. awamori Phy-39, фитазная активность которых увеличена в 300 раз при сохранении глюкоамилазной активности на уровне контроля.

5. На основе новых рекомбинантных штаммов A. awamori 6804, А. awamori Т-14, A. awamori Т-29, A. awamori Xyl-15 и A. awamori EGI-73 наработаны опытные образцы концентрированных ферментных препаратов и проведены сравнительные исследования их гидролитической способности по отношению к полисахаридам зернового сырья. Установлено, что концентрация глюкозы при использовании ферментных препаратов, полученных из рекомбинантных штаммов A awamori Xyl-15 и A. awamori EGI-73, в 1,5 раза выше, чем при использовании препарата из родительского штамма A. awamori 6804. Данный эффект связан с гидролизом некрахмальных полисахаридов ферментами целлюлолитического Hi гемицеллюлолитического действия, синтезируемыми рекомбинантными штаммами.

6. Исследовано влияние новых комплексных ферментных препаратов глюкоамилазы, полученных на основе рекомбинантных штаммов, на реологические и биохимические свойства зернового сусла и бражки. Показано, что их применение способствует улучшению реологических свойств сусла, обеспечивая снижение вязкости в 1,2 - 1,3 раза, повышению выхода целевого продукта на 1,2 %, по сравнению с ферментным препаратом, полученным на основе родительского штамма.

7. Проведены производственные испытания технологии- культивирования высокоэффективных рекомбинантных штаммов A. awamori amyR-T-19 и А. awamori Xyl-15 - продуцентов глюкоамилазы и ксиланазы. Полученные результаты свидетельствует об успешном масштабировании технологии получения препаратов глюкоамилазы и ксиланазы в промышленных условиях.

8. Применение комплексных ферментных препаратов глюкоамилазы, полученных на основе новых высокоактивных рекомбинантных штаммов, положительно влияет на экономические показатели процесса производства спирта за счет снижения расхода фермента на осахаривание, повышения выхода спирта на 0,7-1,2% и снижения технологических потерь сырья. Экономическая эффективность от производства 100 т комплексного ферментного препарата глюкоамилазы на основе новых рекомбинантных штаммов составит порядка 15-20 млн. руб.

3.9 Заключение

В результате проведенных исследований с использованием эффективных методов селекции, индуцированного мутагенеза и генно-инженерных технологий получены новые рекомбинантные штаммы А. сматоп, обладающие повышенной активностью ферментов, необходимых для эффективной конверсии полисахаридов зернового сырья.

На диаграмме (рис. 29) приведены обобщенные результаты экспериментальных исследований по получению новых рекомбинантных штаммов А. ам>атоп.

Я Глюкоамилаза ■ Ксиланаза ■ КМЦ-аза II Бета-глюканаза ■ Фитаза 1 I а 5

Л^» Л^« а\\ашоп алуатоп а »-а топ а »а топ а\\атоп ажипоп а\\атоп а «а топ

М-2002 6804 атуК-Т- Т-29 Т-14 Ху1-15 ЕС1-73 РЬу-7

19

Рисунок 29 - Целевые активности ферментов в КЖ штаммов А. <шатоп: А. аматоп М-2002 - исходный штамм, продуцент глюкоамилазы;

А. амгатоп 6804 — стабильный кобальтовый мутантный штамм, продуцент глюкоамилазы;

А. сматоп атуЯ-Т-19 — рекомбинантный штамм, полученный в результате трансформации плазмидой рА№2я/и>>К., продуцент глюкоамилазы; А. аматоп Т-29 - рекомбинантный штамм, полученный в результате трансформации плазмидой рвА-вА, продуцент глюкоамилазы;

А. сматоп Т-14 - рекомбинантный штамм, полученный в результате трансформации плазмидой рвА-ОА, продуцент глюкоамилазы; А. ам>атог\ Ху1-15 - рекомбинантный штамм, полученный в результате трансформации плазмидой рОА- Ху1, продуцент глюкоамилазы и ксиланазы;

А. статоп ЕС1-73 - рекомбинантный штамм, полученный в результате трансформации плазмидой рвЛ- Ев, продуцент глюкоамилазы и эндоглюканазы; А. статоп РЬу-7 - рекомбинантный штамм, полученный в результате трансформации плазмидой рвА- РЬу, продуцент глюкоамилазы и фитазы

Штаммы А. статоп атуЯ-Т-19 и А. статоп Ху1-15 депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН.

Анализ биохимического состава ферментативного комплекса на основе тестирования активности ферментов по специфичности их действия, а также результаты фракционного состава при храмотографическом разделении ферментных препаратов подтвердил увеличение глюкоамилазной активностей и наличие сопутствующих ксиланазной, эндоглюканазной и фитазной активностей у новых рекомбинантных штаммов А. ам-атоп.

Показана эффективность использования ферментных препаратов, полученных на основе новых рекомбинантных штаммов А. статоп в производстве спирта для улучшения реологических свойств сусла и увеличения выхода спирта. В результате исследований оптимизирована традиционная технологическая схема производства этанола вследствие применения комплексных ФП, полученных на основе новых рекомбинантных штаммов А. статоп (рис. 30).

Рисунок 30 - Процессуальная схема технологии этанола на основе комплексных ФП глюкоамилазы

Основные разработанные способы повышения эффективности технологии производства и применения новых ферментных препаратов, на основе высокоактивных рекомбинантных штаммов А. статоп по сравнению с

1 существующими технологиями представлены в таблице (табл. 42).

1. Римарева, Л.В. Ферментные препараты для спиртовой промышленности. Сб. Пути совершенствования технологического процесса производства спирта, М. : 2001.-С. 17.2. 194. Waites, Michael J. Industrial microbiology: an introduction. Medical, 2008. -288 p.

2. Патент РФ №2245364 от 27.01.2005.4. www.m-bizportal.ru

3. Фараджева, Е.Д., Федоров, В.А. Общая технология бродильных производств. -М.: Колос, 2002.-408 с.

4. Jacques, К.А. The Alcohol Textbook / К.А. Jacques, Т.Р. Lyons, D. R. Kelsall. -4th edition. Nottingham University Press. 2003. - 448 p.

5. Bothast, Rodney J. New technologies in biofuel production (http://gisceu.net/PDF/U361 .pdf).

6. Туршатов M. В. Разработка энергосберегающей технологии этилового спирта на основе новых способов подготовки сырья. Диссертация на соискание ученой степени канд. тех. наук. М., 2009. 132 с.

7. Сотников, В. А., Федоров, А. Д., Гамаюрова, В. С., Котельникова, Н. И., Котельников, М. В. Способ низкотемпературного разваривания крахмалистого сырья в производстве спирта // Производство спирта и ликероводочных изделий. 2002. №1. Р. 13-15.

