автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.04, диссертация на тему:Научные и практические основы получения из молочного сырья биологически активного вещества ангиогенина

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РФ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ПРИКЛАДНОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ

На правах рукописи

ТИХОМИРОВА НАТАЛЬЯ АЛЕКСАНДРОВНА

& ОЛ

-1

НАУЧНЫЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗ МОЛОЧНОГО СЫРЬЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА АНГИОГЕНИНА

Специальность 05.18.04 - технология мясных, молочных и рыбных

продуктов

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук

Москва 2000

Работа выполнена на кафедре «Технология молока и молочных продуктов» Московского государственного университета прикладной биотехнологии

(МГУПБ)

Научные консультанты:

доктор технических наук,

профессор А.М. ШАЛЫГИНА

доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Г.С. КОМОЛОВА

Официальные оппоненты:

член-корресподент РАСХН, доктор технических наук, профессор

доктор технических наук, профессор,

доктор медицинских наук, профессор

Ведущая организация:

Государственное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности

О.В. Большаков Н.П. Захарова В.Я. Шульга

Защита состоится « 3 » Ш^УиЛ 2000г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 063.46.01 в Московском государственном университете прикладной биотехнологии по адресу: 109316, Москва, ул. Талалихина, д.ЗЗ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного университета прикладной биотехнологии по адресу: 109316, Москва, ул. Талалихина, д.ЗЗ.

Автореферат разослан « иЛ£>ИЛ 2000г,

Ученый секретарь диссертационного совета Л^у

доктор технических наук, профессор ^ Прптпппппп

А %0-ъ#90

А г* сггх ^ л

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Одним из приоритетных направлений развития отечественной отраслевой науки является разработка на базе современных достижений науки и техники принципиально новых, оригинальных процессов и технологий рациональной переработки молочного сырья, среди которых важное место занимает разработка теоретических и практических основ глубокого фракционирования компонентов молока. Актуальность проблемы фракционирования на основе последний достижений научно-технического прогресса состоит в том, что позволяет получать принципиально новые продукты различного функционального назначения, в том числе продукты, обладающие направленным действием.

В связи с этим представляет научный и практический интерес разработка научных и практических основ получения из молочного сырья биологически активного вещества ангиогенина, обладающего полифункциональными свойствами. . .

Данная научная проблема отвечает требованиям современной науки о молоке и молочных продуктах в фундаментальном и прикладном значении и имеет непосредственную связь с проблемами, сформулированными в «Концепции государственной политики в области здорового питания населения Российской Федерации до 2005 года», одобренной постановлением Правительства РФ № 917 от 10 августа 1998г.

Исследования, представленные в диссертационной работе, выполнены в рамках Федеральной программы Миннауки РФ, Межотраслевой и Межвузовской Научно-технических программ Минобразования РФ, представляющих приоритетные направления развития науки и техники гражданского назначения в РФ, а также проекта Российского фонда фундаментальных исследований и базируются на достижениях отечественных школ прикладной биотехнологии, биохимии и

нутрициологии, представленных учеными: A.M. Бражниковым, О.В. Большаковым, К.К. Горбатовой, Г.Н. Крусь, H.H. Липатовым (ст.), H.H. Липатовым (мл.), И.А. Радаевой, И. А. Роговым, Э.С. Токаевым, В.Д. Харитоновым, A.M. Шалыгиной, В.П. Шидловской; Г.С. Комоло'вбй, H it. Мертвецовым; М.Н, Волгаревым, В.И. Покровским, В.А. Тутельяном и др., а также зарубежными: D. Dupont, С. Grosclaude, F. Kosikowski, F. Glover, M.D. Bond, F.S. Lee, H.Maes, J.F. Riordan D.J. Strydom, В L. Vallee, et!'al.

В диссертации представлены результаты собственных исследований, проанализированные и обобщенные данные, получе'нНй'е под руководством и личном участии автора.

Цель и задачи исследований.

Целью диссертационной работы является разработка теоретических и практических основ получения из молочного сырья биологически активного вещества ангиогенина и создание на его основе БАД к пище парафармацевтического действия.

Для достижения поставленной цели были сформулированы и последовательно реализованы следующие задачи:

• Формирование информационного файла и разработка научной концепции;

• Разработка математического аппарата для реализации научной концепции;

• Разработка эффективного способа определения ангиогенина в молоке и молочном сырье;

• Исследование зависимости содержания ангиогенина в молоке и молочном сырье от зоотехнических, биотехнологических факторов и оценка сырьевых ресурсов ангиогенина;

• Разработка научных основ выделения ангиогенина из молочного сырья;

• Разработка научных основ получения БАД парафармацевтического действия на основе ангиогенина молока;

• Разработка технологии БАД «МИЛКАНГ»;

• Исследование свойств БАД «МИЛКАНГ».

Научная концепция.

Анализ теоретических и экспериментальных исследований позволил определить новое научное направление в технологии молока и молочных продуктов ■ Разработка теоретических и прикладных основ производства биологически активных веществ для создания биопрепаратов и парафармацевтической продукции.

Актуальной научной концепцией данного направления является разработка фундаментальных научных и прикладных основ получения из молочного сырья биологически активного вещества - ангиогенина.

Научные положения.

На защиту выносятся следующие научные положения:

• Научная концепция получения природного ангиогенина;

• Эмпирические и аналитические методы определения ангиогенина в молоке и вторичном молочном сырье;

• Аналитическое обобщение зависимости содержания ангиогенина в молоке от зоотехнических и биотехнологических факторов;

• Статистический анализ количественной оценки ангиогенина в молочном сырье, содержание ангиогенина в различных видах молочного сырья и оценка ресурсов молочного сырья;

• Метод формирующих фильтров для прогнозной оценки ангиогенина в молоке;

• Механизмы и закономерности выделения ангйогенина из молочного сырья;

• Научное обоснование способов выделения биологически активного ангиогенина методом глубокого фракционирования на основе ионообменной и гидрофобной хроматографии;

• Научное обоснование технологических операций получения природного ангиогенина; ' !

• Технология Б АД «МИЛКАНГ»;

• Физико-химический и биотехнологический скрининг БАД «МИЛКАНГ». Научная новизна.

Научная новизна работы состоит в том, что впервые;

• разработаны теоретические и прикладные основы получения из молочного сырья биологически активных препаратов и парафармацевтической продукции;

• теоретически обосновано и экспериментально подтверждено научное направление получения природного ангиогенина из молочного сырья; разработаны эмпирические и аналитические методы определения ангиогенина в молочном сырье;

• разработан метод формирующих фильтров для прогнозной оценки содержания ангиогенина в молоке и обосновано его применение;

• получены экспериментальные данные содержания ангиогенина в молоке коров различных пород и в различных видах молочного сырья;.

• проведено аналитическое обобщение зависимости содержания ангиогенина в молоке от зоотехнических и биотехнологических факторов;

• осуществлен статистический анализ количественной оценки ангиогенина в молоке и молочном сырье и определены его промышленные ресурсы; .

• изучен, механизм и закономерности выделения ангиогенина из молочного сырья;

• разработан эффективный способ выделения ангиогенина из молочного сырья; • -.. -

• разработана и апробирована технология БАД на основе ангиогенина молока; •"! 1

• определены физико-химические, теплофизические, реологические показатели и аминокислотный состав БАД «МИЛКАНГ»;

• предварительными клиническими исследованиями установлено участие БАД в местном иммунитете при локальном асептическом воспалении.

Практическая ценность.

Диссертационная работа выполнялась в рамках подпрограммы «Перспективные процессы в перерабатывающих отраслях АПК» ФЦНТП Миннауки РФ, МНТП ПТ «Биологическая безопасность и лечебно-профилактическое питание», Межвузовской НТП Госкомвуза РФ «Пища, экология, человек» и проекта «Биологическая функция ангиогенина молока» Российского фонда фундаментальных исследований.

На основе разработанных в диссертационной работе научных и практических основ получения из молочного сырья биологически активного вещества ангиогенина предложены способы определения ангиогенина в биологических жидкостях, в том числе в молочном сырье, составляющие предмет изобретений, защищенные патентами № 2110066 и № 2133464 Российского Агентства по патентам и товарным знакам.

Методом нелинейного регрессионного анализа и сплайн-интерполяции получены калибровочные кривые для определения массовой доли ангиогенина в молочном сырье.

Методом регрессионного и корреляционного анализа получены аналитические зависимости для определения массовой доли ангиогенина.

Разработан способ получения ангиогенина из молочного сырья, составляющий предмет изобретения и важное народно-хозяйственное значение, защищенный патентом №2109748. Российского Агентства по патентам и товарным знакам.

Созданы пилотные модули для выделения ангиогенина из молочного сырья.

Результаты исследований использованы при разработке нормативно-технической документации на биологически активную добавку ангиогенина «МИЛКАНГ» (ТУ 9229-032-02068640-99).

Полученные теоретические и экспериментальные данные используются в проведении учебного процесса по дисциплинам: «Физика и химия молока», «Научные основы производства продуктов питания», «Технология лечебно-профилактических молочных продуктов»; в курсовом и дипломном проектировании; учебно-исследовательской работе студентов; на курсах повышения квалификации преподавателей МГУПБ. Подготовлена монография: Тихомирова H.A. Природный и рекомбинантный ангиогенин. Свойства и количественный анализ. - М.: Пищевая промышленность, 1999. -137с.

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на Первой, Второй и Третьей международной научно-технической конференции «Пища. Экология. Человек.» ( Москва 1995г., Москва 1997г., Москва 1999г.), на научно-техническом семинаре «Проблемы создания экологически безопасных продуктов питания на пороге XXI века» (Москва 1998г.), на

семинаре «Интенсификация и автоматизация технологических процессов обработки пищевых продуктов» (Москва 1998г.), на Всероссийской научно-технической конференции «Прогрессивные, экологически безопасные технологии хранения и комплексной переработки сельхозпродукции для создания продуктов питания повышенной пищевой и биологической ценности» (Углич 1998г.), на Всероссийской конференции с международным участием «Про биотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека» (Москва 1999г.), Межвузовской научно-технической конференции молодых ученых «Перспективные направления научных исследований молодых ученых северо-запада России» (г. Вологда, п. Молочное, 1999г.), Научно-практической конференции с международным участием «Ферменты в пищевой промышленности» (Москва, 13-14 окт. 1999г.), на 1-м Всероссийском конгрессе с международным участием «Питание детей: XXI век» (Москва,14-17 марта 2000г.).

Публикации. По результатам исследований опубликовано 61 печатная работа, в том числе монография и 3 патента.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения,., 8 глав, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 31.7 наименований и 17 приложений. Диссертационная работа изложена на 320 страницах, включая 21 таблицу и 84 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Обоснована актуальность и дана общая характеристика проблемы, сформулирована цель и задачи, показана научная новизна, и практическая ценность диссертационной работы.

Глава 1. Анализ проблемы, постановка цели и задачи исследования

Рост численности населения, нерациональное использование природных ресурсов, увеличение загрязненности среды обитания человека, ставит в XXI веке перед человечеством глобальную проблему обеспечение населения Земли полноценными и безопасными продуктами, удовлетворяющими физиологические потребности. Если данная проблема не будет решена учеными прогнозируется физиологическая, биологическая и интеллектуальная деградация населения.

