автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.02, диссертация на тему:Формирование белково-протеиназного комплекса и технологических достоинств пивоваренного ячменя и пшеницы на основе направленного изменения агрофона

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПО ВЫСШЕМУ ОБРАЗОВАНИЮ

МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМШ р ¡" Б ОД ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ

2 1 ЛВГ 1995

На правах рукописи

КАРШЛЕНКО ГЕННАДИЯ ПЕТРОВИЧ

уда 664.71-11.016:663.15(043.3) +664. 786. 016. 8: 663.15( 043. 3)

ФОРМИРОВАНИЕ" БЕЛКОВО-ЦРОТЕИНАЗНОГО КОМПЛЕКСА И ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ДОСТОИНСТВ ПИВОВАРЕННОГО ЯЧМЕНЯ И ПШЕНИЦЫ НА ССНОЕЕ НАПРАВЛЕННОГО ИЗМЕНЕНИЯ .. АГР0&5НА

Специальности: 05.18. 02 - Технология зерновых,

бобовых, крупяных продуктов ¡1 комбикормов

03.00.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой етешии доктора технических наук

Н о с к в а - 1 9 9

Работа выполнена в Московской Государственной Академии пищевых производств.

Официальные оппоненты: Заслуженный деятель науки Российской

Федерации, доктор технических наук, профессор ТРИСВЯТСКИЙ Л.А.; Доктор технических наук, профессор НЕЧАЕВ А.П.;

Доктор биологических наук, профессор МОСОЛОВ В.В.

Ведущая организация - Всероссийский центр по оценке качества

сортов сельскохозяйственных культур.

Защита состоится "J^" 1ЭЭЧ г. в час.

на заседании специализированного Совета Д 063.51.01 при Московской ордена Трудового- Красного Знамени Государственной Академии Пищевых Производств по адресу:

125080, Москва, Волоколамское шоссе, II.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГАПП. Автореферат разослан »¿У" U/t'iÄ. J994 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, канд.техн.наук

Кобелева И.Б,

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Рост производства зерновых культур в сочетании с улучшением их биохимических показателей и технологических достоинств является наиболее актуальной проблемой.

Одним из факторов, во многом определяющим химический состав зерна, его биохимические особенности и технологические показатели качества, является внешняя среда - состояние почвы, степень ее окулътуренноети, дозы вносимых удобрений.

Известно, что внесение минеральных удобрений влияет на плодородие почвы, увеличивая урожайность зерновых культур. Увеличение урожайности, ' как правило, сопровождается биохимическими изменениями. Направленность биохимических изменений может носить разный характер; в одних случаях эти изменения приводят к улучшению технологических достоинств, в других. -возможно их ухудшение.

Программирование урожайности зерновых культур, направлен' нов формирование биохимических показателей и технологических достоинств зерна особо важное значение приобретают в зонах рискованного земледелия, к числу которых относится и Московская область. К культурам, занимающим важное место в зерновом хозяйстве Нечерноземья, относятся: пшеница, являющаяся основным сырьем мукомольной и ,хлебопекарной промышленности, и ячмень, служащий сырьем для производства солода в пивоваренной промышленности., Изучение влияния степени окулътуренноети почвы, доэ вносимых удобрений, их взаимосвязь с физическими показателями качества выращиваемого зерна, исследование активности протеолитических ферментов зерна и их ингибиторов имеет боль-

шое значение для решения вопросов, связанных с получением зерна пшеницы и ячменя, отвечающего качественным требованиям перерабатывающей промышленности. Это особенно важно в настоящее время, когда значительная часть посевных площадей, отведенных под зерновые культуры, оказались в зоне раскованного земледелия.

Цель и задачи исследования. Целью работы является изучение влияния степени окультуренности почвы, доз вносимых удобрений на качество сортового зерна мягкой озимой пшеницы и пивоваренного ячменя, их биохимические свойства и технологические показатели.

В соответствии с темой исследования бьши поставлены следующие задачи: .

- изучение физических показателей качества зерна пивоваренного ячменя сорта "Заэерский 85" и мягкой озимой пшеницы сорта "Мироновская 808", выращенного на различных агрофонах в условиях Нечерноземной зоны;

- характеристика биохимических и технологических показателей качества исследуемого верна пшеницы и ячменя;

- характеристика нейтральных и кислых протеинаэ и ингибиторов протеинаэ, выделенных из исследуемых образцов

зерна, в том числе, выращенных на различных агрофонах;

* 1 ■ "

- изучение белкового комплекса исследуемых образцов верна с использованием методов гель-хроматографии;

- исследование активности нейтральных протеинаэ, белковых ингибиторов собственных протеинаэ и трипсина в процессах хранения и ускоренного старения верна пвэницы, вырашэнного на различных агрофонах;

- характеристика мукомольных ¡свойств исследуемого верна

пшеницы;

.- исследование изменений хлебопекарного достоинства зерна пшеницы, выращенного на почвах с различной степенью окультуренности;

- исследование белково-протеиназного комплекса в процессе прорастания ячменя, его солодоращения и затирания.

Научная новизна. Проведено комплексное исследование влияния агрофонов на качество зерна пшеницы и ячменя, в том числе:

- физических показателей качества исследуемого зерна, выращиваемого на почвах, различающихся степенью окульту-ренности и дозами вносимых удобрений ;

- морфологической и. геометрической характеристик зерна мягкой озимой пшеницы, выращиваемой на различных агрофо-нах.

Исследована зависимость активности протеолитических ферментов ячменя и пшеницы, а также активность белковых ингибиторов, выделенных из исследуемого зерна, от состояния агрофонов.

Показано, что. протеолитическая активность в ячмене и солоде в кислой зоне рН обусловлена действием одного фермента кислой протеинаэы, а не комплекса протеаз. Для этого фермента была предложена схема очистки. На очищенном ферменте исследованы его свойства, определена молекулярная масса. Выявлена определяющая роль кислой протеинаэы при приготовлении пивного сусла.

Установлена взаимосвязь между активностью кислых и нейтральных протеиназ солода и степенью окульгуренности почвы и доз вносимых удобрений.

Изучено взаимодействие нейтральных протеиназ исследуемого зерна пшеницы и ячменя с белковыми ингибиторами, выделенными

из этого зерна. С помощью корреляционного анализа показано, что определяющим фактором в формировании системы "протеиназы-ингибиторы" является степень окультуренности почвы.

Выявлено влияние агрофона на состояние белкового комплекса исследуемого зерна. Установлено, что повышение степени окультуренности почвы и внесение удобрений влияют на молекулярную массу водорастворимых белков ячменя.

С помощью ускоренного старения зерна пшеницы установлено влияние агрофона на сохранность зерна.

Показано наличие взаимосвязи между активностью нейтральных протеинаэ и удельным объемом хлеба, что подтверждает роль нейтральных протеинаэ, как одного из факторов, определяющих хлебопекарное достоинство зерна.

Практическая значимость работы. Полученные в ходе проведенных экспериментов данные расширяют представление о влиянии степени,окультуренности почвы и доз вносимых удобрений на физические свойства, биохимические показатели качества и технологические достоинства исследуемого зерна ячменя и пшеницы.

Данные о поведении протеолитических ферментов и их ингибиторов при прорастании и о зависимости активности ингибиторов, блокирующих действие протеаз в период покоя от агрофо-нов, позволяют получить Солее глубокие представления о биохимических процессах, протекающих в созревающем и прорастаюшэм зерне, механизмах их регуляции и влиянии на эти процессы окру-жаюшэй среда

Результаты исследований открывают качественно новый подход к формированию технологических свойств зерновых культур путей агротехнических приемов и открывают новые возможности получения зернового сырья требуемого качества путем направлен-

ного воздействия на растения в период вегетации.

Апробация работы, Материалы работы докладывались на 1У Бахою-кои коллоквиуме (Москва, 1971); III и У Всесоюзных биохимических съездах (1974, 1986); У.Всесоюзном симпозиуме по инкенериой знзимологии (Кобулеги, 1985); III Всесоюзной научно-технической конференции "Разработка процессов получения комбинированных продуктов питания" (Москва, 1988); Всесоюзной научной конференции "Пути повышения качества зерна и зернопродуктов, улучшение ассортимента крупы, иуни и хлеба" (Москва,' 1989); зональной конференции "Молекулярная сорбция биологически активных веществ" (Пенза, 1990); Всесоюзной конференции "Химия пищевых веществ. Свойства и использование биополимеров в пищевых продуктах" (Могилев, 1990); Всесоюзной научно-практической конференции "Основные направления научно-технического прогресса в иукоиольной промышленности" (Москва, 1990); Всесоюзной конференции по пищевой химии (Москва, 1990); УШ конференции иолодых ученых и специалистов, посвященной бО-^летию образования ЦТИПП (Нее-ква, I99I); научной конференции, посвященной 60-летию !ШПП (Москва, 1991).

Публикация. По материалам работы ииеетоя 41 публикация, статхи в журналах, тезиоы докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит'из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов и библиографии. Работа изложена на 279 страницах основного текста, содержит 56 таблиц и 43 риоунка. Список литературы включает 376 источников, из которых 205 иностранных._ Количество приложений I.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ I. Эксперимент: |Ы1ая часть

Работа выполнялась на кафедре биохииии и верномдекия Московской Государственной Академии пиц^зых производств в творческом содружестве со специалистами кафедры агрох:ч ,:и и биохииии ТСХА.

1.1. Объекты и методы исследований

Исследования проводились на сортовом зерне пшеницы и пивоваренного ячменя, выращенном на различных агрофонах в учебно-опытном хозяйстве ТСХА "Михайловское" Подольского района Московской области, пивоиренном ячмене, полученной с сортоучастков Курской области и промышленной солоде.

При исследовании были использованы как общепринятые цетоды анализа качества зерна, так и специальные: спектрофотометрия, гель-хроматография, ионообмонная хроматография, афинная хроматография, изоэлектрическая фокусировка и др.

Все работы с ферментами проводились с учетом законов кинетики ферментативных реакций. Их активность .определялась по начальной скорости реакции при насыщающей концентрации субстрата.

При проведении исследований и анализе их результатов применялись методы математической статистики обработки экспериментальных данных.

Исследуемые образцы пшеницы и пивоваренного ячменя возделыва-лись на дерново-подзолистых почвах о севооборотами. Эти почвы различались по агрохимической характеристике, степени окультуренносги и количеству вносимых удобрений. Характеристика применяемых почв приведена в таблицах 1-3.

фосфорно-калийныа удобрения (калийная соль и двойной суперфосфат) внооились под зяблевую вспашку, аммиачная селитра полной нормой вносилась в фазе начала выхода растений в трубку.