8. Лукерченко, В. Н. Технология и оборудование интенсивных производств спирта Текст. : монография / В.Н.Лукерченко. М. : Моск. гос. ун-т им. М.В. Ломоносова, 2003.-451 с.

9. Грачева, И.М. Технология ферментных препаратов / И. М. Грачева, А. Ю. Кривова. М.: Элевар, 2000. - 512 с.

10. Pandey, A., Nigam, P. Advances in. microbial amylases // Biotechnol. Appl. Biochem. 2000. V. 31. P. 135-152.

11. Диксон, M. Ферменты Текст. : в 3-х т. / Пер с англ. J1.M. Гинодмана, М. И. Левянт; Под ред. В.К. Антонова, А.Е. Браунштейна. М : Мир, 1982. 14. Ingle, М.В:, Erickson,- R.J. Bacterial a-amylases // Adv. Appl. Microbiol. 1978. V. 24. - P. • 257-279.

12. Ingle M.B., Erickson R.J. Bacterial a-amylases.// Adv. Appl. Microbiol., 1978, V. 24, P. 257 279.

13. Ratanakhanokchai, K., Kaneko, J., Kamio, Y., Izaki, K. Purification and properties of a maltotetraose and maltotriose producing amylase from Chloroflexus aurantiacus // Appl. Environ. Microbiol. 1992. V. 58. P. 2490-2494.

14. Grootegoed, J. A., Lauwers, A. M., Heinen, W. Separation and partial purification of extracellular amylase and protease from Bacillus caldolyticus // Arch. Microbiol. 1973. V. 90. P. 223.

15. Kobayashi, Т., Kamekura, M., Kanlayakrit, W., Ohnishi, H. Production, purification and characterization of an amylase from the moderate halophile Micrococcus varians subspecies halophilus II Microbios. 1986. V. 46. P. 165.

16. Yuzuru Suzuki and Tetsuro Imai. Bacillus stearothermophilus KP 1064 puilulan hydrolase // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1985. V. 21. P. 20-26.

17. Yuzuru Suzuki and Kazumi Oishi. A relationship between efficiencyof isomaltosaccharide hydrolysis and thermostability of six Bacillus oligo-1,6-glucosidases // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1989. V. 31. P. 32-37.

18. Kim, I-Ch., Cha, J-H., Kim, J-R., Jang, S-Y., Seo, B-Ch., Cheong, T-K., Lee, D.S., Choi, Y.D., Park, K-H. Catalytic properties of the cloned amylase from Bacilluslicheniformis II J. Biol. Chem. 1992. V. 267(31). P. 22108-22114.i

19. Bealin-Kelly, F., Kelly, C. T., Fogarty, W. M. The oc-amylase of the caldoactive bacterium Bacillus caldovelox // Biochem. Enzymol. 1990. V. 1. P. 149-158.

20. Nakano, M., Chaen, H., Sugimoto, T., Miyake, T. Maltohexaose and maltopentaose-forming amylase, and its preparation and uses // US Patent: 5.739.024. 1998.

21. Ben Ali, M., Mhiri, S., Mezghani, M., Bejar, S. Purification and sequence analysis of the B.stearothermophilus US100 II Enz. Microb. Technol. 2001. V. 28. -P. 537-542.

22. Takasaki, Y. Production of maltohexaose by a-amylase from Bacillus circulans G- II Agric. Biol. Chem. 1982. V. 46. P. 1539-1547.

23. Ilayashi, T., Akiba, T., Horikoshi, K. Production and purification of new maltohexaose-forming amylase from alkalophilic Bacillus sp. H-167II Agric. Biol. Chem. 1988. V. 52. P. 443-448.

24. Fogarty, W. M., Bourke, A. C., Kelly, C. T., Doyle, E. M. A constitutive maltotetraose-producing amylase from Pseudomonas sp. IMD 353II Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. V. 42. P. 198-203.

25. Kim, T. U., Gu, B. G., Jeong, J. Y., Byun, S.M., Shin, Y.C. Purification and haracterization of a maltotetraose forming alkaline a-amylase from an alkalophilic Bacillus sp. GM8901 // Appl. Environ. Microbiol. 1995. V. 61. P. 3105 - 3112.

26. Chary, S. J., Reddy, S. M. Starch degrading enzymes of two species of Fusarium //Folia Microbiol. 1985. V. 30. -P. 452.

27. Gupta, R., Gigras, P., Mohapatra, H., Goswami, V. K., Chauhan, B. Microbial a-amylases: a biotechnological perspective // Process Biochemistry. 2003. V. 38(11). -P. 1599-1616 (18).

28. Leveque, E., Janecek, S., Haye, B., Belarbi, A. Thermophilic archaeal amylolytic enzymes II Enzym. Microb. Tech. 2000. V. 26(1). P. 3 - 14.

29. Milner, J. A., Martin, D. J., Smith, A. Two-stage inocula for the production of alpha-amylase by Bacillus amyloliquefaciens II Enz. Microbiol. Techno1. 1997. V. 21. -P. 382 -386.

30. Bose, K., Das, D. Thermostable alpha-amylase production using Bacillus • licheniformis NRRL B14368 // Ind. J. Exp. Biol. 1996. V. 34(12). P. 1279 - 1282.

31. Hwang, K. Y., Song, H. K., Chang, C., Lee, J., Lee, S. Y., Kim, K. K., Choe, S., Sweet, R. M., Sub, S. W. Crystal structure of thermostable a-amylase from Bacillus licheniformis refined at 1,7 A resolution // Mol. Cells. 1997. V. 7(2). P. 251 - 258.

32. Khajeh, K., Naderi-Manesh, H., Ranjbar, B., Moosavi-Movahedi, A. A., Nemat-Gorgani, M. Chemical modification of lysine residues in Bacillus a-amylases: effect on activity and stability // Enz. Microb. Technol., 2001, V. 28, P. 543 549.

33. Declerck, N., Machius, M., Wiegand, G., Huber R., Gaillardin, C. Probing structural determinants specifying high thermostability in Bacillus licheniformis alpha-amylase //J. Mol. Biol. 2000. V. 301(4). P. 1041 - 1057.

34. Duran-Paramo, E., Garcia-Kirchner, O., Hervagault, J. F., Thomas, D., Barbotin, J. N. Alpha-amylase production by free and immobilized Bacillus subtilis II Appl. Biochem. Biotechnol., 2000. V. 84 86. - P. 479 - 485.

35. Yuguo, Z., Zhao, W., Xiaolong, C. Alpha-amylase production by Bacillus subtilis with dregs in an external-loop airlift bioreactor // Biochem. Eng. J. 2000. V. 5(2). P. 115-121.

36. Stredansky, M., Kremnicky, L., Sturdik, E., Feckova, A. Simultaneous production and purification of Bacillus subtilis alpha-amylase // Appl. Biochem. Biotechnol. 1993. V. 38(3). P. 269 - 276.

