автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.04, диссертация на тему:Исследование молокосвертывающего фермента из сычугов северных оленей

На правах рукописи

ЕЛЬЧАНИНОВ ВАДИМ ВАЛЕНТИНОВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛОКОСВЕРТЫВАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА ИЗ СЫЧУГОВ СЕВЕРНЫХ ОЛЕНЕЙ

Специальность 05.18.04 - технология мясных, молочных, рыбных продуктов и холодильных производств

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Кемерово 2005

Работа выполнена в ГНУ Сибирский научно-исследовательский институт сыроделия Сибирского отделения Российской Академии сельскохозяйственных наук.

Научный руководитель:

• доктор технических наук, профессор М.С. Уманский

Официальныеоппоненты:

- доктор технических наук, М.П. Щетинин

- кандидат технических наук, Е.А. Николаева

Ведущее предприятие:

ООО "Экспериментальный сыродельный завод", г. Барнаул

Защита диссертации состоится « 24 » января 2006 года в <14 часов на заседании диссертационного совета Д212.089.01 при Кемеровском технологическом институте пищевой промышленности по адресу: 650056, г. Кемерово-56, бульвар Строителей, 47.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Кемеровского технологического института пищевой промышленности.

Автореферат разослан декабря 2005 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат технических наук, профессор

Н.Н. Потипаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Прогаводство сыра - наиболее важная сфера использования молока во всех странах мира. Объемы производства сыров ежегодно увеличиваются в соответствии с постоянным повышением спроса на этот продукт. Выработка сыров поглощает около 40% мировых объемов производства молока.

Рост производства сыров неразрывно связан с увеличением выпуска мо-локосвертывающих препаратов. Традиционно, при производстве сыров используются натуральные молокосвертывающие ферментные препараты (МФП), получаемые из сырья животного происхождения. Эти препараты хорошо изучены, апробированы, их применение позволяет вырабатывать сыры самого высокого качества.

Возникшая во второй половине 20 века, в связи с постоянным ростом мирового производства сыров, проблема дефицита сычугов легких телят, а следовательно, и проблема дефицита натурального сычужного фермента, не решена и в настоящее время. В конце 20 столетия, проблема усугубилась, после распространения в ряде европейских стран эпидемии прионовых заболеваний среди сельскохозяйственных животных, являвшихся источниками сырья для производства натуральных МФП. В наши дни российские производители натуральных МФП испытывают нехватку доступного отечественного сырья и вынуждены приобретать его в странах ближнего и дальнего зарубежья.

Очевидно, что решение проблемы дефицита сырья для производства натуральных МФП, должно идти по двум основным направлениям. Во-первых, поиск новых сырьевых источников, во-вторых, внедрение современных технологий, позволяющих интенсифицировать уже существующие производственные схемы.

Необходимость проведения данной работы связана с поисками возможности расширения сырьевой базы производства натуральных МФП, за счет использования нетрадиционных источников.

Вести научные изыскания, не опираясь на предшествующий опыт работы отечественных и зарубежных исследователей, - невозможно. Среди тех кто, по мнению автора, внес наиболее значительный теоретический и практический вклад в исследование натуральных МФП и в разработку проблемы их дефицита - И.П.Бузов, Л.М.Гинодман, В.И.Звягинцев, В.А.Краюшкин, В.К.Неберт, P.F.Fox, M.L.Green, B.Foltmann, D.B.Emmons и другие.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является исследование возможности расширения сырьевой базы натуральных МФП, за счет использования в качестве источника молокосвертывающих ферментов (МФ) сычугов северных оленей (СО). Для достижения этой цели решались следующие основные задачи:

- получение МФ из сычугов северных оленей методом экстракции и последующего осаждения сульфатом аммония; ——__

- оптимизация процедуры высаливания

- получение частично очищенного препарата и исследование его основных физико-химических свойств;

- исследование возможности выделения МФ из технологических жидкостей, остающихся после процедуры высаливания, методом гидрофобной хроматографии;

- исследование основных технологических характеристик МФ из сычугов северных оленей;

- исследование влияния МФ из сычугов северных оленей на процесс производства и качество сыра;

- разработка технологического регламента производства нового МФП.

Научная новизна работы. Научно обоснована возможность расширения

сырьевой базы натуральных МФП за счет использования в качестве источника молокосвертывающих ферментов сычугов северных оленей.

Разработан и оптимизирован метод выделения МФ из замороженных сычугов северных оленей путем его экстракции и последующего осаждения сульфатом аммония. Произведена теоретическая оценка возможности использования сырьевой базы северного оленеводства для производства МФП.

В целях интенсификации получения МФ, разработан и запатентован способ его дополнительного выделения из утилизируемой технологической жидкости методом гидрофобной хроматографии. Предложена оригинальная технологическая схема производства молокосвертывающих ферментных препаратов.

Разработан одностадийный способ частичной очистки МФ из сычугов СО методом ионообменной хроматографии. Изучены основные физико-химические свойства частично очищенного ферментного препарата.

Проведено сравнительное исследование главных технологических характеристик МФ из сычугов северных оленей, сычужного фермента и говяжьего пепсина. Установлено, что МФ из сычугов СО обладает наименьшей абсолютной и относительной протеолитической активностью (ПА), по сравнению с сычужным ферментом и говяжьим пепсином.

В результате производственных испытаний показано, что использование МФ из сычугов СО, обладающего очень низким уровнем неспецифического протеолиза, позволяет вырабатывать сыры с длительным сроком хранения (ре-тардантные, "спящие" сыры) без ухудшения органолептических свойств.

Практическая ценность работы. Разработан комплект нормативно-технической документации на молокосвертывающий ферментный препарат из сычугов северных оленей "Алтай-Север" (ТУ 9219-002-00419710-05).

Апробация работы. Основные положения работы и её результаты были предметом обсуждений на конгрессе «Молочная промышленность Сибири» (Барнаул, 2004), на IV международной научно-практической конференции "Пища, Экология, Качество" (Краснообск, 2004), на УП международной научно-практической конференции "Сельскохозяйственная наука АПК Сибири, Монголии, Казахстана и Кыргызстана" (Улан-Батор, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ и получен патент РФ на полезную модель.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, аналитического обзора, методической части, результатов исследований, выводов, списка литературы и приложений. Работа содержит 120 страниц основного текста, 13 таблиц, 22 рисунка, библиографию объемом 257 наименований, 18 приложений.

МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

Все исследования, связанные с выделением МФ из сычугов СО и изучением его физико-химических и технологических свойств, проводились в лаборатории биохимии СибНИИ сыроделия СО РАСХН. Апробацию молокосвер-тывающего фермента из сычугов СО проводили при выработке сыра "Витязь" в условиях производства на ООО "Экспериментальный сыродельный завод" (г. Барнаул).

Общая схема исследований приведена на рисунке 1. Работа состояла из нескольких последовательных и взаимосвязанных этапов:

-исследование возможности выделения МФ из сычугов СО методом экстракции и последующего высаливания сульфатом аммония, определение суммарного выхода молокосвертывающей активности (МА);

-оптимизация процедуры высаливания МФ из водного экстракта сычугов; -разработка процедуры частичной очистки МФ из сычугов СО и исследование его некоторых физико-химических свойств;

-разработка метода выделения МФ из утилизируемой технологической жидкости;

-исследование технологических параметров МФ из сычугов СО. На всех этапах объектом исследования являлся молокосвертывающий фермент из сычугов северного оленя (Rangifer tarandus).

На заключительном этапе работы проведена производственная апробация молокосвертывающего фермента из сьгчугов северных оленей и изучены физико-химических и органолептических показателей сыров, выработанных с его использованием, подготовлен комплект НТД.

В работе использовались стандартные и модифицированные варианты методов исследования сыров и молокосвертывающих препаратов. Полипептидный состав исследовали методом электрофореза в присутствии додецил-сульфата натрия (SDS-ЭФ) по методу Laemmli. В качестве маркеров молекулярных масс использовали стандартные белковые смеси фирмы "Amersham Biosciences" (Швеция). Для сканирования и математической обработки, полученных элекрофореграмм использовали программу OneDScan ("Scanalytics", США). Хроматографию низкого давления проводили с использованием оборудования, сорбентов и методических рекомендаций фирмы "Amersham Biosciences" (Швеция). Исследование продуктов распада казеина при созревании сыров проводили по фракциям с определением количества азота в каждой фракции методом Кьельдаля в аппарате Kjeltek System фирмы "Tecator" (Швеция).

Рисунок 1 - Схема проведения исследований.

Этапы исследований Изучаемые свойства Контролируемые параметры

Выделение МФ из сычугов. ► Активность, физико-химические свойства. ► МА, удельная МА, полипептидный состав.

Т

Оптимизация параметров выделения. ► Молокосвертывающая активность (МА) ► МА, удельная МА, полипептидный состав.

Т

Частичная очистка препарата. ► Взаимодействие с хроматографическими сорбентами, физико-химических свойства. ► Сорбция-десорбция на ионообменых адсорбентах, удельная МА, полипептидный состав.

▼

Выделение МФ из утилизируемых технологических жидкостей. ► Гидрофобные свойства ► Сорбция-десорбция на гидрофобном адсорбенте, удельная МА, полипептидный состав.

Т

Технологические свойства препарата ► Влияние рН, ионов Са2+, термолабильность, протеолитиче-ская активность. ► МА, удельная МА, полипептидный состав, протеолитическая активность.

Т

Апробация при выработке сыра. ► Основные технологические параметры выработки сыра. ► Физико-химические, биохимические и орга-нолептические показатели сыров.

▼ ▼ Т

Комплект НТД (ТУ и ТИ на молокосвертывающий ферментный препарат из _сычугов северных оленей "Алтай-Север")_

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Выделение молокосвертывающего фермента из сычугов северных оленей.

Потенциальные возможности сырьевой базы северного оленеводства.

В результате использования метода экстракции и осаждения сульфатом аммония получен жидкий препарат с молокосвертывающей активностью 5020±53 условных единиц. Удельная молокосвертывающая активность составила 171±8 условных единиц / А28о- Выход ферментативной (молокосверты-

вающей) активности составил 1,1х106 усл. ед./1 сычуг или 3,7x10е усл. ед./ кг замороженного сырья.

Таким образом, показана возможность получения МФ из замороженных сычугов СО, методом экстракции и последующего высаливания сульфатом аммония (СА).

Исследовано поведение МФ из сычугов СО при различных концентрациях вносимого сульфата аммония. Установлено, что оптимальная концентрация СА для осаждения МФ из экстракта сычугов СО составляет 40% от насыщения. Внесение в экстракт оптимальной концентрации СА, позволяет получить МФ с выходом 96,5%, при удельной МА более 300 усл. ед./ А280.

Теоретические расчеты с использованием полученных в эксперименте данных по выходу МА из замороженного сырья показывают, что организация промышленной переработки сычугов СО позволит вырабатывать от 2,5 до 5,0 т МФП с активностью 150 тыс. усл.ед. в год. Это даст возможность дополнительно получать ежегодно от 22300 до 44600 т. сыра.

Частичная очистка молокосвертывающего фермента из сычугов северных оленей. Некоторые физико-химические характеристики частично очищенного препарата

Разработан одностадийный метод выделения молокосвертывающего фермента из сырого экстракта с использованием DEAE-Sepharose FF (Рис.2).

2,5 -

3

2950 -2450

Рисунок 2 - Фракционирование экстракта сычугов северных оленей на ОЕАЕ верЬагозе РИ.

2 -

1950 <§

Стрелками и цифрами указаны различные этапы фракционирования: 1 - нанесение образца; 2 - начало элю-ции стартовым буфером; 3 -начало элюции стартовым

буфером + 0,3 М NaCl; 4 -

начало элюции стартовым

буфером + 1,0 М NaC!. -о-о- - Аио

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 Номера фракций

- Молокосвертываю-щая активность (МА), усл.ед. -Л-Д- - Удельная молокос-вертывающая активность, (МА/А28о), усл.ед./Агм-

Условия фракционирования подобраны таким образом, что, в процессе нанесения образца, и последующей промывки колонки, происходит значите ль-

ное удаление контаминант, не обладающих ферментативной активностью. Фермент элюируется одним узким пиком при внесении в стартовый буфер 1,0М №С1. Удельная МА в процессе выделения увеличилась с 175,2 усл.ед./А28о до 2081,3 усл.ед./А28о, таким образом, степень очистки составила -11,9 раза.

