автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Разработка биотехнологического процесса ферментативного гидролиза дрожжевой биомассы с целью получения биологически активных добавок

На правах рукописи

Серба Елена Михайловна

Разработка биотехнологического процесса ферментативного гидролиза дрожжевой биомассы с целью получения биологически активных добавок

Специальность 05 18.07 - Биотехнология пищевых продуктов (по отраслям)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институ I пищевой био1ехноло1ии» Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИГ1БТ)

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор, член-корр. РАСХН, лауреат премии Правительства РФ Поляков Виктор Антонович

Официальные оппоненты: Доктор технических наук,

профессор Кривова Анна Юрьевна Доктор биологических наук, профессор Воробьева Галина Ивановна

Ведущая организация: ГУ «Всероссийский научно-исследовательский институт пивоваренной, безалкогольной и винодельческой промышленности» Россельхозакадеми и

Защита состоится 15 декабря 2005 года в 1100 на заседании Диссертационного Совета К 006.036.01 по специальности 05.18.07 Всероссийско научно-исследовательского инсштута пищевой биотехнологии По адресу: 11 1033, Москва, Самокатная ул., д. 4 б.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИПБТ

Автореферат разослан 14 ноября 2005 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат технических наук -- ^— Погоржельская Н.С.

•ЩСр/73 1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. В настоящее время в структуре питания населения России преобладает углеводная пища при остром дефицше белка, пищевых волокон, незаменимых аминокислот, ни I аминов, микроэлементов и других биологически важных нугриентов Только половина населения России обеспечена минимально необходимой нормой пофебления белков (49 г/сутки). Мировой дефицит белка составляет около 15 млн тонн. Особенно остро ощущается недостаток животного белка, отличающегося высокой биологической ценностью В результате неправильного питания понижается резистентность населения к неблагоприятным факюрам, развиваются заболевания, сокращается продолжительность жизни

Поэтому одним из актуальных и перспективных направлений в решении проблемы коррекции питания для поддержания адапгивно-компенсаюрных механизмов организма человека является использование пищевых белково-аминокислотных добавок, способствующих повышению биологической полноценности продукюв питания, созданию сбалансированных продуктов и напитков функционального назначения

Дрожжевая биомасса является полноценным источником белковых веществ, аминокислотный скор которых приближается к животному белку, особенно по содержанию лизина Кроме того, наличие витаминов, ценных полисахаридов и микроэлементов позволяет рассматривать микроорганизмы как перспсктивные субстраты для получения биологически активных добавок.

Питательная ценность дрожжевой биомассы ограничена низкой доступностью внутриклеточных биополимеров для действия пищеварительных ферментов Для полноценною усвоения эюю субстрата необходимо разрушить клеточные С1енки дрожжей и перевести все содержащиеся в них биологически ценные высокомо окулярные полимеры в растворимые легко усвояемые соединения.

Одним из наиболее применяемых способов перерабо1КИ клеточной биомассы является метод автолиза. Однако этот метод недостаточно эффективен, энергоемок, так как требует проведения длительного процесса Состав автолизатов полностью зависит от качества и физиологической активности используемых дрожжевых клеток Вместе с тем известно о способности различных ферментативных систем разрушать клеточные стенки микроорганизмов

В связи с Э1им, проблема подбора активной мультиэнзимной системы, обеспечивающей интенсивный и глубокий I идролиз высокомолекулярных полимеров микробной биомассы, и создание эффективного биотехнологического процесса получения конкурентоспособных пищевых белково-аминокислотных добавок, весьма актуальна и перспекшвна. Реализация этого направления исследований позволит повысить удельный вес наукоемкой отечественной продукции на мировом рынке, произвести импортозамещение на отечественном рынке, т к. высокая цена биопрепаратов и добавок офаничивает их широкое применение в пищевой промышленности России

Цель и задачи исследования. Основная цель диссертационной работы состояла в разработке научных основ биотехноло! ии белково-аминокислотных обогатителей и биолошчески активных добавок (БАД) на основе энзиматического г идролиза высокомолекулярных полимеров дрожжевой биомассы, теоретическом и эксперимен/альном обосновании целесообра:/нрэди ^¿^жзования. полученных препаратов для повышения качества питания I БИБЛИОТЕК'

' ¿"ЭДН'

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи-

в провес £и анализ и исследовать биохимическую характеристику и гидролитическую способность ферментных препаратов различного спектра дейс!вия по отношению к структурным полимерам дрожжевой клетки;

• обосновать необходимость использования комплекса ферментов и осуществить скрининг эффективной ферментативной системы, гидролизующей белковые вещества и полисахариды дрожжевых клеток;

• исследовать влияние фермента тивнот о комплекса на процессы гидролиза биополимеров дрожжевой биомассы;

• исследовать влияние индивидуальных ферментов протеоли гическо1 о комплекса на степень гидролиза дрожжевого белка;

• разработать оптимальные условия и мультиэнзимную систему для направленного ферментативного гидролиза дрожжевой биомассы,

• разработать и испытать в производственных условиях биотехнологическии процесс ферменголиза дрожжевой биомассы с получением биологически активных добавок со специальными свойс!вами

Научная концепция работы состоит в разработке биока1алитических процессов целенаправленной трансформации высокомолекулярных полимеров дрожжевой биомассы на основе установления закономерностей и специфичности действия мультиэнзимных систем с целью получения ЬАД и белково-аминокислотных обогатителей пищи.

Научные положения, выносимые на защиту

• анализ и сравнительная характеристика гидролитической способности ферментных препаратов различн<)1 о спектра действия по отношению к структурным полимерам дрожжевой клетки;

• научное и экспериментальное обоснование целесообразности испочыования ферментов протеолитического и (3—тлюканазното действия для гидролиза белковых веществ нроюплазмы и полисахаридов клеточных стенок дрожжей,

• подходы к целенаправленной биотрансформации дрожжевой биомассы с получением ферменголизатов различного функциональною назначения;

• методологические принципы и обоснование направлений использования ферментолизашв дрожжевой биомассы

Научная новизна. Впервые теоретически и экспериментально обоснован состав ферментативного комплекса для гидролиза биополимеров дрожжевой клетки На основании сравнительных биохимических исследований I идролитической способности ферментных препаратов различной специфичное ж действия осуществлен скрининг эффективной мультиэнзимной системы, содержащей комплекс протеаз и р-глюканаз.

Впервые установлено влияние индивидуальных ферментов протеолитического комплекса (аминопептидазы, карбоксипептидазы. карбоксильной и сериновой протеиназ) на эффективность гидролиза дрожжевою белка Выявлен синергизм действия протеаз комплекса при биокатализе белковых полимеров

Установлена зависимость степени гидролиза белковых веществ протоплазмы дрожжей и полисахаридов клеточных стенок от концентрации вводимых протеаз и (5-тлюканаз.

Проведены сравни тельные исследования процессов гидролиза белковых полимеров дрожжевой биомассы при автолизе, ферменголизе и гетеролизе На основе установленных закономерностей биокатализа высокомолекулярных полимеров дрожжевой клетки разработан регулируемый процесс целенаправленной биотрансформации микробной биомассы с получением фермептолизатов ра«1ичного фракционного состава

Практическая значимость.

Разработаны оптимальные i ехнологическис параметры и подобран •¡ффектинный фермешативпый комплекс, обеспечивающие высокую степень г идролиза дрожжевой биомассы

На моделях дрожжей Saccharomyces cerevisiae и S. carlsbergensis разработана шбкая био технологическая схема энзиматического гидролиза дрожжевой биомассы с получением биологически активных добавок функционального назначения со специальными свойствами, позволяющая'

- интенсифицировать процесс гидролиза дрожжевой биомассы в 4-5 раз по сравнению с существующей гехнологией автолиза дрожжей;

- повысить степень гидролиза белка на 15-23%,

- в 2-3 раза увеличить содержание аминного азота и свободных аминокислот,

- получать биоло1 ически активные пищевые добавки с различными функциональными свойствами.

Разработана нормативная документация на технологический процесс и получаемую продукцию (ТИ, ТУ) Проведены санитарно-гигиенические и клинические испытания, получены Санитарно-эпидемиологическое заключение № 77 99 02.916 Д.001848.03 02 на пищевую добавку Протамин пищевой А и К, ферме] 1толизат дрожжевой Протамин - белково-аминокислотный обогатитель пищи, I игиенический сертификат № 72-Ц1 С-305 и Регистрационное удостоверение № 001374.1'.643.01 2000 на БАД к пище - нутрицевгик «Суперпротамин».

Теоретически и экспериментально обоснована целесообразность использования полученных препаратов в качестве БАД иммуномодулирующего действия и для повышения биологической полноценности продуктов питания, напитков и кормов.

Апробация работы. Основные результаты исследований представлены на Международной конференции «Вклад молодых ученых и специалистов в решении проблемы здорового пи1ания в XXI веке» (Москва, 1999 г.), 3-ем Международном Форуме но био типологии (С .-Петербург, 2001), 1-ом Международном конгрессе «Ьио1ехнология. Состояние и перспективы развития» (Москва, 2002); IV Международном форуме «Биотехнология и современность» (С.-Петербург, 2003), Научио-практической конференции «Наукоемкие и конкурентоспособные техноло1 ии продуктов питания со специальными свойствами» (Углич, 2003)

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 13 печатных работ

Струкгура и объем диссертации. Диссср1ация состоит из введения, обзора лшературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 214 источников, из них 98 иностранных работ, и 8 приложений Диссертационная работа изложена на 155 сфаницах компьютерною гекста содержит 24 таблицы и 17 рисунков

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследований

Исследования проводили в лабораторных, опытно-экспериментальных и промышленных условиях на базе отдела биотехнологии ферментных препаратов ГНУ ВНИИПБТ, Бердскою завода биопрепаратов, Тульского пивоварснно!о и Московского дрожжевого заводов.

Объектами исследований служили:

Фермешныс препараты (ФП) - источники протеаз и ß-ипоканаз, полученные осаждением тганотом или ультрафильтрацией из кулыурных жидкостей, а также готовые товарные формы ферментов различных производителей

Микроорганизмы - продуценты протеаз и ß-глюканаз: ипаммы микромицетов, полученные из музея чистых культур, а также собственной селекции 01дела биотехнологии ферментных препаратов ГНУ ВНИИПБТ.

Дрожжевая биомасса: дрожжи Saccharomyces cerevisiae в виде водно-дрожжевой суспензии (после культивирования и сепарации), в пастообразной форме и сухие, а также дрожжи рода S carlsbergensis, Candida utilis и Rodotorula sp

Методы исследований. В работе применены общепринятые и специальные физические, физико-химические, химические, биохимические, микробиологические. хроматографические (на аминокислотном анализаторе «Biotronik») и спекгрофотометричсские методы анализа

2.2 Результаты исследований

2.3 Скрининг эффективной ферментативной системы для гидролиза дрожжевой биомассы

Извесшо, чю клеточная стенка дрожжей имеет жесткую структуру и является прочным наружным покровом клетки [Долгов, 1981J В клеточных стенках обнаружено небольшое количество хитина, а непосредс1венно у цитоплазматической мембраны обнаруживают белковый слой Однако, основным структурным комноненюм клеточной стенки является глюкан, поскольку при его удалении она полностью разрушается Маннан находится главным образом во внешних слоях. Удаление маннана не изменяет общую форму клетки, полому он, видимо, несущественен для поддержания целостности клеточной стенки

Анализ структуры и состава дрожжевой клетки, научной и нашитой лжературы, а также результаты предвари 1ельных исследований показали, чю целесообразным являе1ся подбор комплекса ферментов протеолшическою и ß-1Люканазного действия, способных к глубокому гидролизу полимеров дрожжевой клетки в слабокислой ¡one pH, оптимальной для дейсшия внутриклеточных ферментов дрожжей

2.2.1.1 Сравнительная характеристика микробных протеаз различного происхождения по степени гидролиза белковых субстратов

Результаты проведенных сравнительных исследований гидролизующей способное!и 16 протеолитических ферментных препаратов (ФП) различного микробного происхождения по отношению к гемоглобину и дрожжевому белку показали, чю наибольшей протеолигическои активнооью обладали ФП, синтезируемые бактериями Bacillus subtihs и В. licheniformys, а также микро

мицетами Aspergillub oryzae, A terrícola, A. flavus (табл. ¡). Однако для бактериальных препаратов отмечено резкое снижение протеолитической способности при изменении рН инкубациоиной смеси в сторону кислых значений

Таблица 1

Характеристика препаратов прогеолитических ферментов ______по специфичности действия_______

Препараты/ ПС по гемо- Эффективность гидролиза дрожжевого

Продуцент глобину, ед /г белка

pH 4,0 рН5,5 Аминный азот, mi% % т идролиза

Автолиз - - 107 38,2

Протооризин/ 319,6 365,2 601 79,6

A oryzae 251

Амилоризин 111 ОХ/ 119,8 250,3 567 78,8

Л.oryzae 740-А2

Лмшюпротооризин / 806,5 949,7 644 81,0

A oryzae 387

Протофлавин/ 364,8 304,7 502 74,5

A flavus

Прото1ерризин/ 310,3 315,6 549 75,7

A terrícola

Прототшгмаусин/ 219,6 160,3 589 77,3

Rhisopus pygmauis

Протсаза С/ Acremo- 109,8 200,4 438 70,1

пшт chri/ogenum

Кислая протеиназа Б/ 733,1 601,7 380 67,8

Humicola lutea

Протосуб т илин/ 199,7 920,2 291 63,7

В subtilis

Протомезен герин/ 179,5 590,3 279 65,1

В mesentericus

11ротолихетерм/ 120,2 670,5 398 71,3

В hebemformis

БНЗ Enmex ' 210,5 650,0 281 26,9

В subtihus

Нсйтраза-Ыоуо^ушеч / 50,3 120,0 282 63,9

В subtihus

Алкалаза- Novozymes > 160 0 420,0 270 63,5

В subtihus

При гидролизе дрожжевого белка выявилось четкое различие между исследуемыми препаратами Ферментные препараты грибного происхождения более эффективно катализировали гидролиз микробного белка, чем бактериальные количество переведенною в растворимую форму белка составило 75,7-81,0 и 63,765,1% соответственно Высокую активность проявили все ферментные препараты, синтезированные Азрег§Шш> огугае. В результате ферментолиза амилопрото-оризином концентрация аминного азота в т идролизате возрастала более чем в 6 раз по сравнению с вариантом, где не использовались ферменты извне, а 1идролиз осуществлялся под действием собственных ферментов клетки (автолиз), и в 2 раза по сравнению с действием бактериальных протеаз Образовавшийся растворимый белок при воздействии грибных протеаз представлен, в основном, аминокислотами в свободной форме и низкомолекулярными пептидами, тогда как при гидролизе дрожжей бактериальными препаратами не достается такая глубина гидролиза

белок i идролизуется до пептидов различной молекулярной массы Об этом можно судить rio концентрации аминного азота и по данным аминокислотного анализа (шбл. 1,2).

1 аблица 2

Влияние препаратов протеолитических ферментов на аминокислошый cociaB

дрожжевых гидролизатов

Аминокислоты (АК) Кол-во общих АК, 1/100 i дрожжей Содержание свободных аминокислот после действия ферментных препаратов, т/1 ООг дрожжей

Амилопро-юоризин Амило-ризин Прото-оризин Протосубтилин Протолихетерм

АСП 3,72 0,46 0,36 0,41 0,34 0,38

ТРИ 1,79 0,36 0,27 0,33 0 0,11

СЕР 1,83 0,32 0,20 0,27 0 0,05

ГЛУ 6,54 1,75 1,28 1,49 1,42 1,35

ГЛИ 1,69 0,39 0,25 0,30 0 0

АЛА 2,80 1,50 0,90 1,32 0,83 0,79

ВАЛ 1,40 0,55 0,28 0,48 0 0,08

ЦИС 0,28 0,24 0,09 0,20 0 0

МРТ 0,45 0,41 0,28 0,35 0,20 0,25

изо 1,11 0,30 0,17 0,22 0 0

ЛЕЙ 2,23 0,95 0,46 0,76 0 0,05

ТИР 0,54 0,44 0,28 0,40 0 0,10

ФЕН 0,83 0,53 0,29 0,50 0 0,08

ЛИЗ 2,48 1,57 0,50 0,92 0,41 0,37

1ИС 0,63 0,26 0,17 0,21 0 0,10

АРГ 1,48 0,58 0,30 0,49 0 0,15

ПРО 1,55 0,54 0,31 0,50 0 0,10

Общее кол-во 31,35 11,15 6,46 9,15 3,20 4,06

% 100 35,6 20,6 29,2 10,2 13,0

Практически все исследуемые аминокислоты (АК) в той или иной степени высвобождались под действием грибных протеаз При применении протосубтилина в свободное состояние были переведены, в основном, только аспара1 иновая, глутаминовая кислоты, аланин, метионин и лизин, в то время как в результате прогеолиза протолихетсрмом высвобождалось большее количес!Во аминокислог микробною белка. Интересно отметить, что увеличение концентрации свободных АК в гидролизатах после действия амилопроюоризина происходило в основном, за счет глютаминовой кислоты, аланина, лейцина и лизина; при этом такие АК, как аланин, лизин, фенилаланин, тирозин, цистеин и метионин, были высвобождены на ■53-91% от их содержания в связанном состоянии Следовательно, под действием грибного комплекса не только повышается содержание свободных А К, но и улучшается состав растворимых аминокислот за счет более полного высвобождения незаменимых.