37. Haddaoui, E., Chambert, R., Petit-Glatron, M. F., Lindy, O., Sarvas, M. Bacillus subtilis alpha-amylase: the rate limiting step of secretion is. growth phase-independent.// FEMS Microbiol. Lett. 1999. V. 173(1). P. 127 - 131.

38. Narang, S., Satyanarayana, T. Thermostable alpha-amylase production' by an extreme thermophile Bacillus thermooleovorans II Lett. Appl. Microbiol. 2001'. V'. 32(1).-P. 31-35.

39. Chakraborty, K., Bhattacharyya, B. K., Sen, S. K. Purification and' characterization of a thermostable alpha-amylase from Bacillus stearothermophilus I I Folia Microbiol (Praha). 2000. V. 45(3). P. 207-210.

40. Hamilton, L. M., Kelly, C. T., Fogarty, W. M. Purification and properties of the raw starch degrading a-amylase of Bacillus s/?.IMD434 // Biotechol Lett. 1999. V.21. -P.lll 115.

41. Lin, L. L., Chyau, C. C., Hsu, W. H. Production and properties of a raw-starch-degrading amylase from the thermophilic and alkaliphilic Bacillus sp. TS-23 // Biotech. Appl. Biochem. 1998. V. 28. P. 61 - 68.

42. Ebisu, S., Mori, M., Takagi, H., Kadowaki, K., Yamagata, H., Tsukagoshi, N., Udaka, S. Production of a fungal protein, Taka amylase A, by protein-producing Bacillus brevis HPD31 //J.Ind. Microbiol. 1993. V. 11.-P. 83 -88.

43. Ivanova, V. I., Dobreva, E. P., Emanuilova, E. I. Purification and characterization of a thermostable alpha-amylase from Bacillus licheniformis // J. Biotech. 1993. V. 28 (2-30). -P. 277-289.

44. Femi-Ola, T. O., Olowe, B.M. Characterization of alpha amylase from Bacillus subtilis BS5 isolated from Amitermes evuncifer silvestri // Res. J. Microbiol. 2011. V. 6. -P. 140-146.

45. Paquet, V., Croux, C., Goma, G., Soucaille, P. Purification and characterization! of the extracellular alpha-amylase from Clostridium acetobutylicum ATCC 824 // Appl. Environ. Microbiol. 1991. V. 57(1). P. 212-218.

46. Shih, N. J., Labbe, R. G. Purification and characterization of an extracellular alpha-amylase from Clostridium perfringens type A // Appl. Environ.' Microbiol. 1995, V. 61(5). -P. 776-1779.

47. Pompeyo, C. C., Gömez, M. S., Gasparian, S., Morlon-Guyot, J. Comparison of amylolytic properties of Lactobacillus amylovorus and of Lactobacillus amylophilus II Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993. V. 40. P. 266 - 269.

48. Liebl, W., Stemplinger, I., Ruile, P. Properties and gene structure of the Thermotoga maritima alpha-amylase AmyA, a putative lipoprotein of a hyperthermophilic bacterium // J. Bacteriol. 1997. V. 179(3). -P. 941 -948.

49. Khoo, S. L., Amirul, A-A., Kamaruzaman, M., Nazalan, N., Azizan, M. N. Purification and characterization of a-amylase from Aspergillus flavus II Folia Microbiol. 1994. V. 39. P. 392-398.

50. Michelena, V. V., Castillo, F. J. Production of amylase by Aspergillus foetidus on rice flour medium and characterization of the Enzyme // J. Appl. Bacteriol. 1984. V.56.-P. 395.

51. Bhella, R. S., Altosaar, I. Purification and some properties of the extracellular a-amylase from Aspergillus awamori II Can. J. Microbiol. 1985. V. 31. P. 149.

52. Olutiola, P. O. a-Amylolytic activity of Aspergillus chevahen from mouldy maize seeds // Indian Phytopathol. 1982. V. 35. P. 428.

53. Heese, O., Hansen, G., Höhne, W.E., Körner, D. A thermostable alpha-amylase from Thermoactinomyces vulgaris: purification and characterization // Biomed. Biochim. Acta. 1991. V. 50(3). -P. 225-232.

54. Norouzian, D., Akbarzadeh, A., Scharer, J. M., Young, M. M. Fungal glucoamylases // Biotech. Adv. 2006. V. 24. P. 80 - 85.61. www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/

55. Marín-Navarro, J., Polaina, J. Glucoamylases: structural and' biotechnological aspects // Appl. Microbiol. Biotechnol. /Accepted: 23 November 2010. SpringerVerlag 2010.

56. Sauer, J., Sigurskjold, B. W., Christensen, U., Frandsen, T. P., Migorodskaya, E., Harrison, M., Roepstorff, P., Svensson, B. Glucoamylase: structure/function relationships, and protein engineering // Biochim. Biophys. Acta.2000. V. 1543. P. 275-293.

57. Svensson, B., Larsen, K., Svendsen, I., Boel, E. The complete amino acid sequence of the glycoprotein, glucoamylase Gl, from Aspergillus niger II Carlsberg. Res. Commun. 1983. V. 48. P. 529 - 544.

58. Svensson, B., Larsen, K., Gunnarsson, A. Characterization of glucoamylase G2 from Aspergillus niger II Eur. J. Biochem. 1986. V. 154. P. 497 - 502.

59. Svensson, B., Hespersen, H., Sierks, M.R., MacGregor,' E.A. Sequence homology between putative raw-starch bindingdomains from different starch-degrading enzymes//Biochem. J. 1989. V. 264. -P. 309-311.

60. Boraston, A. B., Bolam, D. N., Gilbert, H. J., Davies, G. J. Carbohydrate-binding modules: fine-tuning polysaccharide recognition // Bio-chem. J. 2004. V. 382. -P. 769-781.

61. Rodríguez-Sanoja, R., Oviedo, N., Sánchez, S. Microbial starch-binding domain // Curr. Opin. Microbiol. 2005. V. 8. P. 260 - 267.

62. Machovic, M., Janecek, S. Starch-binding domains in the post-genome era // Cell. Mol. Life. Sei. 2006 b. V. 63. P. 2710-2724.

63. Lin, S. C., Liu, W. T., Liu, S. H., Chou, W.I., Hsiung, B. K., Lin, I. P., Sheu, C. C., Chang, M. D. T. Role of the linker region in the expression of Rhyzopus oryzae glucoamylase II BMC. Biochem. 2007. V. 8. P. 9.

64. Sevcik, J., Solovicová, A., Hostinová, E., Gasperik, J., Wilson, K., Dauter, Z. Structure of glucoamylase from Saccharomycopsis fibuligera at 1.7 Á resolution // Acta. Crystallogr. Sect. D. 1998. V. 54. -P. 854-866.

65. Adam, A. C., Latorre-Garcia, L., Polaina, J. Structural analysis of glucoamylase encoded by the STA1 gene of Saccharomyces cerevisiae (var. diastaticus) // Yeast. 2004. V. 21. -P. 379-388.

