автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Интенсификация биосинтеза этанола из инулинсодержащего сырья

На правах рукописи

КЕРИМОВА ЗУНИЯТ МАКАШАРИПОВНА

ИНТЕНСИФИКАЦИЯ БИОСИНТЕЗА ЭТАНОЛА ИЗ ИНУЛИНСОДЕРЖАЩЕГО СЫРЬЯ

специальность 05.18.07. - Биотехнология пищевых продуктов

(алкогольные и безалкогольные напитки)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Махачкала 2005

Работа выполнена на кафедре химии Дагестанского государственного технического университета и в Научно-производственном технологическом центре «Синтез»

Научные руководители: Заслуженный деятель науки РД,

доктор химических наук, профессор Вагабов М.-З.В

кандидат химических наук Мангуева 3. М.

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор

Востриков Сергей Всеволодович (ВГТА) доктор технических наук, профессор Алиев Зазав Мустафаевич (ДГУ);

Ведущая организация: ФГУП «Микроген» НПО «Питательные среды»

Защита диссертации состоится 27 декабря 2005 г. в 14 ч. 00 мин. на заседании диссертационного совета К 212.052.02 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата технических наук при Дагестанском государственном техническом университете по адресу: 367001, Махачкала, ул. И. Шамиля, 70, кафедра химии.

Факс (8722) 62-48-96, Е. mail: ukhgmag@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Дагестанского государственного технического университета

Автореферат разослан 26 ноября 2005 г.

кандидат технических наук, доцент

Ученый секретарь диссертационного совет.

М.Н. Исламов

¿£9(ь>

12РГ963

Актуальность работы. Разработка технологии получения пищевых продуктов из нетрадиционных видов сырья с использованием ферментных препаратов приобретает все более широкое применение. Высокая специфичность ферментов требует подбора таких биокаталитических систем, в которых с одной стороны обеспечиваются достаточно высокая скорость протекающих процессов гидролитического расщепления, а с другой стороны вовлечение в систему высокопродуктивной нетрадиционной культуры в качестве сырья, обеспечивающей получение целевых высококачественных продуктов с достаточно высокой рентабельностью.

Для решения поставленной задачи - биосинтеза этанола из инулинсодер-жащего сырья топинамбура использовался ряд ферментов, которые имели, как выяснилось, высокую гидролитическую активность и обеспечивали проведение процесса в временных рамках существующих промышленных технологий получения спирта ректификованного пищевого из крахмалсодержащего сырья, с использованием существующей технологической цепи и оборудования.

Следует отметить, что процесс гидролиза полифруктанов в литературе освещен недостаточно, имеющийся материал свидетельствует о низкой скорости гидролиза (3 и более часа). Это однозначно не позволяет осуществить биосинтез этанола во временных рамках существующего регламента получения спирта ректификованного из крахмалистого сырья.

Поэтому исследования по выбору продуцента инулаз, обоснование параметров гидролитического расщепления инулинсодержащего сырья, изучение факторов, влияющих на гидролиз полифруктанов, получение спирта ректификованного высокого качества является весьма актуальной задачей, тем более, что из года в год стоимость традиционного сырья растет, следовательно, продукт становится менее конкурентоспособным.

Целью работы являлась разработка способа существенного ускорения гидролитического расщепления полифруктанов из топинамбура с последующей интенсификацией процесса сбраживания сусла для получения этилового спирта

ректификованного.

Для достижения этой цели были решены следующие задачи:

• подбор ферментных препаратов, обладающих высокой инулиназной активностью;

• изучение их особенностей и определение физико-химических характеристик ферментных препаратов;

• изучение влияния степени гидролиза инулина на процесс брожения и на выход целевого продукта;

• изучение зависимости состава зрелой бражки от способа подготовки сырья к сбраживанию; установление технологических параметров сбраживания в зависимости от состояния используемых рас дрожжей;

• разработка высокоэффективной технологии ускоренного получения спирта ректификованного по ГОСТ Р 51652-2000.

Объектами исследования являются процессы ускоренного гидролитического расщепления полифруктанов из сусла клубней топинамбура Южного региона и ферментные препараты различного механизма действия. Выбор данных биотехнологических систем обусловлен необходимостью решения весьма экономически целесообразной технологической задачи - получение спирта с вовлечением нетрадиционного вида сырья.

Методы исследования. Экспериментальные исследования степени гидролитического расщепления инулина топинамбура проведены на основе сопоставления данных с инулином фирмы «Мерк».

Массовую долю инулина и инулиназную активность ферментных препаратов определяли по Бертрану, содержание фруктозы в ходе гидролиза резорциновым методом. Количество клеток в процессе сбраживания определяли подсчетом в камере Горяева. Содержание токсичных примесей устанавливали га-зохроматографическим методом на калонке НР РААР 50т 0,32тт. Для выяснения особенностей биокинетических закономерностей гидролиза инулина применены методы математического моделирования.

Научная новизна работы заключается:

• в подборе биокаталитической системы инулин-фермент, позволяющая осуществить ускоренное гидролитическое расщепление полисахарида инулина на фруктозу;

• выявлены оптимальные условия действия, впервые нами использованного ферментного препарата на гидролиз полифруктанов;

• изучены механизмы действия ферментных препаратов Fructozyme L и Aspergillus awamori на гиролитическое расщепление полифруктанов;

• разработана технология серийного получения спирта ректификованного из топинамбура;

• проведена оптимизация процесса гидролиза полифуктанового сусла на основе методов математического планирования.

Теоретическая и практическая ценность заключается в том, что развитые в работе подходы сравнительного изучения гидролиза инулинсодержащего сырья ферментами экзо- и эндодействия показали специфичность действия их на инулинсодержащее сырье. Разработана технологическая схема биосинтеза этанола из топинамбура, обеспечивающая завершение гидролиза полифруктанов за 40 минут и заметное улучшение качества бражки и целевого продукта.

