автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Разработка биоконсерванта на основе иммобилизованных клеток бактериоции образующих стартовых культур

На правах рукописи

БАРАНОВА ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА

РАЗРАБОТКА БИОКОНСЕРВАНТА НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК БАКТЕРИОЦИН ОБРАЗУЮЩИХ СТАРТОВЫХ КУЛЬТУР

Специальность 05.18.07 - Биотехнология пищевых продуктов и биологических

активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва-2010

004603975

Работа выполнена на кафедре «Технология мяса и мясных продуктов» и в Проблемной научно-исследовательской лаборатории электрофизических методов обработки пищевых продуктов Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет прикладной биотехнологии» (ГОУ ВПО МГУПБ)

Научный руководитель: - доктор технических наук,

профессор, В. В. Хоролъский

Официальные оппоненты: - доктор биологических наук,

профессор, Т.И. Громовых

- доктор технических наук, профессор, Л. С. Кудряшов

Ведущая организация:

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт мясной промышленности им. В.М. Горбатова Российской академии сельскохозяйственных наук

Защита диссертации состоится «. ¿шш 2010 г. в ^часов на заседании Диссертационного совета Д 212.149.01. при ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии» по адресу: 109316, г. Москва, ул. Талалихина, 33, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии» по адресу: 109316, г. Москва, ул. Талалихина, 33.

Автореферат разослан «.£_?> 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, //~\\

кандидат технических наук, профессор ( А.Г. Забашта

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

В мясной промышленности по-прежнему одной из ключевых задач остается обеспечение безопасности сырья и готовых продуктов. Эффективное ингибирование санитарно-показательной и патогенной микрофлоры при производстве мясопродуктов осуществляется за счет внесения стартовых культур. В процессе своей жизнедеятельности они синтезируют специфические метаболиты (молочную кислоту, диацетил) и антимикробные вещества, бактериоцины, подавляющие при прямом антагонизме нежелательную микрофлору (Егоров Н.С., 1999).

Потенциал бактериоцинов рассматривают в рамках биоконсервации дня повышения микробиологического качества и безопасности пищевых продуктов. Бактериоцины или бактериоцин синтезирующие культуры могут стать альтернативой химическим консервантам, уменьшить интенсивность тепловой обработки, естественно сохраняя полезные свойства пищевых продуктов (Savadogo А., 2006). Главный фактор, ограничивающий применение бактериоцинов в промышленном масштабе - их низкий выход в течение производства и дорогостоящие выделение и очистка. Вопросы повышения синтеза бактериоцинов микроорганизмами, увеличение активности и стабильности этих соединений всегда актуальны и имеют тенденцию к развитию и совершенствованию.

Теоретическим и практическим работам, основанным на фундаментальных исследованиях в области биотехнологии, посвящены многочисленные научные труды отечественных и зарубежных ученых: JI.B. Антиповой, В.И. Ганиной, H.H. Липатова (мл.), А.Б. Лисицына, Г.М. Слепых, Н.В. Нефедовой, И.А. Рогова, Л.Ф. Митасевой, В.И. Соловьева, Е.И. Титова, В.В. Хорольского, F. Niinîvaara, Klaenhammer T.R., L. de Vuyst, Leroy F., Vandamme E.J., Lacroix С. и др.

Введение чистой культуры жизнеспособного продуцирующего бактериоцины штамма - косвенный путь включения бактериоцинов в мясные изделия, зависящий от способности добавленного штамма расти и продуцировать бактериоцины в промышленных условиях, является перспективным.

Температура - один из важнейших факторов внешней среды, определяющих жизнеспособность микроорганизмов на всех стадиях их развития. С практической точки зрения наиболее важными являются две области температур: температуры, при которых происходит рост и размножение микроорганизмов, и температуры, вызывающие летальные изменения в микробных клетках.

Использование стартовых и защитных культур в мясной промышленности ограничивается производством сырых ферментированных мясопродуктов и изделий с длительной осадкой. Это связано с потерей жизнеспособности стартовых культур после термической обработки. При нагреве продукта до температуры 70±2 °С в процессе тепловой обработки наблюдается практически полное прекращение роста мезофильной и частично термофильной микрофлоры и спсрообразующих бактерий в вегетативной форме. Поэтому актуально направление повышения термоустойчивости бактериоциногенных стартовых

культур.

Данная работа была направлена на создание биоконсерванта на основе бактериоцин синтезирующих стартовых культур для широкого спектра мясных продуктов, исследование его антимикробной активности в модельных фаршевых системах й определение целесообразности применения в технологии мясных продуктов, в частности, полукопченой и вареной колбас.

Цель и задачи исследования

Целью работы является разработка термоустойчивого биоконсерванта на основе бактериоцин синтезирующих стартовых культур для продления сроков годности мясных продуктов. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

> провести скрининг штаммов-продуцентов бактериоцинов среди молочнокислых микроорганизмов различных таксонов из коллекции МГУПБ;

> определить локализацию генетических детерминантов наиболее конкурентоспособных штаммов-продуцентов бактериоцинов, относящихся к видам P. pentosaceus и P. acidilactici;

> повысить термоустойчивость выбранных штаммов к тепловой обработке и замораживанию микрокапсулированием;

> определить эффективность биоконсерванта на модельных фаршевых системах;

> оценить влияние биоконсерванта на срок годности в технологии мясных продуктов на примере полукопченой и вареной колбас;

> разработать технологию биоконсерванта и проект технической документации на препарат, провести апробацию в промышленных условиях.

Научная новизна работы

> проведен скрининг микроорганизмов различных таксонов конкурентоспособных штаммов-продуцентов бактериоцинов из коллекции МГУПБ; определены штаммы, подавляющие санитарно-показательную микрофлору; выявлен бактериоциногенный штамм Lactobacillus plantartim 7К, подавляющий штаммы гомологичного вида;

> установлена локализация генетических детерминантов синтеза бактериоцинов у штаммов Pediococcus acidilactici 27, 38 и Pediococcus pentosaceus 23, 28, 55. У штаммов P. acidilactici 27 и 38 было найдено по одной плазмиде размером 11 тпн, у штаммов P. pentosaceus 23, 28, 55 плазмид обнаружено не было. Элиминацией плазмид установлено, что гены, ответственные за синтез бактериоцинов в случае штаммов P. pentosaceus 23, 28, 55, расположены на хромосоме.

> подобраны параметры и условия микрокапсулирования P. acidilactici 27 и 38, которое осуществлялось методом вытеснения смеси, состоящей из суспензии клеток в физиологическом растворе концентрацией 10 lg КОЕ/мл и 1,5%-ного альгината натрия в отношении 1 : 5 (об/об) в 0,1 М раствор кросс-агента СаС12 с применением монодисперсных технологий;

> создана статистическая модель процесса микрокапсулирования, уравнение множественной регрессии которой позволяет, в зависимости от концентрации альгината натрия и микробных клеток, устанавливать диаметр микрокапсул;

> методом просвечивающей электронной микроскопии установлено, что термическая обработка микрокапсулированных штаммов не изменяет морфологию клеток, следовательно, не снижает общую метаболическую активность, характерную только для целостной структуры клетки.

Практическая значимость

> повышена термоустойчивость штаммов Pediococcus acidilactici 27 и 38 микрокапсулированием в альгинат натрия, в результате которого после инкубирования иммобилизованных штаммов при 72 °С в течение 60 мин остается 57% жизнеспособных клеток;

> установлено, что микрокапсулированные клетки штаммов Р. acidilactici 27 и 38 сохраняют свою гликолитическую активность п ри низких температурах (минус 18 °С) не менее 6 месяцев.

> на основе микрокапсулированных клеток штаммов-продуцентов бактериоцинов разработан биоконсервант «Витасфер» для производства термически обработанных мясных изделий и проект технической документации на препарат; определена рациональная концентрация введения в мясное сырье биоконсерванта, составляющая 9 lg КОЕ/г;

> проведены исследования физико-химических, микробиологических, органолептических показателей и исследована динамика окислительных и гидролитических изменений опытных образцов вареной и полукопченой колбас с использованием биоконсерванта «Витасфер». Установлено, что срок годности изделий увеличивается по сравнению с контролем в 2,3 и 1,2 раза для вареной и полукопченой колбасы соответственно;

> проведена опытно-промышленная выработка биоконсерванта «Витасфер» в условиях «Центра высоких технологий» ГОУ ВПО «Московский энергетический институт (Технический университет)» и промышленная выработка полукопченой колбасы с использованием биоконсерванта «Витасфер» в условиях «Балаковский мясной двор» (ИП).

Апробация работы

Основные положения работы и результаты исследований были представлены на следующих конкурсах и конференциях:

Международная научная конференция студентов и молодых ученых в рамках IV Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007), «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2007, 2008), IV Международный научно-практический симпозиум «Микробные биокатализаторы и их роль в нано- и биотехнологии» (Москва, 2008), 11-ая Международная научная конференция памяти В.М. Горбатова «Тенденции и перспективы развития инновационных и информационных технологий перерабатывающей промышленности» (Москва, 2008), III Международная научно-техническая конференция «Инновационные технологии и оборудование для пищевой промышленности (приоритеты развития)», посвященная 80-летию ГОУ ВПО «Воронежская государственная технологическая академия» (Воронеж, 2009).

Призер конкурса ассоциации «Университетский комплекс прикладной биотехнологии» (Москва, 2007).

Призер конкурса молодых ученых в рамках Международной химической ассамблеи ICA-2008 (Москва, 2008).

Диплом и медаль за разработку биоконсерванта на основе иммобилизованных клеток штаммов-продуцентов бактериоцинов для производства мясных продуктов, полученные на Международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (Москва, 2008).

Лауреат премии Правительства РФ в области науки и техники для молодых ученых 2009 года.

Новизна решений защищена патентами, справками о депонировании стартовых культур в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика. Практическая значимость работы подтверждена соответствующими документами.