66. Aleshin, A. E., Feng, P. H., I-Ionzatko, R. B., Reilly, P. J. Crystal structure and evolution of prokaryotic glucoamylase 11 J. Mol. Biol. 2003. V. 327. — P. 61 73.

67. Coutinho, P. M., Reilly, P. J. Glucoamylase structural, functional and evolutionary relationships // Protein Struct. Funct. Genet. 1997. V. 29. P. 334 -347.

68. Frandsen, T. P., Fierobe, H. P., Svensson, B. Engineering specificity and stability in glucoamylase from Aspergillus niger in protein engineering in industrial biotechnology // In: Alberghin L, editor. Amsterdam: Harwood Academic. 1999. P. 189-206.

69. Reilly, P. J. Protein engineering of glucoamylase to improve industrial properties; a review // Starch. 1999. V. 51. P. 269 - 274.

70. Suresh, C., Dubey, A. K., Srikanta, S., Kumar, U. S. Characterization of starch hydrolyzing enzyme of Aspergillus niger II Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. V. 51. -P. 673-675.

71. Pazure, J., Knull, H. R., Cepure, A. Glucoamylase: structure and properties of the two forms of glucoamylase from Aspergillus niger II Carbohydr. Res. 1971. V. 20. -P. 83-96.

72. Ueda, S. Fungal glucoamylase and raw starch digestion // TIBS. 1981. P. 8990.

73. Spinelli, B. B. L., Lourdes, M., Polizeli, T. M., Terenzi, II.F., Jorge, J. A. Biochemical characterization of glucoamylase from the hyper producer exo-1 mutant strain of Neurospora crassa IIFEMS Microbiol. Lett. 1996. V. 138. P. 173 - 177.

74. Norouzian, D., Rostami, K., Nouri, I. D., Saleh, M. Subsite mapping of purified glucoamylases I, II, III produced by Arthrobotrys amerospora ATCC 34468 // World J. Microbiol. Biotechnol. 2000. V. 16. -P. 155 161.

75. Ono, K., Shintani, K., Shikata, S. Competitive studies of various molecular species in Aspergillus niger glucoamylase // Agric. Biol. Chem. 1988. V. 52(7). P. 1699-1706.

76. Ali, S., Hossain, Z., Mahmood, S., Alam, R. Characterization of glucoamylase of Aspergillus terrues II J. Appl. Bacteriol. 1991. V. 71. P. 144 - 46.

77. Ghosh, A., Chatterjee, B., Das, A. Purification and characterization of glucoamylase of Aspergillus terrues NA-170 mutant I I J. Appl. Bacteriol. 1991. V. 71.-P. 162-169.

78. Thorsen, T. S., Johnsen, A. H., Josefsen, K., Jensen, B. Identification and characterization of glucoamylase from the fungus Thermomyces lanuginosus II Bioch. Bioph. Acta. / Proteins & Proteomics. 2006. V. 1764(4). P. 671 - 676.

79. King, N. J. The Glucoamylase of Coniophora cerebella II Biochem. J. 1967. V. 105.-P. 577-583.

80. Kaji, A., Sato, M., Kobayashi, M., Murao, T. Acid-stable glucoamylase produced in medium containing sucrose by Corticium rolfsii // J. Agric. Chem. Soc. Jpn. 1976. V. 50. -P. 509-517.

81. Tsuboi, A., Yamasaki, Y., Suzuki, Y. Two forms of glucoamylase from Mucor rouxianus II Agric. Biol. Chem. 1974. V. 38. P. 543 - 550.

82. Aquino, A. G., Jorge, J. A., Tercnzi, H. F., Polizeli, M. L. Thermostable glucose-tolerant glucoamylase. produced1 by the thermophilic fungus Scytaliditim thermophiliimi II Folia Microbiol. 2001. V. 46(1). P. 11 -16.

83. Paszczynski, A., Fiedurek, Ji, Ilczuk, Z., Ginalskaj G. The influence of proteases on the activity of glucoamylase from Aspergillus niger G II Appl. Microbiol. Biotechnol. 1985. V. 22(6). P. 434 - 437.

84. Miah, M. N. N., Ueda, S. Multiplicity of Glucoamylase of Aspergillus oryzae Part 2. Enzymatic and Physicochemical1 Properties of Three Forms of Glucoamylase // Starch. 1977. V. 29 (7). P. 235 - 239:

85. Pandey, A. Glucoamylase Research: An Overview // Starch1. 1995. V. 47(11).1. P. 439-445.

86. Close, A., Chatterjee, B. S., Das, A. Characterization of glucoannylaserom Asperigillus terreus 4 IIFEMS. Microbiol. Lett. 1990. V. 66(1-3). P. 345 - 349.

87. Takeda, Y., Matsui, H., Tanida, M., Takao, S., Ghiba, S. Purification and Substrate Specificity of Glucoamylase of Paecilomyces varioti AHU 9417 // Agric. Biol. Chem. 1985. V. 49(6).-P. 1633-1641.

88. Mot, R. D., Van, Oudenduck, E., Verachtert, H. Purification and characterization of an extracellular ' glucoamylase from the yeast Candidatsukuboensis CBS 6389 // Antonie van Leeuwenhoek. 1985. V. 51(3). P. 275 -287.•I103. www.biokemi.org

89. Collins, T., Gerday, Ch., Feller, G. Xylanases, xylanase families andextermophilic xylanases // FEMS Microbiol. Rew. 2005. V. 29. P. 3 - 29.i

90. Carbohydrate Active Enzymes database and URL (http://www.cazy.org/)

91. Biely, P., Vrsanska, M., Tenkanen, M., Kluepfel, D. Endo-p-1,4-xylanase families: differences in catalytic properties // J. Biotechnol. 1997. V. 57. P. 151 -166.

92. Biely, P. Diversity of microbial endo-l,4-(3-xylanases. In Applications of Enzymes to lignocellulosics / Mansfield S.D., Saddler J.N. (eds.) // Amer. Chem. Soc. Washington. 2003. P. 361 - 380.

93. Polizeli, M. L., Rizzatti, A. C. S., Monti, R., Terenzy, H. F., Jorge, J. A., Amorim, D. S. Xylanases from fungi: properties and industrial applications // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005. V. 67. P. 577 - 591.

94. Beg, Q. K., Kapoor, M., Mahajan, L., Hoondal, G. S. Microbial xylanases and their industrial applications: a review // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. V. 56. -P. 326-338.

95. Cleemput, G., Hessing, M., Van Oort, M., Deconynck, M., Delcour, J. A. Purification and characterization of p-D-xylosidase and an endo-xylanase from wheat flour//Plant. Physiol. 1997. V. 113. -P. 377-386.