В процессе очистки, удаляются все балластные белки с ММ больше 43 кДа, а также основные контаминанты с ММ от 17 кДа и ниже (Рис.3).

Рисунок 3 - Исследование полипептадно-го состава молокосвертывающего фермента из сычугов северных оленей, на разных этапах очистки.

Результаты ЭРЗ-электрофореза. Номерами обозначены треки образцов: 1 - МФ, полученный методом высаливания сульфатом аммония; 2,3 - маркеры молекулярных масс; 4 - МФ, полученный методом частичной очистки на ОЕАЕ ЗерЬа-гове БР. Сплошными стрелками обозначены молекулярные массы маркеров. Пунктирными стрелками обозначены компоненты МФ с молекулярными массами ~ 37 кДа

Увеличение относительного содержания полипептидного компонента с ММ около 37 кДа (в 11,8 раза) сопровождается нарастанием удельной МА (в 11,9 раза). Коэффициент корреляции, г=0,84, на высоком уровне значимости (Р<0,01) свидетельствует о значительной положительной связи двух параметров. Это позволяет предполагать, что компонент с ММ около 37кДа соответствует молокосвертывающему ферменту сычуга СО.

Протеолитическую активность частично очищенного препарата исследовали методом БОБ-электрофореза (Табл. 1).

Таблица I - Исследование протеолитической активности частично очищенного МФ из сычугов СО, методом БОв-электрофореза.

Препарат, время инкубации Относительное соде ржание основных фракций казеина (%)(М±т)

аз- казеин Р- казеин к- казеин Продукты гидролиза с ММ-28 и -26 кДа Пара-к-казеин, ММ ~16кДа Продукты гидролиза с ММ -ЮкДа

Контроль 40,1 ±0,4 43,8±0,5 8,6±0,3 - - 5,6±0,1

0 мин 37,3±0,3 42,4±0,4 - 1,6±0,1 9,1±0,1 7,0±0,2

180 мин 8,8±0,1 25,5±0,3 - 16,8±0,2 15,9±0,2 19,3±0,3

При длительной инкубации, МФ из сычугов СО гидролизует все основные группы казеинов, однако протеолитическое действие на as-казеин и р-казеин проявляется по-разному.

Результаты проведенного исследования позволяют сделать вывод о том, что протеолитическая активность частично очищенного МФ, при температуре 35°С и рН 5,6 по отношению к основным группам казеинов убывает в ряду: к-казеин, as-казеин, р-казеин.

Выделение молокосвертывающего фермента из утилизируемой

технологической жидкости методом гидрофобной хроматографии

Технологические жидкости (супернатанты), остающиеся после высаливания и осаждения МФ, не подлежат вторичной переработке и утилизируются. Поскольку соль никогда не осаждает белок полностью, а только снижает его растворимость, какое-то количество белка всегда остается в растворе и теряется при утилизации. Объемы утилизируемых жидкостей на крупных предприятиях составляют до 500 тонн в год. В связи с этим, исследована возможность выделения МФ из утилизируемых технологических жидкостей.

Схема выделения МФ из утилизируемой технологической жидкости методом гидрофобной хроматографии на Phenyl Sepharose CL-4B представлена на рисунке 4.

ю

850

Рисунок 4 - Фракционирование супернатанта, после осаждения молокосвертывающего фермента сульфатом аммония, на Phenyl Sepharose CL-4B.

о

оо -

з5

. 550 Стрелками и цифрами указаны

о различные этапы фракциониро-

. 450 ^ вания: 1 - нанесение образца; 2

< - начало элюции стартовым бу-

- 350 фером + 1,0М (ИН^О.,; 3 - на-

^ чало элюции 5 мМ Ка-Ацетат-

■ 250 ным буфером (рН=5,6); 4 - на-

чало элюции дистиллированной

водой.

-о-о- - Агво

-■-■- - Молокосвертывающая

-■-■- - Молокосвертывающая активность (МА), усл.ед. -Д-Д- - Удельная молокосвер-

1 3 5 7 9 11 13 15 17192123 2527 Номера фракций

тывающая

(МА/А28о), усл.ед./А28о.

активность,

После нанесения супернатанта, не проявлявшего МА, и промывки колонки промежуточным буфером, удаляли 94% балластных белков. Основную часть фермента десорбировали элюирующим буфером и, после того как МА элюата

снижалась до нуля, промывали колонку дистиллированной водой. При этом элюировался минорный белковый пик, обладающий высокой удельной активностью. Ферментативные активности элюируемые 5 мМ Na-ацетатным буфером и дистиллированной водой соотносятся как 18:1. Характер десобции МФ с Phenyl Sepharose CL-4B растворами с низкой ионной силой свидетельствует о гетерогенности МФ, причем минорный компонент является более гидрофобным. Суммарный объем активных фракций составлял 17,5% от объема нанесенного образца. Средняя удельная МА полученного препарата составила 555 усл. ед./А280.

Суммарные выходы МА для МФ из сычугов СО, в пересчете на 1 литр супернатанта, составили 30125 усл. ед.. Таким образом, переработка, с использованием метода ГФХ, 500 тонн утилизируемых отходов производства МФ из сычугов СО, позволила бы получить дополнительно около 100 кг МФП с активностью 150000 условных единиц.

Основные фракции конечного хроматографического профиля исследовали методом SDS-ЭФ. Установлено, что сорбируемые Phenyl Sepharose CL-4B белки, являются минорными, их полосы не видны на исходном препарате. Элюируемая водой фракция - наименее гетерогенна по белковому составу, именно этим, вероятно, объясняется ее высокая удельная МА.

В результате проведенного исследования показано, что остающийся в утилизируемой технологической жидкости молокосвертывающий фермент, может быть выделен методом гидрофобной хроматографии на Phenyl Sepharose CL-4B. Подобраны условия, при которых основная часть балластных белков не связывается с гидрофобными лигандами сорбента и удаляется при нанесении образца и промывке.

Блок-схема технологического процесса получения молокосвертывающего ферментного препарата из сычугов северных оленей

Блок-схема процесса получения молокосвертывающего ферментного препарата из сычугов северных оленей, выполненная с учетом результатов, полученных в ходе проведенной работы, представлена на рисунке 5.

Отличительной чертой данной блок-схемы является включение в нее колонки, заполненной гидрофобным сорбентом - Phenyl Sepharose CL-4B, - для выделения из супернатанта, остающегося в нем после высаливания молокосвертывающего фермента. Предлагаемая линия производства молокосвертывающего ферментного препарата позволяет повысить выход готового продукта, за счет дополнительного получения МФ из утилизируемой технологической жидкости методом гидрофобной хроматографии.

Данная технологическая схема может применяться на специализированных предприятиях по переработке сырья животного происхождения. В качестве сырья возможно использование сычугов не только северных оленей, но и других с/х животных.

Рисунок 5 - Блок-схема технологической линии по производству жидкого мо-локосвертывающего ферментного препарата из сычугов северных оленей.

Сырье. Размороженные и промытые сычуги северных оленей

/

/ о <1

На утилизацию

Жидкий молокосвертывающий ферментный препарат из сычугов северных оленей

Условные обозначения: 1-гомогенизатор сырья, 2-экстракционная емкость, 3-резервуар для высаливания МФ из экстракта, 4-осадок МФ, 5-супернатант после осаждения МФ, 6-колонка с гидрофобным сорбентом (Phenyl Sepharose CL-4B), 7-источник элюирующих и регенерирующих буфере» для гидрофобного сорбента, 8-проэкстрагированные сычуги, 9-емкость для разведения и формулирования жидкого препарата.

Основные технологические характеристики молокосвертывающего фермента из сычугов северных оленей

Для исследования основных технологических характеристик был использован жидкий препарат МФ из сычугов СО, полученный методом экстракции и осажденния сульфатом аммония. Параллельно исследовали отраслевой контрольный образец сычужного фермента (ОКО СФ) и коммерческий препарат говяжьего пепсина (ГП).

Чувствительность к действию денатурирующего агента. Показано,что по сравнению с химозином, МФ из сычугов СО высоко толерантен к действию мочевины и по этому критерию его следует отнести к пепсину.

Влияние конечной концентрации вносимого молокосвертывающего препарата на продолжительность свертывания молока. Установлено, что в диапазоне концентраций от 0,5% до 4%, все исследованные ферменты подчиняются закону Шторка и Зегелке, причем МФ из сычугов СО, проявляет большее сходство с говяжьим пепсином, нежели с сычужным ферментом.

Зависимость молокосвертывающей активности от концентрации хлористого кальция. По сравнению с ОКО СФ, ГП и МФ из сычугов СО, отличаются одинаковой и более высокой чувствительностью к увеличению концентрации ионов кальция.

Зависимость молокосвертывающей активности от рН молока. МФ из сычугов СО высокоактивен при рН молока в диапазоне 6,1-6,7 и быстро теряет активность при рН>6,7. Таким образом, для МФ из сычугов СО значение рН=6,7 является границей оптимума, за пределами которого молокосверты-вающая активность фермента резко снижается. Этим он отличается от ГП и ОКО СФ, снижение МА которых происходит одинаково плавно во всем исследованном диапазоне рН.

Термостабильность. Термостабильность исследуемых препаратов снижается в ряду: говяжий пепсин, ОКО СФ, МФ из сычугов СО. Молокосверты-вающий фермент из сычугов СО стабилен в интервале температур 30-50°С и быстро инакгивируется при 55°С и выше. В большей степени процесс термоинактивации МФ из сычугов СО сходен с таковым для ОКО СФ.

Ферментативная стабильность. Показано, что ионы кальция играют важную роль в сохранении ферментативной активности исследуемого препарата. Очевидна необходимость введения Са2+ в жидкие препараты МФ из сычугов СО для их стабилизации при продолжительном хранении.

Протеолитическая активность. Накопление в фермент-субстратной смеси низкомолекулярных, ТХУ-растворимых продуктов гидролиза, отражает уровень неспецифического протеолиза, - способность гидролизовать не только связь 105 (Phe) - 106 (Met) в молекуле к-казеина, но и другие пептидные связи. Низкий уровень неспецифического протеолиза является важной технологической характеристикой МФП, так как, позволяет избежать потерь белка с сывороткой и образования пороков вкуса при созревании сыра.

Абсолютная протеолитическая активность МФ из сычугов СО оказалась ниже активности, исследуемого в качестве контроля, ОКО СФ (Рис.6)

Рисунок 6 - Абсолютная протео-литическая активность (Агво) ОКО СФ, говяжьего пепсина, МФ из сычугов СО.

Обозначения:

-о-о- - Молокосвертывающий фермент из сычугов северных оленей

-■-■- - Сычужный фермент (ОКО СФ)

- А-А- - Говяжий пепсин

Поскольку МА исследуемых МФП, имели близкие значения, то и относительная (удельная) протеолитическая активность МФ из сычугов СО, оказалась в 4,3 раза ниже, чем у ОКО СФ (Табл. 2)

Таблица 2 - Относительная протеолитическая активность МФП.

Молокосвертывающий препарат Молокосвертывающая активность вносимого в рабочую смесь препарата (усл.ед.) (М±т) Относительная протеолитическая активность, (А28о/усл.ед.МА) xl0"s (M±m)

МФ из сычугов СО 1670±12 1,44±0,02

ОКОСФ 1600±10 6,25±0,33

Пепсин говяжий 1570±12 20,38±0,51

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что МФ из сычугов СО обладает более высокой специфичностью по отношению к пептидной связи 105 (Phe) - 106 (Met) в молекуле к-казеина, чем ОКО СФ.

Испытание молокосвертывающего фермента из сычугов северных оленей

при выработке сыра

После завершения стадии лабораторных исследований МФ из сычугов СО был испытан при выработке сыров в условиях производства.

Для выработки опытных сыров использовали жидкий препарат МФ из сычугов СО активностью 5000±100 условных единиц (усл.ед.). В качестве контроля использовали молокосвертывающий препарат ВНИИМС СГ-50, производства ОАО "МЗСФ", активностью 155000±10000 усл. ед., применяемый на этом предприятии для выработки сыров с низкой температурой второго нагревания.

