автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Разработка биотехнологии препарата регулятора роста сельскохозяйственных растений на основе синтеза биологически активных веществ микромицетом Phialocephala fortinii

ооьииои*.

СИНЧУРИНА ЕКАТЕРИНА ВЛАДИМИРОВНА

РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИИ ПРЕПАРАТА РЕГУЛЯТОРА РОСТА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ НА ОСНОВЕ СИНТЕЗА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ МИКРОМИЦЕТОМ Р1ш11осер1т1а/опит

Специальность: 05.18.07 — Биотехнология пищевых продуктов и

биологических активных всшеств

2 4 НОЯ 2011

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва - 2011

005003621

Работа выполнена на кафедре «Биотехнология» федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный

университет пищевых производств» и в лаборатории отдела технологий препаратов на основе бактериальных и грибных культур Института прикладной биохимии и машиностроения ОАО «Биохиммаш»

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор

Иванова Людмила Афанасьевна

Официальные оппоненты: доктор технических наук

Храмов Евгений Николаевич

кандидат технических наук, доцент Чекасина Елизавета Васильевна

Ведущая организация: Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева (РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева)

Защита состоится: « » 11 г. в /<? " час, в ауд. ^^иа

заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.148.04 при ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» по адресу: 125080, г. Москва, Волоколамское шоссе, д.11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУПП.

Автореферат отправлен по адресу referat_vak@mon.gov.ru для размещения в сети Интернет Министерством образования и науки РФ и размещен на сайте www.mgupp.ru.

Отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенный печатью учреждения, просим направлять по адресу: 125080, г. Москва, Волоколамское шоссе, д. 11, МГУПП, ученому секретарю диссертационного совета Д 212.148.04.

Автореферат разослан « // » исЖ^1^ 2011 г.

Ученый секретарь совета, к.т.н. ^^ Тимофеев Д.В.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Внедрение экологически безопасных и экономически выгодных технологий пищевого растениеводства является приоритетным направлением в решении проблемы обеспеченности пищевыми ресурсами народонаселения нашей страны. Разработанная национальная программа Государственной политики РФ в области сельского хозяйства на 2015 г, меняется в сторону его экологизации и стимулирования биодинамических и органических систем земледелия.

Альтернативой существующим («химическим») технологиям растениеводства призваны служить новые препараты - регуляторы роста растений (РРР) на биологической основе, позволяющих эффективно реализовать потенциальные возможности сорта или гибрида растений, заложенные в геноме. Они используют естественные механизмы взаимовыгодных симбиотиче-ских отношений растения и микромира, в котором оно существует. В настоящее время на Российском рынке РРР доля таких препаратов невелика: в Государственном каталоге пестицидов и агрохимикатов, разрешенных для применения на территории РФ (2011 г.), зарегистрированы только четыре отечественных препарата. Эти препараты разработаны на основе продуктов метаболизма микроорганизмов, они производятся по заказу потребителей и отсутствуют в свободной продаже. Поэтому разработка новой, интенсивной и научно-обоснованной биотехнологии производства регуляторов роста в количествах, способных обеспечить их широкое внедрение в практику пищевого растениеводства, актуальна и способна открыть широкие перспективы для получения экологически чистых продуктов питания.

Цель исследования.

1. Выделить и охарактеризовать новые микромицеты - симбионты растений, обладающих высокой ростостимулирующей активностью.

2. Разработать технологию культивирования активного микромицета -симбионта и получения на его основе препарата - РРР, пригодного для широкого практического применения в сельском хозяйстве.

3. Провести испытания препарата в лабораторных и мелкоделяночных условиях.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Проведение скрининга высокоактивных неспорообразующих штаммов микромицетов - симбионтов растений по биологической активности (БА), исследование их морфологических особенностей и физиологических потребностей;

2. Идентификация штамма-продуцента на основе анализа последовательности 18S rRNA;

3. Выявление основных закономерностей кинетики роста микромицета, оптимизация технологических параметров выращивания по методу глубинного культивирования;

4. Масштабный переход процесса культивирования от колб до аппарата большего типоразмера - ферментера;

5. Изучение химического состава препарата;

6. Разработка препаративной формы препарата с целью получения коммерческого продукта с длительным сроком хранения;

7. Проведение лабораторных, мелкоделяночных испытаний препарата и разработка рекомендаций по способам применения.

Работа выполнялась при финансовой поддержке фонда DOE IPP PNNL (№ 325771-A-G2).

Научная новизна работы. Получен новый штамм микромицета, комплекс метаболитов которого оказывает выраженное стимулирующее действие на рост и развитие растений. Определена видовая принадлежность микромицета, который отнесен к Phialocephala fortinii F-833.

На основании выявленных зависимостей биологической активности штамма от условий культивирования определен состав питательной среды и условия культивирования, обеспечивающие высокую активность комплекса его метаболитов. Разработан состав препаративной формы, подобран наполнитель, определены условия сублимационного высушивания.

Впервые выявлены наиболее эффективные условия выращивания штамма РЫа1осерИа1а /огИпп Р-833 в лабораторном ферментере вместимостью 5 дм3 и в промышленных условиях в аппарате вместимостью 250 дм3.

Показано, что разработанный РРР обладает широким спектром действия - способствует ускорению процессов прорастания семян широкого ряда культур, значительно повышает параметры роста, развития, продуктивность, адаптивный потенциал. Полученная продукция отличается повышенным качеством.

Практическая значимость и реализация результатов работы. Создана лабораторная коллекция микроорганизмов, продукты метаболизма которых оказывают рострегулирующее действие на растения. Разработан паспорт на штамм РЫа1осерИа1а /огИпИ Г-833. Получен патент на изобретение №2237088 «Штамм продуцент комплекса биологически активных веществ, обладающих рострегуляторными свойствами». Штамм РЫа1осерка1а/ЪгИпп Р-833 принят на национальное патентное депонирование в ГосНИИгенетика и включен в состав ВКПМ. Исследована патогенность штамма, получено заключение о возможности его использования при производстве биостимулятора роста растений.

Впервые разработана технология культивирования штамма РЫа1осе-рИа1а/огйпП Р-833, как продуцента РРР в лабораторном ферментере и в промышленном аппарате. Проведено 20 ферментации в аппарате вместимостью 5 дм3 и две ферментации в аппарате вместимостью 250 дм3. Разработаны ТУ оп 9291-008-04777441-2008 на препарат «Мицефит» регулятор роста растений, промышленный регламент на производство препарата «Мицефит» ПР-9291008-04777441-2008. Определены режимы сублимационного высушивания и состав препаративной формы, позволяющие сохранить качество препарата при хранении в широком диапазоне температур без потери активности. Разработана инструкция по способам применения препарата.

На разработанный препарат получено свидетельство на товарный знак № 260587 «Мицефит».

Наработаны опытные партии и проведены испытания препарата в лабораторных, мелкоделяночных, полевых условиях на производственных базах организаций, допущенных к проведению регистрационных испытаний Минсельхозом и ответственных за подготовку экспертных заключений для получения разрешения применения препарата в сельском хозяйстве.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались на Международных форумах, конгрессах и конференциях: «Биотехнология и современность» (С.-Пб.: 2006 г.); «Грибы и водоросли в биоценозах» (М.: 2006 г.); «Аэрокосмический Конгресс 1АС» (М., 2006 г.); «Пилотируемые полеты в космос» (М., 2005 г.).

Препарат «Мицефит» представлялся на международных выставках: «Вэйстэк-2007» (М., 2007 г.), «Мир биотехнологии» (М., 2005-2007 гг.).

Научные положения, выносимые на защиту:

- научно-обоснованная технология получения препарата РРР на основе культуры микромицета, выделенного из ризосферы корней растений, для повышения безопасности пищевого растениеводства;

- выявленные в результате исследований основные параметры культивирования микромицета, обеспечивающие высокую эффективность биотехнологического производства нового препарата РРР.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Диссертационное исследование соответствует пп. 6, 13 и 14 паспорта специальности 05.18.07 - «Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ».

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 20 работ, в т.ч. 2 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК, 2 статьи в сборниках научных трудов, 16 статей в материалах международных научно-практических конференций, форумов, съездов, конгрессов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 210 источников, из них 77 иностранных, и приложе-

ний. Работа изложена на 219 страницах машинописного текста, включающего 34 рисунка и 39 таблиц.

1. Обзор литературы. В литературном обзоре рассмотрено общее состояние вопроса взаимоотношений растений и микромира, взаимовыгодные формы их взаимодействия в процессе вегетации. Рассмотрено современное состояние, практическое применение в растениеводстве регуляторов роста на основе микробиологического синтеза. Описаны методы глубинного культивирования микромицетов в ферментерах, рассмотрены вопросы масштабирования. Представлен обзор рынка препаратов регуляторов роста растений, разрешенных к применению на территории РФ. Рассмотрен вопрос безопасности пищевого сырья, обработанного РРР.

2. Экспериментальная часть

2.1. Материалы и методы исследований

Микроорганизмы. Объектами исследования являлись грибные культуры, выделенные из ризосферы корней растений. Ареалы обитания растительных организмов — Московская область и Центрально-черноземный район России. Отбор микромицетов проводили по способности выделенных моно-изолятов синтезировать биологически активные вещества, оказывающие рос-тостимулирующее действие на растительные организмы. В работе было исследовано 100 культур микромицетов.

Выделение грибных культур. Корни растений отделяли, многократно отмывали водопроводной водой, затем обрабатывали 33% пероксидом водорода и 96% этанолом. Полученные образцы корней промывали водой, измельчали стерильными ножницами, помещали на плотную и жидкую питательную среду Гельцер с добавлением антибиотика стрептомицина (200 мкг/см3) и инкубировали в течение четырех недель [Гельцер Ф.Ю. 1990г]. Чистые культуры выделяли методом последовательных пересевов на агари-зованную среду Гельцер с антибиотиком.

Скрининг культур. БА продуктов метаболизма изучаемых микромицетов оценивали с использованием гипокотильного биотеста на проростках

горчицы сареитской и путём учета прироста корней и листьев у проростков злаковых трав [Нетрусов А.И, 2005].

Морфология клетки, фенотииическая характеристика. Морфологию и размер клетки исследовали с помощью светлопольной микроскопии живых и окрашенных мазков на микроскопе Jenamed. Изучение морфологических и физиолого — биохимических характеристик проводили, руководствуясь общей стратегией фенотипической дифференциации, описанной в руководствах: «Систематика грибов»[Черепанова Н.П., 2005г.], «Основы микологии» [Гарибова JI.B., 2005г.], «Микология сегодня» [Дьяков Ю.Т., 2007г.], «Симбиоз с микроорганизмами - основа жизни растений» [Гельцер Ф.Ю. 1990 г].

Определение последовательности 18S рРНК. Последовательности 18S рРНК генов были получены методом ПЦР в ВКПМ ФГУПГосНИИГене-тика. Секвенирование проводилось на автосеквенаторе АЕ3000, для анализа секвенсов использовали специализированные nporpaMMbi:Blast, PDP 2.

Питательные среды. Культуры микромицетов хранили в пробирках при температуре (4±2)°С на плотной питательной среде Гельцер следующего состава, г/дм3: глюкоза - 8; К2НР04 - 0,6; КН2Р04 - 1,8; MgS04 - 0,2; K2S04 - 0,1; аспарагин - 0,02; раствор микроэлементов - 1 см3; агар микробиологический - 20; рН 6,5±0,2. Штаммы поддерживали путём последовательных пересевов один раз в два месяца.

Культивирование. Культивирование проводили при рН 5,5-6,0; температуре (26±1)°С в течение 21 суток.

Глубинное культивирование осуществляли: в конических колбах вместимостью 250 см3 с объёмом заполнения питательной средой (ПС) 100 см3 на качалке с частотой вращения платформы 200 об/мин и в ферментерах вместимостью 5 дм3 фирмы LKB (Швеция), с рабочим объемом 3 дм3 и фирмы Бион (Россия) вместимостью 250 дм3, с рабочим объемом 100 дм3. Условия перемешивания и аэрации в ферментере составляли 150 об/мин и расходе воздуха, подаваемого на аэрацию, 0,5 дм3 на 1 дм3 ПС.

Концентрацию биомассы определяли весовым способом в трех повтор-ностях по воздушно сухой массе (ВСМ) [Нетрусова А.И., 2005]. Редуцирующие вещества (PB) в фильтрате определяли методом Бертрана [Грачева И.М., 1971 г]. Объемный коэффициент массопередачи кислорода К^ определяли

сульфитным методом [Перт С.Д., 1978 г].

Определение химического состава. Определение фитогормонов, свободных аминокислот, Сахаров проводили в РГАУ-МСХА им.К.А.Тимирязева.