Научная проблема «Научные и практические основы получения из молочного сырья биологически активного вещества ангиогенина» представляет собой совокупность двух научных направлений: получение биологически активных веществ, в частности ангиогенина и рациональное

использование ресурсов молочного сырья. Поэтому решение данной научной проблемы представляет собой комплексную реализацию перечисленных выше научных направлений. Базируется на системном анализе, в рамках которого осуществлено построение обобщенной модели проблемы, отражающей многосторонние связи при целостном рассмотрении объектов исследования.

Для установления причинно-следственных связей по каждому направлению разработано дерево целей проблемы.

Состояние проблемы в ретроспективном периоде оценивалось на основе анализа" результатов информационного и патентного поиска, а перспективное развитие - научно-техническим прогнозированием.

Анализ результатов патентного поиска по первому и второму научному направлению представлен соответственно на рис. 1 и 2.

Интерес к биологически активным веществам обусловлен доказательством их участия в обменных процессах организма и гомеостаза в целом, а также в деятельности нервной системы.

В последнюю четверть двадцатого столетия получило развитие новое направление нутрициологии - пищевые добавки, позволяющие корректировать состав, свойства и назначение продуктов питания. Первые пищевые добавки представляли собой витаминно-минеральные комплексы, белковые, жировые гдобавки, то ' что теперь принято называть согласно действующей терминологии нугрицевтиками. Второе поколение пищевых добавок к пище характеризовалось повышенной биологической активностью. К данному поколению биологически активных добавок можно отнести группу эубиотиков и парафармацевтиков.

Относительно новым направлением в производстве пищевых добавок является разработка и производство парафармацевтиков - биологически активных добавок к пище, применяемых для профилактики, вспомогательной терапии и поддержания в физиологических границах функциональной активности органов и систем.

В развитых странах мира усилилось изучение и изыскание источников биологически активных веществ. Перспективным источником их получения является вторичное молочное сырье, в которое наряду с жирами, белками и углеводами переходят минеральные вещества, витамины, ферменты, гормоны, иммунные тела, т.е. почти все обнаруженные в настоящее время биологически активные вещества молока. Наряду с этим разработка рациональных способов переработки молочного сырья, обеспечивающих глубокую переработку составных частей молока, представляет актуальную социально-экономическую и экологическую проблему. Научная и практическая-значимость вышеперечисленных-положений подтверждается научно-технической -й патентной ситуацией в странах с развитой молочной промышленностью.' ' '■

1В59

Рис. 1. Динамика распределения патентного массива по первому научному

направлению

. Вторичное молочное сырьс; 2-Улырафильтрат; 3,- Пата; 4 -Поясырная м творожная сыворотка; 5 - Обетж'иренное молоко.

Рис.2. Динамика распределения патентного массива по второму научному

направлению " :

Определенный интерес по своим функциональным свойствам и возможности получения из молочного сырья представляет биологически активное вещество - ангиогенин. Анализ структуры относительной патентной активности по исследованию ангиогенина представлен по странам поиска (рис. 3) и по источнику получения ангиогенина (рис. 4).

Как видно из круговой диаграммы на долю США приходится максимальное число патентов, относительно высокий удельный вес занимает Япония и Канада, на долю РФ приходится 8%, Анализ структуры относительной патентной активности по виду источника ангиогенина свидетельствует о том, что в лабораторных условиях получают как рекомбинангный (41%), так и природный (59%) ангиогенин.

Перспективным направление является получение природного ангиогенина из молочного сырья. Молоко представляет сложную биологическую систему, состоящую более чем из 200 веществ и соединений, среди которых особое место занимают биологически активные вещества, а среди них - ферменты. В молоке найдены ферменты обширного класса рибонуклеаз, играющих важное значение в регуляции клеточного метаболизма. Источником рибонуклеаз в молоке могут быть молочная железа, сыворотка крови, содержащиеся в молоке клеточные элементы. У различных видов млекопитающих этот источник может отличаться. Наиболее вероятно, что источником рибонуклеазы коровьего молока является сыворотка крови, так как по всем характеристикам сывороточная и молочная РНКазы идентичны. Впервые РНКаза А-низкомолекулярный белок с молекулярной массой 13,7 кДа был выделен в 1962г. и находился под пристальным вниманием ученых. В последнее десятилетие к нему возрос интерес биохимиков, биологов и физиологов, изучающих физиологическую роль рибонуклеаз молока. Очевидно, рибонуклеазы молока играют важную роль в механизмах поддержания гомеостаза растущего организма как в нормальных физиологических условиях, так и в стрессовых ситуациях. Под влиянием РНКаз повышается, например, антибактериальная резистетнтность мышей. При этом полагают, что рибонуклеаза действует совместно с лизоцимом, который повреждает структурные элементы клеточной стенки патогенных микробов, а РНКаза далее разрушает клеточные РНК. Известно, что эндогенные рибонуклеазы участвуют в противовирусной защите организма, а также способствуют разрушению опухолевых клеток. Кроме того, имеются данные о том, что экзогенные РНКазы вызывают в организме синтез эндогенных рибонуклеаз, участвующих в формировании иммунитета. Панкреатическая РНКаза является не только стимулятором , гуморального и некоторых форм клеточного иммунитета, но также и неспецифических факторов защиты организма. Введенные крысам путем инъекций рибонуклеазы увеличивают в

, 3. Анализ структуры относительной патентной активности по исследованию свойств и способов получения ангиогенина

1лазма и сыворотка крови животных и человека

Рекомбинантные источники

41%

Молоко и молочное сырье

Прочие источники

тс. 4. Анализ структуры относительной патентно^ активности по источникам

получения ангиогенина

сыворотке крови содержание лизоцима, активируют систему комплемента, повышают способность к фагоцитозу нейтрофилов способствуют метаболической активации. Рибонуклеазы обусловливают неспецифическую активность молозива в повышении естественной резистивности телят и ягнят. Важно отметить, что рибонуклеаза, попадающая в организм с молоком, как белок с низкой молекулярной массой, хорошо проникает и задерживается. Этот фермент молока следует рассматривать как один из факторов, участвующих в иммунитете организма в постнатальный период. В условиях не сформировавшихся защитных механизмов новорожденного организма, роль поступающих с материнским молоком регуляторов иммунитета играет значимую роль.

Среди известных рябонуклеаз молока по своей биологической функции выделяется специфическая рибонуклеаза - ангиогенин. Впервые белок ангиогенин был выделен в 1985г. из культуральной среды клеток человека Б. Веяли в Гарвардском университете (США). Выделение было осуществлено из аденокарциномы толстой кишки человека. В 1987г.

Р. Шапиро выделил ангиогенин из плазмы крови человека, а в 1988г. Бонд и Велли выделили ангиогенин из сыворотки крови быка. Позже он был обнаружен в коровьем молоке. Выделенный белок получил название ангиогенин от греческого слова апдюп - сосуд, т.к. обладал способностью активно индуцировать ангиогенез - рост кровеносных сосудов. В соответствии с современными представлениями ангиогенин - биологически активное вещество, обладающее полифункцнанапьныии свойствами.

Известные источники ангиогенина разделены на природные и рекомбинатные. К числу первых относится культуральная среда клеток карциномы человека Нт-29, плазма и сыворотка крови, а также коровье молоко. Рекомбинантные источники сконструированы при использовании генно-инженерной техники на основе естественного или синтезированного гена ангиогенина человека.

На современном, этапе относительно изученным является рекомбинантный ангиогенин. За рубежом и в России разработаны продуценты ангиогенина на основе микробных и животных клеток путем клонирования гена, кодирующего синтез ангиогенина, проведены исследования по изучению свойств рекомбинантного ангиогенина.

Выход ангиогенина и его характеристика в зависимости от источников получения представлены в табл. 1. Анализ данных, приведенных в табл. 1 свидетельствует о том, что наибольший выход ангиогенина достигается из природных источников, при этом наиболее богатым является молочное сырье. Рекомбинантный ангиогенин в отличии от природного изолируется в меньших количествах, а также незначительно отличается по молекулярному весу и аминокислотному составу. При производстве рекомбинантного

ангиогенина требуются дополнительные затраты на культивирование биомассы и выделение ангиогенина из клеточных структур.

Таблица 1

Источник ангиогенина Выход ангиогенина, Молекулярная Аминокислот-

мкг/л масса, кДа ный состав

Природный

Культуральная среда

клеток Нт-2 9 0,5 14,0 124

Плазма крови быка 30-80 14,0 124

Плазма крови человека 60-150 14,0 124

Коровье молоко 1000-8000 14,577-14,599 125

Рекомбинантный

Культуральная среда

Культуры клеток дете-

нышей хомячка 400 14,0 123' ■ '

Культуры Е.СоН, %

общего бактериального 1,5-3,0 14,0 123'

белка

Ангиогенин играет важную роль в поддержании гомеостаза организма в норме и патологии. Введенный в ткань с недостаточным кровоснабжением ангиогенин вызывает ускорение роста кровеносных сосудов вплоть до возвращения ткани к нормальному состоянию. Современными исследователями на основании установленных биохимических свойств ангиогенина прогнозируется определяющая роль этого белка в механизме сосудообразования при эмбриогенезе, биологических циклах1 у млекопитающих и других жизненно важных процессах. 1 -' -

Имеются данные об изменении уровня ангиогенина в крови й околоплодной жидкости человека при патологии, что указывает на возможность использования этого показателя в диагностике. И хотя сделаны только первые шаги, несомненна перспектива использования ангиогенина в медицинской практике.

Таким образом, анализ немногочисленных литературных источников, а также результаты исследований нашего • •: .научного коллектива свидетельствуют о полифункциональных свойствах ангиогенина. : ■

В первую очередь, ангиогенин - активный фактор роста кровеносных сосудов и препарат ангиогенина может быть использован для создания новых лекарственных препаратов широкого спектра действия для лечения ран различного генезиса: инфаркт миокарда, глаукома, диабетическая ретинопатия, артриты, хронические воспаления, переломы, ожоги и др.

Другая очень перспективная функция ангиогенина - иммуномодуляция. Результаты исследований зарубежных и отечественных исследователей свидетельствуют о возможном участии ангиогенина в механизмах неспецифического иммунитета организма.

Очевидно, в результате дальнейших исследований ангиогенина будут открыты новые свойства этого белка, а в настоящее время на основе уже достигнутых знаний возможно следующее направление практического использования природного ангиогенина - получение биологически активных добавок к пище парафармацевтического действия, которые могут использоваться при производстве молочных продуктов направленного действия, в частности: для лиц страдающих заболеваниями, связанными с патологическим ангиогенезом; для больных с травмами; для ожоговых больных; для людей, страдающих нарушениями иммунной системы; для детей различных возрастных групп.

Другим перспективным направлением практического использования ангиогенина молока может стать направление по обогащению традиционных молочных продуктов, частично утративших свою биологическую ценность в процессе технологической обработки, ангиогенином, приближая его содержание к парному молоку.

Глава 2. Методология и организация исследований.