Общая концентрация свободных АК в полученном ферментолизате составила 11,15 г/100г дрожжей и, практически, в 3 раза превышала таковую в (идролизатах дрожжевой биомассы, полученных при использовании бактериальных препаратов протосубтилин (3,2 г/1 ООг дрожжей) и протолихетерм (4,06 г/100г дрожжей) Полученные результат подтверждакм данные о том, что в грибном протсолитическом комплексе присутствуют активные пегнидазы, гидролитующие микробный белок до аминокислот.

Таким образом, в результате проведенных исследований показано, что наибольшей способностью к глубокому шдролизу дрожжевого белка из исследованных ферментных препаратов протеолитического действия обладал ферментный препарат амилопротооризин, выделенный из A oryzae 387. 2.2.1.3 Получение комплексного ферментного препарата КФПА

нротеолшического и Ji-глюканазного действия С целью получения концентрированных ферментных препаратов были исследованы и подобраны оптимальные условия выделения мультиэпзимных препаратов с различным ферментативным составом из культуральной жидкости мутантною штамма микромицета A oryzae 387-4-1 и исходною ппамма 251

Для получения ферментного препарата Протооризин с преобладающей про 1 солитичсскои активностью использовали такое свойство протеолитического комплекса гриба Л oryzae, как устойчивость к низким значениям рН

Получение ФП категории очистки П Ох осуществляли методом осаждеггия ферменюв этиловым спиртом (96 % об ) из супернатанта культуральной жидкости (КЖ) Aspergillus oryzae, варьируя соотношение растворителя и супернатанта КЖ, при различных значениях рН. В результате были подобраны оптимальные условия получения концентрированных спиртоосажденных препаратов- рН 5,0 и соотношение этанол ■ КЖ 3 : 1 Выход препарата составил по протеолитической активности 90%, по р-глюканазе 85%

При ультрафильтрации супернатанта КЖ, предварительно прошедшего микрофильтрацию, использовали мембраны с полыми волокнами Характеристика ферментных препаратов (ФП) различной катеюрии очистки и концентрирования представлены в таблице 3

Таблица 3

Характеристика активности препаратов КФПА, полученных при различных

способах концентрирования культуральной жидкости Aspergillus oryzae_

Фермента! ивная акжвность, ед/г

Г Наименование ФП

A. oryzae 387-4-1 КФПА ПОх КФПА Г20х

КФИЛСФ

КФПА СК

КФПА СБ A. oryzae 251 Протооризин

Способ концентрирования

Осаждение спиртом Ультрафильтрация и вакуум-сушка Фильтр-пресс и распылительная сушка

Вакуум-выпарка и распылительная сушка Сушка биомассы

Осаждение спиртом из КЖ с рН 3,5

Прогеаз

1300 1800

220

640

58

615

(3-1 люканаз

680 450

115

120

35

0

Опытные партии комплексного ферментного препарата КФПА наработаны в промышленных условиях Бердского завода биопрепаратов.

Особое внимание уделялось изучению состава ферменшгивного комплекса, синтезируемого подобранным микроорганизмом (табл 4), что позволит определить сферу и производственно-экономические аспекты сю использования. Наличие ферментативного комплекса с широким спектром действия будет способствовать

эффективной конверсии высокомолекулярных полимеров микробного сырья при получении биологически активных добавок

Таблица 4

Биохимическая характеристика ферментативного комплекса концентрированных _препаратов (ФП) из Aspergillus oryzae 387-4-1

Наименование Ферменга

Активность ферментов в ФП, ед/г

КФПАПОх КФПА Г20х КФПА CK Прсггооризин

Общая активность pH - 4,0

pH - 5,5__

1350 1490

Протсиназы

Сериновая

Карбоксильная

Металлозависимая

Пептидазы

Лейцинамино-

Карбокси-

4,8 79,3 14,2

80,5 38,9

1920 2200

5,2 85,5 16,5

100,4 41,0

670 550

3,2 59,7 6,1

39,3 22,5

а-амилаза

Глюкоамилаза

Фосфотаза

ß-глюканаза

Ксилаиаза

Целлюлаза

1610 15 35 689 280 150

2700 23 32 455 390 120

450 0 0 120 95 41

В дальнейшем исследовали процессы биокагализа высокомолекулярных cipyKiyp дрожжевых клеток под действием КФПА Выявление роли гидролитических ферментов исследуемою комплекса в эффективности i идролиза микробного белка, создание оптимальных мультиэнзимных композиций и параметров катализа позволит получать пищевые добавки с высоким содержанием свободных аминокисло1 для повышения биологической ценности продуктов питания

2.2.2 Влияние ферментативного комплекса Aspergillus oryzae 387-4-1 на степень гидролиза биополимеров дрожжевой биомассы С целью получения легкоусвояемых АК смесей необходимо pa3pa6oiaib условия эффективного доступа протеолигических ферментов к белковым веществам протоплазмы дрожжевой клетки. Каркас клеточной стенки представлен несколькими слоями глюкана и маннана, между которыми локализованы комплексы псрифирических белков с полисахаридами [Бирюзова В И 1993; Kollar R., et al, 1995, Marcilla A, ct al, 1998] Поскольку клеточные иенки дрожжей представляют собой мноюкомпонентную структуру, в cociaB которой входят белковый, хитиновый, глюкановый, маннановый и другие компоненты, то в процессе фермента; ивно! о лизиса целесообразно использование комплексною фермент ною препарата с широким спектром действия

В результате проведенных работ нами отобран штамм Aspergillus oryzae 387-41, синтезирующий комплекс гидролитических ферментов, в составе которого наряду с протеолитическими ферментами присутствовали активные р-глюканазы, получен комплексный ферментный препарат КФПА и показана возможность гидроли ja дрожжевой биомасса. Не исключено, что установленная способность мульти-

жзимной системы микромицета к гидролизу микробных белков связана с наличием в ферментативном составе препарата сложною комплекса сопутствующих гидролитических ферменюв По-видимому, синергизм действия этих ферментов повышает эффективность гидролиза дрожжевой биомассы Для подтверждения данного предположения были проведены дополнительные исследования

2.2.2.1 Влияние индивидуальны* ферментов грибного иротеолитического комплекса на степень i идролиза дрожжевого белка

На первом этапе в модельных опытах исследовали вклад отдельных про т солит ических ферментов различной специфичности в гидролиз белковых веществ дрожжевой биомассы S cerevisiae

Проведена сравнительная оценка действия индивидуальных ферментов цротеолшическою комплекса микромицета A. oryzae на биохимический состав дрожжевого белка. Ферментативный 1идролиз осуществляли лейцинаминопептидазой, карбоксипептидазой, сериновой протеиназой, карбоксильной протеиназой и комплексом вышеперечисленных ферментов.

После этииматической трансформации дрожжевого белка в течение двух часов при 50°С резко повысилась массовая доля растворимой белковой фракции и степень ее гидролиза до пептидов и аминокислот (рис 1-3)

Использование карбоксильной протсиназы способствовало интенсивному растворению белковых веществ и образованию пептидов, однако не приводило к существенному высвобождению аминокислот Роль сериновой протеиназы в г идролизе дрожжевого белка была подобной, но несколько менее эффективной

Максимальная степень т идролиза белковых веществ наблюдалась под действием пептидаз, коюрые интенсивно высвобождали аминокислоты (18-22 % аминокислот от общего количества) и, особенно, всего протеолитического комплекса в целом (31%), что свидетельствует о существенном вкладе пептидаз в конверсию белковых веществ и синергизме действия протеаз. обладающих различной специфичностью.

2.2.2.2 Исследование оптимальных условий ферментативного гидролиза дрожжевой биомассы ферментами гриба Aspergillus oryzae

С целью подбора оптимальных условий для глубокой деполимеризации трудно I идролизуемых биополимеров клетки и создания регулируемого процесса получения аминокислотных смесей исследовали влияние ферментативного комплекса Aspergillus oryzae 387-4-1 на деградацию белковых веществ и почисахаридов биомассы дрожжей Установлена зависимость степени гидротиза от концентрации КФПА (рис.4)

Приведенные данные о глубине гидролиза белков и полисахаридов дрожжей показывают, что оптимальная дозировка амилопротооризина - Ю-15 ед ПС/г дрожжей; при этом в растворимое состояние переводилось 80% белка, высвобождалось 48-52% аминокислот, накапливалось около 5% аминного азота и образовалось 11% растворимых углеводов Дальнейшее повышение концентрации препарата до 20 ед ПС/г дрожжей существенно не изменяло степень гидролиза дрожжевых клеток

30

20

10

Лейцинамино-пелгцдаза

^ЩГ

л-,.

Карбокси-пептидаза

Карбоксильная протеиназа

Гидролизующие ферменты

ш- -жг-

Сериновая протеиназа

Смесь протеаз

Рисунок 1 - Образование свободных аминокислот в ферменюликпах белка

5

о.

100

80

£ 60

40

о.

20

Амино-пептмдаза

¡рВ

кя

«г..,.,

Карбокси-пептидаза

Карбоксильная протеиназа

Сериновая протеиназа

&

Смесь протеаз

Гидролизующие ферменты

Рисунок 2 - Степень гидролиза дрожжевого белка

«»¿г

•Ш

ш

ш

V'

*

Амино- Карбокси- Карбоксильная Сериновая Смесь протеаз

пептидаза пептидаза протеиназа протеиназа

Гидролизующие ферменты

Рисунок 3 - Содержание пептидов в ферментолизатах дрожжевого белка

о 5 10 15 20

Дозировка протеээ, ее» ПА/г дрожжей

Рисунок 4 - Зависимость степени гидролиза дрожжевой биомассы ог концен фации КФП: 1 - концен фация аминно! о азота;

2 - концентрация свободных аминокислот;

3 - концентрация РВ, 4 - процент I идролиза белка

Проведены сравнительные исследования различных способов гидролиза-автолиз, кислотный гидролиз и ферментолиз (табл 5). Наиболее высокое содержание свободных аминокислот в ферментолизатах дрожжевой биомассы приходилось на 1лутаминовую кисло гу, аланин, лизин, лейцин и ар1инин; их концентрация составила 8,5-34,5 мг/г дрожжей При этом в резулыате протеолиза из связанного в свободное состояние было переведено более 50% аминокислот, таких как, лизин, фенилаланин, тирозин, цистеин, метионин, аргинин, аланин, лейцин, гисгидин, валин и глутаминовая кисло га В ш же время в автолизате биомассы, полученном при воздействии собственных ферментов дрожжевой клетки, концен фация свободных аминокислот была в среднем в 7 раз ниже, чем в ферментолизате.

В кислотном 1идролиза1е дрожжевой биомассы, так же как в ферментолизате, более 50% аминокисло1 было переведено в свободное состояние, но это было достишуто, в основном, за счет аспара1 иновой кислоты, концентрация которой в 2,9 раза превышала таковую в ферменюлизате, а глутаминовой кислоты, треонина и глицина - соотве1Сгвенно в !,2; 1,5 и 2,9 раза. Конценфация же дру;их высвобожденных в результе кислотного гидролиза аминокислот была ниже, чем в ферментолизате: лизина - в 1,6 раза, аргинина - в 1,8; лейцина и изолейцина - в 1,4, мстионина - в 1,7; валина - в 2,5 и аланина - в 1 2 раза. Общее содержание в ферментолизате незаменимых аминокиелт, находящихся в свободной форме, н 1 3 раза превысило их количество в кислотном 1идролизате. Эю указывает на более высокую биологическую ценность аминокислотных смесей, получаемых при ферментативном гидролизе.

Таблица 5

Влияние ФГ1 амилопротооризина на глубину гидролиза дрожжевого белка

Аминокислоты (АК) Содержание свободных аминокислот, мт/г дрожжей

Общие АК Ферментолиз Кислотный гидролиз Автолиз

АСП 38.1 8.7 25.1 2.8

ТРЕ 17.4 7.1 10.4 27

СЕР 18.9 6.7 88 0.9

ГЛУ 66.0 34.5 42.2 53

ГЛИ 169 4.0 11.7 04

АЛА 28.9 20.8 16.9 1 6

ВАЛ 14.5 8.2 3.3 1 6

ЦИС 2.8 2.4 1.8 0

МЕТ 52 4.5 2.6 1.2

ИЗО 11.6 4.0 29 0.8

ЛЕЙ 23 5 13 5 9.5 0.4

ГИР 9.7 69 6.0 0.3

ФАЛ 10.9 9.0 10.5 0.1

ЛИЗ 25.9 17 1 10.5 3.2

ГИС 6.4 3.8 2.5 0.5

АР1 15 3 11.8 6.4 1 0

ПРО 16.0 6.0 8.6 0.6

Суммарное 328 0 169.0 179 7 23.4

количество АК

Из них незамени- 134 9 63.4 49.7 100

мых АК

Концен. своб. АК, - 52 55 7

% от общ. кол-ва

При исследовании влияния рН и длительности процесса на степень гидролиза дрожжевой биомассы амилопротооризин использовали в оптимальной концентрации из расчета 15ед ПС/г дрожжей Максимальная интенсивность I идролиза дрожжевой биомассы отмечалась в течение первых 5 часов действия фермента, оптимум рН 4,5-5,2, I - 50°С, при этом концентрация аминного азота составила 4,5 - 5,2 % (рис.5)

2.2.2.3 Подбор оптимальной мультиэнзимной композиции для

эффективного гидролиза дрожжевой биомассы Проведенные исследования показали, чго комплексный ФП амилопротооризин КФПА, содержащий наряду с протеиназами (карбоксильной, сериновой и мешлломвисимой) активные карбокси- и аминопептидазы. позволяет достигать глубокого I идролиза белков клеточной протоплазмы

Наличие в ферментативном комплексе сопутствующих гидролаз (о-амилазы, экзо- и эндо-Р-ьчюканаз), по-видимому, оказывает синер1 етическое действие на эффективность гидролиза дрожжевой биомассы. Для подтверждения этого предположения были проведены исследования с различными ферментативными сиоемами Характеристика использованных в работе ферменжых препаратов приведена в таблице 6.

О 12345678 pH

0 2 4 6 8 10 12 Время, ч

Рисунок 5 - Влияние рН (1) и длительности процесса (2) на накопление аминного азота при гидролизе дрожжевой биомассы КФГ1А

Таблица 6

Характеристика ферментных препаратов___

Активность ферментов в препарате, ед/г

ripenapai а- Про- Эндо-ß- Экзо-Р- Целлюлаза

амилаз теаза глюканаза глюканаза (ЦС)

а (ПС) (эндо-ß- (экзо-р-

(АС) ГкС) ГкС

КФПА 1200 1000 300 500 125

Протосубтилин 0 980 - - -

Кислая протеиназа Б 100 470 - - -

Нейтраза (Novozymes) 0 150 0 0 0

Проюоризин 0 510 0 0 0

I [ротолихетерм 120 600 50 57 21

Грибная амилаза 1200 0 0 0 0

11,елловиридин 0 130 158 170 635

Зимафилт (Enmex) 17 0 165 300 6

Брюзайм (DSM) 0 0 130 200 0

Из полученных данных видно, что по сравнению с КФПА такие препараты, как протосубтилин, прогооризин, нейтраза, кислая протеиназа Б, протлихетерм. обладаю! преимущественно про политической активностью; ФГ1 грибной амилазы проявляет только амиололигическую, а ФП зимафилт, брюзайм и целловиридин -Р-глюканазную активность. Все исследованные препараты использовали в различных комбинациях в модельных опытах по гидролизу дрожжевой биомассы 8 сегеуЫае.

Уиановлено, что наиболее высокая степень деструкции белковых веществ протоплазмы была достигнута в опытах, где использовали прогеолитические ферменты (протосубтилин, кислая протеиназа Б, протолихетерм, нейтраза, протооризин): в растворимое состояние было переведено 57 - 68% белков,

высвобождалось 136 - 285 мг% аминного азота (табл. 7) При этом содержание редуцирующих углеводов составило 0,92 - 1,12%, глюкозы - 0,01- 0,18% Наиболее эффективным гидролиз полисахаридов клеточных стенок дрожжей был при действии препараюв, содержащих а-амилазу и р-глюканазьг концентрация растворимых углеводов (1,45 - 1,60%) в среднем в 1,5-1,6 раза превышала таковую в гидролизатах с протеолитическими ферментами, однако степень растворения белков (9- 17%) и содержание аминного азота ( 91,0 -98,0 мг%) были низкими.

При воздействии комплексного препарата КФПА или смеси ферментных препараюв (протооризина как источника грибного протеолитического комплекса, р-глюканаз и целлюлазы) на дрожжевую биомассу достигнута более высокая степень гидролиза белковых и углеводных полимеров клеток, чем при использовании отдельно каждого из препаратов, обладающих определенной ферменташвной активностью Добавление к грибному комплексу ферментов бактериальной протеазы (протосубтилин) способствовало повышению глубины гидролиза белковых веществ и концентрации высвобождаемых аминокислот в свободной форме на 15%. Данные по составу и количеству свободных аминокислот в получаемых гидролиза1ах также подтвердили эффективность применения комплекса ферментов и синергизм их действия при гидролизе белков и полисахаридов дрожжевой клетки

Таблица 7

Гидролиз дрожжевой биомассы различными __ферментативными системами__

llpcnapai Характеристика [идролшаюв дрожжей после действия ФП

(ФИ) СВ, Раствори- Глюкоза, Аминный Раствори- Степень

% мые угле- % азот, мг мый гидролиза

воды, % % белок,% белков,%

КФПА (АП) 8,6 1,74 0,58 307 38,9 83

Проюсубтилин (ЫТ) 7,6 0,92 0,01 136 26,5 57

Кислая протеаи Б 7,8 1,00 0,12 185 28,2 60

Проюлихетерм (ПП) 7,9 1,08 0 09 190 27,5 60

Ней граза (БП) 7,5 0,96 0,01 141 26,6 57

Протооризин (ГП) 8,3 1,12 0,18 285 32,0 68

Грибная амилаза (ГА) 6,4 1,45 0,01 91 4,1 9

Целловиридин (ЦС) 6,6 1,60 0,50 98 8,1 17

Брюзайм (fJ-ГкС) 7,2 1,65 0,53 105 10,6 22

АП+БП 9,0 1,74 0,56 329 39.8 85

ГП+ Р-ГкС +ЦС 8,8 1,78 0,64 318 39,1 84

2.2.2.4. Гидролиз дрожжевой биомассы различного происхождения подобранным ферментативным комплексом

Действие КФПА и подобранные оптимальные условия подтвердились и при ферментативной конверсии белковых полимеров дрожжевой биомассы S carlsbergenesis, Rodotorula sp. и Candida utilis (табл.8)

Наиболее легко шдролизуемыми являются кормовые и хлебопекарные дрожжи В результате воздействия амилопротооризина на белок лих микроор! анизмов высвобождалось 60-61% свободных аминокислот, в то время как при тидролизе пивных дрожжей это! показатель составлял 42%

Таким образом, установлена целесообразность использования

мулыиэнзимных препараюв, проявляющих не менее трех ферментативных

активностей, таких как прогеиназная, пепгидазная и Р-глюканазная. Подтверждена эффективность гидролиза биомассы дрожжей новым комплексным ферментным препаратом КФПА (продуцент А. огугае 387-4-1) и подобраны оптимальные условия ею действия. Содержание наряду с протеиназами активных карбокси- и аминопептидаз позволяет достигать высокой степени гидролиза белков, а наличие в ферментативном комплексе сопутствующих гидролаз обеспечивает расщепление высокомолекулярных полисахаридов биомассы дрожжей, что повышает биологическую ценность получаемых гидролизатов.

Iаблица 8

Влияние КФПА на образование свободных аминокислот в гидролизатах

различных видов дрожжей

Амино- Содержание аминокислот в гидролизатах дрожжей, г/100г

кислоты 8 сегеу1з1ае 8 сапзЬе^егшя С ибНв ЯоскЛогЫа яп

(АК) общих Своб общих Своб Общих Своб Общих Своб

лен 5 48 4.23 3.75 0.70 3.15 1.25 4,01 2,10

ТРЕ 2.83 1 2 1 79 0 62 1.72 1 18 1,90 0,95

СЕР 2 96 1 43 1.86 0.55 2.15 1.25 2,05 1,18

ГЛУ 7.64 3.20 6 50 1.98 5.50 2.15 6,03 2,05

гли 0 84 0.40 1.70 0.45 1.74 0.85 1,05 0,60

АЛА 3.37 1 84 2 80 1.65 2 50 1.30 1,80 0,90

ВАЛ 2.71 1 53 1.45 0.79 2.00 1 41 2,10 1,35

ЦИС 0.40 0.20 0.24 0 28 0.40 0.28 0,39 0,26

МЕТ 0 70 0 47 0.46 0.44 0.94 0 60 0.69 0,45

ИЗО 2.24 1.36 1.10 0.40 1.54 1.23 1,36 0,98

ЛЕЙ 3.95 3 64 2 28 1.10 2.98 2.05 2,67 1,95

ТИР 3 03 1.70 0.89 0 65 1.11 0.67 1,53 0,70

ФАЛ 2.21 1.77 0.93 0.72 1.70 1.42 1,65 1,05

ЛИЗ 3 91 3 03 2 50 1.40 2 59 1 80 2,35 1,59

I ИС 0.52 0.31 0 62 0.28 0.81 0.57 0,65 0,31

АРГ 2 68 1.87 1.48 0.70 1.86 1.50 1,67 1,00

ПРО 1.93 0.43 1.56 0.59 1.77 1.15 1,69 1,05

Общее

кол-во АК 47.10 28.61 31 91 13.30 34.46 20.66

Свободн. АК, % 100 61 100 42 100 60

2.2.3 Исследование процесса и разработка технологических параметров знзиматического гидролиза дрожжевой биомассы

Па основе установленных закономерностей и механизма действия различных ферментативных систем на высокомолекулярные полимеры микробною сырья разработаны научные принципы направленною энзиматического гидролиза дрожжевых клегок. Показана возможность получения ферментолизатов дрожжевой биомассы с различной степенью деструкции белковых веществ протоплазмы, полисахаридов клеточных стенок и нуклеиновых кислот в зависимости от используемого ферментативного комплекса Наибольшей гидролитической способностью по отношению к полимерам клетки обладал комплексный ферментный препарат амилопротооризин (КФПА).

Целью настоящих исследований явилась оптимизация процесса знзиматического гидролиза дрожжевой биомассы амилопротооризином и разработка технологических параметров производства

2.2.3.1 Исследование физико-химических методов обработки дрожжевой биомассы на эффективность процесса гидролиза

На данном этапе испьпаньг различные технологические приемы подготовки дрожжевой биомассы и параметры ферментативного гидролиза дрожжевых клеток-предвари 1Сльный термолиз исходной дрожжевой суспензии (85-90°С; 15 мин) и проведение фермент олиза гемолизированных клеток, - плазмолиз клеток в присутствии хлористого натрия (2 ч при 50°С) и проведение автолиза или гетеролиза.

О степени гидролиза дрожжевых клеток судили по нарастанию аминного азо!а Как следует из результатов, приведенных на рисунке 6. наибольшее накопление аминною азота о [мечено в опытах, где был применен термолиз субстрата (кривая 2) Уже к 4 часам гидролиза концентрация аминного азота возросла практически в 10 раз по сравнению с вариантами, где был применен плазмолиз, и составила 252-256м1% прошв 21-28мг% Максимальное накопление аминною азота (627мг%) было достигнуто к 10-14 часам гидролиза и дальнейшее продолжение процесса не существенно влияло на степень деструкции дрожжевой клетки (на 18 часов -692мг%) При ферментолизе дрожжевой биомассы, подвергнутой плазмолизу в прису1с!вии хлористого натрия, наблюдалось снижение скорости шдролиза клеток (кривая 3) К 14 часам процесса накопление аминного азота составило 403 мг%, что в 1,6 раза меньше, чем при ферментолизе биомассы, подвергнутой гермолизу, за этот же период Максимум аминного азота (711мг%) достигнут к 18 часам гидролиза.

В кон I рольном варианте, где осуществляли процесс автолиза дрожжевых клеток без дополнительною введения ферментов, к 18 ч гидролиза содержание аминного азота было ниже в 3 раза (210 мг% против 630 мг%), чем при ферментолизе Длительность процесса автолиза составила 30 ч, конечная концентрация аминною азота - 371 М1% Результаты но фермешативному гидролизу дрожжевой биомассы, предварительно подвернутой 1ермотизу или плазмолизу, к 24 ч были практически одинаковы уровень накопления аминного азота соо^етошовал 680 689 мг% Однако к 30 ч эффективность гидролиза дрожжевых клеток в вариантах с плазмолизом несколько возрастала, концентрация амин-Н01 о азота к окончанию процесса составила - 742 мг%, что на 18% превысило показатели ферментолиза термолизированных клеток Вероятно, это вызвано синергизмом дейс1вия высвобождаемых ферментов клетки и ферментов КФПА, в то время как при термолизе дрожжевой биомассы наряду с ослаблением и частичным разрушением клеточных с!енок происходит, по-видимому,инактивация собственных ферментов клетки. Однако скорость гидролиза высокомолекулярных потимеров термолизированных клеток под действием КФПЛ возрастала Поэтому в последующих экспериментах дрожжевую суспензию подвергали предварительному термолизу

2.2.3.2 Разработка техноло1ического процесса гидролиза дрожжевой биомассы подобранным ферментативным комплексом

Процесс фермен гативною гидролиза осуществляли в подобранных оптимальных условиях (температура 50 °С, рН 5,0) с использованием ферментного препарата КФПА, полученного в производственных условиях Бердского завода

10

15 20 Время, ч

30

—♦—Автолиз (1) -о-Термолиз + КПФА (2) —&- Плазмолиз + КПФА (3)

Рисунок 6 - Динамика гидролиза дрожжевой биомассы в процессе автолиза (1) и ферментативного гидролиза (2,3)

8 12 Длительность ферментолиза ч □ 5 ед ПС/г □ 7 ед ПС/г 010 ед ПС/г

Рисунок 7 - Зависимость накопления аминного азота в гидролише дрожжевой биомассы 01 дозировки КФПА и продолжительности процесса ферментолиза

1 - Молекулярная масса (ММ) более 10000 Д 2-ММ от 5000 до 10000 Д 3 - ММ 01 1500 до 5000 Д 4-ММ менее 1500 Д

а)

б)

Рисунок 8 - Фракционный сосшв ферментолизатов дрожжевой биомассы

после 4-х часового гидролиза (а) и 12-ти часового гидролиза (б)

биопрепаратп. Дрожжевую биомассу предварительно подвергали термолизу при 85"С в течение 15 минут.

Исследовали зависимость накопления аминною азота в гидролизатах дрожжевой биомассы от дозировки КФПА и продолжительности процесса ферменюлиза. Установлено, что при расходе амилопротооризина 10 ед ПС/i дрожжей процесс ферментолиза практически заканчивался к 12 ч и уровень накопления аминного азота сос1авил 640-660 мг% (рис 7). Снижение дозировки фермента до 7 ед ПС/г незначительно сказалось на степень гидролиза белковых веществ дрожжей, к 12 ч конценфация аминного азота достигла 600 мг% При снижении дозировки до 5 ед ПС/г максимум накопления аминною азота (640 мг%) был доегшнут юлько к 16 ч Таким образом, варьируя дозировкой ферментов и длительностью процесса гидролиза можно получав белково-амипокислотные смеси с заданным фракционным составом.

В дальнейшем расход амилопротооризина КФПА осуществляли из расчета 10 ед ПС и 5 ед р-I кС Процесс фермешагивного гидролиза проводили в течении 4 ч и 12 ч в оптимальных условиях Результаты исследований показали, что при 4-х часовом гидролизе высокомолекулярные полимеры дрожжевой биомассы переходят в растворимое состояние, концентрация аминного азот составляет 2,8% а с в , при 12-ти часовом гидролизе 5,1% ас в , содержание свободных аминокислот - 34 и 67% от общего количества белковых веществ соответственно

Фракционный состав ферментолизатов приведен на рис 8.

Полученные результаты указывают на возможность проведения регулируемою процесса ферментативного гидролиза дрожжевой биомассы с получением белково-аминокислотных смесей заданного состава.

Ферменюлизат тюслс 4-х часового гидролиза обладал хорошей растворимостью, достаточно высоким содержанием аминокислот и пептидов и может быть использован в качестве пищевой добавки (белково-аминокислотного обогатителя) для повышения биологической полноценности продуктов питания и напитков.

Проведение 12-ш часового гидролиза позволило получить препарат с высоким содержанием свободных аминокислот и низкомолекулярных пептидов Этот препарат может быть предложен в качестве биологически активной добавки, так как известно, что аминокислоты легко ассимилируются, всасываются в кровь и активизируют обменные процессы в организме человека. В результате была разработана биотехнолошческая схема ферментолиза микробной биомассы с получением препаратов различного функционального назначения (рис.9, 10). Для обеспечения необходимой степени и глубины гидролиза биополимеров дрожжевых клеток достаточно варьировать длительностью процесса и дозировкой ферментов

Гаким образом, создана научно обоснованная биотехноло] ия получения белково-аминокислотных пищевых добавок и БАД на основе ферментативною гидролиза дрожжевой биомассы. Разработаны и утверждены (ехнические условия № 9182-055-00334586-2002 и Технологическая инструкция на «Гидролизаг дрожжевой Протамин А и К», 1У № 9182-028-00334586-98 и I И на «Протамин пищевой - белково-аминокислогный обогатитель», 1У № 9182-034-00334586-99 и ТИ на ЬАД «Суперпротамин»

Условия ферментолиза микробной биомассы

Рисунок 9 -1 (роцсссуальная схема ферментативной конверсии микробной биомассы в пищевые и биологически активные добавки

2

Рисунок 10 - Технологическая схема получения ферментолизата дрожжевой биомассы

1 - реактор, 2 - расходный сборник раствора ферментов; 3 теплообменник; 4 - сепаратор; 5 - распылительная сушилка

2.2.3.3 Производственные испытания разработанного процесса ферментативного гидролиза дрожжевой биомассы

Разработанные [ехнологические процессы биоконверсии остаточных пивных и хлебопекарных дрожжей были апробированы в производственных условиях Тульского пивоваренного и Московского дрожжевого заводов.

Промышленная наработка ферментолизата хлебопекарных (Saccharomyces cerevisiae) или пивных дрожжей (Saccharomyees carlsbergensis) осуществлялась на установке, состоящей из реактора, 1де непосредственно проводили ферментолиз дрожжевой суспензии, теплообменника для охлаждения ферментолизата, сепараюра для о (деления непрогидролизованных фрагментов дрожжевой клетки и сушильных агрегатов для сушки готовой продукции (рис 10).

Концентрация аминного азога в юювых ферментолизатах дрожжевой биомассы составила 2,0-3,5% При этом степень 1идролиза белка хлебопекарных дрожжей достигала 80-85%, а пивных - 78-82% Помимо тидролиза белковых веществ протоплазмы ферментный npenapai амилопроооризин катализируе! расщепление полисахаридов клеточных стенок дрожжей. Содержание редуцирующих у!леводов в ферментолизатах хлебопекарных и пивных дрожжей составило 8,8-11,5% и 6,0-6,6%, соо!ветственно.

Таким образом, разработаны оптимальные техноло) ические параметры энзиматического шдролиза дрожжевой биомассы ферментативным комплексом амилопротооризина Производственные испытания подтвердили эффективность использования комплексного ферментного препарата амилопротооризин (КФПА) для ¡идролиза клеточных стенок и протоплазмы хлебопекарных и остаточных пивных дрожжей с получением аминокислотных смесей - пищевых и биологически активных добавок. Сравни!ельная характеристика технологий гидролиза дрожжевой биомассы существующим ранее методом автолиза и разработанным способом ферменголиза приведена в таблице 9.

2.2.4 Получение пищевых и биологически активных добавок на основе регулируемого процесса биокаталию дрожжевой биомассы и перспективы их применения в различных производствах

На основании разработанною способа энзима!ическо1 о шдролиза дрожжевой биомассы и проведенных производственных испытаний наработаны опытные партии пищевых и биологически активных добавок

Отличительной особенностью разработанного метода является то, что впервые осуществлена комплексная переработка дрожжевой биомассы под действием нового препарата КФПЛ. Метод основан па регулируемом процессе биока1ализа дрожжевых клеток с получением пищевых добавок «11ротамин» и Б АД «Суперпротмин» (рис 9)

Технологическая схема производства ферменюлизатов дрожжевой биомассы состоит из нескольких стадий'

1 Под1 о ювка дрожжевой суспензии и термолиз.

2 Фермента!ивный i идролиз дрожжевой суспензии.

3 Пастеризация полученною ферментолизата и его охлаждение

4 Получение добавок к пище и БАДр

• Прогамипа К (комплексного) путем сушки;

• Протамина А (с повышенным содержанием свободных аминокислот) путем сепарирования с последующей сушкой фут ага;

• 11ротамина - бслково-аминокислотного обогатителя пищи,

• БАД «С)пернротамин» в результате глубокого гидролиза дрожжевой биомассы

5 Упаковка и маркировка

Таблица 9

Сравнительная характеристика технологий гидролиза дрожжевой биомассы существующим методом автолиза клетки и разработанным способом ферментолиза, осуществляемого подобранным комплексом ферментов

Этапы Процесса Существующая технология автолиза Разработанная технология ферментолиза Достигнутый результат

Плазмолиз 2 ч, 50°С 0 Сокращение (на 2 ч)

Термолиз 0 15-20 мин, 85°С

Использование антисептиков и индукторов Формалин, т ганол и др Не используются Исключение химических реаген гов

1 (рименение КФ1IA Не применяется КФПА 10-15едПС/[ биомассы 5,0 ед Р-ГкС/г

Длшельносгь гидролиза, ч 24-48 ч 5-12 ч Сокращение времени на 19-36 ч

Степень гидролиза белка, % 58-70 81-85 Повышение глубины гидролиза белка

Аминный аюг, мг% 210-375 600-740 Увеличение содержания аминною азота

Свободные АК, % от обще1 о кол-ва 12-28 37-67 Увеличение содержания свободных АК

Конечные продукты Пищевые добавки Пищевые добавки и БАД Расширение функциональных свойств продуктов гидролиза

И roí о Создан регулируемый процесс, обеспечивающий интенсификацию производства в 4-5 раз, повышение степени гидролиза белка, получение добавок с различными функциональными свойствами

Эффективность разработанной биотехнологии ферменюлиза микробнои биомассы для получения биологически активных добавок различною функциональною назначения подтверждена в производстве'

• на основе энзиматического гидролиза остаточных пивных и хлебопекарных дрожжей разработана и внедрена биотехнологическая схема получения аминокислотных и витаминных БАД иммуномодулирующею действия для лечебно-профилакгического питания;

• разработаны условия и технологические параметры получения ферментолизатов дрожжевой биомассы в качестве добавок к пище белково-аминокислотных обогатителей для повышения питательной ценности и усвояемости продуктов питания и напитков (в производстве хлеба, крекеров, укрепляющих коктейлей).

• с использованием «Протамина» пищевою на основе экструзионных технологий разработан способ получения лечебно-профилактических продуктов сухих завтраков для укрепления и очищения организма и наработаны опытные партии,

• на основе ферментолиза хлебопекарных дрожжей получены пищевые добавки для ликероводочного производства с целью повышения и разнообразия органолептичсских достоинств напитков,

• на основе «мягкого» ферментативного гидролиза микробной биомассы разработаны новые лечебно-профилактические средства в косметологии

Использование аминокислотных добавок в пищевой промышленности позволяет повысить питательную ценность и усвояемость пищевых продуктов и напитков, улучшить их вкус и аромат, создать новые лечебно-профилактические средства

Проведенные клинические испытания БАД «Суперпрогамин» показали возможность сю использования в качестве иммуномодулятора для реабилитации ттостоперационных больных, для повышения сопротивляемости организма человека Положительное воздействие, оказываемое пищевыми добавками и БАД. на здоровье человека, качество продуктов и напитков делает разработанную биотехнологию социально и экономически целесообразной (рис 11)

Хирургическая косметология

• Нормализация белкового обмена

• Повышение усвояемости пищи

• Общеукрепляющее действие

• Улучшение структуры волос и ногтей

Фтизиопульмонология

• Повышение иммунного статуса и функциональной выносливости

• Улучшение обменных процессов

• Улучшение показателей печени

• Выраженный терапевтический эффект

• Снижение доз антибиотиков

Клиническая иммунология

• Хорошая переносимость

• Отсутствие побочных эффектов

• Повышение сопротивляемости организма к вирусным и бактериальным инфекциям

• Улучшение показателей крови, повышение содержания гемоглобина

Онкология

• Нетоксичный иммуномодулятор

• Повышение функциональной выносливости организма

• Улучшение обменных процессов

• Улучшение работы ЖКТ

Рисунок 11 - Медико-биологическая эффективность БАД Суперпрспамин в лечебно-профилактическом питании

ВЫВОДЫ:

1 Проведены сравнительные исследования гидролитической способности ферментных препаратов различного спектра действия по отношению к структурным полимерам дрожжевой клетки и осуществлен скрининг наиболее перспективных

2 Теоретически и экспериментально обоснован состав комплекса ферментов протеолитическою и Р-тлюканазною действия, необходимых для эффективною гидролиза белковых веществ и полисахаридов дрожжевых клеток.

3 Осуществлен скрининг активных продуцентов комплекса ферментов протеолитического и р-т лтоканазного действия и получен комплексный ферментный препарат КФПА, содержащий активные ггротеиназы, пептидазы и р-глкжаназы 1 [оказана способность КФ11А к глубокому гидролизу дрожжевой биомассы.

4 Исследовано влияние ферментов комплекса на степень гидролиза высокомолекулярных биополимеров дрожжевой биомассы.

Впервые установлено влияние индивидуальных ферментов прогеолитическою комплекса на эффективность гидролиза дрожжевого белка выявлена высокая гидролитическая способность пептидаз комплекса, а также синертизм действия аминопешидазы, карбоксипептидазы, карбоксильной и сериновой протеиназ.

Установлена зависимость степени гидролиза белковых веществ протоплазмы дрожжей и полисахаридов клеточных сгенок or концентрации вводимых прогеаз и р-глюканаз

5 Разработаны оптимальные условия и дозировки мультиэнзимной системы для осуществления регулируемого целенаправленного ферментативного гидролиза дрожжевой биомассы- 10-15 ед ПС, 5,0 ед Р-ГкС/i дрожжей, 50°С, 4-12 ч в зависимости от планируемых свойств получаемых ферментолизатов

6 На моделях дрожжей Saccharomyces cerevisiae и S carlsbergensis разработана и испытана в производственных условиях гибкая биотехнологическая схема лниматическото гидролиза дрожжевой биомассы с получением биологически активных добавок функционального назначения со специальными свойствами, позволяющая по сравнению с существующей технологией автолиза дрожжей

- интенсифицировать процесс т идролиза дрожжевой биомассы в 4-5 раз;

- повысить степень гидролиза белка на 15-23%,

- в 2-3 раза увеличить содержание аминнот о азота и свободных аминокислот; -получать биологически активные добавки с различными функциональными свойствами.

7 Полученные пищевые и биологически активные добавки конкурентоспособны по отношению к лучшим зарубежным аналогам; имтгортозамещение позволит экономить 0.5 млн рублей с 1 тонны продукта

8 Наработаны опытные партии пищевых добавок и БАД, исследованы их функциональные свойства, разработана нормативная документация и рецептуры новых биологически полноценных продуктов и лечебно-профилактических средств

Теоретически и экспериментально обоснована целесообразное 1ь использования полученных препаратов в качестве БАД иммуномодулирующего действия и для повышения биологической полноценности продуктов питания, напитков и кормов

Материалы диссертации опубликованы в работах:

1 Римарева JI В , Оверченко М.Б , Серба Е.М , 1 рифонова В В Сравнительная характеристика микробных протеаз по степени гидролиза белковых субстратов // Прикл биохимия, и микробиол - 1997 - I 33, №1- С 43-45

2 Rimareva L.V., Overchenko М В., Serba Е.М , Trifonova V.V.Comparative Characteri-

zation of Microbial Proteases by the Extent of Hydrolysis of Protein Substrates // Applied Biochemystry and Microbiology - 1997 - V 33, N 1. - P. 36-41.

3 Серба L M , Оверченко M Б , Трифонова В В Создание новых аминокислотных и

витаминных добавок для повышения биологической ценноеiи продуктов питания // Сб.. «Проблемы создания ггового поколения отечественных продуктов питания XXI в.» (8-11 09 98) - М , 1998 - С. 271-272

4 Серба Е М. Деструкция полимеров микробных клеток ферменшыми препаратами

иротеолитического действия // Межд. конф. РАСХН «Вклад ученых и специалистов пищ пром-ти в решении проблемы здорового питания в XXI в.» -М„ 1999,- С. 170-171

5 Оверченко М Б Ю , Трифонова В В , Серба Е.М . Поляков В Л Новые продукты питания на основе вторичного сырья пивоваренного производства // Пищевая пром-егь - 1999 - № 1,- С. 33-34.

6. Римарева JI.B., Оверченко М.Б., Серба Е.М., Фурсова Н В. Перспективы использования достижений современной биотехнологии в производстве продуктов повышенной пищевой и биологической ценности // Сб ■ «Проблемы и перспективы совершенствования производства пищевых продуктов с высокими потребительскими свойствами на основе улучшения качества животноводческого сырья» Вол1 оград, 2002 -Т Ш С. 57-61

7. Римарева Л.В., Оверченко МБ., Серба Е.М, Игнатова НИ, Тулякова ТВ, Фурсова Н.В., Пасхин А.Н. Использование комплексною препарата амилопротооризин (КФПА) для энзима шческого гидролиза дрожжевой биомассы. // Хранение и переработка сельскохозяйственного сырья 2002. -№ 10.-С 39-41.

8. Серба Е.М., Оверченко МБ., Поляков В.А. Перспективные биотехнологичсские процессы получения аминокислотных обогажтелей для пищевой промышленности // Сб 1-ый Международный конгресс «Биотехнология Состояние и перспекшвы развития» М , 14-18 октября 2002 i - М, 2002. - С. 371-372.

9. Serba L.M., Overtchenko М В., Polyakov V A Advanced biotechnological processes for obtaining amino acid enriching additives for food industry /1-st Int Congress "Biotechnology - state of the art, prospects of development".- M , 2002 - P 372

10 Римарева JI.B., Оверченко М.Б., Серба Е.М, Поляков В.А Перспективные биотехнологические процессы получения сбалансированных продуктов функционального назначения //IV Мсжд форум «Биотехнология и современность». Санкт-Петербург, 17-18 июля 2003 г - С -11, 2003 - С. 12-14

11 Rimareva L.V., Overtchenko М.В., Serba L M., Polyakov V A Advanced biotechnological processes for obtaining efficient enzyme preparations for hydrolysis of plant and microbial raw material //IV International Forum "Biotechnology and the present". Saint-Petersburg, 17-18 June 2003. - S -P , 2003, p 13-14

12 Римарева JI.B, Оверченко МБ, Серба EM, Игпаюва НИ Научные основы био!ехнологии продуктов повышенной биологической ценности Труды научно-практ Конференции «Наукоемкие и конкурентоспособные iехноло!ии продуктов питания со специальными свойствами» 11-12 сентября 2003 г., Углич

2003.-С,- 389-390.

13.Серба Е.М., Поляков В.А., Оверченко М.Б Разработка процесса фермешативною гидролиза дрожжевой биомассы с целью получения биологически активных добавок.//Сб. трудов III Межд Конференции «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» 15-16 ноября 2005 г., М - 2005.

»2 2 5 А е

РНБ Русский фонд

2006-4 24510

Введение.

1 Обзор литературы.

2. Экспериментальная часть.

2.1 Материалы и методы исследований.

2.1.1 Объекты исследований.

2.1.2 Методы исследований.

2.1.2.1 Культивирование микроорганизмов.

2.1.2.2 Определение ферментативной активности.

2.1.2.3 Изучение зависимости протеолитической и амилолитической активностей от рН и температуры.

2.1.2.4 Изучение степени гидролиза белковых субстратов.

2.2 Результаты экспериментов и их обсуждение.

2.2.1. Скрининг эффективной ферментативной системы для гидролиза дрожжевой биомассы.

2.2.1.1 Сравнительная характеристика микробных протеаз различного происхождения по степени гидролиза белковых субстратов.

2.2.1.2 Скрининг активных продуцентов комплекса ферментов протеолитического и р-глюканазного действия.

2.2.1.3 Получение комплексного ферментного препарата КФПА протеолитического и Р-глюканазного действия.

2.2.2 Влияние ферментативного комплекса Aspergillus oryzae 387-4на степень гидролиза биополимеров дрожжевой биомассы.

2.2.2.1 Влияние индивидуальных ферментов грибного протеолитического комплекса на степень гидролиза дрожжевого белка.

2.2.2.2 Исследование оптимальных условий ферментативного гидролиза дрожжевой биомассы ферментами гриба Aspergillus oryzae.

2.2.2.3 Подбор оптимальной мультиэнзимной композиции для эффективного гидролиза дрожжевой биомассы.

2.2.2.4 Гидролиз дрожжевой биомассы различного происхождения побранным ферментативным комплексом.

2.2.3 Исследование процесса и разработка технологических параметров энзиматического гидролиза дрожжевой биомассы амилопротооризином КФПА.

2.2.3.1 Исследование влияния физико-химических методов обработки дрожжевой биомассы на эффективность процесса гидролиза полимеров клетки.

2.2.3.2 Разработка технологического процесса гидролиза дрожжевой биомассы подобранным ферментативным комплексом

2.2.3.3 Производственные испытания разработанного процесса ферментативного гидролиза дрожжевой биомассы.

2.2.4 Получение получение пищевой добавки «Протамина» - белково-аминокислотного обогатителя и БАД «Суперпротамин» на основе регулируемого процесса биокатализа дрожжевой биомассы.

2.2.4.1 Биохимические и санитарно-гигиенические исследования белково-аминокислотного обогатителя - ферментолизата дрожжевой биомассы «Протамина» пищевого.

2.2.4.2 Клинические испытания БАД «Суперпротамин».

2.2.5 Исследования и испытания эффективности применения ферментолизатов дрожжевой биомассы в различных производствах.

2.2.5.1 Применение пищевой добавки - гидролизата дрожжевого

ПРОТАМИН» в хлебопечении.

2.2.5.2.Использование ПРОТАМИНА в ликероводочном производстве.

2.2.5.3 Использование ПРОТАМИНА при производстве сухих завтраков.

2.2.5.4 Применение Протамина в косметологии.

2.2.5.5 Использование Протамина для генерации дрожжей в спиртовом производстве.

2.2.5.6 Применение Протамина для повышения биологической полноценности сухого корма для собак с нормальной активностью.

3.Вывод ы.

В настоящее время в структуре питания населения России преобладает углеводная пища при остром дефиците белка, пищевых волокон, незаменимых аминокислот, витаминов, микроэлементов и других биологически важных нутриентов. Только половина населения России обеспечена минимально необходимой нормой потребления белков (49 г/сутки). Мировой дефицит белка составляет около 15 млн тонн. Особенно остро ощущается недостаток животного белка, отличающегося высокой биологической ценностью. В результате неправильного питания понижается резистентность населения к неблагоприятным факторам, развиваются заболевания, сокращается продолжительность жизни.

Поэтому одним из актуальных и перспективных направлений в решении проблемы коррекции питания для поддержания адаптивно-компенсаторных механизмов организма человека является использование пищевых белково-аминокислотных добавок, способствующих повышению биологической полноценности продуктов питания, созданию сбалансированных продуктов и напитков функционального назначения.

Дрожжевая биомасса является полноценным источником белковых веществ, аминокислотный скор которых приближается к животному белку, особенно по содержанию лизина. Кроме того, наличие витаминов, ценных полисахаридов и микроэлементов позволяет рассматривать микроорганизмы, как перспективные субстраты для получения биологически активных добавок.

Питательная ценность дрожжевой биомассы ограничена низкой доступностью внутриклеточных биополимеров для действия пищеварительных ферментов. Для полноценного усвоения этого субстрата необходимо разрушить клеточные стенки дрожжей и перевести все содержащиеся в них биологически ценные высокомолекулярные полимеры в растворимые легко усвояемые соединения.

Одним из наиболее применяемых способов переработки клеточной биомассы является метод автолиза. Однако этот метод недостаточно эффективен, энергоемок, так как требует проведения длительного процесса. Состав автолизатов полностью зависит от качества и физиологической активности используемых дрожжевых клеток. Вместе с тем известно о способности различных ферментативных систем разрушать клеточные стенки микроорганизмов.

В связи с этим, проблема подбора активной мультиэнзимной системы, обеспечивающей интенсивный и глубокий гидролиз высокомолекулярных полимеров микробной биомассы, и создание эффективного биотехнологического процесса получения конкурентоспособных пищевых белково-аминокислотных добавок, весьма актуальна и перспективна. Реализация этого направления исследований позволит повысить удельный вес наукоемкой отечественной продукции на мировом рынке, произвести импортозамещение на отечественном рынке, т.к. высокая цена биопрепаратов и добавок ограничивает их широкое применение в пищевой промышленности России.

Цель и задачи исследования. Основная цель диссертационной работы состояла в разработке научных основ биотехнологии белково-аминокислотных обогатителей и биологически активных добавок (БАД) на основе энзиматического гидролиза высокомолекулярных полимеров дрожжевой биомассы, теоретическом и экспериментальном обосновании целесообразности использования полученных препаратов для повышения качества питания.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• провести анализ и исследовать биохимическую характеристику и гидролитическую способность ферментных препаратов различного спектра действия по отношению к структурным полимерам дрожжевой клетки;

• обосновать необходимость использования комплекса ферментов и осуществить скрининг эффективной ферментативной системы, гидролизующей белковые вещества и полисахариды дрожжевых клеток;

• исследовать влияние ферментативного комплекса на процессы гидролиза биополимеров дрожжевой биомассы;

• исследовать влияние индивидуальных ферментов протеолитического комплекса на степень гидролиза дрожжевого белка;

• разработать оптимальные условия и мультиэнзимную систему для направленного ферментативного гидролиза дрожжевой биомассы;

• разработать и испытать в производственных условиях биотехнологический процесс ферментолиза дрожжевой биомассы с получением биологически активных добавок со специальными свойствами.

Основные результаты клинических испытаний БАД «Суперпротамина» приведены на рис. 16.

Хирургическая косметология

• Нормализация белкового обмена

• Повышение усвояемости пищи

• Общеукрепляющее действие

• Улучшение структуры волос и ногтей

Клиническая иммунология

• Хорошая переносимость

• Отсутствие побочных эффектов

• Повышение сопротивляемости организма к вирусным и бактериальным инфекциям

• Улучшение показателей крови, повышение содержания гемоглобина

Фтизиопульмонология

• Повышение иммунного статуса и функциональной выносливости

• Улучшение обменных процессов

• Улучшение показателей печени

• Выраженный терапевтический эффект

• Снижение доз антибиотиков

Онкология

• Нетоксичный иммуномодулятор

• Повышение функциональной выносливости организма

• Улучшение обменных процессов

• Улучшение работы ЖКТ

Рисунок 16 - Медико-биологическая эффективность БАД - Суперпротамин в лечебно-профилактическом питании

2.2.5 Исследования и испытания эффективности применения ферментолизатов дрожжевой биомассы в различных производствах

Подтверждена эффективность рационального использования полупродуктов и отходов бродильных производств в биотехнологии получения ценных пищевых добавок широкого спектра действия:

• на основе энзиматического гидролиза остаточных пивных дрожжей разработана биотехнологическая схема получения аминокислотных и витаминных добавок иммуномодулирующего действия;

• разработаны условия и технологические параметры получения ферментализатов дрожжевой биомассы в качестве пищевых добавок для повышения питательной ценности и усвояемости продуктов питания и напитков;

• с использованием экструзионных технологий разработан способ получения лечебно-профилактических продуктов - сухих завтраков для укрепления и очищения организма;

• на основе ферментолиза хлебопекарных дрожжей получены пищевые добавки для ликероводочного производства с целью повышения и разнообразия органолептических достоинств напитков;

• на основе «мягкого» ферментативного гидролиза микробной биомассы разработаны новые лечебно-профилактические средства в косметологии.

Перспективы и области применения ферментолизата дрожжевой биомассы представлены на рисунке 17.

Использование аминокислотных добавок в пищевой промышленности позволяет повысить питательную ценность и усвояемость пищевых продуктов и напитков, улучшить их вкус и аромат, создать новые лечебно-профилактические средства.

Гидролизат дрожжевой ПРОТАМИН - натуральная вкусо-ароматическая добавка, полученная на основе мягкого ферментативного

Рис. 17 Перспективы применения ферментолизатов дрожжевой биомассы гидролиза хлебопекарных дрожжей, содержит полный набор заменимых и незаменимых аминокислот, комплекс витаминов группы В, легкоусвояемые углеводы и белковые вещества.

ПРОТАМИН в качестве вкусо-ароматической добавки предназначен для пищевой промышленности при производстве хлебобулочных изделий, сухих завтраков, супов, соусов, ликероводочных изделий, а также в качестве вспомогательного средства ПРОТАМИН может быть использован в дрожжевом и бродильном производствах для стимуляции жизнедеятельности дрожжей, интенсификации биотехнологических процессов. Использование ПРОТАМИНА в пищевой промышленности позволяет повысить питательную ценность и усвояемость пищевых продуктов, улучшить их вкус и аромат.

Приведем основные перспективные направления применения аминокислотных и витаминных добавок - ферментолизата дрожжей «Протамин» в пищевой промышленности, показавшие целесообразность их использования в качестве пищевой добавки, положительно влияющей на физико-химические, органолептические и биохимические свойства целевых продуктов.

2.2.5.1 Применение пищевой добавки - гидролизата дрожжевого «ПРОТАМИН» в хлебопечении

При производстве хлебобулочных изделий ПРОТАМИН дозировали в количестве от 1 до 5% в зависимости от вида. При добавлении ПРОТАМИНА в замес сокращается процесс созревания теста, отмечается повышение подъемной силы дрожжей, которая составляла 35-38 минут против 40-45 минут в контроле (без добавления ПРОТАМИНА). В процессе созревания теста наблюдается более интенсивный газообмен, при этом изменяется показатель газообразующей способности дрожжей, который составил 1750-2000 мл С02 /г СВ в опытных вариантах, в то время как в контрольном он был равен 1000-1300 мл С02 /г СВ.

Использование ПРОТАМИНА при замесе теста позволяет уменьшить расход дрожжей на 30-50% , сократить длительность процесса созревания теста, улучшить органолептические и физико-механические свойства готовой продукции: повышается равномерная пористость изделий, увеличивается удельный объем хлеба и улучшаются физико-механические свойства мякиша. Введение ПРОТАМИНА способствует образованию более интенсивной окраски корки хлеба, создает более приятный вкус и аромат, ведет к уменьшению скорости черствения хлеба.

2.2.5.2 Использование ПРОТАМИНА в ликероводочном производстве

Использование ПРОТАМИНА осуществляют с целью повышения и разнообразия органолептических достоинств напитков. Введение

ПРОТАМИНА в водно-спиртовые растворы при купажировании ликероводочных изделий осуществляли в виде вкусо-ароматической добавки в количестве от 0,01 до 2% в зависимости от рецептуры изделия. Использование ПРОТАМИНА, содержащего растворимые углеводы, пептиды, аминокислоты, микро- и макроэлементы, позволяет смягчить вкус водок, бальзамов, придавая им большую насыщенность и тем самым повышая качество изделий. Это было подтверждено результатами дегустационных комиссий ВНИИПБТ.

ПРОТАМИН используется при приготовлении таких видов ликероводочных изделий, как: «Новэре», «Сибирская элитная люкс» /Ишимский винно-водочный завод/, «Солнечный камень» /ЛВЗ «Икалто»/, «Франт крепкая» /ЛВЗ «Фаюр-Союз»/, «Алеша», «Сергей» /Калужский ЛВЗ/, «Штрафная рота» /Калининградский завод шампанских вин/, «Тагайская легенда», «Боярин» /Уссурийский ЛВЗ/ и другие. Ликероводочные изделия, приготовленные по рецептурам, в состав которых входит ПРОТАМИН, пользуются повышенным спросом у покупателей.

2.2.5.3 Использование ПРОТАМИНА при производстве сухих завтраков

ПРОТАМИН рекомендуется к использованию в качестве вкусо-ароматической добавки в составе сухих экструзионных завтраков из зернобобовых, сухих концентратов для супов и соусов. Рекомендуемая доза от 5 до 20% в зависимости от рецептуры. Введение ПРОТАМИНА в состав экструзионных продуктов улучшает их вкусовые качества, сокращает расход или полностью исключает из рецептуры натриевую соль, улучшает ароматику готового продукта, придает ему грибной запах и вкус.

2.2.5.4 Применение ПРОТАМИНА в косметологии

Биологически активный аминокислотный препарат Протамин может быть использован в парфюмерно-косметической отрасли в составе косметических изделий для ухода за кожей и волосами.

Предварительная апробация этого препарата была проведена в клинических условиях; он использовался при приготовлении лечебно-профилактических лосьонов. При этом имел место положительный эффект: улучшалось питание кожного покрова головы и корневой системы волос.

Парфюмерно-косметической фирмой «Квадрига» разработан лосьон для волос Neotonus лечебно-профилактического действия. Его биологически активной основой является ферментолизат пивных дрожжей Протамин пищевой. Кроме того, в состав рекондиционера для волос вводят экстракты крапивы, хмеля, женьшеня и лаванды.

2.2.5.5 Использование ПРОТАМИНА в генерации дрожжей в спиртовом производстве

Введение ПРОТАМИНА, содержащего легко ассимилируемые дрожжами аминокислоты, углеводы и витамины, использовали в качестве вспомогательного средства для питания спиртовых дрожжей. Применение ПРОТАМИНА осуществляли в количестве 0,01-0,05% при приготовлении дрожжевого сусла. При этом отмечена интенсификация процессов размножения и развития дрожжевых клеток (увеличение дрожжевой биомассы в 1,5-2,0 раза по сравнению с контрольными вариантами), увеличение бродильной активности и продуктивности дрожжей в опытных вариантах на 20-25%. Все это способствовало сокращению длительности брожения на 30%.

2.2.5.6 Применение ПРОТАМИНА для повышения биологической полноценности сухого корма для собак с нормальной активностью

Разработанный нами совместно с сотрудниками отдела оборудования пищевой промышленности ВНИИПБТ сухой корм представляет собой сбалансированный продукт, приготовленный на основе натуральных природных компонентов с взаимодополняющими характеристиками. Содержит высококачественные белки, легкоусвояемые жиры и углеводы, незаменимые аминокислоты, необходимые витамины и минеральные вещества, что обуславливает высокую биологическую ценность этого натурального корма (табл.23).

Биохимический состав сухого корма для собак

Показатели Состав, %

1 2

Сырой протеин 16,1

Жир 6,3

Углеводы 47,6

Клетчатка 2,0

Зола 8,2

Минеральные вещества

Кальций 0,5

Калий 1,23

Фосфор 0,43

Натрий 0,83

Железо 0,06

Селен, мг % 0,2

Витамины, мг/кг

Бета-каротин 12,2

Тиамин (В 1) 6,2

Рибофлавин (В 2) 4,3

Пиридоксин (В 6) 5,8

Пантотеновая кислота (В 3) 17,2

Фолиевая кислота (В 9) 73,8

Никотиновая кислота РР 2,7

Биотин 27,4

Инозит 0,2

Эргостерин 21,5

Парааминобензойная кислота (Н 1) 4,9

Энергетическая ценность пищевая энергия, кДж/ЮОг 1524

Корм - продукт с широким спектром воздействия на организм собак, обладающий стимулирующим и общеукрепляющим действием. Способствует нормализации обменных процессов, выведению из организма шлаков и токсинов с одновременным подпитыванием клеток, активизирует имунную систему, повышая иммунитет и устойчивость к неблагоприятным факторам окружающей среды.

Корм содержит льняное масло с ненасыщенными жирными кислотами, которые благоприятно влияют на общее состояние животного, придают шерсти шелковистость и глянец, предупреждают воспалительные заболевания кожи, защищают слизистую оболочку желудка.

Биологически активной основой корма является Протамин биодобавка, полученная на основе остаточных пивных дрожжей, содержащая богатый набор легкоусвояемых аминокислот, в том числе незаменимых, которые повышают биологическую ценность и усвояемость белка корма, способствуют кальцификации костной ткани, поддержанию здоровой густой шерсти. Комплекс витаминов этой биодобавки (группы В, витамин РР, биотин, эргостерин, инозит и другие) благотворно влияет на рост и развитие животных, участвует в углеводном и белковом обмене, способствует развитию мышечной ткани и укреплению костей, оказывает влияние на кожный покров и центральную нервную систему. Содержащиеся в биодобавке олигосахариды — маннаны играют важную роль для поддержания здоровой микрофлоры кишечника, предупреждают нарушения пищеварения.

1.6. Заключение

Анализ научно-технической и патентной литературы показывает острую потребность человечества в биологически полноценной пищевой продукции и, несмотря на уже выявленные закономерности в области получения и применения белковых и аминокислотных обогатителей пищи растительного, животного и микробного происхождения, многочисленные исследования не дали окончательных решений, которые необходимы для создания эффективных технологий получения биологически активных добавок, содержащих легкоусвояемые пептиды и незаменимые аминокислоты. Специалистами многих стран ведутся интенсивные разработки по получению высокоактивных ферментных препаратов, содержащих богатый комплекс гидролитических ферментов, а также по созданию эффективных методов гидролиза белковых субстратов для повышения качества и биологической полноценности продуктов питания, для создания новых видов биологически активных добавок и лечебно-профилактических средств.

Изложенное подтверждает актуальность и перспективность данного направления исследований по разработке биотехнологических основ применения гидролитических ферментных препаратов в процессах получения белковых гидролизатов.

Обобщение литературных данных позволяет сделать следующие выводы:

• Подробно изучено структура и биохимический состав дрожжевой клетки; представленные данные свидетельствуют о перспективе использования биомодифицированной дрожжевой биомассы как источника полноценного белка, незаменимых аминокислот, ценных полисахаридов и витаминов для получения белково-аминокислотных обогатителей пищи.

• Существуют различные пути биотрансформации дрожжевой биомассы, из них наиболее изучен автолиз - энзиматический гидролиз под действием собственной ферментативной системы дрожжевой клетки, скорость которого, однако низка, длительность автолиза достигает 2448 часов.

• Проводятся исследования по ферментативному гидролизу дрожжевой биомассы, в основном бактериальными ферментными препаратами протеолитического действия, однако нет четких данных по влиянию различных дозировок ферментов, не достигнута высокая степень конверсии дрожжевой биомассы, полученный уровень не превышает и даже ниже, чем при автолизе клетки.

• Данные по изучению роли протеолитических ферментов и других гидролаз в процессах гидролиза клеточных стенок и белков протоплазмы дрожжей практически отсутствуют.

• В связи с многокомпонентной структурой дрожжевой клетки для эффективного гидролиза дрожжевой биомассы необходимы, в первую очередь, ферменты, расщепляющие полисахариды клеточных стенок и белковые вещества протоплазмы. • Перспективны исследования по скринингу и применению комплекса протеолитических, глюкано- и целлюлолитических ферментов микробного происхождения для глубокого гидролиза дрожжевой биомассы с целью получения аминокислотных смесей. В связи с этим основная цель настоящей работы состояла в теоретическом и экспериментальном обосновании энзиматического способа гидролиза дрожжевой биомассы под действием комплексных ферментных препаратов с заданными свойствами для создания нового биотехнологического процесса получения биологическиактивных добавок функционального назначения.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Материалы и методы исследований

Исследования проводили в лабораторных и опытно-экспериментальных и промышленных условиях на базе ГНУ ВНИИПБТ, Мичуринского экспериментального завода, Бердского завода биопрепаратов.

2.1.1. Объекты исследований Ферментные препараты

В работе использовали ферментные препараты протеолитического и целлюлолитического действия различного микробного происхождения, полученные осаждением этанолом или ультрафильтрацией из культурных жидкостей, а также готовые товарные формы ферментов различных производителей.

Ферментные препараты - источники протеаз: Bacillus subtilis (протосубтилин - Бердского завода биопрепаратов), В. mesentericus (протомезентерин - ВНИИПБТ), Aspergillus flavus (протофлавин -ВНИИПБТ), A. terricola (прототерризин), Rhisopus pygmauis (протопигмаусин), Acremonium chrizogenum (протеаза С), Humicola lutea Б (кислая протеаза БАН), A.oryzae 251-90 (протооризин), A.oryzae 387 (амилопротооризин Г10х), а так же из поверхностных культур: Asp.oryzae 740-А2 (амилоризин), A.oryzae 387 (амилопротооризин ШОх), Bacillus licheniformis 103 (протолихетерм); а также препараты зарубежных производителей: нейтраза и алкалаза - Novozymes, БНЗ - Enmex.

Ферментные препараты - источники р-глюканаз: Целловиридин -Бердский завод биопрепаратов, Зимафилт - Enmex, Брюзайм - DSM. Микроорганизмы -продуценты протеаз и 0-глюканаз

Объектами исследований служили штаммы микромицетов, полученные из музея чистых культур ГНУ ВНИИПБТ, а также собственной селекции отдела биотехнологии ферментных препаратов ГНУ ВНИИПБТ. На этапе селекционных работ исследовано 29 штаммов: 22 штамма - Aspergillus oryzae, 2 штамма - A. terricola, 4 штамма - A. flavus, 1 штамм - A. foetidus. Дрожжевая биомасса

Объектами исследований служили хлебопекарные дрожжи Saccharomyces cerevisiae в виде водно-дрожжевой суспензии (после культивирования и сепарации), в пастообразной форме и сухие, а также дрожжи рода S. carlsbergensis, Candida utilis и Rodotorula sp.

2.1.2. Методы исследований

В работе применены общепринятые и специальные физические, физико-химические, химические, биохимические, микробиологические, хроматографические и спектрофотометрические методы анализа.

2.1.2.1 Культивирование микроорганизмов

Продуценты культивировали глубинным способом на натуральных средах, в состав которых входили различные виды муки и минеральные соли. Количество и состав компонентов зависел от условий экспериментов. Концентрация сухих веществ питательных сред составляла 4,5 - 6,0 %. Состав основной питательной среды: ячменная мука - 3%, пшеничные отруби - 3 %, КН2Р04 - 1,5%.

Твердофазное культивирование проводили поверхностным способом на средах содержащих пшеничные отруби, минеральные соли и воду. Массовая доля влаги составляла 60-62%.

Культивирование продуцентов проводили в колбах Эрленмейера объемом 750 мл с 50 мл среды; в полупроизводственных условиях - в ферментаторах объемом 15 л (Кириши) при степени заполнения 0,5; в

•5 производственных условиях - в ферментаторах объемом 20 и 32 м с коэффициентами заполнения 0,5 и 0,7 в течение 42 - 56 часов.

Для споруляции и хранения штаммов использовали агаризованную среду, приготовленную на солодовом сусле с концентрацией сухих веществ

11-12% (СА). Инкубацию штаммов для спороношения проводили на скошенном СА в течение 5-ти суток при 30°С.

2.1.2.2 Определение ферментативной активности

Важной характеристикой любой ферментной системы является уровень активности отдельных ферментов комплекса. В настоящем исследовании проводилось определение различных ферментативных активностей, позволяющих составить представление о качественном и количественном составе того или иного комплекса, а также направленности его действия.

Амилолитическая активность

Амилолитическую активность определяли общепринятым методом гидролиза крахмала по ГОСТу РФ 20264.4-89.

Общая протеолитическая активность

Протеолитическая активность характеризует способность фермента катализировать расщепление белков до аминокислот или пептидов. Протеолитическую активность (ПС) определяли модифицированным методом Ансона по гидролизу гемоглобина препаратам фермента с последующей его инактивацией и осаждением непрогидролизованного белка трихлоруксусной кислотой (ТХУ). За единицу активности принимали такое количество фермента, которое за 1 мин при 30°С способствовало образованию 1 мкм тирозина при гидролизе белка (Полыгалина Г.В. и др., 2003).

Активность индивидуальных протеолитических ферментов

Активности сериновой, карбоксильной и металлопротеиназ, лейцинамино- и карбоксипептидаз измеряли по специфическим субстратам. Для обнаружения возможного вклада в гидролиз субстратов других протеаз комплекса применяли специфические ингибиторы. За единицу активности во всех случаях принимали такое количество фермента, которое в стандартных условиях за 1 мин расщепляло 1 мкм субстрата.

Активность сериновой протеиназы определяли по специфическому субстрату n-нитроанилид бензол-оксикарбонил-Ь-аланил-Ь-аланил-Ь-лей-цину (Z-Ala-Ala-Leu-pNa, завод химреактивов "Олайне"). При определении вклада в гидролиз субстрата других протеолитических ферментов комплекса применяли специфический ингибитор сериновой протеиназы фенилметилсульфонилфторид (PMSF, фирмы "Serva", Германия) [Епремян А.С.идр., 1981].

Об активности нейтральной металлопротеиназы судили по гидролизу специфического субстрата динитрофенил-Ь-глицил-Ь-глицил-Ь-изолей- цил-Ь-аргинина (DNP-Gly-Gly-Ile-Arg), синтезирован Л.А.Люблинской). Активность металлопротеиназы подавляли атилендиаминтетраацетатом (ЭДТА) [Люблинская и др., 1976].

Наличие активности карбоксильной протеиназы подтверждали с помощью специфического ингибитора пепсина Н-диазоацетил-Н'-2,4-динитрофенил-этилендиамина (ДДЭ). Активность нейтральной протеиназы, которая также могла гидролизовать субстрат, подавляли CuCl . Остаточную активность определяли по методу Ансона с гемоглобином [Ковалева и др., 1977].

Ч-нитроанилид-Ь-лейцин служил специфическим субстратом при определении активности лейцинаминопептидазы [Иванова и др., 1977].

Активность карбоксипептидазы определяли по специфическому субстрату динитрофенил-Ь-глицил-Ь-глицил-Ь-аргинину (DNP-Gly-Gly-Arg) [Азаренкова и др. 1976].

Экзо-Р-глюканазная активность

Метод основан на определении восстанавливающих Сахаров, образующихся при действии фермента на ячменный р-глюкан [Полыгалина и др., 2003 г.].

Ксиланазная активность

Определение ксиланазной активности основано на способности фермента расщеплять ксилан с образованием восстанавливающих Сахаров [Полыгалина и др., 2003 г.]

Целлюлазная активность

Активность комплекса целлюлаз определялась по гидролизу карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) [Полыгалина и др., 2003 г.].

2.1.2.3 Изучение зависимости протеолитической и амилолитической активностей от рН и температуры

Влияние температуры и рН на общую протеолитическую активность ферментного препарата определяли по результатам его воздействия на 2%-ный раствор гемоглобина при различных температурах и рН.

Аналогично определяли оптимум рН и температуры действия а-амилазы. В качестве субстрата использовали 1%-ный раствор крахмала.

2.1.2.4 Изучение степени гидролиза белковых субстратов

При изучении степени гидролиза микробного белка объектом исследований являлись сухие дрожжи Saccharomyces cerevisiae, из которых готовили 30%-ную водную суспензию. Ферментолиз осуществляли исследуемыми протеолитическими препаратами при 50° С в течение 5 ч из расчета 5 - 25 ед ПА/г сухих дрожжей в зависимости от условий эксперимента. Процесс гидролиза дрожжевой биомассы оценивали по нарастанию в получаемых ферментолизатах концентрации растворимых сухих веществ (по рефрактометру), аминного азота, растворимого белка. В качестве контроля служила дрожжевая суспензия, не обработанная протеазами и подвергнутая автолизу в условиях, аналогичных опыту.

Концентрацию аминного азота определяли медным способом в отсутствие аммонийных солей [Белозерский, Проскуряков, 1951]. Массовую долю абсолютно сухих веществ дрожжевой суспензии устанавливали методом высушивания до постоянной величины при 105°С [Рухлядева А.П., 1986]. Концентрацию общих белковых веществ суспензии и растворимого белка в супернатантах получаемых гидролизатов определяли по содержанию азота методом Кьельдаля [[Белозерский, Проскуряков, 1951]]. Степень гидролиза дрожжевого белка рассчитывали по количеству переведенного в растворимую форму белка в процентах от общего содержания белковых веществ в исходной суспензии.

Концентрацию общих аминокислот определяли после гидролиза анализируемых образцов с 6 н НС1 на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 6 ч и последующим автоклавированием в течение 2 ч при 120°С. Содержание свободных аминокислот, образующихся в результате гидролиза дрожжевой суспензии, определяли после осаждения белков и пептидов ТХУ (Дэвени Т., Гергей Я., 1976). Затем полученные пробы центрифугировали 15 мин при 6000g. Надосадочную жидкость использовали для количественного и качественного анализа общих и свободных аминокислот, который проводили по методу Мура и Штейна на аминокислотном анализаторе LC 200 фирмы "Вю1хошк"(Германия); просчет аминограмм осуществляли методом сравнения площадей стандарта и образца [Росляков В.Я., Тарасенко И.С., 1990].

2.2 Результаты экспериментов и их обсуэвдение

2.2.1. Скрининг эффективной ферментативной системы для гидролиза дрожжевой биомассы

В настоящее время для повышения биологической полноценности питания широко используются белковые и аминокислотные обогатители, полученные на основе гидролиза дрожжевой биомассы. Существуют различные методы расщепления белковых веществ микроорганизмов. Одним из наиболее изученных способов переработки клеточной биомассы с целью получения аминокислотных смесей является автолиз. Однако этот метод недостаточно эффективен, энергоемок, так как требует проведения длительного процесса. Состав автолизата полностью зависит от качества и физиологической активности используемых дрожжевых клеток. Поэтому при автолизе, как правило, не достигается достаточно глубокого гидролиза белков и других высокомолекулярных компонентов дрожжевой биомассы.

Вместе с тем известно о способности различных ферментных систем разрушать клеточные стенки микроорганизмов. Некоторые исследователи предлагают применять ферментные препараты протеолитического действия, синтезируемые различными продуцентами [Коновалов с соав., 1975; Римарева с соав., 1998]. В связи с необходимостью повышения эффективности трансформации микробной клетки в легкодоступные для пищеварительных ферментов компоненты скрининг новых биокатализаторов, осуществляющих глубокий гидролиз высокомолекулярных полимеров дрожжевой клетки, продолжает оставаться актуальным.

2.2.1.1 Сравнительная характеристика микробных протеаз различного происхождения по степени гидролиза белковых субстратов

Особую актуальность приобретает поиск новых биокатализаторов протеолитического действия, осуществляющих глубокий протеолиз микробных белков при рН 4,5 - 5,5. Данная область рН соответствует естественным значениям рН дрожжевой суспензии, а также оптимальным условиям действия внутриклеточных ферментов дрожжей.

Целью данного этапа работы являлось проведение сравнительных исследований гидролизующей способности ряда протеолитических ферментных препаратов микробного происхождения в кислой и слабокислой зонах рН и выбор наиболее эффективного при гидролизе белковых компонентов протоплазмы клетки.

В таблице 3. представлены данные по сравнительной характеристике общей протеолитической активности ферментных препаратов, действующих на гемоглобин при рН 5,5 и 4,0. Наибольшую активность из всех исследуемых препаратов проявляли протосубтилин, протолихетерм, протомезентерин, прототерризин, протофлавин и ферментные препараты из Aspergillus oryzae. Однако для бактериальных препаратов отмечено резкое снижение протеолитической способности при изменении рН инкубационной смеси в сторону кислых значений.

При изучении степени гидролиза микробного белка объектом исследований являлись сухие дрожжи Saccharomyces cerevisiae, из которых готовили 30%-ную водную суспензию. Ферментолиз осуществляли исследуемыми протеолитическими препаратами при 50°С в течение 5 часов из расчета 10 ед. ПС/г сухих дрожжей. Процесс гидролиза дрожжевой биомассы оценивали по нарастанию в получаемых ферментолизатах концентрации растворимых сухих веществ (по рефрактометру), аминного азота, растворимого белка. В качестве контроля служила дрожжевая суспензия, не обработанная микробными протеазами и подвергнутая автолизу в условиях, аналогичных опыту (50°С, 5ч).

При гидролизе дрожжевого белка выявилось четкое различие между исследуемыми препаратами. Ферментные препараты грибного происхождения, содержащие комплекс протеиназ и пептидаз, более эффективно гидролизовали микробный белок, чем бактериальные препараты.

Характеристика препаратов протеолитических ферментов микробного происхождения

Препараты/продуцент Протеолитическая активность по гемоглобину, ед./г рН 4,0 рН5,5

Протолихетерм/ Bacillus licheniformis 120,2 670,5

Протосубтилин/В. subtilis 199,7 920,2

Протомезентерин/В. mesentericus 179,5 590,3

Протофлавин/ Aspergillus flavus 364,8 304,7

Прототерризин/А. terricola 310,3 315,6

Протопигмаусин/ Rhisopus pygmauis 219,6 160,3

Протеаза С/ Acremonium chrizogenum 109,8 200,4

Кислая протеаза БАН/ Humicola lutea 733,1 601,7

Протооризин Г10х/ A.oryzae 251-90 319,6 365,2

Амилопротооризин Г10х/ A.oryzae 387 806,5 949,7

Амилопротооризин П10х/ A.oryzae 387 540,1 589,6

Амилоризин ШОх/ Asp.oryzae 740-А2 119,8 250,3

БНЗ/ В. subtilius 210,5 650,0

Нейтраза/В. subtilius 50,3 120,0

Алкалаза/ В. subtilius 160,0 420,0

В процессе гидролиза дрожжевой биомассы концентрация растворимых сухих веществ в ферментолизатах, полученных в результате действия грибных протеиназ, возрастала до 21,1-24,6%, растворимого белка - до 31,533,7%; при использовании препаратов протеиназ бактериального происхождения эти показатели были несколько ниже: 18,0-18,2 и 26,5-27,1% соответственно (табл.4).

Высокую активность проявили все ферментные препараты, синтезированные Aspergillus oryzae. Однако наибольшей гидролитической способностью по отношению к белковым полимерам дрожжевой клетки обладали препараты из A. oryzae 387. В результате ферментолиза клеточной биомассы амилопротооризином концентрация аминного азота в гидролизате возрастала более чем в 6 раз по сравнению с вариантом, где не использовались ферменты извне, а гидролиз осуществлялся под действием собственных ферментов клетки (автолиз). Концентрация аминного азота в ферментолизатах с грибными протеазами составляла 549-644 мг %, в то время как при воздействии бактериальных препаратов эти показатели были значительно ниже: 279-291 мг %.

1. Авакянц С.П., Шакарова Ф.И., Сергеева A.M. Действие нагревания и охлаждения вина с дрожжами на структуру и свойства дрожжевой клетки. // Прикладная биохимия и микробиология., 1969, т.5, в.1, с. 7277.

2. Аникеева Н.В. Научные основы новых технологий белковых препаратов и диетических продуктов с использованием нута// Автореферат диссертации на соиск. уч.степени доктора техн.наук. -М. -2003.-25 с.

3. Антипова Л.В., Осминин О.С., Шамханов Ч.Ю., Струкова Т.Н. Получение белковой пищевой добавки из вторичных продуктов птицеперерабатывающей промышленности. //Хранение и переработка сельхозсырья. 2003, №2, с.62-64.

4. Антонов В.Ф. Липиды и ионная проницаемость мембран. //М.: Наука. 1982.

5. Бабаян Т.Л., Латов В.К. Выделение физиологически активного маннана и других полисахаридов из автолизатов пекарских дрожжей.// Биотехнология, 1992, №2, с.23-26.

6. Байрамов Р.Б. Перспективы использования микроводрослей.//Ашгабат: Издательство Туркмен НИИНТИ, 1992, с. 19.

7. Безрукова М.Г., Градова Н.Б. Использование биомассы микроорганизмов для пищевых целей // Сб. науч. трудов/ Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АНСССР. Пущино, 1985, с. 119.

8. Беликов В.М., Латов В.К., Цыряпкин В.А., Сергеев В.А. Биомасса дрожжей как источник аминокислот.// Микробиол. пр-сть, 1976, т.З (134), с. 6.

9. Беликов В.М., Бабаян Т.Л., Латов В.К., Князькова А.В. Способ автолиза дрожжевой биомассы. Авт. свид. СССР № 667194 // Б.И. 1979, №22, с.7.

10. Ю.Беликов В.М., Бабаян Т.Л., Харатьян С.Г., Латов В.К., Князькова

11. A.В. Способ автолиза дрожжевой биомассы. Авт. свид. СССР № 554854 // Б.И. 1977, №15, с.12.

12. П.Беликов В. М., Гололобов М. ЮЛ Die Nahrung. 1986. V. 26. № 3-4. Р.427-433.

13. Беликов В.М., Гордиенко С.В., Латов В.К., Харатьян С.Г., Сергеев

14. B.А., Коган А.С., Андрианов В.В. Способ получения аминокислот из низших пептидов. Авт. свид. СССР № 602543 // Б.И. 1978, №14, с.92.

15. Беликов В.М., Гордиенко С.В., Латов В.К., Цыряпкин В.А., Андрианов В.В., Бернова Г.И.,Неклюдов А.Д. Аминокислотный состав препаратов из автолизатов пекарских дрожжей. //Прикл. биохим. и микробиол. 1978, 14, №1,с.60.

16. Белозерский А.Н., Проскуряков Н.И. Практическое руководство по биохимии растений. М.; Совнаука, 1951.

17. Белоусова Н.И., Гордиенко С.В., Ерошин В.К., Ильченко В .Я. Получение смесей аминокислот на основе автолизатов дрожжей Saccharomyces, выращенных на этаноле или сахарах.// Биотехнология. 1990, №3, с.6

18. Берри Д. Биология дрожжей. //М.: Мир. 1985, с.95

19. Бирюзова В.И. Ультраструктурная организация дрожжевой клетки. -М.: Наука, 1993.-146 с.

20. Буяк Л.И., Ландау Н.С., Колесников М.П., Егоров Н.С. Выделение и изучение биологических свойств фактора, стимулирующего биосинтез протеаз в ассоциативной культуре грибов.// Микробиология. 1983, 52, №5, с.750.

21. Васильев П.С. Проблемы парентерального питания // Сб. научных трудов. М.: Минздрав СССР, 1981,с.119.

22. Войнарский И.Н., Яровенко В.Л. // Прикл. биохимия и микробиология. 1975, Т. 11. №6. С. 834-838.

23. Высоцкий В.Г., Тутельян В.А. Методические проблемы исследования качества новых источников пищевых белков // Гигиена: Обзор информации. М.: ВНИИ мед. тех. информ. 1987, №1, с.64.

24. Гаврилова Н.Н., Грачева И.М. Исследование возможности получения аминокислотных смесей на основе спиртовых дрожжей. // Тезисы доклада III Всес. совещание по аминокислотам. Ереван. 1984, с.44.

25. Герасименко Д.В. Ферментативное получение низкомолекулярного хитозана и изучение его антибактериальных свойств// Автореферат диссертации на соиск. уч.степени канд.биол.наук. -М. 2005. - 25 с.

26. Гордиенко С.В., Беликов В.М., Латов В.К., Цыряпкин В.А., Коган А.С., Андрианов В.В. Способ автолиза хлебопекарных дрожжей. Авт. свид. СССР № 843339 //Б.И. 1981, №24, с.332.

27. Грачева И.М., Иванова JI.A., Кантере В.М. Технология микробных белковых препаратов, аминокислот и биоэнергия.// М.: Колос, 1992, с.384.

28. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов.// М.: Изд-во «Элевар». 2000. - 512 с.

29. Джафаров А.Ф., Коршунов Б.А., Могилевская С.П. Способ получения аминокислотного концентрата.// №93021411/13; Заявл. 23.4.93; Опубл. 27.9.93, Бюл.27.

30. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты, (в 3-х т)//М.: Мир. 1982.

31. Долгов В. А. Повышение биологической ценности кормовой микробной биомассы методами деструкции. //Автореф. (канд. биол. наук) Львов. 1981, с.26.

32. Доценко О.Н., Садова В.В. Функционально-технологические характеристики белкового продукта дрожжевой биомассы.// Изв. вузов. Пищ. технол. 2002,№ 2-3, с.25.

33. Дэвени Т., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды и белки. М.: Мир. -1976.-364 с.

34. Ерофеев П.Ю. Разработка технологии дрожжевых лечебно-профилактических продуктов на базе растительного сырья //Автореф. Дисс. к.т.н. МГУПП. 1999. - с. 24.

35. Епремян А.С.,Честухина Г.Г., Азизбекян P.P. //Биохимия. 1981, т. 46, №5. - С.920-929.

36. Зб.Залашко М.В., Солохина Г.А., Шамгина Т.В. Влияние NaCl на метаболизм дрожжей R. Glutinis.// Микробиология, 1984, т.53, №1, с. 16-20.

37. Иванова Л.А., Иванова И.С., Лабутина Н.В. Применение БАД полученных из дрожжевой биомассы в х/п пром-ти.// Хранение и переработка с/х сырья. 2003,№ 2, с.38-40.

38. Иванова Н.И., Индуцированный автолиз дрожжей.//Диссертация. М.-1998, с. 142.

39. Иванова Н.Г. Индуцированный автолиз дрожжей.//Диссертация на соиск. уч.степени канд.биол.наук. -М.-1998, с.142.

40. Иванова М.М., Ваганова Т.И., Стронгин А .Я., Степенов В.М. Биохимия. 1977. т. 42, №5, с.843-849.

41. Иванова И.С. Разработка технологии биологически активной добавки к пище в виде белково-углеводного концентрата из биомассы хлебопекарных дрожжей// Автореферат диссертации на соиск. уч.степени канд.техн.наук. -М. 2003. - 28 с.

42. Иоффе М.Л., Безруков М.Г. Биологическая ценность изолятов белков микробного синтеза // Биотехнология. 1986, № 5, с.73.

43. Использование дрожжевого белка. // АгроНИИТЭИПП, «Пищ. промышленность», экспресс/инф., зарубежный опыт, 1988, №5, с.З.

44. Использование полноценных вкусовых качеств дрожжей //Prepared Foods. 1989, 158, №9, с.128.

45. Калашников Е.Я., Николаева Н.М. //Сб.: Вопросы биохимии и технологии пищевого производства. Харьков. 1967, №5, с.29.

46. Карпенкина Т.А. Ауторегуляция автолитических процессов и интенсификация автолиза дрожжей.//Автореферат диссертации на соиск. уч.степени канд.биол.наук. -М. 2003. - 25 с.

47. Кислухина О. В. Ферменты в производстве пищи и кормов. //М.ДеЛи принт, 2002, с. 336.

48. Кислухина О.В., Кузнецова Т.А., Бандоян А.К. Гидролизаты казеина как регуляторы автолиза микроорганизмов.// В кн. Получение и применение регуляторов роста. Л. 1986, с.83-86.

49. Кислухина О.В., Калунянц К.А., Аленова Д.Ж. Ферментативный лизис микроорганизмов.//Алма-Ата: Рауан. 1990, с.200.

50. Ковалева А., Иванова Т., Люцканов Н. Получение, характеристика и применение автолизатов пивных дрожжей. Y. Применение кислой протеиназы для получения гидролизатов пивных дрожжей. // Висш. инт хранит, и вкус, пром., Пловдив. 1990, 37, №3, с.159.

51. Ковалева Г.Г., Юсупов М.П., Лысогорская Е.Н. Биохимия. 1977, т. 42, № 3, с.534-539.

52. Коновалов С.А. Биохимия дрожжей. //М.: Пищевая промышленность. 1980, с.271.

53. Коновалов С. А., Воротило С.П., Соколова JL Б. Ферментативный метод разрушения клеточных стенок дрожжей. // Прикл. биохимия и микробиология. 1975. Т. 11. № 4. С. 620-622.

54. Кораблин Р.В. Разработка и применение обогатителя из пивной дробины и остаточных дрожжей// Автореферат диссертации на соиск. уч.степени канд.техн.наук. -М. 2003. - 20 с.

55. Котык А., Яначек К. Мембранный транспорт.// М.: Мир. 1980, с.342.

56. Кретович B.JI. Основы биохимии растений. //М.: Высшая школа. 1971, с.464.

57. Латов В.К., Бабаян Т.Д., Гордиенко С.В., Коган А.С., Цыряпкин В.А., Беликов В.М. Комплексная переработка дрожжевой биомассы.// Биотехнология. 1990, №3, с.14-18.

58. Ленинджер А. Биохимия. М.: Мир, 1976,с.957.

59. Люблинская Л.А., Ластовецкая Л.В., Шехватова Г.В. Химия природных соединений. 1976. - № 1 , с. 75-80.

60. Майер Г. Быть вформе + быть в норме.// Пищевая промышленность, 2002, №11, с.66.

61. Максимова Г.Н. Интенсификация биотехнологических процессов получения дрожжевой биомассы повышенного качества. // Диссерт. на соиск. уч. ст. д.б.н. М. 1994, с.523.

62. Матвеева И.В., Белявская И.Г. Биотехнологические основы приготовления хлеба.// М.: ДеЛи принт. 2001, с.150.

63. Матвеев М.В., Грядунов Г.В. Применение биотехнологии для решения экологических проблем. //10 международные Плехановские чтения. Тезисы докладов. М.: Изд-во РЭА им. Г.В. Плеханова. 1997,с. 123-124.

64. Матвеев М.В., Плессер Л.М. Биотехнологические продукты для адаптации человека к неблагоприятным экологическим условиям.// Тез. докладов 4-ой Международной Научно-технической конференции «Пища, экология, человек». М.: МГУПБ, 2001, с.124.

65. Маюрникова JI.A., Поздняковский В.М., Гореликова Г.А. Научно-практические аспекты обогащения продуктов питания. //Пиво и напитки. 2002, №3, с.30-32.

66. Микеладзе Г.Г. Нетрадиционные пути получения пищевых белков.// Пищевая и перерабатывающая промышленность. 1987, №10, с.42

67. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Бердутина А.В. Получение и очистка белковых гидролизатов (обзор).// Прикладная биохимия и микробиология. 2000, т.36, №4, с.371-379.

68. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Бердутина А.В. Свойства и применение белковых гидролизатов (обзор).// Прикладная биохимия и микробиология. 2000, т.36, №5, с.525-534.

69. Неклюдов А. Д., Навашин С.М.// Прикл. биохимия и микробиология. 1985, т. 21, №1, с. 3-17.

70. Несмеянов А.Н., Беликов В.М. Пища будущего.// М.: Педагогика, 1979, с.128.

71. Новаковская С.С., Шишацкий Ю.И. Производство хлебопекарных дрожжей.//М.: Агропромиздат. 1990, с.336.

72. Номенклатура ферментов. Рекомендации международного биохимического союза.// М. 1974. - 321 с.

73. Патент ФРГ №3904194. Способ получения белковых гидролизатов с низким содержанием горьких веществ //Кл. С12Р 21/06. 1990.

74. Петрова Н.Т. Разработка технологии получения препарата литических ферментов, расщепляющих клеточные стенки дрожжей и микроскопических грибов, с использованием мутантного штамма//

75. Автореферат диссертации на соиск. уч.степени канд.техн.наук. -М. -2005.- 18 с.

76. ПивненкоТ.Н., Эпштейн JI. М., Позднякова Ю.Н., Давидович В.В. // Вопросы питания. 1997, № 5, с.34-38.

77. Подобедов А.В. О дефиците белка в России и его устранении за счет производства и переработки сои //Пищевая промышленность. 1998, №8.

78. Полыгалина Г.С., Чередничено B.C., Римарева JI.B. Справочник. Методы определения ферментативных активностей. М., Изд.Пищепром. 2003. - 230.

79. Поляков В.А., Оверченко М.Б., Серба Е.М., Римарева JI.B. Влияние ферментативного комплекса A. oryzae 387 на степень гидролиза дрожжевой биомассы //Хранение и переработка сельхозсырья. 2001, №8. с.32.

80. Поляков В.А., Римарева Л.В., Оверченко М.Б., Трифонова В.В.// Прикл. биохимия и микробиология. 2000. Т. 36. № 3.

81. Попов Г., Владимиров Г., Павлова К. Получение гидролизатов из отходных пивных дрожжей, предназначенных для производства колера-красителя // Науч.тр. Висш. ин-т хран. и вкус, пром-ти. Пловдив. 1990, 37, №2, с.221.

82. Прянишников В.В., Микляшевски П. и др. Функциональные добавки направленного действия для пищевой пром-ти.// Пищевая промышленность 1999, №1.

83. Ракитин В.Ю. Технологические аспекты дезинтеграции микроорганизмов.// Обзор. -М.: НИИТЭХИМ 1980, Вып.15 (100), с.36.

84. Римарева JI.B., Оверченко М.Б., Трифонова В.И., Устинников В.А. Получение пищевых добавок лечебно-профилактического действия.// Сб.: «Пища. Экология. Человек». Межд. науч.-техн. конф. М., 1995, с.25.

85. Римарева Л.В. // Хранение и переработка сельхозсырья. 1996. № 2, с.39-40.

86. Римарева Л.В. Перспективы использования протеолитических ферментных препаратов // Пищевая промышленность. 1996. № 3. С. 44-45.

87. Римарева Л.В., Яровенко В.Л., Милюкова Т.Б., Устинников Б.А. // Прикл. биохимия и микробиология. 1993. Т. 29. № 6.

88. Римарева Л.В. Эффективный ферментный препарат для протеолиза растительного сырья // Хранение и переработка сельхозсырья. 1995, № 6.-С. 40.

89. Римарева Л.В., Милюкова Т.Б., Оверченко М.Б., Трифонова В.В., Устинников Б.А. Штамм гриба Aspergillus oryzae продуцент комплекса кислых и слабокислых протеаз, амилолитических и цитолитических ферментов: Патент РФ № 2070921// БИ. 1996, № 36.

90. Римарева Л.В., Оверченко М. Б., Серба Е.М., Трифонова В. В.// Прикл. биохимия и микробиология. 1997, Т. 33, № 1, с. 43-48.

91. Римарева Л.В., Оверченко М. Б., Трифонова В. В. Способ получения белкового гидролизата дрожжевой биомассы: Патент РФ № 2104300 // Б. И. 1998, №4, с. 151.

92. Родионова Н.А., Безбородов A.M. О локализации систем ферментов, катализирующих расщепление полисахаридов растительных клеточных стенок у высших растений (обзор). // Прикладная биохимия и микробиология. 1997, с.467-487.

93. Росляков В.Я., Тарасенко И.С. Способ получения гидролизатов казеина: А.С. СССР №1587720. 1990. Б.И. №31, С.272.

94. Рошкова 3. Получение и применение дрожжевых белковых продуктов пищевого назначения //Хранительная промышленность. 1986, №1, с.25

95. Руденко А.Н., Конев С.В. О влиянии моно- и дивалентных катионов на термоустойчивость дрожжевых клеток. //В сб. Микроорганизмы -продуценты биологически активных веществ. — Минск. Наука и техника. 1973, с. 168-172.

96. Руденская Г.Н. Глутамил эндопептидаза микроорганизмов новое подсемейство химотрипсиновых протеиназ.// Биоорг. химия. - 1998. -24, №4.-С. 256-261.

97. Руденская Г.Н. Новые подсемейства субтилизинов.// Биоорг. химия. -1994. 20, №5. - С. 475 - 484.

98. Рухлядева А.П. Инструкция по техно-химическому и микробиологическому контролю спиртового производства.// М.: Агропромиздат. 1986, с.397.

99. Семихатова Н.М. Хлебопекарные дрожжи. //М.: Пищевая промышленность. 1980, с. 199.

100. Скрябин Г.К. Микробиологический белок для нужд животноводства.// Вестник с/х наук, 1979, №3, с. 31-32.

101. Спиричев В.Б. Дефицит микронутриентов и отечественные продукты лечебно-профилактического питания для его коррекции. //М.,1998.

102. Суханов В.П., Керимова М.Г., Игнатьев А.Д. Об эффективности использования комплексов аминокислот для повышения биологической ценности пищевых продуктов. //Тезисы докл. III Всес. совещания по аминокислотам. Ереван. 1984, с. 187.

103. Тихомирова Н.А. Технология продуктов функционального питагния. М.: ООО «Франтера». - 2002. - 134 с.

104. Фараджаева Е.Д., Кораблин Р.В. Получение и применение БАД на основе вторичных ресурсов пивоварения.// Пища. Экология.

105. Качество.: Сб.матер. 2 Межд. науч.-практ. конфер. Новосибирск: Издательство СО РАСХН, 2002, с.38-39.

106. Фихте Б. А. Дезинтеграция микроорганизмов.//Задачи и перспективы. Пущено-на-Оке. 1972, с.5-14.

107. Химический состав пищевых продуктов. //М.: Легкая и пищевая прмышленность. 1984, с.305.