Публикации

По результатам исследований, изложенных в диссертационной работе, опубликовано 26 печатных работ, в т.ч. статей в журналах, рекомендованных ВАК - 4, в других изданиях - 4, 2 патента, методические указания для студентов специальностей 260301,240901,240902 и магистров направления 260100.

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, методов исследования, экспериментальной части с обсуждением результатов исследований, выводов, списка литературы, содержащего 101 источник, в том числе 77 работ зарубежных авторов, и 8 приложений.

Работа изложена на 108 страницах машинописного текста, содержит 1 9 таблиц и 29 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Обозначена актуальность проблемы повышения безопасности и пролонгирования сроков годности мясных продуктов за счет биоконсервирования; определено направление решения этой проблемы, сформулированы цели и задачи исследований.

Глава 1. «Литературный обзор»

В данном разделе представлен анализ научно-технической литературы о потенциале использования бактериоцинов в качестве биологических консервантов в технологии пищевых продуктов, представлены механизмы действия и синтеза бактериоцинов. Описаны генетические детерминанты, кодирующие синтез бактериоцинов, и факторы, влияющие на их продуцирование. Раскрыта возможность стабилизации свойств и защиты штаммов-продуцентов иммобилизацией от неблагоприятных воздействий, характерных для промышленных условий.

Гпава 2. «Методика постановки эксперимента и методы исследований»

Представлена схема проведения эксперимента (рис. 1), дана характеристика объектов исследований, указаны исследуемые показатели, и изложены методы их определений.

В работе использовались следующие методы исследований: 1 -

определение антагонистической активности методом перпендикулярных штрихов; 2 - определение продуцентов бактериоцинов экспресс-методом с нейтрализацией молочной кислоты; 3 - стандартные генетические методы (Маниатис Т. и др., 1984); 4 - элиминация плазмидной ДНК из микроорганизмов - по методу Grahami D.C., 1985; 5 - микрокапсулирование микробных клеток-на установке для микрокапсулирования и микрогранулирования лекарственных и витаминных препаратов; 6 - просвечивающая электронная микроскопия на просвечивающем электронном микроскопе LE0912 AB OMEGA ТЕМ, Германия; 7 - определение белка на полуавтоматическом приборе Kjeltec System 1002 «Tecator», Швеция; 8 - определение массовой доли влаги по ГОСТ Р 51479; 9 -массовой доли жира методом Сокслета по ГОСТ 23042; 10 - массовой доли золы методом озоления и прокаливания исследуемого продукта; 11 -влагосвязывающей способности методом прессования; 12 - величины pH потенциометрическим методом; 13 - массовой доли хлорида натрия по ГОСТ 9957; 14 - определение содержания нитрита натрия с применением реактива Грисса по ГОСТ 8558; 15 - определение содержания нитрозопигментов методом, основанным на экстрагировании нитрозогемохромогена и солянокислого гематина водным раствором (Коган М.Б., 1971); 16 - перекисного числа методом определения степени окисления жира, основанном на окислении йодисто-водородной кислоты пероксидами, содержащимися в жире, с последующим отгитровыванием йода тиосульфатом натрия по ГОСТ Р 51487; 17 - определение кислотного числа по ГОСТ Р 50457; 18 - дистилляционный метод определения окислительных изменений с 2-тиобарбитуровой кислотой; 1 9 - опр еделение предельного напряжения сдвига методом пенетрации по ГОСТ Р 50814; 20 -органолептических показателей по ГОСТ 9959; 21 - микробиологических показателей по ГОСТ 9958; 22 - количества молочнокислых микроорганизмов по ГОСТ 10444.11; 23 - определение дрожжей и плесневых грибов по ГОСТ 10444.12; 24 - статистическая обработка экспериментальных данных. Повторность опытов трех- и пятикратная, обработку экспериментальных данных проводили методами математической статистики. Объектами исследований являлись:

> бактериоцин синтезирующие штаммы Pediococcus acidilactici 27 (В-8893), 38 (В-8902) и Pediococcus pentosaceus 23 (В-8894), 28 (В-8888), 55 (В-8955) (разрешенные органами Роспотребнадзора для использования в пищевой промышленности по ТУ 9229-045-02068640-07);

> санитарно-показательнаямикрофлора SalmonellatyphymuriumLTZ (В-3533), Proteus vulgaris АТСС 13315 (В-1667), К coli К-12 С 600 (В-1010), Staphylococcus aureus subsp. aureus 209P (B-6646).

> микрокапсулированные в альгинат натрия (Sigma-Aldrich Со.) штаммы Pediococcus acidilactici 27, 38;

> биоконсервант «Витасфер» на основе микрокапсулированных бактериоцин синтезирующих штаммов Pediococcus acidilactici 27 и 38;

> фаршевые модельные системы с введением биоконсерванта;

> опытные образцы полукопченой и вареной колбас, выработанные с применением биоконсерванта «Витасфер».

Рис. 1. Схема проведения эксперимента

8

Глава 3. «Исследование антагонистических свойств молочнокислых микроорганизмов»

Среди микроорганизмов, так же как и в любой другой биологической среде, существуют различные типы взаимоотношений, в том числе и антагонизм. Одна из наиболее ярко выраженных и специфических форм активного антагонизма заключается в воздействии на партнера биологически активными метаболитами, в том числе бактериоцинами, антибиотическими веществами, т.к. эти метаболиты действуют избирательно, т.е. только на определенные виды микроорганизмов.

Выявление молочнокислых бактерий - продуцентов бактериоцинов проводилось экспресс-методом с нейтрализацией молочной кислоты и использованием 96-луночных планшетов.

В качестве индикаторных штаммов использовали условно-патогенную микрофлору из коллекции ВКПМ ФГУП ГНЦ РФ «ГосНИИгенетика»: Salmonella typhymurium LT2, Proteus vulgaris АТСС 13315, E. coli K-12 С 600, Staphylococcus aureus subsp. aureus 209P.

По результатам скрининга штаммов-продуцентов бактериоцинов среди микроорганизмов коллекции МГУПБ выявлены следующие штаммы с высокими антагонистическими свойствами, в случае которых процент ингибирования роста индикаторных штаммов по сравнению с контролем составил более 50%: Lb. plantarum 7К (В-2663), Lb. plantarum 2П (В-1616), Lb. plantarum 21 (В-8654), Lb. sakei 103 (В-8932), Lb. sakei 104 (B-8936), Lb. sakei 105 (B-8905), Lb. sakei 111-1 (B-8952), P. acidilactici 3 (B-8891), P. acidilactici 8 (B-8897), P. acidilactici 27 (B-8893), P. acidilactici 38 (B-8902), P. pentosaceus 23 (B-8894), P. pentosaceus 28 (B-8888), P. pentosaceus 39 (B-8898), P. pentosaceus 55 (B-8955), P. pentosaceus 106 (B-8935), Staph, xylosus 96-2 (B-8947).

Спектр инги бирования и процент под авления клеток св идетельствуют о том, что способность молочнокислых микроорганизмов синтезировать бактериоцины является штаммоспецифичным признаком. Отмеченные выше штаммы можно рекомендовать к использованию в мясной промышленности для ингибирования роста нежелательной микрофлоры.

Наибольший интерес в технологическом плане представляют педиоцин синтезирующие штаммы педиококков, активные против бактерий рода Listeria, поэтому для следующих этапов работы были отобраны наиболее конкурентоспособные штаммы педиококков: P. pentosaceus 55, P. pentosaceus 23, P. acidilactici 27, P. pentosaceus 28, P. acidilactici 38.

Бактериоцины молочнокислых микроорганизмов могут подавлять рост филогенетически родственных микроорганизмов. Поэтому методом перпендикулярных штрихов был исследован совместный рост молочнокислых микроорганизмов из коллекции МГУПБ (рис. 2, а, б).

Из большого числа различных комбинаций штаммов антагонизм обнаружен только в двух случаях (рис. 2, в, г). В одном случае это можно объяснить сильным образованием молочной кислоты штаммами Pediococcus acidilactici 25 (общая кислотность 91 °Т) и Lb. plantarum 19 (160 °Т), ингибирующими рост штамма Lb. sakei 104 (75 °С). В другом случае - чувствительностью штаммов Lb. plantarum 21 (73 °С) и Lb. plantarum 32 (79 °Т) к бактериоцину, синтезированному

штаммом ЬЬ. р\аыагит 7К (65 °Т), т.к. по степени кислотообразования они одинаковы.

a) Pediococcus pentosaceus 28 (В-8888), Lactobacillus casei 10 (B-8S90), Pediococcus acidUactici 38 (B-8902).

6) Lactobacillus plantarum 7K (B-2663), Lactobacillus piantarum 100 (B-8899), Staphylococcus camosus 108 (B-8953).

в) Pediococcus acidUactici 25 (B-8892), ,-) Lactobacillus plantarum 7K (B-2663),

Lactobacillus sakei 104 (B-8936), Lactobacillus planta rum 21 (B-8654),

Lactobacillus plantarum 19 (B-8907). Lactobacillus plantarum 32 (В-Ш8).

Рис. 2. Совместный рост штаммов молочнокислых микроорганизмов из

коллекции МГУПБ

Гены, кодирующие продуцирование бактериоцинов, могут быть расположены на хромосоме, плазмиде или быть в составе транспозонов. Для интенсификации использования педиоцинов необходимо понимание на генетическом уровне механизма синтеза бактериоцинов в штаммах педиококков и их антимикробного действия. Анализ плазмидных профилей штаммов-продуцентов бактериоцинов Р. реМоаасет 55, Р. репЮхасеия 23, Р. аасШасЧа 27, Р. рето ¿-асем 28, Р. аасШасЧа 38 показал наличие плазмиды размером приблизительно И тпн у штаммов Р. асШасйа 27 и 38 (рис. 3). В случае штаммов Р. реШохасеш 23, 28, 55 плазмид обнаружено не было, это говорит о хромосомной локализации генов, ответственных за синтез бактериоцинов.