В диссертационной работе исследования проводились аналитическим и экспериментальным методами. Структура исследований состояла из аналитического и экспериментального этапа и включала пять основных блоков:

• Разработка количественного метода определения ангиогенина в биологических жидкостях;

• Исследование и аначиз различных видов молочного сырья на содержание ангиогенина;

• Разработка научных основ выделения ангиогенина из молочного сырья;

• Разработка технологии получения БАД ангиогенина из молочного сырья:

• Определение свойств БАД «Милканг».

В основе аналитического этапа исследований заложены: ретроспективный поиск и анализ научно-технической и патентной литературы с использованием ресурсов Интернет;

синтез научной гипотезы и разработка алгоритма исследований; проведение исследований и их оптимизация;

разработка методов математического анализа и статистической обработки экспериментальных данных.

Экспериментальный этап работы включал применение стандартных, общепринятых методов, а также оригинальных, специально разработанных методов и методик исследования.

Экспериментально-исследовательская часть работы проводилась в Московском государственном университете прикладной биотехнологии (МГУПБ), Институте биохимии им А.Н. Баха РАН, Учебном хозяйстве Коломенского аграрного колледжа, АПК «Назарьево» Одинцовского района, Агрофирме «Нива» Люберецкого района, ОАО Завод детских молочных продуктов (г.Москва), ОАО Люберецкий молочный завод, ОАО Коломнамолпром.

Схема проведения исследований представлена на рис.5.

Рис. 5. Схема проведения исследований

Глава 3. Научная концепция получения природного ангиогенина

Современный уровень развития молочной промышленности, научно-технический потенциал свидетельствуют о том, что технология и техника переработки молока достигли высокого совершенства. В свете этого важнейшей проблемой, находящаяся в центре внимания специалистов молочной промышленности, является разработка теоретических и практических основ глубокого фракционирования компонентов молока. Анализ вышеизложенного позволяет сформулировать новое научное направление - создание парафармацевтической продукции и биопрепаратов на основе глубокого фракционирования компонентов молока.

Решение проблем, определяющих сформулированное направление, включает в себя комплекс биохимических, медицинских и биотехнологических задач.

В части получения и использования ангиогенина можно сформулировать две самостоятельных научных и прикладных проблемы.

Первая проблема - разработка БАД на основе ангиогенина как для самостоятельного применения, так и для создания нового поколения пищевых продуктов, в том числе молочных.

Вторая проблема - получение лекарственных препаратов.

В настоящей работе рассматриваются вопросы, направленные на решение проблемы получения БАД на основе молочного ангиогенина.

Глава 4. Разработка метода количественного определения ангиогенина 4.1. Эмпирические методы определения

Метод конкурентного взаимодействия РНКазы и ангиогенина за плацентарный ингибитор РНКазин. Разработанные способы количественного определения ангиогенина базируются на свойстве ангиогенина связываться с плацентарным ингибитором рибонуклеазы. Плацентарный ингибитор РНКазы угнетает РНКазную активность ангиогенина, формируя относительно прочный комплекс ангиогенин -ингибитор. В ходе количественного анализа проводится конкурентная реакция с образованием комплекса плацентарный ингибитор РНКазы -панкреатическая рибонуклеаза - ангиогенин. В качестве плацентарного ингибитора РНКазы использовали сухой коммерческий препарат фирмы Sigma (Германия) или свеже очищенный препарат из плаценты человека. Изоляцию ингибитора из плаценты человека проводили согласно модифицированной методике Института генетики РАН.

Для использования конкурентного способа в коровьем молоке, в котором содержание панкреатической РНКазы колеблется от 11 до 32

мг/л, необходимо проводить очистку от эндогенной рибонуклеазы. Для эффективного снижения массовой доли РНКазы А целесообразно использовать жидкостную сорбционную хроматографию с голубой агарозой, так как «сшитые» с агарозой триазиновые красители являются лигандами, обладающими высоким сродством с ферментами обмена нуклеиновых кислот. Концентрация РНКазы А после хроматографической очистки не должна превышать 0,4 мг/л.

Метод иммуноферментного анализа (ИФА). Разработан количественный метод определения бычьего ангиогенина в чистых растворах на основе ИФА и адаптирован для определения ангиогенина в коровьем молоке. Метод заключается в проведении конкурентного ИФА при использовании поликлональных АТ, коньюгированных с пероксидазой хрена. При разработке данного количественного метода были проведены исследования включающие следующие основные этапы: отбор лабораторных животных по иммуногенности для получения антител к ангиогенину и их иммунизация ангиогенином; выделение поликлональных антител из крови животных, в пик иммунного ответа; синтез коньюгатов полученных антител к ангиогенину с пероксидазой хрена; подбор оптимальных концентраций коньюгата для ИФА; ИФА коньюгатов.

4.2. Аналитические методы определения ангиогенина.

Реализация научной и практической задачи получения ангиогенина из молочного сырья связана с разработкой статистически достоверного количественного анализа ангиогенина.

С целью получения объективной оценки количества ангиогенина в молоке и молочном сырье, которые представляют собой многофакторную биологическую систему, были построены специальные калибровочные кривые. Так, для определения количества ангиогенина в коровьем молоке конкурентным методом используется калибровочная кривая РНКАзной активности (у) от концентрации ангиогенина (х) в пробе.. Данная зависимость Xх) задана п параметрами значений у, и г,, полученными. с определенной (достаточно малой) погрешностью. Такая парная связь может быть близкой к линейной или заведомо нелинейной. В случае линейных зависимостей >>,(*,.) регрессионный анализ сводится к нахождению

параметров а и Ь линейной зависимости:

у(х) = ах + Ь, (1)

при которых достигается минимальное среднеквадратичное отклонение у(х) отточек у>(*,):

Это достигается, если

дЬ

(3)

/=1

Из этих условий получаем систему линейных уравнений для определения а и Ь:

п п

¡«1 (=1 1*1 Решение этой системы имеет вид:

- (5)

-пЛх'

В результате регрессионного анализа нелинейные зависимости с двумя параметрами а и Ь можно свести к линейному вида >■(*) = ах + Ъ. Нередко нелинейная зависимость может приближаться несколькими эмпирическими формулами. Для установления вида нелинейной функции был проведен регрессионный анализ всех соответствующих нелинейных зависимостей, В результате проведенных выкладок была выбрана логарифмическая функция вида у ~ Ъ + а 1п х, как более близкая к заданной последовательности.

Численные значения коэффициентов уравнения, вычисленные по (5) и (б), соответственно будут равны: а= 15.771 и Ь--224.548, а уравнение регрессии примет вид:

у=224.548+15.771 1пх (7)

Графическое изображение логарифмической регрессии, представляющее собой калибровочную кривую приведено на рис 6.

Простейшей много интервальной интерполяцией (сплайн-интерполяцией) является кусочно-линейная аппроксимация. Функциональная зависимость

чО

о4 65.33"

— 60.67

ев

ЬЙ 56

X

ей 51.33"

«

я 46.67-

ж

И 42

ч

се

Г) 37.33

X 1 II 1

С 32.67

р 1 ■

о о аз л К

и е

1 \ ! ! ! ---

1 1 1 '—■ 1 - л

П ---

1 |

1 1

1

2 (

1

1 1

| ! 1

! / 1 ! ! { !

1 ! 1 ; ; ; 1

^ \ 1 1 \ 1

о о.* 0.8 1.2 1.6 2 2.4 2.8 3.2 3-6 4

Я ,л

количество ангиогенина, мг/л

Рис. 6 Калибровочная кривая для определения ангиогенина в молоке, полученная нелинейным регрессионным анализом

-о

о4

л 63 -

.

56-

(X 49 '

<я 0- ,

8 47.

1) е;

а Л (I 1 >• 35

— ■■!

Р ГЗД „

о

о

в 21

•а

0) и

с

У

О 7

1 1 1 1 I

1 ! 1 !__ — ( 1

! (............. ■ 1 ! 1 !

' | г" Ш \ ! \ \

| I • - ■

! П/ | Ег

¡тГ 1 1 Т 1 1 ......1____________ 1 1 ...... 1......

/ 1 ; 1 ! 1 1 1

'[ 1 1 1 1 ; 1 ; - - !

|> 0.35 0.7 1.05 Н 1.7! 2.1 2.45 2.8 3.15 3.5

е,л,.ч1..ч2.чз,«4 количество ангиогенина, мг/л

Зис. 7. Калибровочная кривая для определения ангиогенина в молоке, полученная

методом сплайн-интсрполяции

у{х), заданная узлами (у,, х,) в промежутке между г-м и (/>1)-м узлами, вычисляется по формуле

Ж)=амх + Ьм (8)

где I = О, ...Ы, а N - число узлов интерполяции;

= (9)

Исходя из анализа экспериментальных данных, выбираем N=5 (см. графическое изображение сплайн-интерполяции рис. 7). Каждый интервал зависимости степени восстановления РНКазной активности в исследуемой системе от содержания ангиогенина в ней описан линейной функцией.

Результирующая система линейных уравнений имеет вид

164* при 0 < х < 0,1

34,738ж + 12,948 при 0,11 < х < 1,04 у(х) = \ (10)

9,793*+ 38,74 при 1,05 Их< 2

2,4* + 53,6 при 2,01 < л: 2 3,5

Сравнительный анализ калибровочных функций, полученных методами сплайн-интерополяции и нелинейного регрессионного анализа, показывает, что точность калибровочной сплайн-функции выше, чем логарифмической регрессии.

Анализируя вышесказанное, можно сделать вывод о том, что введение понятия калибровочной функции позволяет получать объективные оценки количества ангиогенина в молочном сырье на всем участке области определения функции.

Для прогнозной оценки ангиогенина в молочном сырье разработан метод имитационного моделирования. Метод имитационного моделирования представляет собой последовательность выполнения следующих операций: обработка массива экспериментальных данных; определение параметров вектора оценок плотности распределения вероятностей; разработка формирующего фильтра статистических данных; формирование суммарной последовательности; разработка алгоритма имитации прогнозируемых данных; регрессионный анализ параметров объекта прогнозирования.

Метод имитационного прогнозирования был апробирован для прогнозной оценки ангиогенина в молоке четырех пород коров: черно. пестрой, холмогорской, голштино-фризской и айршиской.

Разработанные эмпирические и аналитические методы определения ангиогенина в биологических жидкостях были апробированы на молозиве, стародойном и нормальном молоке, вторичном молочном сырье, а именно: обезжиренном молоке, подсырной и творожной сыворотке, пахте и ультрафильтрате.

Глава 5. Исследование молочного сырья на наличие ангиогенина.

5.1. Влияние зоотехнических факторов на содержание ангиогенина.

Секреция молока представляет сложный физиологический процесс, в результате которого часть основных компонентов молока (жиры, белки, углеводы) синтезируется в молочной железе, а часть (ферменты, иммунные тела, гормоны) переходят без изменений из крови. Состав молока зависит от многих зоотехнических факторов: породы и возраста коров, периода лактации, состояния здоровья, условий содержания и т.п. Установить влияние зоотехнических факторов на содержание ангиогенина в молоке возможно путем использования обобщенного показателя, включающего комплекс характерных особенностей лакгирующего организма, которые непосредственно связаны с периодом лактации, а также путем применения методов современного математического аппарата.