В результате проведенных исследований достигнуто сокращение сбраживания сусла топинамбура на 12-18 часов.

Апробация работы. Основные результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на П Всероссийской научно-практической конференции «Химическое загрязнение среды обитания и проблем экологической реабилитации нарушенных экосистем», (Пенза, 2004); П Международной научно-практической конференции «Прогрессивные технологии и оборудования для пищевой промышленности» (Воронеж, 2004); III Московском международном конгрессе по биотехнологии «Состояние и перспективы развития» (Москва, 2005); VI Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 2005); Региональной научно-

практической конференции «Совершенствование технологических процессов пищевой и легкой индустрии» (Махачкала, 2005); конференциях профессорско-преподавательского состава Дагестанского государственного технического университета (Махачкала, 2002-2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 5 статьи и 1 тезис доклада.

Структура и объем: Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, вывода и приложений, иллюстрирована 13 рисунками, содержит 20 таблиц и список использованной литературы из 125 наименований работ отечественных и зарубежных авторов.

Основное содержание работы Глава I. Литературный обзор

В первой главе представлен аналитический обзор отечественной и зарубежной научно-технической литературы в области исследований топинамбура с позиции его пищевой и биологической ценности, эффективности использования его как нетрадиционного вида сырья для производства этилового спирта.

Показана особенность биохимического состава топинамбура в зависимости от почвенно-климатических факторов, способа хранения и изменений, происходящих в его углеводном комплексе в зависимости от режимных параметров хранения.

Приведен анализ литературных данных по способам подготовки топинамбура к сбраживанию, по характеристике дрожжей, а также режимных параметров сбраживания. Обоснована экономическая эффективность производства этилового спирта из топинамбура.

Глава II. Экспериментальная часть и обсуждение результатов

Во второй главе дано описание объектов и методов исследований. В качестве объектов исследований использован топинамбур весеннего и осеннего сборов (2004-2005 гг.) Южного региона, ферментные препараты из Aspergillus awamori 2250 и инвертаза, обладающая инулиназной активностью из Kl.marxianus, а также Fructozyme L («Novozymes», Дания). Для сбраживания топинамбура были применены дрожжи Saccharomyces cerevisiae раса ВГШ-2, термотолерантные дрожжи Т987, а также дрожжи Kl.marxianus у-303.

Состав топинамбура, изменения, происходящие в нем в процессе гидролиза и сбраживания, определяли с использованием следующих методов: массовую долю инулина и инулиназную активность ферментного препарата по методу Бертрана (полумикрометод), содержание фруктозы при гидролизе резорциновым (колориметрическим методом). Ход брожения контролировали по газовыделению. Контроль качества зрелой бражки проводили с использованием общепринятых в технологии спиртового производства методами.

Содержание токсичных микропримесей в дистилляте бражки определяли газохроматографическим методом на колонке HP FAAP 50 m 0,32 mm.

Количество клеток микроорганизмов определяли путем подсчета в камере Тома-Горяева. Количество дрожжевых клеток в 1 см3, содержание в них клеток с гликогеном, процент почкующихся и мертвых клеток определили микроско-пированием пробы.

2.1. Исследование свойств, физико-химических показателей ферментов.

Специфичность действия ферментного препарата Fructozyme.

Изучены свойства и инулиназная активность ферментного препарата, который представляет собой смесь экзоинулиназы (ЕС 3.2.1.80) и эндоинулиназы (ЕС 3.2.1.7), выделенных из селекционных штаммов культуры Aspergillus niger, что и определяет особенности процесса гидролиза, отличающие его от других

ферментных препаратов, используемых для гидролитического расщепления инулина.

Инулиназную активность ферментов определяли, используя в качестве субстрата 2% раствор инулина фирмы «Merk» (Германия). Гидролиз проводили при температуре 50°С, pH 4,7 в течение 20 минут. Об активности фермента судили по накоплению редуцирующих веществ, которые определяли по Бертрану. За единицу инулиназной активности принимали такое количество фермента, которое катализирует образование 1 мкМ редуцирующих веществ за одну минуту.

Для определения оптимальных условий действия ферментных препаратов гидролиз инулина проводили в интервале pH 4,0-6,0 и температур 45-60°С при дозировке ферментов 2 ед/г инулина в течении 30 - 60 минут. Характеристика используемых ферментных препаратов приведена в табл. 1.

Таблица 1

Характеристика ферментных препаратов

Наименование Инулиназная Оптимальные значения РВ,

№ ФП активн., ед/мл pH температура в%

1. Fructozyme 2360 5,5 55 4,5

2. Инулиназа A.awamori 800 4,2 60 4,3

3. Инулиназа Kl.marxianus 9260 5,0 55 3,2

С целью выявления наиболее эффективного ферментного препарата был проведен гидролиз кашицы из топинамбура с массовой долей инулина 12%. Гидролиз проводили при рН 5,5, при температуре 55 градусов в течение 40 минут. Как видно из таблицы ферментный препарат РгисШгуте обладает высокой инулиназной активностью, а так как он представляет собой смесь эндо- и эк-зоинулиназы, то процесс расщепления р-2,1 - фруктозидных связей в по-лифруктозидной цепи идет ступенчато

Инулин ► Инулиды ► Фруктоза

чем и объясняется небольшое первоначальное накопление редуцирующих веществ в процессе гидролиза за 40 минут (см.табл. 1). В процессе брожения идет дальнейшее расщепление инулидов до фруктозы, что и объясняет нормативный выход спирта.

2.2. Исследование способов подготовки топинамбура к сбраживанию. 2.2.1. Влияние водно-тепловой обработки на выход спирта.

С целью определения эффективного способа подготовки корнеплодов топинамбура к сбраживанию проводили исследования по развариванию топинамбура при различной температуре (табл. 2).