96. Dekker, R. F. H., Richards, G. N. Purification, properties and mode of action of hemicellulase produced by Ceratocystis paradoxa II Carbohydr. Res. 1975. V. 39. -P. 97-114.

97. Kimura, I., Sasahara, H., Tajima, S. Purification and characterization of two xylanases and an arabinofuranosidase from Aspergillus sojae II J. Ferment. Bioengin. 1995. V. 804. -P. 334-339.

98. Gubits, G. M., Haltrich, D., Latal, В., Steiner, W. Mode ofdepolymerysation of hemicellulose by varius mannanases and xylanases in relation their ability to bleach softwood pulp // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. V. 47. P. 658 - 662.

99. Belancic, A., Scarpa, J., Peirano A., Diaz, R., Steiner, J., Eyzayuirre, J. Pénicillium purpurogenum produces several xylanases: purification and properties of two of the enzymes // J. Biotechnol. 1995. V. 41. P. 71-79.

100. Синицына, О. А., Окунев, О. H., Серебряный, В. А., Вавилова, Е. А., Винецкий, Ю. П., Синицын, А.П. Рекомбинантная эндо-1,4-р-ксиланаза Pénicillium canescens// Биохимия. 2003. Т. 68. Вып. 12.-С. 1631 1638.

101. Singh, S., Reddy, Р., Haarhoff, J., Biely, P., Janse, В., Pillay, В., Pillay, D., Prior, B. A. Relatedness of Thermomyces lanuginosus strains producing a thermostable xylanase // J. Biotechnol. 2000. V. 81. P. 119 - 128.

102. Марков, А. В. Свойства ферментных комплексов, продуцируемых мутантными штаммами Trichoderma reese. II Диссер. на соискание уч. степени кандидата хим. наук. М. : МГУ. 2003. -201 с.

103. Tenkanen, H., Puls, J., Poutanen, К. Two major xylanases of Trichoderma reesei И Enz. Microb. Technol. 1992. V. 14. -P. 566-574.

104. Dey, D., Hinge, J., Shendye, A., Rao, M. Purification and properties of extracellular endo-xylanases from alkalophilic thermophilic Bacillus sp. // Can. J. Microbiol. 1992. V. 38. -P. 436-442.

105. Ratankhanokchai, K., Kyu, K.L., Tantichareon, M. Purification and properties of a xylan-binding endoxylanase from alkaliphilic Bacillus sp. strain K-l // Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. P. 694 - 697.

106. Morales, P., Madrarro, A., Flors, A., Sendra, J. M., Gonzalez, J. A. P. Purification and characterization of a xylanase and arabinofuranosidase from Bacillus polymyxa II Enz. Microb. Technol. 1995. V. 17. P. 424 - 429.

107. Breecia, J. D., Baigori, M. D., Castro, G. R., Sineriz, F., Hatti-Kaul, R. Purification and charcacterization of a thermostble xylanases from Bacillus amyloliquefaciens// Enz. Microb. Technol. 1998. V. 22. P. 42-49.

108. Gupta, S., Bhushan, B., Hoondal, G. S. Isolation, purification and characterization of xylanase from Staphylococcus sp. SG-13 and its application in biobleaching of kraft pulp // J. Appi. Microbiol. 2000. V. 88. P. 325 - 334.

109. Winterhalter, C., Liebel, W. Two extremely thermostable xylanases of the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritama MSB8 // Appl. Environ. Microbiol. 1995. V. 61. -P. 1810-1815.

110. Hurlbert, J.C., Preston 3rd, J. F. Functional characterization of a novel xylanase from corn strain of Erwinia chrysanthemi I I J. Bacteriol. 2001. V. 183. P. 2093 — 2100.

111. Collins, T., Meuwis, M. A., Stals, I., Claeyssens, M., Feller, G., Gerday, C. A novel family 8 xylanase: functional and physicochemical characterization // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. -P. 35133-35139.

112. Li, X. L., Zhang, Z. Q., Dean, J. F. D., Eriksson, K. E. L., Ljungdahl, L. G. Purification and characterization of a new xylanases (APX-II) from the fungus Aureobasidium pullulans Y-2311-1 // Appl. Environ. Microbiol. 1993. V. 59. P. 3213-3218.

113. Kesker, S.S. High activity xylanase from thermotolerant Streptomyces T7, cultural conditions and enzyme properties // Biotechnol. Lett 1992. V. 14. P. 481 -486.

114. Simpson, D. J., Fincher, G. В., Huang, A. H. C., Cameron-Mills, V. Structure and function of cereal and related higher plant (l,4)-p-xylan endohydrolases // J. Cereal Sci. 2003. V.37. P. 111 - 127.

115. Goesaert, H., Elliott, G., Kroon, P. A., Gebruers, K., Courtin, С. M., Robben, J.,' Delcour, J. A.,. Juge, N. Occurrence, of proteinaceous endoxylanase inhibitors кг cereals // Biochim. Biophys. Acta. 2004: V. 1696. P. 193 - 202.

116. Juge, N., Payan, F., Williamson, G. XIP-I, a xylanase inhibitor protein from wheat: a novel protein function // Biochim. Biophys. Acta. 2004. V. 1696(2). P. 203 -211.

117. Gebruers, K., Debyser, W., Goesaert, H., Proost, P., Van Damme, J., Delcour, J. A. Triticum aestivum L. endoxylanase inhibitor (TAXI) consists of two inhibitors, TAXI I and TAXI II, with different specificities // Biochem. J. 2001. V. 353. P. 239-244.

118. US Patent № 608056. Enzymes With Xylanase Activity From Aspergillus Aculeatus. 27.06.2000.

119. Xu, В., Janson, J.-C., Sellos, D. Cloning and sequencing of a molluscan endo-P-1,4-glucanase gene from the blue mussel Mytilus edulis // Eur. J. Biochem., 2001. V. 268.-P. 3718-3727.

120. Karlsson, J., Siika-aho, M., Tenkanen, M., Tjerneld, F. Enzymatic properties of the low molecular mass endoglucanases Cell2A (EG III) and Cel45A (EG V) of Trichoderma reesei//J. Biotechnol. 2002. V. 99. P. 63 - 68.

121. Schulein, M. Enzymatic properties of cellulases from Humicola insolens И J. Biotechnol. 1997. V. 57. P. 71 - 81.

122. Schou, C., Rasmussen, G., Kaltoft, M. В., Henrissat, В., Schulein, M. Stereochemistry, specificity and kinetics of the hydrolysis of reduced cellodextrins by nine cellulases // Eur. J. Biochem. 1993. V. 217. P. 947 - 953.

123. Saloheimo, M.5 Lehtovaara, P., Penttila, M., Teeri, T. T., Stahlberg, J.,

124. Vincken, J.-P., Beldman, G., Voragen, A. G. J. Substrate specificity of endoglucanases: what determines xyloglucanase activity? // Carbohydr. Res. 1997. V. 298. P. 299-310.