Регрессионный анализ количества ангиогенина на протяжении .всего периода лактации проведен по экспериментальным данным, которые получены для молока коров четырех пород молочного направления: голштино-фризской, черно-пестрой, холмогорской и айрширской. В качестве иллюстрации анализа количественной оценки ангиогенина в молоке коров различных пород представлен регрессионный анализ экспериментальных данных полученных для молока коров голштино-фризской породы. .

Путем математической обработки полной совокупности экспериментальных данных с использованием пакета прикладных программ Ма&Сас16+ получена аналитическая зависимость тригонометрического вида, описывающая всю временную последовательность с 1 по ¿93,день лактации. Для молока коров голштино-фризской породы содержание ангиогенина А^) в зависимости от дня лактации (с]) описывается уравнением вида

... (И-с05-(с1.В,))-1п(2,ЬА,-ш(д-В,))-31)|, ,

А(') =--(аГАОТ-+3' <П)

где коэффициенты аппроксимации А1 и Вг, входящие в формулу, описываются функциями вида

IX-в,-IX,

А, = —-^— (12)

п

В, = *•'-. (13)

1-1 1=1

где Уг, XX - координаты экспериментальных значений, в дисретный момент времени 1, обозначенные на рис. 8 значком (□□).

Графическое изображение тригонометрической функции, описывающей количественное содержание ангиогенина в молоке коров голштино-фризской породы на протяжении всего периода лактации представлено на рис. 8 и обозначено пунктирной линией.

Результаты экспериментальных исследований и регрессионнный анализ показали, что содержание ангиогенина зависит от периода лактации и претерпевает изменения по трем основным периодам лактации. Самое высокое содержание ангиогенина отмечалось в первые дни лактации, при этом наиболее богато ангиогенином молозиво, что подтверждает его важное значение для новорожденного организма в первые дни жизни. В последние дни молозивного периода содержание ангиогенина снижается и стабилизируется на среднем значении в основном, самом продолжительном периоде лактации. После запуска содержание ангиогенина в стародойном молоке повышается, но не достигает значений, характерных для молозива.

Экспериментальные данные четко группируются по трем временным периодам и имеют интервал значений в виде «коридора» для каждого дня, что, с одной стороны, объясняется погрешностью измерения, а с другой, индивидуальными особенностями животных. Представляет интерес описание нижней и верхней границ «коридора», а также усредненного значения для каждого из трех периодов лактации, в частности, для молозивного периода, (с 1 по 9 день). Для нижней границы «коридора» У1(х) аналитическая зависимость имеет вид

У1(х)=1,2-А1-х^ (14)

где коэффициенты аппроксимации А1 и Б1 описываются (15) и (16)

соответственно:

(¿О^-В.-ЕЕ,

А, = —-(15)

п

Рис. И. Содержание ангиогенина в стародойном молоке коров, голштино -фризской породы по дням лактации .

Рис.9. Содержание ангиогенина в молозиве коров голштино-фризской породы по дням лактации

Рис. 10. Содержание ангиогенина в молоке коров голштино-фршской породы по дням лактации

5 10 15 70 25 270 275 280 285 Ч> Е

В, = —^-^-^-, (16)

п-2(Е,) -С±Е

4=1 ч=1

где (0^1, Ес1) - координаты экспериментальных значений для нижней границы «коридора» молозивного периода; п - объем выборки. Аналогично для верхней границы «коридора» Уг(х) аналитическая зависимость имеет вид

У,(х) = 1.4-Аг-х" (17)

где коэффициенты аппроксимации А2 и Вг описываются (18) и (19) соответственно

А = ——-(18)

п

В2 = -_!*_!=!_ , (19)

г

где (Оя,2, Ее]) - координаты экспериментальных значений для верхней границы «коридора» молозивного периода; п - объем выборки.

Среднее значение «коридора» Уз(х) находится путем усреднения верхней и нижней границ «коридора» и имеет вид

У3(х)= Л ' 2 2У }. (20)

Графические зависимости, соответствующие значениям нижней и верхней границ «коридора», а также среднему значению, вычисленному с помощью полученных аналитических зависимостей (14-20), представлены на рис.9.

Аналогичными зависимостями можно описать экспериментальные данные для второго временного интервала с 10 по 281 день, представляющего основной период лактации. Как и для молозивного периода были получены регрессионные зависимости для нижнего, верхнего значения «коридора», а также некоторое усредненное значение.

Для нижней границы «коридора» У1(х) найдена аналитическая зависимость. вида

Y,(x) = A1-xBl, ,. (21)

где коэффициенты аппроксимации Ai и Bi описываются (22) и (23) соответственно:

Ig,.. М,-IX

, " , (22) -7-, . (23)

где (Gq,i, Eq) - координаты экспериментальных значений для нижней границы «коридора» основного периода лактации; п - объем выборки.

Для верхнего значения «коридора» Уз(х) основного периода лактации найдена аналогичная аналитическая зависимость вида

Y2(x) = A2-X\ '"'(24)'

где коэффициенты аппроксимации Аг и Вг описываются формулами (18) и (19) соответственно.

Среднее значение «коридора» Уз(х) основного периода лактации находится путем усреднения значений нижней и верхней границ «коридора» и имеет вид У.М + УЛх)

2 ■ (25)

Графические зависимости, соответствующие значениям нижней и верхней границам «коридора», а также среднему значению, вычисленному с помощью полученных аналитических зависимостей, (21-25), представЛёны на рис.10.

Аналогичными зависимостями можно описать экспериментальные данные для третьего временного интервала - с 282 по 293 день, представляющего стародойный период лактации. Как и для двух предшествующих периодов, получены регрессионные зависимости для нижнего и верхнего значения «коридора», а также некоторое усредненное значение.

Для нижней границы «коридора» У1(х) найдена аналитическая зависимость вида

= + ЛГ04, , ... .'(26)

где коэффициенты аппроксимации Ai и Bi вычисляются по формулам (22) и (23) соответственно.

Для верхнего значения «коридора» Уг(х) стародойного периода лактации найдена аналогичная аналитическая зависимость вида

Кг(*) = 0.87.х2+*", (27)

где коэффициент аппроксимации В2 описывается формулой

р--е!-и—— ( (28)

9=1 \д«1

где (Gq,2, Еф - координаты экспериментальных значений для верхней границы «коридора» стародойного периода; п - объем выборки.

Среднее значение «коридора» Уз(х) для стародойного периода находится путем усреднения верхней и нижней его границ и имеет вид

П(Х)=25М±Ш. (29)

Графические зависимости, соответствующие значениям нижней и верхней границам «коридора», а также среднему значению, вычисленному с помощью полученных аналитических зависимостей (26-29), представлены на рис.11.

Количественный анализа ангиогенина в молоке, молозиве и стародойном молоке на примере голштино-фризской породы является типичным для исследованных четырех пород. По аналогии проведены исследования по количественному анализу ангиогенина в молоке коров черно-пестрой, холмогорской и айрширской породы. Во всех случаях отмечается наиболее высокое содержание ангиогенина в молозиве и стародойном молоке, а именно: - в первые и последние дни лактации. Для основного периода отмечается относительно стабильное его содержание. Экспериментальные данные, полученные для исследуемых пород, сгруппированы по соответствующим временным периодам и для них получены аналитические зависимости, позволяющие определять количество ангиогенина в любой период лактации.

Исследовано влияние молочной продуктивности и количества отелов на содержание ангиогенина в молоке. Установлено, что молочная продуктивность существенного значения на содержание ангиогенина не оказывает, а количество отелов оказывает. Так, в молоке коров первотелок содержание ангиогенина ниже чем в молоке коров 2-го и 7-го отела .

Разработанный количественный метод определения ангиогенина на основе конкурентной реакции позволил провести оценку молочного сырья на наличие ангиогенина в зависимости от зоотехнических факторов. Проведены исследования по определению количества ангиогенина в молоке коров черно-пестрой породы в зависимости от периода лактации. Учитывая, что ангиогенин входит в состав белковой фракции молока, параллельно

(30).

определяли массовую долю белка в исследуемых образцах. Массовую долю белка определяли общеизвестными методами и статистически обрабатывали.

Экспериментальные данные массовой доли белка и ангиогенина в молозиве, молоке и стародойном молоке представлены в виде числовых рядов. Экспериментальные значения массовой доли белка обозначены номером 1, а соответственно ангиогенина - номером 2.

Корреляционная обработка массовой доли белка в молоке коров черно-пестрой породы по дням лактации осуществлялась в соответствии с известными формулами. В частности, для вычисления нормированной автокорреляционной функции Г к+1 использовалась формула

|(ГГХ)-<Г/+К-»)

1=1 1

г,

(31)

"и-1

где х - выборочное среднее; п - объем выборки;

У1 - 1-й элемент числовой последовательности, день лактации; к - интервал сдвига, равный одному дню. Характерно, что нормированные корреляционные функции и для массовой доли белка и ангиогенина в зависимости от периода лактации имеют одинаковую форму, и описываются функцией вида

К. 1 (к) = ехр ( - а | к |) соэ V/ к, (32)

где 1 - номер обрабатываемой числовой последовательности;

а, Ш к • коэффициенты, определяемые экспериментально. Степень статистической зависимости последовательностей 1 и 2 оценивался взаимной корреляционной функцией, которая вычислялась по :формуле

2,(У.-у)(Х -х)

г = , "' ' (33)

к + 1 2 »-» 2 '

v (=1 1 1=1 '

Здесь, как и прежде х п у выборочные средние двух числовых последовательностей с элементами XI и У1, где

п -1

(34)

У = ±^ . "(35)

На рис. 12 представлена взаимная автокорреляционная функция для числовых последовательностей выборок массовой доли ангиогенина - 1 и белка - 2. Форма кривой взаимной автокорреляционной функции не отличается от формы частных корреляционных функций последовательностей 1 и 2, что свидетельствует об идентичности их статистических характеристик.

к

Рис. 12. Взаимная автокорреляционная функция массовой доли белка и ангиогенина в молоке коров черно-пестрой породы

Корреляционный анализ массовой доли белка и ангиогенина в молоке коров черно-пестрой породы по периодам лактации подтвердил, что массовая доля ангиогенина также, как и массовая доля общего белка молока находится в непосредственной взаимосвязи с зоотехническими и физиологическими факторами, интегральным показателем которых является период лактации. Наибольшие колебания массовой доли ангиогенина происходят в молозивный период, в меньшей степени - в стародойный. В период нормальной лактации колебания массовой доли ангиогенина незначительны. .

Таким образом, установлено, что такие зоотехнические факторы как порода, возраст, период лактации оказывают определенное влияние на уровень ангиогенина в молоке.

5.2. Исследование содержания ангиогенина в молочном сырье от бпотехнологических факторов и оценка ресурсов ангиогенина.

На основе разработанных методов количественного анализа (гл.4.) получены данные по содержанию ангиогенина в молоке и вторичном молочном сырье (табл. 2). Сравнительный анализ количественной оценки содержания ангиогенина в молочном сырье показал, что наибольшее его содержание - в цельном молоке. Это вероятно может быть объяснено тем, что часть ангиогенина связана с жировыми шариками молока.