Таблица 2

Влияние термообработки сырья на выход инулина

Температура разваривания, °С Растворенный инулин, % Нерастворенный инулин, %

90 2,5 11,0

110 5,0 8,5

120 1,9 8,0

Наиболее интенсивно происходит накопление растворенного инулина в ходе разваривания топинамбура при температуре 110°С. Дальнейшее повышение температуры разваривания вызывает снижение содержания растворенного инулина в среде.

Подготовку топинамбура к сбраживанию осуществляли следующим образом: измельченные клубни смешивали с водой (гидромодуль 2:1), подвергали тепловой обработке при температурах 90,110,120°С в течение 20,40,60 минут. Осахаривание проводили ферментным препаратом РгисШгуше при рН среды 5,5 и температуре 55°С, который вносили в количестве 1-2 единиц инулиназной активности на 1 г условного инулина.

В охлажденный до 26-28°С затор вносили дрожжи ЗассЬаготусев сеге\ч81ае. Дрожжи вносили в количестве 10% к объему сбраживаемых проб. Брожение проводили в течение 66 час. при температуре 28-30°С. Ход брожения

контролировали по газовыделению взвешиванием бродильных проб. Параллельно осуществляли сбраживание топинамбура без предварительной тепловой обработки.

Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что наиболее интенсивно процесс брожения идет в первые 24 час. в пробах без тепловой обработки топинамбура, чем в пробах, подвергшихся тепловой обработке. Это вероятно можно объяснить тем, что при разваривании топинамбура инактивируются его собственные ферменты, поэтому гидролиз идет медленно. И в первом и во втором случае интенсивность брожения возрастает при добавлении ФП в количестве 2 единиц инулиназной активности на 1 грамм условного инулина. Анализ экспериментальных данных показал (табл.3), что максимальное накопление спирта наблюдалось в опытных образцах, которые были подвергнуты водно-тепловой обработке 57,14 дал/т условного инулина, без термообработки 43,43 дал/т условного инулина.

Таблица 3

Влияние термообработки на выход спирта

Показатели Условия сбраживания

с термообработкой без термообработки

1 ед./г 2 ед./г 1 ед./г 2 ед./г

Несброженные сахара,^ 00 см3 0,04 0,05 0,07 0,06

Несброженный инулин, г/100 см3 0,02 0 0,05 0,04

Нерастворенный инулин, г/100 см3 0,21 0,15 0,18 0,16

Выход спирта, дал/т условного инулина 54,57 57,14 30,9 43,43

2.2.2. Определение оптимальной дозировки ферментного препарата

Для определения оптимальной дозировки РгскЛогуте Ь были поставлены опыты по сбраживанию топинамбура. Предварительно измельченный топинамбур смешивали с водой в соотношении 2:1; смесь автоклавировали при температуре 110°С в течение 30 мин., ферментный препарат РгисЛогуте Ь вносили

10

при температуре 55-57 °С из расчета от 0,5 до 10 единиц инулиназной активности на 1 г инулина и проводили осахаривание в течение 40 мин., после чего замес охлаждали до 28-30 °С и задавали дрожжи 8. сеге^ае. Контролем служила проба без внесения фермента для осахаривания инулина. Величина титруемой и активной кислотности в начале брожения составила соответственно 0,1 и 5,5. Динамику процесса брожения исследовали в течение 72 ч. (рис. 1).

СО,, г/ч

0,9 г----. ----

0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 О

20 24 36 48 60 72

Рис. 1 Динамика сбраживании углеводов топинамбура дрожжами Б. сегех^ае при дозировке ферментного препарата РгисЮгуте Ь ед/г инулина 1 -0,5; 2-1; 3-2; 4-3; 5-10; 6 - без фермента

Результаты исследований представлены в табл. 4.

Таблица 4

Техно-химические показатели зрелой бражки при различной дозировке ферментного препарата

Дозировка Кислотность в конце Несброж. Нераств. Концен.

инулина, брожения сахара,% инулин, % спирта,

ед/г титруемая активная об.%

0,5 0,41 4,50 0,24 0,60 5,80

1 0,34 4,50 0,05 0.44 6,10

2 0,38 4,63 0,15 0,16 6.20

3 0,43 4,34 0,13 0,53 5,70

10 0,44 4,50 0,24 0 6,25

- 0,26 4,85 0,24 0,75 4,25

На рис. 1 видно, что скорость брожения возрастает при увеличении дозировки ферментного препарата, особенно в начальный период брожения. В процессе дображивания происходит доосахаривание остаточного инулина инули-назой. Однако достаточно высокая степень осахаривания в начальный период брожения мало сказывается на дальнейшем брожении. Как видно из результатов, представленных в табл. 4, при значительной разнице в дозировке ферментного препарата 2 ед/г и 10 ед/г инулина концентрация спирта в том и другом вариантах составляет 6,2 и 6,25 об.%, при этом содержание несброженных Сахаров 0,15 и 0,24% соответственно. Процесс брожения в первом случае проходит все стадии брожения: возбраживание, головное брожение и дображивание, при этом продолжается процесс ферментативного гидролиза инулина. Во втором случае идет интенсивное сбраживание топинамбура в первые 24 часа, а процесс доосахаривания замедляется, т.к. сказывается угнетающее действие продуктов брожения, о чем свидетельствует также величина титруемой кислотности в конце брожения. Следовательно, оптимальной дозировкой ферментного препарата можно считать 2 ед/г инулина, причем не только с технологической, но и с экономической точки зрения ввиду относительной дороговизны ферментных препаратов.

Таким образом, оптимальными условиями гидролиза инулина, содержащегося в топинамбуре, являются: температура 55 °С, рН среды 5,5, продолжительность гидролиза 40 мин., дозировка ферментного препарата 2 ед/г инулина.

3. Исследование состава летучих примесей бражки 3.1. Показатели качества зрелой бражки из топинамбура.