125. Chen, G., Du, J., Zhuang, L., Gao, P. Purification and properties of endoglucanases from Aspergillus aculeatus SM-L22 // Wei Sheng Wu Xue Bao. 2001. V. 41(4).-P. 469-474. '

126. Okada, G. Purification and properties of a cellulase from Aspergillus niger // Agric. Biol. Chem. 1985. V. 49. P. 1257 - 1265.

127. Ganju, R. K., Murthy, S. K., Vithayathil, P. J. Purification and functional characteristics of an endocellulase from Chaetomium thermophile var. coprophile II Carbohydr. Res. 1990. V. 197. P. 245 - 255.

128. Yoon, J. J., Cha, C. J., Kim, Y. S., Kim, W. Degradation of cellulose by the major endoglucanase produced from the brown-rot fungus Fomitopsis pinicola. // Biotechnol.Lett. 2008. V. 30. P. 1373 - 1378.

129. Mansfield, S. D., Saddler, J. N., Gubitz, G. M. Characterization of endoglucanases from the brown rot fungi Gloeophyllum sepiarium and Gloeophyllum trabeum II Enz. Microb. Technol. 1998. V. 23. P. 133 - 140.

130. S aha, B. C. Production, purification and properties of endoglucanase from a newly isolated strain of Mucor circinelloides II Process Biochem. 2004. V. 39. -P. 1871 -1876.

131. Chaabouni, S. E., Mechichi, T., Limam, F., Marzouki, N. Purification and characterization i of two low molecular weight endoglucanases produced by Pénicillium occitanis mutant pol 6 // Appl. Biochem. Biotechnol. 2005. V. 125(2). -P. 99-112.

132. Jeya, M., Joo, A., Lee, K. M., Sim, W., Oh, D. K., Kim, Y. S., Kim, I. W., Lee, J. K. Characterization of endo-/?-1,4-glucanase from a novel strain of Pénicillium pinophilum KM.T601 //Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010. V. 85. P. 1005 - 1014.

133. Schulein, M. Enzymatic properties of cellulases from Humicula insolens// J. Biotechnol. 1997. V. 57. P. 71-81.

134. Takashima, S., Iikura, H., Nakamura, A., Hidaka, M., Masaki, H., Uozumi, T. Overproduction of recombinant Trichoderma reesei cellulases by Aspergillus oryzae and their enzymatic properties // J. Biotechnol. 1998. V.65. P. 163-171.

135. Claeyssens, M., Nerinckx, W., Piens, K. Carbohydrases from Trichoderma reesei and other microorganizms. Structure, biochemistry, genetics and applications. The Royal Society of Chemistry. 1998. 23 8p.

136. Lin, S. B., Stutzenberger, F. J. Purification and characterization of the major 3-1,4-endoglucanase from Thermomonospora curvata II J. Appl. Bacteriol. 1995. V. 79.-P. 447-453.

137. Lucas, R., Robles, A. M., Garca, T., De Cienfuegos, G. A., Glvez, A. Production, purification, and properties of an endoglucanase produced by the hyphomycete Chalara (Syn. Thielaviopsis) paradoxa CH32 // J. Agric. Food Chem. V. 49(1). -P. 79-85.

138. Shibuya, H., Kikuchi, T. Purification and characterization of recombinant endoglucanases from the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophilus II Biosci. Biotechnol. Biochem. 2008. V.72 (5). P. 1325 - 1332.

139. Zyla, K. Phytase applications in poultry feeding: Selected issues // J. Animal Feed Science. 2001. V.10. -P. 247-258.

140. Vohra, A., Satyanarayana, T. Phytases: Microbal Sources, Production, Purification, and Potential Biotechnological Applications. Critical Reviews in Biotechnology. 2003. V. 23(1).-P. 29-60.

141. Bryant, R. J., Dorsch, J. A., Peterson, K. L., Rutger, J. N., Raboy, V. Phosphorus and Mineral Concentrations in Whole Grain and Milled Low Phytic Acid (Ipa) 1-1 Rice // Cereal Chem. 2005. V. 82(5). P. 517 - 521.

142. Wodzinski, R. J., Ullah, A. H. J. Phytase // Adv. Appl. Microbiol. 1996. V. 42. -P. 263-302.

143. Pandey, A., Szakacs, G., Soccol, C. R., Rodriguez-Leon, J. A., Soccol, V. T. Production, purification and properties of microbal phytases // Biores. Tech. 2001. V. 77.-P. 203-214.

144. Casey, A., Walsh, G. Identification and characterization of a phytase of potential commercial interest //J. Biotech.2004. V. 110. P. 313 - 322.

145. Ullah, A. H. J., Phillippy, B. Q. Substrate Selectivity in Aspergillus ficuum Phytase and Acid Phosphatases Using wyo-Inositol Phosphates // J. Agric. Food Chem. 1994. V. 42. P. 423 -425.

146. Greiner, R. Purification and Characterization of Three Phytases from Germinated Lupine Seeds (Lupinus albus Var. Amiga) II J. Agric. Food Chem. 2002. V. 50.-P. 6858-6864.

147. Whitaker, J. R., Voragen, A. G. J., Wong, D.W.S. Handbook of Food Enzymology. -NY. : Marcel Dekker Inc. 2003. 1052 p.

148. Tye, A. J., Siu, F. K. Y., Leung, T. Y. C., Lim, B. L. Molecular cloning and the biochemical characterization of two novel phytases from B: subtiilis 168 and B. licheniformisH Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. V. 59. P. 190 - 197.

149. Shah, V., Parekh, L. J. Phytase from Klebsiella Sp. No. PG-2: Purification and properties // Ind. J. Biochem. Bioph. 1990. V. 27. P. 98 - 102.

150. Berka, R. M., Rey, M. W., Brown, K. M., Byun, T., Klotz, A. V. Molecular Characterization and Expression of a Phytase Gene from the Thermophilic Fungus Thermomyces lanuginosus // Appl. Environm. Microbiol. 1998. V. 64(11). P. 4423 -4427.

151. Zyla, K. Mould phytases and their application in the food industry // World J. Microbiol. Biotech. 1992. V. 8(42). P. 467 - 472.

152. Vohra, A., Satyanarayana, T. Purification and characterization of a thermostable and acid-stable phytase from Phichia anomala //World J. Microbiol. Biotechn. 2002. V. 18. -P. 687-691.

153. Casey, A., Walsh, G. Purification and characterization of extracellular phytase from Aspergillus niger ATCC 9142 // Biores. Technol. 2003. V. 86. P. 183-188.

154. Skowronski, T. Some Properties of Partially Purified Phytase from Aspergillus niger//Acta Microbiol. Pol. 1978. V. 27(1). P. 41 -48.

155. Sajidan, A., Farouk, A., Greiner, R., Jungblut, P., Muller, E. C., Borriss, R. Molecular and physiological characterization of a 3-phytase from soil bacterium Klebsiella sp. ASR1 // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2004. V. 65(1). P. 110 - 118.