Химико-технологические показатели, на стадии выработки контрольных и опытных сыров различались незначительно. При исследовании азотистых фракций (Табл.3) установлено, что интенсивность протеолитических процессов

6 60 120 180 Время (минуты)

в контрольных сырах была выше, - это, вероятно, и явилось причиной заметного ухудшения их органолептических показателей после двух месяцев созревания. Относительное содержание азотистых фракций, которые в опытных сырах 5-ти месячного возраста, были примерно такими же, как и в контрольных после двух месяцев созревания, свидетельствуют о различной скорости протеолиза.

Таблица 3 - Содержание азотистых фракций в контрольных (ВНИИМС СГ-50) и опытных (МФ из сычугов СО) сырах.

Наименование вариантов Азотистые фракции, % от общего азота

Растворимый азот Азот растворимых белков Небелковый азот Азот полипептидов Азот аминокислот, амидов и аммиака

Контроль

Сыр после прессования 7,04 1,41 5,63 1,41 4,22

Сыр, 60 дней 25,9 17,54 8,36 3,05 5,31

Сыр, 150 дней - - - - -

Опыт

Сыр после прессования 6,94 1,39 5,56 1,39 4,17

Сыр, 60 дней 15,25 5,54 9,70 4,16 5,54

Сыр, 150 дней 24,11 12,07 12,07 2,68 9,39

Динамика изменения кислотности сырной массы, в процессе созревания сыров позволяет сделать вывод о том, что процесс накопления щелочных продуктов протеолиза в опытных сырах происходил менее интенсивно (Рис. 7).

А

Рисунок 7 - Изменение кислотности сырной массы в процессе созревания контрольных и опытных сыров.

Обозначения:

-■-■-- Контроль, ВНИИМС СГ-50 (через 90 суток контрольные сыры сняты с эксперимента); -о-о- - Опыт, молокосвертывающий фермент из сычугов северных оленей.

Продолжительность созревания, сутки

Такие изменения кислотности в экспериментальных сырах могут быть связаны со спецификой протеолитических процессов, когда медленное накоп-

ление щелочных продуктов протеолиза приводит к плавному снижению кислотности сырной массы.

Сравнительное исследование полипептидного состава показало, что качественный спектр продуктов гидролиза в контрольных и опытных сырах идентичен. Это может быть свидетельством того, что различные МФ атакуют одни и те же участки полипептидных цепей казеинов (Рис.8). Количественный полипептидный состав контрольных и опытных сыров - различен. Контрольные сыры содержат в 4,0 раза больше полипептидов с ММ ~21-24 кДа, в 4,2 раза больше компонентов с ММ ~ 18 кДа и в 1,7 раза больше низкомолекулярных полипептидов (ММ ~ 11-14 кДа), чем сыры, выработанные с МФ из сычугов СО.

Рисунок 8 - Полипептидный состав контрольных (ВНИ-ИМС СГ-50) и опытных (МФ из сычугов СО) сыров, после 2 месяцев созревания.

Результаты ЗОЭ-электрофо-реза. Номерами обозначены треки образцов: 1 - контрольный сыр (ВНИИМС СГ-50); 2,4 - маркеры молекулярных масс; 3 - опытный сыр (МФ из сычугов СО). Стрелками обозначены молекулярные массы маркеров, отдельные фракции казеинов и продукты из гидролиза.

Результаты органолепгической оценки сыров представлены в таблице 4. Через 30 суток созревания, опытные сыры уступали контрольным по органо-лептическим показателям и имели менее выраженный вкус и аромат, более плотную консистенцию.

По истечении 60 суток с момента выработки, в опытных сырах, отмечено улучшение вкусовых и ароматических показателей и появление специфического пикантного привкуса. Опытные сыры характеризовались более нежной и пластичной консистенцией. Через два месяца созревания сыры, выработанные с МФ из сычугов СО, превосходили контрольные в среднем на 3,5 балла.

После 150-ти суток созревания, опытные сыры отличались выраженным, с легкой остротой, пикантным вкусом и ароматом, в то время как контрольные сыры через 3 месяца были сняты с эксперимента ввиду резкого ухудшения ор-ганолептаческих показателей, связанных с их перезреванием.

По прошествии 1 года (368 суток) с момента выработки опытные сыры приобрели выраженный, с богатой гаммой оттенков вкус и аромат, хорошую консистенцию. Общая оценка - 97,0 баллов.

12 3 4

Си-казеин

ММ~27кДа

Пара-К-казеин ММ~14кД —

^Ц ^¡И

94,0 67,0

43,0

30.0

20.1

14,4 кДа

Таблица 4 - Органолептическая оценка зрелых сыров, в баллах.

Показатели Варианты сыров

Опыт Контроль

30 дней 60 дней 150 дней 30 дней 60 дней 150 дней

Вкус и запах 39,0 41,5 42,5 41,0 39,0 -

Консистенция 23,0 24,0 24,0 24,0 23,0 -

Рисунок 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 -

Цвет и упаковка 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 -

Общий балл 92,0 95,5 96,5 95,0 92,0 -

Таким образом, производственная апробация МФ из сычугов СО подтвердила результаты лабораторных исследований и свидетельствует о том, что органолептические показатели сыров с низкой температурой второго нагревания в значительной степени зависят от уровня неспецифического протеолиза используемых ферментных препаратов. Динамика изменения основных физико-химических и биохимических показателей опытных сыров после 5 месяцев созревания показала, что использование МФ из сычугов СО, обладающего низким уровнем неспецифического протеолиза, позволяет вырабатывать сыры с длительным сроком хранения без ухудшения органолептических свойств.

ВЫВОДЫ:

1. Из сычугов СО, получен жидкий МФП с активностью 5000 усл.ед. Выход составил 1,1х106 усл. ед./1 сычуг. Экстраполирование полученных данных на сырьевые возможности северного оленеводства показывает, что промышленная переработка сычугов СО позволит вырабатывать от 2,5 до 5,0 тонн МФП с активностью 150 тыс. усл. ед. Это даст возможность дополнительно получать ежегодно от 22300 до 44600 т. сыра.

2. Оптимальная концентрация СА для осаждения молокосвертывающего фермента из экстракта сычугов СО составляет 40% от насыщения. Внесение в экстракт оптимальной концентрации соли позволяет вдвое сократить её расход и получить МФ с выходом 96,5%, при удельной МА более 300 усл. ед./ A2so-

3. При ионообменной хроматографии, МФ из сычугов СО ведет себя как кислый белок, с изоэлектрической точкой в диапазоне рН равном 4,6 - 5,6. Молекулярная масса основного полипептидного компонента частично очищенного препарата, составляет примерно 37 кДа. Протеолитическая активность МФ, убывает в ряду: к-казеин, as-казеин, р-казеин. Существует высокая положительная корреляция (г=0,84, Р<0,01) между относительным содержанием полипептидного компонента с ММ около 37 к Да и удельной МА препарата.

4. Разработан метод дополнительного выделения молокосвертывающего фермента из утилизируемой технологической жидкости на гидрофобном сорбенте - Phenyl Sepharose CL-4B. По результатам проведенных исследований получен патент Российской Федерации на полезную модель: "Линия производства молокосвертывающего ферментного препарата".

5. По основным технологическим свойствам МФ из сычугов СО, занимает промежуточное положение между СФ и ГП. Отличительной характеристикой МФ из сычугов СО, является меньшая, чем у СФ абсолютная и относительная ПА, что свидетельствует о его высокой специфичности.

6. Производственная апробация МФ из сычугов СО подтвердила результаты лабораторных исследований. Показано, что использование МФ из сычугов СО, обладающего очень низким уровнем неспецифического протеолиза, позволяет вырабатывать сыры с длительным сроком хранения без ухудшения орга-нолептических свойств.

7. Разработан комплект нормативно-технической документации на МФП из сычугов СО - "Алтай-Север" (ТУ 9219-002-00419710-05 и ТИ).

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Ельчанинов, В.В. Молокосвертывающий фермент га сычугов северного оленя. 2. Частичная очистка методом ионообменной хроматографии / В.В. Ельчанинов // Сыроделие и маслоделие.- 2005.- №6.- С. 26-28.

2. Ельчанинов, В.В. Молокосвертывающий фермент из сычугов северного оленя / В.В. Ельчанинов, М.С. Уманский, А.Н. Белов, А.Д. Коваль, В.Г. Шелепов // Сыроделие и маслоделие.- 2005.- №4.- С.13-16.

3. Ельчанинов, В.В. Выделение молокосвертывающих ферментов из утилизируемых технологических жидкостей методом гидрофобной хроматографии / В.В. Ельчанинов, А.Н. Белов, А.Д. Коваль, М.С. Уманский // Современные проблемы техники и технологии переработки молока: сборник научных трудов с международным участием. - Барнаул, 2005.- С. 122-129.

4. Ельчанинов, В.В. Основные технологические характеристики молокос-вертывающего фермента из сычугов северного оленя / В.В. Ельчанинов, А.Н. Белов, А.Д. Коваль, М.С. Уманский // Современные проблемы техники и технологии переработки молока: сборник научных трудов с международным участием. - Барнаул, 2005.- С.130-141.

5. Ельчанинов, В.В. Испытание молокосвертывающего фермента из сычугов северного оленя при выработке сыра / В.В. Ельчанинов, А.Н. Белов, М.С. Уманский, А.Д. Коваль, Е.А. Авданина, В.П. Вистовская, A.B. Кригер // Современные проблемы техники и технологии переработки молока: сборник научных трудов с международным участием. - Барнаул, 2005,- С.149-159.

6. Патент на полезную модель № 48 710. Российская Федерация, МПК7 А 23 С 19/032. Линия производства молокосвертывающего ферментного препарата/ Ельчанинов В.В., Белов А.Н., Коваль А.Д., Уманский М.С.; авторы являются заявителями и патентообладателями - № 2005109079/22; заявл. 29.03.2005. опубл.10.11.2005, Бюл. № 31.- 2 с.

7. Ельчанинов, В.В. Выделение молокосвертывающего фермента из сычугов северного оленя (Rangifer tarandus) / В.В. Ельчанинов, А.Н. Белов, А.Д. Коваль, М.С. Уманский, В.Г. Шелепов // Современные проблемы техники и технологии переработки молока: сборник научных трудов с международным участием. - Барнаул, 2005,- С.106-114.

8. Белов, A.H. К вопросу о роли молокосвертывающих ферментных препаратов в процессах, связанных с производством и созреванием сыра / А.Н. Белов, А.Д. Коваль, В.В. Ельчанинов // Современные проблемы техники и технологии переработки молока: сборник научных трудов с международным участием. - Барнаул, 2005,- С. 141-149.

9. Белов, А.Н. Особенности гидролиза казеина некоторыми молокосвер-тывающими препаратами / А.Н. Белов, В.В. Ельчанинов, А.Д. Коваль // Сельскохозяйственная наука АПК Сибири, Монголии, Казахстана и Кыргызстана: труды 7-й Международной научно-практической конференции (Улан-Батор, 1923 июля 2004 г.).- Улан-Батор,- 2004.- С. 511-515.

10. Коваль, А.Д. Исследование продуктов протеолиза в сырах методом SDS-электрофореза / А.Д. Коваль, В.В. Ельчанинов, А.Н. Белов // Пища. Экология. Качество: Труды IV международной научно-практической конференции (Краснообск, 23-24 сентября 2004 г.).- Новосибирск 2004.- С. 388-391.

11. Белов, А.Н. Влияние некоторых молокосвертывающих препаратов на протеолиз казеина / А.Н. Белов, В.В. Ельчанинов, А.Д. Коваль // Молочная промышленность Сибири: сборник материалов IV специализированного конгресса (г. Барнаул, 26-27 октября, 2004 г.).- Барнаул.- 2004.- С. 19-22.

Подписано в печать 14.12.2005 г. Формат 60x84 1/16 Печать - ризография. Усл.пл. 1,16 Тираж 100 экз. Заказ 2005 - 4кб

Отпечатано в типографии АлтГТУ . 656038, г. Барнаул, пр-т Ленина, 46 Лицензия на полиграфическую деятельность ПЛД № 28-35 от 15.07.1997 г.

Введение.

1. Аналитический обзор.

1.1. Химозин и пепсин — основные молокосвертывающие ферменты.

1.1.1. Терминология.

