автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Разработка научных основ новых технологий пищевых добавок и ингредиентов с использованием крахмалсодержащего сырья

На правах рукописи

ШАРОВА НАТАЛЬЯ ЮРЬЕВНА

РАЗРАБОТКА НАУЧНЫХ ОСНОВ НОВЫХ ТЕХНОЛОГИЙ ПИЩЕВЫХ ДОБАВОК И ИНГРЕДИЕНТОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КРАХМАЛСОДЕРЖАЩЕГО СЫРЬЯ

Специальность 05.18.07. — Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук

Санкт-Петербург 2013

17 окт т

005535102

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте пищевых ароматизаторов, кислот и красителей Российской академии сельскохозяйственных наук

Научный консультант: Никифорова Татьяна Алексеевна,

доктор технических наук, профессор

Официальные оппоненты: Красникова Людмила Васильевна,

доктор технических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «СПб НИУ ИТМО», профессор кафедры органической, физической, биологической химии и микробиологии

Римарева Любовь Вячеславовна, доктор технических наук, член-корреспондент Россельхозакадемии, ГНУ ВНИИПБТ Россельхозакадемии, заместитель директора по научной работе

Фридман Илья Абрамович, доктор технических наук, профессор, ГБОУ ВПО СПХФА Минздрава России, заведующий кафедрой химической технологии лекарственных веществ и витаминов

Ведущая организация - Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет)» (СПбГТИ (ТУ))

Защита состоится 2013 г. в 14 часов на заседании

диссертационного совета Д 212.227.09 при Санкт-Петербургском национальном исследовательском университете информационных технологий, механики и оптики (НИУ ИТМО) по адресу: 191002, г. Санкт-Петербург, ул. Ломоносова, 9, тел./факс (812)315-30-15

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИУ ИТМО.

Автореферат разослан « »

тЯ^ЯЮП г.

Ученый секретарь диссертационного

совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время потребности пищевой индустрии в сырье и пищевых добавках как технологического, так и функционального действия в значительной степени решаются за счет импортных поставок. Среди пищевых добавок определенную нишу занимают ингредиенты -продукты микробного синтеза. К их числу относятся широко используемые в пищевой промышленности лимонная кислота и ферменты амилолитического действия. Однако объемы производства в РФ этих ингредиентов, необходимых целому ряду отраслей (кондитерская, спиртовая, крахмалопаточная и др.), ниже существующих потребностей: по лимонной кислоте почти в три раза, по амилолитическим ферментам - в два раза.

К числу факторов, влияющих на развитие отечественной индустрии пищевых добавок, относятся ограниченность собственной сырьевой базы, недостаток инновационных технологий, позволяющих на базе имеющегося сырья решить проблему импортзамещения. Необходимо учитывать при этом возросшие в стране требования по экологическим нагрузкам на окружающую среду, что выдвигает новые требования к создаваемым технологиям и к действующим предприятиям. Поэтому разработка научных основ технологий микробного синтеза, базирующихся на отечественных источниках сырья, исключающих применение в технологическом процессе токсичных химических элементов, расширяющих номенклатуру и объемы отечественных пищевых ингредиентов, является актуальным направлением научных исследований.

Научные основы технологий лимонной кислоты с использованием углеводсодержащего сырья и продуцента Aspergillus niger разработаны B.C. Омелянксим, С.П. Костычевым, С.В. Буткевич, Г.И. Журавским, О.Ф. Терентьевой, Е.С. Минц, Е.Б. Львовой, JT.H. Мушниковой, И.А. Аглиш, Т.А. Никифоровой и др. В течение 50 лет с момента организации в России профильного производства единственным промышленным сырьем является свекловичная меласса, состав которой требует постоянного контроля при его отборе, хранении, а также и в процессе химпереработки, сопровождающейся загрязняющими стоками, выбросами и утилизируемыми отходами. К числу перспективных сырьевых ресурсов, имеющих стабильную возобновляемую основу, относятся крахмалсодержащие зерновые культуры, широко возделываемые в РФ, свойства которых используется не в полной мере. В зарубежном производстве лимонной кислоты прослеживается тенденция к внедрению крахмалсодержащего сырья (Н. Василев, V.S. Shankaranand, Yu Yun-ling, W. Lesniak, K. Tsekova, G. Xie и др.). Поскольку оно может индуцировать биосинтез амилаз, то применение его в технологиях синтеза лимонной кислоты создает возможность максимальной реализации потенциала микромицетов рода Aspergillus в части получения еще одного целевого продукта, а именно, амилолитических ферментов. Крахмалсодержащее сырье может использоваться актиномицетами рода Streptomyces для продуцирования и ингибиторов амилаз с широкой специфичностью действия. Таким образом, крахмалсодержащее сырье перспективно для создания многопрофильного биотехнологического производства как индивидуальных, так и комплексных, функциональных пищевых добавок, дефицит которых существует на российском рынке.

В основу научного решения проблемы создания многоцелевого процесса положена концепция системного анализа нетрадиционных источников сырья с целью экологизации микробиологического производства за счет перехода на экологически чистое сырье - гидролизаты крахмалов, а также комплексного подхода к регуляции биосинтеза целевых продуктов и создания инновационных технологий ингредиентов, востребованных на российском рынке.

Цель работы - разработка научных основ и создание новых экологически безопасных технологий пищевых ингредиентов и добавок, содержащих продукты метаболизма микроорганизмов различных таксономических групп, при ферментации крахмалсодержащего сырья.

В задачи исследований входило проведение комплексных исследований, направленных на обоснование возможности получения с использованием гидролизатов крахмала в едином технологическом процессе нескольких целевых продуктов - лимонной кислоты и амилаз, а также ингибиторов гликозидаз, а именно:

- разработка способов подготовки сырья - крахмала для получения лимонной кислоты, ферментов и ингибиторов;

- выбор штаммов - продуцентов для получения лимонной кислоты, ферментов и ингибиторов гликозидаз, проведение скрининга;

- исследование механизмов биосинтеза и секреции а-амилазы и глюкоамилазы — ключевых ферментов углеводного метаболизма при биоконверсии гидролизатов крахмала в лимонную кислоту микромицетом Aspergillus niger, их кинетических и обменных характеристик, стабильности в клетке продуцента и во внеклеточном пространстве для установления путей регуляции продуцирования;

- научное обоснование параметров формирования активного вегетативного посевного мицелия продуцентов и технологических режимов культивирования штаммов-кислотообразователей Aspergillus niger и штаммов актиномицетов рода Streptomyces для повышения выхода и активности соответственно амилолитических ферментов и ингибиторов амилаз;

- исследование закономерностей биосинтеза ингибиторов амилаз стрептомицетами и установление химической природы целевых метаболитов;

- разработка способов выделения лимонной кислоты, амилаз и ингибиторов амилаз;

- изучение физико-химических и биохимических свойств амилаз и ингибиторов гликозидаз в составах препаратов и оценка их биологической безопасности для разработки комплексных пищевых добавок и установления эффективности их применения в технологиях хлебобулочных изделий и пива;

- разработка технологий и технической документации на производство в одном технологическом процессе лимонной кислоты, комплексного ферментного препарата кислотостабильных амилаз и комплексной пищевой добавки на его основе, технологии ингибиторов амилаз и функциональной комплексной пищевой добавки на его основе; рекомендации по применению новых пищевых ингредиентов и добавок в пищевой промышленности.

Научная новизна заключается в следующем: - установлены закономерности биосинтеза лимонной кислоты при ферментации гидролизатов

крахмалов, на основании которых впервые разработаны приемы изменения направленности биотехнологического процесса с целью получения наряду с основным метаболитом ферментов амилолитического действия в качестве целевых продуктов микробиологического синтеза; обоснован механизм биосинтеза и секреции а-амилазы и глюкоамилазы, их роль в биоконверсии углеводов среды в процессе кислотообразования и установлены пути регуляции метаболизма микромицета Aspergillus niger для повышения эффективности продуцирования лимонной кислоты и амилаз;

- дана оценка стабильности, кинетических и обменных характеристик амилаз для корректного определения их активности в клетках продуцента и культуральной среде и исследованы биокаталитические, физико-химические свойства, компонентный состав, микрофлора ферментных препаратов и выявлены направления их применения;

- разработаны эффективные, экологически безопасные способы выделения целевых продуктов микробного синтеза, позволяющие получать пищевую кристаллическую лимонную кислоту в соответствии с ГОСТ 908-2004 и комплексный препарат кислотостабильных ферментов Глюкоамилонигрин с активностями амилаз на уровне мультиэнзимных композиций, декларируемых зарубежными фирмами, и высокоочищенные препараты амилаз;

- установлено наличие в культуральной жидкости, полученной в процессе ферментации гидролизатов крахмалов в лимонную кислоту, ингибиторов амилаз и выявлено их структурное подобие известным ингибиторам гликозидаз псевдосахаридной природы, синтезируемым актиномицетами рода Streptomyces.

- путем ступенчатого отбора из культур актиномицетов коллекции ГНУ ВНИИПАКК Россельхозакадемии выделены и запатентованы штаммы Streptomyces lucensis ВКПМ Ас-1743 и Streptomyces violaceus Ас-1734 -продуценты ингибиторов амилаз;

- исследовано влияние углеводов различной структуры, степени деструкции крахмалсодержащего сырья на биосинтез ингибитора амилаз и обоснована целесообразность использования в качестве источника сырья гидролизатов кукурузного крахмала;

- выявлены закономерности биосинтеза ингибиторов амилаз, разработаны составы питательных сред и определены условия культивирования продуцентов для продуктивного биосинтеза целевых метаболитов;

- установлена природа выделенных ингибиторов и разработан способ получения препаратов с активностью на уровне и выше известных аналогов;

- установлено гипогликемическое действие полученных ингибиторов гликозидаз в опытах in vivo на лабораторных животных;

- научно обоснованы и разработаны составы комплексных пищевых добавок и изучено их действие в различных пищевых системах; выявлено, что Глюкоамилонигрин, содержащий кислотостабильные гидролазы, способствует интенсификации гидролиза растительных полимеров, а Люцентин и Виолацентин, состав которых включает ингибиторы гликозидаз, снижают уровень легкоусвояемых Сахаров в хлебобулочных изделиях без изменения технологических и органолептических показателей.

Новизна предлагаемых технических решений защищена 12 патентами.

Основные положения, выносимые на защиту:

Закономерности биодеструкции гидролизатов крахмала микроорганизмами различных таксономических групп для разработки «совмещенной» технологии лимонной кислоты и амилаз и технологии ингибиторов гликозидаз.

• Критерии оценки направленности биосинтеза и пути его регуляции при биоконверсии продуктов деструкции крахмала продуцентом лимонной кислоты -микромицетом Aspergillus niger, сформулированные на основе характеристик кинетики и метаболизма синтезируемых им ключевых амилолитических ферментов (а-амилаза и глюкоамилаза) углеводного обмена.

• Особенности биосинтеза ингибиторов гликозидаз при ферментации гидролизатов крахмалов штаммами аспергиллов и актиномицетов; свойства ингибиторов.

■ Обоснование компонентного состава рецептур комплексных пищевых добавок, содержащих кислотостабильные гидролазы и ингибиторы гликозидаз, полифункционального назначения и функционального действия.

• Методология получения пищевых ингредиентов и добавок на основе продуктов биоконверсии деструктурированного крахмал содержащего сырья для расширения ассортимента и повышения рентабельности монопроизводства.

Практическая значимость. На основании материалов исследований разработаны:

• принципиально новые конкурентоспособные на мировом рынке технологии лимонной кислоты и амилаз и комплексной пищевой добавки Глюкоамилонигрин (ТИ 085-00334557-2004, ТИ 091-0034557-2005, ТИ 0920034557-2005);

• инновационные технологии ингибиторов гликозидаз и комплексных пищевых добавок функционального назначения на их основе (ТИ 115-003345572008);

• модифицированный метод определения глюкоамилазной активности в культуральной жидкости, ферментных препаратах и пищевых добавках; утверждены:

• техническая документация на ферментный препарат Глюкоамилонигрин в жидкой и порошкообразной формах (ТУ 9199-002-00334557-04). Получено Санитарно-эпидемиологическое заключение ФГУЗ «Информационно-методический центр «Экспертиза» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека о возможности использования Глюкоамилонигрина в пищевой промышленности (№ 77.99.24.919.Т.001.091.06.05. от 20.06.2005);

• два вида новой продукции - добавки пищевые функционального назначения для продуктов профилактического направления Люцентин (РЦ 234002-00334557-08) и Виолацентин (РЦ 235-002-00334557-08) и соответствующая разработанная техническая документация (ТУ 9199-080-00334557-08, ТУ 9199-081-00334557-08);

• методические указания по применению препарата Глюкоамилонигрин в пищевой промышленности (РД 059-00334557-2004) и методические рекомендации по применению ингибитора гликозидаз в пищевых продуктах

(РД 092-00334557-2008); проведены с положительным результатом опытно-промышленные испытания улучшителя на основе ферментного препарата Глюкоамилонигрин в хлебопекарном производстве и приготовлении пива; препарат ингибитора гликозидаз и комплексные пищевые добавки на его основе испытаны при приготовлении хлеба различных сортов;

• методические указания для оценки содержания конидий продуцента в воздухе рабочей зоны при получении лимонной кислоты в лабораторных или производственных условиях с использованием различных видов сырья, в том числе и крахмалсодержащего: МУК 4.2.2656-10. «Метод микробиологического измерения концентрации клеток штамма-продуцента лимонной кислоты Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе рабочей зоны» (2010);

• требования к качеству гидролизатов крахмалов как к сырью для промышленного производства лимонной кислоты (ГОСТ Р 52672-2006. «Гидролизаты крахмала. Общие технические условия»).