156. Gouka, R. J., Punt, P. J., van den Hondel, С. A. M. J. J. Efficient production of secreted proteins by Aspergillus: progress, limitations and prospects // Appl. Microbiol. Biotechnol.1997. V. 47. P. 1 - 11.

157. Pedersen, H., Beyer, M., Nielsen, J. Glucoamylase production, in batch; chemostat and fed-batch cultivations by an industrial strain of Aspergillus niger II Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000 V. 53(3). P. 272 - 277.

158. Xiaochun, F., Runxiang, Q. I. U., Li, L. I. U., Guomin; T. Study on the molecular basis of glucoamylase overproduction of a mutant strain Aspergillus niger T21 // Science in China (Series C). 2001. V. 44(3). -P. 288 293.

159. Paulchamy, C. Solid-state cultivation of Aspergillus niger NCIM 548 for glucoamylase production on groundnut shell // The Internet J. Microbiol. 2008 V. 5. № 1.

160. Pandey, A., Selvakumar, P., Ashakumary, L. Glucoamylase production by Aspergillus niger on rice bran is improved by adding nitrogen sources // World J. Microbiol. Biotech. 2008. V. 10 (3). P. 348 - 349.

161. Anto, H., Trivedi, U. P., Patel, K.C. Glucoamylase production by solid-state fermentation using rice flake manufacturing waste products as substrate // Bioresour.Technol. 2006. V. 97. -P. 1161 1166.

162. Авторское свидетельство СССР N 800185, C12 D 13/10, 1981.

163. Авторское свидетельство СССР N 1259673, С12 N 9/34, 1982.

164. Авторское свидетельство СССР N 1271068, С12N 9/34, 1979.

165. Патент РФ №2196821 от 20.01.2003.

166. ГОСТ 20264.4-89. Препараты ферментные. Методы определения амилолитической активности / Издательство стандартов. 1989. —27 с.196. http://www.abercade.ru/research/industrynews/5709.html

167. Егоров, Н. С. Промышленная микробиология / Под ред. Егорова Н. С. -М. : Высш. шк. 1989.-688 с.

168. Дебабов, В. Г., Лившиц, В. А. Современные методы создания промышленных штаммов микроорганизмов // Кн. 2 в Учеб. пособие для вузов.

169. В 8 кн. под ред. Егорова Н. С., Самуилова В. Д. М. : Высш. шк. - 1988. - 208 с.

170. Щелкунов, С.Н: Генетическая инженерия / С.Н. Щелкунов. Новосибирск : Сиб. унив. изд-во, 2004: - 496 с.

171. Глик, Б. Молекулярная биотехнология: принципы и применение/ Б. Глик, Дж. Пастернак. М. : Мир, 2002. - 589 с.

172. Peberdy, J. F., Caten, С. E., Ogden, J'. E., Bennett, J. W. Applied molecular , genetics of fungi // Cambridge: Cambridge University Press. 1991. 187 p.

173. Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations // J. Bacteriol. 1983. V. 153. P. 163 - 168.

174. Aleksenko, A. Y., Makarova, N. A., Nikolaev, I. V., Clutterbuck, A. J. Integrative and replicative transformation of Penicillium canescens with a heterologous nitrate-reductase gene // Curr. Genet. 1995. V. 28. P. 474-477.

175. Gruber, F., Visser, J., Kubicek, C. P., De Graaf, L. H. Cloning of the Trichoderma reesei pyrG gene and its use as a homologous marker for a high-frequency transformation system // Curr. Genet. 1990. V. 18. P. 447 - 451.

176. Mach, R. L., Schindler, M., Kubicek, C. P. Transformation of Trichoderma reesei based on the hygromycin В resistance using homologous expression signals // Curr. Genet. 1994. V. 25. P. 567 - 570.

177. Meyer, V., Mueller, D., Strowig, Т., Stahl, U. Comparison of different transformation methods for Aspergillus giganteus // Curr. Genet. 2003. V. 43. P. 371 -377.

178. Varadarajalu, L. P., Punekar, N. S. Cloning and use of sC as homologous marker for Aspergillus niger transformation // J. Microbiol: Methods. 2005. V. 61. P. 219 -224.

179. Verdoes, J. C., Punt, P. J., Van den Hondel, C. A. M: J. J. Molecular genetic strain improvement for the overproduction of fungal proteins by Filamentous fungi // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. V. 43. P. 195-205.

180. Cheevadhanarak, S., Renno, D.V., Saunders, G., Holt, G. Cloning and selective overexpression of an alkaline protease-encoding gene from Aspergillus oryzae // Gene 1991 V. 108. P. 151 - 155.

181. Ruttkowski, E., Khanh, N.Q., Wirsei, S., Wildhardt, G., Gottschalk, M. Expression of the a-amylase gene from Aspergillus oryzae in Aspergillus awamori. DECHEMA Biotechnology Conferences 3. VCH Verlagsgesellschaft Weinheim, Germany. 1989. P. 325 - 328.

182. Ward, M., Wilson, L. J., Kodama, K. H. Use of Aspergillus overproducing mutants, cured for the integrated plasmid, to overproduce heterologous proteins // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993. V. 39. P. 738 - 743v

183. Christensen, T., Woeldike, H., Boel, E., Mortensen, S.B., Hjortshoej, K., Thim, L., Hansen, M. T. High level expression of recombinant genes in Aspergillus oryzae //J. Biotechnol. 1988. V. 6. P. 1419 - 1422.

184. Boel, E., Christensen, T., Woldlike, H. F. Process for the production of protein products in Aspergillus oryzae and a promoter for the use in Aspergillus // EPA. 1987.-P. 0 238 023

185. Sharif, F.A., Alaeddinoglu, N. G. Expression and overproductionof glucose oxidase in Aspergillus niger// Appl. Microbiol. Biotechnol. 1992. V. 38. -P. 115-116.

186. Witteveen, C. F. B., Van de Vondervoort, P. J. I., Van den Broeck, H. C.,

187. Van Engelenburg, F. A. C., De Graaff, L. H., Hillebrand, M. H. B. C.3 Schaap, P. J., Visser, J. Induction of glucose oxidase, catalase, and lactonase in Aspergillus niger // Curr. Genet. 1993. V. 24. P. 408 - 416.

188. Khanh, N. Q., Ruttkowski, E., Leidinger, K., Albrecht, H., Gottschalk,

189. M. Characterization and expression of a genomic pectin methyl esterease-encoding gene in Aspergillus niger//Gene. 1991. V. 106. P. 71 -77.

190. Khanh, N. Q., Leidinger, K., Albrecht, H., Ruttkowski, E., Gottschalk,

191. M. Effects of promoters on the enhancement of pectinmethyl esterase expression in Aspergillus niger//Biotechnol. Lett. 1992. V. 14.-P. 1047-1052.