__Таблица 2

Вид сырья Содержание ангиогенина, мг/л

цельное молоко обезжиренное молоко подсырная сыворотка творожная сыворотка пахта (способом сбивания) пахта (способом преобразования) ультрафильтрат цельного и обезжиренного молока ультрафильтрат подсырной сыворотки 2,3-9,0± 0,07 1,7-5,0 ±0,09 0,9-1,2±0,05 0,5-0,8±0,05 0,6-0,9±0,03 0,09-0,13±0,008 0,5-0,810,08 0,18-0,27±0,005

Исследование вторичного молочного сырья показало, что ангиогенин содержится во всех видах вторичного сырья. Наибольшее его содержание отмечено в обезжиренном молоке, а наименьшее - в пахте от производства масла способом преобразования.

Проведены исследования по хроматографической очистке ангиогенина на СМ-целлюлозе. На рис. 13. представлены профили элюции ангиогенина с СМ-целлюлозы для различных видов вторичного сырья. С целью анализа данных ионообменной хроматографии для каждого вида' вторичного молочного сырья была проведена статистическая1 обработка экспериментальных данных и получены аппроксимирующие кривые профилей элюции.

Аналитическая зависимость аппроксимирующей функции в общем виде описывается уравнением

(36)

А = Л^ехр

п )

где А - величина оптической плотности при /.=280 нм, ед.; Ао,и - коэффициенты ; N - число фракций; N0 - порядковый номер фракции.

А, мг/л

ю

15

1 / \ 3 ■

1 г КУ* ч! \ \ "> м \ \ ¿у** А ^ „ 5

ш 1 Ъс

20

N фракций

Рис. 13. Профиль элюции с СМ-целлюлозы ангиогенина из вторичного сырья: .1-обезжиренное молоко; 2 - подсырная сыворотка; 3 - творожная сыворотка; 4- ультрафильтрат цельного молока; 5 - пахта (способом сбивания)

Исследование содержания ангиогенина в молочном сырье от биотехнологических факторов показало, что тепловая и механическая обработка, используемая в промышленности, оказывает существенное воздействие на содержание ангиогенина и его активность. Анализ основных видов тепловой обработки, принятых в молочной промышленности свидетельствует о том, что термизация практически не влияет на изменение содержания ангиогенина и его активность. Мгновенный и кратковременный режим пастеризации в среднем снижает активность ангиогенина на 10±2%, а длительная пастеризация более чем на 50%. Все виды применяемой стерилизации полностью инактивируют фермент.

Механическая обработка, в частности, гомогенизация вызывает перераспределение ангиогенина между плазмой молока и оболочками жировых шариков не снижает его общего количества.

В результате анализа выше представленного материала можно сделать следующий вывод: для получения ангиогенина в промышленных масштабах

целесообразно использовать обезжиренное молоко, подсырную сыворотку и ультрафильтрат цельного молока.

Глава 6. Разработка научных основ получения БАД парафармацевтического действия на основе молочного ангиогенина

На основе литературного обзора, результатов патентного поиска и собственных экспериментальных исследований была выдвинута научная гипотеза на базе которой была разработана научная концепция получения природного ангиогенина. Разработанная концепция предполагает использовать в качестве сырья вторичное молочное сырье, в частности, обезжиренное молоко и подсырную сыворотку, оригинальный способ хроматографической очистки ангиогенина на СМ-целлюлозе, получение обогащенной ангиогенином фракции низкомолекулярных белков молока (БАД ангиогенина).

В доступной литературе не были обнаружены данные о получении биологически активной добавки на основе ангиогенина молока, поэтому была разработана технологическая схема и научно обоснованы все ее операции. Она включает следующие операции: приемку и оценку качества сырья; подготовку сырья для выделения ангиогенина; хроматографи-ческую очистку; диализную обработку; микрофильтрационную обработку; стабилизацию белковой фракции.

На первом этапе научного обоснования операций технологического процесса получения БАД на основе природного ангиогенина были проведены исследования подбора рациональных сырьевых источников (см. гл. 5.2.), а на втором - операции технологического процесса.

Ангиогенин - нативный фермент молока который в процессе промежуточного резервирования и переработки может терять свою активность или разрушаться. Поэтому стояла задача по исследованию временных и температурных условий промежуточного резервирования на стойкость ангиогенина. Было установлено, что активность ангиогенина зависит как от температуры хранения молочного сырья, так и от времени.

Для установления комплексного влияния температурного и временного фактора на сохранение активности ангиогенина в молоке был поставлен ПФЭ. В результате которого была получена регрессионная зависимость, которая имеет вид

У = 4,4889 -1,67370 + О,418502 4-0,0139Т + О,О1290Т - 0,0028т1 (37)

где У- концентрация ангиогенина, мг/л;

Т- температура хранения молока, °С;

в- время хранения молока, сутки. Данная зависимость справедлива при следующих условиях: 0£в£2суток; 4 3Т£1б°С.

у = -ЗЕ ОЗУ.* + 0,00 )9х3-0,077 Я!=О,В0С х3 + 1,491" 7 * +92.942

т- 10 4 1'С

У ЗЕ-09хе 0,0002х* Я 0,0086х' = 0,8965 + о,гоз1> - 2,0655? + (06,53

20 30

<0 а® 60 70 80 во

Чвсы

■Л у = -8Е-С ...... 5х4 + 0,001 х'-О.ИЗв =!! = 0,8910 ! + 1.8378Х * 82,303

\

Т» 6±ГС

у"8Е-( 9х'-2Е-06 ' + О.ОООЗх • 0,012** < = 0.9972 о.гзазх3 ■ ,1503*« К 6,44

10 20 30 40 50

70 80

Рис. 14. Результаты аппроксимации зависимости относительного содержания ангиогенина в молоке от условий хранения

Анализ полученной регрессии свидетельствует о том, что наиболее значимым фактором является временной, температурный фактор оказывает меньшее влияние.

Анализ полученных экспериментальных данных и регрессионных зависимостей позволил сделать предположение о возможности использования относительных зависимостей содержания ангиогенина от времени резервирования в виде своеобразных калибровочных графиков. Поэтому была проведена аппроксимация полученных экспериментальных данных и получены регрессионные зависимости по которым были построены соответствующие кривые при исследуемых трех температурных режимах, представленные соответственно на рис. 14.

Аппроксимация приведена в виде коридора и имеет верхнюю кривую аппроксимации У, и нижнюю - У2.

Для получения БАД, обладающей парафармацевгическими свойствами, при фракционировании белка из молочного сырья необходимо обеспечить сохранение биологической активности ангиогенина. Согласно литературным данным и собственным исследованиям было выдвинуто предположение для этих целей использовать ионообменную хроматографию. В результате был разработан оригинальный метод получения обогащенной ангиогенином (степень обогащения десятикратная) катионной фракции низкомолекулярных белков молока, включающей лизоцим, РНКазу и низкомолекулярные пептиды, а также чистого препарата, которые легли в основу соответсвующих патентов.

В качестве сырья для промышленного выделения ангиогенина рекомендовано исходя из его содержания, а также с учетом технологических свойств использовать обезжиренное молоко, подсырную сыворотку и ультрафильтрат молочного сырья. Для этих видов вторичного сырья • исследована хроматографическая очистка на СМ-целлюлозе и проведена аппроксимация экспериментальных данных (рис.15). Ангиогенин во всех случаях выходит пиком, а симметричное расположение хроматограмм свидетельствует об эффективно подобранных режимах элюции.

Полученная белковая СМ-фракция представляет собой водный раствор низкомолекулярных катионных белков молока состав которых представлен в табл.3. Белки СМ-фракшш обладают биологической активностью и могут быть использованы для получения БАД к пище парафармацевтического действия. В связи с этим актуальным является соблюдение условий промышленной стерильности, для чего была апробирована микрофильтрационная обработка. Установлено снижение общей бактериальной обсемененности. Спорообразующая, условно патогенная и патогенная микрофлора отсутствует. Следовательно микрофильтрация может быть рекомендована для очистки СМ-фракции. - ~1

А, мг/л

I 3

"13 5

А, МГ/л 05;

04 |

п'< I 0.2!

¡1 13 15 и :? 21 23

N фракций

а.

9 ;! 13 !5 V !> 2! 23

N фракций

б.

! ! 1 ' г :;

! - ^ \

| ' у7

/4 = 9,47262-1020«хр

3

где:

N - число фракций; N0 - порядковый номер фракции.

А = 2,0109-10 ехр

1.75

А = 2,3791 МОме*р

3

3 5 7 9 11 13 и п н 21 23

N фракций

1 - экспериментально

построенная кривая;

2 - аппроксимирующая

кривая.

в.

Рис. 15. Результаты аппроксимации хроматографической очистки на СМ-целлюлозе : а - обезжиренного молока; б - подсырной сыворотки; в - ультрафильтрата цельного молока

компонент жидкая форма, мг/мл сухая форма, мг/г

белок, 1,0-3,0 5,0-15,0

в том числе:

ангиогенин 0,1-0,3 0,5-1,8

лизоцим 1,3 -10"5- 4-Ю"3 6,5-10"3 - 2,4-10"3

панкреатическая РНКаза 0,7-2,4 3,5-12,0

полипептиды 0,18-0,3 0,9-0,12

Для сохранения биологической активности при соответствующих микробиологических показателях в процессе хранения предусмотрена стабилизация данной фракции, а именно: использование глицерина для хранения при отрицательных температурах и лиофилизация.

Проведенные исследования позволили определить основные параметры и последовательность операций технологического процесса производства принципиально новой БАД к пище парафармацевтического действия, которой было дано название «МИЖАНГ», а также разработать рациональную технологическую схему производства БАД (рис.16). Результаты исследований легли в основу НД на биологически активную добавку ангиогенина «МИЛКАНГ» (ТУ № 9229-032-02068640-99).

Глава 7. Физико-химический и биотехнологический скрининг БАД

«МИЛКАНГ».

БАД «МИЛКАНГ» - это новый вид БАД к пище парафармацевтического действия, аналогов которому не обнаружено как в отечественных, так и в зарубежных доступных источниках информации. В связи с этим был выполнен физико-химический скрининг, который состоял из подробного анализа физических свойств, теплофизических характеристик и реологических показателей. Основные физико-химические показатели представлены в табл.4.

Структурно-механические свойства белковых фракций, обогащенных ангиогенином, определяли методами инженерной механики с помощью ротационного вискозиметра с двумя коаксиальными цилиндрами «Реотест-2». Измерения проводили в режиме 1а при прямом и обратном ходе.

ш

ГЧ

Г1 I

г^х, 1 М

Чк

]_^

®

12

-. обезжиренное молоко

*—. подсырная сыворотка ультрафильтрат

хроматографически очищенное —г—г.— СМ-фракция молочное сырье

-ею-00- 00-

К-фосфатный буфер физраствор

БАД «МИЛКАНГ» глицерин

1 - насос; 2 - счетчик; 3 - сепаратор; 4 - пластинчатый теплообменник; 5 - резервуар с рубашкой; 6 -хроматографическая установка; 7 - коллектор фракций; 8 - диализная установка; 9 - микрофильтрациониая установка; 10 - резервуар асептический; 11- расфасовочная машина; 12-сублимационная установка.