1.1.2. Номенклатура, структура, физико-химические и технологические свойства химозина и пепсина.

1.2. Проблема дефицита сырья для производства натуральных молоко-свертывающих ферментов.

1.3. Молокосвертывающие ферментные препараты животного происхождения: краткий обзор рынка и перспективные разработки.

1.3.1. Отечественные препараты сычужного фермента и говяжьего пепсина.

1.3.2. Импортные препараты животного происхождения.

1.3.3. Генноинженерные препараты химозина.

1.3.4. Перспективные генноинженерные препараты.

1.4. Современные технологические схемы получения коммерческих мо-локосвертывающих препаратов животного происхождения.

1.4.1. Технологии получения натуральных препаратов.

1.4.2. Технология получения рекомбинантных препаратов.

1.5. Основные физико-химические методы выделения и очистки молокосвертывающих ферментов.

1.5.1. Осаждение белков методом высаливания.

1.5.2. Ионообменная хроматография.

1.5.3. Гидрофобная хроматография.

1.6. Северные олени как потенциальный источник молокосвертывающих ферментов.

1.6.1. Краткое описание вида.

1.6.2. Численность популяции северных оленей в России и в мире.

1.6.3. Первичная обработка оленины и средний выход сычугов.

1.6.4. Потенциальные возможности сырьевой базы северного оленеводства. Теоретические расчеты.

Производство сыра - наиболее важная сфера использования молока во всех странах мира. Объемы производства сыров ежегодно увеличиваются в соответствии с постоянным повышением спроса на этот продукт. Анализ мировых и Российских показателей за период с 1998 по 2004 год подтверждает долгосрочную тенденцию увеличения объемов выработки сыров [36,33]. Даже при быстрых темпах роста производства свежих молочных продуктов, сыр поглощает около 40% мировых объемов производства молока [36].

Увеличение объемов производства сыров неразрывно связано с увеличением выпуска молокосвертывающих препаратов. Традиционно, при производстве сыров используются натуральные молокосвертывающие ферментные препараты (МФГТ), получаемые из сырья животного происхождения. Наиболее широко в сыроделии применяются препараты сычужного фермента (химозина), говяжьего пепсина и их смесевые композиции. Эти препараты хорошо изучены, апробированы, их использование позволяет вырабатывать сыры самого высокого качества [2]. Сырьем для производства сычужного фермента служат сычуги телят-молокопоек (легких телят), ягнят и козлят. Препараты пепсина получают из желудков взрослых коров, свиней и других сельскохозяйственных животных [41].

Однако, возникшая во второй половине 20 века, в связи с постоянным ростом мирового производства сыров, проблема дефицита сычугов легких телят (а следовательно, и проблема дефицита натурального сычужного фермента), не решена и в настоящее время [7,56,116,190]. В конце 20 столетия, проблема усугубилась, после распространения в ряде европейских стран эпидемии прионовых заболеваний среди сельскохозяйственных животных, являвшихся источниками сырья для производства натуральных МФП [60,77,134,150,197].

Альтернативой натуральным МФП в течение последних 15 лет являются препараты химозина, полученные методами генной инженерии с использованием рекомбинантных ДНК [95,166,226,244]. Однако, широкому использованию рекомбинантных химозинов, препятствует невозможность оценки отдаленных последствий использования рекомбинантных белков, а также ряд вопросов технологического, этического и экономического характера [57,106,110,206,222].

В наши дни российские производители натуральных МФП (прежде всего химозина) испытывают нехватку доступного отечественного сырья и вынуждены приобретать его в странах ближнего и дальнего зарубежья (Республика Беларусь, Украина, Польша).

Очевидно, что решение проблемы дефицита сырья для производства натуральных МФП, должно идти по двум основным направлениям. Во-первых, поиск новых сырьевых источников, во-вторых, внедрение современных технологий, позволяющих интенсифицировать уже существующие производственные схемы.

Цель настоящей работы - исследование возможности расширения сырьевой базы производства натуральных МФП, за счет использования нетрадиционных источников, одним из которых являются сычуги северных оленей.

Вести научные изыскания, не опираясь на предшествующий опыт работы отечественных и зарубежных исследователей, невозможно. Среди тех, кто, по мнению автора, внес наиболее значительный теоретический и практический вклад в исследование натуральных МФП и в разработку проблемы их дефицита - И.П.Бузов, Л.М.Гинодман, А.В.Гудков, В.И.Звягинцев, В.К.Неберт, В.А.Краюшкин, P.F.Fox, M.L.Green, B.Foltmann, D.B.Emmons и другие.

Формально, о результатах проведенной работы можно сказать следующее. Методом экстракции и последующего осаждения, из сычугов СО выделен молокосвертывающий фермент и изучены его основные физико-химические свойства. Исследована ферментативная стабильность жидкого препарата и влияние на этот параметр ионов кальция. Экстраполяция данных по выходу ферментативной активности, на сырьевые возможности северного оленеводства показывает, что организация промышленной переработки сычугов СО, позволит вырабатывать дополнительно от 2,5 до 5 тонн МФП с активностью 150 тысяч условных единиц. Такое количество МФП даст возможность получать ежегодно от 22300 до 44600 тонн сыра.

Большое внимание уделено различным технологическим аспектам выделения МФ из сычугов СО. Исследована эффективность процедуры высаливания МФ в зависимости от концентрации сульфата аммония. Определена концентрация СА, которая позволяет получать препараты МФ с высокой удельной активностью и выходом, близким к максимальному. Разработана одностадийная хроматографическая процедура выделения МФ из экстракта сычугов. В целях повышения эффективности технологии производства препарата, разработан метод дополнительного выделения МФ из утилизируемой технологической жидкости с использованием гидрофобного хроматографического сорбента. Результатом этого этапа работы стала оригинальная технологическая блок-схема производства МФП из сычугов СО. По итогам работ с применением метода гидрофобной хроматографии подана заявка (Регистрационный № 2005109079 от 29.03.2005) на выдачу патента Российской Федерации на полезную модель: "Линия производства молокосвертывающего ферментного препарата".

Проведено сравнительное исследование основных технологических свойств МФ из сычугов СО, телячьего сычужного фермента и говяжьего пепсина. Показано, что по ряду характеристик, - подчинению закону Шторка и Зе-гелке, зависимости МА от концентрации ионов кальция и рН, по устойчивости к действию мочевины — МФ из сычугов СО в большей степени похож на говяжий пепсин, чем на сычужный фермент. По терморезистентности МФ из сычугов СО уступает ГП и ОКО СФ, и является, таким образом, наименее термостабильным. Отличительной характеристикой МФ из сычугов СО, представляющей наибольший интерес, является низкая абсолютная и относительная ПА, что свидетельствует о его высокой специфичности.

Логичным завершением лабораторных исследований стала производственная апробация МФ из сычугов СО. В динамике исследованы основные физико-химические и органолептические показатели экспериментальных сыров. Показано что использование МФ из сычугов СО, обладающего очень низким уровнем неспецифического протеолиза, позволяет вырабатывать сыры с длительным сроком хранения без ухудшения органолептических свойств.

Диссертация содержит 120 страниц основного текста, 13 таблиц, 22 иллюстрации, библиографию объемом 257 наименований, 18 приложений. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ и получен патент РФ на полезную модель.

ВЫВОДЫ:

1. Из сычугов СО, методом экстракции и осаждения сульфатом аммония получен жидкий МФ с молокосвертывающей активностью 5000 усл.ед. Выход ферментативной активности составил 1,1x106 усл. ед./1 сычуг. Экстраполирование полученных данных на сырьевые возможности северного оленеводства показывает, что промышленная переработка сычугов СО позволит вырабатывать от 2,5 до 5,0 тонн МФП с активностью 150 тыс. усл. ед. Это даст возможность дополнительно получать ежегодно от 22300 до 44600 т. сыра.

2. В результате серии экспериментов по оптимизации процедуры высаливания установлено, что оптимальная концентрация СА для осаждения молокосвертывающего фермента из экстракта сычугов СО составляет 40% от насыщения. Внесение в экстракт оптимальной концентрации соли позволяет вдвое сократить расход сульфата аммония и получить МФ с выходом 96,5%, при удельной МА более 300 усл. ед./ A2so

3. МФ выделен из экстракта сычугов одностадийным методом ионообменной хроматографии на DEAE-Sepharose FF. При ионообменной хроматографии, МФ из сычуга СО ведет себя как кислый белок, с изоэлектрической точкой в диапазоне рН равном 4,6 — 5,6. Молекулярная масса основного полипептидного компонента, частично очищенного препарата, определенная методом SDS-электрофореза, составляет примерно 37 кДа. Существует высокая положительная корреляция (г=0,84, Р<0,01) между относительным содержанием полипептидного компонента с ММ около 37 кДа и удельной МА препарата.

4. Протеолитическая активность МФ, частично очищенного методом ионообменной хроматографии, в модельной системе, при температуре 35°С и рН 5, убывает в ряду: к-казеин, as-казеин, Р-казеин.

5. Разработан метод дополнительного выделения молокосвертывающего фермента из утилизируемой технологической жидкости на гидрофобном сорбенте - Phenyl Sepharose CL-4B. Показано, что молокосвертывающий фермент, из сычугов СО обладает сильно выраженными гидрофобными свойствами и ге-терогенен по этому параметру. По результатам проведенных исследований получен патент Российской Федерации на полезную модель: "Линия производства молокосвёртывающего ферментного препарата".

6. В результате исследования основных технологических свойств МФ из сычугов СО, показано, что по ряду характеристик, - подчинению закону Шторка и Зегелке, зависимости МА от концентрации ионов кальция и рН, по устойчивости к действию мочевины - препарат в большей степени похож на говяжий пепсин, чем на сычужный фермент. По терморезистентности МФ из сычугов СО уступает ГП и ОКО СФ, и является, таким образом, наименее термостабильным. В присутствии 50 мМ хлористого кальция, жидкий препарат сохраняет стабильную МА в течение 6 месяцев, при температуре 5°С. Отличительной характеристикой МФ из сычугов СО, представляющей наибольший интерес, является низкая абсолютная и относительная ПА, что свидетельствует о его высокой специфичности.

7. Производственная апробация МФ из сычугов СО подтвердила результаты лабораторных исследований. Динамика изменения показателей активной кислотности, содержания азотистых фракций и белковый состав опытных сыров после 5 месяцев созревания показали, что использование МФ из сычугов СО, обладающего очень низким уровнем неспецифического протеолиза, позволяет вырабатывать сыры с длительным сроком хранения без ухудшения орга-нолептических свойств.

8. Разработан комплект нормативно-технической документации на МФП из сычугов СО - "Алтай-Север" (ТУ 9219-002-00419710-05).

1. Белов, А.Н. Современные достижения в биотехнологии производства сыров / А.Н. Белов, М.С. Уманский // Сиб. вестник сельскохоз. науки. — 1992 N46.-С. 48-52.

2. Белов, А.Н. Молокосвертывающие препараты / А.Н. Белов, В.В. Ельчанинов, А.Д. Коваль // Сыроделие и маслоделие. 2004 - №1 - С. 14-16.

3. Биохимия: учебник для вузов / Т.Д. Алейникова, JI.B. Авдеева, Л.Е. Андрианова и др.; под ред. чл.-корр.РАН, проф. Е.С.Северина.- М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003.-784 с.

4. Брухман, Э.Э. Прикладная биохимия / Э.Э. Брухман.- М.: Легкая и пищевая промышленность, 1981.- С. 137-139.

5. Двинский, Б.М. Еще раз о молокосвертывающих препаратах / Б.М. Двинский // Сыроделие и маслоделие.- 2004.- № 4.- С. 10-11.

6. Звягинцев, В.И. Заменители сычужного фермента и возможные пути улучшения их качества (обзор) / В.И. Звягинцев, Е.Г.Сергеева, А.В.Гудков // Прикладная биохимия и микробиология.- 1971.- Т.VII.- С. 259-271.

7. Звягинцев, В.И. Методы оценки пригодности молокосвертывающих препаратов / В.И. Звягинцев, Е.Г.Сергеева // Прикладная биохимия и микробиология.- 1971.- Т.VII.- С. 339-341.

8. Инихов, Г. С. Методы анализа молока и молочных продуктов / Г.С.Инихов, Н.П.Брио.- М.: Пищепромиздат. 1971.-422 с.