Рис. 3. Картина электрофореза плазмидного профиля образующих бактериоцины педиококков: М - плазмида рВИСШО размером 12330 пн;

1 - Р. репШасеия 55; 2 -Р. репШасет 23; 3 - Р. асйШасНа 27;

4 -Р. репШасеиь 28; 5 - Р. асиШасНа 38;

в - суперскрученная форма плазмиды, Ь - линейная, С - кольцевая

Для подтверждения предположения о том, что за синтез бактериоцинов в штаммах Р. аШИасИс/ 27 и 38 отвечает именно плазмида, была проведена элиминация плазмид акрифлавином и новобиоцином (рис. 4).

Антибиотик новобиоцин подавляет активность В-субъединицы ДНК-гиразы, фермента обеспечивающего раскручивание суперспиралей ДНК, необходимое для ее репликации. Молекулы красителя акридина оранжевого интеркалируют между цитозин-гуаниновыми парами ДНК, что также приводит к нарушению процесса репликации.

а) б)

Рис. 4. Колонии Р. ас'иШасйсл 38 справа до и слева после элиминации

плазмиды

Колонии педиококков без зон задержки роста индикаторного штамма Staphylococcus epidermidis 109 (В-8933) проверили на отсутствие плазмид. Локализацию генов, отвечающих за синтез бактериоцина в исследуемых штаммах, подтверждают результаты плазмидного профиля после элиминации (рис. 5).

- iftJi

Mfäj 2 3 4

Рис. 5. Электрофореграмма плазмидного профиля штаммов

после элиминации плазмид, М - маркер GeneRuler™ lkb DNA Ladder; 11 - P. acidilactici 27;

2-P. acidilactici38; 3,4 - излеченные от плазмид штаммы P. acidilactici 27 и

38 соответственно

Изучение генетических характеристик бактериоциногенных микроорганизмов и применение методов генной инженерии позволяют лучше понять механизмы продуцирования бактериоцинов, а также создавать функциональные промышленные штаммы с высоким уровнем синтеза бактериоцинов и широким спектром антагонистической активности. Так, например, гены, кодирующие синтез педиоцинов у штаммов P. acidilactici 27 и 38 находятся на плазмиде, однако стабильность нахождения плазмиды в клетке зависит как от генетических особенностей клетки, так и от самой плазмиды. В неблагоприятных для микробной клетки условиях, таких как технологические параметры при производстве мясопродуктов, плазмиды могут элиминировать. Для того чтобы повысить стабильность плазмид, несущих гены синтеза бактериоцинов, необходимо защитить бактерию от нежелательных факторов внешней среды. В качестве такой защиты можно использовать технологию иммобилизации клетки микроорганизма.

Глава 4. «Повышение термоустойчивости штаммов-продуцентов педиоцинов микрокапсулированием»

Одним из возможных способов защиты клеток молочнокислых бактерий от неблагоприятных факторов внешней среды, повышения стабильности внехромосомных носителей информации - плазмид, кодирующих синтез

12

бактериоцинов, в процессе изготовления мясных продуктов является иммобилизация клеток микрокапсулированием (Huang J., Lacroix С., 1996). Иммобилизация увеличивает продолжительность активного функционировании клеток, расширяет рН- и температурные интервалы роста микроорганизмов, повышает их устойчивость к негативным факторам окружающей среды.

Для повышения устойчивости штаммов P. acidilactici 27 и 38 к термической обработке была применена иммобилизация в Са-альгинатные капсулы. В качестве материала для микрокапсулирования микробных клеток был использован водный раствор альгината натрия концентрациями 1, 1,5, 2 % (табл. 1). Микрокапсулирование выполняли методом вытеснения смеси «материал -культура» в раствор кросс-агента СаС12 (табл. 1) с применением монодисперсных технологий. Альгинат натрия добавляли к дистиллированной воде, автоклавировали и охлаждали до 25 °С. К этому материалу добавляли суспензию клеток в физиологическом растворе концентрациями, указанными в таблице 1, в отношении 1 : 5 (об/об).

Таблица 1

Диаметр капсул в зависимости от концентрации материалов, используемых при микрокапсулировании

Показатель Диаметр микрокапсул, мм

Концентрация микробных клеток 10 lg КОЕ/мл, концентрация хлорида кальция 0,1 M

Концентрация альгината натрия, % 1,0 0,49

1,5 0,58

2,0 0,77

Концентрация альгината натрия 1,5%, концентрация хлорида кальция 0,1 M

Концентрация микробных клеток, lg КОЕ/мл 9 0,51

10 0,61

11 0,80

Концентрация микробных клеток 10 lg КОЕ/мл, концентрация альгината натрия 1,5%

Концентрация хлорида кальция, M 0,05 0,67

0,1 0,64

0,2 0,59

Микрокапсулирование было выполнено на установке для микрокапсулирования и микрогранулирования лекарственных и витаминных препаратов в «Центре высоких технологий» ГОУ ВПО «Московский энергетический институт (Технический университет)».

Для длительного хранения капсулы подвергали лиофильной сушке на лиофильной сушилке ЛС-1000 (Россия) при следующих параметрах: предварительное вымораживание влаги осуществлялось в течение 36 ч при -29±1

°С с последующей сушкой в вакуумной камере сушилки с рабочим давлением 6,67 Па в течение 20 ч.

В результате обработки экспериментальных данных, полученных в ходе подбора рациональных условий и параметров микрокапсулирования жизнеспособных микробных клеток, с помощью программы ЯТАИБИСА 7.0 построена статистическая модель процесса микрокапсулирования (рис. 6), и выведено уравнение множественной регрессии, описывающее изменение диаметра капсул (Ок, мм) в зависимости от концентраций альгината натрия, микробных клеток и хлорида кальция:

Д =0,51-0,45с, +0,075г2 +0,23Х3 х, - концентрация альгината натрия, %, 1<х; <2;

х2 - концентрация микробных клеток в суспензии, ^ КОЕ/мл; 9<х2 <11; х3 - концентрация хлорида кальция, М, 0,05<х3 <0,2.

Для процесса микрокапсулирования были выбраны следующие параметры: концентрация альгината натрия - 1,5%, суспензия микробных клеток - 10 ^ КОЕ/мл, концентрация хлорида кальция - 0,1 М. Выбранные параметры позволяют получать капсулы правильной сферической формы диаметром ~ 0,6 мм. Как показали дальнейшие исследования, микрокапсулы данного размера визуально не различимы в продукте.

■ 0,4

Рис. 6. Поверхность отклика зависимости диаметра микрокапсул от концентрации рабочих растворов

Результаты исследования влияния тепловой обработки иммобилизованных

14

и свободных клеток штаммов P. acidilactici 27, 38 в соотношении 1 : 1 при температуре 70±2 °С в пептонной воде на водяной бане «Elpan» water bath shaker показали, что количество жизнеспособных клеток снизилось от начальной концентрации 9 lg КОЕ/мл до 5,11 lg КОЕ/мл через 60 мин для иммобилизованных клеток, а для свободных клеток до 1,32 lg КОЕ/мл уже через

Продолжительность термообработки, мин

-а— свободные клетки — иммобилизованные клетки

Рис. 7. Изменение количества жизнеспособных свободных и иммобилизованных клеток штаммов P. acidilactici 27 и 38 в процессе тепловой обработки при 70±2 °С

Иммобилизованные клетки штаммов-продуцентов педиоцинов эффективно ингибируют развитие индикаторного штамма Staph, epidermidis 109, формируя ясные зоны подавления роста вокруг микрокапсул (рис. 8).

Рис. 8. Ингибирование роста индикаторного штамма Staph, epidermidis 109 иммобилизованными клетками штаммов P. acidilactici 27,38 Анализ просвечивающей электронной микроскопии, осуществленный с помощью просвечивающего электронного микроскопа LE0912 АВ OMEGA ТЕМ, свидетельствует об отсутствии морфологических изменений клеток штаммов после тепловой обработки, что подтверждается сохранением у них высокой метаболической активности, характерной только для целостной

клеточной структуры (рис. 9).

Влияние температуры на изменение количества молочнокислых микроорганизмов и биоконсерванта на общее число микроорганизмов в процессе тепловой обработки мясных продуктов было исследовано на модельных фаршевых системах, в состав которых входили фарш (50% говядины 1 сорта + 50% свинины полужирной), 0,2% глюкозы, 2% поваренной соли, 0,0071% нитрита натрия и 0,005% аскорбината натрия.

а) б)

Рис. 9. Просвечивающая электронная микроскопия образцов микрокапсулироваииых клеток до (а) и после (б) тепловой обработки

В ходе эксперимента было приготовлено 7 модельных фаршевых систем, в б из которых внесли свободные и микрокапсулированные штаммы Р. асШИасИЫ 27 и 38 в концентрации 6 ^ КОЕ/г, 9 и 10 КОЕ/г для каждого вида клеток соответственно. Термообработку проводили в течение 15 мин после достижения в центре образца 70±2 °С. Учет изменения числа жизнеспособных клеток штаммов Р. асгсШасИс! 27, 38 в свободном и иммобилизованном виде проводили до тепловой обработки, сразу после тепловой обработки (0), в 1, 3, 5 сутки хранения при температуре 4±2 °С. Активная кислотность в опытных образцах составила 5,7-5,8. В образцах определили общее число микроорганизмов с использованием питательной среды МПА, не содержащей глюкозы и дрожжевого экстракта (табл. 2).