Рис. 16

показатели , ед. изм. до диализа > после диал

Сухие вещества % 17,0±0,002" 4,0±0,002

Плотность кг/ м1 1067,1±0,05 1002,5±0,05

Активная кислотность ед. рН 6,б±0,02 6,9±0,02

Изоэлектрическая точка ед. рН 9,0±0,2 9,0±0,3

Вязкость динами- Па.с.10"3

ческая, 20°С 1,0510,005 1,03±0,005 :

Показатель преломления усл.ед. 1,359±0,000 1,340±0,0003

Коэффициент поверх- мН/м 81,96±0,005 74,8310,005 .

ностного натяжения

Ом/м 1,5±0,05 ; 0,0710,05

Удельная электропроводность

3530,610,05 3970,210,05-

Удельная теплоемкость кДЖ / мг ■ К

Коэффициент теплопровод- 0,580±0,000 0,595+0,0005

ности Вт/(м К)

Коэффициент 12,122-108 12,125 10я

температуропроводности м2 /с

Реологические характеристики белковой фракции молока, обогащенной ангиогенином, являются важными показателями структурно-механических свойств, которые находятся в прямой зависимости от их состава, температуры и ряда других показателей. Наиболее важной реологической величиной, определяющей состояние среды, является вязкость. Исследование обогащенных фракций в водном растворе и в физрастворе показало, что они ведут себя как ньютоновские жидкости. И величина динамической вязкости при температуре 20 °С составила, соответственно,; Па.с . 10"3 1,03±0,005 и 1,05 ± 0,005.

Исследование структурно-механических свойств белковой фракции молока, обогащенной ангиогенином, в глицерине показало, что они не могут быть описаны законом Ньютона, о чем свидетельствуют полученные кривые' течения.*1 Кривые течения снимались при прямом и обратном ходе в диапазоне градиента скорости сдвига от 3 до 1312 с'1. При этом была получена петля гистерезиса незначительной площади, причем после разрушения структуры отмечается снижение значения напряжения сдвига, которое может быть объяснено с одной стороны, поведением белковых

веществ, а с другой - тиксотропными свойствами глицерина. Зависимость вязкости от величины градиента скорости сдвига при различных значениях температуры носит нелинейный характер (рис.]7 а.) Г"

Учитывая нелинейный характер зависимости вязкости от градиента скорости сдвига и температуры, целесообразно данную зависимость представить в логарифмическом виде (рис. 17 б.). На основе полного факторного эксперимента (ПФЭ) была установлена функциональная зависимость динамической вязкости (г)) обогащенной фракции в глицерине от скорости сдвига Ф) и температуры (0, которая имеет вид:

"П = 1.795 + 3.893^0- 1.41 В^'Б -0.985г - О.ОООбЗг^О +

+ 0.04(Ш2

(38)

Данная зависимость справедлива для белковой фракции молока, обогащенной ангиогенином и стабилизированной 10 % глицерином.

Наряду с температурными параметрами и характером механического воздействия значительное влияние на величину вязкости (г|) оказывает химический состав исследуемых образцов, в качестве обобщенной характеристики которого была выбрана массовая доля сухих веществ, в том числе глицерина (X). Функциональная зависимость установлена с помощью ПФЭ и имеет вид:

1ёП = - 0.938 +0.188^0- 0.090б^20- 0.3831 - 0.045^ О + + 0.017г2 + 0.31бх+.00017х^0+.0003т- 0.0139Х2

(39)

Полученные зависимости справедливы в достаточно широком диапазоне варьирования параметров и могут быть использованы в гидромеханических расчетах при разработке аппаратурного оформления технологического процесса получения БАД на основе ангиогенина молока.

Исследован аминокислотный состав БАД «МИЛКАНГ». Сравнительная характеристика аминокислотного состава БАД и коровьего молока представлена в виде диаграммы. Рассчитанный аминокислотный скор незаменимых аминокислот, входящих в состав БАД, свидетельствует о том, что имеется дефицит только валина и изолейцина, содержание метионина практически соответствует идеальному белку, а других незаменимых аминокислот превышает почти на 50%. Это позволяет сделать вывод о его достаточно высокой биологической ценности.

0, Па

а.

Т,аС

б,

Рис. 17. Реологические показатели БАД «МИЛКАНГ» в глицерина: а - кривые течения, снятые при прямом ходе; б - зависимость вязкости от скорости сдвига и температуры.

8. Медико-биологические исследования БАД «МИЛКАНГ»

Важнейшим компонентом БАД «МИЖАНГ» является полифункциональный белок ангиогенин, а также низкомолекулярные катионные белки молока: лизоцим и РНКаза. Благодаря этим биологически активным веществам «МИЛКАНГ» может быть отнесен к БАД парафармацевгического действия. В данной главе рассмотрены известные и исследованные на данный момент вопросы, касающиеся установления биологической роли антиогенина в молоке, а именно участие в неспецифическом иммунитете организма, а также в исследовании общеукрепляющего и ранозаживляющего действия его в составе БАД.

БАД «МИЖАНГ» в жидкой и сухой формах была исследована на базе хирургического отделения и клинико-диагностической лаборатории Московского областного научно-исследовательского клинического института (МОНИКИ). В частности, исследовано влияние «МИЛКАНГа» на течение локального асептического воспаления, вызванного скарификационным повреждением эпидермиса. В опытных скари-фикационных пробах было выявлено улучшение кооперации клеточных элементов макрофагально-лимфоцитного ряда во второй фазе, кроме того отмечена активизация хемотаксиса и функциональной активности микро-и макрофагов. В контрольных пробах было отмечено снижение ответной реакции в виде отсутствия второй фазы воспаления - фазы макрофагальной защиты или ее слабость. Таким образом, предварительные данные, полученные в результате настоящего исследования, свидетельствуют о положительном действии «МИЛКАНГа» на восполительную реакцию, ее завершенность и стимуляцию местного иммунного ответа.

Проведены исследования по определению распределения ангиогенина между белковой и жировой фазами молока. Определение количества ангиогенина, связанного с двумя основными фазами молока определялось путем определения ангиогенина в обезжиренной и жировой фракции молока, а также установлением определяющих факторов и взаимосвязи между ними в исследуемой системе. В качестве определяющих признаков принято содержание ангиогенина, сывороточных белков, жира, средний диаметр жирового шарика и удельная поверхность жировой фракции с учетом породы коров. Проведенный многофакторный анализ определяющих факторов как в обезжиренной, так и сливочной фракции показал зависимость содержания ангиогенина от поверхности жировой фазы, а следовательно, от массовой доли и дисперсности жира в исследуемой фазе.

Анализ теоретических и экспериментальных исследований позволил получить следующие основные результаты и выводы

1. На базе анализа и систематизации научных и экспериментальных данных разработано новое научное направление технологии молока и молочных продуктов - создание парафармацевтической продукции и биопрепаратов на основе глубокого фракционирования компонентов молока.

2. На основе анализа сформированного информационного файла и результатов собственных исследований по приоритетным направлениям отраслевой науки разработана научная концепция получения природного ангиогенина, обладающего полифункциональными свойствами. Реализация научной концепции осуществлена путем комплексного решения двух научных проблем: получение биологически активных веществ и рациональной переработки молочного сырья.

3. Разработан математический аппарат для реализации научной концепции. На основе формирующих фильтров разработан метод имитационного моделирования и показана возможность его применения в оценке и прогнозировании содержания ангиогенина в молочном сырье.

4. Разработаны эффективные методы определения ангиогенина в молоке: эмпирические методы (метод ИФА на основе поликлональных антител и метод конкурентного взаимодействия РНКазы и ангиогенина за РНКазин); аналитические (на основе нелинейного регрессионного анализа и сплайн интерполяции с привлечением пакета прикладных программ Math Cad 6+), а также получены калибровочные кривые и аналитические зависимости определения ангиогенина в молочном сырье.

5. Определены промышленные ресурсы содержание ангиогенина в молоке и молочном сырье с учетом зоотехнических и биотехнологических факторов. Установлено, что содержание ангиогенина зависит от породы коров ( наиболее богато ангиогенинохМ молоко айрширской породы, а наименьшее его количество содержится в молоке коров черно-пестрой породы, голштино-фризская и холмогорская породы занимают промежуточное положение) и изменяется по трем основным периодам лактации. Наибольшее его количество содержится в первые дни лактации в молозиве( ЗД..26,0 мг/л), затем снижается и стабилизируется в основном периоде (2,3...9,0 мг/л), с повышением в стародойном молоке (2,7... 17,0).

Установлено влияние основных промышленных режимов тепловой обработки на содержание ангиогенина в молоке: термизация практически не оказывает влияния; мгновенная и кратковременная пастеризация снижает его содержание на 10%, длительная - на 50%;

стерилизация - инактивирует. Сепарирование и гомогенизация не снижают общего содержания, а вызывают распределение ангиогенина между жировой и белковой фракциями молока.

Рекомендовано использовать обезжиренное молоко, подсырную сыворотку и ультрафильтрат молочного сырья в качестве промышленных источников ангиогенина.

7. Разработаны научные основы выделения ангиогенина из молочного сырья в виде обогащенной ангиогенином белковой фракции (степень обогащения - десятикратная) и чистого препарата ангиогенина, базирующиеся на ионообменной хроматографии на СМ-целлюлозе и гидрофобной хроматографии на СМ-тойперле и Бутил-тойперле. Научно обоснованы условия хроматографической очистки ангиогенина из различных видов молочного сырья. Проведена аппроксимация параметров и получены аналитические зависимости, описывающие процесс хроматографической очистки.

8. Научно обоснованы операции технологического процесса получения БАД к пище парафармацевтического действия на основе природного ангиогенина: приемка и оценка качества молочного сырья; очистка и охлаждение; промежуточное резервирование; хроматографическая очистка на СМ-целлюлозе; диализная обработка; микрофильтрация; стабилизация СМ-фракции; фасование и упаковывание. Разработана технология БАД «МШ1КАНГ» (ТУ 929-032-02068640-99) и соответствующий товарный знак, зарегистрированный в Российском агентстве по патентам и товарным знакам.

9. Получена БАД «МИЛКАНГ» в жидкой и сухой формах и определены физико-химические, реологические и теплофизические показатели, исследованием аминокислотного состава показана высокая биологическая ценность БАД «МИЛКАНГ».

10. Предварительными клиническими исследованиями получено подтверждение о положительном влиянии БАД «МИЛКАНГ» на местный иммунитет при локальном асептическом воспалении.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Тихомирова H.A. Природный и рекомбинантный ангиогенин. Свойства и количественный анализ. - М: Пищевая промышленность, 1999. - 137с.

2. Чеботарь Ю.М., Тихомирова H.A. Использование вторичного молочного сырья // Молочная промышленность, 1987. N° 2. С. 42- 46.