На слабоокультуренной почве выращизание осуществлялось без применения удобрений, известкования и гербицидов; на средне- и хоро-шоокультуренной почве - без удобрений и на фоне расчетных доз удобрений, спланированных на усвоение 2 и 3 % фотосиктетически активной радиации /ФАР/, приходящейся за весь вегетационный период и обычной, рекомендуемой норме удобрс ,шй.

таолица 1

Агрохимическая характеристика применяемых почв

| Агрохимическая характеристика почвы

Степень |—------------------------------------------

окультуренности | | гумус | Р20? | К20

' * почвы | рН | 7. мг/ЮОг почвы | мг/100г почвы

| | (по Тюрину) | (по Кирсанову) | (по Масловой)

Слабоокуль-туренная 4,5 1,4 . 6,0 7,0 - 8,0

Среднеокуль-туренная 6,0 1.8 15,0 16,0 - 17,0

Хорошоокуль-туренная 6,0 2,5 - 2,8 25,0 23,0 - 25,0

С примен. интенсивной технол. б, б 2,9 27,0 25,0

Таблица 2

Нормы внесения удобрений при выращивании пшеницы на почвах с различной степенью окультуренности

Рекомендуемая доза| Доза удобрений при | Доза удобрений при удобрений кг/га | усвоении 27. ФАР, кг/га | усвоении 3X 9АР, кг/га

N | Р205|К20| N ' | Р20у| (NH,N03)| • | |(№уГО3) | | К20 | N | Р20 | К20 l(N^NOj) | |

Среднеок у л ь г у р е нная почва

45 I 45 |45 1 135-1 45- | 56 | 180 | 45 | 45

Х.о р о ш о о к у л ь г у р е' нная почва

45 | 45 |45 | -1-1 - | 180 | 45 | 45

¿ашшцы э

Нормы внесения удобрений при выращивании ячменя на почвах с различной стедвнью окультуренности

Рекомендуемая доза : Доза удобрений при : Доза удобрений при удобрений, кг/га : усвоении 2 % ФАР, кг/га : усвоении 3 % ФАР, кг/га

(йй^нОд) 2 5 2 2 5_2 2 5 2

Среднеокультуренная почва

45 : 45 : 4-5 : ■ 90 : 45 : 11,2 : 120 : 45 : 91

Хорошоокультуренная почва

45 : 45 : 45 : - : - : - : 120 : 45 : 26,1

1.2. Влияние агрофона на качество пивоваренного ячиеня

Характеристика исследуемых образцов зерна пивоваренного ячменя сорта "Зазерокий 85", выращенных в условиях Нечерноземья, на почвах ' различающихся степенью окультуренности и дозами вносимых удобрении, а также данные по урожайности за два года наблюдений, предотавлены в таблицах 4 и 5.

Результаты исследований, представленные- в таблице 4, свидетельствуют о том, что условия выращивания оказывают влияние не только на рост урожайности, но и непосредственно на показатели качества зерна. Наблюдается увеличение массы 1000 зерен, натуры и крупности. Снижение содержания мелких зерен отмечено на среднеокультуренной почве. Повышение зольности с улучшением агрофона связано, по-видимому, с внесением возрастающих доз удобрений при одновременном повышении степени окультуренности почвы.

В таблице 5 приведены данные, характеризующие основные качественные показатели исследуемых образцов ячиеня, определяющие его' технологические достоинства: пленчатость, стекловиднооть, экотрак-тивность, энергия и способность прорастания, содержание крахмала.

Таблица 4

Характеристика исследуемого зерна ячменя

N | Степень | Уро- |Масса| | |Содер- |

п/п1окультуренкости| жаЛ- 11000 I Нату-| Круп-|жание | Золь

I почвы ¡пасть, |зерен,| ра, ¡ноеть, |мелких | ность,

I I ц/га | г | г/л | 7. | зерен, 7. | Г.

19'Э0г 1991 г

1. Слабоекультуренная, Сез удобрения

2. Среднеокульту-ренная, без удобрений

3. Среднеокульту-ренная, реком. дозы удобрений

4. Среднеокульту-ренная, 27. ФАР

5. Средне о куль туре иная, 3^ ФАР

1990 Г

5. Хорошоокульту-ренная, без удобрений

7. Хоросоокульту-ренная, ре ком. • догы удобрений

8. Хс-рошоокульту-ренная, 37. ФАР

6,5 37,4 622 6,3 34,7 605

20,9 39,7 625 25,3 36,9 621

29.2 40,3 625

38.0 38,3 640

35,6 42,1 632

36.3 36,6 618

37.1 41,1 628 45,0 39,3 634

22,6 43,0 619

33,7 '39,4 621

31,9 41,5 622

70,1 12,6 1,57 85,7 4,0 1,62 '

85.4 4,2 1,-86

86.5 2,9 1,74

80.0 5,2 1,99 93,4 1,6 1,89

81,4 4,1 1,76

85.4 3,9 1,70

90.1 1,5 1,80

88.5 3,8 1,86

88,0 2,2 1,85

67,0 4,6 1,69

86,1 . 5,1 1,87

ТаСлкца 5

Характеристика исследуемого зерна ячменя

N 1 Степень Плен- Стек- |Эстрак- |Энер-| Спо-

п/п1окультуренности ча- ло- | тив- | гия 1 соб- Крах-

| почвы тость, вид- |ность, |про- I ность мал,

1 ность 1 Г |рас- | прорас-

1 1 |тания,| тания,

1 1 1 X 1 *

1990 Г

1991 Г

1. Слабоокулъту-

ренная, без 8,1 63 46,9 79 88 54,1

удобрений 8,1 64 49,3 79 80 55, 2

2. Среднеокульгу-

ренная, беэ 7,9 69 75,9 84 92 57,8

удобрений 8,8 63 70,8 92 94 57,3

3. Среднеокульту-

ренная, реком. 9,5 70 81,0 87 96 61,0

дозы удобр. 7,9 73 80,7 90 91 62,9

4. Среднеокульту- 8,2 73 78,1 88 90 58,6

ренная, 27. ФАР 8,9 75 78,4 89 97 60,6

5. Среднеокульту- 8,2 74 71,1 83 96 63,9

ренная, 37. ФАР 8,8 76 79,0 90 97 65,2

1990 г

6. Хороиоокульту-

ренная, Сеэ 9,9 76 73,0 82 05 63,5

удобрений

7. Хорошоокульту- •

рекная, реком. 7,9 76 72,0 89 94 58,8

дозы удобр.

8. Хоропоокульту-

ренная, 37. ФАР 9,6 73 78,9 8Э 91 63,8

Ю

Из полученных результатов видно, что повышение степени окульту-ренности почвы и внесение различных доз удобрений, в том числе спланированных на усвоение различного количества ФАР, приводит к улучшению целого ряда показателей, определяющих пивоваренные достоинства ячменя. Возрастает жизнеспособность зерна, увеличивается его экстрактивность, наблюдается существенный прирост в содержании крахмала. При этом оптимальные результаты по большинству показателей получены на среднеокультуренной почве.

1.3. Протеолптические ферменты пивоваренного ячменя

Протеолитические ферменты ячменя и ячменного солода имеют большое практическое значение в солодоращении и пивоварении, однако, имеющиеся в настоящее время сведения об этих ферментах недостаточны, что объясняется значительными трудностями, обусловленными тем, что только очень малая часть сложной смеси белков ячменя и солода обладает протеолитической активностью.

В нашей работе были исследованы кислые и нейтральные протеиназы ячменя и солода извлекаемые дисг.^О и нейтральные, извлекаемые 0,35 7о раствором ^СО^.

Экстракция измельченного зерна диет. Н^О показала наличие про-теолигичсской активности при рН 3,8, 6,3 и 8,6. Наибольшей активностью обладают кислые протеиназы, слабее выражена активность нейтральных протеиназ. В щелочной зоне протеолитическая активность незначительна. Таким образом, можно говорить о наличии в ячмене разного типа протеиназ извлекаемых диет. ^О и отличающихся по значению оптимума рН.

Проведенные нами исследования также подтвердили наличие в зерне ячменя и солоде нейтральных протеиназ, извлекаемых раствором ^¿СО^ и обладающих высокой протеолитической активностью при рН 6,26,25. п

Ввиду отсутствия в литературе достоверных сведений б кислых протеиназах и учитывая то, что они имеют практическое»значение в

пивоварении, мы провели исследование этих ферментов. Для этого предварительно были выделены лиофилизированные препараты, которые позволили провести исследования со строго контролируемой дозировкой ферментов.

Определение температурного оптимума кислых протеиназ и их отношение к активатору (цистеину) показало, что максимальная активность кислых протеиназ наблюдается при 55°, что свидетельствует о высокой термостабильности этих ферментов. Можно ожидать, что в условиях технологического процесса, когда создается кислая среда и поддерживается достаточно высокая температура, именно кислые протеиназы будут играть главную роль в превращении азотистых веществ.

Активность кислых протеиназ в присутствии активатора повышается в 1,5-2,0 раза. Кроме того цистеин заметно влияет на устойчивость протеиназ к температурному воздействию. В его присутствии температурный оптимум сдвигается в область более высоких температур на 5?

Исследование термостабильности кислых протеиназ также проводили о активатором и без активатора. Было установлено, что прогревание фермента при 65° без добавок цистеина уке через 20 чин приводит к полной инактивации кислых протеиназ как непроросшего ячменя, так и ячменя различных сроков прорастания. В присутствии цистеина стабильность кислых протеиназ повышается и даже прогревание в течение часа не приводит к полной потере активности.

Термостабильность кислых протеиназ быстро снижается по мере проращивания зерна. Так если протеиназы непроросшего ячменя после 20 мин прогревания при 65° сохраняют около 50% активности, то протеиназы ячменя, прораставшего трое суток, при той же обработке сохраняют только около 2С1/5 своей активности.

Исследование изменения активности кислых протеиназ при прорас-

тании показало, что на протяжении всего срока проращивания наслю-даетсл увеличение активности ферментов. Наиболее интенсивно оно на третьи сутки. За трое суток прорастания активность кислых протеиназ в расчете на I г материала возрастает в 15,5 раза.

При прорастании ячменя наблюдаются изменения в распределении кислых протеиназ по анатомический частям зерновки. В эндосперме и алейроновом слое активность кислых протеиназ, рассчитанная на I г материала, возрастает в течение всего срока проращивания. При этом в алейроновом слое она в среднем в четыре раза выше, чем в эндосперме. В зародыше активность кислых протеиназ очень быстро возрастает на первые сутки проращивания и резко падает на третьи. По -видимому, при прорастании кислые протеиназы мигрируют из зародыша в эндосперм и алейроновый слой.

При расчете активности кислых протеиназ на I г материала за трое суток прорастания в эндосперме она возрастает в 7 раз, в алейроновом слое - в 12 раз; в зародыяе на первые сутки активность возрастает в 4 раза, а затем снижается и к третьим суткам составляет около от максимальной активности.

Изучение ферментов предполагает наличие высокоочищенных ферментных препаратов, так как только получение фермента в очищенном виде позволяет приступить к глубокому и всестороннему его исследованию. Поэтому для более детальной характеристики кислых протеиназ была проведена работа по их выделению и очистке.

Для очистки кислых протеиназ ячменя и солода попользовали разработанную нами схему, включающую подкисление, фракционирование на сефадексе <?-50 и ¿Е-сефадексе С-50, изоэлектрическую фокусировку и ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе ДЕ-52. По этой схеме были выделены кислые протеиназы непроросшего ячменя, ячменя, прораставшего трое суток и промышленного солода. На первой стадии очистки, подкислении, удельная активность кислых протеиназ возрастает в 1,4-3,3 раза практически без потери ферментов. Наиболее

эффективна эта операция для кислых протеиназ непроросшаро зерна.

При фракционировании на сефадексе £-50 максимальная степень очистки достигает II раз. При этом выход ферментов составляет около 95 %.

При разделении на 5Е-сефадексе С-50 максимальная очистка в 27 раз получена для протеиназ непроросшего ячменя. Быход ферментов составляет более 70 %,

Изоэлектрическая фокусировка позволяет получить кислые протеи-назы очищенные, примерно, в 30 раз. Выход ферментов составляет около 20 %.

Несмотря на большие различия белковых комплексов, выделенных из исследуемых объектов, что нашло свое отражение в характере распределения белков при изоэлектрической фокусировке (рис.1), кислые протеиназы во всех случаях фокусировались одним пикоы при рН 4,41. Для получения более полной картины идентичности кислых протеиназ провели аналогичную очистку ферментов эндосперма ячменя, прораставшего трое суток. Бри изоэлектрической фокусировке кислые протеиназы эндосперма также фокусируются одним пикоы при той же значении изоэлектрической точки.

Следовательно, можно считать, что протеолитическая активность в ячмене и солоде при рН 3,8 обусловлена действием одного фермента, а не комплекса протеиназ, как это ранее предполагалось.

Дальнейшая очистка кислой протеиназы на колонке с ДЭАЭ-целлюло-зой ДЕ-52 (фирма Ма^/ло/ч) позволила получить кислую протеиназу ячменя, прораставшего трое суток, очищенную в 106 раз, выход фермента при этом составил 19 %. С помощью разработанной схемы очистки был получен фермент, в значительной мере освобожденный от балласт ных белков, что позволило приступить к изучению его кинетических характеристик.

Из кинетических характеристик исследовали влияние кислотности среды, температуры, активаторов и ингибиторов на активность кислой 14

о

со

СМ

л и

о

о я

(Ч

к и к

0,35+ I

0,30{ 40

0,25 {

0,20^ 60 I

0,15|

0»ю{ 80 0,05|

0,40 * 20$ 0,35 I

§0,30 < ЗД

< 0,25 4 Л I I 0,20 1 б0|5

I 0,15 {

0,05 | 0 1100

70 80 90 100 № фракций

Рис. 1- Изоэлектрическая фокусировка кислых протеиназ зародыша ячменя, прораставшего трое суток: а - диапазон рН 3-10; О - диапазон рН 3-5.

протеиназы. Для определения использовали кислую протеицазу ячменя, очищенную в 29 раз (после изоэлектрической фокусировки).

Максимальная активность кислой протеиназы как и неочищенного фермента наблюдается при рН, равном 3,8.

Оптимальная температура для действия кислой протеиназы равна 50°С, что на 10° ниже значения, полученного для неочищенного фермента.

В качестве активаторов использовали цистеин и восстановленный глютатион. В их'присутствии активность фермента возрастает в 2,5 -3 раза. Использование в качестве ингибиторов ПХМБ и ЭДТА показало, что в их присутствии активность кислой протеиназы подавляется полностью.

Полученные данные позволяют говорить о том, что тиолов.ю группы и ионы металлов одинаково ванны для поддержания активности кислой протеиназы ячменя. Сермент представляет собой металлоэнзш, в состав активного центра которого входят' ¿Н-грушш.

Определение молекулярной массы кислой протеиназы проводили методом гель-хроматографии на сефадексе 6-75. Было установлено, что кислая протеиназа ячменя низкомолекулярный фермент с молекулярной масоой около 17000 Д.

О механизме действия протеолитических ферментов можно судить по характеру образующихся продуктов реакции. Исследование специфичности кислой протеиназы ячменя, очищенной в 29 раз, проводили о использованием кристаллического альбумина животного происхождения и белков зндосперма непроросшего ячменя. Продукты прогеолиэа, образующиеся под действием кислой протеиназы, фракционировали на колонке с сефадексом £-75. Колонку предварительно откалибровали декстра-нои синим и тирозином. Результаты фракционирования продуктов проте-олиза кристаллического альбумина представлены на рис.2. При всех режимах протеолиза непереваренный белок выходит с колонки со свободным объемом, точно соответствующим объему элюции исходного бел-16

лического альбумина на сефадекce G-75: А - калибровка колонки; 0 мин, 5 мин, 30 мин, 60 мин, 120 мин, 180 мин - длительность прогеолиза; С - концентрация белка, мг/мл.

ка. Количество белка по мере углубления протеолиза уменьшается, но профиль злюции белковой фракции остается без заметных изменений - сохраняется постоянной как зона выхода белка, так и общий объем фракций, содержащих его. Одновременно растет количество низкоиоле-кулярных продуктов протеолиза (второй пик), которые выходят с колонки в той же зоне, что и тирозин. При этом практически не наблюдается образования промежуточных продуктов' протеолиза. Фермент, по-видимому, действует по принципу "все или ничего", т.е. белковая молекула, первоначально атакованная ферментом по единичным пептидным связям, теряет свою третичную структуру, в результате чего ее пептидные связи становятся более доступными действию фермента и "осколки" молекулы белка быстро дробятся до аминокислот. Естественно, что разрушение "развернутой" молекулы идет с большей скоростью, чем первичная атака, и поотоиу промежуточные продукты протеолиза не накапливаются.

Особый интерес для выяснения механизма действия кислой протеи-назы представляет исследование продуктов протеолиза естественного субстрата - белков эндосперма ячменя.

Результаты фракционирования продуктов протеолиза белков зндоо-периа непроросшего ячменя под действием кислой протеиназы, полученные с учетом авголитических процессов и механического извлечения белков, приведены на рис.3. Протеолиз белков эндосперма представляет собой более сложную картину по сравнению с ранее рассмотренной. С одной стороны наблюдается переход части нерастворимых белков в растворимое состояние. С другой стороны происходит расщепление белков до низкомолекулярных продуктов протеолиза. В условиях опыта количественно преобладает первый процесс и несмотря на достаточно интенсивное расщепление белков, имеет место непрерывное увеличение высокомолекулярной фракции. Как и в случае с кристаллическим альбумином кислая протепназа ячменя осуществляет глубокое расщепление белков эндосперма без видимого образования промекуточ-18

0,12

0,08

0,04 0

0,08

0,04' О

п

Ни

30 50 {

и30 50

С . * 0,08

0,04 0

О.

0,12

0,08

0,04 О

С 0,16

0,12 0,08 0,04

30 50 1

30 50 1

О-

'30

П

50

15 мин

100 30 иин

п!сГ~

60 мин

лз

150 V

¡и

150

100 120 ыин

150 V

100 180 мин

П2

ТсГ

150

[к,

150 \

Рис.3. (^акционирование продуктов протеолиза белков

эндосперма непророспего ячменя на сефадексе 8-75: С - концентрация белка, иг/ил; У-объеи элщии, ил;

1 - высокомолекулярная фракция;

2 - низкомолекулярная фракция.

ных продуктов, что дает возможность говорить о кислой п^отеиназе ячменя как о ферменте, обладающим низкой специфичностью. При затирании солода кислая протеиназа может обеспечить переход белков в растворимое состояние и частичное разруиение их до низкомолекулярных пептидов и аминокислот.

1.4. Агрофон, белково-протеиназный комплекс и ингибиторы протеиназ пивоваренного ячменя и солода

Качество пивоваренного ячменя и получаемого из него солода во многом определяется набором содержащихся в нем ферментов, в том числе протеолитических. Для выяснения влияния степени окультуренности почвы и доз вносимых удобрений на активность кислых и нейтральных протеиназ ячменя было исследовано 13 образцов зерна ячкеня урожаев 1990 и 1991 годов. Проводилось также исследование активности ингибиторов протеиназ, выделенных по разным схемам: по Аль-Рахыуну (ингибитор I) и по Ибрагимову (ингибитор II).

Результаты, характеризующие исследуемое зерно ячменя по активности нейтральных протеиназ и ингибиторов, были обработаны о помощью метода корреляционного анализа. Обработка проводилась по данным, полученным для образцов ячменя урожая 1990 года. Этот выбор обусловлен тем, что в 1990 году выращивание ячменя проводилось на всех типах окультуренности почв.

Поскольку при выращивании исследуемых образцов ячменя на активность протеиназ и ингибиторов могут оказывать влияние как степень .окультуренности почв, так и дозы вносимых удобрений, корреляционный анализ был проведен отдельно для образцов выращенных на почвах разной степени окультуренности без внесения удобрений, на средне-окультуренной и хорошоокультуренной почвах, о различными дозами удобрений. Анализ полученных данных свидетельствует о наличии тесной взаимосвязи между активностью нейтральных протеиназ и активностью ингибитора I (1= 0,81 ^ 0,037) при выращивании ячменя на

почвах с различной степенью окультуренностью без удобрений. При внесении удобрений на среднеокультуренной почве также сохраняется зависимость нежду активностью нейтральных протеиназ и ингибитора I

п-

(7. =0,72 ± 0,043). На хороиоокультуренной почве внесение удобрений не оказывает влияния на взаимосвязь мекду активностью нейтральных протеиназ и ингибитора I (4=0,14 + 0,013).

Исследование взаимосвязи между активностью нейтральных протеиназ и активностью ингибитора II такие выявило определяющую роль степени окультуренносги почвы (г =-0,66 + 0,059). Однако, корреляционная зависимость в данной случае носит отрицательный характер. Анализ данных, полученных для образцов ячменя, зираценных на сред-неокультуренной почве с различными дозами удобрений, свидетельствует о наличии слабой корреляционной зависимости которая также носит отрицательный характер (г =-0,32 ± 0,024). На хороиоокультуренной почве при внесении разных доз удобрений связь мезду актиглостью нейтральных протеиназ и активностью ингибитора II отсутствует.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что определяющим фактором в формировании уравновешенной системы "протеиназы - ингибиторы" является степень окультуренностл почзы. Роль вносимых удобрений незначительно сказывается на среднеокульту-ренной почве и практически отсутствует на хороиоокультуренной почве.

Кислые протеиназы ячменя, проявляющие активность при рН 3,8, как и нейтральные протеиназы, принимают участие в гидролизе запасных белков зерна. В результате проведенных исследований установлено, что зерно ячменя, полученное на слабоокультуренной почве без удобрений, характеризуется минимальной активностью кислых протеиназ.

Анализ данных полученных на образцах выращенных на среднеокуль-ренной почве, свидетельствует о влиянии вносимых доз удобрений на активность кислых протеиназ. Образцы зерна урожая 1990 и 1991 годов, выращенные без удобрений, имеют самую низкую активность в своей группе (соответственно 0,095 и 0,115 единиц). Последующее вне-

21

сение возрастающих доз удобрений, приводит к рооту активности. В 1990 году максимальная активность кислых протеиназ отмечена йри внесении доз удобрений, спланированных на усвоение 2 % ФАР (0,197 единиц). На хороиоокультуренпоц почве (урожай 1990 г) сохраняется зависимость активности кислых протеиназ от вносимых доз удобрений.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о влиянии степени окультуренности почвы и доз вносимых удобрений на активность кислых протеиназ. Повышение степени окультуренности почвы и внесение доз удобрений способствуют росту их активности.

Поскольку водорастворимая фракция белков является наиболее чувствительной к различным воздействиям, было проведено исследовэтпе влияния степени окультуренности почвы и доз вносимых удобрений на содержание водорастзоримых белков в исследуемых образцах зерна ячменя. Минимальным содержанием водорастворимых белков характеризуются образцы ячменя, выращенные на среднеокультуренной почве без внесения удобрений (1990 г. - 0,94 1991 г. - 1,17 %).

Повышение степени окультуренности почвы способствует росту водорастворимого белка: на среднеокультуренной почве без удобрений в 1990 году содержание водорастворимого белка увеличилось до 1,4 То (прирост 22,16 %), в 1991 году - до 1,44 % (прирост 18,75 %).

Максимальное содержание водорастворимого белка в 1990 году наблюдается на хороиоокультуренной почве с дозами удобрений, рассчитанными 'на усвоение 5 % ФАР (1,71 %).

В 1991 году наибольшим содержанием водорастворимого белка характеризуются образцы со среднеокультуренной почвы с рекоыендуемымми дозами удобрений (1,81 Я и с дозами удобрений, спланированными на усвоение 3 % ФАР (1,64 %).

Полученные результаты подтверждают предположение о влиянии агро-фона на содержание общего белка. . Выявленные количествен-

ные изменения, вполне вероятно, вызывают и качественные изменения

белков, составляющих водорастворимую фракцию, в том числе их молекулярную массу.

Для оценки исследуемой.белковой франции по молекулярной массе применяли колонку с сефадексом 5-75. По результатам фракционирования полученные фракции условно разделили на три зоны олюции: I зона - элюируются белки с молекулярной .массой от 45000 Д; II зона - соответствует молекулярным массам от 10000 до -45000 Д и III зона - белковые фракции с молекулярной кассой менее 10000 Д. В каждой зоне определяли суммарное содержание белка в процентах от общей суммы белков, элюируемых с колонки.

Данные гель-хроматографии на колонке с сефадексом <? -75 водорастворимых белков исследуемых образцов ячменя свидетельствуют о том, что повышение степени окультуренносгл почвы приводит к увеличению их молекулярной массы. Аналогичный эффект г.аблюдастоя при внесении в почву рекомендуемых доз удобрений и доз, рассчитанных на усвоение 2 % ФАР. Дальнейшее увеличение доз вносимых удобрений (рассчитанных на усвоение 3 % ФАР), такие приводит к приросту высокомолекулярной фракции, однако при этом наблюдается увеличение и низкомолекулярной фракции.

Как известно, при прорастании зерна действие ферментов резко усиливается, в том числе и протеиназ. Однако, сведения о влиянии агрофона на активность ферментов при прорастании зерна в литературе отсутствуют. Нами были проведены исследования изменения активности кислых протеиназ при прорастании в течение 3 суток зерна ячменя выращенного на почвах различающихся степенью окультуренности и дозами вносимых удобрений. Полученные результаты приведены в таблице 6. Анализ этих данных свидетельствует об увеличении активности кислых протеиназ во всех образцах исследуемого ячменя на протяжении всего срока проращивания. Однако характер этих изменений, в зависимости от условий выращивания, неоднозначен.

Таблица 0

Изменение активности кислых протеинаэ при прорастании исследуемых образцов зерна ячменя

) | Активность кислых протеинаэ

N н| Степень 1-------

п/п| окультурен- 1непрср. зерно | 1 сутки 1 £ суток | 3 суток

| ности почвы 1

1 1 дА280 1 г; |дАШ) 7- 1 % | дА^д! 7.

1 9 9 0 г.

19 9 1г. 1 1 1 1 I

1. Слабоокульту- 0,0321 100. 10,112 136|0,140|170 |0,155|189

ренная, Сез ■ 0,100| 100 10,135 135|0,160|160 10,182 |182

удобрений 1 1 . .1 1 1

2. Средкеокуль- 0,095| 100 10,142 149|0,162Ц71 |0,200|210

турекная, Сез 0,115| 100 10,140 12110,155|134 |0,185|160

удобрений 1 1 1 1 1

3. Среднеокуль- 0,1551 100 10,185 119|0,197Ц27 |0,215|133

туренная, ре- 0,130| 100 10,180 138|0,190|146 |0,225|173

ком. дозы удобр. 1 1 1 1 1

4. Среднеокуль- 0,197| 100 10,212 107|0,225)114 10,2351119

туренная,2%ФАР 0,145| 100 10,160 1 11010,2001137 1 ' 1 |1,222 |153 1 |

5. Среднеокуль- 0,170| 100 1 10,195 1 1 114|0,210Ц23 1 1 |0,235|138

туренная,3?.ФАР 0,190| 100 10,205 107|0,215|113 |0,235|123

1 9 9 0 г.

6. Хорошоокуль- 0,175| 100 |0,195 11110,2431138 |0,255 |145

туренная, Сез 1 1 1 1 1

удобрений 1 1 1 1 1

7. Хбросоокуль- 0,190| 100 10,245 12810,2601136 |-0,265|139

туренная, ре- 1 1 1 1 1

ком. дозы удобр. 1 1 I 1 1

8. ХЬрошокуль- 0,2121 100 10,225 10610,253Ц19 10,270|127

туренная,37.ФАР 1 1 1 1 1

Для образцов ячменя, выращенных на среднеокультуренной почве, отпечено, что внесение удобрений приводит к снижению прироста активности кислых протеиназ. Снижение прироста активности кислых

Л'

протеиназ с внесением в почву удобрений отмечено и на хорошоокуль-туренной почве. Одновременно отмечено, что уменьшение прироста активности кислых протеиназ при прорастании ячменя наблюдается в образцах, отличающихся высокой активностью в непроросшем зерне.

Данные, полученные на образцах урожая 1991 года, практически полностью подтверждают результаты, полученные на зерне урожая 1990 года.

Исследование изменения активности нейтральных протеиназ при прорастании ячменя впервые было проведено Колесновым (1985). Однако, эти исследования были проведены на одном образце пивоваренного ячменя. В нашей работе исследование изменения активности нейтральных протеиназ при прорастании проводилось на 13 образцах ячменя сорта "Зазерский 85", урокая 1990 и 1991 годов, выращенных на различных агрофонах. Проращивание проводили в течение 3 суток. Как видно из таблицы 7, активность нейтральных протеиназ во всех исследуемых образцах ячменя увеличивается в течение всего срока

I

прорастания. Однако максимальный прирост активности, в основном, наблюдается на 2 сутки проращивания. Особенно резко возрастает активность з образцах ячменя, выращенных на слабоокультуренной почве без удобрений (1990 г. - прирост активности на 2 сутки составил 81 1991 г. - 92 %) и с внесением удобрений, спланированных на усвоение 2 % ФАР (1990 - 95 %). На 3 сутки прорастания темпы прироста активности нейтральных протеиназ ячменя со слабо- и среднео-культуренных почв резко снижаются.

Динамика изменения активности нейтральных протеиназ образцов ячменя, выращенных на хорошоокультуренних почвах отличается от образцов ячменя, полученных со слабоокультуренных и среднеокультурен-

Таблица 7

" "4

Изменение активности нейтральных протеиназ при прорастании исследуемых образцов ячменя

| | Активность нейтральных протеиназ

N N1 Степень I----------------------------------------------

п/п| окультурен- |непрор. зерно) 1 сутки | 2 суток | 3 суток

1 ности почвы 1 -----

1 | •ч 1 Л Ало 7. 1 ДАа0| У' \лАг,д 1 X

1 9 9 0 г.

1 9 9 1 г.

1. Слабоокульту- 0,080 100 10,110 137 |0,145| 181¡0,155(193

ренная, без 0,070 100 10,110 157 10,1351 192)0,1501214

удобрений 1 1 1 I 1

2. Средкеокуль- 0,108 100 |0,120 111 |0,138| 127|0,145|134

туренная, без 0,097 100 10,112 115 |0,152| 156|0,165|170

удобрений 1 1 1 1 1

3. Среднеокуль- 0,105 100 10,117 111 10,1221 116|0,127|120

туренная, ре- 0,105 100 10,113 107 |0,143| 136|0,167|159

ком. дозы удобр. 1 1 1 1 1

4. Среднеокуль- 0,105 100 10,130 123 |0,205| 195)0,2151204

туренная,2ХФАР 0,108 100 10,123 1 113 |0,145| 1 | 134|0,153|141 1 |

5. Среднеокуль- 0,190 100 1 10,110 122 1 1 |0,132| 1 1 146)0,1401155

туренная,ЗХФАР 0,130 100 10,165 126 |0,175| 13710,1981152

1 9 9 0 г.

6. Хорошоокуль- 0,120 100 10,150 120 |0,165| 13210,180 Ц44

туренная, без 1 1 1 1 1

удобрений 1 1 1 1 1

7. Хорошоокуль- 0,125 100 |0,140 120 10,1551 12410,1851148

туренаая, ре- 1 1 1 1 1

ком. дозы удобр. 1 1 1 1 1

8. ХЬрошоокуль- 0,115 100 10,135 117 |0,150| 13010.165 Ц43

туренная.ЗХФАР 1 1 1 1

ных почв с различными дозами удобрений. Для этих образцов прирост активности нейтральных протеиназ, а затем падение темпов прироста их активности носит более плавный характер.

В целом, полученные результаты свидетельствуют о наличии зависимости активности нейтральных протеиназ исследуемых образцов зерна ячменя от степени окультуренности почвы и доз вносимых удобрений.

Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о снижении активности белковых ингибиторов протеолитических ферментов в зсрн ячменя при прорастании (Колеснов, 1987). В наией работе было исследовано влияние степени окультуренности почвы и доз вносимых удобрений при выращивании ячменя на характер снижения активности белковых ингибиторов при прорастании. В работе исследовалось изменение активности ингибиторов I и II по отноаению к собственным (нейтральным) протеиназам и трипсину.

Результаты, характеризующие изменение актизности исследуемых белковых ингибиторов по отношению к нейтральным протеиназам исследуемых образцов зерна ячменн на третьи сутки прорастания показывают, что для всех исследованных образцов наблюдается сникение активности ингибиторов I и II. Однако,характер этого сникения различен. Сравнение данных по активности ингибитора I показывает, что такие как и в непроросшем зерне, максимальная ингибирующая способность ингибитора I в проросшем зерне проявляется среди образцов, полученных со среднеокультуренной почвы. При этом, для образцов, выращенных на почвах о увеличенными дозами вносимых удобрений, характерна более высокая активность ингибитора I. Минимальная активность ингибитора I сохран/яется в зерне со слабоокультуренной почвы без удобрений. Подобная закономерность отмечена как для образцов урожая 1990 года, так и 1991 года.

Изменения активности ингибитора II по отношению к нейтральным протеиназам проросшего зерна исследуемых образцов ячменя, в зависимости от агрофона, носят несколько иной характер.

Наибольшую активность ингибитора XX имеют образцы проросшего зерна со слабоокультуренной почвы. При этом, дозы вносимых удобрений существенного влияния не оказывают.

При анализе данных, характеризующих активность ингибитора I по отношению к трипсину, была отмечена минимальная остаточная активность ингибитора I в проросием зерне урожая 1990 года на слабоокультуренной почве без удобрений. Среди образцов, выращенных на средне- и хорошоокультуренной почвах, минимальные' значения остаточной активности ингибитора I характерны для образцов выращенных без внесения удобрений и образцов, получивших максимальные дозы удобрений, спланированные на усвоение 3^ ФАР. Аналогичная закономерность по ингибитору I отмечена и на проросшем зерне урожая 1991 года.

Остаточная активность ингибитора II по отношению к трипсину колеблется в более пироких пределах: минимальные значения характерны для образцов зерна, полученных на слабоокультуренных почвах без удобрений и образцов, выращенных на хорошоокультуренных почвах без удобрений. Остаточная активность ингибитора II в образцах со сред-неокультуренной почвы характеризуется более высокими значениями, особенно в образцах ячменя 1991 года.

Целью солодоращения является получение солода с высоким уровнем активности ферментов, в том числе и протеолитических. В нашей работе было проведено сравнительное исследование 13 образцов соло- , да по активности кислых и нейтральных протеиназ, выращенных из исследуемого зерна ячменя.

Данные по активности кислых и нейтральных протеиназ полученного солода приведены в таблице 8. •

Сравнение исследуемых образцов солода по активности кислых протеиназ показало, что максимальной активностью обладают образцы, выращенные на почвах с дозами удобрений, спланированными на усвоение 3$ ФАР. Низкая активность кислых протеицаз наблюдается в солоде, полученном из зерна со слабоокультуренной почвы без внесения

Таблица 8

Активность кислых и нейтральных протеиназ солода из исследуемых образцов ячменя

Кислые протеиназы |Нейтральные протеиназы

N N| Степень |-

п/п| окультурен- | Л А2«в |Активность| Ä Ä2SJ |Активность

| ности почвы |ед. прибора | в X от |ед. прибора | в 7. от

1 1 | исходной | | исходной

11 2 | 3 1 4 | 5 ! в

1 9 9 0 Г.

19 9 1г.

1. Слабоокульту- 0,105 123 0,150 187

ренная, без 0,100 100 0,158 225

удобрений

2. Среднеокуль- 0,147 155 0,190 176

туренная, без 0,145 126 0,210 216

удобрений

3. Среднеокуль- 0,150 97 0,182 173

туренная, ре- 0,115 88 0,250 109

ком. дозы удобр.

4. Среднеокуль- 0,160 81 0,240 228

туренная, 2£ФАР 0,150 103 0,280 259

5. Среднеокуль- 0,173 102 0,270 142

туренная, 31ФАР 0,230 121 0,290 223

• 1 9 9 0 г.

6. ХЬрошоокуль- 0,200 114 0,305 254

туренная, без

удобрений

7. Хорошоокулъ- 0,155 82 0,215 172

туренная, ре-

ком. дозы удобр.

8. Хорошоокуль- 0,250 118 0,285 248

туренная, ЗХФАР

удобрений. Активность кислых протеиказ солода полученного из зерна, выращенного на почвах без внесения удобрений и с внесением удобрений спланированных на усвоение З^ФАР, сохраняется , как правило, на уровне, превышающем активность исходного зерна. Солод, полученный из зерна, выращенного на почвах с рекомендуемыми дозами удобрений и дозами, спланированными на усвоение 2% ФАР, характеризуется активностью кислых протеиназ ниже их .активности в исходном зерне. Исключение составляет солод, полученный из зерна урокая 1991 года со ореднеокультуренной почвы с дозами удобрений, спланированными на усвоение 2^ ФАР (103% от исходной активности) и со слабоокуль-туренной почвы без удобрений (102$ от исходной активности).

Анализ данных по активности нейтральных протеиназ исследуемого оолода показывает, что наименьшей активностью обладают образцы, полученные из зерна, выращенного на слабоокультуренной почве без удобрений. Повышение степени окультуренности без внесения удобрений способствует росту активности нейтральных протеиназ солода. Самая высокая активность исследуемых ферментов отмечена в солоде из зерна, выращенного на хорошоокультуренной почве, без внесения удобрений (0,305 ед.прибора). В образцах солода, полученных из зерна, выращенного на среднеокультуренных почвах, различающихся дозами вно-

пр отеиноь

симых удобрений, отмечен рост активности нейтральных"1^ увеличением доз вносимых удобрений при выращивании ячменя. На хорошоокультуренной почве подобного влияния вносимых при выращивании ячменя удобрений на активность нейтральных протеиназ солода не отмечено. Внесение удобрений, наоборот, приводит к снижению активности нейтральных протеиназ солода.

В отличии от кислых протеиназ, активность нейтральных протеиназ исследуемого солода во всех образцах существенно превышает их активность в исходном зерне. Для большинства образцов это превышение составляет более чем в 1,5 - 2,0 раза.

Сравнительные данные, полученные по активности кислых и нейтральных протеиназ солода из зерна, выращенного на почвах различной степени окультуренностя, отличающихся дозами вносимых удобрений, свидетельствуют о существенном влиянии этих факторов на уровень протеолитической активности оолода.

1.5. Изменение белковых веществ в процессе приготовления пивного суола

Для исследования процессов протеоллза при затирании солода использовали двухотварочный способ приготовления сусла для пива "Московское", применяемый на Москворецком пивзаводе.

На всех стадиях - в начале и в конце каждой паузы и в конце отварок - отбирали пробы, в которых определяли содержание сухих веществ, белков (по методу Лоури) и продукюв, не осаждаемых 5% ТХУ (по поглощению при 280 нм). Готовое сусло имело плотность около 13что соответствует промышленным показателям. Содержание азотистых веществ при затираний увеличивается в 3,5 раза, но процесс этот идет неравномерно. Более интенсивное накопление наблюдается при умеренных температурах - 54°-72°С для продуктов, не осаждаемых 5% ТХУ, и 54°-62°С для белковых веществ, определяемых по методу Лоури. При более высоких температурах их прирост небольшой, что-объясняется инактивацией протеолитичеоких ферментов. При кипячении незначительный прирост связан с механическим извлечением некоторого количества азотистых веществ.

Таким образом, изменением температуры по стадиям затирания можно регулировать соотношение между высокомолекулярными и низко-мслекулярными азотистыми соединениями.

Более детальную картину изменения азотистых веществ солода при затирании мы получили при фракционировании отобранных проб на колонке с сефадексом <?-50. Полученные при фракционировании фракция разделили на три зоны элюции. В первой з....е, соответствующей выходу

31

декстрана синего, элюируются белки с молекулярной массой от 19000 Д и выше. Во второй зоне, ограниченной выходом с колонки декстрана и тирозина, элюируются разнообразные пептиды. Они отличаются

пониженным содержанием ароматических аминокислот (слабое поглощение при 280 нм). Третья зона, соответствующая выходу тирозина, элюируются свободные аминокислоты и низкомолекулярные пептиды.

Если в начале затирания на I зону приходится 44,6$ от общего количества азотистых веществ, II зону - 19,9% и III - 35,5$, то в конце затирания на I зону приходится лишь 16,8%, а на III - 58,4%.

Как известно белковые вещества сусла принято делить на три фракции: А, В и С, где А - высокомолекулярная фракция, В - средне-молекулярная и С - фракция, содержащая аминокислоты. Процентное соотношение этих фракций является важным показателем в пивоварении. В нашем случае соотношение азотистых соединений в I, II и III зонах соответствует оптимальному соотношению фракций А, В и С в готовом сусле.

Сравнение результатов фракционирования продуктов протеолиза белков эндосперма непроросшего ячменя под действием очищенной кислой протеиназы с данными, полученными при фракционировании белковых веществ на различных стадиях затирания солода, дает возможность предположить, что накопление высокомолекулярной белковой фракции и значительный прирост аминокислот при приготовлении пивного сусла происходит под действием кислой протеиназы. Образование промежуточных продуктов при затирании происходит под действием других ферментов.

1.6. Влияние агрофона на качество зерна пшеницы

Данные по урожайности и характеристике исследуемого зерна пшеницы свидетельствуют о том, что условия выращивания оказывают влияние не только на рост урожайности, но и непосредственно на показатели

качества зерна. В целом, возросли: масса 1000 зерен, натура, стек-ловидность, содержание общего белка з зерне пшеницы, выращиваемой на почзахоболее высокой степенью окультуренности и с применением удобрений, по сравнению с зариантои опыта, представляющего слабо-окультуренную почву без внесения удобрений. Вместе с тем происходит незначительное повышение зольности, что связано, по-видимому, с внесением больших доз удобрений при одновременном повышении степени окультуренности почвы.

Таким образом, наблюдается улучшение показателей качестза зерна, играющих важную роль в формировании технологических достоинств ио~ следуеыого зерна пшеницы.

С целью.установления влияния различных агрофонов на геометрические признаки зерна пшеницы, на образцах урожая 1987 года были изучены линейные размеры, объем и форма зерновки.

Результаты определения геометрических показателей зерна пшеницы, обработанные с помощью методов математической статистики показывают, что с повышением степени окультуренности почвы возросли длина, ширина, толщина и объем зерновки. Все эти изменения сопровождались уменьшением варьирования морфологических признаков -зерно стало более выравненным.

Применение почв с высокой степенью окультуренности приводит к увеличению линейных и общих размеров зерновки, а небольшие изменения площади внешней поверхности и сферичности позволяют предположить о тенденции к'стремлению зерновки к более округлой форме, что, в овою очередь, должно привести к улучшению показателей при производстве муки.

Исследование жизнеспособности зерна при хранении сводится к опрэделеншо способности и энергии прорастания, силы роста и сравнению этих наиболее чувствительных показателей качества.

Продолжительность хранения методом ускоренного старения была равна 10 оуткам.

Проведенные исследования показали, что в процессе ускоренного старения быстрее "стареет" зерно пшеницы, выращенное на слабоокуль-туренной почве без применения удобрений и обладающее более низкими показателями жизнеспособности (энергия прорастания - 56%, способность прорастания и сила роста - 66%). По мере повышения степени окультуренности почвы и внесения удобрений исходная жизнеспособность повысилась в среднем на 24$ по всем ее показателям. Более стабильным и устойчивым в процессе старения оказалось зерно пшеницы, выращенное на хорошоокуяътуренной почве и о применением интенсивной технологии.

Результаты анализа клейковины доказали, что фактор применения различных агрофонов имеет немаловажное значение при формировании клейковинных белков пшеницы. Наименьший выход сырой клейковины и относительно низкая водопоглотительная способность наблюдаются у образцов пшеницы, выращенных на слабоокультуренной почве без применения удобрений. Остальные образцы отличались большим выходом клейковины и несколько более высокой водопоглотительной способностью по сравнению с вышеупомянутыми образцами.

1.7. Агрофон, нейтральные протеиназы и ингибиторы протеиназ зерна пшеницы

Поскольку применение различных агрофонов оказывало влияние на все показатели качества исследуемого зерна пшеницы, а также на его клейковину, необходимо более детальное изучение технологической роли протеиназного комплекса, как одного из факторов, определяющих хлебопекарное достоинство зерна. Во всех исследуемых образцах зерна пшеницы было проведено сопоставление активности нейтральных протеиназ, ингибиторов I и II нейтральных протеиназ и трипсина, автолитической способности и гакхе содержания водорастворимого белка.

При сравнении активности нейтральных протеиназ и активности ингибитора I по отношению к нейтральным протеиназам установлена удов-34

летворительная корреляционная зависимость между этими показателями ( 1 я 0,78 + 0,092 ). Зерно, обладающее повышенной ироте^олитичео-кой активностью содержало и более мощные ингибиторы протеиназ. Слабая корреляционная зависимость (г = 0,49 + 0,031 ) показана между активностью нейтральных протеиназ и ингибитором II по отношению к нейтральным прогеиназам. ( По этим причинам в дальнейшем рассматривается активность только ингибитора I). Установлена тесная взаимосвязь между активностью нейтральных протеиназ я содержанием водорастворимого белка ( Ч = 0,86 ± 0,018). Между ингибиторами I и II по отношению к трипсину получена зависимость с коэффициентом корреляции %= 0,76 + 0,029. Сравнение результатов по автолитической способности показало ее прямую зависимость от активности нейтральных протеиназ, что подтверждает ранее сделанные Шаненко(1980) выводы об определенной роли нейтральных протеиназ в автолитических процессах в зерновой суспензии и тесте.

Таким образом, подтверждается существование единой системы "лротеиназы - ингибиторы протеиназ", определяющей стабильность про-теиназного комплекса и действие протеолитических ферментов в техно-нологии хлебопечения.

Афинная хроматография является наиболее эффективным методом разделения биологически активных веществ, успешно применяемым для выделения прогеолигичеоких ферментов и их белковых ингибиторов из различных объектов (Ибрагимов, 1987; t1cssezt ¡>kap¿,ъ ,1990). В работе была'попользована афинная хроматография для разделения белковых ингибиторов, выделенных из цельносмолотого зерна пшеницы. В качестве лиганда применялся трипоин, иммобилизованный на СМВг -активированной сефарозе-4В. Полученные после разделения фракции этата контролировали на активнооть по отношению к трипсину и нейтральным протеииазам. Результаты приведены на рис.4.

Из рисунка видно, что ингибитор, не связываемый трипсином,

№ фракций

Рис. Афинная хроматография белковых ингибиторов

протеиназ зерна пшеницы на снвг -активированной еефарозе-4-В-трппсине:

1 - белки, не сорбируемые трипсином;

2 - белки, сорбируемые трипсином;

' ~ ингибитор нейтральных протеиназ; - ингибитор трипсина.

обладает способностью по отношению к нейтральным протеиназаы, не оказывая никакого действия на трипсин, и наоборот, ингибитор, связанный с ишобилизозанным трипсином, характеризуется ингибирукнцей способностью по отношению к трипсину и практически не подавляет активности нейтральных протеиназ.

Таким образом, подтверждается наличие в зерне ингибиторов двух типов: первых, специфичных к нейтральным протеиназам, и вторых, специфичных к трипсину.

С целью изучения распределения активности ингибиторов трипсина и нейтральных протеиназ по анатомическим чаотям зерновки пшеницы

были выделены ингибиторы из цельносмолотого зерна пшеницы, эндосперма и зародыша. Полученные результаты приведены в таблице 9. При расчете исходили из того, что на эндосперм и зародыш приходится соответственно около 75 и 3/5 от всей массы зерновки.

Таблица 9

Распределение ингибиторов собственных протеиназ и трипсина по анатомическим частям зерновки пшеницы

Части зер- : нозки : Мнгибирующая способность^ : Распределение инг'олтороз по зешювке, %

: на собственные протеияазы : на трипсин :на собственные: на трипоин : протеиназы :

Целое зерно 48 36 100 - 100

Эндосперм 49 67 76 6 8

Зародыш 15 15 I I

Приведенные в таблице данные позволяют сделать вывод о преимущественной локализации ингибиторов в эндосперме.

1.8. Технологическая характеристика зерна пшеницы, выращенного на различных агрофонах

I.8.I. Характеристика мукомольных свойств

С целью изучения влияния .различных агрофонов на мукомольные свойства исследуемого зерна пшеницы были проведены лабораторные помолы. Мука, полученная из зерна пшеницы, выращенного на слабоокуль-туренной почве без удобрений по цвету была несколько темнее остальных образцов, что объяоняетоя повышенным содержанием в ней отрубя-ниотых частиц.

Ыукошмьные овойства зерна оценивали по выходу муки и зольности,

а также о помощью технологического показателя К= , где:

, z

И - извлечение муки, Z - зольность муки.

Результаты характеризующие изменение мукомольных свойств зерна пшеницы, выращиваемого на различных агрофонах в течение 3 лет (таблица 10), подтверждают наличие тесной взаимосвязи между условиями

выращивания и мукомольными овойствами, а именно: по пере повышения степени окулмуренности почвы и внесения удобрений, мукомольные свойства зерна значительно улучшаются.

Таблица 10

Характеристика мукомольных свойств продуктов помола исследуемого зерна наеницы

№ : Степень : Twn7r пп : окультурен- :

: ности почвы ; "j^i/"

Зольность, '

К

1987 г.

1. слабоокультур. 75,5 без удобрений

2. среднеокультур. 73,2 без удобрении

3. среднеокультур. 74,3 рек.дозы удобр.

4. хорошоокультур. 74,0 без удобрений

5. с применением'. 72,7 интенс.технол.

1988 г.

6. слабоокультур. 75,8 без удобрении

7. среднеокультур. 74,1 без удобрении

8. среднеокультур. 73,6 рек.дозы удобр.

9. хорошоокультур. 74,1 эк.дозы удобр.

рек.дозы удобр,

с применением. интенс.технол.

1990 г.

слабоокультур. без удобрений

среднеокультур. без удобрений

среднеокультур. рек.дозы удоор.

хорошоокультур. . бе-а удобрении

15. хорошоокультур. рек.дозы удобр.

10

11

12

13

14

73,0

75.6

73.2

74.3

73.7 74,3

1,06 0,84 0,73 0,71 0,68

1,01 0,82 0,70 0,72 0,69

1,02 0,89 0,75 0,80 0,70

71

87 102

104 107

75 90

105 103

106

74 82 99 92 106

1.8.2. Оценка хлебопекарного достоинства зерна пшеницы

Хлебопекарное достоинство исследуемого зерна пшеницы оценивалось по результата« пробных выпечек. Результаты исследований (часть вариантов) представлены в таблице II.

Таблица II

Показатели качества хлеба из образцов пиеницц урожая 1987 - 1988 г.г.

f,'ï№ пп : Степень :Удолышй:Формоус-: окультурен- : объем :тойчи~ : носги почвы :хлеба, :вость, : :см3/Ю0г: (Н:Д) ■: Пористость, : % • :Кислот-:ность, ; °н •:Балльная : оценка, : балл

1987 г.

I. слабоокультур. без удобрении 200 0,29 73 5 56

2. среднеокультур. без удобрении 202 0,32 74 4,5 64

3. среднеокультур. рек.дозы удобр. 250 0,36 76 4,5 73

4. хорошоокультур. без удобрении 204 0,44 74 4,0 68

5. о применением. интенс.технол. 1988 г. 216 0,45 75 4,0 72

6. слабоокультур. без удобрений 330 0,43 77 4,5 74

7. среднеокультур. без удобрений 320 0,40 77 4,5 71

8. среднеокультур. рек.дозы удобр. 335 0,49 78 4,5 78

9. хорошоокультур. рек.дозы удобр. 289 0,39 76 4,0 74

10. , с применением, интенс.технол. 294 0,54 7S 4,0 73

Низкими хлебопекарными свойствами обладали образцы пшеницы, выращенные на олабоокультуреиной почве без применения удобрений. Зыпеченный хлеб имел минимальные балльные оценки. Наиболее высокие балльные оценки по всем показателям качества хлеба получены для образца пшеницы, выращенного на среднеокультуренной почве с рекомендуемыми дозами удобрений. Установлена взаимосвязь между активность»

нейтральных протеиназ и удельным объемом хлеба ( 1 = -0,70 ^ 0,12), что свидетельствует о важной роли протеиназ, как одного из факторов, определяющих хлебопекарное достоинство зерна пшеницы.

1.8.3. Улучшение хлебопекарного достоинству муки, полученной из исследуемого зерна

пшеницы

В ряде отечественных и зарубежных исследований обосновано использование муки из амаранта в хлебопечении для замены части пшеничной муки (Матвеева и др.,1991; Пучкова и др., 1993; 1сгепг,$981;Парада, 1991). Преимущество этой культуры заключается в ее высокой биологической ценности. Белки амаранта лучпе, чем пшеничные,сбалансированы по содержанию незаменимых аминокислот. Применение амаранта позволяет улучшить качество хлеба, ускорить тестоприготовлелие. Однако в опубликованных работах недостаточно раскрыты технологические возможности амаранта при использовании пшеничной муки разного хлебопекарного достоинства.