Таблица 2

Изменение общего количества микроорганизмов в модельных фаршевых

системах в процессе хранения при температуре 4±2 °С

Количество клеток штаммов Р. асйШасЧЫ 27,38, внесенных в фаршевые системы Количество микроорганизмов, 1" КОЕ/г

до тепловой обработки после тепловой обработки

0 сут 1 сут 3 сут 5 сут

Контроль 6,21 4,05 4,10 3,30 5,05

Свободные клетки, 6КОЕ/г 5,88 4,85 4,18 4,06 3,70

Свободные клетки, 9 КОЕ/г 5,70 4,00 5,00 4,93 -

Свободные клетки, 10 ^ КОЕ/г 5,70 4,21 4,73 - -

Иммобилизованные клетки, 6 КОЕ/г 6,37 4,04 4,00 - -

Иммобилизованные клетки, 9 ¡Е КОЕ/г 6,08 5,70 - - -

Иммобилизованные клетки, 10 ^ КОЕ/г 6,11 5,76 - - -

«-» - не обнаружено

По результатам исследования (табл. 2) для использования консерванта в производстве колбасных изделий была выбрана концентрация иммобилизованных клеток 9 ^ КОЕ/г.

Исследована устойчивость к низким температурам (-18 СС) при хранении в течение 6 месяцев микрокапсулированных клеток штаммов Р. аасЫасИЫ 27 и 38 без протекторных сред. Установлено, что жизнеспособными осталось 90% микроорганизмов. Клетки не потеряли способность утилизировать глюкозу до молочной кислоты, т.е. сохранили ферментативную активность. Следует, что иммобилизованные клетки можно использовать для изготовления замороженных продуктов, а также применять иммобилизацию как способ сохранения технологических свойств микробных клеток при низких температурах.

Для производства термически обработанных мясных изделий был разработан бактериальный препарат - биоконсервант «Витасфер», состоящий из микрокапсулированных клеток бактериоцин синтезирующих штаммов Р. аскШасйс! 27 и 38 и проект технической документации на него.

Глава 5. «Обоснование эффективности использования биоконсерванта в производстве термически обработанных мясных продуктов»

Гигиеническая оценка сроков годности и условий хранения колбас, выработанных с добавлением биоконсерванта на основе иммобилизованных бактериоцин синтезирующих штаммов Р. аасШасНа 27 и 38, производили в соответствии с рекомендациями МУК 4.2.1847 «Санитарно-эпидемиологическая оценка обоснования сроков годности и условий хранения пищевых продуктов». Сроки исследования продукта должны по длительности превышать предполагаемый срок годности на время, определяемое коэффициентом резерва:

- при сроках годности до 7 сут включительно - в 1,5 раза;

- при сроках годности до 30 сут - в 1,3 раза.

Для исследования возможности увеличения сроков годности мясных продуктов, на примере колбасы полукопченой «Таллинская» высшего сорта ГОСТ 16351 (оболочка искусственная белковая «Белкозин» диаметром 40 мм), за счет бактериального препарата «Витасфер» были исследованы следующие показатели: органолептические, микробиологические, окислительной порчи липидов, активной кислотности. В ходе эксперимента были выработаны опытные и контрольные образцы. В опытные образцы, кроме предусмотренных

рецептурой ингредиентов, внесли биоконсервант в количестве 0,5% от общей массы фарша. Исследование продукта проводили по следующим контрольным точкам: сразу после выработки, через 5, 10, 15, 20, 26 сут при температуре хранения 4±2 °С.

По химическим показателям опытные образцы колбасы незначительно отличаются от контрольных (табл. 3). Различие заключается в значениях массовой доли влаги и доли нитрозопигментов. Оптимальное значение рН для образования нитрозопигментов 5,1-5,5. Донорами электронов могут быть редуцирующие сахара и молочная кислота, образуемая молочнокислыми бактериями. Увеличение ВУС в опытных образцах связано с применением альгината натрия в качестве подложки для микрокапсулирования. По значению предельного напряжения сдвига образцы идентичны.

Таблица 3

Химический состав и технологические характеристики опытных и _контрольных образцов полукопченой колбасы_

Наименование показателя Значение показателя в готовом продукте

Контрольный образец Опытный образец

Белок, % 23,85±0,14 24,85±0,12

Жир, % 21,23±0,18 20,67±0,19

Зола, % 2,47±0,25 2,46±0,25

Массовая доля влаги, % 46,90±0,22 49,83±0,21

Массовая доля соли, % 3,12±0,12 3,77±0,11

Активная ыслотность 5,70±0,04 5,52±0,03

Массовая доля нитрита натрия, % 0,0004±0,0001 0,0003±0,0001

Массовая доля нитрозопигментов, % 81,66±0,43 89,58±0,46

ВУС, % к массе продукта 41,70±0,41 45,35±0,42

Выход готового продукта, % 77,63±0,19 79,21±0Д8

Предельное напряжение сдвига, Па 440,84±0,32 418,61±0,35

Органолептические показатели контрольных и опытных образцов соответствовали требованиям, предъявляемым к данному виду продуктов. Сравнительная органолептическая оценка опытных и контрольных образцов полукопченой колбасы показала, что внесение биоконсерванта не повлияло на органолептические показатели изделия (консистенцию, внешний вид и рисунок на разрезе опытного образца), по отдельным показателям (цвет, запах, аромат) опытные образцы превосходили контроль (рис. 10).

Внешний вид

-А— Контрольный образец -в— Опытный образец

Рис. 10. Органолептическая оценка образцов полукопченой колбасы

Результаты микробиологических исследований, представленные в табл. 4, показывают ингибирование развития санитарно-показательной микрофлоры в

готовом продукте за счет действия бактериоцинов.

Таблица 4

_Микробиологические изменения в процессе хранения_

Микробиологический показатель Значение показателя при хранении

контрольных образцов, сут опытных образцов, сут

0 5 10 15 20 26 0 5 10 15 20 26

КМАФАнМ, КОЕ/г о X* оо о" "о X о "х гч "о X се ■о X ы Ъ *х СЧ Ъ X "о X ъ X "о X <ч Г4 о X сч % X

БГКП (колиформы) в 1 г Не обнаружено Обнаружено Не обнаружено

Сульфитредуцирующие клостридии а 0(31 г Не обнаружено Не обнаружено

Staph, aureus в 1 г Не обнаружено Не обнаружено

Молочнокислые микроорганизмы, КОЕ/г о X (N "о X "о X ъ о X CN О X « о" Ъ X* ъ X Ъ X о" "о X "о X ■ь N

Дрожжи, КОЕ/г Не обнаружено ю2 10' 102 Не обнаружено

Плесени, КОЕ/г Не обнаружено Не обнаружено

Патогенные, в т.ч. сальмонеллы в 25 г Не обнаружено Не обнаружено

L. monocytogenes в 25 г Не обнаружено Не обнаружено

Микроорганизмы рода Proteus в 1 г Не обнаружено Не обнаружено

В процессе хранения в опытных образцах полукопченой колбасы по сравнению с контрольными образцами наблюдается меньшее накопление свободных жирных кислот и продуктов вторичного окисления (рис. 11-13), т.к. стартовые культуры, используемые в работе, обладают механизмами инактивации активных форм кислорода (Машенцева Н.Г., 2008).

5 10 15 20

Продолжительность хранения, сут

—±— Контрольный образец —в— Опытный образец

Рис. И. Изменение кислотного числа в процессе хранения

о,и

5 10 15 20

Продолжительность хранения, сут

—А— Контрольный образец —О— Опытный образец

Рис. 12. Изменение перекисного числа в процессе хранения

О 5 10 15 20 26

Продолжительность хранения, сут

-А—Контрольный образец -в—Опытный образец

Рис.13. Изменение тиобарбитурового числа в процессе хранения

20

Несмотря на некоторое увеличение себестоимости, данный продукт является функциональным продуктом премиум-класса с пролонгированным сроком годности до 20 сут, следовательно, экономические затраты оправданы.

Для подтверждения целесообразности использования «Витасфер» в производстве мясопродуктов были выработаны контрольные и опытные образцы в соответствии с рецептурой вареной колбасы высшего сорта «Докторская» ГОСТ Р 52196 (оболочка искусственная белковая «Белкозин»). В опытные образцы внесли «Витасфер» в количестве 0,5% от массы колбасного фарша.

Контроль микробиологических показателей провели сразу после выработки колбас, на 3, 5,7 и 10 сут (табл. 5).

Таблица 5

Микробиологические показатели вареной колбасы_

Микробиологический показатель Значение показателя при хранен ни

контрольных образцов, сут опытных образцов, сут

0 3 5 7 10 0 3 5 7 10

КМАФАиМ, КОЕ/г ■ъ *х о "х Tf "о Ъ X ""1 "о .С О "х t*> "о ъ X CS •о X

БГКП (колиформы) в 1 г Не обнаружено Обнару •же но Не обнаружено

Сульфитргдущфугащие клостридии в 0,01 Г Не обнаружено Не обнаружено

Staph, aureus в 1 г Не обнар; лкено Не обнаружено

Молочнокислые микроорганизмы, КОЕ/г о о "х о X ■"Г о X о X Ъ X* сч -О х" ЧО "о х" "о х" CS ъ X а

Дрожжи, КОЕ/г Не обнаружено 10' 101 ю2 Не обнаружено

Плесени, КОЕ/г Не обнаружено Не обнаружено

Патогенные, в т.ч. сальмонеллы в 25 г Не обнаружено Не обнаружено

Микроорганизмы рода Proteus в 1 г Не обнаружено Не обнаружено

В ходе исследования микробиологических показателей в процессе хранения образцов вареной колбасы обнаружено, что в контрольных образцах на 5 сут развиваются дрожжи и, в конце срока, на 10 сут - бактерии группы кишечных палочек.

Среди молочнокислых микроорганизмов, выделенных из опытных образцов полукопченой и вареной колбас, методом микроскопирования были обнаружены микроорганизмы, относящиеся к роду РесИососсю. Микроскопическая картина этого рода высокоспецифична: кокки диаметром 0,61,0 мкм, делящиеся в двух плоскостях с образованием тетрад. Принадлежность "ыделенчых педиококков к термоустойчивому виду РесИососсия аасШасШ была

установлена по совокупности фенотипических свойств, в том числе по культивированию при 50 °С и спектру сбраживаемых углеводов. Выделенные педиококки задерживали рост индикаторного штамма Staphylococcus epidermidis 109, что свидетельствует о сохранении технологически ценного свойства -синтеза бактериоцинов после термической обработки.