9. Каверзнева, Е.Д. Стандартный метод определения протеолитической активности для комплексных препаратов протеаз/ Е.Д. Каверзнева // Прикладная биохимия и микробиология.- 1971.- том VII.- вып.2.- С.225-228.

10. Краюшкин, В.А. К вопросу о моделировании сычужного свертывания молока / В.А.Краюшкин, Ю.Я.Свириденко, Г.В.Мурунова, В.Н. Краюшкина, В.В.Смирнов // Сыроделие и маслоделие. 2004 - № 5 - С. 39-42.

11. Лакин Г.Ф. Биометрия: учеб. Пособие для ВУЗов / Г.Ф.Лакин.- М: Высшая школа, 1990.- 352 с.

12. Ларичев, О.В. О классификации и стандартизации МФП для сыроделия / О.В. Ларичев // Сыроделие и маслоделие. 2004 - №1 - С. 14-16.

13. Ларичев, О.В. Открытое письмо производителей натуральных молокосвертывающих ферментов. С кем вы, сыроделы России? / О.В.Ларичев, А.Н.

14. Штыков, J1.A. Шабунин, J1.B. Уханкин, Т.А.Куликова // Сыроделие и маслоделие. 2005 - № 3 - С. 10.

15. Ленинджер, А. Основы биохимии. В 3 т. Т 1./ А. Ленинджер.- М.: Издательство "Мир", 1985.-С. 155-157.

16. Марданян, М.М. Очистка растворов сычужного фермента фильтрационными методами / М.М. Марданян, И.К. Кузнецова, Н.С. Орлов // Молочная промышленность.- 1996.- № 3.- С. 27-28.

17. Маршелл, Э. Биофизическая химия. Том 1 / Э. Маршелл.- М.: Мир.- 1981.-С. 69-73.

18. Мухачев, А.Д. Мясная продуктивность северных оленей / А.Д. Мухачев, Л.А. Колпащиков, К.А. Лайшев.- Новосибирск: СО РАСХН, 2001.- 121 с.

19. ОАО "Московский завод сычужного фермента". Технологическая инструкция по производству сычужного фермента" (к ТУ 9219-002-0533158198).- 2002.-С. 1-5.

20. ОАО "Московский завод сычужного фермента". Технологическая инструкция по производству пепсина пищевого говяжьего" (к ТУ 9219-56000419779-2000).- 2001.- С. 1-7.

21. Овчинников, А.Д. К методу применения смеси свиного пепсина с ренни-ном при производстве натуральных сыров / А.Д. Овчинников, В.И. Звягинцев, А.Н. Толкачев // Изв. Высш. Учебн. заведений "Пищевая технология".- 1975.-N6.-С. 66-69.

22. Осинцев, А.М Теоретическое и экспериментальное исследование процессов, лежащих в основе свертывания молока / A.M. Осинцев.- Кемеровский технологический институт пищевой промышленности.- Кемерово, 2003.120 С.

23. Осинцев, A.M. Развитие фундаментального подхода к технологии молочных продуктов / A.M. Осинцев.- Кемеровский технологический институт пищевой промышленности.- Кемерово, 2004.- 152 С.

24. ОСТ 10 288-2001. Препараты ферментные молокосвертывающие. Технические условия.

25. Остроумов, JI.A. Перспективные направления развития отечественного сыроделия/ JI.A. Остроумов, А.А. Майоров // Молочная промышленность.-2005.-№ 1.-С. 18-20.

26. Проскуряков, М.Т. Хроматографическая очистка реннина на карбоксиме-тилцеллюлозе / М.Т. Проскуряков, JI.B. Сущинская // Прикладная биохимия и микробиология.- 1973.- вып.З.- т.VII.- С. 343-347.

27. Ситуация в мировой молочной промышленности в 2004 году / Бюллетень ММФ, № 391, 2004 г., перевод А.В. Бережной // Молочная промышленность.- 2005.- № 4.- С.4-6.

28. Скоупс, Р. Методы очистки белков / Р. Скоупс.- М.: Мир, 1985.- 358 с.

29. Снятковский, М.В. Компания "Хр.Хансен"- 130 лет на рынке сыроделия / М.В. Снятковский, Т.А. Горина, Э. Ван Иттен // Сыроделие и маслодели-ею- 2004.-№2.- С. 20-23.

30. Страйер, JI. Биохимия. В 3 т. Т 3. / JI. Страйер.- М.: Издательство "Мир", 1985.- С. 271-272.

31. Сыроечковский, Е.Е. Дикие и домашние северные олени в России: тренды популяции в современных социально-экономических условиях /Е.Е. Сыро-ечковский.- М.- Санкт-Петербург, 2000.- 32 с.

32. Теплы, М. Молокосвертывающие ферменты животного и микробного происхождения / М.Теплы, Я. Машек, Я. Гавлова Я.- М.: Пищевая промышленность, 1980.- 272 с.

33. Уайт, А. Основы биохимии. В 3 т. Т 2. / А. Уайт, Ф. Хендлер, Э. Смит, Р. Хилл, И. Леман.- М.: Издательство "Мир", 1981.- С.1095-1124.

34. Шелепов, В.Г. Дикие северные олени Таймыра / В.Г. Шелепов, А.Г. Неза-витин, Л.А. Колпащиков, Н.Н. Аникиенко. Красноярск, 2002.- 343 с.

35. Шелепов, В.Г. Северное оленеводство. Технология заготовки и переработки пантов, эндокринно-ферментного и специального сырья / В.Г. Шелепов.- М.: Политэкс, 1998.- 136 с.

36. Шилер, Г.Г. Протеиназы в сыроделии / Г.Г. Шилер, И.П. Бузов, М.С. Уманский // Химия протеолитических ферментов: Материалы 2-го Всесо-юзн. симп. по химии протеолитич. ферментов (Углич, 9-11 октября 1979 г). -Углич, 1979.-С. 41-47.

37. Addeo, F. Characterization of the oligopeptides of Parmigiano-Reggiano cheese / F.Addeo, L. Chianese, R. Sacchi, S. S. Musso, P. Ferranti, A. Malorni //.J. Dairy Res.- 1994.- N 61.- P. 365-374.

38. Anafantakis, E.M. Manufacture of Crugere-type cheese with 50:50 rennet-swine pepsin / E.M. Anafantakis, B.C. Veinoglov, J.G. Kandarakis // J.Dairy Res.-1981.-N48.- P. 513-518.

39. Antila, Von V. Der Einflub von verschiedenen Labpraparaten auf die Reifiing von Edam Kase // Von V. Antila, O. Witting // Milchwissenschaft- 1976.- N 11.- P. 654-658.

40. Arakawa, T. Solvent modulation in Hidrophobic Interaction Chromatography / T.Arakawa, L.O.Narhi // Biotechnol. Appl. Biochem.- 1991.- N 13.- P. 151-172.

41. Arunchalam, K. Isolation and characterization of pepsin from polar cod (Boro-gadus saida) / K.Arunchalam, N.F. Haard // Comparative Biochemistry and Physiology Part BiBiochemistry and Molecular Biology.-1985.-N 3.- P.467-473.

42. Awad, S. Proteolytic activities of chymosin and porcine pepsin on buffalo, cow, and goat whole and /?-casein fractions / S. Awad, Q. Q. Luthi-Peng, Z. Puhan //J. Agric. Food Chem.- 1998.- N 46.- P. 4997-5007.

43. Axen, R. Chemical coupling of peptides and proteins to polysaccharides by means of cyanogen halides / R. Axen, J. Porath, S. Ernback // Nature.- 1967.-N 214.- P. 1302-1304.

44. Barbosa, M. Cheesemaking experiments carried out on some Italian cheeses with vegetable rennet from cardo {Cinara cardunculus L.) / M.Barbosa, C. Cor-radini, B. Battistoni // Sci. Tec. Latt. Casearia.- 1981.- N 32.- P.203-221.

45. Belew, M. Purification of recombinant hepatitis В surface antigen produced by transformed Chinese hamster ovary (CHO) cell line grown in culture / M. Belew, M.,Yafang, L. Bin, J. Berglof, J-C.Janson // Bioseparation.- 1991.- N 1.- P. 397-408.

46. Beppu,T. The cloning and expression of chymosin (rennin) genes in microor-ganisns / T.Beppu // Trends in Biotechnology.- 1983.- N 3.- P. 85-89.

47. Birkkjaer, H. Technological suitability of calf rennet substitutes / H. Birkkjaer, P. Jonk // Int. Dairy Fed. Bull.- 1985.-N 194.- P. 8-13.

48. Birks, S. GM Foods A Wider Perspective / S.Birks // International Food Ingredients.- 2000.-N1.-P. 37-39.

49. Broome, M. C. Milk coagulants / M.C. Broome, G.K.Y. Limsowtin // Aust. J. Dairy Technol.- 1998.- N 53.- P.188-190.

50. Burton, S.C. One-step purification of chymosin, by mixed mode chromatography / S.C.Burton // Biotech.Bioengin.- 1997.- N 56(1).- P. 45-55.

51. Caglificio Clerici Spa Via Manzoni 29/A - 22071 Cadorago (CO) - ITALY Tel. +39.031.8859311 - Fax +39.031.904769, E-mail: info@clerici.org (Technical sheets, http://www.clerici.org/schede%20tecniche%20caglificio/index.htm).

52. Campos, R. Chemical characterization of proteases extracted from wild thistle {Cinara cardunculus.) / R.Campos, R. Guerra, M. Aguiar, O.Ventura, L.Camacho // Food Chem.- 1990.- N 35.- P. 89-97.

53. Chr. Hansen's Laboratorium, Danmark/ Genencor, Inc., USA. Kasungsversuch mit genmanipuliertem Chymosin aus Schimmelpilsen geplant / Chr. Hansen's Laboratorium, Danmark/ Genencor, Inc., USA // North European Dairy Journal.- 1985.-N8.- P.228.

54. Coker, C.J. The hydrolysis of asrcasein А,В and С variants by plasmin and chymosin / C.J. Coker, L.K.Creamer, R.J. Burr, J.P. Hill // International Dairy J.- 1999.-N3-6.- P. 371-372.

55. Comings, D.E. Nuclear proteins. VI. Fractionation of chromosomal non-histone proteins using hydrophobic chromatography / D.E. Comings, A.G. Miguel, H.H. Lesser// Biochim. Biophys. Acta.- 1979.- N 563.- P.253-260.

56. Creamer, L.K. Micelle Stability: k-Casein Structure and Function / L.K. Creamer, J.E. Plowman, M.J. Liddel, M.H. Smith, J.P. Hill // J Dairy Sci.-1998.-N81.- P. 3004-3012.

57. Cullen, D. Controlled expression and secretion of bovine chymosin in Aspergillus nidulans / D.Gullen, G. L. Gray, L. J. Wilson, K. J. Hayenga, M. H. Lamsa, M. W. Rey,S. Norton, R. M. Berka // Bio/Technology.-1987.- N 5.- P. 369-376.

58. Czor, R. Crystallised enzymes from the myogen of rabbit skeletal muscle/ R. Czor, T. Bucher// Advan. Prot. Chem.- I960.- N 15.- P. 315-415.

59. Dalgalarrondo, M. Proteolysis of (3- lactoglobulin and (3-casein by pepsin in ethanolic media / M. Dalgalarrondo, E. Dufour, J.-M. Chobert, C. Bertrand-Harb, T. Haertle // International Dairy J.- 1995.- N 1.- P. 1-14.

60. Dalgleish, D.G. The enzymatic coagulation of milk. In Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology / D.G. Dalgleish.- P.P. Fox ed.- 2 ed.- Aspen Publishers, Gaithersburg, MD.- 1993.- Vol. 1.- General Aspects.- P. 69-100.

61. Dalgleish, D.G. A possible structure of the casein micelle based on high-resolution field-emission scanning electron microscopy // International Dairy Journal.-2004.-N 12.-P. 1025-1031.

62. Donnelly, C.A., Maternal transmission of BSE: interpretation of the data on the offspring of BSE-affected pedigree suckler cows / C.A. Donnelly // Veterinary Record.-1998.- N 142.- P. 579-580.

63. Drohse, H.B. Specificity of milk-clotting enzymes towards bovine kappa-casein / H.B. Drohse, B. Foltmann // Biochim. Biophys. Acta.- 1989.- N 3.- P. 221-224.