В своей работе мы исследовали бражку опытных проб по общепринятым показателям качества, а также по определению содержания летучих примесей методом хроматографического анализа на колонке НР РТАР 50 ш 0,32 шт. Хроматограммы, полученные в результате анализа перегонки бражек с использованием дрожжей 8хеге\^ае ВГШ-2, показали, что качественный состав

примесей бражки опытных образцов с тепловой обработкой и без тепловой обработки и при одинаковой дозировке 2 ед./г инулина идентичны, однако количественное содержание целевого продукта и соотношение примесных соединений при этом заметно отличаются (табл.5).

Таблица 5.

Качественная характеристика зрелой бражки из топинамбура

Наименование компонента Группа с водно.-тепл. обработкой без вод.-тепл. обработки

Этиловый эфир, мг/л эфир - -

Ацетальдегид, мг/л альд. 25,475 263,92

Ацетон, мг/л кетон 0,65941 0,774

Метилацетат, мл/л сл.эф - 2,6309

Этилацетат, мг/л сл.эф. 16,145 19,43

Метанол, мг/л % об. 0,026231 0,0255

Пропанол-1, мг/л сив.м. 259,48 72,842

Пропанол-2, мг/л сив.м. - -

Изобутанол, мг/л сив.м. 75,379 59,069

Бутанол, мг/л сив.м. 2,2897 1.9056

Изоамилол, мг/л сив.м. 240,08 77,75

Гексанол, мг/л сив.м. 0,35753 4,3099

Сумма сив.м. 577,5 215,88

Как видно, из таблицы, в образцах, не подвергшихся водно-тепловой обработке, высших спиртов накапливается меньше (215, 88 мл/дм3), что говорит о высоком качестве спирта, хотя при этом выход спирта ниже (табл. 3).

На наш взгляд, это объясняется тем, что при сбраживании сусла из топинамбура, не прошедшего стадию гидротермической обработки, т.е. с сохранённой активностью собственных ферментов сырья не были использованы асептики, т.к. известно, что применение формалина, низина ухудшают качество спирта.

В образцах же подвергшихся водно-тепловой обработке суммарное количество примесных побочных продуктов соответствует 577,59 мл/дм3 (табл.5). Это значит, что, несмотря на более высокий выход спирта (табл. 3), снижаются качественные показатели бражки - образуются вещества, угнетающе дейст-

вующие на спиртовые дрожжи. Здесь надо отметить, что дозировка ферментного препарата влияет на накопление высших спиртов: при использовании 0,5 ед/1 г инулина - 597,1 мл/дм3, 1 ед/1г инулина - 661,96 мл/дм3, 2 ед/1 г инулина - 577,59 мл/дм3,10 ед/1 г инулина - 439,59 мл/дм3.

3.2. Сравнительный анализ качественного состава бражки из топинамбура и зернового сусла.

Для сравнения в работе проводились эксперименты по сбраживанию сусла из ржи, прошедшего традиционную для отрасли обработку, т.е. измельчение, разваривание, осахаривание.

Хроматограмма раствора, полученная в результате перегонки ржаной бражки на содержание летучих примесей, показал, что качественный состав бражки, в отличие от образцов бражки из топинамбура, содержит пропанол-2, большее количество изобутанола, изоамилола и гексанола; поэтому в целом сумма высших спиртов составляет 622,93 мг/дм3 (табл.6).

Таблица 6

Сравнительная таблица показателей бражки из топинамбура и ржи.

Наименование компонента Группа Топинамбур (с вод.-тепл. обраб.) рожь (с развариванием)

Этиловый эфир, мг/л эфир - -

Ацетальдегид, мг/л альд. 25,475 12,068

Ацетон, мг/л кетон 0,65941 0,64341

Метил ацетат, мл/л сл.эф - -

Этилацетат, мг/л сл.эф. 16,145 13,999

Метанол, мг/л %об. 0,026231 0,00042536

Пропанол-1, мг/л сив.м. 259,48 95,414

Пропанол-2, мг/л сив.м. - 0,60752

Изобутанол, мг/л сив.м. 75,379 120,96

Бутанол, мг/л сив.м. 2,2897 1,2436

Изоамилол, мг/л сив.м. 240,08 398,54

Гексанол, мг/л сив.м. 0,35753 6,1652

Сумма сив.м. 577,5 622,93

Проведенные исследования качественных характеристик состава летучих примесей из топинамбура и ржи показали перспективность использования топинамбура для производства спирта ректификованного пищевого.

3.3. Влияние рас дрожжей на показатели бражки.

Анализ бражек на содержание летучих примесей свидетельствует о значительном влиянии технологических факторов (табл.3), а также рас дрожжей на процесс их образования. Несмотря на то, что, сусло из топинамбура является нетрадиционным для сбраживания спиртовыми дрожжами, засевные дрожжи выращивали на крахмалсодержащей среде. Для приготовление производственных дрожжей использовали крахмалсодержащее сусло с концентрацией сухих веществ 14-16%. Первый этап выращивания производственных дрожжей вели на стерильном сусле с концентрацией сухих веществ 7-8%, второй 12-13%, третий - 14-16%. Температура размножения 23-25°С, продолжительность 13 часов. Для сбраживания сусла из топинамбура использовали адаптированные к инулинсодержащей среде дрожжи: ЗассЬагошусез сеге^ае штамм ВГШ-2, Юуиуегописев тагаапиз у-303, ЗасЛаготусев сеге\^ае Т987. Хроматограммы растворов, полученных в результате перегонки бражек на содержание летучих примесей, показал, что качественный состав бражек идентичен, а по количественному содержанию микропримесей в спирте-сырце при использовании дрожжей БассЬаготусез сеге^ае ВГШ-2-накапливается меньшее количество высших спиртов (табл.7)

Таблица №7

Содержание микропримесных соединений в спирте-сырце при различных рас дрожжей

Наименование компонента Группа К. тагаапив У-303 в. сегет1ае Т987 Б. сегеч^ае ВГШ-2

Этиловый эфир, мг/л эфир 15,142 17,451

Ацетальдегид, мг/л альд. 65,067 550,81 25,475

Ацетон, мг/л кетон - - 0,65941

Этилацетат, мг/л сл. эф. 68,052 1,7195 16,145

Метанол, мг/л %об 0,0803 0.0782 0,026231

Пропанол-1, мг/л сив. м. 186,3 325,78 259,48

Изобутанол, мг/л сив. м. 317,06 125.92 75,379

Бутанол, мг/л сив. м. 5.0608 3,8249 2,2897

Изоамилол, мг/л сив. м. 570,12 224,91 240,08

Гексанол, мг/л сив. м. - 7,9909 0,35753

Сумма сив. м. 1078,5 688,42 577,5

Таким образом, оптимальными условиями производства этилового спирта из топинамбура, позволяющими вырабатывать максимальное количество спирта из единицы сырья при использовании ферментного препарата Ргийогуте Ь является: а) применение водно-тепловой обработки; б) дозировка ферментного препарата 2 ед инулиназной активности на 1 г инулина; в) применение дрожжей ВГШ-2.

3.4. Метод планирования эксперимента

В рамках поставленных в работе задач был проведен анализ оптимизации процесса гидролиза инулина методом планирования эксперимента. В качестве факторов были выбраны: температура (X]), рН среды (Х2) и дозировка фер-

ментного препарата Ргийогуте (Х3), а показателя - степень гидролиза инулина (V).

На основании предварительных экспериментальных данных по изучению рассматриваемого процесса, были выбраны следующие интервалы варьирования: для температуры: 45-60 °С, рН среды: 4-6 и дозировки РгисЮгуше: 1-3 ед/г. Поиск уравнения регрессии проводили с учетом эффектов парного взаимодействия: в виде полинома третьей степени:

У = Ь0+Ь, X, +Ь2х2+Ь! 2Х, х2+Ь 1, XI 2+Ь22х22+ Ь3х3+Ь , 3х, х3+Ь, , х, 3+Ь22х23 При планировании эксперимента использован ротатабельный план второго порядка Бокса-Хантера в рамках которого коэффициенты полинома определяются с разной степенью точности. При использовании ротатабельных планов второго порядка отпадает необходимость в постановке дополнительных параллельных опытов для оценки дисперсии воспроизводимости. Расчет коэффициентов регрессии и их дисперсия проводилась по соответствующей процедуре.

Значимость коэффициентов проверяли по критерию Стьюдента, а

адекватность полученных уравнений эксперименту - по критерию Фишера. В результате статистической обработки экспериментальных данных, отсева незначимых коэффициентов и проверки адекватности, получено следующее уравнение регрессии:

У = 27-13.8Х, - 3.95Х2 + 0.64Х3 + 0.29Х22- 2Х22 - 0,002Х,3 - 0,2Х23 Анализ уравнений регрессии позволяет выделить факторы, оказывающие наибольшее влияние на процесс гидролиза.

На рис. 2 (а,б,в) представлены трехмерные графики, отражающие закономерности процесса гидролиза в зависимости от различных факторов. Анализ соотношения (1) и вид рис 2 (а,б,в) показывает, что степень гидролиза инулина возрастает нелинейно с увеличением температуры и рН среды. Следует подчеркнуть, что максимумы полученных парабол в целом приходятся на исследуемую область (55,2 °С, рН среды 5,48).

в

Рис. 2. Зависимость степени гидролиза (% ) от:

а) температуры и рН,

б) температуры и дозировки РгисК)гуте;

в) рН и дозировки Ргийогуте

Выводы

1. Разработана высокоэффективная технология, позволяющая проведение ускоренного гидролиза, сокращение срока сбраживания, повышение качества и выхода спирта.

2. Изучены технохимические свойства и инулиназная активность ряда ферментных препаратов, обладающих гидролитической активностью, выявлены наиболее активные и селективные их формы.

3. Впервые нами использован для получения спирта ферментный препарат Ргийогуте Ь, значительно интенсифицирующий процесс гидролиза инулина с 3-х и более часов до 40 минут.

4. Изучен состав летучих примесных соединений бражки из топинамбура и установлено, что он зависит от способа подготовки сырья к сбраживанию и от способности к адаптации рас дрожжей.

5. На основе регрессионной модели, отражающей зависимость степени гидролиза инулина от трех факторов - температуры, рН и дозировки фермента, показано, что глобального минимума для заданных интервалов изменения всех трех параметров не существует; оптимальные значения I и 55,2 °С и рН » 5,48 процесса гидролитического процесса.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Керимова З.М., Исламова Ф.И. Топинамбур-высокоэкологичная и биоэнергетическая культура реабилитации и рекультивации загрязненных земель / II Всероссийская научно- практ. конф. «Химическое загрязнение среды обитания и проблем экологической реабилитации нарушенных экосистем». Сб. докл. Пенза: МНИЦ, 2004. С. 81-84

2. Вагабов М-З.В., Керимова З..М., Мальцева Т.В., Корнеева О.С. Применение ферментных препаратов с целью ускоренного гидролиза инулина при производстве этилового спирта // Биотехнология, 2003. № 1 С. 34-36

3. Корнеева О.С., Шуваева Г.П., Мальцева Т.В., Рутковская Т.Р., Керимова З.М. Биоконверсия инулинсодержащего сырья. / III Московский Международный конгресс по биотехнологии: «Состояние и перспективы развития». Сб. докл. Ч.П. Москва, 2005. С. 119

4. Корнеева О.С., Вагабов М-З.В., Керимова З.М., Мальцева Т.В Исследование ферментативного гидролиза инулина при производстве этилового спирта / II Международная научно-практическая конференция «Прогрессивные технологии и оборудования для пищевой промышленности» Тез. докл. Воронеж: ВГТА, 2004. С. 99-100

5. Корнеева О.С., Вагабов М-З.В., Керимова З.М., Мальцева Т.В. Использование инулинсодержащего сырья для получения спирта / VI Междун. симпозиум «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования». Сб. докл. Пущино: ВНИИССОК, 2005. С. 343-345

6. Вагабов 3-М.В., Керимова З.М., Мангуева З.М., Мурзаева П.Д Оптимизация ферментативного гидролиза в биосинтезе этанола из инулинсодержащего сырья /Регион, научно-практ. конф. «Совершенствование технологических процессов пищевой и легкой индустрии» Сб. докл. Махачкала: ДГТУ, 2005. С. 110-113

7. Способ производства этилового спирта из инулинсодержащего сырья. Вагабов 3-М.В., Корнеева О.С. Керимова З.М., Мальцева Т.В. Мангуева З.М. Положительное решение о выдаче патента РФ от 21.11.2005 г. по заявке №200413708613 (040341) от 20.12.2004 г.

s -

Формат 60x84 Гарнитура Тайме Бумага офсетная Тираж 100 Размножено Фирмой «Кит» г.Махачкала, ул.Ленина,21

»2 5 016

РНБ Русский фонд

2006-4 28915

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1 .Топинамбур - нетрадиционное сырье для спиртового производства.

1.2.Сравнительная характеристика кислотного и ферментативного способов гидролиза инулина.

1.3. Инулиназа микробного происхождения, физико-химические свойства и механизм действия.

1.4. Перспектива получения этилового спирта из инулиносодержащего сырья.

1.5. Характеристика дрожжей, применяемых для сбраживания топинамбура.

ГЛАВА II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Объекты и методы исследования.

2.1.1. Определение массовой доли инулина.

2.1.2. Определение инулиназной активности.

2.1.3. Подготовка сырья.

2.1.4. Культивирование дрожжей.

2.1.5. Методы контроля спиртового производства.

2.1.5.1. Определение активной кислотности.

2.1.5.2. Определение концентрации сбраживаемых углеводов.

2.1.5.3. Определение концентрации фруктозы (резорциновым методом).

2.1.5.4. Контроль осахаривания инулина.

2.1.5.5. Колориметрическое определение количества растворимых несброженных углеводов.

2.1.5.6. Газохроматографический метод определения этилового спирта и примесных соединений в бражке и в ректификованном спирте.

2.1.5.7. Органолептический метод оценки качества спирта ректификованного.

2.1.5.8. Микробиологический контроль.

2.1.6. Результаты исследований процесса ферментативного гидролиза.

2.1.6.1. Исследование свойств и физико-химических. показателей ферментов.

2.1.6.2. Влияние продолжительности гидролиза на накопление РВ в среде.

2.1.6.3. Влияние дозировки ферментного препарата. на степень гидролиза инулина.

Ф 2.1.6.4. Влияние температуры на эффективность осахаривания инулина.

2.1.6.5. Влияние начальной величины рН на гидролиз инулина.

2.1.6.6. Механизм действия инулиназ на инулин.

2.2. Исследование способов подготовки топинамбура к сбраживанию.

2.2.1. Влияние вводно-тепловой обработке топинамбура на выход спирта.

2.2.2. Определение оптимальной дозировки ферментного препарата РпкЛогуте Ь.

ГЛАВА III. ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТАВА ЛЕТУЧИХ ПРИМЕСЕЙ * БРАЖКИ ИЗ ТОПИНАМБУРА.

3.1. Показатели качественного состава микропримесей бражки.

3.2. Сравнительный анализ качественного состава летучих примесей бражки из топинамбура и из зернового сусла.

3.3. Влияние рас дрожжей на содержание микропримесей в спирте-сырце.

3.4. Метод планирования эксперимента. ф 3.5. Описание предлагаемой технологической схемы производства этилового спирта из топинамбура.

3.6. Расчет экономической эффективности производства спирта этилово-ректификованного.

ВЫВОДЫ.

Актуальность работы. Разработка технологии получения пищевых продуктов из нетрадиционных видов сырья с использованием ферментных препаратов приобретает все более широкое применение. Высокая специфичность ферментов требует подбора таких биокаталитических систем, в которых с одной стороны обеспечиваются достаточно высокая скорость протекающих процессов гидролитического расщепления полисахаридов, а с другой - вовлечение в систему высокопродуктивной нетрадиционной культуры, обеспечивающей получение целевых продуктов высокого качества с достаточно высокой рентабельностью.

Для решения поставленной задачи - биосинтеза этанола из инулинсо-дерлсащего сырья топинамбура использовались различные ферменты, которые имеют высокую гидролитическую активность и обеспечивают проведение процесса в рамках существующих промышленных технологий получения этанола из крахмалсодержащего сырья на основе серийного технологического оборудования.

Следует подчеркнуть, что процесс гидролиза полифруктанов в литературе освещен недостаточно, а имеющийся материал свидетельствует о низкой скорости гидролиза. Это, естественно, не позволяет осуществлять биосинтез этанола во временных рамках существующего регламента производства спирта ректификованного из крахмалистого сырья.

Поэтому исследования по выбору продуцента инулиназ, обоснование параметров гидролитического расщепления инулинсодержащего сырья, установлению факторов, влияющих на гидролиз полифруктанов, и организации производства спирта этилового ректификованного, соответствующего ГОСТу Р 51652-2000, является актуальной задачей.

Цель работы заключается в интенсификации гидролитического расщепления полифруктанов топинамбура с последующим ускорением процесса сбраживания сусла для производства этилового спирта ректификованного.

Для достижения этой цели были решены следующие задачи:

• осуществлен подбор ферментных препаратов, обладающих высокой инулиназной активностью;

• определены физико-химические характеристики исследуемых ферментных препаратов;

• изучено влияние степени гидролиза инулина на процесс брожения и на выход целевого продукта;

• установлена зависимость состава зрелой бражки от способа подготовки сырья и определены технологические параметров сбраживания от состояния используемых рас дрожжей;

• разработана высокоэффективная технология ускоренного получения этанола из топинамбура.

Объектами исследования являются процессы ускоренного гидролитического расщепления полифруктанов из сусла клубней топинамбура весеннего и осеннего сбора 2004-05 гг Республики Дагестан, а также и ферментные препараты различного механизма действия. Выбор данных биотехнологических систем обусловлен необходимостью решения весьма экологически целесообразной технологической задачи - получение спирта из нетрадиционного сырья.

Методы исследования. Массовую долю инулина и инулиназную активность ферментных препаратов определяли по Бертрану, а содержание фруктозы установливали фотоколориметрически резорциновым методом.В качестве стандарта при определении инулиназной активности ферментных препаратов использовали инулин фирмы «Merk». Количество клеток в процессе сбраживания определяли подсчетом в камере Горяева. Содержание токсичных примесей определяли газохроматографическим методом на колонке HP FAAP 50 m 0,32 mm.

Оптимизацию процессов гидролиза инулина из топинамбура проводили при помощи методов планирования эксперимента.

Научная новизна работы заключается в:

• подборе биокаталитической системы инулин-фермент, позволяющей осуществить ускоренное гидролитическое расщепление полисахарида инулина на фруктозу;

• выявлении оптимальных условий действия, впервые нами использованного ферментного препарата, для гидролиза полифруктанов;

• изучении механизмов действия ферментных препаратов Fructozyme L и Aspergillus awamori 2250 гидролитического расщепления полифруктанов;

• разработке технологии серийного получения спирта ректификованного из топинамбура;

• проведении оптимизации процесса гидролиза сусла на основе методов математического планирования эксперимента.

Теоретическая и практическая ценность заключается в том, что развитые в работе подходы сравнительного изучения гидролиза инулинсодер-жащего сырья ферментами экзо- и эндодействия позволили установить специфичность их действия на инулинсодержащее сырье.

Разработана технологическая схема биосинтеза этанола из топинамбура, обеспечивающая гидролиз полифруктанов за 40 минут и заметное улучшение качества бражки и целевого продукта.

В результате проведенных исследований достигнуто сокращение времени сбраживания сусла топинамбура на 12 часов относительно регламентного.

выводы

1. Разработана высокоэффективная технология, позволяющая проведение ускоренного гидролиза, сокращение срока сбраживания, повышение качества и выхода спирта.

2. Изучены технохимические свойства и инулиназная активность ряда ферментных препаратов, обладающих гидролитической активностью, выявлены наиболее активные и селективные их формы.

3. Впервые нами использован для получения спирта ферментный препарат Ргайогуте Ь, значительно интенсифицирующий процесс гидролиза инулина с 3-х и более часов до 40 минут.

4. Изучен состав летучих примесных соединений бражки из топинамбура и установлено, что он зависит от способа подготовки сырья к сбраживанию и от способности к адаптации рас дрожжей.

5. На основе регрессионной модели, отражающей зависимость степени гидролиза инулина от трех факторов - температуры, рН и дозировки фермента, показано, что глобального минимума для заданных интервалов изменения всех трех параметров не существует; оптимальные значения t и 55,2 °С и рН « 5,48 процесса гидролитического процесса.

6. Разработан способ получения спирта из инулинсодержащего сырья, на которую получено положительное решение Российского Агентства по патентам и товарным знакам о выдаче патента от 21 ноября 2005 года

1. Абелян В.А., Манукян Л.С., Африкян Э.Г. Получение фруктозо-глюкозного сиропа из инулинсодержащего сырья с применением иммобилизованных клеток дрожжей // Прикладная биохимия и микробиология. -1998. Т. 34. - №5. - С. 544-548.

2. Акопян Ю.Р. Разработка технологии получения фруктозного сиропа из топинамбура// Автореф. дис. канд. техн. наук. М., 1994. - 19с.

3. A.C. 1631070 СССР, МКИ С12 № 1/14, 9/24/ Павлова И.М, Нарсия Т.А, Калунянц К.А., Шаненко Е.Ф., Крименцова В.П., Зуниава Р.В., Слобод-кина Г.Б. -- №464700 213, Заявлено 06.02.89. 0пуб.28.02.91. Бюл. №12 -Юс.

4. Багаутдинова Р.И., Федосеева Г.П. Продуктивность и фракционный состав углеводного комплекса разных по скороспелости сортов топинамбура// Сельскохозяйственная биология. 2000. - №1. - С. 55-63.

5. Бархатов В.Ю., Мамедова Э.И. Рубан B.C. Способ гидролиза инулина топинамбура // Известия вузов. Пищевая технология. 1998. - №2-3. - С. 48-49.

6. Бобрик Л.Д., Гулий И.С., Лужко Г.А. Использование высоко- и низкотемпературного гидролиза для получения фруктозы из топинамбура // Топинамбур и топинсолнечник проблемы возделывания и использования: Тез. докл. П Всес. конф. — Иркутск, 1990. - С. 22.

7. Бобровник Л. Д., Лезенко Г.А. Углеводы в пищевой промышленности. -К.: Урожай, 1991.- 112 с.

8. Бобровник Л. Д. и др. Криосушка новый метод хранения топинамбура // Тез. докл. 3-й Всес. научн. - произв. конф.: "Топинамбур и топинсолнеч-ник - проблемы возделывания и использования". - Одесса. - 1991. - С. 118 119.

9. Бобровник Л.Д., Бахрина Т.Ю., Слюсаренко Т.П. и др. Витаминный состав топинамбура и его изменения в процессе технологической переработки // Деп. в АргоНИИТЭИПП 10.11.1988, №1948 пщ 88

10. Бобков П.К. Производство спирта из цикория и топинамбура. 1936

11. Вагабов М.З-В., Керимова З.М., Мальцева Т.В., Корнеева О.С. Применение ферментных препаратов с целью ускоренного гидролиза инулина при производстве этилового спирта / Биотехнология, 2003. №1 С.34-36

12. Варламов Т.П., Долгошеев A.M., Варламов А.Г., Зимин B.C. Технология и оборудование для глубокой переработки топинамбура: получение спирта // Тракторы и с/х машины. 1999. - №7. - с. 9-11.

13. Варламова К.А., Кошелев В.И., Серегин В.В. и др. Химический состав и пищевая ценность клубней некоторых сортов топинамбура // Проблемы возделывания и использования топинамбура и топинсолнечника: IV Межд. науч.-произв. конф. Воронеж, 1992. - с. 18-19.

14. Володин В.В., Брусов O.A. Углеводный состав клубней Helianthus tuberosus L // Мат. науч. конф. поев. 30-лет. Института биологии, 1992. -С. 9.

15. Вербина Н.М., Каптерева Ю.В. Микробиология пищевых производств. -М.: Агропромиздат, 1988. 256 с.

16. Геращенко И.Н. Исследование особенностей биосинтеза инулиназ бактериями.// Материалы научной конф. мол. ученых аспирантов и студ. Воронежская государственная технологическая академия. Воронеж, 1998. - С.97

17. Голубев В.Н., Мамонова Г.В. Сохранение качества клубней топинамбура // Хранение и переработка сельхозсырья. 1997. - №12. - С.20-23.

18. Голубев В.Н., Волкова Н.В., Кушалаков Х.М. Топинамбур, состав, свойства, способы переработки, области применения. М., 1995. - 82 с.

19. Голубев В.Н., Н.И.Пасысо, И.В.Волкова. Топинамбур пищевой, биоэнергетический и экологосберегающий ресурс. Хранение и переработка сельхозсырья. - 1994 г. - 5

20. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. М.: Высшая школа, 1988.- 80 с.

21. Гулый И.С., Донченко JIB., Карпович Н.С. др. Пектин, его свойства и производство (обзорная информация) // АгроНИИТЭИПП, 1992. Вып. 6. - 56 с.

22. Давидович С.М. Земляная груша. Сельхозиздат. М., 1957 стр.93

23. Донченко Л.В., Нелина В.В., Карпович Н.С. и др. Влияние температуры на экстрагирование пектина // Пищевая промышленность. 1988. -№6.-С.31.

24. Дудина И.С. Болезни и вредители топинамбура. М.: Пищевая промышленность. - 1935. - 85 с.

25. Жеребцов Н.А., Абрамова И.Н. Кинетика гидролиза инулина. Материалы 39 Отчетной научной конференции Воронежской Государственной технологической Академии за 2000 год, Воронеж, 2001. 4.1. Воронеж: Изд-во ВГТА. 2001, с.71-72.

26. Жеребцов Н.А., Корнеева О.С., Тертичная Т.Н. О механизме каталитического действия карбогидраз (обзор) /Прикладная биохимия и микробиология. 1999. -Т.З 5. --№2-С. 123-132

27. Жеребцов Н.А., Корнеева О.С., Тертичная Т.Н. О механизме расщепления (3-2,1 фруктозидных связей инулина инулиназой Aspergillus awamori 2250// Биохимия, 1995. - Т.60 -№1- с.158588

28. Зимин B.C., Варламов Г.П. Технико-экономическое обоснование переработки клубней топинамбура на порошок. АО "ВИСХОМ". - М: -1996. -27 с. Рук. деп. в ЦНИИТЭИтракторосельхозмаш 10.10.1996; 1640 - тс 96.

29. Зеленков В.Н., Шаин С.С. Многоликий топинамбур в прошлом и настоящем. Новосибирск, 2000. - 241 с.

30. Зимин B.C. Экономическая эффективность механизации возделывания и переработки топинамбура // Автореф. дис. канд. экон. наук. М., 1997.-19с.

31. Инулиназа Saccharomyces cerevisiae: выделение, свойства. Материалы 39 Отчетной научной конференции Воронежской Государственной технологической Академии за 2000 год, Воронеж, 2001. 4.1. Воронеж: Изд-во ВГТА. 2001, с.74-75.

32. Кахана Б.М. О полисахаридах в ортогенезе топинамбура, Растительные полисахариды. 1970, стр. 52-74.

33. Кахана Б.М., Арасимович Б.В. Биохимия топинамбура. Кишинев, 1974.-88 с.

34. Калунянц К.А., Рогов С.И., Кочеткова A.A. и др. способ получения фруктозного сиропа из топинамбура. A.c. №1596518. СССр.1989

35. Калунянц К.А., Шаненко Е.Ф., Рублева E.JI. и др. Некоторые свойства микробных инулиназ // Биосинтез ферментов микроорганизмами: Тез. докл. IV Всес. конф. Ташкент, 1988. - С. 80-81.

36. Корнеева О.С. Карбогидролизы; препаративныое получение, структура и механизм действия на олиго- и полисахарид. Воронеж. 2001. -183 с.

37. Клесов A.A., Березин И.Ф. Ферментативный катализ. ч.1 Специфичность ферментативного катализа. М.; изд-во Московского университета, 1980.-264 с.

38. Климовский Д.Н., Стабников В.Н. Технология спирта. М.: Пищепро-миздат, 1955, с.278

39. Крикунова JI.H., Шаненко Е.Ф., Соколовский М.В. Патент №2161652, 28.02.2000

40. Крикунова JI.H., Александрова М.М., Ильяшенко Н.Г., Шаненко Е.Ф. Патент РФ № 2144084, 10.01.2000 г.

41. Корнеева О.С., Вагабов МЗ.В., Керимова З.М., Мальцова Т.В., использование инулинсодержащего сырья для получения спирта /VI Межд. симпозиум «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования». Сб докл. Пущино: ВНИИССОК, 2005.С.343-345

42. Корнеева О.С., Жеребцов H.A., Тертичная Т.Н. О механизме расщепления гликозидных связей в олиго- полисахаридах под действием гликози-даз // Вестник ВГТА. Воронеж.гос.технол. академия, 1997. №2 - С.60-71

43. Куев B.JL, Паулина Я.Б., Гончаров Н.И., Ползитис В.Г.// Тез.докл. Все-союз. конф. «Достиж. биотехнол. агропром. комплексу», г.Черновцы,44.