192. Bussink, H. J. D., Kester, H. C. M., Visser, J. Molecular cloning, nucleotide sequence and> expression of the gene encoding prepropotygalacturonase II of Aspergillus niger// FEBS Lett. 1990. V. 273. P. 127 - 130.

193. Bussink, H. J. D., Buxton, F. P., Visser, J. Expression and sequence comparison of the Aspergillus niger and Aspergillus tubigensis genes encoding polygalacturonase II // Curr. Genet. 1991a. V. 19. P. 467 - 474.

194. Bussink, H. J. D., Hombergh, J. P. T. W., Van den Ussel, P. R. L. A., Visser, J. Characterization of polygalacturonase-overproducing Aspergillus niger transformants // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1992a. V. 37. P. 324 - 329.

195. Van Gorcom, R. F. M., Van Hartingsveldt, W., Van Paridon, P. A., Veenstra, A. E., Luiten, R. G. M., Selten, G. C. M. Cloning and expression of microbial phytase // EPA. 1990. № 0420358.

196. Hessing, J. K. M., Van Rotterdam, C., Verbakel, J. A. M., Roza, M., Maat, J., Gorcom, R. F. M., Van Hondel, C. A. M. J. J. Isolation and characterization of a 1,4-ß-endoxylanase gene of A awamori // Curr. Gennet. 1994. V. 26. P. 228-232.

197. Van Gorcom, R. F. M., Hessing, J. G. M., Maat, J., Roza, M., Verbakel, J.A. Xylanase production // World Patent Application 1992. 91/19782.

198. Kinghorn, J. R., Unkles, S. E. Inorganic nitrogen assimilation: molecular aspects. In Aspergillus: 50 years on; eds Martinelli S.D. and Kinghorn J.R. Elsevier, Amsterdam, P. 181-194.

199. Ward, O. P., Qin, W. M., Dhanjoon, N. J., Ye, J., Singh, A. Physiology and Biotechnology of Aspergillus II Adv. Appl. Microbiol. 2006. V. 58. P. 1 - 75.

200. Tsuchiya, K., Nagasjhiam, T., Yamamoto, Y., Gomi, K., Kitamoto, K., Umagai, C. High level secretion of calf chymosin using a glucoamylase prochymosin fusion gene in Aspergillus oryzae //Biosci. Biotechnol. Biochem. 1994. V. 58. P. 895 -899.

201. Jeenes, D. J., Marczinke, B., Mackenzie, D. A., Archer, D. B. A truncated glucoamylase gene fusion for heterologous protein secretion from A. niger II FEMS Microbiol. Lett. 1993. V. 107. P. 267-271.

202. Gouka, R. J., Punt, P. J., Hessing, J. G. M., Van den Hondel, C. A. M. J. J. Analysis of heterologous protein production in defined recombinant Aspergillus awamori strains // Appl. Environ. Microbiol. 1996. V. 62. P. 1951 - 1957.

203. Ward, P. P., Peddington, C. S., Cunnighham, G. A., Zhou, X., Wyatt, R. D., Conneely, O. M. A system for production of commercial quantities of human lactoferrin: A broad spectrum natural antibiotic // J. Biotechnol. 1995. V. 13. P. 498 -503.

204. Aleksenko, A. Y., Makarova, N. A., Nikolaev I. V., Clutterbuck, A. J. Integrative and replieative transformation off Pénicillium canescens with a heterologous nitrate-reductase gene // Curr: Genet. 1995. V.28. P. 474 - 478.

205. Punt, P. J., Oliver, R. P., Dingemanse, M. A., Pouwels, P. H., van den Hondel, C. A. Transformation of Aspergillus based on the hygromycin В resistance marker from Escherichia coli И Gene. 1987. V. 56. P. 117-124.

206. Sambrook, J., Russell, D. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001. p. 1.44.

207. Aslanidis, C., de Jong, P.J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR) // Nucleic Acid Research. 1990. V. 18. P. 6069-6075.

208. Tilburn, J., Scazzocchio, C., Taylor, G. G., Zabicky-Zissman, J. H., Lockington, R. A., Davies, R. W. Transformation by integration in Aspergillus nidulans II Gene. 1983. V. 26(1)-P. 205-221.

209. Синицын, А. П., Гусаков, А. В., Черноглазов, В. А. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. М. : МГУ. 1995. 144 с.

210. Досон, Р., Элиот, Д., Элиот, У., Джонс, К. Справочник биохимика. М. : Мир, 1991.-543 с.

211. Патент РФ. 2002. № 2245364.

212. Hessing, J. G., van Rotterdam, С., Verbake, J. M., Roza, М., Маа, J., van Gorcom, R. F., van den Hondel, C. A. Isolation and characterization of a 1,4-beta-endoxylanase gene of A. awamori // Curr. Genet. 1994. V. 26. P. 228 - 232.

213. Casey, А., Wals, G. Purification and characterization of extracellular phytase from Aspergillus niger ATCC 9142 // Biores. Technol. 2003. V. 86. -P. 183-188.

214. ГОСТ 10840-64. Зерно. Методы определения натуры. М. : ИПК Изд-во Стандартов, 2001.

215. ГОСТ 10847-74. Зерно. Методы определения зольности. М. : Изд-во Стандартов, 1985.

216. ГОСТ 13586.5-93. Зерно. Метод определения влажности. Минск : Межгосударственный Совет по стандартизации метрологии и сертификации, 1993.

217. Boel, Е., Hjort, I., Svensson, В., Norris, F., Norris, К. Glucoamylases Gi and G2 from Aspergillus niger are synthesized from two different but closely related mRNAs //EMBO J. 1984. V. 3(5).-P. 1097-1102.

218. Tsukagoshi, N., Kobayashi, Т., Kato, M. Regulation of the amylolytic and (hemi-)cellulolytic genes in aspergilli // J. Gen. Appl. Microbiol. 2001. V. 47. P. 119.

219. Gwynne, D. I., Buxton, F. P. Genetically Engineered Secretion of Active Human Interferon and a Bacterial Endoglucanase from Aspergillus nidulans // Biotechnology. 1987. V. 5. -P. 713-719.

220. Verdoes, J. C., Punt, P. J., Stouthamer, A. H., Hondel, С. A. M. J. J. The effect of multiple copies of the upstream region on expression of the Aspergillus niger glucoamylase-encodinggene//Gene. 1994. V. 145.-P. 179-187.

221. Я хотела бы выразить глубокую благодарность д.т.н., проф. Римаревой Любови Вячеславовне за руководство при выполнении и написании диссертационной работы.

222. Выражаю глубокую и искреннюю признательность д.х.н., проф. Синицыну Аркадию Пантелеймоновичу, к.т.н. Цуриковой Нине Васильевне и к.х.н. Рожковой Александре Михайловне за помощь и руководство в выполнении диссертационной работы.