При внесении биоконсеванта в рецептуру вареных колбас и разработке технической документации на данный вид продукции необходимо регламентировать микробиологический показатель КМАФАнМ.

Полученные результаты позволяют рекомендовать биоконсервант «Витасфер» к использованию в производстве мясных изделий для повышения качества продукции за счет эффективного ингибирования санитарно-показательной микрофлоры и продления сроков годности исследованных в данной работе вареной и полукопченой колбас в 2,3 и 1,2 раза соответственно.

ВЫВОДЫ

1. С помощью экспресс-метода осуществлен скрининг штаммов из коллекции МГУПБ, продуцирующих бакгериоцины, активные в отношении условно-патогенной микрофлоры: Salmonella typhymurium LT2, Proteus vulgaris АТСС 13315, E. coli K-12 С 600, Staphylococcus aureus subsp. aureus 209?. Выбран ряд наиболее конкурентоспособных штаммов-продуцентов, относящихся к родам Lactobacillus, Pediococcus, Staphylococcus. Методом перпендикулярных штрихов выявлен бактериоциногенный штамм Lb. plant arum 7К, подавляющий микроорганизмы гомологичного вида Lb. plantarum 21, Lb. plantarum 32.

2. Исследован плазмидный профиль штаммов-продуцентов бактериоцинов Р. pentosaceus 55, P. pentosaceus 23, P. acidilactici 27, P. pentosaceus 28, Р. acidilactici 38. У штаммов Р. acidilactici 27 и 38 обнаружены плазмиды размером ~ 11 тпн. Элиминацией доказана плазмидная локализация генов, кодирующих синтез бактериоцинов в штаммах Р. acidilactici 27 и 38.

3. Подобраны параметры микрокапсулирования штаммов Р. acidilactici 27 и 38, которое осуществлялось методом вытеснения смеси, состоящей из суспензии клеток в физиологическом растворе концентрацией 10 lg КОЕ/мл и 1,5%-ного альгината натрия в соотношении 1 : 5 в 0,1 М раствор кросс-агента СаС12, позволяющие получить микрокапсулы правильной сферической формы размером ~ 0,6 мм.

4. В ходе статистической обработки опытных данных процесса микрокапсулирования выведено уравнение множественной регрессии, позволяющее установить диаметр микрокапсул в зависимости от концентрации альгината натрия, микробных клеток и хлорида кальция.

5. Показана высокая выживаемость (90%) микрокапсулированных клеток штаммов Р. acidilactici 27 и 38 без использования протекторных сред при температуре минус 18 °С в течение 6 месяцев с сохранением их гликолитической активности.

Установлено, что в ходе термической инактивации иммобилизованных штаммов Pediococcus acidilactici 27 и 38 при 72 °С в течение 60 мин остается 57% жизнеспособных клеток. Методом просвечивающей электронной микроскопии

22

установлено, что термическая обработка микрокапсулированных штаммов не изменяет морфологию клеток, следовательно, не снижает общую метаболическую активность, характерную только для целостной структуры клетки.

6. Разработан биоконсервант «Витасфер» для производства термически обработанных мясных изделий на основе микрокапсулированных клеток бактериоцинсинтезирующих штаммов Р. acidilactici 27 и 38 и проект технической документации на препарат. Проведена опытно-промышленная выработка биоконсерванта «Витасфер» в условиях «Центра высоких технологий» ГОУ ВПО «Московский энергетический институт (Технический университет)».

7. На модельных фаршевых системах определена рациональная концентрация биоконсерванта для использования в технологии мясопродуктов, составляющая 9 lg КОЕ/г и позволяющая продлить срок годности за счет ингибирования санитарно-показательной микрофлоры. Обоснованы сроки годности опытных образцов полукопченой и вареной колбас с использованием биоконсерванта: для полукопченой - 20 сут вместо 15 сут и д ля вареной - 7 сут вместо 3 сут.

8. Промышленная апробация биоконсерванта «Витасфер» осуществлена в условиях ИП «Балаковский мясной двор». Установлено, что по физико-химическим, органолептическим показателям опытные образцы полукопченой колбасы не отличались от контрольных образцов, в опытных образцах с использованием биоконсерванта наблюдалось замедление окислительных и гидролитических процессов, а также торможение развития посторонней микрофлоры.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Баранова Е.А. Бактериальные аминооксидазы позволяют повысить качество и безопасность мясных продуктов / Е.А. Баранова, A.A. Осанова, В.В. Хорольский, Н.Г. Машенцева // Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы IV Международной научной конференции студентов и молодых ученых. - М.: МГУПБ, 2005. - С. 10-11.

2. Баранова Е.А. Определение факторов патогенности пробиотических энтерококков / Е.А. Баранова, A.A. Осанова, В.В. Хорольский, Н.Г. Машенцева// Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы IV Международной научной конференции студентов и молодых ученых. - М.: МГУПБ, 2005. - С. 64-65.

3. Ботина С.Г. Изучение возможности использования бактерий рода Enterococcus в качестве стартовых культур / С.Г. Ботина, Н.Г. Машенцева, Е.А. Баранова, A.A. Осанова, М.А. Корниенко, О.В. Пикасова // Биология - наука 21 века: 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых, посвященная 50-летию Пущинского научного центра РАН. - Пущино, 2006. - 426 с. - С. 359.

4. Баранова Е.А. Использование стартовых бактериальных культур для понижения уровня биогенных аминов в мясных продуктах / Е.А. Баранова, A.A. Осанова, В.В. Хорольский, Н.Г. Машенцева // Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы V Международной научной конференции студентов и молодых ученых. - М.: МГУПБ, 2006. - С. 155-157.

5. Патент № 2367685 РФ. Препарат бактериальный для производства

23

ферментированных мясных изделий / Хорольский В.В., Машенцева Н.Г., Баранова Е.А., Семенышева А.И., Васильченко A.A. - заявл. 19.12.2007; опубл. 20.09.2009. Бюл. № 26. - 5 с.

6. Баранова Е.А. Изучение молочнокислых микроорганизмов, продуцентов бактериоцинов / Е.А. Баранова, В.В. Хорольский, Л.П. Блинкова, Н.Г. Машенцева, Е.С. Дорофеева // Материалы IV Московского международного конгресса «Биотехнология; состояние и перспективы развития» (Москва, 12-16 марта, 2007 г.) М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2007. - часть 2. - С. 154.

7. Осанова A.A. Использование стартовых культур для снижения уровня биогенных аминов в мясных продуктах / A.A. Осанова, В.В. Хорольский, Н.Г. Машенцева, Е.А. Баранова, О.В. Семина // Материалы IV Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 12-16 марта, 2007 г.) М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2007. - часть 2. - С. 195.

8. Дорофеева Е.С. Бактериоциноподобные вещества и локализация генов, контролирующих их синтез, у новых кандидатов в пробиотики / Е.С. Дорофеева, Л.П. Блинкова, Н.Г. Машенцева, И.А. Лаптев, Е.А. Баранова // Материалы Международного конгресса «Пробиотики пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты» (Санкт-Петербург, 15-16 мая, 2007). - С. 38.

9. Хорольский В.В. Исследование аминоксидазной активности молочнокислых микроорганизмов / В.В. Хорольский, Н.Г. Машенцева, О.В. Семина, Е.А. Баранова, A.A. Осанова, Е.Д. Барсуков, C.B. Антонова // Мясная индустрия. -2007.- №5. -С. 56-58.

10. Патент № 2329304 РФ. Способ определения декарбоксилазной активности / Хорольский В.В., Машенцева Н.Г., Семина О.В., Баранова Е.А., Осанова A.A. -заявл. 10.01.2007; опубл. 20.07.2008. Бюл. № 20. - 6 с.

11. Хорольский В.В. Влияние стартовых культур на уровень биогенных аминов в мясных продуктах / В.В. Хорольский, Л.Ф. Митасева, Н.Г. Машенцева, Е.А. Баранова, А.А Осанова., О.В. Семина // Сборник докладов 10-й Международной конференции памяти В.М. Горбатова. Актуальные проблемы мясной промышленности: инновации, качество, управление. - Москва, 2007. - С. 154— 157.

12. Баранова Е.А. Использование в технологии мясных продуктов стартовых культур, синтезирующих бактериоцины / Е.А. Баранова, И.А. Лаптев, В.В. Хорольский, Н.Г. Машенцева, Е.С. Дорофеева, Л.П. Блинкова // Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы V Международной научной конференции студентов и молодых ученых. - М.: МГУПБ, 2007. - С. 156-157.

13. Машенцева Н.Г. Изучение генетического контроля синтеза педиоцинов / Н.Г. Машенцева, В.В. Хорольский, Л.П. Блинкова, Е.А. Баранова, Е.С. Горбатко, И.А. Лаптев // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - M.: «С-ИНФО». - 2008. - № 6. - С. 3-7.

14. Горбатко Е.С. Микрококки как продуценты бактериоцинов, перспективных для получения консервантов биотехнологической продукции / Горбатко Е.С.,

24

Машенцева Н.Г., Блинкова Л. П., Хорольский В.В., Лаптев И.А., Баранова Е.А. // Международная научно-практическая конференция «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» в рамках Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 11-13 марта, 2008).-С. 84.

15. Хорольский В.В. Изучение функционально-технологических свойств стартовых культур, используемых в мясной промышленности: методические указания / В.В. Хорольский, Л.Ф. Митасева, Н.Г. Машенцева, И.А. Лаптев, Е.А. Баранова. - М.: МГУПБ, 2008. - 44 с.