64. E.C. (European Commission). Safety of milk with regard to TSE: State of affairs.- Statement of March 2000 of the Scientific Steering Committee.- 2000. (http://europa.eu.int/comm/food/fs/sc/ssc/outl75en.html).

65. Elagamy, E. I. Physicochemical, molecular and immunological characterization of camel calf rennet: A comparison with buffalo rennet / E. I. Elagamy // J. Dairy Res.-.2000.- N 67.- P. 73-81.

66. Emmons, D.B. Cheese Yield Experiments and Proteolysis by Milk-Clotting Enzymes / D.B. Emmons, M. Binns // J. Dairy Sci.- 1990.- N 8.- P. 2028-2043.

67. Emmons, D.B. Cheddar cheese made with bovine pepsin. I. Yield and quality of cheese / D.B. Emmons, B. Reiser, R.N. Giroux, D.W. Stanley // Can. Inst. Food Sci. Technol. J.- 1976.- N 9.- P. 189.

68. Emmons, D.B. Milk-clotting enzymes. 1. Proteolysis during cheese making in relation to estimated losses of yield / D.B. Emmons, D.C. Beckett, M. Binns // J. Dairy Sci.- 1990.- N 8.- P. 2007-2015.

69. Emmons, D.B. Milk-clotting enzymes. 2. Estimating of cheese yield losses from proteolysis during cheese making / D.B. Emmons // J. Dairy Sci.- 1990.- N 8.-P. 2016-2021.

70. Emmons, D.B. Milk-clotting enzymes. 3. Design of experiments on Proteolysis During Cheese Making / D.B.Emmons // J.Dairy Sci.-1990.- N 8.- P.2022-2027.

71. Emmons, D.B. Predictive formulas for yield of cheese from composition of milk / D.B. Emmons, C.A. Ernstrom, C. Locroix, P. Verret // J. Dairy Science.-1990.-N8.-P. 1365-1371.

72. Emtage, J. S. Synthesis of calf prochymosin (prorennin) in Escherichia coli /J.S. Emtage, S. Angal, M. T. Doel, T. J. R. Harris, B. Jenkins, G. Lilley, P. A. Lowe // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1983.- N 80.- P. 3671-3675.

73. Enzyme Nomenclature. International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB).- 1992.

74. Farkye, N. Y. Milk plasmin activity influence on cheddar cheese quality during ripening / N.Y.Farkye, C. F.Landkammer // J.Food Sci.-992.- N 57.- P.622-624.

75. Farkye, N. Y. Proteolysis in mozzarella cheese during refrigerated storage / N.Y Farkye, L. J. Kiely, R. S. Allshouse, P. S. Kindstedt // J. Dairy Sci.- 1991.- N 74.- P.1433-1438.

76. Fasman, G.D. Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology: handbook / G.D. Fasman.- Third Printing.- CRC Press, Inc., 1990.- 601 p.

77. Fedrick, I.A. Comparison of calf rennet and modified Mucor miehei coagulany in Cheddar cheese / I.A. Fedrick, S.C. Fuller // Aust J. Dairy Technol.- 1988.- N 43.-P. 12-17.

78. Flamm, E. L. How FDA approved chymosin: a case history / E.L.Flamm // Bio/Technology.- 1991.- N 9.- P. 349-351.

79. Flores, O. Factors involved in specific transcription by mammalian RNA polymerase II. Identification and characterization of Factor IIH / O. Flores, H. Lu, D. Reinberg// Journal Biol. Chem.- 1992.- N 267.- P. 2786-2793.

80. Foltmann, B. Chymosin: a short review on foetal and neonatal gastric proteases / B. Foltmann // Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl.- 1992.- N 210.- P. 65-79.

81. Foltmann, В. Gastric proteinases structure, function, evolution and mechanism of action / B. Foltmann. // Essays Biochem.- 1981.- N 17.- P. 52-84.

82. Foltmann, B. Outlines of the history of cheese rennet / B. Foltmann // Theriaca.-1994.-N29.-P. 9-44.

83. Foltmann, B. Structure and function of proparts in zymogens for aspartic proteinases / B. Foltmann // Biol. Chem. Hoppe Seyler.- 1988.- N 369 Suppl.- P. 311-314.

84. Foltmann, B. The complete amino acid sequence of prochymosin / B. Foltmann, V.B. Pedersen, H. Jacobsen, D. Kaufmann D, G. Wybrandt // Proc. Nat. Acad. Sci. US.- 1977.-N74.- P. 2321-2324.

85. Foltmann, B. The primary structure of calf chymosin / B. Foltmann, V.B. Pedersen, D. Kauffman, G. Wybrandt// J. Biol. Chem.- 1979.-N 17.- P. 8447-8456.

86. Fox, P. F. Proteolysis during cheese manufacture and ripening / P.F. Fox // J. Dairy Sci.- 1989.- N 72.- Р.1379-1400.л1-46, p3.5-10

87. Fox, P.F. Ensymes other then rennets in dairy technology / P.F.Fox // Journal of the Society of Dairy Technolody.- 1980.- N 3.- P. 118-128.

88. Franco, I. Biochemical changes throughout the ripening of a traditional Spanish goat cheese variety (Babia-Laciana) / I. Franco, B. Prieto, A. Bernardo, J.G. Prieto, J. Carballo // International Dairy J.- 2003.- N 2-3.- P. 221-230.

89. Frewer, L.J. Genetic engineering and food: what determines consumer acceptance / L.J. Frewer, C. Howard R Shepherd // British Food Journal.- 1995.- N 8.- P. 31-36.

90. Gagnaire, V. Role of electrostatic interactions in the curd of Emmental cheese / V. Gagnarie, E. Trotel, Y.L. Огаё1, J. Leonil // International Dairy Journal.-2002.-N7.- P. 601-608.

91. Gaiaschi, A. Proteolysis of «s-casein as a marker of Grana Padano cheese ripening / A. Gaiaschi, B. Beretta, C. Poiesi, A. Conti, M. G. Giuffrida, C. L. Galli, P. Restani // J. Dairy Sci.- 2000.- N 83.- P. 2733-2739.

92. Gaiaschi, A. Proteolysis of |3-casein as a marker of Grana Padano cheese ripening / A. Gaiaschi, B. Beretta, C. Poiesi, A. Conti, M. G. Giuffrida, C. L. Galli, P. Restani // J. Dairy Sci.- 2001.- N 84.- P. 60-65.

93. Gamble, J. How the Public Views Genetic Engineering: Preliminary Summary of Results / J. Gamble, S. Muggleston, D. Hedderley // 2000. http://www.hortnet.co.nz/publications/science/g/gamble/ ge.htm.

94. Gel Filtration. Principles and Methods / Edition: Amersham Biosciences, 2002.-P. 57-70.

95. Gilliland, G. L. The three-dimensional structure of recombinant bovine chymosin at 2.3: A resolution / G.L. Gilliland, E. L. Winborne, J. Nachman, A. Wlodawer // Proteins.- 1990.- N 8.- P. 82-101.

96. Gilliland, G.L. Functional implications of the three dimensional structure of bovine chymosin / G.L. Gilliland, M.T. Oliva, J. Dill // Adv. Exp. Med. Biol.-1991.- N 306.-P. 23-37.

97. Goff, C.G. Expression of calf prochymosin in Saccharomyces cerevisiae / C.G. Goff, D.T. Moir, T.Kohno, T.C. Gravius, R.A. Smith, E. Yamasaki, A. Taunton-Rigby // Gene.- 1984.- N1.- P. 35-46.

98. Grappin, R. Primaiy proteolysis of cheese proteins during ripening. A review / R. Grappin, Т. C. Rank, N. F. Olson // J. Dairy Sci.- 1985.- N 68.- P. 531-540.

99. Green, M.L. Review of the progress of Dairy Science: milk coagulants / M.L. Green//J. Dairy Res.- 1977.-N 1.- P. 159-188.

100. GrittiJ. PEPSINOGENS: PHYSIOLOGY, PHARMACOLOGY, PATO-PHYSIOLOGY AND EXERCISE / I. Gritti, G. Banfi, G.S. Roi // Pharmacological Research.- 2000.- N 3.- P. 265-281.

101. Guillou, H. Hydrolysis of beta casein by gastric proteases. I. Comparison of proteolytic action of bovine chymosin and pepsin A / H. Guillou, G. Miranda, J.P. Pelissier // Int. J. Pept. Protein Res.- 1991.- N 6.- P. 494-501.

102. Gupta, C.B. Potential use of vegetable rennet in the production of cheese / C.B. Gupta, N.A. Eskin // Food Technol.- 1977.- N 5.- P. 34-41.

103. Harboe, M. The activation of bovine pepsinogen. Sequense of the peptides released, identification of a pepsin inhibitor / M. Harboe, P.M. Andersen, B. Foltmann // J. Biological Chem.- 1974.- N 14.- P. 4487-4494.

104. Hidaka, M. Cloning and structural analysis of the calf prochymosin gene / M.Hidaka, K. Sasaki, T. Uozumi, T. Beppu // Gene.- 1986.- N 43 P. 197-203.

105. Hjerten, S. Gradient and isocratic High Performance Hidrophobic Interaction Chromatography of proteins on agarose columns / S. Hjerten, K. Yao, K.O. Erksson, B. Johansson // J. Chromatography.- 1986.- N 359.- P. 99-109.

106. Hjert6n, S. Some general aspects of hydrophobic interaction chromatography / S. Hjert6n // J. Chromatog.- 1973.- N 87.- P. 325-331.

107. Hofstee, B.H.J. Non-ionic adsorption chromatography of proteins / B.H.J. Hof-stee, N.F.Otillio //J. Chromatog.- 1978.- N 159.- P. 57-69.

108. Hofstee, B.H.J. Hydrophobic affinity chromatography of proteins / B.H.J Hofstee // Anal. Biochem.- 1973.- N 52.- P. 430^48.

109. Holmes, D.G. Distribution of milk-clotting enzymes between curd and whey and their survival during cheddar cheese making / D.G. Holmes, J.W. Duersch, C.A. Ernstrom // J. Dairy Sci.- 1977.- N 6.- P.862-869.

110. Holt, С. The hairy casein micelle: evolution of the concept and its implication for dairy technology / C.Holt, D.S.Horne // Neth. Milk Dairy J.-1996.- N 50.-P.85-111.

111. Home, D.S. Casein Interactions: Casting Light on Black Boxes, the Structure in Dairy Products / D.S. Home // Int. Dairy Journal.- 1998.- N 3.- P. 171-177.

112. Home, D.S. Casein structure, self-assembly and gelation / D.S. Home // Current Opinion in Colloid and Interface Sci.- 2002.- N 7.- P. 456-461.

113. Houen, G. The primary structure and enzymatic properties of porcine prochy-mosin and chymosin / G. Houen, M.T. Madsen, K.W. Harlow, P. Lonblad, B. Foltman // Int. J. Biochem. Cell Biol.- 1996.- N 28.- P. 667-675.

114. Hourrigan, J.L. Experimentally induced bovine spongiform encephalopathy in cattle in Mission, Tex, and the control of scrapie / J.L. Hourrigan // J. Am. Vet. Med. Assoc.- 1990.- N 10.- P. 1678-1679.

115. Hrkal, Z. Hydrophobic interaction chromatography of serum proteins on Phenyl-Sepharose CL-4B / Z. Hrkal, J.J. Rejnkova // J. Chromatog.- 1982.- N 242.- P. 385-388.

116. Hydrophobic Interaction Chromatography. Principles and Methods / Edition: Amersham Biosciences, 2002.- P. 65-69.

117. Hyens, E.R. Influence of Residual Milk-Clotting Enzyme on asi Casein Hydrolysis During Ripening of Reggianito Argentino Cheese / E.R. Hynes, L. Ap-aro, M.C. Candioti // Journal of Dairy Sciense.- 2004.- N 87.- P. 565-573.

118. International Dairy Federation. Bovine rennets: determination of total milk-clotting activity.- IDF Standard No. 157.- Brussels,Belgium.- 1992.