Методология подготовки крахмалов к ферментации использована для разработки новых технологий лимонной кислоты на базе зернового крахмалсодержащего сырья.

Материалы исследований в виде отдельных разделов вошли в монографию «Биосинтез и выделение лимонной кислоты и амилолитических ферментов» (Кулев Д.Х., Шарова Н.Ю., - М.: ДеЛи принт, 2008. - 128 е.), рекомендованную к использованию в учебном процессе высших учебных заведений.

Разработки технологий лимонной кислоты и амилолитических ферментов, ингибиторов гликозидаз и пищевых добавок на их основе награждены дипломами международной выставки-ярмарки «АгроРусь» (2007, 2009), седьмого международного профессионального конкурса «Ингредиент года 2008». Цикл исследований по созданию пищевых композиций антидиабетического направления на основе ингибиторов гликозидаз микробного происхождения в Конкурсе на лучшие инновационные проекты в сфере науки и высшего профессионального образования СПб в 2011 г. признан победителем в номинации «Лучшая научно-инновационная идея» (диплом ИП № 10/11).

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: научно-практических конференциях (НПК) Отделения хранения и переработки сельскохозяйственной продукции Россельхозакадемии (Углич, 2000-2004, 2006, 2007, 2010,2012), Всероссийской НПК «Перспективные технологии пищевых добавок» (СПб, 2007); четвертом Международном семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология - 2000» (СПб, 2000), Международном форуме «Биотехнология и современность» (СПб, 2003, 2006); Международных научно-практических симпозиумах (НПС) по направлению «Микробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК» (Москва, 2004,2006,2008,2010,2012), третьей Международной НПК «Низкотемпературные и пищевые технологии в XXI веке» (СПб, 2007), седьмой Международной конференции «Масложировая индустрия - 2007» (СПб, 2007), Международном форуме «Пищевые ингредиенты - 2008» (Москва, 2008), НПК «Пищевые добавки и современные технологии переработки сельскохозяйственного сырья» (СПб, 2011), Международной НПК «Крахмал и

крахмалопродукты, состояние и перспективы развития» (Москва, 2011), Европейском конгрессе «The first North and East European Congress on Food. NEEFood-2012» (СПб, 2012).

Публикации результатов исследований. Основные положения диссертационной работы изложены в 92 научных работах, в том числе 12 патентах, 2 монографиях. Основные материалы диссертации представлены 35 статьями в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 241 страницах машинописного текста, содержит 73 таблицы и 62 рисунка, состоит из введения, аналитического обзора, объектов, методов и результатов экспериментальных исследований, изложенных в 3 основных главах, заключения, выводов, списка использованных источников и основных обозначений, содержит 53 приложения. Библиографический список состоит из 400 наименований (206 иностранных).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана краткая оценка состояния производства пищевых ингредиентов и добавок - продуктов микробиологического синтеза, наиболее востребованных в качестве пищевых ингредиентов и добавок полифункционального назначения.

В аналитическом' обзоре рассмотрены направления развития пищевой биотехнологии с использованием микроорганизмов и продуктов их метаболизма. Представлен анализ современного состояния производства пищевой лимонной кислоты, амилолитических ферментов и их ингибиторов на лабораторном уровне и в условиях монопроизводства. Отражены особенности микробиологического производства функциональных пищевых ингредиентов, комплексных ферментных препаратов и добавок. Определены общие факторы, влияющие на биосинтез и выделение целевых метаболитов, спрогнозирована перспективность и возможность их получения в одном технологическом процессе. Обоснована актуальность рассмотрения поставленной проблемы, целесообразность проведения намеченных исследований, сформулированы цель, задачи, научная новизна и практическая значимость выносимых на защиту положений. Схема проведения эксперимента приведена на рисунке 1.

Объектами исследований являлись промышленные штаммы-продуценты лимонной кислоты Aspergillus niger, полученные методом мутагенеза (ВКПМ F-171 (Л-4), ВКПМ F-326 (Л-5), ВКПМ F-681 (В-1), ВКПМ F-696 (В-2), ВКПМ F-719 (В-3)) и вегетативной гибридизации (ВКПМ F-501 (Л-7)), и культуры актиномицетов из коллекции ГНУ ВНИИПАКК Росельхозакадемии; крахмалсодержащее сырье и его гидролизаты; культуральная жидкость (КЖ) и нативные растворы', лимонная кислота; ферменты, синтезируемые штаммами-кислотообразователями Aspergillus niger; ингибиторы гликозидаз, продуцируемые культурами аспергиллов и стрептомицетов; комплексные ферментные препараты (КФП) и комплексные пищевые добавки (КПД), составы которых разработаны на основе лимонной кислоты, амилаз и их ингибиторов. Культивирование микроорганизмов проводили в условиях шейкера-инкубатора Multitron (Швейцария), встряхивающего аппарата АВУ-50Р (Россия) и экспериментально-промышленной установки ГНУ ВНИИПАКК Россельхозакадемии.

Рисунок 1 - Схема проведения экспериментальных исследований

Методы исследований. В работе использованы общепринятые и стандартизованные в производствах лимонной кислоты и ферментов методы, в том числе хроматографические, колориметрические, биохимические, радиоизотопый и иммунохимический, а также гель-электрофорез, ИК- и УФ-спектроскопирование. Модифицирован колориметрический метод определения глюкоамилазной активности (ГлС), так как этот показатель по стандартной методике (ГОСТ Р 20264.4-89) определяется в узких пределах скорости ферментативной реакции гидролиза крахмала. Для очистки КЖ и нативного раствора использовали микрофильтрацию на мембранных элементах капсульного типа (ООО НПП «ТехноФильтр», Россия) из стекловолоконного картона и фторопласта, патронного типа (фирма «Sartorius», Германия, мембраны «Sartopure РР» из пропилена и стекловолокна и «Sartobran Р» из полиэфирсульфона); ультрафильтрацию на мембранном модуле ВПУ (полые волокна из полисульфона, НПК «Биотест», Россия); фильтрацию через углеродноволокнистый карбонизованный актилен (УВКА); сорбцию на бентоните; ионообменную хроматографию на анионите AB-17-2 (СГ, СН3СОО\ (В4072'+С4Н4042")-формы), катионитах КМТ и КУ-23 (Na+- и Н4-формы), сорбирующем геле - мелкозернистом крупнопористом силикагеле; осаждение растворами солей, оснований - по классической «цитратной» технологии в модификации. Целевые вещества выделяли: лимонную кислоту - из цитрата кальция по классической схеме и по мембранной технологии; амилолитические ферменты - из фильтрата цитрата калымя высаливанием или осаждением органическими растворителями; ретентата - осаждением этанолом; ингибиторы амилаз - из осветленного и сконцентрированного пермеата. Мицелиальную массу продуцента (в натрий-ацетатном буферном растворе (0,1 М, рН=4,7 ед.) разрушали ультразвуком (дезинтегратор HSF (Англия), амплитуда колебаний волны 7 мкм, время 6-8 мин), далее центрифугировали (20000 об./мин, плюс 4 °С, 20 мин). Для тонкой очистки амилаз из ретентатов и ингибиторов из пермеатов проводили гель-фильтрацию (сефадексы G-50 и G-100 - для ферментов и G-15 - для ингибиторов); для изучения ферментов проводили аффинную хроматографию (носитель - нативный крахмал, элюент -буферный раствор Tris-HCl (0,05 М, рН=6,5 ед.) с гликогеном (массовая доля 0,4 %), ионообменную хроматографию (КМТ или ДЭАЭ-целлюлоза в Na+- и Реформах), электрофорез в ПААГ (массовая доля ПАА 7,5 %). При технологической оценке препаратов ферментов, ингибиторов амилаз и содержащих их КПД в хлебопечении контролировали степень сохранения ингибиторной активности (ИА), углеводный состав теста и хлеба, качество выпечных изделий - по ГОСТ 21094-75, ГОСТ 5669-96, ГОСТ 4-96, ГОСТ 5667-65; в пивоварении - качество солода и уровень массовой доли спирта в пиве согласно ГОСТ 12787-81.

Статистическую обработку, графическую интерпритацию результатов проводили с использованием компьютерной программы Microsoft Office Excel.

Способность штаммов гриба Aspergillus niger - продуцента лимонной кислоты к синтезу амилолитических ферментов

Селекционированные в ГНУ ВНИИПАКК Россельхозакадемии штаммы-продуценты лимонной кислоты микромицета Aspergillus niger обладают

способностью активно ферментировать среды различного углеводного состава -многокомпонентные (мелассные) и более «простые» (сахарозо- и глюкозоминеральные), а также синтезируют амилазы в «следовых» количествах. Это свидетельствует о вариабельности активности их ферментной системы и возможности вести направленный биосинтез нескольких целевых продуктов микробного синтеза путем изменения условий и режимов культивирования продуцентов, в частности, замены традиционного углеводного субстрата на гидролизаты крахмала с различной степенью гидролиза. В результате перехода на специфические субстраты (декстрины, мальтоза) в составе гидролизата с декстрозным эквивалентом (ДЕ) 15-20 %, наиболее предпочтительного для ацидогенеза микромицетом Aspergillus niger, активности амилаз увеличивались до: в нативном растворе, ед./см3, АС -(0,17-0,26), ГлС - (1,5-2,5), в мицелии, ед./(г СБ), АС - (2,5-3,0), ГлС - (10-15). Продуктивность биосинтеза лимонной кислоты практически не изменялась в сравнении с адаптированными для продуцентов условиями культивирования.

Установлено, что штаммы Aspergillus niger, селекционированные для мелассных (Л-4, Л-5) и сахарозоминеральных (Л-7) сред, обладают большей способностью синтезировать амилазы при продуцировании лимонной кислоты, чем штаммы В-1 и В-2, полученные на следующих стадиях селекции (табл. 1).

Таблица 1 - Показатели процесса ферментации гидролизатов крахмала (на примере кукурузного крахмала) _

1 Наименование показателей Наименование штамма

Л-4 Л-5 Л-7 В-1 В-2 В-3

Конверсия Сахаров в лимонную кислоту, % 80,8 ±0,5 79,3 ±0,1 80,1 ±0,1 82,6 ±0,1 86,2 ±1,6 81,4 ±1,1

[Доля лимонной кислоты в сумме органических кислот, % 93,7±0,1 93,1±0,2 94,2±0,1 94,3±0,1 96,5±0,1 93,4±0,1

Сухая биомасса с влажностью 10 % (СБ), г/дм3 12,7±0,1 12,9±0,1 12,5±0,1 13,2±0,1 13,2±0,1 11,4±0,1

[Продуктивность мицелия, г/г 0,56±0,01 0,53±0,02 0,53±0,01 0,59±0,01 0,66±0,02 0,63±0,01

Активность шерментов в нативном растворе, рд./см3: - а-амилазная (ЛС) ■ глюкоамилазная (ГлС) - мальтазная (MC) ■ осахаривающая (ОС) -декстринолитическая (ДС) 1,0±0,1 18,7±0,5 17,6±1,2 14,1±0,5 1,8±0,1 0,6±0,1 9,3±0,3 12,7±1,1 10,6±0,2 0,9±0,1 1,0±0,1 17,5±0,6 10,9±0,8 12,6±0,4 1,5±0,1 0,4±0,1 3,5±0,2 9,9±0,1 8,8±0,1 0,30±0,01 0,6±0,1 7,9±0,5 11,3±0,2 9,5±0,1 0,8±0,1 1,1±0,1 20,1±1,1 18,6±0,5 15,4±0,3 1,9±0,1

Примечание: массовая концентрация Сахаров в питательной среде - 160±2 г/дм"1, длительность процесса - 6 сут.

Максимум ферментативной активности посевного мицелия проявлялся в широком его возрастном диапазоне (36-48 ч), за исключении В-3 (24-36 ч). Наибольшая кислотообразующая способность для Л-5, Л-7 и В-3 приходилась на 36 ч культивирования, а для Л-4, В-1 и В-2 - на 48 ч. Установлено оптимальное количество суспензии конидий, необходимое для получения кислотообразующего мицелия - 20 % к объему питательной среды с титром (6-7)" 107 конидий/см3 среды А4. Изменение значения данного показателя в большей мере влияло на активности амилаз, чем на образование лимонной кислоты. Конверсия Сахаров в лимонную кислоту снижалась на 1,3-6,7 % (исключение - В-2). Скорость накопления амилаз продуцентами Л-4 и В-3 была выше таковой для других штаммов в 1,2-2,2 раза (рис. 2). Полученные данные свидетельствуют о том, что с практической точки зрения, исследуемые штаммы при биоконверсии

Т^пемя. с\гг

Условные обозначения: штамм Л-4 (1,3,5) и штамм В-3 (2,4,6); V,, У2, и Уз- соответственно скорости накопления а-амилазы (1,2), глюкоамилазы (3,4) и лимонной кислоты (5,6)

Рисунок 2 - Динамика амилолитических ферментов

и лимонной кислоты при ферментации гидролизатов кукурузного крахмала (ДЕ=(19±1) %) штаммами Азре^Шиэ шдег

гидролизатов крахмала в лимонную кислоту являются потенциальными продуцентами амилаз, но для максимального проявления возможностей их ферментной системы необходимо оптимизировать питание микроорганизмов, в частности по углеводному составу, и условия культивирования.

Исследование влияния углеводного состава среды на биосинтез лимонной

кислоты и амилаз Сравнительное изучение зависимостей изменения концентрации трех фракций углеводов (декстринов, мальтозы, глюкозы) в среде, содержащей гидролизат кукурузного крахмала с ДЕ=(19±1) %, в процессе ферментации показало, что скорость их биотрансформации штаммами уменьшается в ряду: Л-4—>В-3—»Л-7—>Л-5. На вторые сутки культивирования всех продуцентов декстрины в среде отсутствовали, а значения максимальных скоростей накопления ферментов (по АС и ДС) были близки. Максимальное значение концентрации мальтозы, которая присутствовала в среде до конца процесса ферментации, наблюдалось на 2 сут культивирования штамма Л-4 и превышало в 1,2, 1,8 и 2,7 раз таковое соответственно для штамов Л-7, Л-5 и В-3 (рис. 3). Скорость накопления ферментов штаммами Л-4 и В-3 была выше по сравнению с Л-5 и Л-7 в 1,2-2,2 раза. Максимальная скорость синтеза лимонной кислоты приходилась на 5 сут процесса для штаммов Л-4, В-3, Л-5 и на 4 сут - для Л-7. Для Л-7 и Л-5 биосинтез амилаз, процессы накопления-потребления мальтозы и катаболизм Сахаров в лимонную кислоту носят пролонгированный характер. Аналогичные зависимости получены при ферментации гидролизатов пшеничного, ржаного и картофельного крахмалов. Выявлено, что для продуктивного биосинтеза целевых веществ эффективно использование гидролизатов крахмалов с ДЕ, %: картофельного - 12,5±2,5 кукурузного, пшеничного, ржаного - 27,5±2,5, (рис. 4). Предпочтительная концентрация Сахаров находилась в пределах от 120 до 150 г/дм3. Для дальнейших исследований выбраны два штамма Б-171 (Л-4) и Р-719 (В-3), обладающие наибольшей способностью к биосинтезу амилаз при периодическом способе ферментации гидролизатов кукурузного крахмала.

Время, сут

Рисунок 3 - Динамика декстринов (—), мальтозы (—) и глюкозы (—) в среде, содержащей гидролизат кукурузного крахмала (ДЕ=(19±1) %), при культивировании штаммов Л-4 (-о-). Л-5 (-□-). Л-7 (-Д-). В-3 (-х-)

о £

Гидролизаты кукурузного, пшеничного, ржаного 100 крахмалов

Гидролизаты картофельного крахмала

Условные обозначения:

8 - конверсия Сахаров в

лимонную кислоту, В - активность а-амилазы, I - активность глюкоамилазы

Рисунок 4 - Показатели процесса ферментации в зависимости от степени гидролиза крахмалов (на примере штамма Л-4 (Р-171))

25 30 35 40

/Г

ДЕ, %

Влияние азот-, фосфорсодержащих компонентов и солевого состава питательной среды на биосинтез лимонной кислоты и амилаз

В результате исследований установлено, что при соотношении углерода и азота (C:N) менее 30 развитие и рост мицелия штаммов Л-4 и В-3 гриба Aspergillus niger замедляются (СБ (5,3±0,5) г/дм3 против (10,1±0,1) г/дм3 в контроле (C:N=75)). Повышенное содержание углеводов (C:N>75) вызывало активное накопление биомассы и приводило к снижению его кислотообразующей способности. Увеличение активности а- и глюкоамилазы соответственно на 44-50 % и 21-30 % выявлено при C:N в среде 55±5 с использованием NH4NO3 (рис. 5); показатель конверсии Сахаров в лимонную кислоту был на уровне контроля. Выявлено существенное влияние на биосинтез амилаз компонентов гидролизата смеси кукурузного крахмала и кукурузной муки (N:P=8,1±0,2). Наиболее активный биосинтез амилаз при конверсии Сахаров в лимонную кислоту практически на уровне контроля наблюдался в присутствии автолизата мицелия Aspergillus niger (N:P=6,7±0,7). Для повышения активности продуцирования амилаз без существенного снижения активности синтеза лимонной кислоты обоснована необходимость применения макроэлементов в виде солей MgS04-7H20 и КН2Р04 и микроэлементов: Zn, Си в сочетании с Fe для штамма Л-4 (F-171) и с Со - для штамма В-3 (F-719). Сочетание минерального и органического источников азота и микроэлементов позволило достичь повышения активности амилаз в 1,3-3,3 раза по сравнению с ферментацией комплексных сред, содержащих в качестве источника азота только NH4NO.i.

Регуляция процесса биосинтеза лимонной кислоты и амилаз Ранее (Никифорова, 1998) отмечено, что в условиях, оптимальных в основном для биосинтеза лимонной кислоты (ДЕ<20 %), изменение активности цитратсинтазы - регуляторного фермента ЦТК имеет фазный характер. В ходе исследований процесса ферментации гидролизатов кукурузного крахмала с

10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85

Условные обозначения: -о- - АС, ед./см3; - • - - ГлС, ед./см' ■ - конверсия сахароз в лимонную кислоту, % Рисунок 5 - Зависимость биосинтеза амилаз и конверсии Сахаров в лимонную кислоту от С:К при использовании в качестве источника азота ЫН^ЫОз

ДЕ=(27,5±2,5) %, обеспечивающем продуктивный биосинтез не только лимонной кислоты, но и амилаз, установлена аналогичная зависимость (рис. 6).

Условные обозначения: 1 - цитратсинтаза, 2 - цитрат, 3- гкжоамилаза, 4- а-амилаза, 5- белок, 6 - глюкоза Рисунок 6 - Динамика ферментативных активностей, концентраций белка и глюкозы в

клетках Aspergillus niger JI-4 (F-171)в процессе ферментации гидролизата кукурузного крахмала Д£=(27,5±2,5)%

Снижение активности цитратсинтазы наблюдалось по мере накопления-потребления глюкозы в среде, максимумы которых совпадали с периодом наибольшего прироста цитрата в клетке (рис. 6,7). В начальный период активного ацидогенеза (3 сут) скорость потребления углеводов была минимальна, несмотря на то, что активность а-амилазы в среде достигала максимума и активизировалась секреция глюкоамилазы. Совмещение периодов наибольшей активности глюкоамилазы в клетках аспергилла с пиками скоростей превращения мальтозы и вторичного прироста цитрата в клетке свидетельствует об ее активном включении в сложную систему гликолиза и цикла трикарбоновых кислот (ЦТК) с образованием избыточного количества лимонной кислоты. Второй пик активности цитратсинтазы в этот период был ниже, в цитозоле вновь наблюдалось повышение активности амилаз, очевидно, в связи с накоплением во внеклеточном пространстве мальтозы. Проведенный анализ позволил сделать вывод о косвенном влиянии амилаз гриба-кисло-тообразователя Aspergillus niger на биосинтез лимонной кислоты. Сохранение их активности в конце ферментации и повышение активности цитратсинтазы в стационарной фазе роста гриба свидетельствует о высоком потенциале микромицета Aspergillus niger для синтеза лимонной кислоты при дополнительном введении углеводов в культуральную среду и о возможности регуляции процесса на уровне углеводного обмена. Сочетание иммунохимиического и радиоизотопного методов позволило впервые определить скорости накопления амилаз, исходя из их количества, а не активности, и определить параметры их оборота (табл. 2). Установлено, что скорости деградации внутриклеточных а- и глюкоамилазы близки, а синтезируется и секретируется первая в 3-4 раза быстрее второй. Распад секреторной формы а-амилазы происходит медленнее, чем секреторной

3

Время, сут

"s I30- V

3 к ^ *

о g20 Я Я 3.5- п Я * ю 3

¡10 & Й § * 2 1 S 1-5 О >. , ' б! °'5 U 0

о % X Ö0

АС, ед./см , ГлС, ед./см

8 3,5 I 3

£ 2,5

I 2

5 1,5

I 1,0

I 0,5

6 0

и б Время, сут

Рисунок 7 — Накопление а-амилазы (1), глюкоамилазы (2), скорости изменения концентраций

ферментируемых Сахаров (3), мальтозы (4) и глюкозы (5) в культуральной среде при биоконверсии гидролизатов кукурузного крахмала (ДЕ=(27,5±2,5) %) штаммом АзпегаШиз теег Р-171 (Л-4)

Наименова- Значения показателей

ние объекта Е, Ks, Kseb Kd, tl/2,

исследований мкг/см3 мкг/(см3-сут) сут"' сут

Внутриклеточные белки

а-Амилаза 725,0 75,4 0,104 5,66

Глюкоамилаза 200,0 18,2 0,091 7,26

Белок 4500,0 1314,0 0,292 2,37

Секреторные белки

а-Амилаза 306,0 104,4 0,341 2,03

Глюкоамилаза 83,3 36,1 0,433 1,60

Белок 5000,0 - 0,213 3,25

Примечание: Е - концентрация белка, К^ К^ К<1 -соответственно константы синтеза, секреции и деградации, - время полужизни

Таблица 2 - Параметры обмена амилаз глюкоамилазы, И ее количество В 1 СМ

КЖ выше в 3,6 раза. По-видимому, большая потребность в синтезе а-ами-лазы грибом-кислотообразователем обусловлена ее ключевой ролью на стадии гидролиза декстринов в культу-ральной среде. По расчетам, одна единица активности а-амилазы соответствует =107 мкг а-амилазного белка, а глюкоамилазы - =70 мкг глюкоамилазного белка. Содержание амилазного белка варьирует при изменении состава питательной среды, поэтому полученные данные позволяют корректно определить активность амилаз в пересчете на ферментативно активный белок и использовать ее в качестве критерия оценки продуктивности биосинтеза ферментов при биоконверсии гидролизатов крахмала в лимонную кислоту. На основании результатов опытов определены возможные пути регуляции биосинтеза лимонной кислоты и амилаз:

• поддержание постоянного уровня соотношения концентраций углеводов среды (декстрины, мальтоза, глюкоза), что длительное время обеспечивает максимальную биоконверсию Сахаров в лимонную кислоту или при увеличении содержания моно- и дисахаридов позволяет продуктивно получать и амилазы;

• обеспечение соотношения C:N в питательной среде на уровне, способствующем активизации биосинтеза целевых продуктов;

• дополнительное введение в питательную среду органического источника азота, который позволяет повысить активность ферментов при продуктивном ацидогенезе.

По совокупности результатов исследований получены уравнения регрессии, позволяющие оценить влияние различных факторов на технологические показатели при культивировании штаммов F-171 и F-719. В тексте в качестве примера приведены уравнения для F-171 (уравнения 1-3):

Y,=80,45+9,07Xi+2,06X2-0,006X3-0,09X4-0,85Х,Х2 (1);

Y2=2,68+0,05Х,+0,21Х2-0,009X4-0,73Х5-0,63Х,Х2-0,09X^3+0,06Х2Х3 (2);

Уз=166,32+1,67Xi+50,61Х2-0,19Хз-1,45Х4-18,2Х5-0,003X]X2-0,003XiX3+ 0,03X1X4+0,02Х1Х5+0,02Х2Х3 (3),

где Yi - конверсия Сахаров в лимонную кислоту; %, Y2, Y3 - активности, ед./см3, соответственно АС и ГлС; Х1,Х2,Хз,Х4 - массовые концентрации, г/дм3, соответственно глюкозы, мальтозы, декстринов, общего сахара; Х5 - C:N. Наибольшее влияние на биосинтез лимонной кислоты оказывает концентрация глюкозы, а ферментов - концентрация мальтозы и C:N. С учетом вышеприведенных данных разработаны составы питательных сред, г/дм3: гидролизат кукурузного крахмала - 140 (ДЕ=(26,5±1,5) %); аммоний азотнокислый - 2,0; автолизат мицелия Aspergillus niger - 0,5; магний сернокислый семиводный - 0,25; калий фосфорнокислый однозамещенный -0,16; цинк сернокислый семиводный - 0,005; медь сернокислая пятиводная -

0,002; железо сернокислое семиводное - 0,001 (для Р-171) и кобальт сернокислый семиводный - 0,0025 (для Р-719). Установлены технологические режимы подготовки питательных сред оптимизированного состава. При оптимальных значениях параметров (массовые концентрации Сахаров, глюкозы, мальтозы и декстринов в составе питательной среды, г/дм3, соответственно 130±5, 3,1±0,3, 23,1±1,2 и 73,2±2,5; С№55±1) показатели процесса имели значения: АС - (4,1±0,2) ед./см3, ГлС - (140±6) ед./см3, конверсия Сахаров в лимонную кислоту - (84,5±2,5) %.

Очистка иативиого раствора, выделение лимонной кислоты и амилаз Полученные в результате ферментации нативные растворы содержали вещества минеральной, углеводной и белковой природы (табл. 3).

Таблица 3 - Характеристика нативных растворов

Показатель, Массовая концентрация, г/дм"1 Активность,

ед.оп пл. pH, ед./см3

цвет- мут- ед. органических кислот золь- Саха- бел- коло-

ности ности, лимон- глюко- щаве- ных ров ка идных

D360 D760 ной новой левой зеществ веществ АС ГлС

2,5 1,1 2,0 109 6,9 отсут- 0,30 2,1 4,3 2,0 3,8 141

±0,1 ±0,1 ±0,1 ±5 ±0,1 ствует ±0,02 ±0,1 ±0,1 ±0,1 ±0,1 ±2

Исследованные варианты очистки нативных растворов и выделения лимонной кислоты и амилаз приведены в таблице 4. Из исследованных приемов для предварительной очистки нативных растворов эффективно применять обработку бентонитом и УВКА (осветляющие сорбирующие материалы) или ионный обмен на анионите (сорбция - при рН=3 ед.). В результате получены обесцвеченные на 90 % растворы с содержанием сухих веществ (СВ) от 10 % до 12 %, концентрацией лимонной кислоты на уровне исходного нативного раствора и удельными АС и ГлС, увеличенными в 3-4 раза. Однако совместить и очистку нативного раствора, и разделение целевых веществ удалось только при модификации классического «цитратного» способа или применении приемов баромембранный технологии. Мембранный способ составляет альтернативу классическому «цитратному» способу при создании новых профильных предприятий по переработке крахмалсодержащего сырья в лимонную кислоту с преимуществом по количественному выходу целевых продуктов. Качество полученной лимонной кислоты соответствовало требованиям ГОСТ 908-2004, а жидкой - ТУ 9199-056-00334557-2001.

Оценка безопасности продуктов биоконверсии гидролизатов крахмала грибом Aspergillus niger В КЖ при биоконверсии гидролизатов крахмала микромицетом Aspergillus niger идентифицирован ненормируемый афлатоксин G2, содержание которого в процессе инактивации мицелия и очистки нативного раствора существенно снижалось (табл. 5). Установлено, что обсемененность КЖ находилось на уровне 20 КОЕ/см3 (по гигиеническим требованиям для пищевых добавок от 10 до 100 КОЕ/см3). В растворах лимонной кислоты микроорганизмы отсутствуют, а в ферментных препаратах выявлены только бактериальные формы (от 20 до 40 КОЕ/г).

Таблица 4 - Выделение целевых продуктов из очищенных нативных растворов

Наименование целевого продукта, реагента, материала Количество Активность, ед./г, ед./см3 Массовая доля белка в ф.п.«,%

лимонной кислоты, г/(дм3 н.р.*) ферментного препарата

г/дм"1 н.р.* или см3/дм3 кг/т лимонной кислоты АС ГлС

Классический «цитрап (Смирнов, 1983) Кристаллическая лимонная кислота 1ЫЙ» спосо 78±2 б Ферменты отсутствуют

Разработанный модиф] Кристаллическая лимонная кислота и препарат амилаз ипфованп 78±2 ый «нитратный» способ с использованием осадителей Порошкообразные препараты

Наименование осадителя Содержа ние, %

Сульфат аммония 70 4,8±0,2 38±2 450±20 2000±100 20±2

Этанол 70 4,8±0,2 37±3 700±50 4000±100 70±1

Изопропанол 50 1,3±0,3 10±2 2000±100 10000±100 75±2

Ацетон 55 4,3±0,3 34±2 1200±50 7000±50 82±2

50 % Раствор лимоиной кислоты и препараты амилаз Разработ 68±2 анный бесцитратный способ Порошкообразные препараты

а-амилаза и глюкоамилаза

Наименование носителя фор ма pH, сорбции ед. десорб ции

AB-17-2 сг 5,0±0,1 6,0±0,1 4,8±0,2 37±1 650±50 4000±200 65±1

¡СУ-23 Na+ 3,0±0,1 6,2±0,3 65±5 2,4±0,2 20±2 700±20 15000±500 90±2

КМТ Na+ 4,7±0,3 5,5±0,1 70±5 а-амилаза

2,5±0,2 | 10±1 | 400±50 | отсутств. | 92±5

Силика-гель - 3,5-5,0 5,5±0,1 68±2 глюкоамилаза

1,1±0,1 | 8±1 | отсутств |10000±500| 95±3

50 % Раствор / кристаллическая лимонная кислота и препараты амилаз Разрабо 85±2/ 78±2 гапный мембранный способ Ретентат (СВ 20 %)

14±1 | 112±8 | 280±20 16500±5001 24±1

Порошкообразный препарат (лиофилизироваиный ретентат)

5±1 | 40±5 | 750±20 | 5000±50 | 65±3

Порошкообразный препарат (осаждение этанолом (70%))

3±1 | 25±1 | 1100±20 |10000±200| 80±2

Примечание: * н.р. - нативный раствор, ** - ф.п. - ферментный препарат

Разработанный модифицированный «цитратный» способ, отличия от классического: нейтрализация: 1=(50±3) °С до рН=(5,9±0,1) ед., одностадийное обесцвечивание активным углем (1 г/100 г лимонной кислоты); фильтрат цитрата кальция концентрируют (вакуум 0,082 МПа, \.=(27±2) °С, до рН=(4,7±0,2) ед., СВ (11±2) %) и выделяют из него ферменты методом осаждения; маточные растворы как отходы утилизируют по классическому «цитратному» способу.

Разработанный бссцмтратный способ: очистка бентонитом - (22±2) г на 100 г н.р.* и УВКА (рН=3,8 ед., 1=(22±3) °С) с последующим разделением лимонной кислоты и ферментов на ионитах или силикагеле и осаждением амилаз этанолом (70 %).

Разработанный мембранный способ: микрофильтрация (мембраны с размером пор 1,65; 1,2; 0,45 и 0,25 мкм), ультрафильтрация («отсечение» 15 кДа), осветление пермеата (1 г угля БАУ-А на 100 г лимонной кислоты, длительность 30 мин), концентрирование (1=(37±2) °С); маточные растворы возвращают на стадию осветления.

Таблица 5 - Содержание афлатоксина G2 в продуктах биоконверсии гидролизатов крахмала микромицетом Aspergillus niger

Наименование образца

Массовая доля

СВ, не менее %

Содержание афлатоксина G2

мг на кг продукта

мг на кг лимонной кислоты

Посевной мицелий Aspergillus niger

90

не обнаружен

Мицелиальная биомасса Asp, niger

90

1,70

14,2

Нативиый раствор

11

0,58

5,24

Раствор лимонной кислоты

50

0,08

0,16

Ферментный препарат

15

отсутствует

Выделение высокоочищенных амилаз и их свойства

Полученный ферментный комплекс, как установлено, содержит 10-20 % амилазного белка, который состотит из двух форм а-амилазы (М.м 55-66 и 29-36 кДа) и глюкоамилазы (М.м. 97 и 116 кДа), мальтазы (М.м. 24-29 кДа) (рис. 8).

Условные обозначения:

Наборы стандартных белков Wide Range Molecular Weight Calibration Kit («Sigma»)-7,8; исходный ретентат-4; амилазы, осажденные из ретентата этанолом -1; внутриклеточные формы (ультрафильтрация): а-амилаза- 2, глюкоамилаза- 5; внеклеточные формы (аффинная хроматография): а-амилаза- 3, глюкоамилаза- 6 Рисунок 8 - Электрофореграмма амилаз Aspergillus niger

HS

Для выделения высокоочищенной

12 3

а-амилазы

29 1Ü 36 да

ш

Шш

ИИ ^'riri* жжл И^НПб^*"

4 5 6

наиболее

7 8

эффективна

аффинная хроматография, Таблица 6

глюкоамилазы - ультрафильтрация (табл. 6).

Метод очистки Активность амилазы Степень очистки, раз

ед./см'1 препарата|ед./мг белка| выход,%

а-Амилаза (форма фермента Gi)

Высаливание —> гель-фильтрация 28-32 112-128 15-17 112-128

Ионообменная хроматография 37-42 73-76 20-22 73-76

Аффинная хроматография 51-55 110-120 23-30 157-160

Глюкоамилаза (форма фермента Gi и G2)

Гель-фильтрация (формы Gi и G2) 2000-2100 2500-2700 1-2 116-127

Ультрафильтрация (форма Gi) 2120±100 338-368 4-5 11-15

Выделенные а- и глюкоамилаза Aspergillus niger имеют практически равные оптимумы проявления активности (рН=(4,5-5,0) ед.; t=(50±l) °С) и отличаются по аминокислотному составу от амилаз, синтезируемых штаммами-продуцентами ферментов Aspergillus niger. В отличие от данных Svensson (1983) и Stein (1960) а-амилаза продуцента лимонной кислоты содержит 220 аминокислот против 433, а глюкоамилаза - 564 против 616.

Исследование физико-химических и биохимических свойств ферментного комплекса, выделенного из нативного раствора Ферменты выделенного комплекса сохраняли (97±3) % активности при рН=(2,5-6,5) ед. и t=(20-70) °С в составе концентрата (ретентата), при t=(20-60)°C - порошкообразной формы (осаждение этанолом). Помимо а- и глюкоамилазной активностей они обладали мальтазной (МС), осахаривающей (ОС),

декстринолитической (ДС), протеиназной (ПС) и ксиланазной (КС) способностью.

Исследование углеводного состава пшеничной муки (распространенный вид пищевого сырья) показало, что амилазы Aspergillus niger проявляют большее осахаривающее действие, чем глюкоамилаза «Novo Nordisk» и МЭК «Biobake fresh XL». Увеличение степени гидролиза углеводов муки наблюдали при рН=(4,7±0,3) ед. и дозировке полученных ферментных препаратов к массе муки 0,005-0,010 % (рис. 9). В течение 12 мес хранения при (5±1)°С и минус (12±1)°С

Условные обозначения: 1 -4 маркеры (соответственно глюкоза, мальтоза, декстрины, мука); , к. 5-7— полученный препарат ферментного комплекса амилаз; | Щ 8-10 - МЭК «Biobake fresh XL» («Quest International»);

11-13 - препарат глкжоамилазы («Novo Nordisk»)

Рисунок 9 - Углеводный состав гидролизатов пшеничной муки (рН среды 3,5 ед. (5,8,11),4,7 ед. (6,9,12) и 5,9 ед. (7,10,13)

*ff »1

12 3 4 5 ( 7 II 10 И 12 13

амилазы в препаратах сохраняли до 100 % активности. При (22±3) °С активность концентрата в течение 6 мес снижалась до (46±2) % и 12 мес - до (23±2) %. Разработка составов и оценка качества комплексного ферментного препарата и комплексной пищевой добавки Глюкоамилонигрин

Установлено, что в составе полученного концентрата (ретентата) помимо комплекса ферментов содержится остаточная лимонная кислота (4-6 %), которая является регулятором буферности растворов и способствует сохранению рН в пределах проявления активности амилаз на высоком уровне (табл. 7).

Наименование показателя Значение показателя в КФП

жидкий порошкообразный

Массовая доля, %: • сухих веществ, не менее • белка, не менее • остатка после просеивания на сите № 067, не более • лимонной кислоты, не более • кальция в пересчете на СаО, не менее ■ бензоата натрия (Е211) или сорбата калия (Е202) или молочной кислоты, не менее 15 80

12 65

- 5

3,0 5,0

0,2 0,8

0,005(Е211,202)/ 0,2

Ферментативная активность, • АС, не менее ед./см3, ед./г, • ГлС, не менее 100 600

3500 10000

Количество мезофильно-аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, КОЕ/г, не более 5104

Показано, что для длительного хранения концентрата (6 мес) при (22±3) °С необходима стабилизация активности амилаз (сохранение на 90 %) ионами кальция. В ферментном комплексе, осажденном этанолом из такого концентрата, уровень активности превышал в 1,5 раза активность препаратов без кальция. Присутствие последнего исключает необходимость дополнительного введения в составы препаратов других веществ с аналогичными функциями в технологиях приготовления пищевой продукции. Для стандартизации активности амилаз в состав препарата введен наполнитель (крахмал - аффинный лиганд). В процессе хранения в указанных выше условиях обсемененность жидкой формы КФП превышала нормативный уровень, что потребовало добавления консервантов; в

порошкообразной форме изменение микробиологического состава не выявлено. Каталитическая активность Глюкоамилонигрина оценена в хлебопечении и пивоварении (рис. 10,11).

Условные обозначения: 1-3, 5-7 - содержание редуцирующих веществ, %, в тесте: 1,5 - после замеса, 2,6 - после брожения; в хлебе - 3,7; 1 -3 - концентрат, 5-7 - порошкообразная форма; □ - контроль (без ферментов),0 - опыт

Рисунок 10 - Влияние комплекса амилаз на углеводный состав теста и хлеба из пшеничной муки

Условные обозначения: 1-4 - концентрат; 6-9 - порошкообразная форма; 1,2,6,7 - содержание редуцирующих веществ, %, в сусле; 3,4,8,9 - массовая доля спирта, %, в пиве; 1,3,6,8 и 2,4,7,9 - использование солода соответственно с пониженной и стандартной активностью амилаз; □ -контроль (без ферментов), Ш-опыт

Рисунок 11 - Влияние комплекса амилаз на качество сусла и пива

Выявлено, что при приготовлении хлебобулочных изделий из пшеничной муки использование препарата на разных стадиях технологического процесса приводит к увеличению содержания редуцирующих веществ, интенсификации газообразования и положительно отражается на качестве готового продукта (увеличение пористости на 4-15 %, удельного объема на 6-12 %). После хранения в течение 48-96 ч показатель сжимаемости мякиша опытных образцов хлеба превышал уровень контроля на 16-30 %, что свидетельствует о возможности увеличения срока хранения готового изделия. Применение Глюкоамилонигрина в пивоварении показало, что введение его в затор с солодом как с пониженной ферментативной активностью, так и со стандартными свойствами, способствует снижению времени осахаривания на 10-15 мин, увеличению содержания редуцирующих веществ в сусле на 5-8 % и объёмной доли спирта в пиве - на 11-20 %. КФП Глюкоамилонигрин стандартизован по амилолитической активности, однако он содержит и другие ферменты (ксиланазу, протеиназу, мальтазу), а также, наряду с остаточной лимонной кислотой, цитрат кальция, образующийся в результате стабилизации активности амилаз. Указанное выше расширяет функциональные свойства препарата и позволяет обосновать состав КПД на его основе. Молочная кислота, введенная в состав КФП для предотвращения повышения обсемененности (альтернатива консервантам), обладает влагоудерживающей способностью, что важно при

Таблица 8 - Состав комплексной

Наименование Массовая доля, %

Сухие вещества 25

Общий белок 20

Ферменты 16

Лимонная кислота 0,5

Цитрат кальция 0,4

Молочная кислота 0,4

хранении пищевых продуктов. В итоге разработан состав полифункциональной КПД Глюкоамилонигрин (табл. 8). По уровню активностей ферментов и спектру действия Глюкоамилонигрин не уступает мультиэнзимным композициям (МЭК) и превышает активности препаратов индивидуальных ферментов (табл. 9).

Таблица 9 - Каталитические свойства комплексной пищевой добавки Глюкоамилонигрин и промышленных образцов____

Наименование препарата Ферментативные активности, едУсм^ (жидкая форма); ед./г (порошкообразная форма)

а- амилазная АС глко-амилазная ГлС маль-тазная МС осахари-вающая ОС декстри-нолити-ческаяДС проте-иназная ПС ксила-назная КС

Жидкая форма

Глюкоамилонигрин 220±15 8200±250 8,5±0,5 8000±220 70±5 20±2 45±5

SAN Super 240L, «Novozymes» 700±50 3000±130 3,5±0,2 6200±150 34±2 - -

Глюкаваморин (БЗБП) 15±2 1000±45 1,5±0,1 2000±120 16±1 10±1 -

Порошкообразная форма

Глюкоами лон и грин 1300±60 10000±520 28±2 8200±230 120±5 50±5 100±25

МЭК «Biobake fresh XL» («Quest International») 380±20 8200±140 84±5 2500±120 20±2

Глюкавморин, ЗАО «БК Восток) 30±2 2000±160 35±3 1000±50 2,5±0,1 15±1 -

Эффективность Глюкоамилонигрина при испытаниях в хлебопечении проявлялась в интенсификации брожения и улучшении оргаиолептических показателей готовой продукции (более приятные вкус, запах, более нежный мякиш) и длительном сохранении свежести.

Ингибиторы амилаз, синтезируемые грибом-кислотообрарователем

Установлено, что нативные растворы, ^ Q ©

полученные в результате ферментации гид- w w w ^ ^ w Rf=q,63

ролизатов крахмала, содержат углеводы со о О

значениями Rf, близкими к Rf мальтозы (0,58) ® © ® © ® Z.

(рис. 12). По-видимому, это вещества, не © . ^

потребляемые грибом Aspergillus niger. ® © © :RrO,4S

Результаты спектрального анализа показали, *if' "f ™ *" '¡j 8 *9

что их структуры содержат а-1,2- И а-1,4- 1-глюкоза, 2 - мальтоза, 3 - посевной

гликозидные И двойную СВЯЗИ, альдегидные, мицелий; 4-8-нативный раствор:

ферментация в течение 1 сут - 4; 2 сут - 5;

гидроксильные, амино- И иминогруппы. Зсут-6;4сут-7;5сут-8;

Изучаемые вещества имеют относительную 9 - пермеат после осаждения белков ТХУ M.M.-1500, ингибируют амилазы продуцента. Рисунок 12 -Углеводный состав нативного При ферментации кристаллического сахара раствора

вещества с указанными выше свойствами не обнаружены. На основании полученных данных сделан вывод о том, что гриб Aspergillus niger синтезирует ингибитор амилазы только в присутствии их субстратов-индукторов.

Исследование способности стрептомицетов к синтезу ингибиторов гликозидаз при ферментации крахмалсодержащего сырья Синтез ингибиторов гликозидаз в промышленном масштабе аспергиллами не эффективен, но этой способностью обладают стрептомицеты. Показано, что при ферментации среды, содержащей растворимый (картофельный) крахмал, культуры Streptomyces из коллекции ГНУ ВНИИПАКК Россельхозакадемии продуцируют ингибитор а-амилазы (в качестве тестового выбран фермент из панкреаса свиньи, по специфичности действия близкий к панкреатической амилазе человека). Методом ступенчатого отбора селекционированы активные штаммы S. lucensis ВКПМ Ас-1743 и S. violaceus ВКПМ Ас-1734.

В результате исследования влияния химической природы и концентрации углеводов на биосинтез ингибитора установлено, что наиболее предпочтительным источником углерода для получения посевного материала с высокой дегидрогеназной активностью, является глюкоза. Продуктивный биосинтез ингибитора происходил в присутствии в среде премущественно декстринов и мальтозы, и в наибольшей мере при ферментации гидролизатов кукурузного крахмала (рис. 13).

< s

§ < х S

в S

Условные обозначения:

ДЕ,%: □ -10; □ -20; 1 -30; 1 -40; 1-50 1,2,4 - гидролизаты соответственно кукурузного, картофельного и пшеничного крахмалов;

3 - гидролизаты рисовой муки Рисунок 13 - Влияние источника крахмала и степени его гидролиза на биосинтез ингибитора панкреатической а-амилазы: A- S. lucensis ВКПМ Ас-1743, Б — S. violaceus ВКПМ Ас-1734

В результате замены гидролизатов крахмалов на индивидуальные углеводы (глюкоза, мальтоза, декстрины, сахароза) синтезировался ингибитор глюкоамилазы (Asp. awamori), но не а-амилазы (панкреатическая, Вас. subtilis). Исследование культурально-морфологических и физиолого-биохимических свойств продуцентов ингибитора гликозидаз Стадии физиологического развития посевного мицелия двух изучаемых штаммов стрептомицетов были практически идентичны, однако культура S. lucensis ВКПМ Ас-1743 проявляла дегидрогеназиую активность уже в возрасте 24 ч и сохраняла активное физиологическое состояние в течение 72 ч в отличие от мицелия S. violaceus ВКПМ Ас-1734 (от 43 до 48 ч). Накопление ингибитора в КЖ происходило в период максимального потребления продуцентами источника углерода (от 1 до 3 сут) на фоне снижения их амилолитической активности, которая практически отсутствовала к 3 сут процесса. В данный период изменялись морфологические признаки продуцентов: активное спорообразование и формирование из спор «розеток» у S. violaceus Ас-1734, интенсивное ветвление мицелия у S. lucensis Ас-1743 (рис. 14).

^^^^т^Зир^ JhgZjS Рисунок 14 - Микроскопирование

мицелия актиномицетов (3 сут) на электронном сканирующем микроскопе JSM-35

А - штамм S. violaceus Ас-1734, Б - штамм S. lucensis Ас-1743

Совпадение периодов биосинтеза ингибитора и дифференциации клеток актиномицетов предполагает, что образование ингибитора - это защитная реакция в ответ на активный синтез амилаз продуцента, которая находит отражение в видоизменении мицелия.

Влияние химической природы и концентрации источников азота, макро- и микроэлементов на биосинтез ингибитора гликозидаз

Исследуемые штаммы стрептомицетов продуцировали ингибитор гликозидаз только в присутствии органического источника азота, а именно, соевой муки. При ее замене на дрожжевой экстракт или пептон синтезировался ингибитор с пониженной активностью (в 5-6 раз). Отношение С:КГ, обеспечивающее наибольшую продуктивность биосинтеза, составило: для 8. 1исепз18 ВКПМ Ас-1743 - (20-22), для Б. ую1асеиз ВКПМ Ас-1734 - (40-42). На стадии приготовления посевного материала наибольший эффект в конечном результате оказало присутствие в питательной среде ионов натрия и кальция, а при ферментации гидролизатов как кукурузного, так и картофельного крахмалов

- ионов натрия и магния. По совокупности проведенных исследований разработаны составы питательных сред, г/дм3: для шт. 8. Ьсег^з ВКПМ Ас-1743

- гидролизат кукурузного крахмала - 20 (ДЕ=(20-25) %) и для шт. 8. ую1асеия ВКПМ Ас-1734 - 40 (ДЕ=(30-35) %); соевая мука - 5,0; натрий хлористый - 3,0; магний сернокислый семиводный - 0,5. Получены уравнения множественной регрессии, характеризующие влияние основных компонентов питательной среды на биосинтез ингибитора гликозидаз при ферментации гидролизатов кукурузного крахмала (уравнение 7 - для 8. 1исеш!з ВКПМ Ас-1743, уравнение 8 - для Б. ую1асеиз ВКПМ Ас-1734):

У=1654+165,02Х1+236,17Х2+7,83Хз+28,91Х1Х2-5,88Х1Хз-0,62Х|Х4+ 8,09Х2Хз-5,61Х2Х4-2,31ХзХ4 (7);

У=1308+238,22X1+203,22X2+6,89Х3-30,19Х1Х2-4,02Х,Х3+5,51Х,Х4-7,10X2X3-4,94X2X4-1,92X3X4 (8),

где У - ИА, ед./см3; Х1,Х2,Хз,Х4- соответственно массовые концентрации, г/дм3, соевой муки, глюкозы, мальтозы, декстринов. Согласно уравнениям, ингибиторная активность в большей мере зависит от концентрации в питательной среде глюкозы и соевой муки.

Влияние эпигенетических факторов на процесс биосинтеза ингибитора гликозидаз и разработка технологических параметров ферментации оптимизированной по составу среды Интенсивный биосинтез ингибитора амилаз происходил при температуре культивирования продуцента (28±1) °С. Повышение до (35±1) °С отрицательно влияло на продуцирование ингибитора (ингибиторная активность составляла от 60 % до 70 % от достигнутого уровня); при (24±1) °С рост актиномицета отсутствовал. Наиболее активный мицелий актиномицетов, который можно передавать на стадию ферментации, формировался на 43-48 ч культивирования как 8. 1исеп51Б ВКПМ Ас-1743, так и 8. ую1асеш ВКПМ Ас-1734. В данный период мицелий обладал максимальной дегидрогеназной активностью (время обесцвечивания метиленового синего от 2 до 3 мин). Количество посевного материала, при котором формируется активный ингибиторобразующий мицелий в процессе ферментации, составил 10 % от объема ферментационной среды. Уровень активности синтезируемого ингибитора зависел от способа ферментации и наиболее эффективным был отъемно-доливной. Так, при практически одинаковой с периодическим способом интенсивностью биосинтеза

ингибитора продуктивность мицелия и абсолютное значение ингибиторной активности были выше (соответственно в 1,5 и 1,3 раза), а длительность процесса составила 5 сут против 7 сут. Наибольший эффект достигнут при лимитации уровня кислорода в среде (скорость перемешивания 80-150 об. мин"1, расход воздуха 290-580 дм3-ч'') (табл. 10).

Таблица 10 - Показатели процесса С )ерментации отъемно-доливным способом

Наименование показателя Наименование штамма

S. violaceus S. lucensis

Ингибиториая активность, ед. ИА/см"* 3375±500 3600±500

Интенсивность биосинтеза, ед.^дм^-сут) от 4,8-105 до 5,5-105 от4,4-105 до 5,9-Ю5

СБ, г/дм-3 от 6,0 до 6,9 от 5,8 до 6,2

Продуктивность мицелия, ед./г от 372 до 496 от 532 до 634

Разработка способа выделения ингибиторов гликозидаз

Нативные растворы, полученные в результате ферментации гидролизатов крахмала штаммами актиномицетов, представляли собой окрашенные жидкости, обсемененные клетками продуцента, содержащие редуцирующие сахара и белок. В результате изучения режимов ультрафильтрации (отсечение мембраны 15 кДа) достигнута полная очистка от клеток микроорганизмов, удалены вещества, создающие мутность, снижено содержание окрашенных и белковых примесей при сохранении ингибиторной активности на исходном уровне (табл. 11).

Таблица 11 - Показатели процесса выделения ингибитора гликозидаз

Массовая концентрация, г/дм3, г/г Показатель цвет- Ингибнторная актив-

Наимено- белковых веществ углеводов ности, D36o, е.о.п. ность, ед. ИА/см3(мг]

вание S.lucensis S.violaceus S.lucensis S.violaceus S.lucensis S.violaceus S.lucensis S.violaceus

Нативный 5,1 3,8 6,9 9,5 8,3 11,0 3700 3500

раствор ±0,5 ±0,1 ±0,5 ±0,5 ±0,5 ±0,5 ±125 ±230

Пермеат 1,5±0,1 1,9±0,1 6,9±0,5 6,0±0,5 0,8±0,1 1,0±0,1 3700±120 3500±200

Осветленный 0,52 0,45 8,1 8,8 0,35 0,25 3700 3500

пермеат ±0,04 ±0,02 ±0,5 ±0,3 ±0,02 ±0,04 ±110 ±215

Концентрат осветленного 5,2 4,1 77,2 83,9 1,68 1,88 34500 32700

пермеата ±0,2 ±0,1 ±1,1 ±2,1 ±0,04 ±0,05 ±500 ±510

Высушенный 0,08 0,07± 0,85± 0,87± 540 550

препарат ±0,01 0,01 0,02 0,01 - ±54 ±27

фракции*:1 отсутствуют 19,8±0,2 20,3±1,2 отсутствует fl500±120 4200±100

2 то же 10,1 ±0,9 10,5±1,1 то же ^200±110 2000±115

Примечание: * - фракционирование методом гель-фильтрации

Для снижения содержания окрашенных примесей в 2,0-2,5 раза использовали уголь активный порошкообразный БАУ-А из расчета 2 мг на 1 см3 пермеата при 1=(25-50) °С в течение 60 мин. Изменение дозировки угля и времени очистки либо не изменяло свойства пермеата, либо приводило к их ухудшению. Далее очищенный пермеат концентрировали (СВ 50 %) под вакуумом, высушивали при температуре плюс (55±5) °С, обеспечивающей оптимальную длительность процесса и сохранение свойств ингибиторов (избежание карамелизации), измельчали субстанцию до однородного состояния и стандартизовали ингибиторную активность препарата. Разработанный способ позволяет получать препарат ингибитора в количестве от 7 до 12 г/дм3 нативного раствора и выходом по активности от 60 % до 85 % (от 500 до 700 ед. ИА/мг).

Исследование химической природы и свойств ингибитора гликозидаз

Состав выделенных препаратов на 85-88 % представлен веществами углеводной природы, содержащими альдегидные, гидроксильные, а-1,2- и а-1,4-гликозидные, двойную связи, амино- и аминогруппы; ингибиторы проявляют высокое сродство к амилазам и являются субстратами для микробной глюкоамилазы (табл. 12).