Экстракция, очистка фитогормонов [индолилуксусная (ИУК), абсцизо-вая (АБК) кислоты, цитокинины (ЦК), гиббереллины (ГА)] выполнялась по методике РГАУ-МСХА им. К.А.Тимирязева [Скоробогатова И.В., 1999 г]. ЦК, ИУК, АБК определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Количественное содержание ГА определяли по калибровочной кривой, для построения которой использовали гибберелловую кислоту (Россия). БА бесклеточного фильтрата определяли по методу Франкленда и Уоринга с использованием салата сорта Берлинский [Скоробогатова И. В.,1999 г; Нетрусов А.И., 2005 г].

Содержание свободных углеводов, аминокислот проводили методом ионообменной хроматографии на анализаторе Hitachi-835 (Vratny P., 1980).

Наличие жирных кислот определяли в Военной Академии РХБЗ методом ВЭЖХ. Исследование элементного состава проводили там же методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ICP-MS) на спектрометре ED2000 «Oxford Instruments».

Статистическую обработку экспериментальных данных, полученных не менее, чем в 3-х повторностях, проводили в Microsoft Office Exel.

2.2. Результаты исследований и их обсуждение

2.2.1. Скрининг микромицетов. Всего было выделено 100 грибных изолятов из образцов 30 растений. На основании изучения макро- и микроморфологических особенностей выделенных микоризных грибов для дальнейшей работы были отобраны 33 моноизолята, которые в цикле своего развития при росте на плотной ПС Гельцер не образовывали спор.

2.2.2. Сравнение биологической активности штаммов в условиях глубинной культуры. В климатической камере фитотрон определяли БА фильтрата культуральной жидкости (КЖ) каждого изолята. Установили, что семь штаммов микромицетов обладают высокой БА, в интервале разведений КЖ от 10"4 до 1(Г7 см3/см3 (см. рис. 1).

Максимальную БА показал штамм, выделенный из корней багульника болотного (Ledum palustre L.). Увеличение длины корней и стеблей растений мятлика составляло соответственно 97% и 22 % по сравнению с контролем.

Основные морфологические и филогенетические особенности отобранного штамма. Микромицет из корней багульника аэроб; при росте на плотной питательной среде Гельцер гриб дает медленно растущие прижато - бархатистые колонии черного

I корни

6 7 вариант

Рис. I. Биологическая активность микромицетов, выделенных из корней растений, цвета ростовой коэффициент равен 10 (Бухало, 1988г.); окраска среды не изменяется. Гифы гриба (диаметр гиф не превышает 3 мкм) темно окрашены, с большим содержанием капель масла, на гифах формируется большое количество интеркалярных, собранных в цепочки шаровидных хламидоспор. Культура обладает протеолитической активностью и не обладает амилолитиче-ской и липолитической.

Идентификация штамма проводилось в ВКПМ ФГУП ГосНИИГенети-ка. По данным секвенса было построено филогенетическое дерево, где показано, что культура с точностью 97,3 % относится к роду РЫа1осерка1а виду /огИпп Р-833.

2.2.3. Определение биологической активности РЫа1осерка1а /огйпи Р-833 на зерновых сельскохозяйственных культурах в лабораторных условиях. Проведены испытания по обработке семян различных зерновых

культур (пшеница, ячмень, просо, подсолнечник, мятлик, райграс) путём замачивания в фильтрате КЖ РМа1осерЬа1а /оПти К-833 при разведении 10"5 см3/см3 (см. табл. 1). Контрольные варианты семян замачивали в стерильной водопроводной воде.

Таблица 1. Биологическая активность фильтрата культуральной жидкости гриба РЫа1осерЪа1а/огНпп Р-833 в % к контролю (контроль - вода, 100 %)

№ Культура* Всхожесть Биологическая активность, %

п/п Стебли Корни

1 2 3 4 5

1. Пшеница 103,4 ±5,6 107,3 ±3,4 144,1 ±3,8

2. Ячмень 130,0 ±8,3 118,9 ±9,1 125,4 ±8,2

3. Просо 128,2 ±7,4 129,6 ±7,8 110,9 ±8,1

4. Подсолнечник 100,0 ±6,8 110,0 ±8,1 106,1 ±7,0

5. Мятлик 128,2 ± 10,3 139,7 ±9,8 137,4 ±9,3

6. Райграсе 112,0 ±6,7 136,7 ±5,4 138,9 ±5,1

- время выращивания семян варьировали от 3 до 7 дней в зависимости от вида растения.

Из данных табл. 1 следует, что такая обработка приводит к увеличению всхожести до 30% в зависимости от тест-объекта, удлинение стеблей составило до 39% и корней до 44% по сравнению с контролем. Отмечено, что БА зависит от вида растения, но в пределах одного разведения рабочего раствора.

2.3. Влияние состава питательной среды и условий культивирования на рост и биологическую активность культуры РМа1осер1ш1а/огйпи Р-833

2.3.1. Влияние источника углерода. В качестве источников углерода в составе среды Гельцер использовали (8 г/дм3): Б-глюкозу, Б-маннит, Ь-глюкозу, крахмал, дульцит, Б-лактозу, Б-галактозу, Б-мальтозу, О-сорбит, инозит, Ь-арабинозу, БЬ-сахарозу, Б-ксилозу, Ь-рамнозу. Культивирование осуществляли в колбах на качалке на жидкой ПС, посевная доза составляла 10%. Результаты исследований показали, что активный рост и интенсивное накопление биомассы культуры отмечены на среде с глюкозой и крахмалом. Накопление ВСМ составило 0,11 г/100см3 и 0,25г/100см3 соответственно. При выращивании микромицета на среде, содержащей крахмал, БА не превышала

контроля. Наиболее высокие значения БА получены при росте культуры на среде, содержащей глюкозу во всех исследованных разведениях.

2.3.2. Влияние источника азота. Изучали влияние неорганического (ЫН4ЫОз 1г/дм3; КаЫ03 2,5 г/дм3) и органического азота (пептон 5 г/дм3; гис-тидин 0,022г/дм3, аргинин 0,026 г/дм3, аспарагин 0,02г/дм3) в составе ПС. В качестве источника углерода была использована глюкоза (8 г/дм3). Таблица 2. Биологическая активность в зависимости от источника азота в со-

ставе питательной среды (Контроль - вода 100%). Мятлик, сорт Denim

№ Вариант ВСМ, Степень разведения КЖ

г/100см3 ю-4 ю-5 10"6 ю-7

1 2 3 4 5 6 7

1. Пептон 0,5590 С -83,7±9,1 С -112,2±7,4 С -95,2±8,1 С -104,2±7,2

К-98,6±10,2 К-105,2±8,7 К-91,9±7,3 К-113,6±7,8

2. NH4N03 0,2581 С -86,3±2,6 С-110,4±2,5 С-101,3±3,1 С-99,6±1,5

К -81,5±2,5 К-111,2±2,4 К-99,6±2,5 К-98,4±1,8

3. NaN03 0,1886 С-78,2±4,1 С-108,6±1,4 С-102,4±0,9 С-95,8±1,0

К-82,4±1,6 К-112,3±1,0 К-101,2±3,6 К-97,2±1,9

4. Гистидин 0,1567 С-111,2±7,4 С—114,7±8,8 С -100,2±8,5 С -94,9±7,5

К -121,7±7,8 К -123,3±8,6 К-110,1±8,2 К-107,4±8,1

5. Аргинин 0,2738 С-109,2±7,9 С- 106,3±8,2 С-114,3±8,2 С- 115,7±8,5

К-125,8±8,5 К- 122,5±9,0 К - 127,1±8,3 К- 128,9±9,1

6. Аспарагин 0,2480 С-100,9±10,4 С -92,0±12,7 С -108,7±11,9 С-122,2±12,7

К-118,2±11,0 fK-103,0±ll,9 К-130,9±12,8 К-132,8±12,9

Высокие значения Б А (см. табл. 2) получены при инкубировании на средах с добавлением аминокислот (гистидина, аргинина, аспарагина).

Максимальные показатели БА в данной серии опытов были получены на среде с аспарагином: увеличение длины стеблей и корней по сравнению с контролем составило до 22,2% и 32,8% соответственно. На среде с пептоном отмечен интенсивный рост и накопление ВСМ, но значения БА при этом не высоки. В серии экспериментов зависимость БА от продуктивности культуры не выявлена, низкая БА не связана со слабым ростом культуры.

2.3.3. Определение наиболее эффективного состава питательной среды методом математического планирования эксперимента. Подбор состава питательной среды для штамма РЫа1осерИа1а /оМти Г-833 с целью

получения максимальной БА проводили по результатам реализации метода аддитивно-решетчатого математического описания объекта. В качестве базового взято соотношение компонентов среды Гельцер. Процесс подбора состава питательной среды заключался в выборе факторов, обеспечивающих наибольший эффект.

Наиболее эффективной оказалась питательная среда состава (г/дм3): глюкоза 8; аргинин 0,026; К2НР04 0,6; КН2Р04 1,8; MgS04 0,2; IC2S04 0,1. БА бесклеточного фильтрата КЖ, полученного при выращивании Phialocephala fortinii F-833 на этой среде, составила 46% для стеблей и 57% для корней, что превышает среднюю БА в ранее проведенных опытах на 24% по стеблям и на 25% по корням.

2.3.4. Влияние физико-химических условий культивирования штамма Phialocephala fortinii F-833 на биологическую активность и оптимизация режимных параметров процесса роста

2.3.4.1. Влияние температуры культивирования и длительности.

Влияние температуры культивирования (22±1; 26±1; 30±1; 34±1)°С на рост и БА изучали при инкубировании Phialocephala fortinii F-833 на отработанной среде в колбах на качалке в течение четырех недель.

A3

0,1 о

а.

X 30 ■

□ Степень разведени

■ . "

9н "Чи Ли

ЗВСМ

. разведения КЖ:

кг5

ю-7

Время роста, нед.

о К

Ум

SL

Рис. 2. Влияние температуры (26±1)°С на БА и накопление ВСМ. С - стебли; К- корни

На основе выявленных зависимостей БА от температуры и времени инкубирования определено, что наиболее эффективной является температура (26±1) С (см. рис.2). Максимальные значения БА получены на третью неде-

лю роста при переходе культуры в стационарную фазу, увеличения стеблей и корней на 20 и 29 % превышает контроль соответственно; значения продуктивности составило 0,24 г/100 см3. Содержание РВ к третьей неделе снижается с 0,8 до 0,21 %; аминный азот увеличивается с 28 до 33,6 мг/%; значения рН среды в процессе роста снижается незначительно с 6,4 до 6,1 в конце.

2.3.4.2. Влияние рН среды на биологическую активность РЫа1осе-р1ш1а/огНпИ Р-833. Влияние рН среды (5, 6, 7, 8) на БА изучали при культивировании гриба в колбах на качалке на среде с буферной основой (К-Ыа буферные смеси).

ВСМ

Степень разведения КЖ:

10

10"6

10

10"'

Рис. 3. Влияние рН среды на БА и накопление ВСМ РЫа1осерИа1а )>ЬНшИИ-вЗЗ

При рН=5,5 6,0 происходит процесс интенсивного роста, накопления биомассы (см. рис. 3). При достижении стационарной фазы роста БА максимальна, увеличение гипокотиля растений горчицы Саперской в среднем составляет 35-45% по сравнению с контролем.

2.3.4.3. Влияние ограниченной аэрации на биологическую активность РЫа1осерИа1а/огйпи Р-833. При переходе от культивирования в колбе к аппарату большего размера - ферментеру, одной из основных проблем роста гриба в аппарате является механическое повреждение клеток мицелия при высокой степени турбулентности, возникающей при вращении мешалки. При культивировании гриба в колбах на качалке и в стационарных условиях (без принудительной аэрации) установлено, что химический состав активных ве-

ществ в КЖ очень близок, а БА (увеличение гипокотиля растений горчицы) составило 39% и 32% соответственно.

Анализ состава фитогормонов фильтрата КЖ показал наличие трех веществ: ИУК - присутствует почти равное количество в стационарных условиях 8,9 мкг/см^ и в колбах на качалке 8,4 мкг/см3; содержание ЦК составляет 10,5 и 16,4 мкг/см3, ГБ - 534,6 нг/см3 и 524,2 нг/см3 соответственно; АБК отсутствует.

Отсюда следует, что культура не требовательна к интенсивной аэрации и в процессе роста благоприятны низкие значения массообмена.

2.4. Определение критериев масштабирования. Процесс масштабирования осуществляли по величине коэффициента массопередачи кислорода KLa. Определение объемного коэффициента массопередачи в колбах на качалке и в ферментере проводили сульфитным методом.

Как показали исследования, интенсивный рост и накопление Б AB культурой, происходит при обеспечении за счет аэрации и перемешивания KLa = 62 ч"1. По полученным экспериментальным данным этому соответствует число оборотов мешалки ферментера (150+2) об/мин при барботаже воздуха 0,5 дм3 на 1 дм3 ПС в минуту.