С целью изучения влияния добавок муки амаранта на качество хлеба из пшеничной муки разного хлебопзпарного достоинства проводили пробные лабораторные выпечки о заменой 5% пшеничной муки на муку из семян амаранта. Образцы пшеничной муки с разными хлебопекарными свойствами были получены из зерна урожая 1992 года, выращенного на слабо-, средне- и хорошоокультурешшх почвах с различными дозами вносимых удобрений. Полученная пиеничная мука (8 образцов) удовлетворяла стандартным требованиям, предъявляемым к пшеничной муке I сорта. Опытные образцы хлеба превосходили контрольные по ряду показателей: удельному объему - на 6-20%, объемному выходу на 4-28$, общей деформации мякиша, определяемой на пенетрометре АП-4/2, - на 7-27/5, однако формоустойчивость подового хлеба как правило снижалась. По органолептическим характеристикам образцы хлеба с амарантом были либо лучше, либо на одном уровне с контрольными. Влажность

и кислотность хлеба с амарантом соответствовали нормативным требованиям на сорт хлеба данной рецептуры без амаранта.

Различие в хлебопекарных свойствах пшениц, выращенных на равных агрофонах, оказывало влияние на результат, получаемый от применения муки амаранта в хлебопечении. Наибольшее положительное влияние добавок амаранта проявлялось при выпечке хлеба из пшениц, выращенных на среднеокультуренной почве. Балльная оценка этих образцов хлеба была наиболее высокой и составляла 80-85 баллов, что на 4-5 баллов выше контроля. Слабее влияние амаранта проявилось при иопользочании муки из пшеницы, выращенной на слабоокультуренной почве. При выпечке хлеба из пшениц, выращенных на хороыоокультурен» ной почве, положительный эффект от внесения муки амаранта был наименьшим.

Качественные характеристики пшеничного хлеба зависят в первую очередь от силы муки, от структуры и свойств клейковины, образуемой белковыми соединениями муки. Из литературных данных (Парада,1991) известно, что белки амаранта клейковину не образуют. Поэтому уоха-новив, что результат добавления муки амаранта при выпечке хлеба зависит от исходных свойств пшеничной муки далее исследовали влияние добавления муки амаранта на количество и качество клейковины исследуемых образцов пшеницы«

Было установлено, что добавление муки амаранта к размолотому зерну пшеницы не оказывает сколько-нибудь значительного влияния на выход оырой клейковины, однако качество клейковины улучшается -почти все образцы о добавлением амаранта по показаниям ИДК-I были отнесены к I группе - хорошей, в то время как исходное зерно имело клейковину удовлетворительную слабую. При этом укрепляющее действие добавок амаранта отмечено для всех исслодусмых образцов пшеницы, выращенных как на слабоокультуренной, так и на средне- и хоропо-окультуренных почвах.

выводы

1. Проведены комплексные исследования зависимости фиаиоло-го-биохимических процессов в зерне от используемых при выращивании агрофонов, что позволило выявить их взаимосвязь с технологическими достоинствами исследуемого зерна.

2. Исследованы показатели качества зерна пивоваренного ячменя и мягкой озимой пшеницы, выращенного на различных агрофо-нах.

Показано, что:

- повышение степени окультуренности почвы и внесение возрастающих доз удобрений увеличивает массу 1000 зерен, натуру, стекло-видность, крупность исследуемого зерна. При этом снижается содержание мелких зерен;

- улучшение агрофона способствует увеличению экстрактивности ячменя, изменяется его пленчатость, возрастает содержание крахмала, наблюдается прирост водорастворимых белков и возрастание их молекулярной массы. В зерне пшеницы увеличивается количество клейковины.

3. Исследована жизнеспособность зерна ячменя и пшеницы, выращенного на различных агрофонах.

Установлено, что:

- повышение степени окультуренности почвы и внесение удобрений способствует увеличению энергии и способности прорастания;

- образцы ячменя, выращенные на улучшенных агрофонах, в отличие

от образцов, выращенных на слабоокультуренной почие без удобрений, соответствуют требованиям, предъявляемым к пивоваренному ячменю;

- более высокая жизнеспособность характерна для образцов, выращенных на среднеокультуренной почве.

4. Процесс ускореного старения показал, что быстрее ".'■таре ют" семена пшеницы, выращенные на слабоокультуренной почве без применения удобрений, а более стойким оказалось зерно пшеницы, выращенное на хорошоокультуренных почвах и с применением интенсивной технологии.

5. В альбуминной фракции ячменя и ячменного солода обнаружены три группы протеиназ: кислые, нейтральные и щэлочние, оптимум рН которых 3,8, 6,3 и 8,6. Показано, что:

- наибольшей активностью обладают кислые протеиназы;

- при прорастании зерна активность кислых протеиназ за трое су*-ток возрастает в 15,5 раз (в расчете ка 1 г материала). При этом в эндосперме она возрастает в 7 раз, в алейроновом слое -в 12 раз, в зародыше на первые сутки активность кислых протеиназ возрастает в 4 раза, а затем снижается и к третьим суткам составляет около ЗОХ от максимальной активности;

- кислые протеиназы ячменя активируются цнстеином. Максимальная активность наблюдается при концентрации цистеика 0,20-0,257.. Оптимум температуры неочищенных кислых протеиназ без активатора составил 50°С, с ага-иватором - 65°С. При прорастании ячменя их термостабильность снижается.

6, Разработана схема очистки кислых протеиназ ячменя и ячменного солода, включашдя: подкисление, гель-хроматографию на сефадексе G-50, ионообменную хроматографию на SE-сефадексе С-50 и ДЭАЭ-целлюлозе ДЕ-52 и изоэлектрическую фокусировку. Достигнута максимальная очистка фермента в 106 раз.

Установлено, что: • - протеолитическая активность в ячмене и солоде при pH 3,8 обусловлена действием одного фермента;

- кислая протеиназа ячменя является метадлоэнзимом, в состав активного центра входят SH-группы, на что указывает ее ингиби-рование ПХМБ и ЭДГА и активация цистеином и восстановленным глютатионом;

- молекулярная масса очищенной кислой протеинааы равна 17000 Д, оптимум pH - 3,8, температурный оптимум - 50°С, изоэлектричес-кая точка - 4,41;

- кислая прогеинаэа может быть охарактеризована как фермент, обладающий низкой специфичностью. При гидролизе белков эндосперма ячменя, она обеспечивает переход белков из нерастворимого состояния в растворимое и их гидролиз до аминокислот и низкомолекулярных пептидов.

7. Исследовано влияние агрофонов на активность протеиназ пивоваренного ячменя, ячменного солода и мягкой озимой пшеницы. Выявлено, что:

- повышение степени окудътурекностк почвы и внесение дополнительных доз удобрений вызывают в исследуемом зерне существенные различия в их активности;

•* на характер изменения активности кислых и нейтральных протеиназ при прорастании ячменя влияет состояние агрсфсна;

- уровень активности кислых и нейтральных протеиназ ячменного солода зависит от,доз вносимых удобрений.

8. Проведено исследование активности ингибиторов нейтральных протеиназ и' трипсина, выделенных из зерна озимой мягкой пшеницы и пивоваренного ячменя:

- использование "афинной хроматографии подтвердило наличие в зерне пщеницы ингибиторов двух типов: первых, подавляющих активность трипсина, и вторых - подавляющих активность нейтраль-

■ ных протеиназ;

- максимальная активность ингибиторов протеиназ наблюдается в

*

эндосперме зерновки пшеницы;

- выращивание ячменя и пшеницы на различных агрофонах приводит к существенным различиям в активности белковых ингибиторов собственных протеиназ и трипсина;

- величина остаточной активности ингибиторов протеиназ в проросшем зерне зависит от. степени окультуренности почвы и дозы вносимых удобрений.

N •

9. С помощью корреляционного анализа установлено, что:

- для образцов пшеницы, выращенных на различных агрофонах, имеет место зависимость ■ между активностями ингибиторов трипсина выделенных по различным схемам (г =• 0,76 ± 0,029), между активностью нейтральных-протеиназ и их ингибиторов, выделенных по схеме Аль-Рахмуна (г » 0,78 ,± 0,092), а также тесная зависимость между активностью нейтральных протеиназ и содержанием в исследуемом зерне водорастворимого белка (г * 0,86 ± 0,01а);

. - для исследуемых образцов ячменя, тесная взаимосвязь между активностью нейтральных протеиназ и активностью ингибиторов, вы-

деленных по схеме Аль-Рахмуна (г = 0.81 ± 0,037), наблюдается в зависимости от степени окультуренности почвы. При внесении удобрений эта зависимость сохраняется только на среднеокульту-ренной почве (г » 0,72 ± 0,043);

- определяющим фактором в формировании уравновешенной системы "протеинаэы-ингибиторы" является степень окультуренности почвы.

10. Изучено изменение белковых веодэств в процессе приготовления пивного сусла. Показано, что при затирании солода накопление отдельных фракций азотистых соединений происходит неравномерно, и к концу затирания резко увеличивается удельный вес низкомолекулярных фракций (аминокислоты и низкомолекулярные пептиды),' га образование которых ответственна кислая протеина-га. .

11. Проведена оценка технологических достоинств исследуемого зерна пшеницы. Установлено, что:

- повышение степени 'окультуренности почвы, в сочетании с внесением рекомендуемых доз удобрений, приводит к максимальному улучшению мукомольных свойств исследуемого зерна, дальнейшее увеличение вносимых доз удобрений, как правило,, не оказывает существенного влияния на мукомольные свойства;

- хлеб из муки, полученной из зерна, выращенного на среднео-культуренных почвах, как правило, обладает Солее высоким качеством;

- между активностью нейтральных протеиназ и удельным объемом хлеба имеется корреляционная зависимость (г - - 0,70 ± 0,012),

Что подтверждает роль нейтральных протеиназ, как одного из ■

факторов, определяют хлебопекарное достоинство зерна - добавление муки амаранта в пределах 5?. максимально повиет-?? хлебопекарное достоинстео муки из зерна, полученного со с;<е,':;;>'-окультуренной почвы. Укрепление клейковины при добавлении мук;: амаранта отмечено для всех исследуемых образцов псеницы.

12. Полученные результаты по основным подателям качсс.;-: зерна, свидетельству*.? о преимуществе выращивания в услоп Нечерноземья пивоваренного ячменя и озимой мягкой ггжиц'.! нч среднеокультуренных почвах с дозам]1 удобрения не пил? рекомендуемых.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ШЕРИАЛАЛ ДИССЕРТАЦИИ

1. Целик-Саркискн С,С., Карпиленко Г.П., Ыапош'.икоь Г.Л, Сравнительное исследование I и II компонентов легоглобина люпл-на желтого.//Тезисы докладов Всесоюзно;'! ;сол:]о])онц:::т "Лоханиi > биологичоскоП фиксации молекулярного азота",L! .,1971,19.