16. Титов Е.И. Комплексный подход к разработке отечественных бактериальных препаратов для мясной промышленности / Е.И. Титов, В.В. Хорольский, Л.Ф. Митасева, Н.Г. Машенцева, Е.А. Баранова, A.A. Васильченко, А.И. Семенышева // Микробные биокатализаторы и их роль в нано- и биотехнологиях. - М.: Пищепромиздат, 2008.-267 с.-С. 209-215.

17. Баранова Е.А. Иммобилизация штаммов-продуцентов бактериоцинов стартовых культур как средство повышения их жизнеспособности / Е.А. Баранова, В.В. Хорольский, Н.Г. Машенцева, Л.П. Блинкова, Е.С. Горбатко, И.А. Лаптев // Материалы международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты», Москва. - 2008. - С. 49.

18. Хорольский В.В. Функциональные стартовые культуры - высокое качество мясных продуктов / В.В. Хорольский, Н.Г. Машенцева, Е.А. Баранова, А.И. Семенышева, И.А. Лаптев // Мясной ряд. - 2008. - № 4. - С. 26-29.

19. Баранова Е.А. Биопрезервация в технологии мясных продуктов / Е.А. Баранова, В.В. Хорольский, Н.Г. Машенцева// Материалы 11-ой Международной научной конференции памяти В.М. Горбатова. Тенденции и перспективы развития инновационных и информационных технологий перерабатывающей промышленности. - М.: ВНИИМП, 2008. - С. 32-36.

20. Баранова Е.А. Повышение устойчивости бактериоциногенных стартовых культур при тепловой обработке микрокапсулированием / Е.А. Баранова, В.В. Хорольский, Н.Г. Машенцева // Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы VI Международной научной конференции студентов и молодых ученых. - М.: МГУПБ, 2008. - С. 53-55.

21. Баранова Е.А. Влияние компонентов питательных сред и условий роста на синтез бактериоцинов молочнокислыми микроорганизмами / Е.А. Баранова, Н.В. Кузнецова, Н.Г. Машенцева // Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы VI Международной научной конференции студентов и молодых ученых. - М.: МГУПБ, 2008. - С. 117-118.

22. Баранова Е.А. Разработка термоустойчивых биоконсервантов на основе бактериоцин синтезирующих стартовых культур / Е.А. Баранова, В.В. Хорольский, Н.Г. Машенцева И Материалы V Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 16-20 марта, 2009 г.). - М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им Д.И. Менделеева, 2009. - часть 2. - С. 47-48.

23. Кузнецова Н.В. Повышение синтеза бактериоцинов, синтезируемых Pediococcus acidilacíici и Pediococcus pentosaceus / Н.В. Кузнецова, B.B.

Хорольский, Н.Г. Машенцева, Е.А. Баранова // Материалы V Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 16-20 марта, 2009 г.). - М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им Д.И. Менделеева, 2009. - часть 2. - С. 97-98.

24. Баранова Е.А. Биоконсервирование в технологии мясных продуктов / Е.А. Баранова, В.В. Хорольский, Н.Г. Машенцева // Материалы III Международной научно-технической конференции «Инновационные технологии и оборудование для пищевой промышленности (приоритеты развития)», посвященной 80-летию ГОУ ВПО «Воронежская государственная технологическая академия» (Воронеж, 22-24 сентября 2009 г.). - Воронеж, 2009. - том 1. - С. 39-41.

25. Баранова Е.А. Обоснование возможности повышения устойчивости стартовых культур к замораживанию и термической обработке / Е.А. Баранова // Мясная индустрия. - 2009.- № 9. - С. 70-72.

26. Баранова Е.А. Иммобилизация защитных культур для биоконсервации термически обработанных мясных изделий / Е.А. Баранова, В.В. Хорольский, Н.Г. Машенцева, A.B. Бухаров // Пищевая промышленность. - 2009. - № 10. - С. 54-56.

Подписано в печать 30.04.10 Усл. печ. л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 11/24 МГУПБ. 109316 Москва, ул. Талалихина, 33.

ООО «Полисувенир», 109316 Москва, ул. Талалихина, 33. Тел. 677-03-86

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Бактериоцины - природные консерванты.

1.2. Определение и классификация бактерицинов.

1.3. Механизмы синтеза pi действия бактериоцинов.

1.4. Факторы, влияющие на синтез бактериоцинов.

1.5. Потенциал педиоцинов в биоконсервировании.

1.6. Генетические детерминанты синтеза педиоцинов.

1.7. Иммобилизация микробных клеток.

В мясной промышленности, по-прежнему, одной из основных задач остается обеспечение безопасности сырья и готовых продуктов и продление их сроков годности. Эффективное ингибирование санитарно-показательной и патогенной микрофлоры при производстве мясопродуктов осуществляется за счет внесения стартовых культур. В процессе своей жизнедеятельности они синтезируют специфические метаболиты: молочную кислоту, диацетил, а также бактериоцины, подавляющие при прямом антагонизме нежелательную микрофлору.

Биоконсервация, основанная на антагонизме микроорганизмов бактериоцинами, - перспективный подход сохранения продуктов питания. По технологическим свойствам наибольший интерес для мясной промышленности представляют бактерии рода Pediococcus, продуцирующие бактериоцин педиоцин, активный против санитарно-показательной и патогенной микрофлоры, в т.ч. против Listeria monocytogenes, пищевого патогена, не чувствительного к консервирующему действию нитрита натрия.

Применение стартовых культур в мясной промышленности ограничивается производством ферментированных мясопродуктов, так как микроорганизмы, входящие в состав бактериальных препаратов, в большинстве своем являются мезофильными. В ходе тепловой обработки при достижении температуры 70±2 °С в центре продукта наблюдается практически полное прекращение роста мезофильной микрофлоры и частично термофильных и спорообразующих бактерий в вегетативной форме. Качество готового продукта зависит от начальной обсемененности сырья и эффективности вносимых консервантов. Иммобилизация стартовых культур позволяет сохранить клетки живыми в продукте при термообработке. Снижение скорости роста бактериальных клеток с помощью их иммобилизации способствует увеличению секреции вторичных метаболитов, в том числе бактериоцинов. Кроме этого, иммобилизация позволяет повысить стабильность плазмид, кодирующих важные технологические характеристики, а также способность клетки синтезировать бактериоцины.

Данная работа направлена на обеспечение высокого качества и безопасности мясных продуктов и продления их сроков годности за счет использования биотехнологического потенциала стартовых культур.

Биоконсерванты на основе иммобилизованных клеток продуцентов бактериоцинов могут использоваться в пищевой промышленности в качестве альтернативы искусственным консервантам и является частью барьерных технологий.

ВЫВОДЫ

1. С помощью экспресс-метода осуществлен скрининг штаммов из коллекции МГУ lib, продуцирующих бактериоцины, активные в отношении условно-патогенной микрофлоры: Salmonella typhymurium LT2, Proteus vulgaris АТСС 13315, E. coli K-12 С 600, Staphylococcus aureus subsp. aureus 209P. Выбран ряд наиболее конкурентоспособных штаммов-продуцентов, относящихся к родам Lactobacillus, Pediococcus, Staphylococcus. Методом перпендикулярных штрихов выявлен бактериоциногенный штамм Lb. plantarum 7К, подавляющий микроорганизмы гомологичного вида Lb. plantarum 21, Lb. plantarum 32.

2. Исследован плазмидный профиль штаммов-продуцентов бактериоцинов Р. pentosaceus 55, P. pentosaceus 23, P. acidilactici 27, P. pentosaceus 28, Р. acidilactici 38. У штаммов P. acidilactici 27 и 38 обнаружены плазмиды размером ~ 11 тпн. Элиминацией доказана плазмидная локализация генов, кодирующих синтез бактериоцинов в штаммах P. acidilactici 27 и 38.

3. Подобраны параметры микрокапсулирования штаммов P. acidilactici 27 и 38, которое осуществлялось методом вытеснения смеси, состоящей из суспензии клеток в физиологическом растворе концентрацией 10 lg КОЕ/мл и 1,5%-ного альгината натрия в соотношении 1 : 5 в 0,1 М раствор кросс-агента СаСЬ, позволяющие получить микрокапсулы правильной сферической формы размером ~ 0,6 мм.

4. В ходе статистической обработки опытных данных процесса микрокапсулирования выведено уравнение множественной регрессии, позволяющее установить диаметр микрокапсул в зависимости от концентрации альгината натрия, микробных клеток и хлорида кальция.

5. Показана высокая выживаемость (90%) микрокапсулированных клеток штаммов P. acidilactici 27 и 38 без использования протекторных сред при температуре минус 18 °С в течение 6 месяцев с сохранением их гликолитической активности.

Установлено, что в ходе термической инактивации иммобилизованных штаммов Pediococcus acidilactici 27 и 38 при 72 °С в течение 60 мин остается 57% жизнеспособных клеток. Методом просвечивающей электронной микроскопии установлено, что термическая обработка микрокапсулированных штаммов не изменяет морфологию клеток, следовательно, не снижает общую метаболическую активность, характерную только для целостной структуры клетки.

6. Разработан биоконсервант «Витасфер» для производства термически обработанных мясных изделий на основе микрокапсулированных клеток бактериоцинсинтезирующих штаммов P. acidilactici 27 и 38 и проект технической документации на препарат. Проведена опытно-промышленная выработка биоконсерванта «Витасфер» в условиях «Центра высоких технологий» ГОУ ВПО «Московский энергетический институт (Технический университет)».

7. На модельных фаршевых системах определена рациональная концентрация биоконсерванта для использования в технологии мясопродуктов, составляющая 9 lg КОЕ/г и позволяющая продлить срок годности за счет ингибирования санитарно-показательной микрофлоры. Обоснованы сроки годности опытных образцов полукопченой и вареной колбас с использованием биоконсерванта: для полукопченой - 20 сут вместо 15 сут и для вареной - 7 сут вместо 3 сут.