119. Ion Exchange Chromatography. Principles and Methods / Edition: Amersham Biosciences, 2002.- P. 85-86.

120. Irigoyen, A. Influence of calf or lamb rennet on the physicochemical, proteolytic and sensory characteristics of an ewe's-milk cheese / A. Irigoyen, J.M. Izco, F.C. Ibanez, P.Torre // International Dairy J.- 2002.- N 1.- P. 27-34.

121. Janson, J-C. Hydrophobic interaction chromatography on Phenyl- and Octyl-Sepharose CL-4B / J-C. Janson, T. Laas // in: Chromatography of synthetic andbiological macromolecules.- Roger, E. Ed.,- Ellis Horwood Ltd.- Chichester, England.- 1978.

122. Jennissen, H.P. General aspects of hydrophobic chromatography. Adsorption and elution characteristics of some skeletal muscle enzymes /. H.P. Jennissen,

123. M.G. Heilmeyer // Biochemistry.- 1975.- N 14.- P. 754-760.

124. Jennissen, H.P. Multivalent interaction chromatography as exemplified by the adsorption and desorption of skeletal muscle enzymes on hydrophobic alkyl-ligands / H.P. Jennissen // J. Chromatog.- 1978.- N 159.- P. 71-83.

125. Jordan, M. J. Characterization and comparative study of animal rennets from different ruminants applied to goat milk / M. J. Jordan, P. Hellin, M. Castillo, J. Laencina, M. B. Lopez // Milchwissenschaft- 1999.- N 54.- P. 144-148.

126. Kageyama, T. Pepsinogens, progastricsins and prochymosins: structure, function, evolution and development / T. Kageyama // Cell. Mol. Life Sci.- 2002.- N2.- P. 288-306.

127. Kappeler, S. Compositional and Structural Analysis of Camel Milk Proteins with Emphasis on Protective Proteins, Dissertation ETH No. 12947, Swiss Federal Institute of Technology.- 1998.

128. Kasche, V. Rapid Protein Purification Using Phenylbutylamine-Eupergit: a novel method for large-scale procedures / V. Kasche // J. Chromatography.-1990.-N510.- 149-154.

129. Kimberlin, R.H. Bovine spongiform encephalopathy and public health: some problems and solutions in assessing the risk / R.H. Kimberlin // In 3rd International Symposium on Transmissible Subacute Spongiform Encephalopathies:

130. Prion Diseases, March 18-20.- Paris.: Eds L. Court, B.Dodet, Amsterdam, El-sevier.-1996.- P. 487-502.

131. Klotz, I.M. Comparison of molecular structures of proteins: Helix content; distribution of apolar residues/ I.M. Klotz // Arch. Biochem.Biophys.-1970.- N 138.- P. 704-707.

132. Kolmer, M. Expression of recombinant calf prochymosin in mammalian cellculture / M.Kolmer, T.Ord, I.Ulmanen // J.Biotechnology.-1991.-N2.-P.131-139.

133. Lefort, S. Hydrophobic adsorbants for the isolation and purification of biosyn-thetic human growth hormone from crude fermentation mixtures / S. Lefort, P.Ferrara // J. Chromatog.- 1986.-N 361.- P. 209-216.

134. Lopez, M.B. Kinetics of лг-casein hydrolysis by different rennet and coagulant enzymes in Murciano-granadina goat milk / M. B. Lopez, M. J. Jordan, P. Hel-lin, M. Castillo, J. Laencina // Milchwissenschaft.-1997.- N 52.- P.370-373.

135. Lu, Q. Molecular cloning of multiple bovine aspartyl protease genes / Q.Lu, K.H. Wolfe, D.J. McConnell // Gene.- 1988.- N 1.- P. 135-146.

136. Lucey, J.A. Formation and physical properties of milk protein gels / J.A. Lucey II J. Dairy Sci.- 2002.- N 85.- P.281-294.

137. Ludwig, Von E. Zur pH-Abhangigkeit der proteolytischen und milchgerin-nenden Aktivitat von Chymosin und Rinderpepsin A in Lab /. Von E. Ludwig, W.Krause, K.Otto, U.Arnold// Milchwissenschaft.-1988.-N 8.- P.500-502.

138. Maisano, F. Synthesis of new hydrophobic adsorbents based on homologous series of uncharged alkyl sulphide agarose derivatives / F. Maisano, M. Belew, J.Porath // J. Chromatog.- 1985.- N 321.- P. 305-317.

139. Mallatou, H. Proteolysis in Teleme cheese made from ewes', goats' or a mixture of ewes' and goats' milk / H. Mallatou, E.C. Pappa, V. A. Boumba // International Dairy J.- 2004.- N 11.- P. 977-987.

140. Mara, O. Contribution of milk enzymes, starter and rennet to proteolysis during storage of quarg /О. Mara, A. L. Kelly // Int. Dairy J.- 1998.- N 8.- P. 973-979.

141. Marston, F. A. Purification of calf prochymosin (prorennin) synthesized in Escherichia coli / F. A. Marston, P. A. Lowe, M. T. Doel, J. M. Schoemaker, S. White, S. Angal // Bio/Technology (New York).-1984.-N 2.- P.800-804.

142. Martin, P. Fractionation of the multiple forms of bovine gastric aspartic proteases by chromatofocusing / P. Martin, C. Corre // Anal. Biochem.- 1984.- N 2.-P. 256-264.

143. Martin, P. Genetic polymorphism of caseins: a tool to investigate casein micelle organization / P. Martin, M. Ollivier-Bosquet, F. Grosclaude // International Daity Journal.- 1999.-N3-6.- P. 163-171.

144. McCaman, M.T. Enzymatic properties and processing of bovine prochymosin synthesized in Escherichia coli / T.M. McCaman, W.A. Andrews, J.G. Files // J. Biotechnology.- 1985.-N3-4.- P. 177-190.

145. McNair, R.D. Proteins of the kidney microvillar membrane. The amphipathic form of dipeptidyl peptidase IV / R.D. McNair, A.J. Kenny // Biochem. J.-1979.-N 179.- P. 379-395.

146. McSweeney, P.L.H. Proteolytic specificity of chymosin on bovine «si-casein / P.L.H. McSweeney, N. F. Olson, P. F. Fox, A. Healy, P.Hojrup // J. Dairy Res.- 1993.- N 60.- P. 401-412.1. Щ'

147. Melander, W. Salt effects on hydrophobic interactions in precipitation and chromatography of proteins: An interpretation of the lyotropic series / W. Melander, C. Horvath // Arch. Biochem. Biophys.- 1977.- N 183.- P. 200-215.

148. Middleton, D.J. Failure to transmit bovine spongiform encephalopathy to mice by feeding them with extraneural tissues of affected cattle / D. J.Middleton, R.M. Barlow // Veterinary Record.- 1993.- N 22.- P. 545-547.

149. Mocquot, G. Reviews of the progress of Dairy Science: Swiss-type cheese / G. Mocquot// J. Dairy Res.- 1979.-N 1.- P. 133-160.

150. Mohanty, A.K. Bovine chymosin. Production by rDNA technology and application in cheese manufacture / A.K.Mohanty, U.K. Mukhopadhyay, S.Grover, V.K.Batish // Biotechnology Advances.- 1999.- N 2-3.- P.205-217.

151. Moir, D. Milecular cloning and characterization of double-stranded cDNA coding for bovine chymosin / D. Moir, J. Mao, J.W. Schumm, G.F. Vovis, B.L. Al-ford, A. Taunton-Rigby // Gene.- 1982.- N 1.- P. 127-138.

152. Mulvihill, D. M. Relationship between plasmin levels in rennet caseins and proteolytic and rheological changes on storage of cheese analogues made from these caseins / D.M. Mulvihill, A. McCarthy // J. Dairy Res.- 1993.- N 60.-P.431-438.

153. Munoz, R. Cloning of the Autentic Bovine Gene Encoding Pepsinogen A and Its Expression in Microbial Cells / R. Munoz, J.L.Garcia, A.V. Carrascosa, R. Gonzales // Applied and Enviromental Microbiology.- 2004.- N 5.- 2588-2595.

154. Najera, A.I. Effects of pH, temperature, CaCl2 and enzyme concentrations on the .4 rennet-lotting properties of milk: a multifactorial study / A.I. Najera, M. de

155. Renobales, L.J.R. Barron // Food Chemistry.- 2003.- N3.- P. 345-352.

156. Narhi, L.O. Hydrophobic Interaction Chromatography in alkaline pH / L.O. Narhi, Y. Kita, T. Arakawa // Anal. Biochem.- 1989.- N 182.- P.266-270.

157. Narita,Y. Multiplicities and some enzymatic characteristics of ape pepsinogens and pepsins / Y. Narita, S. Oda, О. Takenaka, T. Kageyama // J. Med. Primatol.-2000.- N6.- P. 402-410.

158. Nau, I. Effects of Mobile Phase Conditions on Protein Conformation and Chromatographic Selectivity in Ion Exchange and Hydrophobic Interaction Chromatography /1. Nau // BioChromatography.- 1989.- N 4.- P.62-68.

159. Nielsen, F.S. Activation of porcine pepsinogen A. The stability of two non-covalent activation intermediates at pH 8.5 / F.S. Nielsen, B. Foltman // Eur. J. Biochem.- 1993.-N217.- P. 137-142.

160. Nielsen, P.K. Purification and Characterisation of Porcine Pepsinogen В and Pepsin В / P.K. Nielsen, B. Foltmann // Archives of Biochemistry and Biophysics." 1995.-N2.- P. 417-422.

161. Nishimori, K. Expression of cloned calf prochymosin cDNA under control of the tryptophan promoter / K.Nishimori, N.Shimizu, Y. Kawaguchi, M. Hidaka, T. Uozumi, T. Beppu // Gene.- 1984.- N 1-2.- P. 41-49.

162. Nishimori, K. Expression of cloned calf prochymosin gene sequence in Escherichia coli / K. Nishimori, Y. Kawaguchi, M. Hudaka, T. Uozumi, T. Beppu // Gene.- 1982.- N 19.- P.337-344.

163. Ortiz de Apodaca, M. JStudy of the milk-clotting and proteolytic activity of calf rennet, fermentation-produced chymosin, vegetable and microbial coagulants / M. Ortiz de Apodaca, L. Amigo, M. Ramos // Milchwissenschaft.- 1994.- N 49.- P.13-16.

164. Pahlman, S. Hydrophobic interaction chromatography on uncharged Sepharose derivatives. Effects of neutral salts on the adsorption of proteins / S. Pahlman, J. Rosengren, S. Hjerten // J. Chromatog.- 1977.- N 131.- P. 99-108.

165. Parsegan, V.A. Temperature-dependent van der Waals forses / V.A. Parsegan, B.W. Ninham // Biophysical Journal.- 1970.- N 10.- P. 664-674.

166. Pedersen, V. Investigations on the activation of bovine prochymosin / V. Peder-sen, K. Christensen, B. Foltmann 11 Eur. J. Biochem.- 1979.- N 94.- P.573-580.

167. Pedersen, V.B. Amino-acid sequence of the peptide segment liberated during activation of prochymosin (prorennin) / V.B. Pedersen, B. Foltmann // Eur. J. Biochem.- 1975.-N 1.- P.95-103.

168. Phelan, J.A. Milk Coagulants A Critical Review / J.A. Phelan // Dairy J. International.- 1977.- N2.- P. 50-54.

169. Plowman, J.E. Restrained molecular dynamics study of the interaction between bovine к-casein peptide 98-111 and bovine chymosin and porcine pepsin / J.E. Plowman, L.K. Creamer // J. Dairy Res.- 1995.- N 62.- P.451-467.

170. Porath, J. Salt-promoted adsorption: recent developments / J. Porath // J. Chromatogr.- 1986.- N 376.- P. 331-341.

171. Porath, J. Salting-out in amphiphilic gels as a new approach to hydrophobic adsorption / J. Porath, L. Sundberg, N. Fornstedt, I. Olson // Nature.- 1973.-N 245.- P. 465-466.

172. Practical Protein Chemistry: A Handbook / edited by A. Darbre.- John Wiley & Sons Ltd.- 1986.- Reprinted April 1987.- 620 p.

173. Privalov, P.L. Comparative thermodynamic study of pepsinogen and pepsin structure / P.L. Privalov, P.L. Mateo, N.N. Khechinashvili, V.M. Stepanov, L.P. Revina // Journal of Molecular Biology.- 1981.- N 2.- P. 445-464.