108. Черкасов И.А., Кравченко Н.А., Павловский П.Е., Брагина Л.П. О некоторых особенностях бактериолитического действия лизоцима.// Биохимия. 1974, т.З, в.6, с.1308-1310.

109. Шальнова Н.Д. Использование профилактических продуктов питания в экстремальных условиях. //Пищевая промышленность. 2002, №11, с.55-57.

110. Шимилин Л.(перевод с англ.) Химия и обеспечение человечества пищей.// М. Мир. 1986, с. 616.

111. Шкляр Б.Х. Ферментативный лизис дрожжей.//Минск. 1977, с.147.

112. Шлокене А.П., Гуреева М.П., Ужкуренас А.П., Гричишкис С.Л., Валиляускас Ю.Ф., Малей С.М., Хагендорф А.А. Способ получения белкового гидролизата из биомассы дрожжей. Авт. свид. СССР № 947988 //Б.И. 1982, №28, с.255.

113. Щелкунов Л.Ф., Дудкин М.С., Корзун В.Н. Пища и экология. Одесса: Оптимум. -2000. С. 23.

114. Эль-Регистан Г.И., Бабаян Т. Л. Явление автолиза у микроорганизмов. Обзор. информ.//М.: ЦБНТИ Медбиопрома СССР, 1987, вып.2, с.52.

115. Achstetter Т., Emter О., Ehmann С., Wolf D.H., Proteolytic system of yeast.№New developments.// Horre-seyer's Z. Physiol. Chem., 1983, v.364, № 9, p. 1089.

116. Achstetter Т., Emter O., Ehmann C., Wolf D.H. Proteolysis in eucariotyc cell: aminopeptidases and dipeptidylaminopeptidases of yeast revisited. //Arch. Biochem Biophys., 1983, v.226, № 1, p.292-305.

117. Achstetter Т., Emter O., Ehmann C., Wolf D.H. Proteolysis in eucariotic cell: aminopeptidases and dipeptidylaminopeptidases of yeast revisited. //Arch.Biochem. Biophys., 1983, v.226, N1, p. 292-305.

118. Agboola S.O., Dalgleish D.G. // J. Agr. Food Chem. 1996. V. 44. N11. P.3631-3636.

119. Agboola S.O., Singh H., Munro P.A., Dalgleish D.G., Singh A.M. // J/ Agr. Food Chem. 1998 V. 46. N1. p. 84-90.

120. Alemohammad M.M., Knowless C.J. Osmotically induced volume and turbidity changes of E. coli due salts, sucrose and glycerol, with particular reference to the rapid permeation of glycerolin to the cell.// J. Gen. Microbiol., 1974, v. №1, p. 125-142.

121. Alvarez R., Enriquez A. Nucleic acid reduction in yest. //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1988, v.29, № 2-36 p. 208-210.

122. Andreas Cal.//Food Processes (USA). 1986. - 47 , N7. - P .37.

123. Atsushi I., Takashi I. possible involvement of membrane damage in the inactivation by broad-band near-UV. //Protochem. Photobiol. 1983, v.37, №4, p.395-401.

124. Arnold W.N. In " Yeast Cell Envelopes" CRC Press Inc., Boca Raton, Florida, 1981, p.97.

125. Aubes-Dufau I., Combes D. // Appl. Biochem. Biotechnol. 1997. V.67.N 1-2. P. 127-138.

126. Baldwin C., Robinson C. Increased disruption resistence of Candida utilis grown for survivors of enzymatic lysis combined with high pressure homogenization.// Letters in Applied Microbiology. 1992, vol.15, p.59-62.

127. Bomar M.T.,Yakubick V., Schmidt S. Autosysis of yeast induced by elevated temperature, ultraviolet and electron radiation. // Alimenta. 1977, v.16, p.53-57.

128. Babayan T.L., Bezrukov M.G., Latov V. K., Belikov B.M., Belatseva E.M., Titova E.F. Curr. Microbiol. 1981, v.5, p. 161.

129. Barett A.J. Proteolytic enzymes: aspartic and metallopeptidases.// Methods Enzymol., 1995, V. 248, P. 183.

130. Behalova В., Sillinger V.,Machek F. Баланс эргостерина при получении дрожжевого экстракта из клеток S. cerevisiae и C.utilis. // Kvasny Prum., 1996, v.32, №11, p.279-280.

131. Beck R.H.F., De Sadelur J.W.G.C. Pat. Europa. 1998. N 834537

132. Berthelsen J.H., Frokajaer S., Saltin B. Int.Pat. 1997 WO 39641.

133. Bohni P.C., Daum G., Schatz G. Import of protein into mitohondria. // J.Biol. Chem, 1983, v.258 №8, p. 4937-4943.

134. ChangW. Т., Douglas K.T., Mechanistic studies of carboxypeptidase Y from Saccharomyces cerevisiae.// Biochem.J. 1980, v. 187, № 3, p.843-849.

135. Chobert J.- M., Bertrand- Harb C., Dalgalarrando M., Nicolas M.-G. // J.Food Biochem. 1989. V. 13. N 2. P. 335-352.

136. Chrenova N.M., Bezrukov M.G., Kogan A.S., Sergeev W.A. Autolysis der H-hefe Saccharomyces cerevisiae induziert durch metallkationen. //Nahrung, 1981, B. 25, S. 837 -844.

137. Company "Provesta" marketing of new Yeast production // Bioprocessing Technology. - 1990. - 12, N7. - P.7.

138. Czapinska R., Otlenski J. Structural and energetic determinants of the SI-site specifity in serine proteases// Eur. J. Bioch., 1999-V.260. -P.571-595.

139. Diniz F.M., Martin A.M. // Food Sci. Technol. ( London). 1997. V. 30. N3. P. 266-272.

140. Duran A., Cabib E., Solubilization and partial purificato of yeast syntethase.//J. Biol Chem.1978, v.253, №12 , p.4419-4425

141. Dworzak E., Ors E. //Elelmiszen virsgalati Kozlemenyek. 1978 24, №3-4,1. 104.

142. Elango N., Correa J.U., Cabib E. Secretory of yeast chitinase.// J.Biol.Chem., 1982, v.257,№3, p. 1398-1400. bei treatment with enzymes.// J. Gen. Microbiol., 1980, v.l 17, p.383-391.

143. Emter O., Wolf D.H. Vacuoles are not the role compartments of proteolytic enzymes in yeast. FEBS Lett., 1984, 166, N2, p 321-325.

144. Flaczyk E. // Przem. Spozyw. 1997. V.51. N4. P. 43-45

145. Fleet G. In " Microbial cell Wall Synthesis and Autolysis", Elsevier, Amsterdam, 1984, p. 227.

146. Frokjaer S. // Food Technol. 1994. V. 48. N10. P. 86-88.

147. Gale E.F., Ingram J., Kerridge D., Notario V., Waymann F. Reduction of amphotericin resistance in stationary phase cultures of Candida albicans.

148. Gies A., Stasinska В., Skupin J. // Proc. 4th Eur. Congr. Biotechnol. , Amsterdam, June 14-19. 1987. - V.2.-P.146.

149. Hagi Т., Hatta H., Kobayashi M., Yoshikawa K., Pat. Japan. 1997. N 09-121814.

150. Halasz'A^Barath A., Matrai В., // Acta alim. 1988. - 17, N4 - 374.

151. Haque Z.U., Mozaffar Z. // Food Hydrocolloids. 1992. N5. P. 559571.

152. Hemmings B.A., Zubenko G.S., Halsilik A., Jones E.W. Mutant defective in processing of an enzyme located in the lysosome-like vacuole of Saccharomyces cerevisiae.// Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1981 v.78, №1, p 435-439.

153. Hetz G., Rohm K.H. Biol. Chem., 1987, v.363, p.63.

154. Hien N.H., Fleet G.H. Separation und characterization of six (l-3)-(3-glucanases from S.cerevisae.// J. Bacteriol., 1983,v.l56, №3, p.1204-1213.

155. Hilt W., Wolf D.H. Stress-induced proteolysis in yeast.// Mol. Microbiol., 1992, v.6, №17, p. 2437-2442.

156. Holzer H., Heinrich P.C. -Ann.Rev.Biochem., 1980, v.49, №63.

157. Johnson J.C. Food Additives. // Recent Developments, Noyes Data Corp., Park Ridge, 1983,s.526.

158. Ju H.-P., Okumiya M., Nishizono S., Ki M., Sugano M., Imaizumi K. // Food Chem. Toxicol. 1997. V. 35. N7. p. 663-668.

159. Klimova O.A., Borukhov S.I., Solovyeva N.I., Balaevskaya Т.О., Strongin A. Ya. The isolation and properties of coolagenolytic proteases from crab hepatopancreas.// Biochem. Biophys. Res. Com., 1990; 166(3), P. 1411 1420.

160. Kollar R., Sturdir E. Indukovana autolyza kvasinick. // Biologia, 1989, v.44, №12, p.1211-1223.

161. Kollar R., Petrakova E., Ashwell G., et.al.//J. Biol. Chem 1995 - v. 270.- P.l 170-1178.

162. Kovach В., Deak P., Haidu D., Vealand A.// Szeszipar. Januar -Vfrcius. 1988, p.36.

163. Lahl W.J., Braun S.D. // Food Technol. 1994. V. 48. N10. P. 68-71.

164. Leduc M., van Heijenoort J. Autolysis of E.coli. J. Bacteriol., 1980,v. 142,№ 16 p.52-59.

165. Lesk A.M., Fordman W.D. Conservation and variability inn the structure of serine proteinases of the chymotrypsin family// J. Mol. Biol. -1996, V. 258,-P 501 -537.

166. LexueZ.X. //Food Sci. 1996. V. 17. N5. P. 3-6.

167. Magni G., Drewniak M., Santarelli I., Huang C. Reexamination of the activation of yeast proteinase В on pH 5 : loss of inhibition effect of proteinase В inhibitors.// Biochem Int., 1986, v. 12, № 4 p.557-565

168. Mahmoud M.I., Malone W.T., Cordle C.T. // J. Food Sci. 1992. V. 57. N5. P. 1223-1229.

169. Mahmoud M.I. // Food Technol. 1994. V. 48. N 10. P. 89-95.

170. Makinen KK, Makinen PL. Purification and properties of an extracellular collagenolytic protease produced by the human oral bacterium Bacillus cereus (strain Soc 67)JI J Biol. Chem., 1987; 262(26), P. 12488 -12495.

171. Mala B. Rao, Aparna M. Tanksale, Mohini S. Ghatge, Vasanti V. Deshpande. Molecular and Biotechnological Aspects of Microbial Proteases// Microbiol, and Mol. Biol. Rev., 1998, 62(3), P. 597 635.

172. Marcilla A., Valentin E., Sentandreu R.//Internal Microbiol. 1998. -V. 1. -P. 107-116.

173. Masters P.M., Friedmon M. //J. Agr. Food Chem. 1979 27, 3, p.507.

174. Nielsen P.M. // Food Sci. Technol. ( N.Y.) . 1997. V. 80. N2 . P. 443-472.

175. Nagano H., To KA. Purification of collagenase and specificity of its related enzyme from Bacillus subtilis FS-2.11 Biosci. Biotechnol. Biochem., 2000; 64(1), P. 181-183.

176. Nombela C. In " Microbiol Cell Wall Synthesis and Autolysis", Elsivier, Amsterdam, 1984, p327.

177. Notario V. (3-glucanases from Candida albicans: purification, characterization and the nature of their attachment to cell wall components.// J. Gen. Mikrobiol., 1982, v. 128, №4, p. 747-759.

178. Otero M.A., Wagner J.R. Thermal behaviour and hydration properties of yeast proteins from Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces fragilis. //Food Chemistry. -2000.№69. pp. 161-165.

179. PAG. Revised PAG Guidelines. PAG/UNU Guideline № 6; Preclinical testing of novel sources of food // Food and Nutr. Bull. 1983, 5, №1, p.60

180. Parente A.M., Silva M.T. Ultrastruktural aspects of autolysis of Ps. Fluorescens induced by osmotic shock. // J. Gen. Microbiol., 1984, v. 130, №6, p.1459-1470.

181. Patching J.W., Rose A.N., Cold osmotic shock in S. serevisiae.//j. Bacterid., 1971, v. 108, p. 451-458.

182. Pedersen B. // Food Technol. 1994. V. 48. N10. P. 96-98.

183. Pntremoli S., Melloni E., Salamino F., Sparatore В., Michetti M., Horecker B.L.// Endogenous inhibitors of lysosomal proteinases.//Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 1983, v.80, №5, p. 1261-1264.

184. Production of Yeasts avtolyser in USA // Chemical Marketing Reporter. 1990. - 1237, N13. - p.5, 25.

185. Reyea F., Lahoz R., val Moreno A. J. Gen. Microbiol. // 1980, v.26, p.1120.

186. Riemay K.-H., Troger R. Autolyse bei Pilzen: Autolytischer Abbau von Kohlenhydraten, Proteinen, und Nucleinsaueren.// Z. Allg. Mikrobiol., 1978(8), B. 18,S.617-625.

187. Riemay R.-H., Wiese M. Verlauf und Beeinflussung der Analyse von Hypomyces ochraceus m. 359.// Z. Allg. Microbiologic, 1979, B. 19, № 4 , s. 269-276.

188. Rosales F. H. Yeast as protein source for human nutrition (a review).//Acta Microbiol. Hung., 1984, v.31, p. 159-172.

189. Roth F. Mikroorganismen als Proteinquelle in der Tierernaeehrung.// Kraftlutter, 1979, b.62, № 3, s. 122-128.

190. Ruggieri S., Magni G. // Phys.Chem.Phys., 1982, v. 14, р.315.

191. Saheki Т., Holzer H. Proteolytic activities in yeast. // Biochim. Biophys. Acta 1975, v.384, №1, p. 203- 214.

192. Saheki Т., Holzen H. Comparisons of the tryptophan synthase inactivating enzymes with proteinases from yeast. // Eur. J. Biochem., 1974, v. 42, p.621-626.

193. Schmidt G. //Food Flavor, Ingred., Process, and Packag. 1987. -9, N5. - C.25, 27, 29-30.

194. Shanidi F., Synowiecky // J. Food Chem. 1997. v. 60. N1. P.29-32.

195. Sergeev V.A., Solosenko U.M., Berzucov M.G.// Acta Biotechnol. 1984, №4,1. 105.

196. Sielecki A.R., Fujinaga M., Read R.J., James N.G. Refined structure of porcine pepsinogen at 1,8A resolution.// J. Mol. Biol., 1991, V. 219, P. 671 -692.

197. Sommer R., Yeast autolysates production, properties and applications// Product information "Only", 1989.

198. Suares R.M.P., Schwencke J., Garcia A.N., Garcon S. A new X-propyl-dipeptidyl aminopeptidase from yeast associated with a particulate fraction.//FEBS Lett, 1981,v. 131, № 2, p. 296-300.

199. Taylor S.L. // J Food Protect. 1986. v. 49. N2. p. 239-250.

200. US Patent 5.741.693. Alkalophilic Bacillus sp. AC13 and protease, xylanase, cellulase obtainable therefrom. 1998.

201. US Patent 5.801.038. Modified subtilisins having amino acid alterations. 1998.

202. US Patent 5.811.112. Oil-in-water cosmetic emultions containing a stabilized protease. 1998.

203. US Patent 5.837.516. Subtilisin variants capable of cleaving substrates containing basic residues. 1998.

204. Villa T.G., Notario V, Villanueva J.R. Occurrence of an endo-1,3- (3-glycanase in culture fluids of the yeast C.utilis.// Biochem.J, 1979, v. 177, p.107-114.

205. Villan G. J., Enriquez M.A., Lopez S.P. Reina C.R., Permeabilization cellular de C. utillis.// Rev. cienc.biol. 1983, v. 14, №1, p.35-47.

206. Vioque Javier, Clemente Alfonso, Pedroche Justo.//Instituto de la Grasa. Avda. Grasas у aceites. Espana., 2001, t.52, № 2, p. 132-136.

207. Wagner J.C., Escher C., Wolf D.H.//FEBS Lett., 1987, v.218, p.31.

208. Yeast protein en hances flavour and nutrition. //Food Process. 1986 -55, №10, p.13.

209. Watson R.R. Substrate specificities of aminopeptidases: a specific method for microbial differentiation.// Methods Microbiol., 1976, V. 9, P. 1-14.

210. Yumi Y.,Dao Thi D., Xing X., Kanji M., Characteristics of baker's yeast destruction by means of homogenezator working with high pressure.//J.Soc.Pwder Technol. -1999.-vol. 36.№7. -p.534-541.