2.5. Инкубирование Phialocephala fortinii F-833 отъемно - доливным способом. Исследование проводилось с целью интенсификации процесса культивирования. На отработанной среде при наиболее эффективных условиях культивирования проводили 1 пассаж культивирования, после чего КЖ сливали (в количестве 100, 50, 30 %), добавляли эквивалентное количество стерильной ПС и продолжали культивирование до окончания 2 пассажа. Критерием эффективности метода считали сохранение БА в КЖ последующего пассажа.

В серии экспериментов в колбах на качалке при росте в течение трех недель и полной замене ПС были получены высокие значения БА в КЖ 2 пассажа (увеличение длины стеблей растений мятлика до 39,7%, корней до 29,6%). На основании этих данных в ферментере (У0бщ= 5 дм3, Vpa6=3 дм3;

Т=(26±1) С; п= (150±2) об/мин; барботаж - 0,5 объёма воздуха на 1 дм3 среды в минуту) осуществляли инкубирование культуры до получения трех последовательных пассажей при 100%-ной замене ПС. Высокие показатели БА получены во всех трех пассажах культивирования (см. рис. 4). Максимальные значения БА для стеблей и корней растений мятлика на 24 % и 51 % выше контроля, соответственно.

о- 60 1

Степень разведения:

~ ~ ю-5

10"7 С-стебли К - корни

ю-4 ■

■ 10"6

1 пассаж

2 пассаж

3 пассаж

Рис. 4. Влияние процесса отъемно - доливного культивирования в ферментере на БА

Анализ состава фитогормонов бесклеточного фильтрата КЖ показал показал изменения в составе веществ: ИУК — присутствует в трех пассажах (4,916; 1,574; 3,6 мкг/см3 соответственно); содержание ЦК и ГА снижается от первого к третьему пассажу с 50,8 до 8,33мкг/мл и с 632,0 до 81,31 нг/см3 соответственно; содержание АБК увеличивается ко второму пассажу от 79,16 до 158,Знг/см3 и отсутствует в третьем.

Свободные аминокислоты в бесклеточном фильтрате КЖ присутствуют в небольших количествах, за исключением глутаминовой кислоты (см. рис. 5). Общее содержание аминокислот максимально в первом пассаже, к третьему пассажу наблюдается снижение общего количества в 4,5 раза.

□ маннит

□ фруктоза

□ глюкоза ■ сахароза

1 пассаж 2 пассаж 3 пассаж

1 пассаж 2 пассаж 3 пассаж

Рис.5. Содержание свободных аминокис- Рис. 6. Содержание свободных Сахаров в лот в фильтрате КЖ фильтрате КЖ

Свободные углеводы в бесклеточном фильтрате КЖ присутствуют во всех пассажах (см. рис. 6), практически в равном количестве. Ко второму пассажу появляется фруктоза, в третьем общее количество углеводов снижается, что свидетельствует об изменении биохимических процессов при длительном культивировании отьемно - доливным способом.

Таким образом, показана принципиальная возможность получения высокой БА и преимущество наработки препарата в ферментационных аппаратах с использованием отьемно - доливного способа культивирования, что является необходимым условием коммерциализации проекта.

2.5. Опытно - промышленные испытания технологического процесса. На производственной базе ОАО «Биохиммаш» проведены испытания технологии производства препарата РРР. В ферментационных аппаратах вместимостью 0,25 м3 получены две партии КЖ. БА превышает контроль до 23% и 25% по стеблям и корням растений мятлика соответственно.

2.6. Определение готовой формы препарата. Лиофильно высушенная форма различных органических веществ обеспечивает наибольшее удобство хранения, транспортировки и применения потребителями. Поэтому для получения готовой формы препарата применяли метод сублимационного высушивания во флаконах. Высушивание бесклеточного фильтрата КЖ проводили в пенициллиновых флаконах (Vo6u, = 10 см3; V3an=4 см3) на автоматической сушилке Virtis Advantage при следующем режиме: заморозка до минус (45±5)°С, вакуумирование до остаточного давления 30 - 70 мм рт. ст., последовательное повышение температуры: до минус (30±2)°С первые сутки, до плюс (20±2)°С вторые сутки, до плюс (30±2)°С третьи: полный цикл 72 часа.

Сухой продукт представляет собой чрезвычайно пористый слой белого цвета, хорошо сохраняющий первоначальную форму замороженного продукта и исходную БА.

2.6.1. Подбор состава наполнителя препарата. Для улучшения внешнего вида и сохраняемости препарата в процессе хранения и при транспорти-

ровке традиционно используются модифицирующие добавки. В качестве добавок нами изучены (г/дм3): маннит 20; глицин 20; лактоза 20; глюкоза 50 и полиглюкин (ПГ) 16.

Исследования показали, что максимальное сохранение БА достигается применением смеси маннита, лактозы и ПГ. Обработка семян мятлика препаратом с таким наполнителем позволила увеличить длину стеблей и корней до 77% и 61%, соответственно, по сравнению с контролем (вода-100%). Наполнитель способствует сохранению формы сухой белой таблетки, которая не изменяет цвет, физико-механические характеристики продукта при хранении в широком интервале температур от +4 до +40°С в течение месяца. Значения БА в начале и в конце срока хранения сопоставимы между собой.

Была проверена БА препарата при более длительном сроке хранения в течение 3 лет. Обработка препаратом повышала всхожесть семян рапса на 32,6%. Препарат увеличивал длину стеблей рапса во всех испытанных разведениях на 6,1-22,6% и длину корней на 32,4-97,1%.

2.7. Определение химического состава препарата - регулятора роста растений. Данные по химическому составу представлены в сводной табл. 3. Анализ результатов исследования показал, что 75,1% массы лиофильно высушенного фильтрата составляют различные сахара (сахароза, глюкоза, фруктоза и маннит), основная доля которых приходится на глюкозу (более половины всех Сахаров). Оставшиеся 17,3% - составляют спирты, карбо-новые и дикарбоновые кислоты, оксикислоты, фитогормоны, аминокислоты.

Часть идентифицированных соединений представляют собой полупродукты и продукты дальнейших превращений идентифицированных соединений, а их содержание в продукте без учета фосфорной кислоты составляет не более 1,5% массы лиофильно высушенного фильтрата. Зольные элементы составляют 2,8%. В препарате присутствуют жирные кислоты Сю - С2о ряда.

Таблица 3. Химический состав препарата (% активного начала)

№ п/п Компонент %, масс.

1 2 3

1. Фитогормоны: -ИУК 0,00005

-ЦК 0,51

-ГА 0,006

- АБК 0,0008

Итого: 0,52

2. Аминокислоты: - Глютаминовая 0,05

- Глицин 0,004

- Цистеин 0,003

- Валин 0,003

- Лейцин 0,006

Итого: 0,066

3. Углеводы: - Сахароза 17,8

- Глюкоза 37,6

- Фруктоза 9,1

- Маннит 10,6

Итого: 75,1

4. Янтарная кислота 3,158

5. Молочная кислота 9,067

6. Фосфорная кислота 2,064

7. Фумаровая кислота 1,572

8. Гликолевая кислота 0,271

9. Дигидроксиацетон 0,193

10. Этиленгликоль 0,091

И. Пропиленгликоль 0,014

12. 2,3-гидроксипропановая 0,087

13. 2,4 -гидроксибутановая 0,091

14. Гидракриловая 0,049

15. 2-гидроксиизокапроновая кислота 0,052

Итого: 16,7

16. Зольные элементы 2,8

Сумма компонентов: 95,2

Из идентифицированных веществ биологически активны прежде всего оксикислоты и дикарбоновые кислоты, например, янтарная кислота повышает активность клеточного дыхания и ускоряет рост клеток. Фито-гормоны обладают широким спектром действия и регулируют многие процессы жизнедеятельности растений. В то же время можно полагать, что на-

блюдаемая БА является результатом комплексного действия всех компонентов препарата.

2.8. Испытания препарата на сельскохозяйственных культурах в различных геоклиматических условиях. Разработана методика и инструкция по способам применения препарата. Проводились испытания препарата в тепличных, мелкоделяночных и полевых условиях. Результаты испытаний показали, что обработка препаратом увеличивает энергию прорастания и полевую всхожесть семян, повышает урожай и улучшает качество растительной продукции и зависит от вида растения.

На основе экспериментально полученных данных определен расход препарата: 1 г сухого препарата (1,7 м3 рабочего раствора) достаточно для замачивания 3,4 т семян или опрыскивания 1,7 га посадок.

По результатам проведенных исследований получен акт о внедрении препарата РРР «Мицефит».

2.9. Технологическая схема получения препарата РРР. На основании проведенных исследований разработаны ТУ оп 9291-008-04777441-2008, промышленный регламент ПР-9291008-04777441-2008, принципиальная технологическая блок-схема проведения процесса (см. рис. 7).

2.10. Технико-экономическая оценка. Расчет экономической эффективности показал, что стоимость одного флакона препарата находится на уровне стоимости препаратов-аналогов и составляет 91 руб. Проведенный анализ рынка позволил определить основные преимущества препарата «Мицефит» по сравнению с аналогами.

тп 1.1 Приготовление питательной среды и ее стерилизация

тп 1.2 Засеа и выращивание посевной культуры

ТП 2.1 Охлаждение питательной среды и засев инокулятора

ТП 3.1 Охлаждение питательной среды и засев ферментера -посевным материалом

ТП 5.1 Подготовка и стерилизация установки для микрофильтрации

ТП 5.2 Регенерация установки

наполнитель

та 1

тп 2

тп з

Выращивание посевного материала в три стадии в лабораторных условиях

леьйоолель

вода

конденсат в котельную

Выращивание посевного материала в инокуляторе

воздух

оборотная вода на ОБО-З

отработанный воздух на ОБВ-1 промывныевфы в сборник ~ усреднитель *на ОБО-З

пеиогаситель

конденсат в куельную

Выращивание культуры в ферментере

оборотная ипду на ОБО-З отработанный^воздух на ОБВ-1

промывные воды в сборник усреднитель на ОБО-З

ТП 4 Отделение биомассы фильтрацией

ТП 5 Стерилизующая фильтрация культуральной жидкости

ТП 6 Смешивание фильтрата с наполнителями

ТП 7 Фасовка жидкой субстанции

ТП 8 Сублимационная сушка жидкой субстанции

УМО Упаковка, маркировка, отгрузка

биомасса на пр~1

отработанный воздух на ОБВ-2

конденсат в котельную

Готовый продукт на склад

Рис. 7. Принципиальная блок-схема технологического процесса получения препарата РРР.

3. Выводы

1. Проведен скрининг 100 микромицетов, выделенных из корней 30 растений, выбран штамм микромицета-симбионта багульника, продукты метаболизма которого оказывают наибольший ростостимулирующий эффект на растения по методике биотеста (в среднем БА составляет до 40-60%).

2. На основании изучения последовательности 18S rRNA определено, что культура с точностью 97,3 % относится к Phialocephala fortinii F-833.

Установлен наиболее эффективный состав питательной среды методом аддитивно-решетчатого математического описания объекта. Полученные результаты позволили выбрать питательную среду состава (г/дм3): глюкоза 8; аргинин 0,026; К2НР040,6; КН2Р04 l,8;MgS04 0,2; K2S040,1.

БА бесклеточного фильтрата КЖ Phialocephala fortinii F-833 составила 46 % для стеблей и 57% для корней растений мятлика, что превышает среднюю БА в ранее проведенных опытах на 24% по стеблям и на 25% по корням.

3. Установлены наиболее эффективные условия культивирования мик-ромицета Phialocephala fortinii F-833: температура роста (26±1)°С, диапазон значения рН 5.5-6.0.

4. Выявлено, что наибольшие значения биологической активности культуральной жидкости достигаются при переходе культуры в стационарную фазу роста при культивировании в течение трех недель на жидкой питательной среде.

5. Проведен процесс масштабирования культивирования микрогриба Phialocephala fortinii F-833. Выявлено, что для культуры наиболее благоприятны низкие значения массообмена, коэффициент KLa = 62 ч"1. Разработан отьемно-доливной способ культивирования в ферментере V = 5 дм3. Разработана технология получения препарата — регулятора роста растений, включающая три стадии: глубинное культивирование штамма Phialocephala fortinii F-833, отделение культуральной жидкости от грибного мицелия и лиофильное высушивание. Проведен процесс культивирования в ферментере вместимостью V = 250 дм3, что позволило перейти к промышленному производству.

6. Определена форма препарата, подобран наполнитель, обеспечивающий хранение в течение трех лет в широком интервале температур от плюс 4 до 40° С без потери биологической активности.

7. Состав лиофильно высушенного препарата представлен широким классом веществ: сахара, аминокислоты, карбоновые и дикарбоновые кислоты, оксикислоты, микроэлементы, жирные кислоты и фитогормоны: индоли-луксусная кислота, цитокинины, гиббереллины, абсцизовая кислота.

8. Показано, что обработка препаратом увеличивает энергию прорастания, полевую всхожесть семян, повышает урожай и улучшает качество растительной продукции и зависит от вида растения.