8. Промышленная апробация биоконсерванта «Витасфер» осуществлена в условиях ИП «Балаковский мясной двор». Установлено, что по физико-химическим, органолептическим показателям опытные образцы полукопченой колбасы не отличались от контрольных образцов, в опытных образцах с использованием биоконсерванта наблюдалось замедление окислительных и гидролитических процессов, а также торможение развития посторонней микрофлоры.

1. Блинкова Л.П. Бактериоцины: критерии, классификация, свойства, методы выявления // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -2003.-№3.-С. 109-113.

2. Варфоломеев С.Д. Биосенсоры // Соросовский образовательный журнал. -1997. -№ 1.-С. 45-49.

3. ГОСТ 10444.11-89. Продукты пищевые. Методы определения молочнокислых микроорганизмов. Введ. 01.01.91. — М.: Госстандарт России: Изд-во стандартов, 2004. - 15 с.

4. ГОСТ 10444.12-88. Продукты пищевые. Метод определения дрожжей и плесневых грибов. Введ. 01.01.90. - М.: Госстандарт России: Изд-во стандартов, 2001. - 8 с.

5. ГОСТ 23042-86. Мясо и мясные продукты. Методы определения жира. -Введ. 01.01.88. — М.: Госстандарт России: Изд-во стандартов, 2003. 5 с.

6. ГОСТ 8558.1-78. Продукты мясные. Методы определения нитрита. — Введ. 01.01.80. М.: Госстандарт России: Изд-во стандартов, 2003. - 11 с.

7. ГОСТ 9957-73. Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины и говядины. Метод определения хлористого натрия. Введ. 01.07.74. - М.: Госстандарт России: Изд-во стандартов, 2001. - 4 с.

8. ГОСТ 9958-81. Изделия колбасные и продукты из мяса. Методы бактериологического анализа. — Введ. 01.01.83. М.: Госстандарт России: Изд-во стандартов, 2003. — 14 с.

9. ГОСТ 9959-91. Продукты мясные. Общие условия проведения органолептической оценки. Введ. 01.01.93. - М.: Госстандарт России: Изд-во стандартов, 2003. - 9 с.

10. ГОСТ Р 51479-99. Мясо и мясные продукты. Метод определения массовой доли влаги. Введ. 01.01.01. — М.: Госстандарт России: Изд-во стандартов, 2006. - 7 с.

11. ГОСТ Р 51487-99. Масла растительные и жиры животные. Методопределения перекисного числа. Введ. 01.01.01. - М.: Госстандарт России: Изд-во стандартов, 2008. - 8 с.

12. ГОСТ Р 50457-92. Жиры и масла животные и растительные. Определение кислотного числа и кислотности. Введ. 01.01.94. - М.: Госстандарт России: Изд-во стандартов, 2006. - 8 с.

13. ГОСТ Р 50814-95. Мясопродукты. Методы определения пенетрации конусом и игольчатым индентором. Введ. 01.08.96. - М.: Госстандарт России: Изд-во стандартов, 2003. - 8 с.

14. Егоров Н.С., Баранова И.П. Бактериоцины. Образование, свойства, применение // Антибиотики и химиотерапия. 1999. - № 6. - С. 33-40.

15. Журавская Н.К., Алехина JI.T., Отряшенкова JI.M. Исследование и контроль качества мяса и мясопродуктов. М.: Агропромиздат, 1985. - 296 с.

16. Коган М.Б., Пожариская JI.C., Рындина В.П., Фрейдлин Е.М. Физико-химический и бактериологический контроль в мясной промышленности. М.: Пищевая промышленность, 1971. -462 с.

17. Котельникова Е.А., Гельфанд М.С. Выработка бактериоцинов грамположительными бактериями и механизм транскрипционной регуляции // Генетика. 2002. - том 38. - № 6 - С. 758-772.

18. Кузьмина Н.А. Основы Биотехнологии Электронный ресурс. Режим доступа: hltp://\\n\>\v. biofechnolog. ru/aboutbook. htm

19. Лысак В.В., Желдакова Р.А. Микробиология: методические рекомендации к лабораторным занятиям и контроль самостоятельной работы студентов // Мн.: БГУ, 2002.- 100 с.

20. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.-479 с.

21. Просвечивающая электронная микроскопия Электронный ресурс. —

22. Режим доступа: http://tem.genebee.msu.ги/equipment, htm

23. Санитарно-эпидемиологическая оценка обоснования сроков годности и условий хранения пищевых продуктов. МУК 4.2.1847-04. М.: Минздрав России, 2004. - 32 с.

24. Синицын А.П., Райнина Е.И., Лозинский В.И., Спасов С.Д. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. М.: МГУ, 1994. - 288 с.

25. Axelsson L., Hoick A., Birekland S.-E., Aukrust Т., H. Bloom H. Cloning and nucleotide sequence of a gene from Lactobacillus sake LB 706 necessary for sakacin A production and immunity // Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V. 59. - 28682875.

26. Bennik M.H.J., Smid E.J., Gorris L.G.M. Vegetable associated Pediococcus parvulus produces pediocin PA-1 // Appl. Environ. Microbiol. 1997. — V. 63. — № 5.-P. 2074-2076.

27. Bhunia A., Johnson M.C., Ray B. Direct detection of an antimicrobial peptide of Pediococcus acidilactici in SDS-PAGE // J. Ind. Microbiol. 1987. - V. 2. - № 5. -P. 319-322.

28. Biswas S.R., Ray P., Johnson M.C., Ray B. Influence of growth conditions on the production of a bacteriocin, pediocin AcH, by Pediococcus acidilactici H // Appl Environ Microbiol.- 1991.-V. 57. -№ 4. P. 1265-1267.

29. Bukhtiyarova M., Yang R., Ray B. Analysis of the pediocin PA-l/AcH gene cluster from plasmid pSMB74 and its expression in a pediocin-negative Pediococcusacidilactici strain // Appl. Environ. Microbiol. 1994. - V. 60, 3405-3408.

30. Chikindas M.L., Venema K., Ledeboer A.M. Venema G., Kok J. Expression of lactococcin A and pediocin PA-1 in heterologous hosts // Lett. Appl. Microbiol. -1995.-V. 21. № 3. - P. 183-189.

31. Cleveland J., Montville T.J., Nes I.F., Chikindas M.L. Bacteriocins: safe, natural antimicrobials for food preservation // Inter J of Food Microbiol. 2001. - № 7. - P. 1-20.

32. Cutter C.N., Siragusa G.R. Reduction of Brochothrix thermosphacta on beef surfaces following immobilization of nisin in calcium alginate gels // Lett Appl Microbiol. 1996. -V. 23. - № 1. - P. 9-12.

33. Daeschel M.A., Klaenhammer T.R Association of a 13.6-megadalton plasmid in Pediococcus pentosaceus with bacteriocin activity // Appl Environ Microbiol. 1985. V. 50.-№6. -P. 1538-1541.

34. De Vuyst L., Leroy F. Bacteriocins from lactic acid bacteria: production, purification, and food applications // J Mol Microbiol Biotechnol. 2007. - V. 13. -№4.-P. 194-199.

35. Degnan A.J., Buyong N., Luchansky J.B. Antilisterial activity of pediocin AcH in model food systems in the presence of an emulsifier or encapsulated within liposomes // Int J Food Microbiol. 1993. - V. 18. - № 2. - P. 127-138.

36. Ding W.K., Shah N.P. Acid, bile, and heat tolerance of free and microencapsulated probiotic bacteria // J Food Sci. 2007 - V. 72. - № 9. - P. M446-M450.

37. Doleyres Y., Lacroix C. Cell immobilization for the dairy industry // Crit Rev Biotechnol. 1994. -V. 14. -№ 2. - P. 109-134.

38. Drider D., Fimland G., Hechard Y., McMullen L.M., Prevost H. The Continuing Story of Class Ha Bacteriocins // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2006.- V. 70. - № 2.1. P. 564-582.

39. Ennahar S., Aoude-Werner D., Sorokine O., van Dorsselear A., Bringel F., Hubert J.C., Hasselmann C. Production of pediocin AcH by Lactobacillus plantarum WHE92 isolated from cheese I I Appl. Environ. Microbiol. 1996. - V. 62. - P. 4381-4387.

40. Ennahar S., Sashihara Т., Sonomoto K., Ishizaki A. Class Ha bacteriocins: biosynthesis, structure and activity // FEMS Microbiol. Rev. 2000. - V. 24. P. 85106.

41. Erkkila S., Bioprotective and probiotic meat starter cultures for the fermentation of dry sausages, Academic dissertation, Helsinki. 2001. - 64 p.

42. Gillor O., Nigro L.M., Riley M.A. Genetically engineered bacteriocins and their potential as the next generation of antimicrobials // Curr. Pharm. Des. 2005. - V.l 1. -№8.-P. 1067-1075.

43. Foegeding P.M., Thomas A.B., Pilkington D.H., Klaenhammer T.R. Enhanced control of Listeria monocytogenes by in situ-produced Pediocin during dry fermented sausage production // Appl Environ Microbiol. 1992. - V. 58. - № 3. - P. 884-890.

44. Galvez A., Abriouel H., Lopez R.L., Omar N.B. Bacteriocin-based strategies for food biopreservation // Int J Food Microbiol. 2007. - V. 120. - № (1-2). - P. 5170.

45. Garneau S., Martin N.I., Vederas J.C. Two-peptide bacteriocins produced by lactic acid bacteria // Biochim. 2002. - V.84. - P. 577-592.

46. Giraffa G., Gatti M., Beltzame A. Antimicrobial activity of lactic acid bacteriaisolated from fermented meat products // Ann. Microbiol. Enzimol. 1994. - V. 44. -№ l.-P. 29-34.

47. Gonzalez C., Kunka B.S. Plasmid associated bacteriocin production and sucrose fermentation in Pediococcus acidilactici II Appl. Environ. Microbiol. 1987. — V.53.-P. 2534-2538.

48. Grahami D.C., McKay L.L. Plasmid DNA in strains of Pediococcus cerevisiae and Pediococcus pentosaceus II Appl. Environ. Microbiol. 1985. - V. 50. — № 2. — P. 532-534.