2. Карпиленко Г.П., Попов Ц.П» Распределение протеаз ячиенн и ячменного солода по анатомический частям.//Известия вузов СССР, Пищевая технология,^ 6,30,1973.

3. Генералова Т.Г., Ауэриан Т.Л., Карпиленко Г.П. Псследозкик • г утаиинсинтетазы кориовых дройжой. //Прикладч:--.

биохимия и микробиология, т,1Х, 3.1,26,1973.

'i. Попов 11.П,, Карпиленко Г.П., Белов В.Б., Хныкин А.и.Протоаз!,' пивоваренного ячаеня и солода.//Сб."Хранение и переработка зерна", серия"Блозаторная промышленность",Ц., ЩШПТЗН Мнкзага СССР, »;3,20,1973.

5. Ыелик-Саркиспн С.С., Карпиленко Г.П., Шапоыников Г.Л. Сравнительное исследование I и II коыпононмв легоглобина Ленина желтого .//об ."Иехани ац биологической фиксации иолскуллрниго азота.Черноголовка,58,1973.

G. Попов II.П., Карпиленко Г.П. Исследование кислых протеаз с теля и ячменного солода .//Прикладная виохжшя и микро^ло;:?"

гия, т.Х, в.2,301,1974.

7. Попов Ы.П., Карпиленко Г.П., Глинская E.H. Исследование киолых протеиназ ячменя и ячменного солода.//III биохимический съезд, Рефераты научных сообщений, Рига, г.1,1974.

8. Карпиленко Г.П., Попов М.П. Свойства кислой протеиназы ячменя.// Прикладная биохимия и микробиология, т.XI, в.5,757,1975.

9. Мелик-Саркисян С.С., Башпрова Н.Ф., Владзиевокая Л.П., Карпиленко Г.П., Кретович В.Л. Изучение легоглобина клубеньков люпина методом изоэлектрического фокусирования.//Известия АН СССР, серия биологическая, Й 6,837,1975.

10. Попов М.П., Дубцов Г.Г., Карпиленко Г.П. Изменение активности ферментов пшеницы при прорастании.//Труды Горьковского сельскохозяйственного института, т.102, 39,1976.

11. Любушкин В.Т., Карпиленко Г.П., Рыкова А.И., Лыкова И.В., Панкратова Т.С. Влияние физических параметров и химического ооотава зерна лопающейся кукурузы на его взрываеыость.// Сб."Хранение и переработка зерна", серия "Комбикормовая промышленность",!^, ЩШТЭИ Минзага СССР, з.З, 18,1975.

12. Попов М.П., Карпиленко Т.П., Глинская E.H. Исследование продуктов протеолпза альбумина и белков эндосперма ячменя кислой протеи-назой ячменя.//Прикладная биохимия и микробиология, т.ХП,в,3,438, 1976.

13. Мельников Е.М., Карпиленко Г.П., Суровегина Л.И. фракционирование водорастворимых белков рисовой крупы.// "Научно-технический реферативный сборник", серия "Мукомольно-крупянея промышленность", М.,ЩШШ Динзага СССР, в.4, 26,1977.

14. Калошина E.H., ГаПденко М.В., Карпилеико Г.П. Исследование процесса сушки гранулированиях комбикормов для рыб.//"Научно-реферативный сборник", серия: Комбикормовая промышленность. 11., ЩШТЭИ Нинзага СССР, в.3,8,1978.

15. Попов U.П., Алексеева ¡1.11., Карпиленко Г.П. Методические указания по органической хиши о основами биохимии.// !.!ТИПП, М., 1979. • .

16. Топунов А.Ф., Медин-Саркисян С.С., Лысенко Л.А.,й'арл;1лгтко ГЛ., Крстовнч В.Л. Цетлегоглобинредуктаза клубеньков лклина.Некоуор:-свойства.// Биохимия, М., т.45, в.II,2053,1980.

17. 1!;аСаков М.С., Мельников ü.M., Карпиленко Г.П. Исследование 4 В

¡лизистых веществ овса методами гель-хроматографии и ионообиен-юй хроматографии.//Известия вузов, Пищевая технология, №3,109, :98i.

8. Попов М.П., Карпилешсо Г.П., Ауэрман Т.Л., Сахарова И.А. и др. 'азработать химические методы контроля качества комбикормов.// )тчет по х/д теме, te гоорегистрации 79048802,1981,

9. Некрасова Е.А., Карпилеико Г.П., Пружанская В.Ю. Получение ¡ысокоочшценной липазы «n.yz.q4. 1414.// У Всесоюзный сим-:озиум по инженерной энзимологии. Кобулети,май,302,1985.

:0. Аузрман Т.Л., Карпилеико Г.П., Полоцкая И.В., Голубева Л.;!., !вядищ И.Ф. Выделение, очистка и некоторые кинетические свойства ■лутаминазы пекарских дрожжей.// Прикладная биохимия и микробиология, 1.20, № 3,355,1984.

I, Джелилова М.К., Карпилеико Г.П., Залзсская Е.В., Надыкта В.Д. ¡лияние условий хранения на белковые вещества рапса.// Масло- жи-|Овая промышленность, №1,6,1986.

:2. Панкратов Г.Н., Карпилеико Г.П. Лабораторный практикум Ntiiogaje ejes ^»«»«s".//Национальный институт легкой и пищевой ромишленности,Алжир,Бумердес,1986.

,3. Попов М.П., Алексеева И.И., Карпилеико Г.П. Методические ука-¡ания к проведению лабораторных работ по органической химии о ооно-ами биохимии.// 1ШПП, М.,1986.

:4. Попов М.П., Ауэрман Т.Л., Карпилеико Т.П., Генералова Т.Г. и р. Разработка методов определения декстринов в комбикормах.// атериалы У Всесоюзного биохимического съезда.М.,т.3,191,1986,

5. Пивцаева U.M., Осташенкова Н.В., Карпилеико Г.П. и др» риыенениа ферментного препарата протосубтилина Г10Х для получения оввого гидролизата.// Материалы 3 Всесоюзной научно-технической онференции "Разработка процессов получения комбинированных про-уктов питания",U«,65,1988.

6. Ли Е.В., Карпилеико Т.П., Хайнике Р. Особенности зерна пшеницы, ыраценной на различных агрофоиах,/Материалы Всесоюзной научной онференцич "Пути повышения качества зерна.и зернопродуктов, улуч-енип ассортимента крупы, муки и хлеба",«1.¿59,1989.

7. Карпилеико Т.П., Калунянц К.А., Шпрочнна Т.Н., Филишова В.Е. ель-хроматография пе ¡политических ферментов.//Тезисы докладов оналыюй конференции "Молекулярная сорбция биологически активных

веществ",Пенза,69,1990.

28. Карпиленко Г.П., Алексеева И.И., Коссова О.В., Посемейник С.М О роли летучих компонентов при самосогревании отрубей в повышении взрывобезопасности мукомольных заводов.//Всесоюзная научно-практи ческая конференция "Основные направления научно-технического лрог ресса в мукомольной промышленности". ГКНТ СССР,ВНПО "Зернопродукт М.,1990.

29. Попов М.П., Алексеева И.И., Ауэрман Т.Л., Генералова Т.Г., Карпиленко Г.П. и др. Разработка метода определения содержания декстринов в продуктах детского питания.//Тезисы докладов Всесоюз ной конференции "Химия пищевых веществ. Свойства и использование биополимеров в пищевых продуктах".Могилев,29-31 мая,135,1990.

30. Карпиленко Г.П., Казаков Е.Д., Ли Е.В. Морфологическая характеристика зерна пшеницы при интенсивном режиме выращивания.// Зер новые культуры,М.,№6,29,1990.

31. Алексеева И.И., Карпиленко Г.П., Попои М.П. Методические указания по курсу "Основы биохимии о началами органической химии" //МГИПП,М.,1990.

32. Попов М.П., Ауэрман Т.Л., Карпиленко Г.П. и др. Изучение ферментов продовольственных культур и микроорганизмов и унификация методов анализа зерновых продуктов.//Сб.рефератов НЛР и 0КР,ВНТ1Щ серия 12,Пищевая промышленность,№ ^,25,1991.

33. Ли Е.В., Карпиленко Г.П. Нейтральныо протеазы и их ингибиторы из зерна пшеницы, выращенной на различных почвах.//Сборник матери алов Всесоюзной конференции по пищевой химии,М.,32,1991.

34. Ли Е.В., Карпиленко Г.П. Изменение активности протоаз и их ингибиторов при хранении и искусственном старении зерна пшеницы. //Сб.тезисов докладов ЛИ конференции молодых ученых и специалио тов, посвященной 60-летию образования 1ШПП, 11-14 июня 1991 г.,II

35. Карпиленко Г.П., Ли Е.В., Щеголева И.Д., Шатилова Т.И. Влияш: опособов возделывания пшеницы на хлебопекарное достоинство муки./ Деп. в Ц1ШТЭИ хлебопродуктов,№ 1,5,П235-Хб,1991.

36. Карпиленко Г.П., Ли Е.В. Жизнеспособность семян пшеницы, вире щенноЙ на почвах различной степени окультурзнности.//Тезисы докле. дов научной конференции посвященной 60-лстпю ¡¿ТЛШ1 "Научное обеспечение хрпненип я поре раб :>т-ш растительного сырья в падевой промышленности",М., 32,1991.

Карпиленко Т.П., Щеголева И.Д., Ли Е.В. Влияние технологии 1зделывания пшеницы на мукомольные качества зерна.//Тезиоы докла-IB научной конференции посвященной 60-летию 1ЛГИПП "Научное обеопе-1ние хранения и переработки растительного оырья в пищевой промыш-гсиоехиЦ М.,43,1991.

I. Карпиленко Г.П., Ли Е.В., Диаби U.K., Шатилова Г.И. Особенности |рна ячменя, выращенного на различных агрофонах.//Инф.об.ЩШТЭИ ie6 опр одуктов, в. 4,8,1993.

I,' Карпиленко Г.П., Диаби И.К. Влияние технологии возделывания i качественные показатели пивоваренного ячменя.//Инф.сб.ЩШИТЭй [е<5опродуктов,в.1,3,1994.

I. Карпиленко" Г.П., Щеголем И .Д., Суслянок Г.М. Хлебопекарные юйства пшеницы, выращенной на различных агрофонах.//Инф.сб. :ИИТЭЙ хлебопродуктов,в.2,3,1994.

.. Карпиленко Г.П., Щеролева И. Д., Су о л ян ок Г.М., Шатилова Т.Н. некоторых аопектах улучшения хлебопекарного достоинства пшеничной ки,//Извеогия вузов, Пищевая технология.(В печати).

8акаа 59

Тира» НО

Множительное проиаводотзо "Орион"