9. Доказана экономическая эффективность использования препарата: при существующей стоимости одного флакона препарата 91 руб. и расходе I г сухого препарата (1,7 м3 рабочего раствора) на замачивание 3,4 т семян или опрыскивания 1,7 га посадок.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Публикации в изданиях, Рекомендованных ВАК РФ:

1. Жемчужина Н.С., Кофнова И.Н., Крашенинникова Т.К., Лаврикова В.В., Синчу-рина Е.В., Смоляная Г.Л., Украинцев А.Д. Результаты экспериментов лаборатории космической биотехнологии ОАО «Биохиммаш» // Космонавтика и ракетостроение,- 2007.- Т. 49,- №4,- С. 103-107.- 4,9 с. (лично автором 2,1 е.);

2. Синчурина Е.В. Технология культивирования грибного штамма РЫа1осерка1а /оШпН - продуцента биологически активных веществ // Естественные и технические нау-ки.-№1, 2010, с. 359-361.- 2,5 с. (лично автором 2,5 е.).

Статьи и материалы конференций:

3. Синчурина Е.В., Смоляная Г.Л., Жемчужина Н.С., Крашенинникова Т.К. Выделение микромицетов, обладающих ростостимулирующими свойствами, из ризосферы корней лекарственных растений // В сб.: Материалы международной конференции посвященной 85-летшо кафедры «Микологии и альгологии» МГУ им. Ломоносова. - М. «Прометей» МИГУ, 2004, стр. 122-123.- 1 с. (лично автором 0,9 е.);

4. Синчурина Е.В., Жемчужина Н.С., Крашенинникова Т.К. Новый препарат - стимулятор роста растений для увеличения продуктивности сельскохозяйственной растений // В сб.: Сборник научных трудов второй Всероссийской научно-практической конференции - выставки с международным участием «Высокоэффективные пищевые технологии и технические средства для их реализации». Ч. 2. - М.: МГУПП, 2004, стр. 118-121.- 4 с.

(лично автором 3,4 е.);

5.Синчурина Е.В., Жемчужина Н.С., Крашенинникова Т.К. Повышение продуктивности сельскохозяйственных растений при обработке стимуляторами роста грибного происхождения // В сб.: Биотехнология и современность. 4 - ый Международный форум, Санкт - Петербург, 2005, стр. 53-54. - 1 с. (лично автором 0,9 е.);

6.Синчурина Е.В., Жемчужина Н.С., Никишенкова Н.Г., Крашенинникова Т.К. Увеличение продуктивности сельскохозяйственных растений и улучшение качества получаемой продукции при обработке стимуляторами роста растений грибного происхождения // В сб.: Тезисы научно - практической конференции «Значение биотехнологии для здорового питания и решения медико-социальных проблем», Калининград, 22-23 июня 2005 г./Предисл. Р.Г.Василова. - М.: МАКС Пресс 2005,стр.91-92.- 1,2 с. (лично автором 1,1 е.);

7. Синчурина Е.В., Жемчужина Н.С., Крашенинникова Т.К. Выделение микромице-тов из ризосферы корней лекарственных растений и изучение их биологической активности // В сб.: Материалы всероссийской конференции «Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты», Саратов, 15-17 июня 2005. Саратов: Изд-во Научная книга, 2005, стр. 46-47.- 1,3 с. (лично автором 1 е.);

8.Синчурина Е.В., Тараканов И.Г., Жемчужина Н.С., Крашенинникова Т.К. Применение стимулятора роста растений для повышения всхожести семян и ускорения роста растений в ходе мероприятий по восстановлению растительного покрова на загрязненных почвах // В сб.: Международная конференция "Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды". Саратов, 14-16 сентября 2005 г. Саратов: Изд-во Научная книга, 2005, стр. 90-91,-1 с. (лично автором 0,9 е.);

9.Синчурина Е.В., Жемчужина Н.С., Крашенинникова Т.К. Новый препарат - стимулятор роста растений на основе микоризных грибов // В сб.: Международная научно -практическая конференция "Перспективы и проблемы развития биотехнологии в рамках единого экономического пространства стран СНГ", Белоруссия 2005 г. - 1,4 с. (лично автором 1,2 е.);

10. Синчурина Е.В., Жемчужина Н.С., Крашенинникова Т.К. Влияние стимулятора роста растений на урожай и качество получаемой сельскохозяйственной продукции // В сб.: Материалы третьего съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова: Москва, 25-27 октября 2005 г./ Под ред. Р.Г. Василова.-М.: МАКС Пресс, 2005, стр. 125-126.-1,3 с. (лично автором 1,2 е.);

11. Синчурина Е.В., Иванова Л.А., Крашенинникова Т.К. Влияние препарата - стимулятора роста растений на качество получаемой продукции // В сб.: Сборник докладов молодых ученых МГУПП третья Юбилейная международная выставка-конференция «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации». Ч. 2. - М.: МГУПП, 2005, стр. 145-148.- 3,8 с. (лично автором 3,7 е.);

12. Синчурина Е.В., Жемчужина Н.С., Крашенинникова Т.К. Влияние ризосферных микромицетов на рост и развитие растений // В сб.: Грибы и водоросли в биоценозах - 2006:

Материалы международной конференции МГУ им. М.В. Ломоносова «Грибы и водоросли в биоценозах» — М.: МАКС Пресс, 2006.-212 е.; стр. 143-145. - 2 с. (лично автором 1,9 е.);

13. Синчурина E.D., Крашенинникова Т.К., Никишенкова Н.Г. Влияние факторов космичечкого полета на метаболизм микромицета при инкубировании на борту PC МКС // В сб.: Тезисы докладов 6 - ого Международного форума «Биотехнология и современность»., С.-Петербург, 2006. 56 е.; стр. 22-23.-0,8 с. (лично автором 0,7 е.);

14. Жемчужина Н.С., Крашенинникова Т.К., Кофнова И.Н., Синчурина Е.В., Смоляная Г.Л., Украинцев А.Д. Изучение влияния факторов космического пространства на свойства бактериальной культуры и культур микоризных грибов при экспонировании в космосе в течение 16 дней на КА «Фотон» // В сб.: Материалы пятого международного Аэрокосмического Конгресса IAC" 06, посвященного 20-летию вывода в космос орбитальной станции «Мир», 27 - 31 августа 2006 г., Москва - 1,5 с. (лично автором 0,3 е.);

15. Украинцев А.Д., Крашенинникова Т.К., Кофнова И.Н., Жемчужина Н.С., Синчурина Е.В., Смоляная Г.Л., Лаврикова В.В. (ОАО «Биохиммаш», г. Москва); Щербаков Г.Я. (ОАО «Биопрепарат», г. Москва); Уткина Е.В., Фролов С.А. (РКК «Энергия» г. Королев) Влияние факторов космического полета на свойства бактериальных и грибных культур при длительном пребывании в космосе в составе аппаратуры «Биоэкология» // В сб.: Материалы шестой международной научно-практической конференции «Пилотируемые полеты в космос», 10-11 ноября 2005г., Москва -1,8 с. (лично автором 0,4 е.);

16. Синчурина Е.В., Крашенинникова Т.К. Новый препарат - стимулятор роста растений «Мицефит» // В сб.: Материалы четвертого международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 12-16 марта 2007 г., Москва - 1 с. (лично автором 0,8 е.);

17. Украинцев А.Д., Крашенинникова Т.К., Кофнова И.Н., Лаврикова В.В., Смоляная Г.Л., Жемчужина Н.С., Синчурина Е.В. Результаты экспериментов лаборатории космической биотехнологии ОАО «Биохиммаш» // В сб.: Материалы научно-технической конференции Роскосмоса по рассмотрению результатов исследований, проведенных на PC МКС, 28 февраля-1 марта 2007 г., Королев - 2 с. (лично автором 0,4 е.);

18. Синицын А.Н., Крашенинникова Т.К., Синчурина Е.В., Смоляная Г.Л. Новые биопрепараты для утилизации нефтесодержащих отходов и фиторемедиации загрязненных территорий // В сб.: Материалы международного конгресса «Вэйстэк-2007», 29 мая-1 июня 2007 г., Москва - 1 с. (лично автором 0,3 е.);

19. Украинцев А.Д., Крашенинникова Т.К., Синчурина Е.В. Основные результаты КЭ «Биоэкология», проведенного в период 2002-2008 г.г. // В сб.: Материалы восьмой Международной научно - практической конференции «Пилотируемые полеты в космос», 28-29 октября 2009 г., Звездный городок - 2 с. (лично автором 0,5 е.);

20. Tarakanov I., Krasheninnikova Т., Cataldo D., Nikishenkova N., Sinitsin A., Sinchu-rina E. Studies on innovative biotech plant growth regulator on the basis of rhizosphere microflora metabolites //20th International Conference on Plant Grrowth Substances 2010 Universität Ro-vira I Virgili, Terragona-Spain.- p.142-143.- 1,5 с. (лично автором 0,2 е.).

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1. Взаимоотношения растений и микроорганизмов.

1.1 Микробно - растительные взаимодействия.

1.2. Растения - центры формирования симбиотических сообществ микроорганизмов

1.3. Специфические взаимовыгодные формы микробно -растительных взаимодействий. Симбиоз растений и грибов. Микориза

1.3.1 .Эндотрофная микориза.

1.3.2.Эктотрофная микориза.

1.3.3. Экто-эндотрофная микориза.

1.3.4. Взаимоотношения партнёров в симбиозе везикулярно -арбускулярного типа.

1. 4. Значение симбиоза для жизненно важных процессов в растительном организме.

1.5. Участие симбионтных грибов в синтетической деятельности растений.

1.5.1. Витамины и ферменты.

1.5.2. Аминокислоты.

1.5.3. Жиры.

1.5.4. Пигменты.

1.5.5. Жирные кислоты.

1.5.6. Гормональные вещества

2.Фитогормон ы.

2.1. Гормоны растений.

2.1.1. Поливалентность, или множественность, действия.

2.1.2. Зависимость эффекта от концентрации.

2.1.3. Комплектность действия фитогормонов.

2.1.4. Компенсатортгость действия.

2.2. Негормональные регуляторы роста.

2.3. Взаимодействие гормонов.

2.4. Рецепторы и механизм действия гормонов.

3. Микроорганизмы продуценты фнтогормонов - регуляторов роста растений и их практическое применение.

3.1 .Распространение ауксинов, гибберилтшов и цитокининов среди микроор! ани змов.

3.2.Практическое применение фитогормонов и штаммов их образующих в растениеводстве.

4. Получение фитогормонов - регуляторов роста растений.

4.1. Культивирование грибов на жидких питательных средах.

5. Масштабирование процессов микробиологического синтеза.

6. Обзор рынка препаратов - регуляторов роста растений.

7. Безопасность пищевых продуктов при использовании регуляторов роста в сельскохозяйственном производстве.

7.1. Влияние регуляторов роста на качество получаемой продукции

111. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1.1. Объекты исследования.

3.1.2. Приготовление питательных сред.

3.1.2.1. Плотная агаризованная питательная среда Гельцер

3.1.2.2 Жидкая питательная среда Гельцер.

3.1.2.3. Методика приготовления раствора микроэлементов

3.1.3. Методика выделения микромицетов из корней растений и получения ЧИСТЫХ КУЛЬТУР.

3.1.4. Методика приготовления посевного материала.

3.1.5. Методика проведения суспензионного культивирования в колбах на качалке и в ферментере вместимостью 5 дм" и 250 дм*

3.1.6. Методика получения жидкого препарата.

3.1.7. Методика определения биологической активности.

3.1.8. Методы исследования.

3.1.8.1. Микроскопические методы исследования.

3.1.8.2. Определение pH растворов.

3.1.8.3. Методика определения объемного коэффициента массопередачи сульфитным методом.

3.1.8.4. Методика определения амннного азота методом формолъного титрования.

3.1.8.5. Методика определения редуцирующих веществ по методу Бертрана.

3.1.8.6. Методика определения абсолютно сухих веществ.

3.1.8.7. Методика определения воздушно сухой биомассы грибного мицелия.

3.1.8.8. Методика определения сухой массы стеблей и корней растения.

3.1.8.9. Методика отбора средней пробы растений.

3.1.8.10. Методика определения хлорофиллов А, В и каратиноидов в листьях.

3.1.8.11. Методика количественного определения аскорбиновой кислоты в растениях.

3.1.8.12. Статистическая обработка результатов.

3.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕШ1Е.

3.2.1 Скрининг микромицетов.

3.2.2. Сравнение биологической активности в условиях глубинной культуры. Выбор штамма продуцента. Основные морфологические и филогенетические особенности отобранного штамма.

3.2.3. Определение оптимального разведения бесклеточнош фильтрата культуральной жидкости микромицета.

3.2.4. Определение биологической активности Phialocephala for tin ii F-833 на зерновых сельскохозяйственных культурах в лабораторных условиях.

3.2.5. Влияние состава питательной среды и условий культивирования на рост и биологическую активность культуры Phialocephala fortinii F-S33.

3.2.5.1. Влияние источника углерода.

3.2.5.2. Влияние источника азота.

3.2.5.3. Подбор наиболее эффективного состава питательной среды методом математического планирования эксперимента.

3.2.5.4. Подбор внесения посевной дозы.

3.2.5.5. Влияние физико-химических условий культивирования на биологическую активность Phialocephala fortinii F-833 и подбор наиболее эффективных режимных параметров процесса роста.

3.2.5.5.1. Влияние гемперагуры культивирования и длительности на биологическую активность культуры Phialocephala fortinii F-833.

3.2.5.5.2. Влияние рН среды на биологическую активность микромицета Phialocephala fortinii F-833.

3.2.5.5.3. Влияние ограниченной аэрации на биологическую активность.

3.2.6. Определение критериев масштабирования.

3.2.7. Инкубирование Phialocephala fortinii F-833 отъемно- 154 доливным способом.

3.2.7.1. В колбах на качалке.

3.2.7.2. В ферментере объемом 5 дм3.

3.2.8. Культивирование мицелиального гриба Ркіаіосерішіа /огПпіі Р-833 в ферментере вместимостью 250 дм3.

3.2.9. Определение готовой формы препарата.

3.2.9.1. Подбор состава наполнителя препарата.]

3.2.9.2. Оценка биологической активности в процессе 176 хранения сухого препарата.

3.2.10. Определение химического состава препарата - регулятора роста растений.

3.2.11. Испытания препарата на сельскохозяйственных культурах

IV. Технологическая часть.

V. Тех ни ко — эконимическая оценка.

ВЫВОДЫ.

Актуальность темы

К 2020 г. население планеты составит порядка 7.7 млрд. человек, почти половина из которых, будет проживать в городах. Для обеспечения себя продовольствием человечество должно увеличить к этому времени производство зерна минимум на 41 %, мяса - на 63 %, клубней и корнеплодов - на 40% (8а1атЫ., 1999).

Прошедшая в 1950-1960-х годах «зеленая» революция позволила накормить население таких стран как Китай и Индия. Однако в 21 -ом веке возможность обеспечить значительный прирост объемов производства сельскохозяйственной продукции с помощью традиционных агротехнических приемов (таких как увеличение площадей посадок, использование химических средств подкормки и защиты растений, выведение новых сортов путем классической селекции и т.д.) практически уже исчерпаны. Кроме того, «зеленая» революция происходила в условиях, когда климат, несмотря на отдельные катаклизмы, был стабилен, генетические изменения в живые организмы не вносились, население Земли было вдвое меньше, бурный рост промышленности только начинался, также как и загрязнение окружающей среды. В настоящее время, когда указанные факторы достигли современного уровня, многими признаваемого критическим, возникли и стали нарастать новые проблемы, к которым относятся снижение плодородия почвы, в связи с ухудшением ее структуры, состава и физико-химических свойств и загрязнение почвы и воды многочисленными ксенобиотиками, постоянно и в больших количествах вводимыми в хозяйственный оборот. Эти факторы не преодолеваются современной агротехникой, снижают урожайность, ухудшают качество товарной продукции. Ксенобиотики по трофическим цепям достигают конечного потребителя - человека, что ставит под сомнение безопасность самых традиционных продуктов питания.

В России дополнительными проблемами являются продолжающееся сокращение посевных площадей, бедность почв в зоне неустойчивого земледелия, низкая культура агротехники. Приоритетное направление Государственной политики РФ в области сельского хозяйства, меняется в сторону его экологизации и стимулирования биодинамических и органических систем земледелия (РФ МСХ, 2002 ).

Современная наука видит решение проблем растениеводства в снижении количество вносимых минеральных удобрений и средств защиты растений («химической» нагрузки), что должно быть компенсировано укреплением жизнеспособноеги растения и его сопротивляемости к неблагоприятным факторам окружающей среды. Определенные надежды в этом плане связаны не только с созданием трансгенных сортов, которые выращиваются в 18 странах мира, но и созданием и применением активаторов метаболизма - физиологически активных веществ, позволяющих эффективно реализовать потенциальные возможности сорта или гибрида, заложенные в геноме.

Такой потенциал заложен во взаимовыгодных отношениях растений и микромира, в котором они существуют. Так, микоризные грибы в природе вступают в симбиоз со многими травянистыми растениями и деревьями. Считается, что микоризные грибы увеличивают всасывающую поверхность корней; синтезируют многие биологически активные вещества, используемые растениями; переводят трудно усвояемые соединения фосфора почвы в растворимую форму, доступную растениям; защищают корни от поражения потенциальными патогенами; мицелий микоризных грибов, выходящий из корней разных экземпляров растений в почву, сливается, и по нему мигрируют от одного растения к другому метаболиты - питательные вещества, гормоны, токсины (Дьяков ЮЛ ., 1997).

В практическую плоскость это направление перешло в наступившую эру биотехнологии, когда технологически стало возможно целевое создание регуляторов роста растений на основе препаратов природного происхождения.

В настоящее время в Государственном каталоге пестицидов и агрохи-микатов разрешенных для применения на территории Российской Федерации гражданами и юридическими лицами в сельском, лесном, коммунальном и личных подсобных хозяйствах за 2011 год. представлены 54 торговых названия регуляторов роста, список же действующих веществ намного короче -36 (wmv.mcx.ru). Большинство из них являются синтетическими аналогами фитогормонов и эффективно стимулируют рост и развитие растений. Однако они содержат, как правило, одно активное вещество (например, ИУК, гиберрилииовые кислоты), в связи с чем, они действуют только на определенной стадии роста и в узком диапазоне концентраций, а при передозировке вызывают ингибирование развития растения.

Только четыре препаратов представляют собой продукты метаболизма бактериальных (Бинорам) и грибных культур (Эмистим, Симбионт и Агропон). Это комплексные препараты, отличающиеся высокой эффективностью и не вызывающие загрязнения окружающей среды.

Актуальными являются исследования направленные на активное использования возможностей симбиотических отношений растений и грибов в сельском хозяйстве. Не менее актуальной проблемой является разработка интенсивной и надежной технологии получения таких препаратов в количествах, способных обеспечить их широкое внедрение в практику растениеводства.

Цель исследования.

1. Выделить и охарактеризовать новые микромицетьт - симбионты растений, обладающих высокой ростостимулирующей активностью.

2. Разработать технологию культивирования активного микромицета -симбионта и получения на его основе препарата - РРР, пригодного для широкого практического применения в сельском хозяйстве.

3. Провести испытания препарата в лабораторных и мелкоделяночных условиях.

Для достижения »оставленной цели решались следующие задачи:

1. Проведение скрининга высокоактивных неспорообразующих штаммов микромипетов - симбионтов растений по биологической активности (БА), исследование их морфологических особенностей и физиологических потребностей;

2. Идентификация штамма-продуцента на основе анализа последовательности 18S rRNA;

3. Выявление основных закономерностей кинетики роста микромицета, оптимизация технологических параметров выращивания по методу глубинного культивирования;

4. Масштабный переход процесса культивирования от колб до аппарата большего типоразмера - ферментера;

5. .Изучение химического состава препарата;

6. Разработка препаративной формы препарата с целью получения коммерческого продукта с длительным сроком хранения;

7. Проведение лабораторных, мелкоделяночных испытаний препарата и разработка рекомендаций по способам применения.

Работа выполнялась при финансовой поддержке фонда DOE ТРР PNNL (№> 325771-A-G2).

Научная новизна работы. Получен новый штамм микромицета, комплекс метаболитов которого оказывает выраженное стимулирующее дейс гвие на рост и развитие растений. Определена видовая принадлежность микромицета, который отнесен к роду Phialocephala виду fortinii F-833.

На основании выявленных зависимостей биологической активности штамма от условий культивирования определен состав питательной среды и условия культивирования, обеспечивающие высокую активность комплекса его метаболитов. Разработан состав препаративной формы, подобран наполнитель, определены условия сублимационного высушивания.

Впервые выявлены наиболее эффективные условия выращивания штамма Phialocephala fortinii F-833 в лабораторном ферментере вместимостью 5 дм"5 и в промышленных, условиях в аппарате вместимостью 250 дм\

Показано, что разработанный РРР обладает широким спектром действия - способствует ускорению процессов прорастания семян широкого ряда культур, повышает параметры роста, развития, продуктивность, адаптивный потенциал и водный баланс растений. Полученная продукция отличается повышенным качеством.

Практическая значимость и реализация результатов работы. Создана лабораторная коллекция микроорганизмов, продукты метаболизма которых оказывают рострегулирующее действие на растения. Разработан паспорт на штамм РЫа\осерка\а /огппи Р-833. Получен патент на изобретение „N«2237088 «Штамм продуцент комплекса биологически активных веществ, обладающих рострегуляторными свойствами». Штамм РЫа1осерка1а /огппи Р-833 принят на национальное патентное депонирование в ГосНИИгенетика и включен в состав ВКПМ. Исследована патогенность штамма, получено заключение о возможности его использования при производстве биостимулятора роста растений.

Впервые разработана технология культивирования штамма РЫа1осер1т1а ^огНпи Р-833, как продуцента РРР в лабораторном ферментере и в промышленном аппарате. Проведено 20 ферментаций в аппарате вместимостью 5 дм" и две ферментации в аппарате вместимостью 250 дм\ Разработаны ТУ оп 9291-008-04777441-2008 на препарат «Мицефит» регулятор роста растений, промышленный регламент на производство препарата «Мицефит» Г1Р-9291008-04777441-2008. Определены режимы сублимационного высушивания и состав препаративной формы, позволяющие сохранить качество препарата при хранении в широком диапазоне температур без потери активности. Разработана инструкция по способам применения препарата.

На разработанный препарат получено свидетельство на товарный знак № 260587 «Мицефит».

Наработаны опытные партии и проведены испытания препарата в лабораторных, мелкоделяночных, полевых условиях на производственных базах организаций, допущенных к проведению регистрационных испытаний Минсельхозом и ответственных за подготовку экспертных заключений для получения разрешения применения препарата в сельском хозяйстве.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались на Международных форумах, конгрессах и конференциях: «Биотехнология и современность» (С.-Пб.: 2006 г.); «Грибы и водоросли в биоценозах» (М.: 2006 г.); «Аэрокосмический Конгресс TAC» (М.„ 2006 г.); «Пилотируемые полеты в космос» (М. 2005 г.).

Препарат «Мицефит» представлялся на международных выставках: «Вэйстэк-2007» (М., 2007 г.), «Мир биотехнологии» {М, 2005-2007 гг.).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 20 работ, в т.ч. 2 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК, 2 статьи в сборниках научных трудов, 16 статей в материалах международных научно-практических конференций, форумов, съездов, конгрессов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения,

Выводы

1. Проведен скрининг 100 микромицетов, выделенных из корней 30 растений, выбран штамм микромицета-симбионта багульника, продукты метаболизма которого оказывают наибольший ростостимулирующий эффект на растения по методике биотеста (в среднем БА составляет до 40-60%).

2. На основании изучения последовательности 185 гЮЧА определено, что культура с точностью 97,3 % относится к РШа1осер1ш!а/огНпИ Р-833.

3. Установлен наиболее эффективный состав питательной среды методом аддитивно-решетчатого математического описания объекта. Полученные результаты позволили выбрать питательную среду состава (г/дм3): глюкоза 8; аргинин 0,026; К2НР04 0,6; КН2РО, 1,8; М§50, 0,2: К2804 0,1. Б А бесклеточного фильтрата КЖ РЫа1осер!га1а /оШгт Р-833 составила 46 % для стеблей и 57% для корней растений мятлика, что превышает среднюю Б А в ранее проведенных опытах на 24% по стеблям и на 25% по корням.

4. Установлены наиболее эффективные условия культивирования микромицета РЫа1осерИа1 а /огплп Р-833: температура роста диапазон значения рН 5.5-6.0.

5. Выявлено, что наибольшие значения биологической активности культуральной жидкости достигаются при переходе культуры в стационарную фазу роста при культивировании в течение трех недель на жидкой питательной среде.

6. Проведен процесс масштабирования культивирования микрогриба РЫсйосерЬхйа [огИпи Р-833. Выявлено, что для культуры наиболее благоприятны низкие значения массообмена, коэффициент Кьа = 62 ч"1. Разработан отъемно-доливной способ культивирования в ферментере V = 5 дм\ Разработана технология получения препарата - регулятора роста растений, включающая три стадии: глубинное культивирование штамма РЫа1осерка1а /огПпИ Р-833, отделение культуральной жидкости от грибного мицелия и лиофильное высушивание. Проведен процесс культивирования в ферментере вместимостью V = 250 дм\ что позволило перейти к промышленному производству.

7. Определена форма препарата, подобран наполнитель, обеспечивающий хранение в течение трех лет в широком интервале температур от плюс 4 до 40° С без потери биологической активности.

8. Состав лиофильно высушенного препарата представлен широким классом веществ: сахара, аминокислоты, карбоновьте и дикарбоновые кислоты, оксикислогы, микроэлементы, жирные кислоты и фитогормоны: индолилуксусная кислота, цитокинины, гиббереллины, абсцизовая кислота.

9. Показано, что обработка препаратом увеличивает энергию прорастания, полевую всхожесть семян, повышает урожай и улучшает качество растительной продукции и зависит от вида растения.

10.Доказана экономическая эффективность использования препарата: при существующей стоимости одного флакона препарата 91 руб. и расходе 1

•у г сухого препарата (1,7 м' рабочего раствора) на замачивание 3,4 т семян или опрыскивания 1,7 га посадок.

Заключение:

Проведена сравнительная оценка морфобиологических и физиологических показателей для оценки функционального состояния растений. При анализе полученных данных выявлено, что в реакции на предпосевную обработку семян препаратом обнаружились сортовые различия, что связано с разной интенсивностью ростовых процессов у различных сортов.

Обработка препаратом увеличивает энергию прорастания и полевую всхожесть семян, повышает урожай и улучшает качество растительной продукции.

На основе экспериментально полученных данных определен расход препарата: 1 г сухого препарата (1,7 м"1 рабочего раствора) достаточно для замачивания 3,4 т семян или опрыскивания 1,7 га посадок.

Разработана инструкция по способам применения препарата (см. Приложение 11).

На основе разработанной технологии получения нового препарата регулятора роста растений «Мицефит» наработаны опытные партии препарата и переданы для проведения испытаний на производственных базах организаций, допущенных к проведению регистрационных испытаний Минсельхозом и ответственных за подготовку экспертных заключений для получения разрешения применения препарата в сельском хозяйстве. По результатам работы получен акт о внедрении препарата - регулятора роста растений «Мицефит» (см. Приложение 12).

4. Технологическая часть

1. ГОСТ 8.134-98 Шкала pH водных растворов.

2. ГОСТ 12575-86 Сахар. Методы определения редуцирующих веществ.

3. ГОСТ 8756.13-87 Продукты переработки плодов и овощей. Методы определения Сахаров.

4. ГОСТ 24556-89 Продукты переработки плодов и овощей. Методы определения витамина «С».

5. Бсккер З.Э. Физиология грибов и их практическое использование. М.: Издательство Московского Университета, 1963. - 267.

6. Безуглова О.С. Новый справочник по удобрениям и стимуляторам роста: Серия «Справочники». Ростов и /Д: Феникс, 2003. - 384 с.

7. Белоус A.M., Цветков Ц.Д. Научные основы технологии сублимационного консервирования. Киев: Наук, думка, 1985. - 208 с.

8. Бетехнина A.A. Эндомикориза травянистых растений: распространенность и экологическое значение // Автореферат дисс. канд. биол. наук. Екатеринбург.: «Интерленд», 2006. - 24 с.

9. Билай В.И. Основы общей микологии.-Киев: Высшая школа, 1974-396 с.

10. Биргер М.О., Аврех В.В. и др. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Москва: Из-во «Медицина», 1967 г. - 463 с.

11. Борзенкова P.A., Боровкова М.П. Динамика распределения фитогормонов по различным зонам клубней картофеля в связи с ростом и запасанием крахмала // Физиология растений-2003,- Т. 50.- № 1,- С. 129-135.

12. Борисов А.Ю., Наумкина Т.С. Симбиотическая эффективность гороха. В кн.: Продукционный процесс сельскохозяйственных культур. Часть Ш. Орел: Орел ГАУ. 2001.- 66-70 с.

13. Боробов В.Н. Развитие многоукладности в аграрной сфере. М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2003. - 204 с.

14. Боташев P.M. Микоризные грибы (макромицеты) в экосистемах Тебердинского заповедника/УМатериалы конференции «Микология и криптогамная ботаника в России».- 2000.- 75-77 с.

15. Брыкалов A.B., Скорбина Е.А. Технология получения комплексного препарата и его биологическая активность // Проблемы экологии изащиты растений в сельском хозяйстве.-Ставроп. гос. аграр. ун-т, 2005. -С. 90-93.

16. Ванюшин Б.Ф., Шорнинг Б.К). Середина A.B., Александрушкина Н.И. Влияние фитогармонов и 5-азацитина на апоптоз у этиолированных проростков пшеницы // Физиология растений.- 2002,- Г. 49.- № 4.- С. 558-564.

17. Варфоломеев С.Д., Калюжный C.B. Биотехнология: Кинетические основы микробиологических производств: Учеб. Пособие для биол. и хим. спец. вузов . М.: Высш. шк., 1990. - 296 с.

18. Васильев H.A., Амбросов В.А., Складнев A.A. Моделирование процессов микробиологическог о синтеза: М.: Лесная промышленность, 1975. 344 с.

19. Вацке Р. Использование микоризы в садоводстве как метод решения проблем в области экологического возделывания растений// Плодоводство и ягодоводство России.'-Всерос. селекц.-технол. ин-т садоводства и питомниководства, 2005; т. 14. С. 234-244.

20. Вилленбринк И. Транспорт ассимилянтов во флоэме: регуляция и механизм // Физиология растений.- 2002.- Т. 49.- № 1С. 13-21.

21. Воронина Е.Ю. Микоризы и их роль в формировании сообществ/,'ОЗестн.Моск.ун-та.Сер. 16, 2006; N 4. С. 17-26.

22. Гамалей Ю.В. Транспорт и распределение асеимилятнов в растении. Подходы, методы, и направления исследований // Физиология растений.-2002.- Т. 49.-№ 1.-С. 22-39.

23. Гарибова JI.B., Лекомцева. Основы микологии: Морфология и систематика грибов и грибоподобных организмов: Учебное пособие.-М.: Товарищество научных изданий КМК, 2005. 220 с.

24. Тельцер Ф.Ю. Симбиоз с микроорганизмами основа жизни растений. М.: Изд-во МСХА, 1990. - 134 с.

25. Георгиевский В. П., Комисаренко Н.Ф., Дмитрук С.Е. Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1990,- 333 с.

26. Голышенков П.Г1. Лекарственные растения и их использование/Под общ. ред. Проф. Г.С. Назарова.- 4-ое изд.- Саранск: Мордов. кн. изд-во, 1982. -132 с.

27. Грачева И.М., Иванова Л.А. Биотехнология биологически активных веществ. М.: Изд-во НПО «Элевар», 2006. - 453 с.

28. Демидов All. Влияние биогенных стимуляторов роста и химических средств защиты растений на урожайность и качество яровой пшеницы в степной зоне Оренбурского Преду рал ья: Автореф. дис.канд. б иол. наук. -Оренб., 2001.-25 с.

29. Джерзи К. Изучение эффективности применения микоризы и минеральных удобрений при выращивании черной сосны (Pinus Nigra) в контейнерах с использованием медленнодействующих удобрений в 2006 году// Вестн.Белорус.гос.с.-х.акад., 2007; N 4. С. 128-129.

30. Диос Э. Количественные проблемы биохимии: Пер. с англ. -М.: Мир, 1983.- 376 е., ил.

31. Драговоз И.В., Коць С. Я., Чехун Т. И., Яровская В. К., Волкогон Н. В. Увеличение семенной продуктивности люцерны пр обработке комплексным регулятором роста // Физиология растений.- 2002.- Т. 49.-№ 6.- С. 925-930.

32. Добровольская Т.Г. Структура бактериальных сообществ почв. М.: Наука, 2002.- 282 с.

33. Дудка И.А. Методы экспериментальной микологии: Справочник. Киев.: Наукова думка, 1982. 550 с.

34. Дьяков Ю.Т. Грибы и их значение в жизни природы и человека // Соровский образовательный журнал.- 1997.- №3,- С, 38-45.

35. Завалин A.A., Соколенко В.А., Соколов В.А., Благовещенская Г.Г. Кожемяков А.П. Использование удобрений и арбускулярной микоризы при возделывании вики посевной // Плодородие.- 2007.- N 4. С. 24-26.

36. Зауралов O.A., Колмыкова Т.С. Влияние продолжительности обработки семян регуляторами роста на продуктивность пшеницы и кукурузы // Агрохимия.- 1999.- № 8.- С. 54-56.

37. Зауралов O.A., Курова Е.А., Лукаткин A.C. Влияние цитокининовых препаратов и охлаждения на ростовые реакции растений кукурузы // Агрохимия.- 2000.- № 3.- С. 55-59.

38. Заякин В.В., Нам И .Я. Стимуляция роста абсзизовой кислотой поступления ассимилянтов из оболочки семени к развивающемуся зародышу люпина // Физиология растений.- 1998.-Т. 45.- № 1.-е. 100-107.

39. Иванова А.Б., Анцыгина Л.Л., Ярин А.Ю. Современные аспекты изучения фитогормонов. Цитокинины // Цитология.- 2001.- Т. 43,- № 6,-С. 537-542.

40. Карандашов В. Е., Кузовкина И.Н., Георге Э., Маршнер X. Совместное культивирование арбускулярных микоризных грибов и генетически трансформированных корней растений in vitro // Физиология растений.-1999.- Т. 46.-№ 1.-С. 102-108.

41. Каратыгин И.В.; Сиигиревская Н.С.; Демченко К.Н. Эндомикориза растений в экосистемах раннего девона //Микология и фитопатология.-2006.- T.40.-N 6. С. 494.

42. Клячко Н.Л. Фиторогмоны и цитоскелет // Физиология растений.- 2003.Т. 50.- № 3,- С. 475-480.

43. Коваленко А.Е. Эктомикоризные грибы: ценологический аспект // Микология и фитопатология,- 1994,- Т. 28.- Вьтп 3,- С. 84 91.

44. Кутафьева Н.П. Морфология грибов: Учеб. Пособрте. 2-е изд., испр. и доп. Новосибирск: Сиб. У нив. Изд-во, 2003. - 215 с.

45. Кубузенко С.Н. Влияние экзогенных фиторармонов на рост и солеустойчивость культурных растений // Физиология и биохимия культурных растений.- 1997.- Т. 29.- № 3.- С.220-225.

46. Кудрявцев Д.В., Осипов А.И., Пономарев Л.В. Микробные культуры как регуляторы роста и развития растений на кислой почве//Материалы 2 съезда белоруссокого общества почвоведов «Почвы и их плодородие на рубеже столетий».- Минск: 2001.- 150-152 с.

47. Кузнецов В.В., Дмитриева Г.А. Физиология растений: Учеб. Для вузов. -М.: Высш. Шк., 2005. 736 е.: ил.

48. Кулаева О.Н., Кузнецов B.B. Новейшие достижения и перспективы в области изучения цитокининов // Физиология растений.- 2002.- Т. 49.- № 4.- С. 626-640.

49. Кулаева О.Н., Леонова Т.Г. Регуляторы роста растений в трудах Г.С. Муромцева // Физиология растений.- 2000,- Г. 47.- С. 646-649.

50. Кулаева О.Н 17-я международная конференция по ростовым веществам растений // Физиология растений,- 2002,- Т. 49.- JSfb 2,- С. 330-336.

51. Кулаева О.Н. Идеи Курсанова в исследовании фитогормонов // Физиология растений.- 2000.- Т. 49.- № 1.- С. 85-86.

52. Кушманова О.Д., Ивченко Г.М. Руководство к практическим занятиям по биологической химии: Руководство- М.: Медицина., 1974. 424 с.

53. Лабутова Н.М. Цикл развития, углеродный обмен и облигатная биотрофность эндомикоризных грибов.- Вестн.С.-Петербург.ун-та.Сер.З, 2006; N 1.-С. 200-209.

54. Лавренков В.К., Лавренкова Г.В. Полная энциклопедия лекарственных растений. Том 1-2.СПб.: «Издательский дом "Нева"»; М.: «Олма-пресс», 1999.-816 с.

55. Ленгелер Й. , Г. Древе, Г. Шлегеля. Современная микробиология. Прокариоты: В 2-х томах. Пер. с с англ. М: Мир, 2005. - 656 е.: 16 с.

56. Леонова Т.Г., Барчукова А.Я., Кудрявцев H.A. Природный регулятор роста Фузикотщин // Достижения науки и техники,- 2003,- С. 12-13.

57. Лобакова Е.С. Ассоциативные микроорганизмы растительных симбиозов: Автореферат дисс. докт. биол. наук. М., 2004. - 44 с.

58. Маргелис Л. Роль симбиоза в эволюции клетки. М.: Мир, 1983.- 354 с.

59. Марфенина O.E. Антропогенная экология почвенных грибов.- М.: Медицина для всех, 2005.-196 с.

60. Матевосян Г. Л., Кудашов А. А., Езаов А. Е. Влияние фиторегуляторов и биопрепаратов на рост, развитие, урожайность и устойчивость томата к вирусной инфекции // Агрохимия.- 2001.- № 3.- С. 51-56.

