автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Биотехнология биологически активной добавки к пище "моллюскам"

На правах рукописи

ДАВИДОВИЧ Валентина Владимировна

БИОТЕХНОЛОГИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ДОБАВКИ К ПИЩЕ «МОЛЛЮСКАМ»

Специальность 05.18.07 - биотехноло! ия пищевых продуктов (биотехнология гидробионтов)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Владивосток - 2005

Работа выполнена в лаборатории БАДов и фармпрепаратов Федерального государственного унитарного предприятия «Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйст-венный центр» (ФГУП «ТИНРО-Центр»),

Научный руководитель - доктор биологических наук, ст н сотр.

Пивненко Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты - доктор технических наук, ст.н.сотр.

Ярочкин Альберт Павлович

- кандидат технических наук, доцент

Лёвочкина Людмила Владимировна

Ведущая организация - Дальневосточный государственный технический

рыбохозяйственный университет (ДГТРУ)

Защита диссертации состоится 15 декабря 2005 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета ДР 307.012.01 при ФГУП «Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр» по адресу 690950, г. Владивосток, ГСП, пер. Шевченко, 4, факс-(4232)300-751.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ФГУП «Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр».

Автореферат разослан « 14 » ноября 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Темных О С

2006- 4

з

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Согласно современным литературным данным, морские беспозвоночные (двустворчатые моллюски, голотурии, морские ежи и др.) содержат уникальные биологически активные вещества различной природы (Слуцкая, 1972; Лебедев, 1974; Новикова и др., 1998; Левинтон и др., 1999). Основную долю азотистых экстрактивных веществ беспозвоночных составляют аминокислоты и родственные им соединения (Кудряшов, Гон-чаренко, 1999). Значительное количество аминокислот представлено соединениями необычного строения: саркозин, фосфосерин, гидроксилизин, триметилгистидин, р-аминомаслянная кислота, цитруллин, орнитин и другие (Аюшин и др., 1999). Наибольший интерес представляют гаурин и гистидинсодержащие дипептиды (аналоги карнозина) как функциональные компоненты, обладающие широким спектром биологической активности.

Особенности химического состава моллюсков позволяют рассматривать их в качестве потенциального источника биологически активных добавок (БАД) к пище, содержащих свободные аминокислоты и их производные. В числе сырьевых объектов могут быть привлечены мантия и щупальца головоногих, фадиционно добываемые гребешок и мидия, а также новые для промысла (спизула, анадара, петушок, мерценария, мактра, каллиста, перонидия и другие) виды двустворчатых моллюсков.

В настоящее время препараты, содержащие свободные аминокислоты, используются как нутрицевтики для лиц, занятых интенсивным физическим или умственным трудом (Ту-1ельян и др, 1999, Федеральный реестр.. ., 1999) В тоже время не рассматривается вопрос об участии отдельных аминокислот и пептидов, входящих в состав этих препаратов, в антиоксид антной защите организма. Многие аминокислоты способны ингибировать различные формы свободных радикалов (Меныцикова, Зенков, 1993; Нечаев, 2003, Лйвочкина, 1993). К ним относятся ароматические аминокислоты - триптофан, фенилаланин и тирозин, а также серусодержащие аминокислоты - таурин, цистеин, метионин. Наиболее активными антиок-сидангами из компонентов аминокислотной природы являются таурин и гистидинсодержащие дипептиды (ГСД).

Предлагаемые в настоящее время подобные препараты получают синтетическим путем или из отходов животноводства и растениеводства методом гидролиза, преимущественного кислотного, при котором происходит разрушение многих незаменимых аминокислот. При этом вследствие жестких условий полностью распадаются триптофан, треонин и серии, а метионин, цистин, гистидин, лизин подвергаются частичной деструкции. Такие белковые гидролизаты дополнительно содержат продукты неГ рганиче-

ских кислот, амины, окрашенные смолообразные пр

>0 и дру-

гие продукты распада биополимеров При дальнейшей очисгке отмечается выпадение из растворов глутаминовой кислоты, тирозина и некоторых других аминокислот (Неклюдов, 2000).

Ферментативный гидролиз, как наиболее щадящий способ деструкции, позволяет сохранить ценные компоненты без нарушения их структуры и модификации Однако в настоящее время этот способ распространен недостаточно. Остается неисследованным целый ряд параметров (например, ионная сила и липофильность реакционной среды), влияющих на активность и специфичность ферментов. Разработанные ранее методы ферментативного гидролиза, должны быть адаптированы к различным видам морского сырья, в том числе к тканям моллюсков. Модификация этих методов позволит регулировать глубину гидролиза, учитывая специфичность ферментов, и ожидаемый состав получаемых БАД к пище. Обоснованные параметры проведения ферментативной реакции для сложных многокомпонентных систем позволят контролировать как количественный выход цетевого продукта, так и его состав.

Целью настоящей работы явилась разработка биотехнэлогии биологически активной добавки к пище «Моллюскам», включая обоснование выбора сырьевых источников и направлений практического применения. Задачи исследований:

- исследование химического состава сырьевых источников для получения БАД «Моллюскам»;

- подбор параметров ферментативного гидролиза применительно к различным видам сырья;

- исследование состава полученных препаратов;

- выявление перспективных дополнительных источников для получения БАД, исследование свободных аминокислот (САК) и гигиенической безопасности;

- разработка методов регуляции скорости, глубины и специфичности ферментативного гидролиза;

- оценка антиоксидантной активности препаратов, содержащих свободные аминокислоты с использованием различных методов;

- оценка безопасности, исследование биологической активности и функциональной направленности действия БАД «Моллюскам».

Научная новизна: Впервые исследован полный состав свободных аминокислот в тканях двустворчатых и головоногих моллюсков, а также содержание таурина и гистидинсо-держащих дипептидов в БАД «Моллюскам» на их основе. Впервые установлено, что соотношение суммарного количества Хал ЕоснЕар = 2:1:1 является устойчивым для БАД «Моллюскам» из двустворчатых и головоногих моллюсков В качестве показателей подлинности

этого продукта предложено использовать указанное соотношение наряду с нижним пределом содержания таурина Исследовано влияние липофильности реакционной среды на скорость и глубину ферментативного гидролиза для одпокомпонентных белковых субстратов и в условиях сложных многокомпонентных систем (тканей моллюсков) Определены пороговые точки концентраций этанола, в пределах которых сохраняется активность ферментов, дан сравнительный анализ состава свободных аминокислот в препаратах, полученных различными методами Обоснованы пути и методы регуляции ферментативного катализа при различных условиях реакционной среды применительно к используемым сырьевым источникам.

Впервые показано, что БАД «Моллюскам» обладает антиоксидантными свойствами. Прямыми и косвенными методами проведена сравнительная оценка аптиоксидантной активности препаратов, содержащих свободные аминокислоты Показана способность компонентов БЛД «Моллюскам» связывать гипохлорит-анион, ингибировать образование свободно-радикального катиона ABTS*+, предотвращать накопление МДА в сыворотке крови in vivo и m vitro.

Впервые установлена безопасность БАД «Моллюскам» и ее эффективность при применении в комплексе лечения ряда заболеваний.

Практическая значимость. Разработан способ получения БАД «Моллюскам», позволяющий наиболее эффективно обогащать целевой продукт свободными аминокислотами и регулировать его состав путем изменения условий реакции. Состав БАД и способ ее получения защищены патентом: №2171066 «Продукт, обогащенный свободными аминокислотами, и способ его получения».

Разработана и утверждена документация на БАД «Моллюскам»: ТУ 9283-24700472012-04, ТИ № 36-247-2004 и двустворчатые моллюски - сырец: ТУ 9253-146-004720122001, ТИ№ 36-191-2001

По результатам экспертной оценки и санитарно-гигиенических исследований в федеральном центре Госсанэпиднадзора РФ «Моллюскам» соответствует требованиям СанПиН и зарегистрирован как БАД' санитарно-эпидемиологическое заключение №77.99 11 003.Т.001763.10.04ог08.10.2004.

Препарат внедрен в производство и выпускается в ФГУП «ТИНРО-Центре» и ОАО «Биополимеры».

Способ комплексного лечения первичной открытоугольной глаукомы с использованием «Моллюскама» внедрен в практику работы на кафедре офтальмологии ВМГУ и Приморской краевой клинической больницы Использование БАД «Моллюскам» позволяет сократить сроки медикаментозного лечения и повысить его качество

Апробация работы: основные положения диссертации были представлены на научно-практической конференции «Состояние здоровья населения Дальнего Востока Новые медицинские технологии с использованием биоресурсов» (Владивосток, 1999); Международном симпозиуме «Пищевые биотехнологии' Проблемы и перспективы в XXI веке» (Владивосток, 2000); региональной конференции молодых ученых «Проблемы экологии и рационального природопользования Дальнего Востока» (Владивосток, 200С1); IV Международном симпозиуме «Биологически активные добавки к пище: XXI век» (Санкт-Петербург, 2002), IX Российском национальном конгрессе Москва, 2002) Международном симпозиуме «Пищевые биотехнологии: проблемы и перспективы в XXI веке» (Владивосток, 2004).

Положения, выносимые на защиту:

Биотехнология БАД к пище, основанная на рационализа щи процесса ферментативного гидролиза, приводит к получению продуктов с высоким содержанием свободных аминокислот, таурина и гистидинсодержащих дипептидов.

Регулирование специфичности, скорости и глубины ферментативного гидролиза включает изменение липофильности реакционной среды и вызывает активацию протеолитических ферментов.

Антиоксидантная активность БАД «Моллюскам», содержащей свободные аминокислоты, таурин и ГСД, проявляется в прямых реакциях нейтрали-.ации свободных радикалов и в опосредованных реакциях накопления продуктов окисления ir vivo и in vitro.

Публикации: по теме диссертации опубликовано 10 работ.

Структура работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть, результаты и обсуждения, выводы, список литературы, содержащий 137 источников (в том числе и 23 зарубежных) Работа изложена на 166 страницах, содержит 27 таблиц, 20 рисунков и 16 приложений.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

Введение. Обоснована актуальность темы, с форму ли розаны цель и задачи исследования, научная новизна и практическая значимость работы.

Обзор литературы. Проанализировано содержание и физиологическая роль свободных аминокислот и дипептидов моллюсков. Показаны основные функции аминокислот и потребность в них животных организмов, а также использование их в качестве БАД и лекарственных средств. Большое внимание уделено оценке антиокси/.антных свойств аминокислот Рассмотрены способы получения препаратов, содержащих свободные аминокислоты Сделан вывод о том, что моллюски могут служить сырьевым источш[ком для получения препаратов содержащих свободные аминокислоты и гистидинсодержащиг дипептиды Наличие у гисти-

динсодержащих дипептидов и некоторых аминокислот, содержащихся в этих препаратах, антиоксидантных свойств позволяет предположить новую для них область использования. Рассмотрены способы получения препаратов, содержащих свободные аминокислоты. Наиболее щадящим методом является ферментативный гидролиз, позволяющий сохранить не только свободные аминокислоты, но и гистидинсодержащие дипептиды. Сделан вывод о необходимости исследования ряда параметров проведения ферментативного гидролиза относительно используемых сырьевых источников.

Экспериментальная часть включает описание объектов, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения. Объектами исследования являлись:

- двустворчатые моллюски: мидии (Mytilus edulus, Mytilus trossulus, Crenomytilus grayanus), гребешок Приморский (Patinopecten yessoensis), спизула сахалинская (Spisula sachalinensis), корбикула (Corbicula japónica), каллисга короткосифонная (Callista brevisiphonata), мерце-нария Стимпсона (Mercenaria stimpsoni), мактра китайская (Mactra chinensis), анадара Бро-утона (Anadara broughtoní); головоногие моллюски: кальмары - тихоокеанский (Todarodes pacificus) и командорский (Berryteuthis magister), отходы переработки минтая (Theragra chalcogramma), мясо тюленя (Phoca largha) заготовленные в экспериментальных условиях на месте промысла и в свежем или замороженном виде доставленные в ТИНРО-центр;

- ферментные препараты: гепатопанкреатин, пилорин, мегатерии, протамекс.

- препараты, содержащие свободные аминокислоты и дипептиды.

- Б АД «Моллюскам».

Схема проведения экспериментальных работ и методы исследования. Экспериментальные работы выполнялись в соответствии со схемой исследований (рис. 1).

Общую протеолитическую активность определяли по методу Е.Д. Каверзневой (1971), коллагенолитическую по методу описанному Т.Н. Пивненко (1998). Определение содержания белка проводили по методу Лоури. Содержание общего азота определяли рефрактометрически (Грачева и др., 1982), аминного азота методом формольного титрования (Шапиро, 1976). Степень гидролиза определяли как соотношение аминного азота к общему. Определение состава аминокислот проводили в стандартных условиях на аминокислотном анализаторе «Hitachi - 935» (Япония), содержания триптофана по методу Девенуа (Devenyi et al., 1991). Накопление растворимых белковых компонентов определяли по модифицированному методу Ансона (Алексеенко, 1968).

Анализ состава белковых фракций проводили методом гель-хроматографии на сорбенте Toyo-pearl-50 (полиэтиленоксидный гель) на колонке 1,5x49 см. Элюцию проводили фосфатным буфером рН 8, со скоростью 0,5 мл/мин.

Рис. I. Схема исследований

Антиокислительную активность препаратов оценивали методом определения кислородной емкости с использованием ABTS - 2.2 азинобис-З-этил-бензотиадолин-6-сульфоновой кислоты (Re, Pellegrini et all, 1999), и по методу определения антиокислительной активности карнозина, с образованием хлораминовых комплексов (Формазюк, 1993).

Содержание малонового диальдегида определяли по модифицированному методу Итабэ и Мацусима с применением тиобарбитуровой кислоты (Чумак, 1992)

Острую и хроническую токсичность препаратов исследовали в Пермской государственной фармацевтической академии в соответствии с требованиями Фармакопеи (ГФ XI, 1990).

Клинические испытания БАД «Моллюскам» проводили на базе следующих медицинских учреждений- поликлиники Медобъединения ДВО РАН, медико-санитарной части работников рыбного хозяйства (МСЧРРХ), глаукомного центра Приморской краевой клинической больницы, краевого гематологического отделения МСЧРРХ, Приморской краевой больницы ветеранов войны и труда, неврологического отделения детской городской клинической больницы, центра восстановительного лечения детей «Альтус» и других.

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с помощью стандартного пакета прикладных программ Statistica-6,0, определяя стандартное отклонение (5), среднюю квадратическую ошибку (т), доверительный интервал (р)

Результаты и их обсуждение.

В разделе «Разработка методов получения препаратов, содержащих свободные аминокислоты» приведены обоснования выбора сырья, включающие техно-химическую характеристику сырьевых источников для получения БАД «Моллюскам» и характеристику состава свободных аминокислот и гистидинсодержащих дипептидов в сырьевых источниках для получения БАД к пище.

Основную долю небелковых азотистых веществ в тканях моллюсков составляют свободные аминокислоты (в среднем 1,3 г на 100 г ткани).

Состав свободных аминокислот для отдельных видов моллюсков отличается как видос-пецифичностью, так и общими характерными чертами: а именно близким содержанием тау-рина и ГСД (табл. 1). В тканях приморского гребешка обнаружено 15 свободных аминокислот. у мидии - 18, преобладающими среди них являются таурин и i лицин.

Из 19 свободных аминокислот, обнаруженных в щупальцах и мантии кальмара, наибольшее количество приходится на пролин, отличительной чертой состава мантии, кроме того, является высокое содержание лизина. Одновременно, наблюдается очень высокий уровень ГСД и невысокое содержание таурина.

Таблица 1

Содержание свободных аминокислот в сырьевых источниках для получения БАД

«Моллюскам» (% от суммы САК).

Г Вещество ^ Приморский ' Мидия 1 Кальмар, мышцы 1

) I гребешок | ] щупалец Г мантии I

\ Таурин | 54,70* ' 50,11» Г 23,15* ) 8,01* !

) Аспарагиновая кислота \ 1,53 ' 3,99 I 1,57 | 0,22 1

Пронин ™0/76 ~Г Г,07 ¡" 0,92 | 0,73 |

[Глутаминовая кислота | 2,84 6,05 1 2,94 Г 1,06 |

Г Про лип | ~ " 0 ~ , 1,35 I ~ 29,0_~ { """29,58 !

(Глицин " [ 26,95 , 20,63 [ " 5,08 [ 1,90 |

ГАЛТниГН " Г 5,17 ~~' 5,69 | 7,92 \ " 4,00 _ |

ГЦисгеин | 0 | 0 Г 0,51 \ 0,06 >

[Валин Г 0,16 г 0,25 \ 0,56 ~ Т 0,44 ~~ \

\ Метионин _ [ следы , " 0,33 ~ "Г 0,58 } 0,52 !

| Йз<отейцин | 0^18 I 0,42 [ " ~0?71 \ 0,59 ~ ~~

[ ЗТейвдш 0,49 | ™0^51 | Ь39 I ТдЗ

| Тирозин | 0,19 5 0^43" | 0,31 [ 0,21

| Фенилаланин Г" 0,23 ' 0,28 \ ~ 0,59 Г °>44 \

[Т^ШШН ——|— г "рГз> I | >

Гбртгган" " ] 0* ' 0,39* -р —— -р- —-

ГЛизин" " I ~"~0ДГ~ ! Пб5 [ 090 | 36Д6

ГГистадин " ОЛТ Г 1>03~ \ ТЛ9

[ Триптофан [ 0~......; 0 "Г 0 [ 0

|Аргинин""" ...........} " " 5,71" " 1 6,09 " " 13,79 _ \ ' 1,85

_ ^ ___ | 6,29* ~ !

р < 0,05, * данные Аюпшна, 1999.

Примечание: содержание свободных аминокислот в сырье составляет: 1,67; 0,91;

1,41; 1,22 г/100 г сырья, соответственно графам.

Высокое содержание САК и ГСД в тканях моллюсков позволяет рекомендовать их в качестве источника этих компонентов. Дополнительное увеличение содержания САК может быть получено методом ферментативного гидролиза.

В качестве перспективных источников исследовали новые для промысла виды двустворчатых моллюсков' спизулу сахалинскую, корбикулу, каллисту короткосифонную, мерценарию Стимпсона, мактру, анадару (табл. 2).

Установлено, что в тканях анадары содержится 14 свободных аминокислот, каллисты -11, мактры - 8, среди которых преобладает таурин. В тканях мерценарии обнаружено всего 5 свободных аминокислот, при этом содержание таурина очень высоко. У всех видов отсутствует свободный триптофан В некоторых видах моллюсков обнаружено высокое содержание

цитруллина и орнитина, которые обладают гепатопротекторным действием, повышают энергообеспечение и стимулируют иммунитет.

Таблица 2

Содержание свободных аминокислот и гистидинсодержащих дипептидов в тканях некоторых видов двустворчатых моллюсков (% от суммы САК).

| Вещество ! Корби- Анадара Мерце- Мактра ! Каллиста

| | кула нария

рГаурин |" 9,47* 47,99* 95,03* 48,13* '" " 70,3*

[ Цитруллин 1 37,9* 9,72* 0* 41,45* 1 17,26*

Гр-Лланин ] 0* 0,81* 0* 0* ! 0,28*

[Орнитин | 0* 2,02* 0* 1,33* | 0*

Г Ароматические аминокислоты, Г 11,14 2,89 3,39 0,69 1,79

[ в том числе триптофан ! о 0 0 0 '• 0

| Дикарбоновые аминокислоты Г 17,49 12,99 0 6,23 1 2,85

[ Диаминокислоты Г 0 11,45 0,35 0 • 0,28

[ Серу содержащие аминокислоты, 1 4,99 1,17 0,45 0 , 0,80

' Алифатические ! 10,37 3,92 0,78 0 1 2,63

| Нейтральные [ 6,29" 2,47 г— о 1 1,62

I Пролин ( н.о. н.о. н.о. н.о. | и.о.

| Гистидин | 2,65 1,84 о 0,15 I 0,49 1

Ггсд 1 о 3,03 0,01 1,47 > 1,79

н.о - не определяли, р < 0,05, * - Аюшин, 1999.

Примечание: содержание свободных аминокисло! в сырье составляет' 1,22; 3,74; 0,84; 0,95, 0,56; 0,69 г/100 г сырья, соответственно графам.

Таким образом, для получения БАД «Моллюскам» могут быть использованы все исследованные виды двустворчатых моллюсков, за исключением корбикулы, вследствие низкого содержания таурина и отсутствия ГСД Использование новых видов и углубленное изучение биологической активности позволит предложить их либо для получения БАД «Моллюскам», либо - других видов БАД.

В развитие научных основ и практических аспектов ферментативного гидролиза весомый вклад внесли отечественные исследователи, в том числе представители ТИНРО-центра (Слуцкая и др 1972; Кузнецов, Ярочкин, 1997; Пивненко,1997). Основные условия и кинетика гидролиза ферментами гидробионтов чистых белков, а также белков в составе некоторых тканей и органов животных были изучены ранее Поэтому одной из задач нашей работы была рационализация основных параметров гидролиза применительно к белкам из тканей моллюсков: время реакции, температура, соотношение фермент - субстрат, рН-оптимум. Наиболее детальной проработки потребовали условия гидролиза мышечной ткани и щупальцев

кальмара, содержащих значительное количество соединитель]-отканных белков, характерных для данного вида сырья, устойчивых к ферментативной дестру кции.

Для проведения гидролиза были использованы ферментные препараты: из панкреатической ткани гидробионтов - пилорин и гепатопанкреатин, содержащие сериновые протеиназы трипсинового и химотрипсинового типа, и микробиальные - мегатерии и протамекс, содержащие протеиназы нескольких подклассов В качестве субстратов для определения активности использовали казеин и коллаген из гольевого порошка (табл. 3).

Основным фактором, лимитирующим глубину гидроли а, являются активность и субстратная специфичность ферментных препаратов Наиболее высокая казеинолитическая активность наблюдалась для ферментов, содержащихся в препаратах микробиального происхождения - протамексе и мегатерине, более высокая коллагенолитическая - в гепатопан-креатине и пилорине.

Таблица 3

Удельная активность протеолитических ферментов в препаратах различного происхождения, среднее ± 5

[ Препарат Г Казеинолитическая актив- Г Коллагенолитическая активность,

| | ность, Пе/г I Е/гх 10"3

[Пилорин [ 17010,5 | 88+1,0

| Гепатопанкреатин > 150 ±0,9 [ 96±1,0 |

| Мегатерии | 340 + 1,2 | 70±0,9 1

| Протамекс | 330 + 0,7 1, 15±0,3 |

Кинетика гидролиза белков тканей моллюсков, при раз гачных концентрациях, подчинялась тем же закономерностям, которые были установлены тля чистых субстратов. Накопление растворимых белковых компонентов оценивали по приросту оптической плотности при 280 нМ. Полученные результаты позволяют рекомендовать для расщепления такого бе-локсодержащего субстрата как щупальца кальмара и манти I гребешка - панкреатические протеиназы, для мышечной ткани кальмара - микробиальные.

Выявлена зависимость степени гидролиза от концентрации используемых ферментных препаратов (рис. 2) Для ферментных препаратов панкреатического происхождения эффективной является концентрация 2,25±0,25 Пе/г, микробиального - 5,0+0,5 Пе/г

2 3 4

Активность, Пе/г сырья

-пилорин ---гепатопанкреятин

• мегатерии — - —протамекс

Рис. 2. Зависимость степени гидролиза от протеоли-тической активности ферментных препаратов на примере мышечной ткани кальмара, I - 37±2 °С, рН для ферментов из панкреатической ткани 8, микроби-альных 6, гидромодуль! :2.

рН оптимумы расщепления белковых субстратов для анионных форм панкреатических протеиназ, к которым относятся ферменты краба и лосося сдвинуты в щелочную область и располагаются для трипсиноподобных протеаз при рН 8-9,5, для химотрипсиноподобных при рН 8,0-9,0. Протеолитические ферменты микробиального происхождения сохраняют высокий уровень активности в широком диапазоне рН - от 5 до 8.

гепатопанк реагин

пилорин

Ч <1

Рис. 3. Динамика гидролиза сырья различными ферментными препаратами 1 - мантия гребешка, 2 - щупальца кальмара, 3 - мышечная ткань кальмара Концентрация ферментного препарата для ферментов из панкреатической ткани гидробионтов 2-2,5 Пе/г сырья, микробиальных 4,5-5,5 Пе/г, рН для ферментов из панкреатической ткани 8, микробиальных 6, гидромодуль 1:2,1 - 37±2 С

Соотношение сырья и воды в реакционной смеси должно удовлетворять двум условиям: максимальному выходу конечного продукта и доступности субстрата для фермента В результате проведенных экспериментов установлено, что гидролиз наиболее эффективен при гидромодуле сырье вода 1 '2 для всех видов используемого сырья

Время, которое требовалось для наиболее полного гидролиза тканей моллюсков, зависело от структуры белков, входящих в состав сырья, и составляло 3-6 часов в зависимости от используемого ферментного препарата (рис. 3). Об окончании гидролиза судили по отсутствию прироста оптической плотности в гидролизуемой смеси.

( оптимум Температурная стабильность

1

температура,°С температура, "С

Рис. 4. Влияние температуры па активность пилорина (1) и протамекса (2) в ходе реакции в течение четырех часов (I оптимум) и после инкубации в течение одного часа (стабильность), субстрат казеин.

Температурный оптимум для панкреатических протеиназ составил 55 °С, для микроби-альных - 50 °С (рис 4) При инкубации ферментных препаратов в течение часа при этой температуре их активность значительно снижается Так как гидролиз тканей моллюсков проводился в течение 3-6 часов, наиболее целесообразные условия температуры - 37+2 °С, при этом остаточная активность составляет 55-45 %, соответственно.

Таблица 4

Рациональные параметры гидролиза сырья для производства БАД «Моллюскам» | Параметры \ Панкреатические протеазы Микробиальные протеазы

| pH , 8,010.5 _ __ __6,711,3

I __ . | ___ ,

1 гидромодуль ! 1:2 1:2

[ время | 511 ; 411

f концентрация ферментного ; 2,2510,25 ' 5,010,5

j препарата, Пе/г <

Обобщенные рациональные параметры для проведения ферментативного гидролиза, которые были определены путем анализа различных вариантов рН, температуры, гидромодуля, времени и концентрации ферментных препаратов представлены в таблице 4.

В таблице 5 представлены основные показатели химического состава БАД «Моллюскам» из двустворчатых и головоногих моллюсков, полученные в этих условиях.

Таблица 5

Общий химический состав БАД «Моллюскам» из различных источников, ± 8

! Показатели, % от массы мидии мантии гребешка щупалец кальмара

1 Липиды ~~ "< 1 ' <1 < 1

1 Белок 19,3 + 0,1 24,88 ±0,2 " 20,67 ± 0,3

•1 ! САК, в том числе 70,5 ± 0,5 62,5 + 0,4 56,5 ± 0,4 "

! таурин ; 7,1 +0,04 3,9 ±0,03 4,7 ±0,03

[ Углеводы <1 " <1 . __

> Минеральные вещества 8,0 ±0,1 8,4 ±0,1 8,2 ±0,1

1 ГСД 2,0+ 0,01 4,0± 0,01 14,3± 0,01

Общее содержание свободных аминокислот составляет 56,5-70,5 % при этом наибольшее количество таурина в гидролизатах мидии, а ГСД - в гидролизатах щупальцев кальмара

При сравнении состава САК в ферментативных гидролизатах из различных источников, сначала были установлены отличительные характерные черты, свойственные только БАД «Моллюскам» (табл. 6).

Аминокислоты

САК в ферментативных гидролизатах из различных сырьевых источников < Содержание, % от суммы САК

Таблица 6

отходы

«Моллюскам»

! > ! ! филетирования минтая ^ морзверя \ 1 мцдия | мантия гребешка 1 щупальца 1 тихоокеанского { кальмара

1 Таурин , 0 7" о , 10,0 М 1 83

' Пролин 3,7 1 4,6 ' 5,9 6,2 Г 5,7 ■ "

1 Нейтральные 11,5 1 12,7 ] 9,8 8,3 [ 5,8

! Дикарбоновые ; 14,7 [ 8,9 [ 15,0 11,5 ! 26,1

| Серусодержащие 1 6,4 ! 2,6 1 4,0 4,8 Г ' з,1........~

| Алифатические 23,9 1 37,3 1 28,0 30,1 I 21,3

, Основные 1 16,3 ! 14,9 1 15,5 17,5 1 14,2

! Ароматические 23,5 ! 18,7~ : 11,5 15,6 12,7

' Еал:£осн:Еар 2 1:2 Г" з-1-1 ' 2:1:1 Г" 2:1:1 | 2:1:1

р < 0,05

Наиболее характерными чертами аминокислотного состава БАД «Моллюскам», позволяющими установить подлинность, являются, во-первых наличие ч то I . . > >

таурина и, во-вторых, соотношение суммарного количества алифатических, основных и ароматических аминокислот - Хал.Уосн-Уар = 211 В препаратах из других источников тау-рин отсутствует, а показатели соотношения выбранных аминокислот варьируются Технологическая схема получения БАД «Моллюскам >.

На основании полученных ре!ультатов составлена технологическая схема получения БАД «Моллюскам», которая включает следующие стадии' подготовка сырья, ферментирова-ние, инактивирование, фильтрование и охлаждение, сушка и измельчение, приготовление готовых форм, хранение.

Составлены и утверждены ТУ 9283-247-00472012-04, ТИ № 36-247-2004. На основании исследований по определению необходимой и достаточной дозы препарата, были разработаны и обоснованны рецептуры готовых форм (табл. 7)

Таблица 7

Рецептура на 1000 г смеси, г: \ Наименование 1 Состав моллюскама |

! компонентов Порошки Г Таблетки Капсулы ;

моллюскам 505 ! 255 637,5

аскорбиновая кислота 121,2 > 122,4 ' 102

микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ) 383,8 Г" 632,4 ' 280,5

кальция етеарат ! - | 10,2

Установленный срок хранения БАД к пище «Моллюскам» для порошков - 1 год, для таблеток и капсул 2 года. В течение этого времени компоненты, входящие в состав БАД, а также качественные характеристики таблеток и капсул сохранялись без изменений в условиях предусмотренных ТУ. Комплект документов на БАД «Мэллюскам» был представлен на экспертизу Госсанэпиднадзора РФ, препарат зарегистрирован в Федеральном реестре БАД РФ, получено санитарно-эпидемиологическое заключение № 77.99.11.003.Т.001763.10.04 от 08.10.2004, позволяющее производить «Моллюскам» в качестве дополнительного источника аминокислот.

Сравнительная характеристика различных методов получения БАД «Моллюскам».

Для оценки эффективности метода ферментативного I идролиза по сравнению с кислотным из аналогичных источников, рассматривали состав (ГАК в препаратах, полученных этими способами (табл. 8).

В препаратах, полученных при помощи кислотного гидролиза, жесткие условия приводят к разрушению ряда аминокислот: полностью - триптофана, частично - метионина, цис-теина. В кислотном гидролизате мидии - МИГИ-К снижено содержание аланина, незамени-

мых аминокислот - валина лизина, изолейцина В «Гремарине», где в качестве сырья используются все мягкие ткани гребешка за исключением мускула, снижено содержание валина, изолейцина и лизина Кроме того, в кислотных гидролизатах количество таурина значительно ниже, по сравнению с ферментативными гидролизатами из аналогичных источников сырья Основным недостатком кислотных гидролизатов является отсутствие ГСД.

Таблица8

Содержание аминокислот и ГСД в препаратах, полученных кислотным и ферментативным гидролизом.

Вещество ( Содержание, % от суммы САК

Таурин Пролин

Нейтральные аминокислоты

«Моллюскам» из мидии

10,0

5,9

МИГИ-К кислотный гидролизаг мидии

Г

«Моллюскам» из мантии

6,7 8,4

Дикарбоновые аминокислоты Серу содержащие аминокислоты Алифатические аминокислоты

9,8 "15,0"

9,9

4,0 28,0

26,57 2,1 29,2

м

6,2

8,3

11,5

4,8 30,1

«Гремарии» * кислотный гидролизах из отходов разделки гребешка

4,9 4,8

9,7

29,3

3,4

""27,6 '

Основные аминокислоты

15,5

10,9

17,5

15,0

Ароматические аминокислоты, ■ 6,1 , 5,6 в том числе триптофан ¡5,4 ' 0

8,4 7,2

53 о

ГСД % от сухой массы

2,0

0

4,0

0

р < 0,05, * - Новикова МБ. и др., 2004.

Примечание: содержание свободных аминокислот составляет 72,5; 71,6; 62,5; 80,1 г/100 г сухой малы, соответственно графам.

Таким образом, сравнение эффективности кислотного и ферментативного гидролиза по предлагаемой технологии позволяет говорить о преимуществе последнего как с точки зрения накопления общего количества САК, так и по сохранению отдельных аминокислот.

Модификация технологии БАД «Моллюскам».

Известно, что проведение реакции ферментативного гидролиза в присутствии органических растворителей позволяет изменить в определенной степени, ход реакции и повысить глубину гидролиза за счет изменения субстратной специфичности. Некоторые органические растворители обладают активационными эффектами. Ряд авторов (Еремеев и др., 1999; Белова и др , 1991) полагает, что замещение воды в гидратной оболочке белковой глобулы на молекулы органического растворителя приводит к структурным изменениям, затрагивающим активный центр фермента.

пилорин гепатопанкреатин

[этанол], % [этанол], %

мегатерии

протамекс

150

5 10 пт 15

[этанол], %

ю

[этанол], %

Рис 5. Влияние различных концентраций этилового спирта на активность ферментных препаратов, п.т.- пороговая точка. Субстрат: казеин; соотношение фермент:субстрат 2 мг/г; 137±2 °С; время 3,5 час.

При исследовании влияния различных концентраций этанола на активность ферментов использовали в качестве модельного субстрата казеин (рис 5). Введение в реакционную смесь низких концентраций этанола увеличило активность ферментных препаратов, исключение составил только пршамекс. активность которого практически сразу снижалась.

Это, вероятно, объясняется тем, что в состав протамекса входят протеолигические ферменты значительно отличающиеся по своей структуре от сериновых протеиназ. Повышение концентрации спирта выше 20 % приводит к частичное или полной инактивации пи-лорина, гепатопанкреатина, мегатерина. Наиболее эффективнэй является 10 %-ная концентрация этанола в реакционной смеси. Эксперименты были продолжены с использованием мидии и мантии гребешка. Было проведено сравнение содержания свободных аминокислот в I идролизатах, полученных как в присутствии этанола, так и (5ез него (табл. 9). Использование водно-спиртовой смеси, в большинстве случаев, увеличило выход практически всех

аминокислот, и наиболее всего лейцина, глутаминовой кислоты и лизина. Присутствие этилового спирта позволило сокра1ить время проведения гидролиза до 2,5 часов.

В результате проведенных исследований была предложена модифицированная технология БАД, в которой на стадии «ферментирование» предусмотрено введение измельченного сырья в 10% водно-спиртовый раствор. Остальные стадии остаются такими же, как в основной технологической схеме

Таблица 9

Содержание САК в гидролизатах, полученных в присутствии этилового спирта.

1 Аминокислоты Содержание, % от обшей массы САК

1 I ( гидролиза™ (контроль) гидролизаты (10 % водно- спиртовая смесь)

1 мидии 1 мантии гребешка мидии мантии гребешка

' Таурин 7,06 | 3,93 7,05 4,0

! Гистидин 1,23 ; 0,88 1,49 1,40

| Пролин 4,20 I 3,72 4,78 3,96

Дикарбоновые 9,55 7,27 11,03 11,33

Серу содержащие 2,79 г 3,16 1,27 1,64

[ Основные 9,85 1 9,78 12,62 8,47

! Ароматические 7,47 I 9.03 8,63 11,45

| Нейтральные 6,77 1 6,38 6,76 6,40

1 Алифатические 19,83 I 18,35 21,66 19,04

, Сумма 70,47 1 62,52 75,29 67,69

р < 0,05

Оценка антиоксидантной активности БАД «Моллюскам».

Первоначальные эксперименты по оценке медико-биологической активности БАД «Моллюскам» были направлены по пути возмещения недостатка аминокислот, а также включения их в метаболизм отдельных тканей и органов. Вместе с тем, проводимые в клиниках биохимические анализы явно указывали на наличие в испытуемом препарате антиоксидантной активности.

Хотя, САК являются достаточно слабыми антиоксидантами в отдельности, но можно предположить, что в сумме аминокислоты и дипептиды способны дополнять и усиливать друг друга, составляя комплекс антиокислителей.

Для того, чтобы проверить высказанные предположения, были проведены эксперименты по оценке антиоксидантной активности препаратов, содержащих свободные аминокислоты, различными методами, включая прямые методы, основанные на взаимодействии компонентов БАД и прооксидантов, и опосредованные методы определения продуктов окисления, образующихся в процессе метаболизма

Прямые методы включали определение антиокислительной активности карнозина, с образованием хлораминовых комплексов и определение кислородной емкости с использованием ABTS - 2,2 азинобис-3-этил-бензотиадолин-6-сульфонсвой кислоты; опосредованные методы - определение малоново! о диальдегида (МДА) с применением тиобарбитуровой кислоты in vivo и in vitro.

Известно, что ряд аминокислот (таурин, гистидин, валин, аланин) и ГСД способны эффективно взаимодействовать с гипохлорит-анионом Уже через 1 мин после смешивания растворов таурина и гипохлорита натрия регистрируется появление пика с максимумом поглощения при 255-265 нм, что свидетельствует об образовании хлораминового комплекса. При этом поглощение реакционной смеси в области характерной для шпохлорита натрия полностью исчезает Взаимодействие гипохлорит-аниона с аминокислотами позволяет оценить убыль гипохлорит-аниона и оценить динамику и стабиль тость взаимодействия

Исследовали нейтрализацию гипохлорит-аниона в присутствии «Моллюскама» из мидии и мантии гребешка Спектры поглощения реагентов и их комплекса показаны на рисунке 8. Они в целом аналогичны полученным для таурина.

длина волны, нм

Рис.8 Спектры поглощения препаратов- а) моллюскам из мантии гребешка, в) моллюскам из мидии, в) гипохлорит, г) моллюскам из мантии гребешка + гипохлорит, д) моллюскам из мидии + гипохлорит. А - оптическая плотность образцов.

Для стабильности гипохлорит - «Моллюскамового» комплекса характерна та же динамика, что и для гипохлорит-тауринового- полное связывание гипохлорита натрия в течение 180 мин Проведенные исследования позволяют утверждать, что «Моллюскам» проявляет антиоксидантную активность путем нейтрализации гипохлорит-аниона

Метод определения кислородной емкости основан на том, что добавление антиокси-данта к катион-радикалу, образованному при реакции между ABTS и персульфатом калия, снижает величину его поглощения при длине волны 734 нм в прямопропорциональной зависимости от времени или концентрации ангиоксиданта. В результате степень обесцвечивания хромофора выражается как процент ингибирования свободнорадикального катиона. Как стандартный антиоксидант используют тролокс - синтетический аналог токоферола. Измерение величины антиоксидантной активности выражают в виде гролоксового эквивалента ан-I иоксидантной емкости - ТЕАС. ТЕАС для «Моллюскам» - субстанции составляет 45,0 мг/г сухого вещества. Таким образом, «Моллюскам» обладает способностью ингибировать образование свободнорадикального катиона и является мягким антиоксидантом, позволяющим использовать его в достаточно больших дозировках, необходимых для обеспечения его включения в метаболизм различных тканей и органов при рекомендуемых направлениях и дозах применения.

Определение одного из вторичных продуктов окисления - МДА позволяет судить об интенсивности перекисных процессов. В результате реакции между МДА и 2-тиобарбитуровой кислотоы (ТБК) образуется окрашенный продукт с максимумом поглощения при 532 нм. Этот метод может быть использован как в модельных системах так и in vivo. В молельных системах (сыворотка крови) проводят индуцированное окисление с помощью катализаторов, одновременно оценивают способность антиоксиданта снижать накопление МДА. In vivo уровень МДА оценивается как один из биохимических показателей в сыворотке крови пациентов.

Для ингибирования процесса образования малонового диальдегида в сыворотку вводили "Моллюскам". В качестве кон 1роля использовали сыворотку с добавлением катализатора окисления (сульфат железа), но без испытуемого препарата.

Защитный эффект «Моллюскама» проявлялся в том, что он препятствовал накоплению в сыворотке крови МДА как продукта окисления липидов (табл. 10).

Таблица 10

Антиоксидантный эффект БАД «Моллюскам» (по модифицированному методу Итабэ и Мацусима с применением тиобарбитуровой кислоты). S Реакционная среда прирост МДА мг/мл сыворотки крови

Интактная сыворотка крови человека 0

f Контроль (сыворотка + катализатор окисления) 1 0,070

Сыворотка крови + катализатор окисления + «Мол-¡ люскам» 100 % , 0,028

Сыворотка крови + катализатор окисления + БАД ¡ ! «Моллюскам» - таблетки (МКЦ 35,5 % + аскорби- ' 0,032

| новая кислота 12 % + моллюскам 25 %) :

Наглядным примером подтверждения антиоксидантной активности «Моллюскама» in vivo явилось его применение у больных с множественной миеломой. Полихимиотерапия, получаемая больными множественной миеломой, приводила к накоплению в сыворотке крови больших количеств МДА. Включение в схему лечения «Моллюскама» предотвратило нарастание уровня перекисей в сыворотке крови, и имелась тенденция к снижению уровня МДА по сравнению с показателями до лечения.

Экспериментальное обоснование возможности применения БАД «Моллюскам» при коррекции различных патологических состояний.

При экспериментальном обосновании возможности при не нения «Моллюскама» первоначально были исследованы острая и хроническая токсичность. В процессе исследования острой токсичности препарата гибели животных не отмечено, результаты опытов свидетельствуют о том, что ЛД50 при пероральном введении превышает 1000 мг/кг, препарат не токсичен.

Установлено, что БАД «Моллюскам» положительно влидет на процессы кроветворения в отношении лейкопоэза и тромбоцитопоэза и усиливает фагоцитарные процессы в поли-морфноядерных лейкоцитах, при этом возрастает как поглотительная, так и переваривающая активность этих клеток. Положительное влияние на окислительные процессы в организме позволили рекомендовать применение БАД для коррекции нарушений антиоксидантной защиты при исходной гиперактивации системы перекисного окисления липидов. Установлен мягкий иммунокоррегирующий эффект «Моллюскама».

Технико-экономические показатели промышленного производства БАД «Моллюскам».

Промышленный выпуск БАД «Моллюскам» осуществляется на экспериментальном участке по производству опытных партий биопрепаратов ФГУП «ТИНРО-Центра» с 2000 г. Для изготовления одной партии продукта используют 18 кг «мороженного сырья, из которого получают 1 -1,4 кг сухой субстанции, в месяц выпускают 8 кг, или 96 кг - в год. Выход «Моллюскама» составляет 6-8 % от массы исходного сырья Себестоимость продукта 12740 руб за 1 кг, при цене препарата 20 000 руб за 1 кг, общая сумма производимой продукции составляет 1,92 млн руб в год при рентабельности 67 %.

ВЫВОДЫ.

1. Обоснован выбор двустворчатых и головоногих моллюсков как источников биологически активных добавок, содержащих свободные аминокислоты Показано, что моллюски содержат все незаменимые аминокислоты, таурин, а также гистидинсодержащие дипептиды. Основные сырьевые источники - традиционно добываемые двустворчатые моллюскои (мидия и гребешок), перспективные - новые дня промысла виды (спизула, анадара, мерценария и др).

Для расширения сырьевой базы в качестве дополнительных источников получения БАД к пище «Моллюскам» рекомендовано использовать мантию и щупальца кальмаров

2. Определяющей стадией технологического процесса получения биологически активной добавки «Моллюскам» является ферментативный гидролиз тканей моллюсков. Ферментативный гидролиз в отличие от кислотного, является наиболее щадящим способом получения белковых гидролизатов и позволяет сохранить наиболее ценные компоненты без нарушения их структуры. Эффективность ферментативного гидролиза по предлагаемой технологии обеспечивается как суммарным накоплением свободных аминокислот, так и сохранением отдельных аминокислот.

3. Обоснованы рациональнее режимы проведения гидролиза с использованием панкреатических протеиназ: температура - 37±2 °С; pH - 8,0±0,5; время 5±1 час, гидромодуль 1:2, концентрация ферментного препарата 2,25+0,25 Пе/г; и микробиальных: температура - 37+2 °С; pH -6,7+1,3 ; время 4±1 час, гидромодуль 1:2, концентрация ферментного препарата 5,0±0,5 Пе/г.

4. Общее содержание свободных аминокислот в БАД «Моллюскам» достигает 62,5-70,5 %. Наиболее характерными чертами аминокислотного состава, позволяющими установить подлинность, являются, во-первых, наличие и высокое содержание таурина (не менее 3,9 %) и, во-вторых, соотношение суммарного количества алифатических, основных и ароматических аминокислот, составляющее Еал:£осн:£ар = 21-1

5 Изучено влияние этанола на активность протеолитических ферментов Определены пороговые точки концентраций, в пределах которых не происходит снижения активности ферментов. Наиболее эффекттна 10 %-ная концентрация этанола в реакционной смеси, позволяющая увеличить активность ферментных препаратов (исключение - протамекс); сократить время проведения гидролиза до 2,5±0,5 часов (в зависимости от используемого вида сырья и ферментного препарата); увеличить степень гидролиза (на 9,7+8,6 %), повысить выход свободных аминокислот на 4,3+2,6 %.

6. Предложено модифицировать метод ферментативного гидролиза путем увеличения липофильности реакционной цгсды, заменив на стадии ферментирования водный раствор реакционной смеси на водно-спиртовый Наблюдающиеся отличия в ходе процесса и качестве конечного продукта соответствовали изменениям субстратной специфичности, скорости и глубины гидролиза.

7. Показано, что БАД к пище «Моллюскам» обладает выраженным антиоксидантньтм действием- нейтрализует действие гипохлорит-аниона, ингибирует образование свободнора-дикального катиона ABTS+ (2,2 азштобис-3-этил-бензотиадолин-6-сульфоновой кислоты), препятствует накоплению в сыворотке крови малонового диальдегида in vivo и in vitro «Мол-

05 - 2 2 6 1 8

2006-4

люскам» обладает широким спектром биологической активногги: оказывает стимулирующее действие на факторы неспецифической резисгентнс

8. Технологические решения производства Б

ботке нормативной документации: ТУ № 9283-28. РНБ Русский фонд технических решений подтверяадена патентом РФ нокислотами, и способ его получения» №2171066.

9. По результатам исследований безопасносг 28006 (СанПиН 2.3.2.1078-01) и медико-биологической

пакет документации, на производство и использование препарата в качестве дополнительного источника аминокислот. Решением экспертного совета Госсанэпиднадзора РФ выдано санитарно-эпидемиологическое заключение № 77.99.11.003.Т.001763.10.04.

Основное содержание диссертации отражено в следующих публикациях:

1. Давидович В.В., Позднякова Ю М Исследование субстратной специфичности панкреатических сериновых протеиназ различного происхождения // Сб тезисов конференции молодых ученых ТИНРО. -1997. - С.36.

2. Пивненко Т.Н., JIM. Эпштейн Ю.М., Давидович В.В., Позднякова Ю.М. Получение и характеристика белковых гидролизатов из гидробионтов // Известия ТИНРО. - 1997. -Т 120. - С. 23-31.

3. Пивненко ТН, Л.М. Эпштейн Ю.М., Давидович В.В., Позднякова Ю.М Ферментативные способы приготовления белковых гидролизатов с использованием ферментных препаратов различной специфичности // Вопросы питания. - 1997 - № 5. - С 34-38.

4. Давидович В.В., Позднякова Ю.М. Состав и свойства ферментативных гидролизатов из двустворчатых моллюсков // Сб тезисов конференции молодых "ченых ТИНРО - 1999. -С.202.

5. Давидович В.В. Технологии получения новых видов продуктов из двустворчатых моллюсков // Сб. тезисов международного симпозиума: «Пищевые биотехнологии: проблемы и перспективы в XXI веке». ДВГАЭУ. - 2000. - С. 189.

6. Давидович В.В. Комплексная переработка двустворчатых моллюсков // Сб тезисов конференции молодых ученых «Проблемы экологии и рационального природопользования Дальнего Востока». ВГУЭС. - 2000. - С. 186.

7 Пат. РФ № 217 1066 «Продукт, обогащенный аминокислотами, и способ его получения» Пивненко Т.Н., Л.М. Эпштейн Ю.М., Давидович В.В., Позднякова Ю.М. от 22.03 2000. 8. Давидович В.В., Пивненко Т.Н Аминокислоты двустворчатых моллюсков: биологическая

роль и применение в качестве БАД // Известия ТИНРО - 2001. - Т. 129. - С. 146-154. 9 Потапова В.В., Иванушко Л.А., Беседнова H.H., Орловская H.A., Позднякова Ю.М., Давидович В.В., Пивненко Т.М.. Эпштейн Л.М. Влияние БАД из тканей и органов морских гидробионтов на кроветворение при острой лучевой болезни // Известия ТИНРО. - 2004. - С 130. 10. Давидович В.В. Получение и характеристика БАД «Моллюскам» из мантии и щупалец кальмаров // Материалы II Международного симпозиума «Пищевые биотехнологии' проблемы и перспективы в XXI веке». ДВГАЭУ. - 2004. - С. 17-20.

Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохсзяйственный центр _Владивосток, переулок Шевченко, 4

Подписано в печать 10.11.2005 г. Формат 60х90'16. Уч.-изд. л. 1. Тираж 100. Заказ № 31. Типография ТИНРО-Центра

Список сокращений.

Введение.

1 Обзор литературы.

1.1 Свободные аминокислоты и дипептиды моллюсков. Содержание и физиологическая роль.

1.2 Основные функции аминокислот и потребности в них животных организмов

1.3 Использование свободных аминокислот в качестве БАД и лекарственных средств.

1.4 Антиоксиданты: возможность применения в качестве БАД.

1.5 Антиоксидантные свойства аминокислот и гистидинсодержащих дипепти-дов.

1.6 Способы получения препаратов, содержащих свободные аминокислоты.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2 Объекты, материалы и методы исследований.

2.1 Объекты и материалы исследований.

2.2 Методы исследований.

3 Результаты и их обсуждение.

3.1 Разработка методов получения препаратов, содержащих свободные аминокислоты.

3.1.1 Обоснования выбора сырья.

3.1.2 Подбор условий проведения ферментативного гидролиза.

3.1.3 Состав полученных ферментативных гидролизатов.

3.2 Технологическая схема получения БАД «Моллюскам».

3.2.1 Технология получения препарата.

3.2.2 Разработка рецептуры потребительских форм.

3.3 Сравнительная характеристика различных методов получения БАД «Моллюскам».

3.4 Модификация технологии БАД «Моллюскам».

3.5 Оценка антиоксидантной активности БАД «Моллюскам».

3.5.1 Образование хлораминовых комплексов при взаимодействии «Моллю-скама» с гипохлорит-анионом.

Моллюскам» Выводы.

Актуальность работы. Согласно современным литературным данным, морские беспозвоночные (двустворчатые моллюски, голотурии, морские ежи и др.) содержат уникальные биологически активные вещества различной природы, являющиеся основой для создания лечебно-профилактических пищевых продуктов или лекарственных средств (Слуцкая, 1972; Лебедев, 1974; Новикова и др., 1998; Левинтон и др., 1999).

У морских беспозвоночных основную долю азотистых экстрактивных соединений внутренних органов составляют аминокислоты и родственные им соединения. Наиболее высокое содержание свободных аминокислот, в том числе и незаменимых, обнаружено в тканях двустворчатых моллюсков. Для них характерно высокое содержание глицина, аланина, серина, аргинина и циклических аминокислот. Доминирующими аминокислотами мышечных белков являются глутаминовая и аспарагиновая (Кудряшов, Гончаренко, 1999). В тканях моллюсков обнаружены такие вещества, как таурин и бетаин, которые пополняют общее число анионов и вносят определенный вклад в регуляцию осмотического давления. Только у моллюсков найдены метилированные производные гистидина, которые вместе с (3-аланином являются возможными предшественниками анзерина (метилированное производное карно-зина) и офидина ((3-аланил-М3-метилгистидин) (Лебедев, 1974; Болдырев, 1998).

Кроме аминокислот, встречающихся в составе тканей высших животных, у моллюсков обнаружено значительное количество аминокислот необычного строения. К ним относятся саркозин, фосфосерин, триметилгистидин, а-аминобензойная кислота, цитруллин, орнитин и некоторые другие (Аюшин и др., 1999). О биологической роли этих компонентов в настоящее время известно очень мало, они обозначены главным образом как промежуточные продукты метаболизма аминокислот и мочевины. Отсутствуют сведения о потенциальном лекарственном механизме действия этих компонентов.

Большинство из аминокислот, содержащихся в моллюсках, являются непременными участниками белкового обмена в организме человека, оказывают значительное стимулирующее действие на его функции и необходимы в качестве питательных добавок на определенных стадиях его развития.

В настоящее время препараты, содержащие свободные аминокислоты, используются не только как источники аминокислот для лиц, занятых интенсивным физическим или умственным трудом (Тутельян и др., 1999), но и как вспомогательные средства при функциональных нарушениях ЦНС (повышенная возбудимость, снижение физической активности, ухудшение памяти и др.) (Федеральный реестр., 1999). В тоже время способность отдельных аминокислот и пептидов принимать участие в антиоксидантной защите организма не рассматривается. Тем не менее, известно, что многие аминокислоты способны ингибировать различные формы свободных радикалов (Меныцикова, Зенков, 1993; Нечаев, 2003, Лёвочкина, 1993). К ним относятся триптофан, фенилаланин и тирозин, имеющие в ароматическом кольце одну или несколько гидроксильных групп, а также серусодержащие аминокислоты - таурин, цистеин, метионин. Наиболее активными антиоксидантами из компонентов аминокислотной природы являются таурин и гистидин-содержащие дипепти-ды. Таурин представляет собой серусодержащую аминокислоту, не входящую в состав белков и образующуюся в процессе метаболизма метионина. Структурная простота этой небелковой (З-аминокислоты сопровождается сложностью и разнообразием биологических эффектов, что позволяет поставить ее в один ряд с важнейшими биологически активными веществами. Таурин вовлекается в сохранение нормального функционирования различных органов и тканей и, вероятно, занимает одно из центральных мест в реализации тех процессов, которые защищают клетки от разнообразных повреждающих факторов.

Таким образом, особенности химического состава двустворчатых моллюсков позволяют рекомендовать их в качестве источника БАД, обогащенных свободными аминокислотами, и рассматривать такие БАД в качестве антиоксидантов. В числе используемых объектов могут быть привлечены традиционно добываемые виды - гребешок, мидия, а также новые для промысла виды (спизула, анадара, гребешок белорозовый, гребешок Свифта, петушок, модио-лус длиннощетинистый, мерценария Стимпсона, мактра китайская, каллиста короткосифонная, перонидия жилковатая). В качестве еще одного массового источника сырья могут быть рассмотрены мантия и щупальца головоногих моллюсков.

Важнейшим этапом работы по созданию БАД является разработка эффективной технологии, позволяющей обогатить целевые продукты свободными аминокислотами. Наиболее распространенным методом получения подобных препаратов является кислотный гидролиз, обеспечивающий наибольший выход свободных аминокислот, однако при этом наблюдается частичное или полное разрушение отдельных аминокислот. Этот метод требует использования концентрированных кислот при высоких температурах и их последующей утилизацией. Разработанные в ТИНРО-центре методы ферментативного гидролиза (Пивненко и др. 1997), могут быть адаптированы к различным видам морского сырья, в том числе к тканям двустворчатых моллюсков. Модификация этих методов позволит регулировать специфичность ферментов, глубину гидролиза и состав получаемых БАД.

Целью настоящей работы явилась разработка биотехнологии биологически активной добавки к пище «Моллюскам», включая обоснование выбора сырьевых источников и направлений практического применения.

Для достижения целей поставлены следующие задачи:

- исследование химического состава сырьевых источников для получения БАД «Моллюскам»;

- подбор параметров ферментативного гидролиза применительно к различным видам сырья;

- исследование состава полученных препаратов;

- выявление перспективных дополнительных источников для получения БАД, исследование свободных аминокислот (САК) и гигиенической безопасности;

- разработка методов регуляции скорости, глубины и специфичности ферментативного гидролиза;

- оценка антиоксидантной активности препаратов, содержащих свободные аминокислоты с использованием различных методов;

- оценка безопасности, исследование биологической активности и функциональной направленности действия.

Научная новизна: Впервые исследован полный состав свободных аминокислот в тканях двустворчатых и головоногих моллюсков, а также содержание таурина и гистидинсодержащих дипептидов в БАД «Моллюскам» на их основе. Впервые установлено, что соотношение суммарного количества Хал:Хосн:Еар = 2:1:1 является устойчивым для БАД «Моллюскам» из двустворчатых и головоногих моллюсков. В качестве показателей подлинности этого продукта предложено использовать указанное соотношение наряду с нижним пределом содержания таурина. Исследовано влияние липофильности реакционной среды на скорость и глубину ферментативного гидролиза для однокомпонентных белковых субстратов и в условиях сложных многокомпонентных систем (тканей моллюсков) Определены пороговые точки концентраций этанола, в пределах которых сохраняется активность ферментов, дан сравнительный анализ состава свободных аминокислот в препаратах, полученных различными методами. Обоснованы пути и методы регуляции ферментативного катализа при различных условиях реакционной среды применительно к используемым сырьевым источникам.

Показано, что БАД «Моллюскам» обладает антиоксидантными свойствами. Впервые прямыми и косвенными методами проведена сравнительная оценка антиоксидантной активности препаратов, содержащих свободные аминокислоты. Показана способность компонентов БАД «Моллюскам» связывать гипохлорит-анион, ингибировать образование свободнорадикального катиона АВТ8"+, предотвращать накопление МДА.

Впервые установлена безопасность БАД «Моллюскам» и ее эффективность при применении в комплексе лечения ряда заболеваний.

Практическая значимость. Разработан способ получения БАД «Моллюскам», позволяющий наиболее эффективно обогащать целевой продукт свободными аминокислотами и регулировать его состав путем изменения условий реакции. Состав БАД и способ ее получения защищены патентом: №2171066 «Продукт, обогащенный свободными аминокислотами, и способ его получения».

Разработана и утверждена документация на БАД «Моллюскам»: ТУ 9283-247-00472012-04, ТИ № 36-247-2004 и двустворчатые моллюски - сырец: ТУ 9253-146-00472012-2001, ТИ№ 36-191-2001

По результатам экспертной оценки и санитарно-гигиенических исследований в федеральном центре Госсанэпиднадзора РФ «Моллюскам» соответствует требованиям СанПиН и зарегистрирован как БАД: санитарно-эпидемиологическое заключение № 77.99.11.003.Т.001763.10.04 от 08.10.2004.

Препарат внедрен в производство и выпускается в ФГУП «ТИНРО-Центре» и ОАО «Биополимеры».

Апробация работы: основные положения были представлены на научно-практической конференции «Состояние здоровья населения Дальнего Востока. Новые медицинские технологии с использованием биоресурсов» (Владивосток, 1999); Международном симпозиуме «Пищевые биотехнологии: Проблемы и перспективы в XXI веке» (Владивосток, 2000); региональной конференции молодых ученых «Проблемы экологии и рационального природопользования Дальнего Востока» (Владивосток, 2000); Международном симпозиуме «Пищевые биотехнологии: проблемы и перспективы в XXI веке» (Владивосток, 2004).

Положения, выносимые на защиту:

Биотехнология БАД к пище, основанная на рационализации процесса ферментативного гидролиза приводит к получению продуктов с высоким содержанием свободных аминокислот, таурина и гистидинсодержащих дипеп-тидов.

Регулирование специфичности, скорости и глубины ферментативного гидролиза включает изменение липофильности реакционной среды и вызывает активацию протеолитических ферментов.

Антиоксидантная активность БАД «Моллюскам», содержащей свободные аминокислоты, таурин и ГСД, проявляется в прямых реакциях нейтрализации свободных радикалов и в опосредованных реакциях накопления продуктов окисления in vivo и in vitro.

Публикации: по теме диссертации опубликовано 10 работ.

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть, заключение, выводы, список литературы, содержащий 137 источников (в том числе 23 зарубежных). Работа изложена на 166 страницах, содержит 27 таблиц, 20 рисунков и 16 приложений.

ВЫВОДЫ.

1. Обоснован выбор двустворчатых и головоногих моллюсков как источников биологически активных добавок, содержащих свободные аминокислоты. Показано, что моллюски содержат все незаменимые аминокислоты, таурин, а также гистидинсодержащие дипептиды. Основные сырьевые источники - традиционно добываемые двустворчатые моллюскои (мидия и гребешок), перспективные - новые для промысла виды (спизула, анадара, мерценария и др.). Для расширения сырьевой базы в качестве дополнительных источников получения БАД к пище «Моллюскам» рекомендовано использовать мантию и щупальца кальмаров.

2. Определяющей стадией технологического процесса получения биологически активной добавки «Моллюскам» является ферментативный гидролиз тканей моллюсков. Ферментативный гидролиз в отличие от кислотного, является наиболее щадящим способом получения белковых гидролизатов и позволяет сохранить наиболее ценные компоненты без нарушения их структуры. Эффективность ферментативного гидролиза по предлагаемой технологии обеспечивается как суммарным накоплением свободных аминокислот, так и сохранением отдельных аминокислот.

3. Обоснованы рациональные режимы проведения гидролиза с использованием панкреатических протеиназ: температура - 37±2 °С; рН - 8,0±0,5; время 5±1 час, гидромодуль 1:2, концентрация ферментного препарата 2,25±0,25 Пе/г; и микробиальных: температура - 37±2 °С; рН-6,7±1,3 ; время 4±1 час, гидромодуль 1:2, концентрация ферментного препарата 5,0±0,5 Пе/г.

4. Общее содержание свободных аминокислот в БАД «Моллюскам» достигает 62,5-70,5 %. Наиболее характерными чертами аминокислотного состава, позволяющими установить подлинность, являются, во-первых, наличие и высокое содержание таурина (не менее 3,9 %) и, во-вторых, соотношение суммарного количества алифатических, основных и ароматических аминокислот, составляющее Еал:Хосн:Хар = 2:1:1.

5. Изучено влияние этанола на активность протеолитических ферментов. Определены пороговые точки концентраций, в пределах которых не происходит снижения активности ферментов. Наиболее эффективна 10 %-ная концентрация этанола в реакционной смеси, позволяющая увеличить активность ферментных препаратов (исключение - протамекс); сократить время проведения гидролиза до 2,5±0,5 часов (в зависимости от используемого вида сырья и ферментного препарата); увеличить степень гидролиза (на 9,7±8,6 %), повысить выход свободных аминокислот на 4,3+2,6 %.

6. Предложено модифицировать метод ферментативного гидролиза путем увеличения липофильности реакционной среды, заменив на стадии ферменти-рования водный раствор реакционной смеси на водно-спиртовый. Наблюдающиеся отличия в ходе процесса и качестве конечного продукта соответствовали изменениям субстратной специфичности, скорости и глубины гидролиза.

7. Показано, что Б АД к пище «Моллюскам» обладает выраженным антиок-сидантным действием: нейтрализует действие гипохлорит-аниона, ингибирует образование свободнорадикального катиона ABTS + (2,2 азинобис-3-этил-бензотиадолин-6-сульфоновой кислоты), препятствует накоплению в сыворотке крови малонового диальдегида in vivo и in vitro. «Моллюскам» обладает широким спектром биологической активности: оказывает стимулирующее действие на факторы неспецифической резистентности организма.

8. Технологические решения производства Б АД «Моллюскам» использованы при разработке нормативной документации: ТУ № 9283-283-00472012-05, ТИ № 36-283-2005. Новизна технических решений подтверждена патентом РФ: «Продукт, обогащенный свободными аминокислотами, и способ его получения» №2171066.

9. По результатам исследований безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов (СанПиН 2.3.2.1078-01) и медико-биологической активности БАД «Моллюскам» составлен пакет документации на производство и использование препарата в качестве дополнительного источника аминокислот. Решением экспертного совета Госсанэпиднадзора РФ выдано санитарно-эпидемиологическое заключение № 77.99.11.003.Т.001763.10.04.

1. A.c. РФ 1827811. Средство, ускоряющее выведение радионуклидов из организма лабораторных животных / Ю.Б. Кудряшов, И.М. Пархоменко, Г.В. Коссова и др. Заявлено 17.03.89.

2. Абрамова Ж.И., Оксенгендлер Г.И. Человек и противоокислительные вещества. Л.: Наука. - 1985. - 229 с.

3. Абелев Г.И., Андреева Н.Е., Афанасьев В.В и др. Клиническая гематология. М: Медицина. - 2001. - 576 с.

4. Алексеенко Л.П. // Современные методы в биохимии. М.: Медицина. - 1968. -Т.2.-112 с.

5. Анисимов В.Н. Средства профилактики преждевременного старения (ге-ропротекторы) //Успехи геронтологии. 2000. - Вып. 4 . - С. 55-74.

6. Афанасьев Ю.И., Бронихина Т.В. // Успехи соврем, биологии. 1987. -Т. 104.-№3.-С. 400.

7. Аюшин Н.Б. Таурин: фармацевтические свойства и перспективы получения из морских организмов // Изв. ТИНРО. Владивосток. 2001. - Т. 129. -С. 129-146.

8. Аюшин Н.Б., Петрова И.П., Эпштейн Л.М. Азотистые экстрактивные вещества в тканях дальневосточных моллюсков // Изв. ТИНРО. 1999. -Т. 125.-С. 52-56.

9. Аюшин Н.Б., Петрова И.П., Эпштейн Л.М. Таурин и карнозин в тканях тихоокеанских моллюсков // Вопросы питания 1997. - № 6. - С. 6-8.

10. Беляева Е.А., Еремеев Н.Л. Кинетическая демонстрация локальных кон-формационных изменений вблизи активного центра а-химотрипсина в смесяхсмесях вода-диметилсульфоксид // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. 2000. -Т. 4L-№6.-С. 392-394.

11. Бобылев Р.В., Грядунова Г.П., Иванова JI.A., Игнатьева Н.С., Козлова JI.M., Тенцова А.И. Технология лекарственных форм: Учебник в 2-х томах. Том 2/Р. М.: Медицина. - 1991. - С. 451-476.

12. Богатков C.B., Фролова Т.Т., Грачева И.М., Неклюдов А.Д., Логинова Т.А. Оптимизация гидролиза белков щелочной протеиназой Bacillus Sub-tilis // Прикл. Биохим. и микробиол. 1982. - Т. 18, вып. 5. - С. 71-75

13. Бойков Ю.А., Мухленов А.Г., Бичурина М.А., Дергалева Ж.Т. Наука в России. Мидии «лечат» людей и животных. // Изд. Президиума Российской академии наук, Мин. науки и технол. Российской Федерации. 1997. - № 5. -С. 38-41.

14. Быков В.П. Справочник по химическому составу и технологическим свойствам водорослей, беспозвоночных и морских млекопитающих. М.: Изд. ВНИРО.- 1999. -261 с.

15. Воробьев М.М., Левичева И.Ю., Беликов В.М. Исследование начальной кинетики гидролиза белков молока химотрипсином // Прикл. биохим. и микробиол. 1996. - Т. 32. - № 2. - С. 237-241.

16. Воскресенский О.Н., Бобырев В.Н. // Вопр. мед. химии. 1992. - Т. 38.-№4.-с. 21-26.

17. Гигиеническое заключение № 77.99.9.916.П.15411.10.00 от 30.10.00 г.

18. Пищевая добавка ферментный препарат «Протамекс».

19. Гончаренко М.С., Латинова A.M. Метод оценки перекисного окисления липидов // Лабораторное дело. 1985. - № 1. - С. 60-61.

20. ГОСТ Р51495-99. Кальмар и каракатица мороженые.

21. ГОСТ 20414-93. Кальмар мороженый.

22. ГОСТ 2026.2-88. Препараты ферментные. Методы определения протео-литической активности.

23. Государственная фармакопея СССР. М.: Медицина. -1987. - XI издание, вып. 2. - 182 с.

24. Грачева И.М., Грачев Ю.П., Мосичев М.С., Борисенко Е.Г., Богатков C.B., Гернет М.В. Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов. М.: Легкая и пищевая промышленность. - 1982. - 239 с.

25. Гриффит В. Витамины, травы, минералы и пищевые добавки. Справочник. (Пер. с англ. К. Ткаченко). М.: ФАИР-ПРЕСС. - 2000. - 1056 с.

26. Давидович В.В. Пивненко Т.Н. Аминокислоты двустворчатых моллюсков: биологическая роль и применение в качестве БАД // Изв. ТИНРО. -2001. Т. 129. - С. 146-154

27. Докшина Г.А., Силаева Т.Ю., Ярцев Е.И. Некоторые инсулиноподоб-ные эффекты таурина // Вопр. мед. химии. 1976. - Т. 22. - № 4. - С. 503-507.

28. Дэвени Т., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды и белки. М.: «Мир». -1976.-С. 165-174.

29. Денисов JI.H., Лобарева Л.С., Якушева Е.О. Антиоксидантные эффекты витаминов. Значение в ревматологии. М.: «Медицина», Терапевтический архив. - 1994. - Т. 66. - № 5. - С. 82-87.

30. Закс М.Г. и Соколова М.М. О механизмах адаптации к опреснению среды у некоторых литоральных организмов // Журн. эвол. биохим. и физиол. 1965.-Т. 1.-№6.-С.538-542.

31. Заявка № 94035039/14. Препарат из тканей морских гидробионтов «Орбитар» и способ его получения. Кудряшов Ю.Б., Лихарев В.А., Перов Ю.Ф. Заявлено 30.09.94.

32. Заявка № 98113555/14. Фармацевтическая композиция для лечения герпеса М.А. Бичурина, Л.Ю. Тарос, Л.Е. Никитина и др. Заявлено 10.07.98.

33. Зенков Н.К., Меньшикова Е.Б. // Успехи совр. биол. 1993. - Т. 113, вып. З.-С. 286-296.

34. Каверзнева Е.Д. Стандартный метод определения протеолитической активности для комплексных препаратов протеаз // Прикладная биохимия и микробиология. 1971. Т. 7. - № 2. - С. 225-228.

35. Кения М.В., Лукаш А.И., Гуськов Е.П. Роль низкомолекулярных анти-оксидантов при окислительном стрессе. М.: «Наука». Успехи современной биологии. - 1993. - Т. 113, вып. 4. - С. 456-471.

36. Кизеветтер И.В. Биохимия сырья водного происхождения. М.: Пищ. Пром-сть. - 1973. - 416 с.

37. Ковалев H.H. Гистидинсодержащие дипептиды. Свойства и перспективы использования // Изв. ТИНРО. Владивосток. 1999. - Т. 125. - С. 159-164.

38. Колесников Ю.А., Шульгина М.А., Ярцев Е.И. и др. Влияние некоторых химических соединений на радиационный гемолиз эритроцитов // Радиобиология. 1975.-Т. 15.- № 15.-С. 671-674.

39. Колодзейская М.В., Пивненко Т.Н. Трипсин-, химотрипсиноподобные протеиназы рыб // Укр. биохим. журн. 1988. - Т. 60. - № 4. - С. 103-117.

40. Костылев Э.Ф., Рябошапко А.П. Биохимия сырья водного происхождения. М.: Пищ. пром. - 1982. - С. 112-124.

41. Кудряшов Ю.Б., Гончаренко E.H. Современные проблемы противолучевой химической защиты организмов // Радиционная биология. Радиоэкология. 1999. - Т. 39. - № 2-3. - С. 197-211.

42. Лазаревский A.A. Техно-химический контроль в рыбообрабатывающей промышленности. М.: «Пищепромиздат». - 1955. - 518 с.

43. Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии. М.: «Мир» 1986. 431 с.

44. Лебедев A.B. Азотистые экстрактивные вещества мышечной ткани беспозвоночных // Журн. эволюц. биохим. и физиол. 1974. - Т. 10. - С. 232242.

45. Леванидов И.П., Захарова В.П. Химический состав промысловых моллюсков и иглокожих Сахалинского района // Известия ТИНРО. 1968. - Т. 65. -С. 221-230.

46. Левинтон Ж.Б.* Химич Т.Л., Ятченко Е.А. и др. Медико-биологические исследования икры морского ежа // Изв. ТИНРО. 1999. — Т. 125. - С. 254-259.

47. Лёвочкина Л.В., Лашук В.Н. Влияние наполнителей котлетной массы из щупалец кальмара на степень окисления липидов // Сб. тезисов международного симпозиума «Проблемы состояния и здоровья населения». М. -1993.-С. 16.

48. Лобарева Л.С., Денисов Л.Н., Якушева O.E. Витамины антиоксидант-ного действия и ревматические заболевания // Вопр. питания. 1995. - №4. -С. 24-29.

49. Машкова Н.Ю., Алексеева E.H., Докшина Г.А. О возможности регуляции таурином внутриклеточного содержания калия в гепатоцитах и эритроцитах крыс при облучении // Радиобиология. — 1983. Т. 23. - № 6. - С. 758-760.

50. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Медицина. 1993. - Т. 2.- 590 с.

51. Меньшикова Е.Б., Зенков Н.К. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов. М.: «Наука». Успехи современной биологии. - 1993. - Т. ИЗ, вып. 4. - С. 442-456.

52. Мухин В.А., Новиков В.Ю., Рыжикова Л.С. Ферментный белковый гидролизат из отходов промысла исландского гребешка Chlamys islandica //Прикл. Биохим. имикробиол.-2001.-Т. 37. -№3.- С. 338-343.

53. Мухин В.А., Новиков В.Ю. Ферментативные белковые гидролизаты тканей морских гидробионтов: получение, свойства и практическое использование. Мурманск: Изд. ПИНРО. - 2001. - 97 с.

54. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Бердутина A.B. Получение и очистка белковых гидролизатов // Прикл. Биохим. и микробиол. 2000. - Т. 36. - № 4. -С. 371-379.

55. Неклюдов А.Д., Федорова Н.В., Илюхина В.П., Лисица Е.П. Ферментативный профиль автолизирующих дрожжей рода Saccharomyces // Прикладная биохим. и микробиол. 1993. - Т. 29, вып. 5. - С. 734-743.

56. Неклюдов А.Д., Илюхина В.П., Мосина Г.И., Петракова А.Н., Федорова Н.В., Кузнецов В.Д. Гидролизующая способность дрожжевых протеаз по отношению к белковым субстратам // Прикладная биохимия и микробиология. 1996. - Т. 32. - № 2. - С. 231-236.

57. Нетребенко O.K., Ладодо К.С., Яцык Г.В., Грибакин С.Г. Особенности аминокислотного обмена у недоношенных детей при различных видах вскармливания // Вопросы питания. 1995. -№4. - С. 20-23.

58. Нечаев А.П., Траубенберг С.Е., Кочеткова A.A., Колпакова В.В., Ви-тол И.С., Кобелева И.Б. // Пищевая химия. ГИОРД. 2003. - 640 с.

59. Николаев А.Я. // Биологическая химия. Мед. информ. агенство. 2004. -565 с.

60. Новиков В.М. Справочник технолога рыбной промышленности. М.: «Пищевая промышленность». - 1964. - Т. 2. - 781 с.

61. Новикова М.В. и др. Пищевая биологически активная добавка из мидий // Вопр. питания. 1998. - № 1. - С. 10-13.

62. Новикова М.В., Беседина., Рехина Н.И. Сравнительная характеристика биологически активных добавок из гидробионтов и тходов их разделки // Труды ВНИРО. 2004. - Т.134. - С. 124-133.

63. Номенклатура ферментов. Рекомендации (1972 г) Международного биохимического Союза по номенклатуре и классификации ферментов, а также по единицам ферментов и символам кинетики ферментативных реакций. / Под ред. Браунштейна А.Е. М.: Наука. - 1979.

64. Орехович В.Н. // Современные методы в биохимии. М.: Медицина. -1977. - С. 62-69.

65. Оруджев Я.С., Ростовщиков В.В. Применение медиаторных аминокислот (таурин) во внебольничной геронтологической практике // Социальная и клиническая психиатрия. 1998. - № 3. - С. 78-81.

66. Остерман JI.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: Наука. - 1981. - 286 с.

67. Паркер. С. Фото-люминесценция растворов. М.: «Мир». - 1972. - 497 с.

68. Пархоменко И.М., Граевская Е.Э., Гонсалес Г.М. Влияние мидий но го гидролизата МИГИ-К на адаптивный ответ у стволовых клеток костного мозгамышей // Радиационная биол., Радиоэкол. 1999. - Т. 39. - № 2-3. - С. 310312.

69. Пат. РФ 2001616. Средство для лечения сердечно-сосудистой недостаточности / Н.И. Фетисова, Н.Ю. Титенко, А.П. Сафронова и др. Заявлено 12.05.91; Опубл. 30.10.93.

70. Пат. РФ 2121844. Способ получения углевод-белкового комплекса из приморского гребешка / A.M. Ковалевская. Заявлено 18.03.96; Опубл. 20.11.98.

71. Пат. 2090084. Способ переработки мидий / Кузнецов Ю.Н., Ярочкин А.П. Заявлено 20.09.97.

72. Пат. РФ 2043109. Способ ингибиции вируса гриппа серотипов А и В / М.А. Бичурина, JI.E. Никитина, Ф.Н. Носков и др. Заявлено 17.03.92.

73. Пат« РФ 2134571. Средство для очистки кожи лица «Троя» / A.B. Гордин, Л.А. Николаева, Соха В.И. Заявлено 23.04.98; Опубл. 20.08.99.

74. Пат. РФ 2017439. Продукт из мяса мидий и способ его получения / Л.Л. Лагунов, Н.И. Рехина, Т.В. Беседина и др. Опубл. 12.11.92. i

75. Пат. РФ 2066105. Способ получения белково-углеводного мидийного концентрата / А.Г. Губанова, Л.Ю. Полешук, Ж.Б. Левинтон и др. Заявлено 20.05.92; Опубл. 10.09.96.

76. Пат. РФ 2134523. Способ получения белкового гидролизата из моллюсков / Ю.А. Бойков, А.Г. Мухленов, В.Н. Елагин. Опубл. 26.08.98.

77. Пат. РФ № 2034028. Способ получения протеолитического комплекса / Пивненко Т.Н., Жданюк В.М., Эпштейн Л.М. 1992. - БИ№ 14.

78. Пат. РФ 2090103. Способ приготовления икры рыб / Пивненко Т.Н., Эпштейн Л.М., Шульгина Л.В., Блинов Ю.Г. и др. 1997.- БИ № 26.

79. Пат. SU 1807353. Способ определения антиокислительной активности карнозина / Формазюк В.Е., Дудина Е.И., Болдырев A.A. Опубл. 07.04.93.

80. Пат. РФ 2105504. Пищевая биологически-активная добавка «Тинростим1. С».

81. Пивненко Т.Н. Трипсиноподобные протеазы дальневосточных лососей // Дис. .канд. биол. наук Киев. - Инст. Биохимии им. Палладина. - 1986. -176 с.

82. Пивненко Т.Н., Позднякова Ю.М., Давидович В.В. Получение и характеристика белковых гидролизатов из гидробионтов // Изв. ТИНРО. — 1997. -Т. 120.-С. 23-31.

83. Пивненко Т.Н. Эпштейн Л.М., Колодзейская М.В., Кудинов С.А. Получение и свойства трипсина из пилорических придатков тихоокеанского лосося // Прикладная биохимия и микробиология. 1989. - Т. 25. - № 4. - С. 490497.

84. Пилат Т.Л., Иванов A.A. Биологически активные добавки к пище (теория, производство, применение). М.: Авваллон. - 2002.- 710 с.

85. Платонов А.Г., Ахалая М.Я., Деев Л.И., Кудряшов Ю.Б. Защитные эффекты МИГИ-K при облучении животных // Радиационная биология. Радиоэкология. 1999. - Т. 39. - № 2-3. - С. 313.

86. Позднякова Ю.М. Технология биологически активных добавок к пище на основе ферментативного гидролиза гонад гидробионтов. Дис. .канд. техн. наук Владивосток. - ФГУП «ТИНРО-центр». - 2003. - 126 С.

87. Проссер Л., Браун Ф. Сравнительная физиология животных. М.: Мир, 1967.-751 с.

88. Пяллин P.A. Влияние органических растворителей на взаимодействие а-химотрипсина с фосфорорганическими ингибиторами. Дис. .канд. химич. наук Таллин. - Инст. химии АН Эстонской ССР. - 1979.

89. Рекомендуемые уровни потребления пищевых и биологически активных веществ. Методические рекомендации МР 2.3.1. 1915-04. Минздрав России. М. - 2004. - 35 с.

90. СанПиН 2.3.2.1078-01. Гигиенические требования безопастности и пищевой ценности пищевых продуктов. Санитарно-эпидемиологические правила и нормативы.

91. Сажинов Г.Ю., Круглик В.И., Соломадина JI.B. Новые технологии в производстве перспективных продуктов детского питания // Вопр. питания. — 1996.-№5.-С. 41-44

92. Сапронов Н.С., Елисеев В.В, Торкунов П.А., Крылова И.Б., Евдокимова Н.Р. Влияние нового фенилалкильного производного таурина на сердечно-сосудистые эффекты аденозина. Научно-исследовательский институт эксп. медицины РАМН, С-Петербург. - 1998. - С. 9-11.

93. Сафронова Т.М. Аминосахара промысловых рыб и беспозвоночных и их роль в формировании качества продукции. М.: «Пищевая промышленность». - 1980. - С. 46-81.

94. Северин С.Е. Биологическая роль природных дипептидов скелетной мускулатуры // Вест. МГУ. 1972. - Т. 1. - С, 187-189.

95. Сейфула Р.Д., Борисова И.Г. Проблемы фармакологии антиоксидантов // Фармакол.и токсикол. 1990. - Т. 53. - № 6. - С. 3-10.

96. Татаркина Н.Д., Жилкова H.H., Пивненко Т.Н., Аюшин Н.Б. Влияние Моллюскама на процессы кроветворения Изв. ТИНРО. 2001. - Т. 129. - С. 68-73.

97. Торкунов П.А., Сапронов Н.С. Кардиопротекторное действие таурина // Экспериментальная и клиническая фармакология. 1997. - Т. 60. - № 5. - С. 72-77.

98. ТУ 00479942-002-94. Протомегатерин (металлопротеиназа). Технические условия на опытную партию.

99. ТУ 15-01 279-97. Мидии-сырец.

100. ТУ 15-01 1720-2001. Спизула-сырец.

101. ТУ 9253-006-33620410-03. Гребешок морской-сырец.

102. ТУ 9253-146-00472012-2001. Моллюски двустворчатые-сырец. ТУ 9253-187-00472012-2000. Анадара-сырец.

103. ТУ 9265-216-00472012-02. Корбикула мороженая. ТУ 9280-1203-00472012-96. Пилорин марки А.

104. ТУ 9289-011-00038155-02. Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) с витамином С и глюкозой.

105. ТУ 9280-055-02698170-2000. Коллагеназа краба пищевая.

106. Тутельян В.А., Суханов Б.П., Австриевских А.Н., Поздняковский

107. B.Мо Биологически активные добавки в питании человека. Томск. Изд.-во научн.-техн. лит-ры. - 1999. - 296 с.

108. ФГУП «ТИНРО-центр». Прогноз общих допустимых уловов по Тихоокеанскому бассейну на 2004 г. // Гос. Ком. по Рыболовству РФ. 2004. - С.252.

109. Федеральный реестр биологически активных добавок к пище. / Подредакцией Т.Л. Барабанова, Е.И.Максакова М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России. - 1999. - Ч. 3. - 124 с. |

110. Формазюк В.Е., Горшкова Т.Ю., Болдырев A.A., Сергиенко В.И. Характеристика хлораминовых комплексов карнозина с гипохлорит-анионом // Биохимия. 1992. - Т. 57, вып. 9. - С. 1324-1329.

111. Формазюк В.Е., Дудина Е.И. и Болдырев A.A. Способ определения антиокислительной активности карнозина // Бюлл. Экспер. Биол. Мед. (Описание изобретения к авторскому свидетельству. SU 1807353 Al).- 1989. № 12.1. C. 668-670.

112. Христофорова Н.К., Шулькин В.М., Кавун В.Я., Чернова E.H. Тяжелые металлы в промысловых и культивируемых моллюсках залива Петра Великого // Дальнаука. 1993. - 295 с.

113. Черногорцев А.П. Переработка мелкой рыбы на основе ферментирова-ния сырья. М.: «Пищевая промышленность». - 1973. - 141.с.

114. Чумак А.Д., Миленина Н.И., Слуцкая Т.Н., Кротова Т.П., Чибиряк ф JI.M., Синюкова C.B., Павловский A.M. Влияние различных добавок наокисление липидов и качество соленых лососевых // Изв. ТИНРО. 1992. - Т. 114.-С. 167-174.

115. Чумак А.Д., Чибиряк Л.М., Павель К.Г., Андреев НЛГ. Повышение качества слабосоленой рыбной продукции с помощью добавок антиокислительного действия //Изв. ТИНРО. 1999. - Т.125. - С. 315-320»

116. Чумак А.Д. Окисление липидов рыб. Методы определения // Изв. ТИНРО. 1995. - Т. 118. - С. 3-18.

117. Шапиро Д.К. Практикум по биологической химии. Минск: Высшая школа. - 1976.-285 с.

118. Шульгина Л.В., Загородная Г.И., Блинов Ю.Г. и др. Лечебно-профилактический продукт на основе отварных вод из кукумарии // Пищевая промышленность. 2001.-№ 12. - С. 73-75.

119. Якубке Х.Д., Ешкайт X. Аминокислоты. Пептиды. Белки. М: Мир. -1985.- 312 с.

120. Brown С.Е. Interaction among carnosine, anserin, ophidine, and cooper in bio-i chemical adaptation//J. Theoret. Biol.-1981.-P. 245-256.

121. Marino B. Arnao, Antonio Cano and Manuel Acosta // Total antioxidant activity inplant material and its interest in food technology. Recent Res. Devel. in Agricultural I Food Chem., 2. 1998. - P. 893-903.

122. Michizo S., Hirobumi K. Free Amino Acids and Quaternary Ammonium Bases in Mantle Muscle of Squids // Bull, of the Japanese Society of Scientific Fisheries. 1980.-P. 1261-1264.

123. Orr H.T., Cohen A.I., Lowry O.H. The distribution of taurine in the verte-bratr retina // J. Nerochem. 1976. - V. 26. - № 3. - P. 609-611.

124. Pat. US, № 3,655,875. Clam extract effective against sarcoma 180 and krebs-2 carcinoma in mice / Jerome D. Goldberg. Опубл. 11.04.72.

125. Preston R.Lo Transport of amino asids by marine invertebrates // J. Exp. Biol. 1993. - V. 256. - № 4. - P. 410-421.

126. Rc. R., Pellegrini N., Proteggente A., Min Yang et all. Antioxidant activity applying an improved ABTS Radical cation decolorization assay // Free Radical Biology I Medicine. 1999. - V. 26. - № 9/10. - P 1231-1237.

127. Rona Id L. and Gvonva Cao. Oxidative stress status in vivo total antioxidant capacity: comparison of different ANALYTICAL METHODS // Free Radical Biology I Medicine. 1999. - V. 27. - № 11/12. - P. 1173-1181.

128. Schoffeniels E. Cellular aspects of active transport // Сотр. Biochem. 1964. -V. 7. -P. 137.

129. Schoffeniels E., Gilles R. Ionoregulation and osmoregulation in Mollusca // Chemical-Zoology-Volume-7-Mollusca Florkin,-M.-(ed.); Scheer,-B.T.-(ed.). -1972. P. 393-420.

130. Toda S., Kumura M., Ohnishi M. // Planta med. 1991. - V. 57. - P. 8.

131. Vorob'ev M.M., Paskonova E.A., Vitt S.V., Belikov V.M. // Nahrung. -1986.-V. 30.-№10.-P. 995-1001.

132. Wright C.E., Tallan H.H., Lyn Y.Y., Gaull G.E. Taurine: biological update // Annu. Rev. Biochem. Palo Alto, Calif. - 1986. - V. 55. - P. 427-453.

133. Wright S.H. Multiple pathways for amino acid transport in Mytiius gill // J.-COMP.-PHYSIOL.,-B. 1985. - V. 156. - № 2. - P. 259-267.

134. Zachariassen K.E», Olsen A. The transmembrane distribution of free amino acids in the adductor muscle of blue mussels (Mytiius edulis) exposed to organic pollutants: A study on regulatory mechanisms // REP.-BECTOS-PROG. 1993. -P. 49-56.