3. Тихомирова H.A. Современные физические методы обработки сырья в производстве молочных продуктов. - М.: Российская академия кадрового обеспечения АПК. 1990. - 33 с.

4. Тихомирова H.A., Федорус И.И., Кирьянов И.А. Экономия топлива и тепловой энергии на предприятиях мясной и молочной промышленности. - М.: АгроНИИТЭИММП, 1991. - 84 с.

5. Тихомирова H.A. Влияние сушки на белковую фракцию жиро-белковоуглеводного концентрата. - М.: АгроНИИТЭИММП. Науч,-техн.сб. 1991. Вып. 9. С.11-14.

6. Тихомирова H.A. Оценка дисперсности жиробелковой фракции сухого молока, полученного на основе ультрафюгьтрации. - М,: АгроНИИТЭИММП. Науч.-техн.сб. 1991. Вып. 9. С.14 -15.

7. Тихомирова H.A. Имитационное прогнозирование биотехнологкческих систем методом формирующих фильтров. - М.: АгроНИИТЭИММП. Деп. рук, № 762мм. 1991.-21 с.

8. Тихомирова H.A. Исследование свойств глюкозо-галактозных сиропов для молочных консервов и пресервов. - М.: АгроНИИТЭИММП. Науч.-техн.сб. 1991. Вып. 10. С. 23 - 26.

9. Тихомирова H.A. Молочные консервы функционального назначения // Сборник докладов 1У Всесоюзн. Научн.-техн. Конф. «Разработка комбинированных продуктов питания (Медико-биологические аспекты, технология, аппаратурное оформление, оптимизация)». Кемерово. 1991. Раздел Ша. С. 132- 133.

Ю.Тихомирова H.A., Акинин П.П. Основные направления формирования и развития рынка молока и молочных продуктов. - М.:. . Научно-методический центр Российской академии кадрового обеспечения АПК. 1991,- 31 с. . ;

П.Тихомирова H.A. Результаты имитационного прогнозирования негауссовских процессов на примере биотехнологических систем. - М.: АгроНИИТЭИММП. Деп. рук. № 778мм. 1992. - 45с."

12.Тихомирова H.A. Исследование протеолигической активности ультрафильтрационных концентратов цельного; молока. - М.: АгроНИИТЭИММП. 1992. Вып. 9-10. С. 14 -15.

13.Тихомирова H.A. Осмотические свойства и показатель активности воды молочных концентратов, полученных на основе современных физических

методов обработки молока. - М: АгроНИИТЭИММП. 1992. Вып. 9-10. С. 21-24.

Н.Тихомирова H.A. Исследование жировой фракции молочных ультрафильтрационных концентратов. - М.: АгроНИИТЭИММП. 1992. Вып. П. С. 12-25.

Н.Тихомирова H.A., Шекоян С.А. Организация первичной переработки молока и технология производства молочной продукции на малых предприятиях. - М.: Российский научно-исследовательский институт по социальным и кадровым проблемам АПК. 1993. - 67 с.

16.Исследование возможности использования стрептококков немолочного происхождения в технологии кисломолочного продукта / М.А. Сидоров, А.М. Шалыгина, Г.Н. Крусь, H.A. Тихомирова, H.H. Каткова - М.: АгроНИИТЭИММП. 1993. Вып. 1. С. 8 -10.

17.Исследование реологических характеристик молочных сгустков, полученных на основе Str. Fecium / A.M. Шалыгина, Г.Н. Крусь, H.H. Каткова, H.A. Тихомирова - М.: АгроНИИТЭИММП. 1993. Вып. 1. С. 17 -20.

18.Тихомирова H.A. Производство молочных консервов на основе современных физических методов обработки молочного сырья. - М.: АгроНИИТЭИММП. 1993. 63 с.

19.Молочные продукты для детского и диетического питания / A.M. Шалыгина, Г.Н. Крусь, H.H. Каткова, H.A. Тихомирова - М.: АгроНИИТЭИММП. 1993. 36с.

20 .Тихомирова H.A., Каткова H.H. Организация и технология приемки молока от фермерских хозяйств и оценка его качества. - М.: Российский научно-исследовательский институт по социальным и кадровым проблемам АПК. 1994. - 44 с.

21 .Тихомирова H.A., Хани Альхаджи Геме. Исследование термостойкости сухого жиробелкового концентрата. - М.: АгроНИИТЭИММП. 1994. Вып. 1. С. 11 - 15.

22.Количественное определение ангиогенина быка. И.А. Рогов, Шалыгина, H.A. Тихомирова, Ю.Л. Рустамьян, О.В.Скоробогатько, А.М. Михайлов, Е.В. Степанова, Г.С. Комолова. // Биохимия, 1995. Т. 60. № 8. С. 13441348.

23.Выделение ангиогенина из молочного сырья / А.М. Шалыгина, Комолова, H.A. Тихомирова, А.М. Михайлов, Ю.Л. Рустамьян // Молочная промышленность. 1995. № 4. С. 22 - 23

24.Комолова Г.С., Шалыгина A.M., Тихомирова H.A. Новый белок ангиогенин. - М.: АгроНИИТЭИММП. 1995. Вып. 1. С. 14 -15.

25.Ангиогенин мощный фактор роста кровеносных сосудов / ИАРогов, А.М. Шалыгина, Г.С. Комолова, H.A. Тихомирова // Материалы Междун. Науч.-техн. конф. «Пища, экология, человек», М. 1995. Раздел 1. С.2.

26.Биологически активный компонент молока - ангиогенин / И.А.Рогов,,,

A.M. Шалыгина, Г.С. Комолова, Ионова И.И., H.A. Тихомирова // Материалы Междун. Науч.-техн. конф. «Пища, экология, человек», М. 1995. Раздел 2. С, 13. , ,

27.Хроматографическая очистка молочного сырья от. ., примесей панкреатической РНКазы / И.А. Рогов, A.M. Шалыгина, Г.С. Кощшова, И.И. Ионова, H.A. Тихомирова // Материалы Междун. Науч.-техн. конф. «Пиша, ' экология, человек», М. Раздел 2. С. 29. ■

28.Сравнительная характеристика различных видов культур по синерезису /

B.И. Ганина, H.A. Тихомирова, Т.АГорина, И.Г. Фирсова;// Тезисы докл. науч. чтен. Памяти акад. Горбатова «Теоретические. и, практические аспекты применения методов инженерной физико-химической механики с целью совершенствования и интенсификации технологических процессов пищевых производств». М. 1996. С. 71.

29.Ганина В.И., Тихомирова H.A., Ионова И.И. Реологические характеристики некоторых кисломолочных сгустков // Тезисы докл. науч. чтен. Памяти акад. Горбатова A.B. «Теоретические' и практические аспекты применения методов инженерной физико-химической механики с целью совершенствования и > интенсификации технологических процессов пищевых производств». М. 1996. С. 77.

30.Выделение ангиогенина из коровьего молока / A.M. Шалыгина, H.A. Тихомирова, И.И. Ионова, Г.С. Комолова. - : АгроНИИТЭИММП. 1996. Вып. 4. С. 4.

31.Шалыгина A.M., Тихомирова H.A., Петухов A.A. Влияние температурной обработки на белок молока ангиогенин // Тезисы докл. науч. чтен. «Научное наследие проф., д.т.н. Э.И. Каухчешвили». М. 1996.

C.122.

32.Очистка ангиогенина из коровьего молока / И.А. Рогов, A.M. Михайлов, A.M. Шалыгина, H.A. Тихомирова, Ю.Л. Рустамьян, Г.С. Комолова // Прикладная биохимия и микробиология. 1997. Т. 33. № 1. С. 107-110. 33.Определение ангиогенина в коровьем молоке / A.M. Шалыгина, H.A. Тихомирова, И.И. Ионова, Г.С. Комолова // Молочная промышленность. 1997. № 3. 1997. С. 32. 34.Очистка ангиогенина из коровьего молока. И.А. Рогов, А.М. Михайлов, A.M. Шалыгина, H.A. Тихомирова, Ю.Л. Рустамьян, Г.С. Комолова // Прикл. Биохимия и микробиология. 1997. Т.33, № 1. С.Ю7-110. л , .

35.Определение ангиогенина в коровьем ,молоке на основе,конкурентной пробы «Панкреатическая РНКаза / плацентарный ингибитор РНКазы -ангиогенин» / И.А. Рогов, A.Mt Шалыгина, И.И. Ионова, А.1у{. Михайлову H.A. Тихомирова, Г.С. Комолова//Вопросы питания. 1997. № 2. С. 35г37.

36.Биологически активные вещества молока / A.M. Шалыгина, H.A. Тихомирова, И.И. Ионова, A.A. Петухов, Г.С. Комолова - М.: АгроНЙИТЭИММП. 1997. Вып. 6. 16 с.

37.Рогов И.А., Шалыгина А.М., Тихомирова H.A. Исследование биологической и ферментативной активности ангиогенина, выделенного из коровьего молока // Материалы Второй Междун. Науч.-техн. конф. «Пища, экология, человек», М. 1997. Раздел 1. С. 55 - 56.

ЗЗ.Ангиогенин молока как пищевая добавка для продуктов лечебно-профилактического назначения / A.M. Шалыгина, Г.С. Комолова, H.A. Тихомирова, Ю.Л. Рустамьян, О.С. Куркина // Тезисы докладов Научн. техн. семинара «Проблемы создания экологически безопасных продуктов питания на пороге XXI века». М. 1998. С.24

39.Тихомирова H.A. Перспективы производства молочных продуктов нового поколения на основе ангиогенина // Тезисы докладов Научн.-практич. конф. «Прогрессивные, экологически безопасные технологии хранения и комплексной переработки сельхозпродукции для создания продуктов питания повышенной пищевой и биологической ценности» по направлению «Проблемы создания нового поколения отечественных продуктов питания повышенной пищевой и биологической ценности -продуктов XXI века» .Углич - М. 1998. С. 334.

40.Содержание биологически активного фактора роста - ангиогенина во вторичном молочном сырье / A.M. Шалыгина, И.И. Ионова, H.A. Тихомирова, Г.С. Комолова // Тезисы докладов Научн.-практич. конф. «Прогрессивные, экологически безопасные технологии хранения и комплексной переработки сельхозпродукции для создания продуктов питания повышенной пищевой и биологической ценности» по направлению «Проблемы создания нового поколения отечественных продуктов питания повышенной пищевой и биологической ценности -продуктов XXI века» .Углич - М. 1998. С. 359.

41.Иммуноферментный анализ ангиогенина в молоке коров / Ю.Л. Рустамьян, А.М. Шалыгина, H.A. Тихомирова, М.Л. Рабинович, А.Н. Плешанов, Г.С. Комолова // Прикладная биохимия и микробиология. 1999. Т. 35. № 1.С. 105-108.

42.Рустамьян Ю.Л., Тихомирова H.A., Комолова Г.С. Использование иммуноферментного анализа ангиогенина для разработки диетических молочных продуктов // тезисы Всероссийской конф. с междунар. участием. «Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека». М. 1999. С.43.

43.Перспективы получения молочных продуктов с биологически активным веществом ангиогенином / А.М. Шалыгина, Г.С. Комолова, H.A. Тихомирова, О.С. Куркина // тезисы Всероссийской конф. с междунар.