61. Матвеева Н.М. Влияние предпосевного термического закаливания семян и обработки их синтетическими аналогами цитокининов на физиологические процессы и продуктивность огурца и моркови: Автореф. дис.канд. биол. наук. М., 1989. - 30 с.

62. Махачкова И., Крекуле Я. Шестьдесят пять лет исследования сигналов, приводящих к цветению/,'Физиология растений.-2002.-Т.49.- № 4.- С. 507-515.

63. Меденцев А.Г. Аринбасарова А.Ю. Акименко В.К. Биосинтез нафтохиноновых пигментов грибами рода Fusarium // Прикл.биохимия и микробиология, 2005,- Т.41.- N 5. С. 573-577.

64. Мирчинк Т.Г. Почвенная микробиология.- М.: Изд-во МГУ, 1998.-220 с.

65. Назаров A.B.; Иларионов С.А. Потенциал использования микробно-растительного взаимодействия для биоремедиации.- Биотехнология, 2005; N5.-С. 54-62.

66. Наумкина Т.С., Борисов Ю.А.; Штарк А.Ю. Эндомикоризный симбиоз /У Науч.- техн. Бюл. Всерос. Науч. исслед. Ин-т зернобовых и крупяных культур. -2005.- С. 85-90.

67. Нечаев А.П., Траубенберг С.Е., Кочеткова A.A. Пищевая химия. Издание 3-е, испр. СПб.: ГИОРД, 2004. - 640 с.

68. Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М. Практикум по микробиологии: Учеб. Пособие для студ. высш. учеб. заведений. М.: Издательский центр «Академия», 2005. - 608 с.

69. Нетрусов А.И., Бонч-Осмоловская Е.А., Горленко В.М. Экология микроорганизмов: Учеб. Для студ. Вузов. М.: Издательский центр «Академия», 2004. - 272 с.

70. Нещадим Н.Н. Урожай и качество продукции сахарного тросника при обработке черенков стимуляторами роста: Автореф. дис.канд. биол. наук. Краснодар, 1994.

71. Обручева Н.В., Антипова О.В. Физиология инициации прорастания семян // Физиология растений,- 1997.- Т. № 2.- С. 287-302

72. Озерецкая О.Л., Джавахия В.Г., Багирова С.Ф.

73. Общая и молекулярная фитопатология: Учеб. Пособие. Дьяков Ю. Т. -М. Изд-во Общество фитопатологов.- 2001. 302 с.

74. Патыка В.Ф., Андреева Н.А., Косенко Н.Н., Чайковская Л.А. Везикулярно арбуекулярные микоризные грибы, их роль и значение в биоценозах // Физиология и биохимия культурных растений.- 1997.- Т. 29.-№3.-С. 163-171.

75. Пилыцикова Н.В. Физиология растений с основами микробиологии. -М.: Мир, 2004. 184 е.: ил.

76. Перт С.Д. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.: Мир, 1978.-321с.

77. Полевой В.В. Физиология целостности растительного организма // Физиология растений,- 2001.- Т. 48.- № 4,- С. 631-643.

78. Полянская Л.М., Ведина О.В., Лысак Л.В., Звягинцев Д.Г. Стимуляция роста растений культурами Beijerinckia и Clostridium /./ Микробиология.-2002,- Т. 71.-№ 1.-С. 123-129.

79. Пономаренко С.П. , Гашников Э.Г. Определение типа физиологической активности эмистима с использованием специфических биотестов // Аграр.Россия, 1999; N 1 (2). С. 15-16.

80. Попова М.П., Золотарь P.M. Защитное действие брассиностероидов на растения огурца в условиях пониженной температуры: Тезисы докладов шестой международной конференции «Регуляторы роста и развития растений», 2001.- 116-117 с.

81. Пороховинова Е.А. Лутова Л.А. Молекулярно-генетические механизмы устойчивости высших растений к патогенам // С.-х. биология. Сер. Биология растений.- 2000.- N 5, С. 20-30.

82. Починок X. Н. Методы биохимического анализа растений // Из-во: «Наукова думка», Киев 1976 г. - 333 с.

83. Проворов H.A., Борисов А.Ю., Тихонович И.А. Сравнительная генетика и эволюционная морфология симбиозов растений с микробами-азотфиксаторами и эндомикоризными грибами .// Журнал общей биологии,- 2002.- Т. 63.- № 6.- С. 451-472.

84. Проворов H.A. Происхождение и эволюция бобово-ризобиального симбиоза II Общая Биология 2001.- Т. 62.- С. 472-495.

85. Проворов H.A.; Воробьев НИ.; Андронов Е.Е. Макро- и микроэволюция бактерий в системах симбиоза// Генетика, 2008; Т.44, N 1. С. 12-28.

86. Пус-товойтова Т.Н., Жданова НЕ., Жолкевич В.Н. Последовательность изменений содержания ИУК и АБК в листьях огурца при прогрессирующей почвенной засухе // Физиология растений.- 2004.- Т. 51.- №4,- С. 569-574

87. Рожнова H.A., Геращенков Г.А., Бабоша A.B. Действие арахидоновой кислоты и вирусной инфекции на активность фитогемагглютинов при формировании устойчивости у табака // Физиология растений.- 2003.- Т. 50.-№5.-С. 738-743.

88. Рожнова H.A., Геращенков Г.А., Янина М.М., Гилязетдинов III.Я. Эмистим индуктор устойчивости к вирусным болезням пасленовых // Аграрная Россия. Научно-производственный бюллетень .- 1999. - №1 — С. 35-39.

89. Романов Г.А. Международный симпозиум «Ауксины и цитокинины в развитии растений» (Прага, 26-30 июля 1999 г.) // Физиология растений.-2000.- Т. 47.-№ 1С. 166-169.

90. Романов Г.А. Рецепторы фитогирмонов // Физиология растений.- 2002,Т. 49.-№4.- С. 615-625.

91. Роньжина Е.С. Регуляция цитокининами деления и растяжения клеток мезофилла в онтогенезе листа Cucurbita pepo // Физиология растений,-2003.- Т. 50.- № 5.- С. 722-732.

92. Роньжина Е.С. Сравнительный анализ действия фузикокцина, АБК и Б Ail на транспорт и распределение веществ в изолированных листьях в связи с проблемой аттрагирующего эффекта цитокининов // Физиология растений.- 2004.- Т. 51.- № 4.- С. 493-499.

93. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды: Пер. с англ.- М.: Мир, 1987.-411 с.

94. Селиванкина С.ТО., Каравай ко H.H., Земляченко Я.В., Маслова Г.Г., Кулаева О.И. Регуляция рецептором цитокинина в система in vitro // Физиология растений,- 2001.- Т. 48.- №3.- С. 434-440.

95. Селиванов И.А. Современные представления о систематике грибов, образующих везикулярно-арбускулярные эндомикоризы. М.:, 1987.120 с.

96. Скоробогатова И.В., Захарова Е.В., Карсункина Н.П., Курапов П.Б., Соркина Г.Д., Кислин E.H. Изменение содержания фиторогмонов в проростках ячменя в онтогенезе и при внесении регуляторов, стимулирующих рост//Агрохимия.- 1999.-№ 8.-С. 49-53.

97. Смешевский H.Д. Влияние сочетаний витаминов и фитогормонов на физиологические процессы огурца: Тез. докл. итог. науч. конф. АПГУ. -М.: 2000.

98. Соловьева Н.Ф., Савеико В.Г. Современные технические средства для опрыскивания сельскохозяйственных культур: Сер. «Б-чка фермера». -М.: ФГНУ «Роисинформагротех», 2002. 60 с.

99. Соколова H.A. Использование ВАМ-грибов в агроценозе для регулирования фосфорного питания растений на обычных и эродированных черноземах // Автореферат дисс. канд. биол. наук. М., 1995. -20 с.

100. Соколова H.A., Пахненко O.A., Дурынина Е.П. Питание и продуктивность растений при инокуляции их ВАМ грибами // Агрохимия.- 1998,- № 5,- С. 51-57.

101. Софронова В.Е.; Петров К.А. Новый фенольный ингибитор роста из почек Duschekia fruticosa (Rupr.) Pouzar //Раст.ресурсы.- 2002.- T.38.- N 1. С. 92-96.

102. Строев Е.А., Макарова В.Г. Практикум по биологической химии: Учеб. Пособие для фармац. Вузов и фак.- М.: Высш. Шк., 1986. 231 с.

103. Тарасенко С.А., Дорошкевич Е.И., Тарасенко B.C. Влияние стимуляторов роста на урожай и качество сельскохозяйственных культур// Тез. докл. шестой международной конференции «Регуляторы роста и развития растений», 2001.- 280 с.

104. Табаленкова Г.Н., Куренкова C.B. Использование регуляторов роста при выращивании рапонтикума сафлоровидного // Агрохимия.- 2001.- JMb 3,-С. 35-41.

105. Торхова И.А. Эффективность использования фосфатмобилизующей микоризы на рекультивированных землях.- Биологическая рекультивация и мониторинг нарушенных земель, 2007. С. 616-619

106. Хранин В.Н. Роль фитогормонов в дифференциации пола у растений // Физиология растений.- 2002.- Т. 49.- № 4.- С. 608-614.

107. Хохлова JT.1T, Олипевич О.В. Реорганизация цитоскелета в клетках Triticum aestivum при закаливании растений к холоду и действии абсзизовой кислоты//Физиология растений.-2000.-Т. 50.- № 4.- С.528-540

108. Цавкелова Е. А., Климова С. Ю., Чердьтнцева Т. А., Нетрусов А. И. Микроорганизмы продуценты стимуляторов роста растений и их практическое применение // Прикладная биохомия и микробиология.-2006,- Т. 42,-№2.- С. 133-143.

109. Чераланова Н.П. Систематика грибов: Учеб. Пособие. 2-е изд. - СПб.: Изд-во С.-Петерб. Ун-та, 2005. - 344 с.

110. Четверикова H.П. Роль абсцизовой кислоты в морозоустойчивости растений и криоконсервация культур in vitro // Физиология растений.1999.- Т. 46.- № 5.-С. 823-829.

111. Шевелуха B.C., Калашникова Е.А., Воронин Е.С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология: Учеб. Пособие. 2-2 изд., перераб. и доп. М.: Высш. Шк., 2003. - 469 с.

112. Шевченко А.И., Турчешок Л.А., Шевченко М.А. Качество зерна яровой пшеницы при допосевном применении биологически активных веществ: Тезисы докладов шестой международной конференции «Регуляторы роста и развития растений», 2001.- 296 с.

113. Шлегель Г.Г. История микробиологии:Пер. с нем.-М.:УРСС,2002.-304 с.

114. Шлегель Г. Г. Общая микробиология : Пер. с нем.-М.: Мир, 1987, 567 с.

115. Янкелевич Р.К., Басинская Е.А. Влияние регуляторов роста растений на продуктивность растений кукурузы /У Тезисы докладов шестой международной конференции «Регуляторы роста и развития растений», 2001.-С. 298-299.

116. Янчевская Т.Г., Ольшаникова А. Л., Вербицка H.A. Действие на растения картофеля биологическиактивных веществ природного происхождения: Тезисы докладов шестой международной конференции «Регуляторы роста и развития растений», 2001 .-С. 299.

117. Ячевский A.A. Определитель грибов: Несовершенные грибы.- М.: Кинда, 1917. 803 е., ил.

118. Aikavva J., Ishii T., Kuramoto M., Kadoya К. Growth stimulants for VAM fungi in Satsuma Mandarin Pomace // J. Japan. Soc. Hon. Sei.- 2000.- No.69.-Vol. 4.-P. 385-389.

119. A new EU COST action on mycorrhiza: first meeting in Nancy, France i i Mycorrhiza.- 2000.- No. 10.- P. 49-50.

120. Bago B., Azcon-Aguilar C. Piche Y. Architecture and developmental dynamics of the external mycelium of the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus intradices grown under monoxenic conditions //Mycologia.-1998.- 90 (1).- P.52-62.

121. Berbee M.L., Taylor J. W. From 18S ribosomal sequence date to evolution of morphology among the fungi // Can. Journ. Bot. 1995. Vol.73, suppl.l. P. S677-S683.

122. Bever J.D., Schultz P.A., Pringle A., Morton J.B. Arbuscular Mycorrhizal Fungi: more diverse than meets the a) e, and the ecological tale of why // Bioscience.- 2001.- Vol 51.- No 11.- P. 923-931.

123. Bleecker A.B., Kende H. Ethylene: a Gaseous Signal Molecule in Plant H Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2000.V. 16. P. 1-18.

124. Bolton H. et. al. Microbial ecology of the rhizosphere // Soil Microbial Ecology. Meettin F.B., Basel N.Y. (eds)// Hong Kong: Marcel Dekker Inc.-1993.-P. 27-63.