49. Hammes W.P. Bacterial starter cultures in food production // Food Biotechnol-1990-V. 4.-P. 383-397.

50. Hammami R., Zouhir A., Hamida J., Fliss I. BACTIBASE: a new web-accessible database for bacteriocin characterization // Microbiol Mol Biol Rev. -2006. V. 70. - № 2. - P. 564-582.

51. Hansen J.N., Chung Y.J., Liu W., Steen M.T. Biosynthesis and mechanism of action of nisin and subtilin. In G. Jung and H.-G. Sahl (ed.), Nisin and novel 1 antibiotics. Escom. Publishers, Leiden, The Netherlands. 1991. - P. 287-302.

52. Hoick A., Axelsson L., Huhne K., Krockel L. Purification and cloning of sakacin 674, a bacteriocin from Lactobacillus sake Lb6741IFEMS Microbiol. Lett. 1994. -V. 115.-P. 143-150.

53. Holo H., Nissen O., Ness I.F. Lactococcin A, a new bacteriocin from Lactococcus lactis subsp. cremoris: isolation, and characterization of the protein and its gene // J. Bacteriol. 1991. - V. 173. - P. 3879-3887.

54. Holzapfel W. H., Franz С. M. A. P., Ludwig W., Back W., Dicks L. M. T. The Genera Pediococcus and Tetragenococcus. Procaryotes. — 2006. V. 4. - P. 229266.

55. Hoover D.G., Walsh P.M., Kolaetis K.M., Daly M.M. A bacteriocin producedby Pediococcus species associated with a 5.5 MDa plasmid // J. Food Prot. 1988. -V. 51.-P. 29-31.

56. Huang J., Lacroix C., Daba H., Simard R.E. Pediocin 5 production and plasmid stability during continuous free and immobilized cell cultures of Pediococcus acidilactici UL5 // J Appl Bacteriol. 1996. - V. 80. - № 6. - P. - 635-644.

57. Hugas M., Garriga M., Pascual M., Aymerich M.T., Monfort J. M. Enhancement of sakacin К activity against Listeria monocytogenes in fermented sausages with pepper or manganese as ingredients // Food Microbiol. 2002. - V. 19. - P. 519-528.

58. Ivanova E., Chipeva V., Ivanova I., Dousset X. and Poncelet D. Encapsulation of lactic acid bacteria in calcium alginate beads for bacteriocin production // J Cult Collect. 2000-2002. - V. 3. - P. 53-58.

59. Jack W.R., Tagg J.R., Ray B. Bacteriocins of Grampositive bacteria // Microbiol. Rev. 1995. - V. 59. - P. 171-200.

60. Jack R.W., Bierbaum G., Salh H-G. Lantibiotics and related peptides. Pringer-Verlag. NewYork, 1997. 224 pp.

61. Klaenhammer T.R. Genetics of bacteriocins producer by lactic acid bacteria // FEMS Microbiol. Rev. 1993. - V. 12. - P. 39-85.

62. Leroy F., Verluyten J., De Vuyst L. Functional meat starter cultures for improved sausage fermentation // Int. J. Food Microbiol. — 2006. — V. 106. — № 3. — P. 270-85. Rev.

63. Luchansky J.B., Glass K.A., Harsono K.D., Degnan A.J., Faith N.G., Cauvin В.,

64. Baccus-Taylor G., Arihara K., Bater В., Maurer A.J., Cassens R.G. Genomic analysis of Pediococcus starter cultures used to control Listeria monocytogenes in Turkey summer sausage // Appl Environ Microbiol. 1992. - V. 58. - № 9. - P. 3053-3059.

65. McLoughlin A.J., Champagne C.P. Immobilized cells in meat fermentation // CritRev Biotechnol. 1994. -V. 14. -№ 2. - P. 179-192.

66. Motlagh A.M., Bukhtiyarova M., Ray B. Complete nucleotide sequence of pSMB74, a plasmid encoding the production of pediocin PA-l/AcH in Pediococcus acidilactici //Lett. Appl. Microbiol. 1994. - 18. - P. 305-312.

67. Millette M., Dupont C., Shareck F., Ruiz M.T., Archambault D., Lacroix M. Purification and identification of the pediocin produced by Pediococcus acidilactici MM33, a new human intestinal strain // J Appl Microbiol. 2008. - V. 104- № 1. -P.269-275.

68. Miller K.W., Ray P., Steinmetz Т., Hanekamp Т., Ray B. Gene organization and sequences of pediocin AcH/PA-1 production operons in Pediococcus and Lactobacillus plasmids // Lett Appl Microbiol. 2005. - V. 40. - № 1. - P. 56-62.

69. Muriana P., Klaenhammer T.R. Cloning, phenotypic expression, and DNA sequence of the gene for the lactocin F, an antimicrobial peptide produced by Lactobacillus sp. //J. Bacteriol. 1991. -V. 173. - P. 1779-1788.

70. Muthukumarasamy P., Holley R.A. Microbiological and sensory quality of dry fermented sausages containing alginate-microencapsulated Lactobacillus reuteri II Int

71. J Food Microbiol. 2006. V. 111. - P. 164-169.

72. Nes I.F., Bao Diep D., HaE Varstein L.S., Brurberg M.B., Eijsink V., Holo H. Biosynthesis of bacteriocins of lactic acid bacteria // Antonie van Leeuwenhoek. -1996.-V. 70.-P. 113-128.

73. Nettles C.G., Barefoot S.F. Biochemical and genetic characteristics of bacteriocins of food-associated lactic acid bacteria // J. Food Prot. — 1993. 56. - P. 338-356.

74. Nielsen J.W., Dickson J.S., Crouse J.D. Use of a bacteriocin produced by Pediococcus acidilactici to inhibit Listeria monocytogenes associated with fresh meat // Appl Environ Microbiol. 1990. - V. 56. - № 7. - P. 2142-2145.

75. Nissen-Meyer J., Havarstein L.S., Holo H., Sletten K., Nes I.F. Association of the lactococcin A immunity factor with the cell membrane: purification and characterization of the immunity factor // J. Gen. Microbiol. 1993. -V. 139. - P. 1503-1509.

76. Osmanagaoglu O., Beyatli Y., Gunduz U. Cloning and expression of a plasmid-linked pediocin determinant trait of Pediococcus acidilactici F // J Basic Microbiol. -2000. V. 40. - № 1. - P. 41-49.

77. Osmanagaoglu O., Beyatli Y., Gunduz Т., Sacilik S.C. Analysis of the genetic determinant for production of the pediocin P of Pediococcus pentosaceus Pep 1 // J Basic Microbiol. . 2000. - V. 40. - № 4. - P. 233-241.

78. Ray S.K., Johnson M.C. Ray B. Bacteriocin plasmids of Pediococcus acidilactici И J. Ind. Microbiol. 1989. - V. 4. - P. 163-171.

79. Ray S.K., Kim W.-J., Johnson M.C., Ray B. Conjugal transfer of a plasmid encoding bacteriocin production and immunity in Pediococcus acidilactici H // J. Appl. Bacteriol. 1989. - V. 66. - P. 393-399.

80. Rodriguezf M., Cintas L.M., Casaus P., Martinez M.I., Suarez A., Hernandez P.E. Detection of pediocin PA-1-producing pediococci by rapid molecular biology techniques //Food Microbiol. 1997. -V. 14.-№4.-P. 363-371.

81. Tsen J.H., Huang H.Y., Lin Y.P., King V.A. Freezing resistance improvement of Lactobacillus reuteri by using cell immobilization // J Microbiol Methods. 2007. -V. 70. - № 3 - P. 561-564.

82. Savadogo A., Ouattara C.A.T., Bassole I.H.N., Traore S.A. Bacteriocins and lactic acid bacteria a minireview // African J Biotechnol. - 2006. — V. 5. - № 9. - P. 678-683.

83. Scannell A.G., Schwarz G., Hill C, Ross R.P., Arendt E.K. Pre-inoculation enrichment procedure enhances the performance of bacteriocinogenic Lactococcus lactis meat starter culture // Int J Food Microbiol. 2001. - V. 64. - № (1-2). - P. 151-159.

84. Schved F, Lalazar A, Henis Y, Juven BJ. Purification, partial characterization and plasmid-linkage of pediocin SJ-1, a bacteriocin produced by Pediococcus acidilactici IIJ Appl Bacteriol. 1993. - V. 74. - № 1. - P. 67-77.

85. Souza E.L., Silva C.A., Sousa C.P. Bacteriocins: molecules of fundamental impact on the microbial ecology and potential food biopreservatives // Braz. arch, biol. technol. 2005. - V. 48. - № 4. - P. 559-566.

86. Steen M.T., Chung Y.J., Hansen J.N. Characterization of the nisin gene as part of a polycistronic operon in the chromosome of Lactococcus lactis ATCC 11454 I I Appl. Environ. Microbiol. 1991.-V. 57.-P. 1181-1188.

87. Van Reenen C.A., Dicks L.M.T., Chikindas M.L. Isolation, purification and characterization of plantaricin 423, a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum // J Appl Microbiol. 1998. - V. 84. - P. 1131-1137.

88. Vermeiren L., Devlieghere F., Debevere J. Evaluation of meat born lactic acid bacteria as protective cultures for the biopreservation of cooked meat products // Int. J. Food. Microbiol. 2004. - V. 96. - № 2. - P. 149-164.

89. Yin L.J., Wu C.W., Jiang S.T. Bacteriocins from Pediococcus pentosaceus L and S from pork meat //J Agric Food Chem. 2003. - V. 51. - № 4. - P. 10711076.

90. Zendo Т., Nakayama J., Fujita K., Sonomoto K. Bacteriocin detection by liquid chromatography/mass spectrometry for rapid identification // J Appl Microbiol. -2007. V. 104. - № 2. - P. 499-507.