Таблица 12 - Физико- и биохимические свойства ингибиторов

Наименование показателя Наименование штамма

S. lucensis 1 S. violaceus

Гермостабильность, °С от 20 до 200

pH-стабильность, ед. от 2 до 8

Относительная М.м.: компонент 1 / компонент 2 2100-2300/ 1100-1200 1800-2000/900-1000

К], М, в отношении а-амилазы: - свиной панкреатической ■ Aspergillus niger штамм JT-4 ■ из крови человека - глюкоамилазы Aspergilus niger штамм Л-4 (6,5±0,2)-105 (4,3±0,2)-10~6

(1,1±0,1)-106 (2,3±0,1)10_6

(1,7±0,1)-10ь -

(3,4±0,1)10'° (8,3±0,1)-10~'

Km, М, при воздействии па ингибиторы - панкреатической а-амилазы - а-амилазы Aspergillus niger штамм Л-4 - глюкоамилазы Aspergillus niger штамм Л-4 не действует не действует

то же то же

(1,2±0,1)'10"¿ (1,8±0,1)-10"2

Показатель КМАФАнМ составляет от 20 до 50 КОЕ/г, клетки продуцента-стрептомицета отсутствуют. В процессе хранения в течение 12 мес при температурах (4±1)°С и (22±3)°С увеличение обсемененности не обнаружено. Испытания биологической безопасности и гипогликемического действия в условиях in vivo (совместно с ВМедА им. Кирова) показали, что при введении в рацион питания опытным крысам препарата ингибитора в сочетании с крахмалом соответственно в количестве 0,5 и 3,0 г/(кг массы животного) уровень глюкозы в крови снижается на 40-60 %. Изменения в общем состоянии подопытных животных не обнаружены.

Разработка рецептур новых пищевых добавок функционального назначения

Изучение действия ингибиторов при приготовлении хлебобулочных изделий для потребителей с нарушениями углеводного обмена и имеющими ограничения по их суточному потреблению, показало, что независимо от способа приготовления теста и сорта хлеба ингибиторная активность сохраняется в процессе выпечки. В лабораторных образцах хлеба пшеничного сорта содержание глюкозы в составе хлеба с ингибитором было ниже в сравнении с контрольным образцом на (3,8±0,1) %. При внесении ингибиторов в тесто совместно с цитратом калия или мальтодекстрином в массовом соотношении 1:1 или 1:5 содержание глюкозы в хлебе было на (8±1) % ниже контроля. В результате проведения технологических испытаний установлено, что опытные образцы хлеба, независимо от соотношения ингредиентов при безопарном способе приготовления теста в сравнении с контролем содержали меньше глюкозы. В итоге разработаны рецептуры КПД Люцентин и Виолацентин, включающие наряду с ингибитором гликозидаз цитрат калия (1:2), регулирующий кислотность пищевой системы, и мальтодекстрин (1:1), придающий текучесть и легкость тесту. Установлено, что в сравнении с

контрольными образцами массовая доля глюкозы в опытных образцах хлеба пшеничных сортов, содержащих добавки, была ниже в 1,1-1,6 раза (рис. 15). Содержание декстринов в образцах, приготовленных по рецептуре хлеба дарницкого, превышало уровень для хлеба пшеничных сортов на (5±1) %. Хлеб, содержащий ингибитор гликозидаз, по качеству соответствовал действующей нормативной документации.

Таким образом, введение ингибитора как функционального ингредиента в состав КПД и пищевых продуктов создает перспективу расширения ассортимента изделий с низким гликемическим индексом (ГИ), в частности, хлеба традиционных пшеничных и диетических

на«

Условные обозначения: 1-6 - хлеб пшеничный (1-3 - безопарный и 4-6- опарный способы); 7-9 - хлеб белый (безопарный способ); 10-12 - хлеб дарницкий (на густой закваске); 1,4,7,10 — контрольные образцы (без

добавок); 2,3,5,6,8,9,11,12- опытные образцы: 2,3,5,6 - Виолацентин, 8,9,11,12 - Люцентин дозировка от 0,0005 % до 0,001 % по массе муки Рисунок 15 - Содержание (%) глюкозы в хлебе

ржаных сортов.

Результаты проведенных исследований позволили сформулировать концепцию создания многоцелевого технологического процесса с использованием экологически безопасного сырья, методология реализации которого приведена на рис. 16.

Исходные. ' ' gggg

Крахмалсодержащее сырь?: ю

Продуцент: мицелиальный i

Перевод сырья в доступную для пр.одуцентовЛдр!

питательная

среда I Подготовка проду!

биокатализ

Гидролизаты с разл!____

_____üü

Посевная

макро- и микроэлементы, неорганический источник азота

Периодический

±

Streptomyees Iucensis. Streptomyces^^gci^lgjgj

-макршаемиыы.

Биотехнологический процесс,

Отъем шъ.

мембранный или

«цитратныи>^_

Целевые метабави;

Лимонная кислота _

Пищевая добавка _ Ферментный препаваЙй!

\

Комплексные пищевые ДобршйаУ •

лоливнои

мембранный

Ингибиторы активное

Препарат пищев! ферме;

Пищевая .юб

Пищевые добавки функционалы назначения (в.том чийле^.

Рисунок 16 - Методология получения пищевых ингредиентов и добавок для расширения ассортимента и повышения рентабельности монопроизводства

Выводы

Разработана научная концепция получения в одном производственном цикле из крахмалсодержащего сырья и при использовании в качестве продуцентов микроорганизмов различных таксономических групп нескольких продуктов микробного синтеза (органических кислот, ферментов и их ингибиторов) для применения в пищевой промышленности в качестве ингредиентов и добавок полифункционалыюго назначения (в том числе комплексных), соответствующих нормативным требованиям безопасности.

1. Теоретически обоснованы и экспериментально подтверждены технологические режимы биокатализа крахмалсодержащего сырья, которые позволяют повысить доступность субстратов для продуцентов лимонной кислоты, амилолитических ферментов и ингибиторов.

2. Установлены закономерности биосинтеза лимонной кислоты при ферментации гидролизатов крахмалов. Показана возможность использования штаммов-кислотообразователей микромицета Aspergillus niger в качестве промышленных продуцентов амилаз и оптимизированы биотехнологические процессы получения продуктов микробного синтеза.

3. Селекционированы штаммы актиномицетов Streptomyces lucensis ВКПМ Ас-1743 и Streptomyces violaceus ВКПМ Ас-1734 - продуценты ингибиторов гликозидаз широкого спектра действия. Установлены закономерности биосинтеза ингибиторов актиномицетами и штаммами-кислотообразователями при ферментации гидролизатов крахмалов, на основе которых определены функции целевых метаболитов в биотехнологическом процессе: индуцибельные амилазы катализируют гидролиз углеводов питательной среды, а ингибиторы, образующиеся при лимитировании концентрации источника углерода, подавляют их активность для регулирования интенсивности гидролиза. Штаммы актиномицетов запатентованы (2 патента).

4. Установлено, что регуляция направленности биосинтеза при ферментации гидролизатов крахмалов как аспергиллами-кислотообразователями, так и актиномицетами возможна путем оптимизации состава питательной среды по содержанию моно-, ди и олигосахаридов и источников азота. Методом математического планирования при постановке полного многофакторного эксперимента показано, что в сбалансированном составе питательных сред основное влияние на биосинтез лимонной кислоты оказывают концентрация глюкозы, ферментов - концентрация мальтозы и отношение C:N, ингибиторов гликозидаз — концентрации глюкозы и соевой муки. Для биосинтеза ингибитора амилаз стрептомицетами предпочтительными являются продукты гидролиза кукурузного крахмала в составе гидролизатов с ДЕ, близким к значению, полученному для биосинтеза лимонной кислоты и амилаз. Разработаны технологии ферментации гидролизатов крахмалов аспергиллами-кислотообразователями и штаммами стрептомицетов, обеспечивающие продуктивность процесса соответственно по ферментам и ингибиторам, превышающую показатели действующих технологий в 3-5 раз (5 патентов).

5. Теоретически обоснован и экспериментально подтвержден механизм биосинтеза-секреции а-амилазы и глюкоамилазы продуцентом лимонной кислоты Aspergillus niger при ферментации гидролизатов крахмала. Динамика

уровня активностей амилаз и цитратсинтазы (регуляторный фермент ЦТК на стадии биосинтеза лимонной кислоты) имеет фазный характер.

6. Установлено, что внутриклеточные и секреторные амилазы штамма F-171 Aspergillus niger - это самостоятельные белки, которые различаются строением, кинетическими и обменными параметрами, и представлены двумя изоэнзимами, внутри- и внеклеточные формы которых имеют близкие значения М.м.:

• уровни константы Михаэлиса и максимальной скорости реакции гидролиза крахмала для секреторных амилаз выше, чем для внутриклеточных соответственно на два порядка и в 2,2 раза для а-амилазы, в 5 раз для глюкоамилазы;

• время полуобновления и скорость распада внеклеточной а-амилазы в 3,3 раза, а глюкоамилазы соответственно в 4,5 и 4,8 раза меньше, чем у внутриклеточных ферментов. Содержание внеклеточной а-амилазы и глюкоамилазы в 2,4 раза ниже, чем их внутриклеточный уровень, что позволяет высказать предположение о большей востребованности ферментов во внутриклеточном углеводном обмене для обеспечения клетки продуцента продуктами гидролиза транзитных внеклеточных олигосахаридов. По отношению к общему белку а-амилаза составляет 22,2 %, а глюкоамилаза - 6,2 %, что свидетельствует об активной индукции синтеза а-амилазы продуктами гидролиза крахмала.

7. Доказано, что полученные препараты кислотостабильных амилаз обладают каталитическими свойствами на уровне ферментов в составах известных мультиэнзимных композиций, в том числе и импортных (3 патента). Разработаны рекомендации по их применению в качестве биокатализаторов при подготовке растительного сырья к биотехнологическому процессу, в процессах брожения при производстве хлеба и пива, в производстве модифицированного крахмала, глюкозных сиропов, в биохимии и медицине. Разработан состав комплексной пищевой добавки Глюкоамилонигрин, содержащий амилазы и лимонную кислоту, для интенсификации процессов брожения и улучшения свойств готовой продукции в пивоварении и хлебопечении (2 патента).

8. Установлена принадлежность ингибиторов, синтезируемых микромицетом-кислотообразователем Aspergillus niger и штаммами стрептомицетов при биоконверсии гидролизатов крахмала, к группе псевдосахаридов, существенно различающихся сродством к гликозидазам. Доказано, что ингибиторы, продуцируемые актиномицетами, в отличие от ингибиторов, синтезируемых аспергиллами-кислотообразователями, являются потенциальными гипогликемическими средствами.

9. Разработаны составы комплексных пищевых добавок Люцентин и Виолацентин, обеспечивающие снижение гликемического индекса готовой хлебобулочной продукции по сравнению с традиционными изделиями при сохранении соответствия физико-химических и органолептических показателей действующей нормативной документации. Показана возможность расширения ассортимента функциональных продуктов антидиабетического направления, в том числе и хлебобулочных изделий, приготовленных по рецептурам хлеба пшеничных сортов. Выпуск такой продукции имеет социальный эффект.

10. Разработана нормативная документация на сырье - гидролизаты крахмала (ГОСТ Р 52672-2006 «Гидролизаты крахмала. Общие технические условия») и

техническая документация на новые технологии, апробированные на полупромышленных установках: 1. «совмещенная» (лимонная кислота и амилолитические ферменты); 2. технология ингибиторов гликозидаз. Технологии позволяют за счет использования крахмалов и практически безотходного мембранного способа выделения и очистки целевых веществ в условиях одного промышленного предприятия по производству лимонной кислоты дополнительно получать пищевые добавки, в том числе комплексные, специального и функционального (антидиабетического) назначения с физико-химическими и биохимическими показателями, отвечающими современным требованиям. Годовой экономический эффект от реализации технологий, обеспечивающих многоцелевой процесс получения пищевых ингредиентов и полифункциональных пищевых добавок в производстве лимонной кислоты, составит от 37 до 120 тыс. руб/(т готовой продукции).

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

Монографии

1. Шарова, НЛО. Биосинтез и выделение лимонной кислоты и амилолитических ферментов/ Д.Х. Кулев, Н.Ю. Шарова- М.: ДеЛи принт, 2008. - 128 с.

2. Шарова НЛО. Процессы получения пищевых кислот и амилолитических ферментов/ Н.Ю. Шарова/ Теоретические основы пищевых технологий/ отв. редактор В.А. Панфилов. - М.: КолосС, 2009, Книга 2. - 608 с.

Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК РФ

3. Акулова (Шарова), Н.Ю. Инактивация глюкозидаз под действием биологически активного вещества из Actinoplanes sp./ Н.Ю. Акулова (Шарова), Е.В. Аверьянова, М.Д. Большакова, А.А. Селезнева // Прикладная биохимия и микробиология. - 1992. - т. 28, № 3. - С. 375-379.

4. Акулова (Шарова), Н.Ю. Сравнительное изучение действия ингибиторов микробного происхождения на различные а-глюкозидазы/ Н.Ю.Акулова (Шарова), Г.А. Казанина, А.А. Селезнева //Прикладная биохимия и микробиология. - 1994.- т.30, вып.1. - С.83- 87.

5. Акулова, (Шарова) Н.Ю. Микробные ингибиторы а-глюкозидаз псевдосахаридной природы. Обзор./ Н.Ю. Акулова (Шарова), А.А. Селезнева// Прикладная биохимия и микробиология. - 1995. - т. 31, № 4. - С. 371-380.

6. Шарова, Н.Ю. Новый ингибитор а-глюкозидаз из Streptomyces tomyces (Kitasatoa) sp./ Н.Ю. Шарова, А.А. Селезнева// Прикладная биохимия и микробиология. - 1999. - т. 35, № 1. - С. 10-14.

7. Шарова, Н.Ю. Роль экзогенных амилолитических ферментов Aspergillus niger при биосинтезе лимонной кислоты на гидролизате крахмала/ Т.А. Никифорова, Н.Ю. Брик, Л.Н. Мушникова, Н.Ю. Шарова, Т.В. Выборнова// Хранение и переработка сельхозсырья. - 1999. - № 9. - С. 17-18.

8. Шарова, Н.Ю. Очистка нативных растворов амилолитических ферментов/ Н.Ю. Шарова, Н.Н. Макагонова, Л.Н. Мушникова//Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 1999. - № 3. - С. 68-70.

9. Шарова, Н.Ю. Научные аспекты биоконверсии гидролизатов крахмала в лимонную кислоту/Н.Ю. Шарова, Л.Н. Мушникова, Т.А.Никифорова // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2001. - № 4. - С. 40-42.

10. Шарова, Н.Ю. Физико-химический и микробиологический состав углевод-

улеводсодеращего сырья - субстрата для биосинтеза лимонной кислоты/ JT.H. Мушникова, Т.А. Никифорова, Т.А. Позднякова, Н.Ю. Шарова// Хранение и переработка сельхозсырья. - 2001. - №7. - С.7-9.

11. Шарова, Н.Ю. Выделение кислотостабильных амилолитических ферментов/ Н.Ю. Шарова, JI.H. Мушникова //Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2002. - № 4. - С. 80-81.

12. Шарова, Н.Ю. Ферментный препарат кислотостабильных амилаз -потенциальный улучшитель при приготовлении хлебобулочных изделий / Н.Ю. Шарова, Т.А. Никифорова, Л.И. Кузнецова, Н.Д. Синявская // Хлебопечение России,- 2003. -№ 2. - С. 26-28.

13. Шарова, Н.Ю. Углеводный состав пшеничной муки при гидролизе кислотостабильными амилазами/ Н.Ю. Шарова// Хранение и переработка сельхозсырья. - 2003. - № 5. - С.46-48.

14. Шарова, Н.Ю. Научные аспекты совмещенной технологии микробного синтеза/ Н.Ю. Шарова, Т.А. Никифорова// Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2004. - № 3. - С. 69-71.

15. Шарова, Н.Ю. Биокатализатор на основе кислотостабильного амилолитического комплекса микробного. происхождения/ Н.Ю. Шарова// Хранение и переработка сельхозсырья. - 2005. - № 2. - С. 27-29.

16. Шарова, Н.Ю. Влияние азотсодержащих компонентов питательной среды на биосинтез лимонной кислоты и кислотостабильных амилаз/ Н.Ю. Шарова//Хранение и переработка сельхозсырья. - 2005. - № 9. - С. 36-39.

17. Шарова, Н.Ю. Амилолитические ферменты гриба Aspergillus niger: выделение и свойства/ Н.Ю. Шарова, Т.А. Никифорова, А.В. Кабанов, В.П. Комов// Хранение и переработка сельхозсырья. - 2006. - № 3. - С. 42-44.

18. Шарова, Н.Ю. Секреция, выделение и характеристика а-амилазы плесневого гриба Aspergillus niger/ Н.Ю. Шарова, Т.А. Никифорова, В.П. Комов// Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2006. - № 1. - С. 80-82.

19. Шарова, Н.Ю. Биосинтез ингибиторов амилаз при биоконверсии гидролизатов крахмала штаммом актиномицета Streptomyces lucensis/ Н.Ю. Шарова, О.А. Ходкевич // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2006. - № 11. - С. 43-45.

20. Шарова, Н.Ю. Модифициованный метод определения глюкоамилазной активности/ Н.Ю. Шарова//Хранение и переработка сельхозсырья. -2007. -№ 2,-С. 41-44.

21. Шарова, Н.Ю. Синтез и стабильность а-амилазы из плесневого гриба Aspergillus niger/ Н.Ю. Шарова, А.В. Кабанов, В.П. Комов// Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2007. - № 1. - С. 56-58.

22. Шарова, Н.Ю. Регуляция направленности биосинтеза лимонной кислоты при биоконверсии гидролизатов крахмала плесневым грибом Aspergillus niger/Н.Ю. Шарова, Т.А. Никифорова //Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2007. - № 6. - С. 19-21.

23. Шарова, Н.Ю. Закономерности биотрансформации гидролизатов крахмала штаммами актиномицетов - продуцентами ингибиторов амилаз/ Н.Ю. Шарова, О.А. Ходкевич // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2007. - № 4. - С. 27-30.

24. Шарова, Н.Ю. Биосинтетическая способность штаммов гриба-кислотообразователя Aspergillus niger при ферментации крахмалсодержащего сырья/

Н.Ю. Шарова, Т.В. Выборнова, Т.А. Позднякова // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2008. - № 1. - С. 52-54.

25. Шарова, Н.Ю. Влияние углеводных субстратов на биосинтез ингибитора гликозидаз/ Н.Ю. Шарова, Т.А. Никифорова, О.А. Ходкевич // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2008. - № 1. - С. 89-91.

26. Шарова, Н.Ю. Биосинтез ингибиторов гликозидаз актиномицетами рода Streptomyces/ Н.Ю. Шарова, О.А. Ходкевич // Хранение и переработка сельхозсырья,- 2008. - № 3. - С. 53-56.

27. Шарова, Н.Ю. Новые комплексные пищевые добавки для создания хлебобулочных изделий с низким гликемическим индексом / Н.Ю. Шарова, Т.А. Никифорова, О.А. Ходкевич, Л.И. Кузнецова, Е.С. Иванова // Хлебопродукты.-2008.-№ 11.-С. 57-59.

28. Шарова, Н.Ю. Теоретические аспекты синтеза а-амилазы мицелиальным грибом-кислотообразователем Aspergillus niger/ Н.Ю. Шарова, Т.А. Никифорова, А.В. Кабанов, В.П. Комов // Хранение и переработка сельхозсырья,- 2008. - № 8. -С. 59-61.

29. Шарова, Н.Ю. Крахмалсодержащие продукты переработки зерна ржи -перспективное сырье для биосинтеза лимонной кислоты/ Т.А. Позднякова, Н.Ю. Шарова, Т.В. Выборнова //Хранение и переработка сельхозсырья.- 2008.-№ 7.-С.56-59.

30. Шарова, Н.Ю. Выделение и свойства ингибитора гликозидаз псевдосахаридной природы/ Н.Ю. Шарова, О.А. Ходкевич// Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2009. - № 1. - С. 65-67.

31. Шарова, Н.Ю. Культурально-морфологические и физиолого-биохимические свойства новых штаммов актиномицетов — продуцентов ингибиторов гликозидаз/ Н.Ю. Шарова, О.А. Ходкевич, Т.А. Позднякова// Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2009. -№ 3. - С. 74-76.

32. Шарова, Н.Ю. Ингибитор гликозидаз - ингредиент для создания функциональных хлебобулочных изделий антидиабетического направления/ Н.Ю.Шарова, Т.А. Никифорова, О.А. Ходкевич, Л.И. Кузнецова, Е.С. Иванова// Хранение и переработка сельхозсырья. - 2010. - № 6. - С. 49-51.

33. Шарова, Н.Ю. Экологически безопасное сырье для микробиологического производства лимонной кислоты/ Н.Ю. Шарова// Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2011. - № 2. - С. 75-77.

34. Шарова, Н.Ю. Синтез и стабильность глюкоамилазы мицелиального гриба Aspergillus niger/ НЛО. Шарова, Т.А. Никифорова, А.В. Кабанов, В.П. Комов // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2011. - № 3. - С. 76-77.

35. Шарова, Н.Ю. Новые ферментные препараты для подготовки деструктурированного зерна ржи к ферментации в лимонную кислоту/ Н.Ю. Шарова, Н.В. Каменькова, О.А. Ходкевич // Хранение и переработка сельхозсырья. -2012. - № 6. - С. 37-39.

Зарубежные публикации

36. Шарова, Н.Ю. Технология ингибитора гликозидаз- ингредиента для пищевых продуктов функционального назначения/ Н.Ю. Шарова, Т.А. Никифорова, О.А. Ходкевич // Материалы VII научно-практич. конф.: Инновационные технологии в пищевой промышленности. - Минск, 2008, ч. 2. -С. 202-208.

37. Шарова, Н.Ю. Новые технологии лимонной кислоты на основе крахмалсодержащего сырья/ Н.Ю. Шарова, Н.В. Каменькова, Т.В. Выборнова// Материалы VIII междунар. научно-практич. конф.: Инновационные технологии в пищевой промышленности. - Минск, 2009. - С. 46-53.

38. Шарова, Н.Ю. Направленный биосинтез ингибитора гликозидаз для лекарственной субстанции антидиабетического действия/ Н.Ю. Шарова// Материалы национального съезда фармацевтов Украины: Фармация Украины. Взгляд в будущее. - Харьков, 2010, Т. 1. - С. 565-566.

Патенты на изобретения

39. Пат. 1816379 СССР Способ получения ингибитора а-глюкозидаз / Акулова (Шарова), Н.Ю., Большакова, М.Д., Аверьянова, Е.В., Селезнева, A.A. -ДСП.-заявл. 17.12.90.

40. Пат. 2186850 РФ Способ получения лимонной кислоты / Шарова, Н.Ю., Мушникова, Л.Н., Позднякова, Т.А., Никифорова, Т.А. Опубл. 10.08.2002, Бюл. 22.

41. Пат. 2215036 РФ Способ получения лимонной кислоты / Шарова, Н.Ю., Мушникова, Л.Н., Позднякова, Т.А., Никифорова, Т.А. Опубл. 27.10.2003, Бюл. 30.

42. Пат. 2233882 РФ Способ получения лимонной кислоты / Шарова, Н.Ю., Мушникова, Л.Н., Кулёв, Д.Х., Зенькевич, В.Б., Чиванов, В.Н., Старевский, A.B. Опубл. 10.08.2004, Бюл. 22.

43. Пат. 2261915 РФ Способ получения цитрата кальция / Шарова, Н.Ю., Мушникова, Л.Н. Опубл. 10.10.2005, Бюл. 28.

44. Пат. 2266960 РФ Способ получения лимонной кислоты, альфа-амилазы и глюкоамилазы / Шарова, Н.Ю., Никифорова, Т.А.. Опубл. 27.12.2005, Бюл. 36.

45. Пат. 2294368 РФ Пищевая добавка для гидролиза растительного сырья/ Шарова Н.Ю. Опубл. 27.02.2007, Бюл. № 6.

46. Пат. 2294371 РФ Способ получения лимонной кислоты и комплекса кислотостабильных амилолитических ферментов/ Шарова, Н.Ю. Опубл. 27.02.2007, Бюл. 6.

47. Пат. 2345529 РФ Способ производства хлеба и хлебобулочных изделий/ Евелева, В.В., Шарова, Н.Ю., Кузнецова, Л.И., Синявская, Н.Д. Опубл. 10.02.2009, Бюл. 4.

48. Пат. 2346042 РФ Штамм актиномицета Streptomyces violaceus -продуцент ингибитора гликозидаз / Шарова, Н.Ю., Никифорова, Т.А., Позднякова, Т.А. Опубл. 10.02.2009, Бюл. 4.

49. Пат. 2355755 РФ Штамм актиномицета Streptomyces lucensis -продуцент ингибитора гликозидаз / Шарова, Н.Ю., Позднякова, Т.А., Ходкевич, O.A. Опубл. 20.05.2009, Бюл. 14.

50. Пат. 2366712 РФ Способ получения лимонной кислоты, альфа-амилазы и глюкоамилазы / Шарова, Н.Ю., Позднякова, Т.А., Выборнова, Т.В., Кулев, Д.Х. Опубл. 10.09. 2009, Бюл. 25.

Подписано в печать /?■ 06- ZOU Формат 60x84 1/16

Печ. л. 2,0 Тираж/00 экз. Заказ № !83

НИУ ИТМО. 197101, Санкт-Петербург, Кронверкский пр., 49 ИИКИХиБТ. 191002, Санкт-Петербург, ул. Ломоносова, 9

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт пищевых ароматизаторов, кислот и красителей Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИПАКК Россельхозакадемии)

05201351864 На правах рукописи

ШАРОВА НАТАЛЬЯ ЮРЬЕВНА

РАЗРАБОТКА НАУЧНЫХ ОСНОВ НОВЫХ ТЕХНОЛОГИЙ ПИЩЕВЫХ ДОБАВОК И ИНГРЕДИЕНТОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КРАХМАЛСОДЕРЖАЩЕГО СЫРЬЯ

Специальность 05.18.07 - Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ

Диссертация на соискание ученой степени доктора технических наук

Научный консультант -

доктор технических наук, профессор Т.А.Никифорова

Санкт-Петербург-2013

Приложение Е2 Оптимизация состава питательной среды по содержанию

источников азота и углерода для биосинтеза лимонной кислоты и амилолитических ферментов при ферментации гидролизатов крахмалов

микромицетом Aspergillus niger штамм JI-4...........................................427

Приложение ЕЗ Оптимизация состава питательной среды для биосинтеза лимонной кислоты и амилолитических ферментов при ферментации

гидролизатов кукурузного крахмала....................................................434

Приложение Е4 Оптимизация состава питательной среды для получения ингибитора гликозидаз при ферментации гидролизатов кукурузного

крахмала.......................................................................................443

Приложение Ж Принципиальные технологические схемы........................446

Приложение Ж1 Принципиальная технологическая схема ферментации

гидролизатов крахмала в лимонную кислоту и ферменты..........................446

Приложение Ж2 Принципиальная технологическая схема выделения лимонной кислоты и ферментов модифицированным классическим

способом.......................................................................................447

Приложение ЖЗ Принципиальная технологическая схема выделения

лимонной кислоты и ферментов мембранным способом...........................448

Приложение Ж4 Принципиальная технологическая схема получения

ингибитора гликозидаз.....................................................................449

Приложение К Технологические инструкции (копии титульных листов)......450

Приложение К1 Технологическая инструкция по совместному получению лимонной кислоты и амилолитических ферментов ТИ 085-00334557-2004....450 Приложение К2 Технологическая инструкция "Комплексная пищевая добавка на основе препарата кислотостабильных ферментов

Глюкоамилонигрин" ТИ 091-00334557-2005..........................................451

Приложение К 3 Технологическая инструкция "Применение пищевой

добавки Глюкоамилонигрин" ТИ 092-00334557-2005...............................452

Приложение К4 Технологическая инструкция на процесс получения ингибитора гликозидаз ТИ 115-00334557-2008.......................................453

Приложение Л Технические условия (копии титульных листов).................454

Приложение Л1 "Препарат ферментный Глюкоамилонигрин. Технические

условия" ТУ 9199-002-00334557-04.....................................................454

Приложение Л2 "Добавка функциональная пищевая Люцентин. Технические

условия" ТУ 9199-080-00334557-08......................................................455

Приложение ЛЗ "Добавка функциональная пищевая Виолацентин.

Технические условия" ТУ 9199-081-00334557-08....................................456

Приложением Методические указания (копии титульных листов)............457

Приложение М1 "Методические указания. Применение препарата

Глюкоамилонигрин в пищевой промышленности" РД 059-00334557-2004.....457

Приложение М2 " Методические указания. Применение ингибитора

гликозидаз в пищевых продуктах" РД 092-00334557-2008.........................458

Приложение Н Рецептуры...............................................................459

Приложение Н1 Рецептура "Люцентин" РЦ 234-00334557-2008..................459

Приложение Н2 Рецептура "Виолацентин" РЦ 235-00334557-2008..............460

Приложение П Заключения...............................................................461

Приложение П1 Заключение ФГУ "Ленинградская межобластная ветеринарная лаборатрория" № 4661/746-747 о химико-токсикологическом

исследовании ферментного препарата..................................................461

Приложение П2 Санитарно-эпидемиологическое заключение Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека на ферментный препарат Глюкоамилонигрин

№ 77.99.24.919.Т.001091.06.05 ...........................................................462

Приложение ПЗ Экспертное заключение ГНУ Научно-исследовательского института питания Российской академии медицинских наук на документацию и состав ферментного препарата Глюкоамилонигрин

№ 72/Э-4784/и-05.....................................................................................................463

Приложение П4 Экспертное заключение ГНУ Научно-исследовательского института питания Российской академии медицинских наук

на ТУ 9199-02-00334557-04 "Препарат ферментый Глюкоамилонигрин"

№ 72/Э-4785/и-05............................................................................467

Приложение П5 Заключение Санкт-Петербургского филиала Государственного научно-исследовательского хлебопекарного института о результатах испытаний ферментного препарата Глюкоамилонигрин при приготовлении хлебобулочных изделий..............................................469

Приложение П6 Заключение Санкт-Петербургского филиала ГНУ Государственного научно-исследовательского хлебопекарного института Российской академии сельскохозяйственныйх наук о результатах испытаний пищевых добавок на основе ингибитора гликозидаз при приготовлении хлеба пшеничного из муки пшеничной высшего сорта, хлеба белого из муки пшеничной высшего сорта и хлеба дарницкого

из смеси муки ржаной обдирной и пшеничной первого сорта.....................477

Приложение Р Справки.....................................................................486

Приложение Р1 Справка ФГУП Госудасртвенного

научно-исследовательского института Генетика о депонировании культуры

Э^ериэтусез ую1асеиз Б20 ................................................................486

Приложение Р2 Справка ФГУП Госудасртвенного

научно-исследовательского института Генетика о депонировании культуры

81хер1:отусе8 ^сегшБ Б665 ................................................................487

Приложение С Акты........................................................................488

Приложение С1 Акт от ГУ Всероссийского научно-исследовательского института пищевых ароматизаторов, кислот и красителей Российской академии сельскохозяйственных наук о промышленных испытаниях технологии ферментации гидролизатов крахмала в лимонную

кислоту и кислотостабильные ферменты...............................................488

Приложение С2 Акт внедрения элитных линий штамма Aspergillus niger J1-4, полученных при выполнении работ №01/2005-1,

ЗАО "Цитробел"..............................................................................490

Приложение СЗ Акт внедрения элитных линий штамма

Aspergillus niger Jl-4, полученных при выполнении работ по теме: НТП 10.02.01.0 Россельхозакадемии и договору № 03/2010-1,

ООО "Цитробел"..............................................................................491

Приложение С4 Акт внедрения методических указаний МУК 4.2.2656-10 "Метод микробиологического измерения концентрации клеток штамма-продуцента лимонной кисолоты Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе рабочей зоны", разработанных ГНУ ВНРТИПАКК Россельхозакадемии

по теме № 10.02.02.02 и х/д 31/2008-1, ООО "Цитробел"...........................492

Приложение С5 Акт внедрения технологической инструкии по производству посевного материала ТИ 116-00334557-2008, разработанной ГНУ ВНИИПАКК Россельхозакадемии по теме № 10.02.02.02

и х/д 6/2008-1, ООО "Цитробел".........................................................493

Приложение С6 Акт о производственных испытаниях технологии выделения лимонной кислоты и кислотостабильных ферментов,

НПК "Биотест"...............................................................................494

Приложение С7 Акт внедрения технологии деструкции зернового сырья (пшеница) Омского региона для получения лимонной кислоты,

ООО "СпецЛитКемистри".................................................................500

Приложение С 8 Акт внедрения технологии деструкции зернового сырья (рожь) Омского региона для получения лимонной кислоты,

ООО "СпецЛитКемистри".................................................................501

Приложение С9 Акт испытаний ферментного препарата Глюкоамилонигрин в пивоварении, лаборатоия "Брожения и санитарии пивоварения",

ГУ ВНИИ ПБ и ВП..........................................................................502

Приложение С10 Акт о производственных испытаниях полифункциональных пищевых добавок на основе органических кислот и их производных,

разработанных ГУ ВНИИПАКК РАСХН, в хлебопечении, ОАО "Заря"........505

Приложение CI 1 Акт внедрения полифункциоанльных комплексных пищевых добавок на основе ферментов амилолитического действия, лимонной и молочной кислот в производственную практику и

техническую документацию ОАО "Аромарос М".................................

Приложение С12 Акт от ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института пищевых ароматизаторов, кислот и красителей Российской академии сельскохозяйственных наук о пролупромышленных

испытаниях технологии получения ингибитора гликозидаз....................

Приложение С13 Акт об опытно-промышленных испытаниях препарата ингибитора гликозидаз и комплексных пищевых добавок на его основе, разработанных ГУ ВНИИПАКК РАСХН при выполнении НИР по теме "Создать технологию получения пищевой добавки на базе ингибитора гликозидаз при биоконверсии гидпролизатов крахмала штаммами

актиномицетов", в хлебопечении, СПбФ ГНУ ГОСНИИХП...................

Приложение Т Экономический эффект..............................................

Приложение Т1 Экономический эффект от выполнения НИР 01.65.0 - 2002-2004 г.г. в рамках НТП Россельхозакадемии "Разработать научные основы систем технологического обеспечения хранения и комплексной переработки сельскохозяйственного сырья при производстве экологически безопасных конкурентоспособных пищевых продуктов

общего и специального назначения"............................................

Приложение Т2 Экономический эффект от выполнения НИР 10.05.02.01 - 2006-2008 г.г. в рамках НТП Россельхозакадемии "Разработать современные ресурсосберегающие методы и технологии высокоэффективной переработки сельскохозяйственного сырья при производстве безопасных продуктов адекватного питания"...............

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время отечественный рынок испытывает существенный недостаток в пищевых ингредиентах и добавках, как полифункционального назначения, так и функционального действия. Среди них значительную долю занимают продукты микробиологического синтеза. В основном их получают как индивидуальные вещества, являющиеся целевыми монопродуктами технологического процесса. К числу последних относятся широко используемые в пищевой промышленности лимонная кислота и ферменты амилолитического действия.

За последние пять лет объем мирового производства лимонной кислоты изменился мало, и совокупная рыночная доля ингредиента снизилась более чем на 9 %, за исключением Китая, где его импорт вырос на 37 % (до 198 тыс. т) [37]. Напротив, потребление лимонной кислоты увеличивается с каждым годом и на европейском рынке составляет до (80-85) тыс. т в год (до 440 тыс. т). В России потребность в лимонной кислоте в три раза превышает объем ее производства (11 тыс. т в год), который обеспечивается лишь одним профильным заводом (ООО «ЦИТРОБЕЛ», г. Белгород).

На рынке ферментов отмечается положительная динамика. Ежегодный рост мирового рынка ферментных препаратов составляет в среднем 10 %, а европейского - на уровне 3,5 %, причем за счет инновационных разработок, в том числе касающихся ферментов для пищевой промышленности [35]. По прогнозу международной исследовательской компании «Euromonitor International» в 2011 г. российский рынок ферментов вырастет на 6,5 %, однако на мировом уровне доля отечественных препаратов составляет лишь 30 %. Наибольший объем потребления в России составляют амилолитические ферменты (73,3 % на 2007 г.), из которых более 50 % импортного производства. Развитие рынка ферментов зависит от экономической целесообразности их применения и возможности промышленного производства. В Европе уровень использования ферментных препаратов в пищевых отраслях существенно

выше, чем в России, и половину продаваемых из них составляют ферменты для хлебопечения, выпуск которых за последние пять лет вырос почти на 40 %. Однако в России масштабное производство ферментных препаратов практически отсутствует. В настоящее время работают только несколько заводов, выпускающих ферменты микробного происхождения, в том числе и амилолитического действия. Наиболее востребована продукция предприятий «Сибиофарм» (г. Бердск), ОАО «Восток» (Кировская обл.) и Мичуринского экспериментального завода (МЭЗ), основными потребителями которых являются спиртовая, пивобезалкогольная промышленность и кормопроизводство. Остальные отрасли пищевой промышленности предпочитают использовать импортные препараты.

Одним из факторов, повлиявших на снижение объема выпуска отечественных пищевых ингредиентов и добавок, является ограниченность сырьевой базы. В настоящее время в производстве лимонной кислоты в основном используют свекловичную мелассу - сезонное сырье, требующее постоянного контроля состава и обработки токсичными химическими реагентами при подготовке к ферментации. В рамках решения проблемы экологизации микробиологических производств возникла необходимость перехода на условно экологически чистое и рациональное сырье, которым являются крахмалсодержащие природные ресурсы. Кроме того, они содержат источники субстратов, индуцирующих биосинтез амилолитических ферментов, что выгодно отличает его от мелассы и создает возможность максимального использования потенциала микромицета Aspergillus niger для получения в одном технологическом процессе и лимонной кислоты, и кислотостабильных амилаз.

Лимонная кислота (Е330) - известный подкислитель и регулятор рН пищевой системы, антиоксидант и комплексообразователь (используется широко в медицине, фармакологии, бытовой химии, текстильной и металлургической промышленностях, на предприятиях электроэнергетики) за рубежом производится при ферментации гидролизатов крахмалов, которые

содержат индукторы синтеза амилолитических ферментов. Ферментные препараты кислотостабильных амилаз востребованы в технологиях, требующих проведения процесса при низких значениях рН, в частности, в качестве улучшителей для хлебопекарного производства, интенсифицирующих процесс сахарообразования и брожения, в добавках, катализирующих гидролиз растительного сырья, например, для пивоварения, крахмалопаточной промышленности. Однако не всегда составы пищевых ингредиентов и добавок отвечают потребностям производителей и потребителей. Так, ряд технологий требуют длительного проведения ферментативного гидролиза при низких значениях рН, для чего необходимо создание условий, способствующих сохранению на высоком уровне ферментативной активности. На российских предприятиях пищевой промышленности для этих целей в основном используют импортные мультиэнзимные .композиции, которые содержат ферменты, синтезируемые разными продуцентами и стабилизаторы их активности. Поскольку условия биосинтеза лимонной кислоты и амилаз микромицетом Aspergillus niger во многом совпадают, то при выборе и оптимизации определенных факторов, влияющих на направленность биотехнологического процесса, возможно создание технологий полифункциональных ингредиентов и комплексных пищевых добавок на их основе с выходами и активностями амилаз, сравнимыми с показателями культивирования специально селекционированных штаммов гриба.

Согласно данным научно-технической и патентной литературы микромицет Aspergillus niger синтезирует в незначительных количествах и вторичные метаболиты - ингибиторы амилолитических ферментов, которые являются функциональными пищевыми добавками к специализированным продуктам для лиц, вынужденных в рационе питания ограничивать потребление углеводов. Ингибиторы с широкой специфичностью действия на амилазы выделены в существенных количествах из культуральных жидкостей, полученных в результате ферментации нативного крахмала и олигосахаридов актиномицетами рода Streptomyces. Известные представления об условиях

культивирования продуцентов и стадиях синтеза ими ингибиторов амилаз предопределяют возможность получения последних в качестве дополнительного продукта микробного синтеза в «совмещенных» технологиях лимонной кислоты и амилаз с использованием аспергиллов, близких по физиолого-биохимическим и культурально-морфологическим признакам к стрептомицетам. Такой подход позволит расширить номенклатуру отечественных пищевых добавок функционального действия.

Современные исследования в области регуляции направленного биосинтеза у микроорганизмов идут быстрыми темпами. Однако многие подробности белкового синтеза, в частности ферментов, большинством прокариот, в том числе и грибами рода Aspergillus, остаются неясными. Поскольку от активности ферментной системы продуцента зависит эффективность биоконверсии субстратов в целевые продукты метаболизма, несомненный интерес вызывает установление путей регуляции биосинтеза ферментов с определенной специфичностью действия. Применительно к биосинтезу лимонной кислоты при использовании в качестве углеводсодерж