участием. «Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека». М. 1999. С.54.

44.Тихомирова H.A. Перспективы использования ангиогенина молока в лечебно-профилактическом питании // Материалы Всероссийской конф. с междунар. участием. «Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека». М. 1999. С.31-33.

45.Перспективы получения стерилизованного молока, обогащенного биологически активным веществом ангиогенином / A.M. Шалыгина, Г.С. Комолова, H.A. Тихомирова, О.С. Куркина // Материалы Всероссийской конф. с междунар. участием. «Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека». М. 1999. С.79-80.

46.Шалыгина А.М., Тихомирова H.A. Использование ресурсов интернет в курсе «Научные основы производства продуктов питания» // Тезисы докл. Учебно-методич. конф. «Применение информационных технологий ' в учебном процессе» М.: МГУПБ 1999. С.13.

47.Тихомирова H.A. Теплофизические свойства обогащенной ангиогенином белковой фракции, полученной из молока // Материалы Третьей Междун. Науч.-техн. конф. «Пища, экология, человек», М.. 1999. Раздел 1. С.93.

48.Анализ содержания ангиогенина в молоке коров черно-пестрой породы / Ю.Л. Рустамьян, Г.С. Комолова, H.A. Тихомирова, A.M. Шалыгина // Материалы Третьей Междун. Науч.-техн. конф. «Пища, экология, человек», М. 1999. Раздел 1. С. 33.

49.Влияние технологических режимов производства масла на содержание панкреатической рибонуклеазы и лизоцима в пахте / A.M. Шалыгина, H.A. Тихомирова, Т.В. Федорова, И.И. Ионова, Г.С. Комолова // Материалы Третьей Междун. Науч.-техн. конф. «Пища, экология, человек», М. 1999. Раздел 1. С. 33.

50.Физико-химические показатели обогащенной ангиогенином белковой фракции, полученной из молока / H.A.Тихомирова, А.М. Шалыгина, В.А. Кудрявцева, Г.С. Комолова // Материалы Второй Междун. Науч.-техн. конф. «Пища, экология, человек», М. 1997. Раздел 1. С. 78.

51 .Исследование вторичного молочного сырья для получения биологически активных веществ молока / A.M. Шалыгина, Г.С. Комолова, H.A. Тихомирова, О.С. Куркина И Сб. Тезисов Межвузовской научн.-техн. конф. «Перспективные направления научных исследований молодых ученых северо-запада России». Вологда-Молочное. 1999. С.69.

52,Перспективы использования пахты как источника ангиогенина / А.М. Шалыгина, H.A. Тихомирова, Т.В. Федорова, И.И. Ионова, Г.С. Комолова // Сб. Тезисов Межвузовской научн.-техн. конф. «Перспективные

направления научных исследований молодых ученых северо-запада России». Вологда-Молочное. 1999. С.68.

53.Тихомирова H.A. Количественный анализ ангиогенина в молоке коров // Молочная промышленность. 1999. № 10. С. 40 -42.

54.Тихомирова H.A. Выделение ангиогенина из подсырной сыворотки // Сыроделие .1999. № 3. С. 32.

55.Исследование влияния катионной фракции белков молока на бактерии группы кишечной палочки / H.A. Тихомирова, A.M. Шалыгина, В.И. Ганина, Е.А. Алякина, Г.С. Комолова, Ю.Л. Рустамьян // Молочная промышленность. 1999. № 11. С. 31-33.

56.Тихомирова H.A. Исследование физико-химических свойств белковой фракции молока, обогащенной ангиогенином // Доклады Третьей Междун. Науч.-техн. конф. «Пища, экология, человек», М. 1999. С.89-90.

57.Тихомирова H.A., Шалыгина А.М., Карпычев C.B. Реологические показатели белковой фракции молока, обогащенной ангиогенином //Молочная промышленность. 2000. № 1. С.44.

58.Тихомирова H.A. Молочные продукты для дошкольников и школьников // Материалы 1 Всероссийского конгресса с международным участием «Питание детей : XXI век». М. 14-17 марта 2000г. С. 89-90,

59.Патент № 2110066 (Россия). Бюл. № 12. 27.04.98. Способ количественного определения ангиогенина в молочном сырье / И.А. Рогов, A.M. Шалыгина, Г.С. Комолова, И.И. Ионова, Тихомирова H.A., Ю.Л. Рустамьян.

60. Патент № 2109748 (Россия). Бюл. № 12. 27.04.98. Способ количественного определения ангиогенина в ' молочном сырье / И.А. Рогов, A.M. Шалыгина, Г.С. Комолова, A.M. Михайлов, Тихомирова H.A.

61. Патент № 2133464 (Россия). Бюл. № 20. 20.07.99. Способ количественного определения ангиогенина в молочном сырье / И.А. Рогов, А.М. Шалыгина, Г.С. Комолова, Ю.Л. Рустамьян, H.A. Тихомирова, И.И. Ионова.

Введение.

Глава 1. Анализ проблемы, постановка цели и задачи исследования

1.1. Формирование информационного файла.

1.2. Характеристика БАД к пище, тенденции их производства и применения

1.2.1. Анализ структуры питания населения России

1.2.2. Классификация БАД к пище.

1.2.3. БАД к пище - нутрицевтики.

1.2.4. БАД к пище - пробиотики.

1.2.5. БАД к пище - парафармацевтики.

1.3. Получение БАВ молока как одно из рациональных и перспективных направлений переработки вторичного молочного сырья.

1.4. Структура, свойства и источники ангиогенина

1.4.1. Структура и биохимические свойства ангиогенина.

1.4.2. Медико-биологические свойства ангиогенина.

1.4.3. Источники ангиогенина.

По данным ФАО ВОЗ из каждых ста человек, живущих сегодня на земном шаре, десять не получают достаточного питания. В XXI веке на Земле будут жить более 6 млрд. человек, для обеспечения их полноценным питанием необходимо за несколько десятилетий увеличить производство продуктов питания, примерно, на столько же, на сколько оно выросло за последние 10-12 тыс. лет.

По мнению отечественных и зарубежных ученых одним лишь совершенствованием и интенсификацией мирового сельскохозяйственного производства не возможно достигнуть таких результатов, так как традиционное производство продовольствия характеризуется особенностями, ограничивающими повышение экономической эффективности агропромышленного комплекса и качества его продукции.

Первая особенность - сезонность, не позволяющая эффективно использовать специализированную и дорогостоящую технику и людские ресурсы, а также требующая резервирования и хранения сельскохозяйственной продукции.

Вторая - нестадартность условий производства.

Третья - зависимость результатов труда от погодных и природных условий.

Четвертая особенность заключается в том, что сложившийся ассортимент традиционных пищевых продуктов не только отвечает в полной мере биологическим потребностям человека, но и позволяет лишь в весьма органиченной степени регулировать режим и рацион питания, чтобы приспособить его к современным условиям жизни. Больше того, для многих современных пищевых производств характерны неблагоприятные изменения в составе продукции: в ходе переработки снижается содержание белка, биологически активных компонентов, балластных веществ, чрезмерно повышается калорийность, увеличивается содержание контаминантов.

Рост численности населения, нерациональное использование природных ресурсов, увеличение загрязненности среды обитания человека ставит в XXI веке глобальную проблему перед человечеством -обеспечение населения Земли полноценными и безопасными продуктами, удовлетворяющими физилогические потребности и повышающие пищевую плотность рациона в целом.

Современный период развития нашей цивилизации характеризуется возрастающей интенсификацией техногенного фактора - широкое применение ксенобиотиков, включая химикотерапевтические препараты, воздействие физических и биологических факторов, локальные и глобальные экологические катастрофы - все это приводит к значительным микроэкологическим нарушениям в человеческом организме, которые вызывают серьезные последствия как для отдельные индивидумов, так и для общества в целом. Без уделения должного внимания этой проблеме прогнозируется физиологическая, биологическая и интеллектуальная деградация населения.

В силу сложившихся реалий возникла потребность в новой стратегии решения мировой продовольственной программы, базирующейся на использовании достижений современной биотехнологии, генной инженерии, высоких технологиях переработки растительного и животного сырья, теории адекватного питания, фармаконутрициологии.

Большой теоретический и практический вклад в решение данной проблемы внесли ученые отечественных школ прикладной биотехнологии, биохимии и нутрициологии, представленных учеными: A.M. Бражниковым, О.В. Большаковым, К.К. Горбатовой, Г.Н. Крусь, H.H. Липатовым (ст.), H.H. Липатовым (мл.), И.А. Радаевой, И. А. Роговым, Э.С. Токаевым, В.Д. Харитоновым, A.M. Шалыгиной, В.П. Шидловской; А. А. Клесовым, Г.С. Комоловой, Н.П. Мертвецовым, Л.Н. Остерманом; М.Н. Волгаревым, В.И. Покровским, В.А. Тутельяном и др., а также зарубежными: D. Dupont, С. Grosclaude, F. Kosikowski, F. Glover, M.D. Bond, F.S. Lee, H.Maes, J.F. Riordan D.J. Strydom, B.L. Yallee, et. al.

Рассматривая производство пищи в фундаментальном его понимании, прежде всего подразумевают хлеб, мясо и молоко. Молоку при этом отводят особую роль. Это объясняется тем, что белки, жиры и углеводы молока уникальны и соответствуют физиологическим потребностям организма человека от рождения до глубокой старости. Кроме того без молока и молочных продуктов невозможно адекватное и сбалансированное питание. В настоящее время молоко еще расценивается как защитное средство от неблагоприятных воздействий загрязненной окружающей среды и источник получения биологически активных веществ (БAB).

В мире сформировалось новое направление пищевого производства -производство и использование биологически активных добавок (БАД) в функциональных продуктах питания.

Разработка БАД к пище производится по трем основным направлениям:

• биологически активные добавки к пище, применяемые для коррекции химического состава пищи человека;

• биологогически активные добавки к пище, в состав которых входят живые микроорганизмы и (или) их метаболиты, оказывающие нормализующее воздействие на состав и биологическую активность микрофлоры пищеварительного тракта; 6

• биологически активные добавки к пище, применяемые для профилактики,-вспомогательной-терапии и поддержки-в физиологических границах функциональной активности органов и систем.

Одним из приоритетных направлений развития отечественной отраслевой науки является разработка на базе современных достижений науки и техники принципиально новых, оригинальных процессов и технологий, среди которых важное место занимает разработка теоретических и практических основ фракционирования компонентов молока. Актуальность проблемы фракционирования состоит в том, что оно позволяет получать принципиально новые продукты различного функционального назначения, в том числе продукты, обладающие направленным действием.

В связи с этим представляет научный и практический интерес разработка научных основ получения из молочного сырья биологически активного вещества ангиогенина, обладающего полифункциональными свойствами.

Данная научная проблема отвечает требованиям современной науки о молоке и молочных продуктах в фундаментальном и прикладном ракурсах и имеет непосредственную связь с проблемами, сформулированными в «Концепции государственной политики в области здорового питания населения Российской Федерации до 2005 года», одобренной постановлением Правительства РФ № 917 от 10 августа 1998г.