125. Borisov A.Y., Madsen L.H., Tsyganov V.E., Umehara Y. Voroshilova V.A., Batagov A.O., Sandal N., Frederiksen A., Schauser L., Ellis N., Tikhonovich I.A., Stougaard J, The Sym35 gene required for root nodule development in

126. Pisum sativum is an orthologue of Nin from Lotus japonic us. /7 Plant Physiology.- 2003.-V. 131.- P. 1009-1017.

127. Borisov A.Y., Morzhina E.V., Kulikova O.A., Tchetkova S.A., Lebsky V.K., Tikhonovich I.A. New symbiotic mutants of pea (Pisum sativum L.) affecting either nodule initiation and symbiosome development// Symbiosis.- 1992.-No. 14,-P. 297-313.

128. Cairney J. \V. G. Evolution of mycorrhiza systems // Naturwissenschaflen. 2000. Bd. 87. H. 11. S. 467-475.

129. Castellano M. A., Bougher N.L. Consideration of the taxonomy and biodiversity of Australian ectomvcorrhizal fungi // Plant and Soil.- 1994,1. J O1. Vol. 159.-P. 37-46.

130. Castellano M.A.; Cazares E.; Fondrick B.; Dreisbach T. Fiandbook to additional fungal species of special concern in the Northwest forest plan: Portland.- 2003. P.- 144.

131. Clark R.B., Zeto S.K. Mineral acquisition by Arbuscular Mycorrhizal Plants U Jomal of plant nutrition.- 2000.-No. 23.-Vol.7.-P. 867-902.

132. Chang C., Kwok S.F., Bleecker A.B. Meyerowntz Arabidopsis Ethyleneeresponse Gene ETR1: Similarity of Product to Twoocomponent

133. Regulators // Science. 1993. V. 262. P. 539-544.

134. Dalpe Y.; Litten W.; Sigler L, Scytalidium vaccinii sp. nov., an ericoid endophyte of Vccinium angustifolium roots// Mycotaxon.- 1989.- T. 35.- No 2.-P. 371-377.

135. Diallo A.T., Samb P.L., Ducousso M. Distribution et diversite des champignons endomycorhiziens (Glomales) du Senegal // Tropicultura.-1998-99.-Vol.4.- P. 161-166.

136. Dobereiner J. et al. New N2 fixing bacteria in association with cereals and sugar cane // Nitrogen fixation: hundred years after// Stuttgart, N-Y.- 1988.- P. 717-722.

137. Dodd J. C., Thomson B.D. The screening and selection of inoculant arbuzcular-mycoirhizal and ectomycorrhizal fungi // Plant and Soil.- 1994.-Vol. 159.-P. 149-158.

138. Douglas A.E. Symbiotic interaction. Oxford Univer. Press: Oxford:Y-N, Toronto, 1994. P.-148.

139. Douds D.D. jr; Nagahashi G.; Pfeffer P.E.; Kayser W.M.; Reider C. On-farm production and utilization of arbuscular mycorrhizal fungus inoculum.-Canad.J.Plant Sc. 2005; r.85, N 1. P. 15-21.

140. Fujioka S., Yokota T. Biosynthesis and metabolism of brassinosteroids // Annual review of plant biologe,- 2003,- Vol. 54,- P. 137-164.

141. Godeas A., Fracchia S., Mujica M. T., Jcampo J. A. Influence of soil impoverishment on the interaction between Glomus mosseae and saprobe fungi // Mycorrhiza Abstract.- 1999.-Vol. 9.- P. 185-189.

142. Gupta N.K., Gupta S., Kumar A. Exogenous cytokinin application increases cell membrane and chlorophyll stability in wheat ii Cerial Reseach Communication.- 2000,- No 3.- Vol. 28.- P.287-291.

143. Hame1 C.; Strullu D.-G. Arbuscular mycorrhizal fungi in field crop production: Potential and new direction Canad.J.Plant Sc., 2006; T.86, N 4. -P. 941-950.

144. Harrison M.J. Signaling in the Arbuscular Mycorrhiza! Symbiosis // Annu. rev. of microbiology.- L.N.Omston, ed.- 2005.-Vol.59. P. 19-42.

145. Heinstein P.F., Chang C.-J. Taxol. Ann.Rev.Plant Physiol/./Plant molec.Biol. -Palo Alto(Calif.).- 1994.- Vol.45.- P. 663-674.

146. Honold A., Maifeld D. Oberwinkler F.Endephytische Pilze der Fichte ein Potential von Antagonisten zur biologischen Kontrolle vov Heterobasidio annosum // Mitt. Biol. Bundesants. Land- and Forstwirt. Berlin-Dahlem. -1998. - № 357. - C. 339 - 340.

147. Jacobi L.M., Petrova O.S., Tsyganov V.E., Borisov A.Y., Tikhonovich I.A. 2003a. Effect of mutations in the pea genes Sym33 and Sym40. I. Arbuscular mycorrhiza formation and function. // Mycorrhiza.- 2003.- V. 13.- P. 3-7.

148. Jacobi L.M., Zubkova L.A., Barmicheva E.M., Tsyganov V.E., Borisov A.Y., Tikhonovich LA. Effect of mutations in the pea genes Sym33 and Sym40. II. Dynamics of arbuscule development and turnover. // Mycorrhiza.- 2003.- V. 13.-P. 9-16.

149. Jolicoeur M., Williams R.D., Chavarie C., Fortin J.A., Archambault J. Production of Glomus intraradices propagules, an arbuscular mycorrhizalfungus, in an airlift bioreactor// Biotechnology and Bioengineering.- 1999.-vol. 63.-no. 2.-P. 224-231.

150. Kim Y.S., Kim D.H., Jung J. Isolation of a Novel Auxin Receptor from Soluble Fractions of Rice (Oryza sativa L.) Shoots /7 FEBS Lett. 1998. V. 438. P. 241-44.

151. Kabir Z. Tillage or no-tillage: Impact on mycorrhizae.- Canad.J.Plant Sc., 2005; T.85, N 1. P. 23-29.

152. Lan Qi, Ji Zhi-qin, Gu Ai-guo, Shi Bao-Jin, Wu Wen-Jin. Xibei nonglin keji daxue xuebao. Ziran kexue ban J. Norwest Sci-Tech Univ. Agr. And Forest// Nat. Sci. Ed. - 2004. - 32. № 10. - C. 79-84.

153. Leblanc N., PeiTOttRechenmann C., BarbierrBrygoo H. The AuxinnBinding Protein NttERabpl Alone Activates an AuxinnLike Transduction Pathway // FEBS Lett. 1999. V. 449. P. 57-60.

154. Lechno-Yossef S., Nierzwicki-Bauer S.A. Azolla-Anabaena symbiosis // Cyanobacteria symbiosis. A.N. Rai ey ai. (eds.). Kluwer Acad. Publ.: Dortmoot.-2002.-P. 153-178.

155. Maier W., Schmidt J., Nimtz M., Wray V., Strack D. Secondary products in mycorrhizal roots of tobacco and tomato // Phytochemistry 54,- 2000.- P. 473479.

156. Matsubayahi Y.; Sakagami Y. Peptide Hormones in Plants // Annu. rev. of plant biology / Merchant S. e.a., ed.- 2006,- Vol.57. P. 649-674.

157. Mohammad A., Khan A. G., Kuek C. Improved aeroponic culture of inocula of arbuscular mycorrhizal fungi /7 Mycorrhiza. -2000.- No 9.- P. 337-339.

158. Mok D.WS., Mole M.C. Cytokinin metabolism and action // Annual review of plant physiologi and plant molecular biologi,- 2001.- Vol. 52.- P. 89-118.

159. Morton J.B., Bentivenga S.P. Levels of diversity in endomycorrhizal fungi (Glome ral es, Zygomycetes) and their role in defining taxonomic and non-taxonomic groups // Plant and Soil.- 1994.- Vol. 159.- P. 47-59.

160. Morzhina E.V., Tsyganov V.E., Borisov A.Y., Lebsky V.K., Tikhonovich T.A. Four developmental stages identified by genetic dissection of pea (Pisum sativum L.) root nodule morphogenesis. // Plant Science.- 2000.- V. 155.- № 1.-P. 75-83.

161. Napier R.M.; Venis M.A.Receptors for plant growth regulators: recent advances // Plant Growth Régulât.-1990.- T. 9. N 2.-P. 113-126.

162. Peterson R.L., Bonfante P. Comparative structure of vesicular arbuscular mycorrhizal and ectomycorrhizas //Plant and Soil.- 1994,- Vol. 159.-P. 79-88.

163. Pirozynski K.A., Dalpe Y. Geological history of the Glomaceae with particular reference to mycorrhizal symbiosis/7Symbiosis.1989. Vol.7 P. 1-36.

164. Pospisilova J., Synkova FT., Ruicova J. Cytokinins and water stress // Biologia Plantarum 43 (3).- 2000,- P. 321-328.

165. Pritsch K., Munch J., Buscot F. Identification and differentiation of mycorrhizal isolates of black alder by sequence analysis of the ITS region /7 Mycorrhiza.- 2000,- No 10.- P. 87-93.

166. Ramesh C., Chellappan P., Mahadevan A. X-Rav microanalysis of elements of VA mycorrhizal and non-mycorrhizal Pennisetum pedicellatum roots // Indian Jornal of Experimental Biology.- 2000.-Vol. 38.- P.396-398.

167. Redeker D., Thierfelder H., Werner D. A new cultivation system for arbuscular mycorrhizal fungi on glass beads // Angew. 1995. - Bot. 69. -P.189-191.

168. Redeker D., Molecular identification and phylogeny of arbuscular mycorrhizal fungi .//'Plant and Soil. 2002. Vol. 2441-2. P.67-73.

169. Redeker D., Konder R., Graham L.E. Palaeogmus grayi from the Ordovician .// Mycotaxon. 2002. Vol. 84, oct. dec.P.33-37.

170. Remv W., Tailor T.N., Hass 11., Kerp H. Four Hundred Million - Year -Old Vesicular Arbuscular Mycorrhizae // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.-1994. V. 91. p. H841 - 11843.

171. Rusty Rodriguez; Regina Redman. More than 400 million years of evolution and some plants still can't make it on their own: plant stress tolerance via fungal symbiosis.- Journal of Experimental Botany; Oxford, Mar 2008; Vol.59, Iss.5; P. 1109-1114.

172. Salamini F. North-South Innovation Transfer // Nature Biotech.-1999,-Vol.l7.-Suppl. P. BV11-BV12.

173. Sato K.; Saito K.; Sugawara K. Effects of Phosphate Fertilization on Symbiotic Associations between White Clover and Arbuscular Mycorrhizal

174. Fungi and the Fungal Community Structures Grassland Sc., 2006; T.51, N 4. -P. 333-340.

175. Srinivasan M., Natarajan K., Nagarajan G. Growth optimization of an ectomycorrhizal fungus with respect to pH and temperature in vitro, using Design of Experiments // Bioprocess Engineering.- 2000,- No 22.- P. 267-273

176. Stenstrom E., Damm E., Unestam T. Le role des mycorhizes dans la protection des arbres forestiers contre les agents pathobenes du sol // Rev. forest. Fr. 1997. - 49, Num. special. C. 121-128.

177. Stock A.M., Robinson V.L., Goudreau P.N. TwooComponent Signal Transduction // Annu. Rev. Biochem. 2000. V. 69. P. 183-216.

178. Taylor T.N., Hass H., Remy W., Kerp H. The oldest fossil lichen // Nature. 1995. Vol. 378. № 6554. P.244.

179. Taylor T.N. Fungai association in the terrestrial palaeoecosystems // Tree. 1990. Vol. 5. № l.P. 21-25.

180. Thomas D. Brans. Thoughts on the processed that maintain local species diversity of ectomycorrhizal fungi // lants and Soil.- 1995.- Vol 170.-P. 63-73,

181. Venis M.A., Napier R.M. Auxin Receptors and Auxin Binding Proteins // Crit. Rev. Plant Sci. 1995. V. 14.P. 27-41.

182. Vratny P., Ouhrabkova J., Copikova J. Liquid chromatography of non-reducing oligosaccharides: a new detection principle. /7 Journal of Chromatography.- 1980.-V. 191.-№ L-P. 313-317.

183. ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

184. ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧЕРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ»

185. РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИИ ПРЕПАРАТА РЕГУЛЯТОРА РОСТА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ НА ОСНОВЕ СИНТЕЗА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ МИКРОМИЦЕТОМ РМаІосерИаІа /огіїпії

186. Специальность: 05.18.07 Биотехнология пищевых продуктов ибиологических активных веществна соискание ученой степени кандидата технических наук1. На правах рукописи042.01 2 50 29 6 "

187. СИНЧУРИНА ЕКАТЕРИНА ВЛАДИМИРОВ1. ДИССЕРТАЦИЯ

188. Научный руководитель: доктор технических наук, профессор Иванова Л.А.1. Москва 2011