174. Pungercar, J. Complete primary structure of lamb preprochymosin deduced from cDNA / J. Pungercar, B. Strukelj, F. Gubensjek, V. Turk, and I. Kregar // Nucleic Acids Res.- 1990.- N 18.- P. 4602-4608.

175. Rampilli, M. Natural heterogeneity of chymosin and pepsin in extracts of bovine stomachs / M. Rampilli, R. Larsen, M. Harboe // International Dairy J.- 2005.-Article in Press.

176. Reid, J.R. The action of chymosin on к-casein and its macropeptide: effect of pH and analysis of products of secondary hydrolysis / J.R. Reid, T. Coolbear, J.S. Ayers, K.P. Coolbear // Int. Dairy J.- 1997.- N 8-9.- P. 559-569.

177. Repelius, K. Coagulants produced by fermentation technology / K. Repelius // Aust. J. Dairy Technol.- 1998.- N 53.- P. 124.

178. Restani, P. y-Casein as a marker of ripening and/or quality of Grana Padano cheese / P. Restany, T. Velona, A. Carpen, M. Duranti, C. L. Galli. J. Agric. Food Chem. 1996.- N 44.- P. 2026-2029.

179. Richter, C. Review. Mechanism of activation of the gastric aspartic proteinases: pepsinogen, progastricsin and prochymosin. / C. Richter, T. Tanaka, R.I. Yada // Biochemical J.- 1998.- N 335.- P. 481-490.

180. Rogelj, I. Recombinant Lamb Chymosin as an Alternative Coagulating Enzyme in Cheese Production /1. Rogelj, B. Perko, A. Francky, V. Репса, J. Purgencar // J. Dairy Sci.- 2001.- N 84.- P.1020-1026.

181. Roos, P. Isolation of Human Pituitary Prolactin / P. Roos, F. Nyberg, L. Wide // Biochim. Biophys Acta.- 1979.- N 588.- P. 368-379.

182. Saba, A. Biotechnology in agriculture. Perceived risks, benefits and attitudes in Italy / A.Saba, S. Rosati, M. Vassallo // British Food Journal.- 2000.- N 2.- P. 114-120.

183. SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Isoelectric Focusing / Handbook.-Edition: Amersham Biosciences, 2001.- P.23-30.

184. Shaltiel, S. Hydrophobic chromatography: Use for purification of glycogen synthetase /S. Shaltiel, Z. Er-el //Proc. Nat. Acad. Sci.USA.- 1973.-N 70.- 778-781.

185. Sienkiewicz, Т., Untersuchungen zum proteolytischen abbau der Caseine. 1. Wirkung von Plasmin und Chymosin auf Caseine im Modell-System Studies on

186. V proteolytic degradation of caseins. 1. Effect of plasmin and chymosin on caseinin a model system./ T. Sienkiewicz, I. Scherze, K. Krenkel // Milchwissen-schaft.-1994.- N 49.- P.499-504.

187. Smith, M.H. Modelling the effect of ic-casein A and С on the hydrolysis of к-casein by chymosin / M.H. Smith, L.K. Creamer, J.E Plowman, J.P. Hill // International Dairy J.- 1999.- N 3-6.- P.373-374.

188. Sohal, T. S. Rennet as a cause of bitterness development in quarg / T. S. Sohal,f

189. D. Roehl, P. Jelen// J. Dairy Sci.- 1988.-N 71.- P. 3188-3196.

190. Sousa, M.J. Advances in the study of proteolysis during cheese ripening / M.J. Sousa, Y. Ardo, P.L.H. McSweeney // International Dairy J.- 2001.- N 4-7.- P. 327-345.

191. Sponset, M. Current developments and understanding of rennet use in the dairy industry / M. Sponset, P. Stifflet, A. Michallet // J. Dairy Ind. International.-1985.-N 10.- P. 21-30.

192. Srinivasan, R. Role of physical forses in hydrophobic interaction chromatography/ R. Srinivasan, E. Ruckenstein // Separation & Purification Methods.-1980.-N9.- P. 267-370.

193. Subramanian, S. Separation of chymosin and pepsin in calf rennet by dye-^ ligand affinity chromatography / S. Subramanian // Preparative Biochemistry.1987.-N3.- P. 297-312.

194. Sundberg, L. Preparation of adsorbents for biospecific affinity chromatography. I. Attachment of amino groupcontaining ligands to insoluble polymers by means of bifunctional oxiranes /L. Sundberg, J. Porath // J. Chromatog.- 1974.- N 90.87-98.

195. TAFS (INTERNATIONAL FORUM FOR TSE AND FOOD SAFETY). TAFS position paper on the Safety of Milk and Milk Products.-May 7, 2003.- P. 1-5. (http://www.tseandfoodsafety.org/positionpapers/positionpaperonthesafet yo /tafspositionjpaperonthe2 .pdf).

196. Tang, J. Structural evidence for gene duplication in the evolution of the acid proteases / J.Tang, M. N. James, I. N. Hsu, J. A. Jenkins, T. L. Blundell // Nature.- 1978.- N 271.- P. 618-621.

197. Tester, M. The dangerously polarized debate on genetic modification / M.Tester // British Food Journal.- 2001.- N 11.- P. 785-790.

198. Tichy, P.J. Improved Procedure for a High-Yield Recovery of Enzymatically Active Recombinant Calf Chymosin from Escherichia coli Inclusion Bodies / P.J. Tichy, F. Kapralek, P.Jecmen // Protein Expression and Purification.- 1993.-N l.-P. 59-63.

199. Tiselius, A. Adsorption separation by salting out / A. Tiselius // Arkiv for Kemi, Mineralogi Geologi.- 1948.- N 26B.- P. 1-5.

200. U.S. Food and Drug Administration, Direct food substance affirmed as generally recognized as safe; chymosin enzyme preparation derived from Escherichia coli K-12, Federal Register, March 23.-1990.-V 57.- P. 10932-10936.

201. United States Patent Application, International Class: C12N 009/64. Method of producing non-bovine chymosin and use of hereof / Kappler S., Farah Z., Brink J.M. van den., Rahbek-Nielsen H., Budtz P.- № 20040180410; Filed 24.03.2004; 16.09.2004.

202. United States Patent Application, International Class: C12N 009/64. Method for the purification of chymosin / Fahrenmark J., Lagerlund I., Morenweiser R., Caussette M., Piron E.;-№ 20040072320; Filed 01.12.2003; 15.04.2004.

203. United States Patent Application, International Class: C12P 021/02. Method of producing non-bovine chymosin and use of hereof / Kappler S., Farah Z., Brink J.M. van den., Rahbek-Nielsen H., Budtz P.- № 20020164696; Filed 06.11.2001; 07.11.2002.

204. United States Patent Application, International Class: C12Q 001/70. Chromatographic resins and methods for using same / Burton S., Harding D.R.K.,

205. Becker N.T., Bulthuis B.A., Steele L.M.- № 20040214157; Filed 06.06.1995; 28.10.2004.

206. United States Patent, International Class: A61K 038/43. Process for separating milk clotting enzymes, and stable rennet compositions / Larsen R., Harboe M.K., Ladsten P.M.; Assignee: CHR Hansen A/S (DK).- № 5,888,966; Filed 12.12.1996; 30.03.1999.

207. United States Patent, International Class: C12N 009/64. Method for the purification of calf rennet / Subramanian S.; Assignee: Miles Laboratories, Inc. (Elkhart, IN).-№4,666,843; Filed 16.10.1985; 19.05.1987.

208. United States Patent, International Class: C12N 009/64. Method for separating rennet components / Birschbach P.; Assignee: Sanofi Bio Ingredients.- № 4,745,063; Filed 17.08.1987; 17.05.1988.

209. United States Patent, International Class: C12N 009/64. Method for separating rennet components / Birschbach P.; Assignee: Sanofi Bio Ingredients.- № 4,745,063; Filed 17.08.1987; 17.05.1988.

210. United States Patent, International Class: C12N 009/64. Process for recovery and purification of chymosin/ Heinson H.G., Murphy M.B.; Assignee: Genencor International, Inc.-№ 5,215,908; Filed 16.04.1992; 01.06.1993.

211. Vega-Hernandes, M.C. Molecular cloning and expression in yeast of caprine prochymosin / M.C. Vega-Hernandes, A. Gomes-Coello, J. Villar, F. Claverie-Martin // Journal of Biotechnology.- 2004.- N 1-2.- P.69-79.

212. Verdini, R.A. Characterisation of soft cheese proteolysis by RP-HPLC analysis of its nitrogenous fractions. Effect of ripening time and sampling zone / R.A. Verdini, S.E. Zorrilla, A.C. Rubiolo // International Dairy J.- 2004.- N 5.- P. 445-454.

213. Vieiera-de-Sa, F. Cheese-making experiments vith a vegetable rennet from cardo (Cinara cardunculus L.) // F. Vieiera-de-Sa, M. Barbosa // J. Dairy Res.-1972.-N39.- P. 335-343.

214. Visser, S. Peptide substrates for chymosin (rennin). Isolation and substrate behaviour of two tryptic fragments of bovine к-casein / S. Visser, P.J. van Rooi-jen, C.J.Slangen // Eur. J. Biochem.- 1980.-N 108.- P. 415-421.

215. Walstra, P. On the stability of casein micelles / P. Walstra // J. Dairy Sci.-1990.-N73.-P. 1965-1979.

216. Wangoh, J. Extraction of camel rennet and its comparison with calf rennet extract / J. Wangoh, Z. Farah, Z. Puhan // Milchwissenschaft.- 1993.- N 48.- P. 322-325.

217. Ward, M. Improved production of chymosin in Aspergillus by expression of glycoamylase-chymosin fusion / M.Ward, L. J. Wilson, К. H. Kodoma, M. W. Rey, R. M. Berka // Bio/Technology.- 1990.- N 8.- P. 435-440.

218. Ward, M. Use of Aspergillus overproducing mutants, cured for integrated plas-mid, to overproduce heterologous proteins / M. Ward, L.J. Wilson, K.H. Kodoma // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1993.- N 39.- P. 738-743.

219. Wilchek, M. On the mode of adsorption of proteins to "hydrophobic columns" / M. Wilchek, T. Miron // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1976.- N 72.- P. 108-113.

220. Wilesmith, J.W. A cohort study to examine maternally-associated risk factors for bovine spongiform encephalopathy / J.W.Wilesmith, G.A.H. Wells, J.B.M. Ryan, D. Gavier-Widen, M. Simmons // Veterinary Record.- 1997.- N 141.- P. 239-243.

221. Yon, R.J. Chromatography of lipophilic proteins on adsorbents containing mixed hydrophobic and ionic groups / R. J. Yon // Biochem. J.- 1972.- N 126.- P 765-767.

222. Zinnen, T. Biotechnology and Food. Cooperative Extension Publications, University of Wisconsin, Wisconsin, 1994, 90 p. (http://www.biotech.wisc.edu/outreach/pdfs/biotechandfood.pdf.)

223. Zinovieva, N. Short Communication: Identification and characterization of multiple splicing forms of bovine prochymosin mRNA / N.Zinovieva, M. Miiller, G.Brem // J. Dairy Science.- 2002.- N 12.- P.3476-3479.

224. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

225. А280 оптическая плотность при длине волны 280 нанометров1. АО аминокислотные остатки

226. ВОЗ — Всемирная организация здравоохранения1. ГП говяжий пепсин

227. ГФХ гидрофобная хроматография

228. ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

229. ИОХ ионообменная хроматографиякДа килодальтонк ДНК комплементарная ДНК

230. МА молокосвертывающая активность1. ММ молекулярная масса

231. МП молокосвертывающие препаратымРНК матричная (информационная) РНК

232. МФ молокосвертывающий фермент

233. МФП молокосвертывающие ферментные препараты

234. ОКО отраслевой контрольный образец

235. ПА — протеолитическая активность

236. РНК рибонуклеиновая кислота1. С А сульфат аммония1. СО северный олень

237. СОМО — сухой обезжиренный молочный остаток1. СФ сычужный фермент

238. ТХУ трихлоруксусная кислотау.е. — условные единицы (молокосвертывающей активности) ЦНС центральная нервная система ЭР - эндоплазматический ретикулум ЭФ - электрофорез

239. SDS-ЭФ электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия