автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.04, диссертация на тему:Теоретическое обоснование и практическая реализация технологий гармонизирующих ингредиентов и напитков на основе молочного сырья

На правах рукописи

Крупин Алексей Владимирович

003494645

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ И ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕАЛИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИЙ ГАРМОНИЗИРУЮЩИХ ИНГРЕДИЕНТОВ И НАПИТКОВ НА ОСНОВЕ МОЛОЧНОГО СЫРЬЯ

Специальность: 05.18.04 - Технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук

2 ^ МАР 2010

Улан-Удэ-2010

003494645

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» (ГОУ ВПО КемТИПП)

Научный консультант: заслуженный деятель науки и техники РФ,

доктор технических наук, профессор Остроумов Лев Александрович

Официальные оппоненты: академик Россельхозакадемии,

заслуженный деятель науки РФ, доктор технических наук, профессор, лауреат премии Правительства РФ Храмцов Андрей Георгиевич

доктор технических наук, профессор Майоров Александр Альбертович

доктор технических наук, профессор Ханхалаева Ирина Архиповна

Ведущая организация: Государственное научное учреждение

«Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности» (г. Москва)

Защита диссертации состоится 20 апреля 2010 г в 10.00 ч на заседании диссертационного совета Д212.039.05 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Восточно-Сибирский государственный технологический университет» (ГОУ ВПО ВСГТУ) по адресу: 670013, г. Улан-Удэ, ул. Ключевская, 40 в, ауд. 8-122.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО ВСГТУ. С авторефератом можно ознакомиться на официальном сайте ВАК Минобрнауки РФ (http://vak.ed.gov.ru/announcements/techn/) и на сайте ГОУ ВПО «ВосточноСибирский государственный технологический университет» www.esstu.ru.

Автореферат разослан 15 марта 2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета

А.С. Столярова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Среди пищевых продуктов особое место занимают напитки, в том числе содержащие этиловый спирт. В их ассортименте превалируют крепкие напитки, которые потребляются в значительных количествах. В то же время отмечается тенденция снижения спроса на водку н увеличение доли потребления слабоалкогольных напитков (главным образом пива и значительно в меньших количествах вина, коктейлей, газированных напитков).

На сегодняшний день накоплены убедительные данные о губительном воздействии чрезмерного потребления алкогольных напитков на продолжительность жизни населения, его смертность, работоспособность, социально-культурное поведение. Выход из создавшегося положения специалисты видят в разработке последовательного осуществления научно обоснованной и экономически обеспеченной, четко сбалансированной государственной алкогольной потггики, учитывающей условия жизни народа, а также его опыт, культурные традиции и обычаи.

Негативные последствия потребления этилового спирта во многом связаны с накоплением высокотоксичного вещества - ацетальдегнда. Метаболическое окисление алкоголя происходит с участием мультиферментой системы, состоящей, как минимум, из двух ферментов: алкогольдегидрогеназы (АДГ) и ацетальдегидрогсназы (АлДГ). Скорость катаболизма алкоголя и альдегида уксусной кислоты различна у каждого человека и определяется генетическим фактором. В нашей стране продукты питания и препараты, направленные на снижение токсического действия этанола и продуктов его метаболизма (ацетальдегнда) на живой организм, в достаточном количестве н ассортименте не производятся. При этом в странах ЕС, США, Канаде, Китае и экономически развитых странах Юго-Восточной Азии подобные направления, связанные с выработкой напитков с гармонизирующими свойствами (улучшающими функциональное состояние организма) весьма развиты.

Считаем, что создание конкурентоспособных отечественных гармонизирующих ингредиентов и напитков как общего, так и специального назначения для обезвреживания продуктов метаболизма этилового спирта, является актуальным и практически важным направлением биотехнологии и смежных отраслей перерабатывающей промышленности. К таким компонентам относятся гармонизирующие ингредиенты, а именно ферментные препараты, обладающие детоксицирующими свойствами, а также коферменты, в роли которых часто выступают витамины, такие как, например, янтарная кислота.

С одной стороны, разнообразие подходов к проектированию напитков с гармонизирующими свойствами, а с другой - отсутствие четкой системы и требований к их изготовлению обусловливают необходимость проведения исследований, в том числе связанных с поиском дополнительных возможностей использования в качестве природных биостимуляторов компонентов и ингредиентов, полученных из молочного лактозосодержащего сырья. Все вышеизложенное указывает на актуальность выбранного направления исследований.

При выполнении работы автор основывался на трудах отечественных

ученых: В.И. Ганнной, Г.Б. Гаврилова, Н.Б. Гавриловой, М.В. Гернет, J1.B. Го-лубевой, М.Б. Данилова, H.H. Дунченко, И .А. Евдокимова, П.Ф. Крашенинина, H.H. Липатова, H.H. Липатова (мл.), A.M. Маслова, A.A. Майорова, П.Г. Не-стеренко, Л.А. Остроумова, В.А. Павлова, В.А. Полякова, В.А. Помозовой, В.Ф.Семенихиной, H.A. Тихомировой, И.С. Хамагаевой, В.Д.Харитонова, А.Г.Храмцова, A.M. Шалыгинойи др.

Отдельные этапы работы выполнены в рамках Федеральных целевых программ «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы и «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы».

Цель н задачи исследований. Целью диссертационной работы является исследование биотехнологнческих и физико-химических особенностей формирования гармонизирующих ингредиентов, а также разработка концепции, позволяющей создавать новые виды напитков на основе молочного сырья.

Для достижения поставленной цели определены следующие задачи:

- исследование закономерностей модификации субстратов лактозосодер-жащего сырья путем гидролиза лактозы препаратами ß-галактозндаз различного происхождения (дрожжами Kluyveromyces lactis; экстрактом из дрожжей К. lactis и Lactococcus lactis spb. lactis с геном дрожжей К. lactis);

- моделирование технологий гармонизирующих напитков на основе сырья с пщролнзованной лактозой;

- исследование закономерностей метаболизма янтарной кислоты в лакто-зосодержащем сырье микроорганизмами Streptococcus termophilus, Lactobacillus tlelbrueckii subsp. bulgaricum, Lac. lactis spb. lactis, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Mannheimia succiniciproducens;

- анализ особенностей биотрансформации дрожжей Saccharomyces cerevisiae н получение ферментных препаратов этанолметаболизирующего действия (ЭМС) с их использованием;

- исследование закономерностей взаимодействия этилового спирта и продуктов его метаболизма с гармонизирующими ингредиентами и белками молочного сырья;

- использование установленных закономерностей для разработки технических документов и широкомасштабного внедрения на предприятиях промышленности, результатов исследования при создании гармонизирующих ингредиентов и напитков общего и специального назначения.

Научная новизна работы:

- изучены состав и свойства препаратов ß-галактозидаз различного происхождения;

- проведена оценка модификации субстратов лактозосодержащего сырья путем гидролиза лактозы препаратами различного происхождения, показано накопление мононосахаров (глюкозы, галактозы) и побочных продуктов ферментации (органических кислот - молочной, муравьиной, щавелевой, винной, яблочной, янтарной, уксусной);

— изучены физнолого-биохимические свойства культур микроорганизмов,

доказана принципиальная возможность применения Man. succiniciproducens для биосинтеза янтарной кислоты при использовании в качестве основною субстрата лактозосодержащего сырья;

— исследованы закономерности процесса культивирования дрожжей S. se-revisiae па молочной сыворотке в односекцпонном биореакторе, определены рациональные параметры процесса;

— обоснованы параметры очистки ЭМС от балластных соединений с последующей доочисткой от коитамшшрующей микрофлоры на мембранах «Milliporc», изучены состав и свойства полученных препаратов;

— показана возможность повышения активности АДГ и АлДГ путем использования НАДФ в окисленной или восстановленной форме, установлена целесообразность иммобилизации препаратов на полимерной матрице, состоящей из агарозы;

— раскрыты особенности взаимодействия этилового спирта и продуктов его метаболизма с белками лактозосодержащего сырья, а также ферментами, входящими в состав ЭМС;

— исследованы пищевая, биологическая и энергетическая ценность напитков, полученных с использованием гармонизирующих ингредиентов.

Практическая значимость н реализация результатов работы в промышленности. Созданы оригинальные технологии, новизна технических решений которых подтверждена (№№2008139159/13, 2008150962/13, 2000128853/13, 2008123647/13, 2009133995, 2009134620). Предложена принципиальная технологическая схема и разработаны частные технологии гармонизирующих ингредиентов и напитков с их использованием. Указанные разработки внедрены в производство (РЦ 10-146564-2000; ТИ 10-146564-00; ТУ 9222-055-0268315-01; ТУ 9222-055-0268315-01; ТУ 9222-057-0268315-01; ТИ 9184-065-02068315-02, ТУ 9222-126-02068315-04, ТУ 9222-006-02068315-09; ТУ 9222-007-0206831509; ТУ 9256-008-02055312-09; ТУ 9256-008-02055313-09; ТУ 9256-00802055314-09; ТУ 9222-004-02068315-10).

Результаты работы прошли апробацию и внедрены в производство на предприятиях (Барнаульский молочный комбинат, Кемеровский молочный комбинат, Мариинскин ликероводочный завод, Мастер-Милк, Новокемеровский пивобезалкогольный завод, Новокузнецкий ликероводочный завод, Экспериментальный сыродельный завод и др.).

Апробация работы. Основные результаты работы доложены и получили одобрение на симпозиумах, конгрессах, конференциях, семинарах и совещаниях различного уровня, проходивших в 2000-2009 гг. в городах Алматы, Астана, Волгоград, Кемерово, Москва, Новосибирск, Омск, Орел, Оренбург, Пенза, Самара, Семипалатинск, Ставрополь, Юрга и др.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано более семидесяти печатных работ, в том числе две монографии общим объемом 25,2 усл.пл., статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикации основных материалов диссертаций («Молочная промышленность», «Пиво и напитки», «Сыроделие и маслоделие», «Достижение науки и техники АПК»), научных трудах ин-

ститутов, материалах конгрессов, симпозиумов, конференций.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из восьми глав, в том числе введения, аналитического обзора, методической части, результатов собственных исследований и их анализа, выводов, списка использованных источников литературы и приложений. Основной текст работы изложен на 323 страницах машинописного текста, содержит 91 таблицу, 74 рисунка, 404 литературных источника и приложения, отражающие масштабы реализации работы.

Основные положения, выносимые на защиту:

- состав и свойства р-галактозидаз различного происхождения;

- сущность модификации субстратов лактозосодержащего сырья в связи с получением гармонизирующих ингредиентов;

- результаты изменений характеристик лактозосодержащего сырья при использовании его в качестве субстрата для биосинтеза янтарной кислоты;

-биотехнологии получения гармонизирующих ингредиентов;

- концепция создания гармонизирующих напитков с направленно регулируемыми составом и свойствами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Обоснована актуальность, научная новизна и практическая значимость диссертационной работы.

Глава 1. Аналитический обзор. В аналитическом обзоре приведены сведения о перспективах использования лактозосодержащего сырья в технологии гармонизирующих напитков с общими и специальными свойствами. Обсуждаются вопросы, связанные с характеристикой основных ферментов, участвующих в технологии изготовления продукции данного вида, уделено внимание вопросам получения янтарной кислоты и ее применению в отраслях народного хозяйства. Раскрыты свойства янтарной кислоты как важного гармонизирующего ингредиента.

С целью дальнейшего совершенствования существующих и разработки новых гармонизирующих ингредиентов и напитков с их использованием проведено обобщение материалов в унифицированной системе, базирующейся на сочетании значимых факторов и критериев. В заключении по аналитическому обзору разработана схема классификации, которая позволяет прогнозировать и давать оценку возможностям дальнейшего расширения ассортимента и совершенствования технологии ингредиентов и напитков данной группы. Предложенная схема в диссертации дополняет отдельные литературные данные по обсуждаемому вопросу и не претендует на завершенность, поскольку является доступной для системоконструирующих отношений.

Все напитки, согласно предлагаемой схемы, дифференцированы по определенному признаку на два класса, в каждом из которых выделено несколько подклассов, отличающихся особенностями блок-структурных элементов. В предлагаемой схеме в качестве критериев, определяющих видовое разнообра-

зие гармонизирующих напитков, используется стадия технологического процесса, связанная с ферментацией сырья.

В рецептурах напитков присутствуют гармонизирующие ингредиенты самой разнообразной природы. Показана целесообразность модификации лак-тозосодержащих субстратов, использования этилового спирта, АДГ и АлДГ, а также янтарной кислоты как важного кофермсша дстоксицирующнх систем организма для придания напиткам общих н специальных свойств.

На основании анализа литературных данных сформулирована цель и задачи диссертационной работы.

Глава 2. Организация, объекты и методы проведения исследовании. В настоящей главе рассмотрена схема и организация выполнения работы, приведена характеристика объектов и методов исследований.

Теоретические и экспериментальные исследования выполнены в соответствии с поставленными задачами в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» (ГОУ ВПО КемТИПП). Поэтапная схема эксперимента приведена на рис. 1.

На первом этапе исследовали закономерности модификации субстратов лактозосодержащего сырья путем гидролиза лактозы препаратами ß-галактозидаз различного происхождения. Для этого изучали состав и свойства препаратов (дрожжей К. lactis, дрожжевого экстракта из К. lactis и Lac. lactis spb. lactis с геном дрожжей К. lactis), обладающих ß-галактозидазной активностью. При выполнении опытов оценивали массовую долю белковых веществ по соответствующим спектрам паров азота, образующихся при сжигании образцов ß-галактозидаз по методу Дюма, молскулярно-массовое распределение белковых фракций электрофорезом в полиакриламидном геле, рассчитывали теоретические значения показателя гидролиза лактозы, анализировали органолеити-ческие характеристики. В случае использования микробных препаратов определяли интенсивность роста микробных клеток на субстрате через 5 и 10 ч культивирования в образцах.

Варьируя температуру, pH, активность препарата и продолжительность ферментации, исследовали закономерности гидролиза лактозы. Оценивали изменения физико-химических показателей молока при гидролизе лактозы. Изучали состав углеводов, образующихся при гидролизе, определяли массовую долю продуктов трансгликозилирования, анализировали накопление органических кислот (молочной, муравьиной, щавелевой, винной, янтарной, яблочной, уксусной), аминокислотный состав и активность ферментных систем микроорганизмов в молоке с гидролизованной лактозой. Результаты экспериментов положены в основу для расчета в соответствующих координатах констант Миха-элиса-Ментен.

Полученные на первом этапе данные использовали в дальнейшем для моделирования технологий создания гармонизирующих напитков.

Рис. 1. Общая схема проведения исследований

Исследовали процесс сбраживания углеводов сыворотки с шдролизован-ной лактозой дрожжами S. cerevisiae, оптимизировали техполошчсскне параметры получения напитков. Изучали параметры активации дрожжей с использованием роторно-пульсационной обработки и с применением различных сред. Рассматривали влияние параметров работы на физиологическое состояние дрожжей и активность их отдельных ферментных систем. На основании полученных результатов определены оптимальные параметры обработки дрожжей в роторно-пульсацнонном аппарате, позволяющие увеличить бродильную активность и минимизировать количество мертвых клеток в суспензии.

Третий этап экспериментальных исследований связан с анализом физио-лого-бнохимических свойств микроорганизмов - продуцентов янтарной кислоты, которая является коферментом многих ферментов и считается важным гармонизирующим ингредиентом. Для ферментации лактозосодержащего сырья использовали продуценты янтарной кислоты Man. succiniciproducens и An succiniciproduccns, в качестве контроля использовали молочнокислые микроорганизмы Str. termophilus, Lac. delbrueckii subsp. bulgaricum, Lac. lactis spb. lactis. Закваски вносили в лактозосодержащие субстраты в количестве 3-7%, выдерживали при заданной температуре и визуально оценивали препараты микроорганизмов, контролировали pH, исследовали накопление микроорганизмов. При выборе препара тов также учитывали активность протенназно-пептндазной системы, свойства которой оценивали по накоплению продуктов протеолнза. Проводили оценку качественного и количественного состава белковых фракций, полученных с использованием вертикального электрофореза. В дальнейшем проводили исследования, связанные с выбором и уточнением состава закваски. Определяли влияние технологических параметров (дозы закваски, температуры, pH, продолжительности процесса) на выход продуктов ферментации. Результаты, полученные в ходе выполнения этапа исследований, использовали для разработки рецептур и обоснования технологического регламента выработки гармонизирующих напитков с повышенным содержанием янтарной кислоты.

В дальнейшем проводили анализ закономерностей биотрансформацни дрожжей в связи с получением гармонизирующих ингредиентов, а именно ферментных препаратов этанолметаболизирующего действия с использованием лактозосодержащего молочного сырья. Изучали процесс разрушения дрожжей S. cerevisiae, подбирали скорость вращения ротора, размер стеклянных шариковых бус, продолжительность процесса, оценивали степень разрушения клеток дрожжей. Разрабатывали технологию выделения и очистки этанолмстаболизи-рующей системы. Варьируя параметры технологического процесса (температуру, размер и марку мембран, pH среды, скорость элюации, вид носителя), получали ЭМС с различным составом. Ферменты, содержащиеся в ЭМС, оценивали по молекулярной массе, активности, наличию сопутствующих веществ и некоторым физико-химическим свойствам: изоэлектрическои точке, аминокислотной последовательности и другим.

В дальнейшем исследовали закономерности взаимодействия этилового спирта п продуктов его метаболизма с гармонизирующими ингредиентами и белками лактозосодержащего сырья. Проводили анализ состава спиртов раз-

личных марок, исследовали особенности деградации этилового спирта и аце-тальдегида под влиянием АДГ и АлДГ, изучали биотрансформацию казеина, а-лактоальбумнна и р-лактоглобулнна под влиянием этилового спирта и сопутствующих ингредиентов. В качестве объективных характеристик белковой фазы выбраны соотношение белкового и пептидного азота, молекулярно-массовое распределение белковых фракций, водосвязывающая и жироэмульгирующая способность, а также средний диаметр мицелл казеина.

Заключительный этап связан с освоением и внедрением разработанных технологий на предприятиях отрасли, а также оценкой эффективности разработанных технологий. В соответствии с существующими требованиями осуществляли адаптацию разработанных технологий к промышленным условиям, разрабатывали техническую документацию, внедряли результаты исследований в промышленности, при необходимости оформляли патентную документацию.

На разных этапах работы объектами исследований являлись - лактозосо-держащее сырье, коммерческие образцы микроорганизмов и ферментных препаратов, а также вспомогательные материалы, отвечающие требованиям действующей нормативной и технической документации.

При выполнении работы использовали общепринятые, стандартные и оригинальные методы исследований. Физико-химические показатели определяли по стандартным методикам: каталитическую активность АДГ оценивали по скорости окисления кофермента никотинамиддинуклеотида восстановленного (НАДИ); каталитическую активность АлДГ определяли методом Б.М. Кершен-гольц и Е.В. Серкиной, регистрируя начальную скорость образования НАДЯ при окислении ацетапьдегида с образованием уксусной кислоты; изоэлектриче-скую точку ферментов определяли методом изоэлектрического фокусирования на установке фирмы ВюЯа1; молекулярную массу полученного АДГ и АлДГ определяли методом гель-фильтрации с использованием тестовых белков; микробиологические показатели определяли с учетом требований, указанных в действующей документации. Отдельные показатели изучали по известным методикам, прописанным Г.С. Иниховым, А.И. Ермаковым и др.

Результаты экспериментов обрабатывали методами статистики. Адекватность уравнений регрессии экспериментальным данным проверяли по критерию Фишера. Доверительную ошибку коэффициентов уравнения регрессии рассчитывали по критерию Стьюдента.

Глава 3. Исследование закономерностей модификации субстратов лактозосодержащего сырья путем гидролиза лактозы препаратами [3-галактозндаз различного происхождения. Изучали свойства р-галактозидаз в связи с оценкой возможности их применения для модификации лактозосодержащего сырья в биотехнологии гармонизирующих ингредиентов и напитков с их использованием. В табл. 1 приведена характеристика используемых биопрепаратов.

Представленные данные свидетельствуют о том, что у используемых биопрепаратов активность р-галактозидазы варьировала в широких пределах. Минимальной активностью характеризовался образец дрожжей К. кс^в (на

уровне 3,8+0,22 Е/мл), у трансгенного образца Ьаск>соссиз 1ас11в врЬ. 1асПз с геном дрожжей К. ксШ аналогичный показатель превышал базовое значение в 2,23 раза, а у дрожжевого экстракта из К. ЬсИэ в наших экспериментах он являлся максимальным и составлял 14,2+0,74 Е/мл, что в 3,74 раза выше базового значения. Подобное варьирование, вероятно, связано со степенью очистки препаратов, а также массовой долей как общего содержания белковых веществ, так и р-галактозидазы в исходном препарате.

Таблица 1

Ха рактсристнка используемых биопрепаратов

Биопрепарат Активность ß-галакто-зидазы, Е/мл КОЕ/г, после продолжительности культивирования, ч Орган олсптичес кие свойства

5 10

Дрожжи К. lactis 3,8±0,22 8,5*102 8,5*105 Овальные и яйцевидные, много почкующихся клеток

Экстракт из К. lactis 14,2+0,74 Жидкость темно-коричпе-вого цвета с характерным запахом

Lac. lactis spb. lactis с геном дрожжей К. lactis 8,5+0,47 4,1х 105 11,2*109 Одиночные кокковые формы, диплококки

ПРИМЕЧАНИЕ. Культнвированис после 12 ч на стерилизованном обезжиренном молоке с массовой долей лактозы 4,5%.

При фракционировании белковых веществ в биопрепаратах методом диск-электрофореза получены соответствующие образцы. Путем постановки специальных опытов нз них в дальнейшем выделены р-галактозидазы, качественный состав которых согласно обработке результатов представлен на рис. 2.

Из литературных источников известно, что молекулярная масса домена Р-галактозндазы составляет 120-130 кДа. В этой связи при получении биопрепаратов использована селективная ультрафильтрационная мембрана по указанной молекулярной массе. На рис. 2 отчетливо видно, что попавшие фракции белковых веществ имеют молекулярную массу в диапазоне от 90 до 130 кДа. Не занимаясь дополнительным идентифицированием белковых веществ полученных биопрепаратов, провели оценку лишь их молекулярно-массового распределения (табл. 2).

Таблица 2

Молекулярно-массовое распределение фракций белков в препаратах

Образец Молекулярно-массовое распределение, %

120-130 кДа 110-120 кДа 100-110 кДа 90-100 кДа

Дрожжи К. lactis 57,0 18,1 10,2 14,7

Экстракт из К. lactis 81,7 6,3 5,1 6,9

Lac. lactis spb. lactis с геном дрожжей К. lactis 64,8 17,3 10,8 7,1

Рис. 2. Фракционный состав препаратов на электрофорезе в полиакрила-мпдном геле после выделения р-галактозндазы: а - маркеры заданных молекулярных масс, 1\Да (1 - 200, II - 180, Ш - 150, IV - 140, V - 120 (р-галактозидаза), VI - 100, VII - 90); б - из дрожжей К. lactis; в - из экстракта из К. lactis; г - из Lac. lactis spb. laetis с геном дрожжей К. lactis

Во всех исследуемых биопрепаратах фракция размером 120-130 кДа является преобладающей. Тем не менее, количество примесей, содержащихся в образцах, варьирует в достаточно широких пределах (от 18,3 до 43,0%). Можно предположить, что наличие побочных фракций является предпосылкой протекания побочных реакций при ферментации, не связанных со специфичным процессом пиролиза лакгозы.

Известно, что регулирование концентрации ионов водорода позволяет существенно изменять скорость ферментативных реакций, обеспечивая заданные показатели. В наших опытах продемонстрированы особенности изменения показателя степени гидролиза в зависимости от рН (рис. 3). Показано, что рН-действия биопрепаратов (3-галактозидаз напрямую зависит от активной кислотности, которая зависит от оптимальных значений рН развития микроорганизма.

Активная кислотность, pH

piic. 3. Влияние активной кислотности на степень гидролиза лактозы: I - дрожжи К. lactis; 2 - экстракт из К. lactis; 3 -Lac. lactis spb. lactis с геном дрожжей К. lactis

В общем случае минимальной степенью гидролиза лактозы характеризуются образцы, полученные с использованием дрожжей К. 1асЦ5, у образца К.

аналогичный показатель колебался на уровне 82-83% от полного гидролиза лактозы.

Значения констант кинетического уравнения для экстракта из К. 1асН5, описывающего процесс пиролиза лактозы, приведены в табл. 3.

Таблица 3

Значения констант и энергий активации процесса гидролиза лактозы

Константа Е, кДж/моль Ка, моль/л к*, с'1

К 13,5±0,68 (2,4±0,13)-10~2 (9,0±0,47)-10"2

11,0±0,66 (6,3±0,32)10": (1,7±0,09)104

Зависящие от температуры и pH среды константы гидролиза рассчитаны по результатам обработки соответствующих серий кинетических кривых гидролиза. Предложенная кинетическая схема адекватно описывает весь массив полученных нами экспериментальных данных.

В процессе ферментации происходят существенные изменения с составными частями молока. В связи с тем, что наибольшим изменениям подвергся молочный сахар, проанализирован состав углеводов, получаемых при гидролизе лактозы, проведена оценка их качественного и количественного состава. Не приводя в тексте автореферата хроматограммы, следует отметить, что в процессе ферментации отмечается накопление продуктов трансгликозилнрования (рис. 4).

Установлено, что темп изменения углеводов в лактозосодержащем сырье подчиняется общим законам независимо от использованного препарата, трансформирующего лактозу. Так, наибольшее падение массовой доли лактозы в молоке после двух часов ферментации отмечено в случае использования Lac. lactis spb. lactis с геном дрожжей К. lactis - на 39%, затем на 25% в случае гидролиза дрожжами К. lactis и на 12% в образце, ферментированном экстракт из К. lactis. В дальнейшем темп падения массовой доли лактозы замедлялся и, начиная с 8-ми часового интервала, переходил в зону, соответствующую показателю ошибки опыта (R2>0,15), стадия процесса являлась заключительной.

Продолжительность процесс а, ч Продолжите л ьн ость процесса, ч

б

Цюдэлжптельность процесса, ч

Рис. 4. Темп изменения углеводов при гидролизе лактозы (а -дрожжи К. lactis; б - экстракт из К. lactis; в - Lac. lactis spb. lactis с геном дрожжей К. lactis): 1 -лактоза; 2 - глюкоза; 3 - галактоза; 4 -продукты трансгликозилирования

Отметим, что во втором варианте опытов с использованием экстракта из К. 1асП8 глюкоза и галактоза накапливались практически в равных концентрациях (как и следовало ожидать, исходя из теоретического выхода), различия в темпе накопления являлись недостоверными. Так, содержание глюкозы и галактозы после 2, 4, 6, 8 и 10 ч ферментации в относительном содержании углеводов составило 20 и 20, 23 и 22, 24 и 22, 29 и 28, а также 36 и 34% соответственно. В результате биотрансформации основного субстрата, в качестве которого выступала лактоза, произошло увеличение массовой доли моносахаров и продуктов трансгликозилирования за счет неравновесного течения процесса гидролиза. Отметим, что практически во всех образцах темп накопления глюкозы превалировал над аналогичным показателем второго продукта гидролиза лактозы, а именно - галактозы, которая, являлась более реакционно-способной.

В процессе ферментации происходят существенные изменения с субстратом. Помимо гидролиза лактозы произошло накопление органических кислот. На рис. 5 показаны хроматограм.мы органических кислот в обезжиренном молоке с гидролизованной лактозой после 10 ч ферментации, расшифровка спектра органических кислот при ферментации приведена в табл. 4.

14.0 m AU

C'a pet

2 3

8 9

_„Лл_

4 I

5 I ,6 7

ají

10.0 mAU

2,2 a

5l 5a 1 6

17,2 mAU

-S , 9

Capel

2,2 a

12 3 4 мин

Рис. 5. Хроматографический профиль органических кислот в молоке с гидролизованнои лактозой (а - дрожжи К. lactis; б - экстракт из К. lactis; в - Lac. lactis spb. lactis с геном дрожжей К. lactis) по вариантам: 1 - молочная кислота; 2- муравьиная кислота; 2а, 3, 9, 5а -нендентифнцнрованные пики; 4 -щавелевая кислота; 5 - винная кислота; 6 - яблочная кислота; 7 - янтарная кислота; 8 - уксусная кислота

Таблица 4

Количественный состав идентифицированных органических кислот

в молоке с гидр олизо ванной лактозой (^¿т; т<0,05)

Кислота Массовая доля, мг/100 г, после продолжительности ферментации, ч

дрожжи К. lactis экстракт из К. lactis Lac. lactis spb. lactis с геном дрожжей К. lactis

4 8 12 4 8 12 4 8 12

Молочная 2,12 35,7 67,2 3,55 4,93 10,36 6,20 50,31 79,30

Муравьиная - 3,68 6,71 1,56 1,78 2,06 0,05 0,09 2,37

Щавелевая 0,01 0,08 1,27 0,02 0,06 0,07 _ - -

Винная - - 0,03 - - 0,02 - - -

Янтарная - 0,05 0,09 _ - - - - -

Яблочная 0,34 0,40 0,46 - 0,02 0,06 1,05 8,96 20,11

Уксусная 0,03 0,07 1,02 0,01 0,04 0,05 - - -

Установлено, что спектр образованных органических кислот является разнообразным. Судя по результатам хроматографического анализа, можно заключить, что из всех биопрепаратов наиболее активным продуцентом молочной кислоты является Lac. lactis spb. lactis с геном дрожжей К. lactis, пики других органических кислот не являются значительными, за исключением яблочной кислоты, которая является промежуточным продуктом при трансформации углеводов в молочную кислоту. Также установлено, что использованные биопрепараты не продуцируют в лактозосодержащем сырье янтарную кислоту. В этой связи необходимо проведение дополнительных исследований, связанных с поиском микроорганизмов-продуцентов янтарной кислоты.

Тем не менее, поставленная задача по модификации субстратов лактозо-содержащего сырья путем гидролиза лактозы препаратами ß-галактозндаз различного происхождения была выполнена. Полученные на данном этапе работы результаты исследований использованы в дальнейшем при моделировании технологий напитков.

Глава 4. Моделирование технологий гармонизирующих напитков на основе молочного сырья с гндролнзованной лактозой. Известно, что технология получения ингредиентов и напитков представляет собой статистический многофакторный процесс, характеризующийся большим количеством взаимосвязанных параметров и изменяющимися показателями качества всей системы во времени. В связи с тем, что технологические процессы культивирования микроорганизмов, построенные на использовании одного фактора, ограничены возможностями либо ферментных систем самого микроорганизма, либо условиями Ii параметрам! культивирования в соответствии с методологией априорного ранжирования, учетом литературных данных и результатов предварительных экспериментов осуществлен отбор основных переменных параметров, оказывающих значимое влияние на формирование качества напитков, а также оп-

ределены интервалы их варьирования. Для анализа показателей процесса использовали аппарат математической статистики, включая планирование эксперимента. Это позволило при ограниченном количестве опытов определ1гть истинные значения исследуемых величин, а также формализовать описание процесса в виде регрессионных уравнений.

Моделировали технологии гармонизирующих напитков двух видов: слабоалкогольных, с использованием закваски дрожжей, и безалкогольных, с использованием молочнокислых микроорганизмов. В автореферате приведены данные, связанные с моделированием технологии гармонизирующих безалкогольных напитков общего назначения.

При поиске рациональных режимов получения напитков учитывали влияние входных параметров: доза закваски (Xi) от 1,0 до 5,0%; массовая доля продуктов трансгликозилирования (Х2) егг 50 до 200 мг/100 г и температура сквашивания (Хэ) от 30 до 42°С. В качестве результирующих критериев выбраны продолжительность сквашивания (Y,, ч), вкус и запах (Y2, балл) и консистенция (Y;„ балл). В качестве закваски использовали Lac. Iactis. Определение адекватности полученных математических моделей проводили на основе дисперсионного анализа по критерию Фишера, значимость всех коэффициентов подтверждали критериями Стыодента. В результате обработки экспериментальных данных с помощью пакета прикладных программ Microsoft Excel рассчитаны коэффициенты уравнении регрессии вида (2) для каждого исследуемого варианта и сведены в табл. 5.

Нами исследовано поведение входных параметров на трех уровнях, что позволило получить описание процесса в виде уравнения:

, _____ , . т у

ч I J

Y = Bn+YB.X.+ V B..x.x.+ У В..Xi

о Mil . . , // I ; . , II I

1=1 l,J=\ ■ 1=1

(2)

Коэффициенты В)2, В)3, В2} характеризуют эффекты парных межфакгор-ных взаимодействий и будут играть более заметную роль в описании процесса при больших интервалах варьирования.

Таблица 5

Факторы Значения коэффициентов

Во в. в? в, в,? bp в?1 В„ в72 в„

y, 59,423 -0,537 -0,116 -2,380 0,001 0,000 0,001 0,056 0,000 0,031

y2 -18,954 0,472 0,061 1,130 0,000 0,000 -0,001 -0,079 0,000 -0,012

Y? -9,034 0,348 0,004 0,615 0,001 -0,012 0,000 0,000 0,000 -0,007

Для обоснования рациональных режимов получения напитков использовали уравнения регрессии и треугольники Гиббса-Розебома, на которых изображены сечения поверхностей отклика (рис. 6) на уровнях, соответствующих определенным значениям результирующего критерия.

0,00»1,00

•0,00

0,00 0,25 0,50 0,75 1,00

0,00*1,00

0,00

0,00л1,00

1,00

0,00

0,00 0,25 0,50 0,75 1,00

Рис. 6. Параметры получения ферментированных напитков:

а - продолжительность сквашивания, ч; б - вкус и запах, балл; в - консистенция, балл

Анализ результатов показал, что, корректируя параметры технологического процесса, можно обеспечить требуемый уровень качества готовой продукции, а также воздействовать на продолжительность технологического процесса ее изготовления. Показано, что увеличение дозы закваски является фактором интенсификации технологического процесса, причем в значительной степени на активность заквасочных культур влияет содержание продуктов трансгликозилирования в ферментируемой системе. Именно эти два фактора являются наиболее значимыми в технологии напитков. В кодированной форме рациональной дозой закваски можно считать 0,6-1,0, продолжительность процесса при этом не превышает 6 ч.

Аппроксимируя результаты оценки влияния технологических факторов, следует отметить, что для получения продукта необходимого качества нужно внести соответствующие поправки. Как показал анализ полученной математической модели, на органолсптнческне показатели в большей степени влияет температура культивирования и присутствие олигосахаридов. Очевидно, что именно эти факторы оказывают влияние на активность фильтрующихся ферментных систем, а также на скорость накопления биомассы, которая, лизируя, способствует появлению дополнительного количества ферментов, в том числе гетерогенного брожения, которые продуцируют вкусоароматические вещества, формируя органолептические характеристики готовой продукции.

Для облегчения восприятия материала сведем рациональные параметры технологического процесса в табл. 6.

Таблица 6

Рациональные параметры процесса получения напптков_

Рациональные параметры процесса в кодированном виде Параметры

X, Х2 X,

У,<6,0 0,63-1,00 0,00-0,65 0,00-0,55

У2>9,5 0,23-0,85 0,05-1,00 0,00-0,50

У,>4,8 0,00-0,75 0,45-1,00 0,00-0,25

Наложение граничных условий получения рациональных значений продолжительности процесса и органолептических свойств определяет зону опти-

мизации трех исследуемых факторов (табл. 7).

Таблица 7

_Зона оптимизации технологических факторов напитков_

Максимальные (рациональные) значения У,, У2, У3 Область рациональных значений

X, х2 Х3

В кодированном виде 0,63-0,75 0,45-0,65 0,00-0,25

В натуральном выражении 2,52-3,00 90,00-130,0 30,0-33,0

Обобщая результаты проведенных исследований, отметим, что они являются научно обоснованной базой для создания новых видов напитков, обладающих гармонизирующим действием на организм человека.

Анализ литературных данных по вопросам активации микрофлоры показал, что для повышения ферментативной активности широко используются ме-

тоды обработки клеток, повышающие проницаемость клеточных мембран, что способствует улучшению транспорта полезных компонентов среды внутрь клеток. К таким методам относятся термическая активация, обработка аэроионами, магнитными полями, электроимпульсная и акустическая обработка.

Нами для этой цели использована роторно-пульсационная обработка (РПО), которая воздействует на клетки микроорганизмов, в частности дрожжи, в нескольких направлениях. За счет кавитационного воздействия происходит освобождение поверхности клеток, что ускоряет транспорт компонентов среды в дрожжевую клетку. В процессе РПО происходит увеличение температуры, что также ускоряет ферментативные процессы в клетке. Кроме того, важным фактором, активирующим дрожжи, является насыщение среды кислородом воздуха за счет его диспергирования в процессе РПО. Кислород необходим дрожжам в начальный момент размножения для синтеза некоторых липидных компонентов клетки. В то же время РПО оказывает жесткое механическое и термическое воздействие на клетки, что может привести к их разрушению. В данном случае защитную функцию для клеточных оболочек дрожжей могут оказывать содержащиеся во вторичном молочном сырье ацилглицернды.

Для подтверждения наших гипотез проведены соответствующие экспериментальные исследования. Использованы дрожжи расы 95 Новокемеровского инвобезалкогольного завода пятой генерации. Исходные дрожжи характеризовались показателям!, приведенными в табл. 8.

Таблица 8

Физиолого-биохимпческие показатели дрожжей_

Показатели Значения

нормируемые фактические

Общая концентрация клеток, КОЕ'см3 700-900 875,2±43,6

Количество клеток, % от общей концентрации: - мертвых - почкующихся - с гликогеном 0-10 30-40 50-80 6,6±0,44 38,4±2,0 52,0±2,23

Протеолнтическая активность, ед/100 см' _ 1,1±0,10

Массовая доля глютатиона, мг/100 см3 - 1,5±0,21

Исходные дрожжи содержат небольшое количество мертвых клеток, а по числу почкующихся соответствуют нормам. Эту дрожжевую суспензию обрабатывали при разных параметрах работы РПО. Оценку влияния параметров РПО на дрожжи проводили на основании исследования количества мертвых клеток. Учитывая, что допустимое содержание в дрожжевой суспензии мертвых клеток не должно превышать 10%, можно ограничить диапазон исследуемых параметров, при которых отмирание дрожжей не превышает нормируемых значений. Результаты исследований представлены в табл. 9.

Из представленных данных видно, что РПО оказывает влияние на концентрацию мертвых клеток в дрожжевой суспензии. С увеличением числа оборотов и уменьшением зазора их количество увеличивается. Это объясняется тем, что дрожжи в большой степени подвержены механическому воздействию.

Таблица 9

Влияние РПО на содержание мертвых клеток в дрожжах, %

Зазор, мм Частота вращения, мин"1 Продолжительность обработки, мин

0,5 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0

0,1± ±0,01 1000 2000 3000 4000 10,8±0,61 11,6±0,72 13,2±0,66 16,9±0,86 11,4±0,58 11,9±0,60 14,6±0,74 18,0±0,09 12,3±0,62 13,5±0,68 16,4±0,83 18,8±0,94 13,5±0,68 14,0±0,71 16,2±0,82 19,0±0,97 13,8±0,71 15,2±0,08 16,0±0,81 19,9±0,21 14,0±0,71 16,8±0,85 19,3±0,96 20,4± 1,05

0,2± ±0,02 1000 2000 3000 4000 10,9±0,55 11,0±0,56 12,6±0,63 13,1±0,66 10,9±0,55 11,4±0,57 12,9±0,66 14,9±0,74 13,4±0,68 14,9±0,75 16,2±0,82 17,7±0,90 15,0±0,76 16,0±0,80 17,8±0,90 17,9±0,91 15,2±0,77 16,7±0,84 18,2±0,92 18,9±0,95 16,0±0,81 16,6±0,84 18,4±0,93 19,2±0,96

0,3± ±0,03 1000 2000 3000 4000 9,0±0,46 9,0±0,46 8,9±0,45 11,3±0,57 9,9±0,50 9,8±0,49 9,8±0,49 11,7±0,59 9,8±0,50 10,2±0,51 12,3±0,62 12,6±0,64 9,8±0,50 9,9±0,50 13,0±0,65 13,8±0,70 10,8±0,54 11,2±0,56 14,5±0,73 15,9±0,80 12,6±0,63 12,9±0,65 14,8±0,75 16,0±0,81

0,5± ±0,05 1000 2000 3000 4000 10,6±0,55 10,7±0,54 10,8±0,55 10,9±0,56 9,7±0,49 11,9±0,60 12,5±0,63 12,5±0,63 10,2±0,51 12,3±0,62 12,8±0,64 13,0±0,65 10,0±0,51 12,2±0,61 13,2±0,66 13,5±0,68 11,2±0,56 12,4±0,63 13,4±0,68 13,5±0,69 11,0±0,55 12,6±0,64 12,8±0,64 12,0±0,61

Прн механическом перемешивании жидкости вследствие развитой турбулентности достигается наиболее тонкое диспергирование газа, что создает большую удельную поверхность раздела фаз. Одновременно возникают акустические колебания, и в акустических полях ультразвукового излучения при определенных условиях возникает кавитация жидкой фазы.

По полученным данным рассчитано уравнение регрессии с использованием стандартных процедур. В качестве основного критерия оптимизации выбрано количество мертвых клеток (К) в зависимости от факторов варьирования: и! - величина зазора, мм; - частота вращения, мин"'; и2 - продолжительность обработки, мин.

Уравнение, описывающее зависимость указанных факторов с выходным критерием, имеет вид:

К=11,66-12,5би ,+0,67и3+17,93и,2+5,0-107и22--2,6- 10"3и,и2-2,4-10^и^из. (3)

По представленному уравнению рассчитаны частные значения и прн фиксированных параметрах обработки. Выявлено, что наибольшее влияние оказывают величина зазора и продолжительность обработки. Можно констатировать, что при величине зазора 0,1-0,2 мм и 3000 мин'1 число мертвых клеток в суспензии дрожжей при любой продолжительности обработки превышает нормируемые значения. В меньшей степени, в пределах 10±0,5%, отмирание дрожжевых клеток происходит при продолжительности обработки 1-2 мин; частоте вращения 1000-3000 мин"1; величине зазора 0,3-0,5 мм.

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что роторно-пульсационная обработка дрожжей в молочной сыворотке оказывает положительное влияние на физиологические и биохимические показатели культуры. По ряду параметров можно сделать вывод о том, что молочная сыворотка н смесь молочной сыворотки и пивного сусла как среды для активирования более предпочтительны, чем вода и пивное сусло.

Глава 5. Исследование закономерностей метаболизма янтарной кислоты в лактозосодержащем сырье. В последние годы во всем мире получило широкое признание развитие нового направления по созданию продуктов, содержащих янтарную кислоту. Она способствует активации энергетического обмена, повышает эффективность иммунной защиты и устойчивость организма к кислородному голоданию и помогает справиться с заболеваниями печени и почек, сердца и сосудов, защищает от аллергии и стресса. Кроме того, янтарная кислота повышает работоспособность, ускоряет процесс «сгорания» алкоголя в организме и быстро снимает похмельный синдром. Янтарная кислота содержится во многих пищевых продуктах, особенно в кисломолочных продуктах, выдержанных винах, сырах, черном хлебе, пиве, глубоководных морских моллюсках, некоторых фруктах и ягодах. Однако основная масса продуктов питания лишена янтарной кислоты.

В качестве заквасок-продуцентов нами опробованы препараты следующих видов микроорганизмов: Str. termophilus, Lbm. bulgaricum, Str. lactis, Man. succiniciproducens, An. succiniciproducens. В табл. 10 приведены результаты определения содержания янтарной кислоты в культуральной среде при проведении процесса ферментации.

Таблица 10

Образование янтарной кислоты культурами микроорганизмов

Культура микроорганизма Массовая доля янтарной кислоты, мг/ЮО г

пахта обезжиренное молоко молочная сыворотка

Str. termophilus 30,0±1,80 25,0±1,50 22,0±1,32

Lbm. bulgaricum 35,0±2,10 21,0±1,26 26,0±1,56

Str. lactis 42,0±2,52 22,0±1,32 18,0±1,08

Man. succiniciproducens 1300,0±65,20 1205,0±72,30 1100,0±66,00

An. succiniciproducens 980,0±58,80 815,0±48,90 720,0±43,2

Результаты опытов, обобщенные в табл. 10, позволяют выявить наиболее перспективные культуры, продуцирующие янтарную кислоту: An. succiniciproducens и Man. succiniciproducens, способные дать наибольший выход целевого продукта при относительно низком содержании побочных органических кислот (молочной, яблочной, лимонной, уксусной и других). Выход янтарной кислоты от использованной лактозы был выше 50%. С этими культурами проведены более детальные эксперименты по биосинтезу янтарной кислоты.

Нами изучены культуры микроорганизмов An. succiniciproducens и Man. succiniciproducens, продуцирующие янтарную кислоту. Какой-либо

коррекции химического состава молочного сырья перед использованием в качестве культуральной среды не проводилось. На данном этапе работы стояла задача уточнить состав микрофлоры закваски, используемой для производства ферментированных напитков.

Соотношение заквасочных культур в процессе ферментации выбирали по сравнительной оценке нескольких показателей: титруемой и активной кислотности, продолжительности сквашивания и изменению органолеитических показателей. Выбор рационального соотношения микроорганизмов в закваске проводили с учетом свойств исследуемых культур и их ассоциаций. Для выработки ферментированного напитка использовали микроорганизмы Str. termo-philus, Lbm. bulgaricum, Str. lactis с продуцентом янтарной кислоты Man. succiniciproducens. Результаты исследований подбора комбинированной закваски представлены в табл. 11.

Таблица 11

Влияние соотношения культур микроорганизмов в комбинированной закваске на процесс ферментации_

Соот- Титруе- Активная кислотность, pH Продолжительность

ноше- мая ки- сквашивания, ч

ние слот- обезжи- пахта молочная обезжи- пахта молочная

заква- ность, ренное сыворотка ренное сыворот-

сок молоко молоко ка

Str. termophilus : Man. succiniciproducens

1 0 70±2 4,6±0,28 4,5±0,27 4,4±0,27 8,0±0,3 7,0±0,3 6,5±0,3

1 1 70±2 4,8±0,29 4,7±0,28 4,7±0,28 9,0±0,3 8,0±0,3 7,0±0,3

1 2 70±2 5,0±0,30 5,2±0,31 5,2±0,31 10,0±0,3 10,0±0,3 9,5±0,3

1 4 70±2 5,1±0,31 5,4±0,32 5,6±0,32 12,0±0,3 11,0±0,3 10,5±0,3

Lbm. bulgaricum : Man. succiniciproducen s

1 0 75±2 4,7±0,28 4,7±0,28 4,7±0,28 4,0±0,3 4,5±0,3 4,6±0,3

1 1 75±2 4,8±0,29 4,8±0,29 4,8±0,29 6,0±0,3 5,5±0,3 5,0±0,3

1 2 75±2 5,0±0,30 5,2±0,31 5,2±0,31 8,0±0,3 6,0±0,3 5,5±0,3

1 4 75±2 5.2±0,31 5,4±0,32 5,4±0,32 9,0±0,3 7.0±0,3 6,5±0,3

Str. lactis : Man. succiniciproducens

1 0 65±2 5,2±0,31 5,0tt0,30 5,1 ±0,30 6,0±0,3 5,0±0,3 5,0±0,3

1 1 65±2 5,4±0,32 5,2±0,31 5,2±0,31 7,0±0,3 6,3±0,3 6,3±0,3

1 2 65±2 5,5±0,33 5,5±0,33 5,7 ±0,33 9,0±0,3 7,0±0,3 7,0±0,3

1 4 65±2 5,6±0,34 5,7±0,34 6,0±0,34 13,0±0,3 10,0±0,3 10,0±0,3

Результаты исследований, приведенные в табл. И, показали, что в случае использования культур микроорганизмов Str. termophilus и Man. succiniciproducens при предельной титруемой кислотности 70±2°Т наблюдается увеличение показателя активной кислотности за счет увеличения количества культуры Man. succiniciproducens в закваске. В случае использования закваски, состоящей из Str. termophilus н Man. succiniciproducens в равных количественных соотношениях, активная кислотность обезжиренного молока изменилась до pH 4,8±0,29.

При использования комбинированной закваски из Lbm. balgaricum и Man. succiniciproducens наблюдается более интенсивный рост активной и титруемой кислотности в связи с тем, что болгарская палочка обладает более высокой биохимической активностью и высокой кислотообразующей способностью, что неизбежно приводит к преобладанию кислого вкуса в конечном продукте.

В случае использования комбинированной закваски Str. lactis и Man. succiniciproducens с соотношением культур 1:2 и 1:4 установлено, что при постоянном заданном показателе титруемой кислотности 65±2°Т с увеличением количества последней увеличивается продолжительность сквашивания обезжиренного молока более чем в два раза.

При использовании закваски, состоящей из Str. termophilus и продуцента янтарной кислоты Man. succiniciproducens в количественных соотношениях 1:2 и 1:4 пли из Str. lactis и продуцента янтарной кислоты Man. Succiniciproducens, активная кислотность (5,2±0,31 и 5,4±0,32 соответственно) была примерно одинаковой. Однако продолжительность сквашивания увеличилась с 10,0±0,3 до 11,0±0,3 ч в закваске, содержащей Str. termophilus, а в закваске с Str. lactis с 6,0±0,3 до 7,0±0,3 ч. При использовании закваски, состоящей из Lbm. bulgaricum и Man. succiniciproducens, наблюдается самый высокий показатель титруемой кислотности 75±2°Т за счет продуцирования, по-видимому, молочной кислоты, поэтому использование данной закваски нецелесообразно.

Дня выработки ферментированных напитков на основе молочной сыворотки целесообразно использование закваски в комбинация Str. lactis и Man. succiniciproducens с соотношением культур 1:2. В этом случае наблюдается достижение показателей активной кислотности 5,2±0,31 и титруемой кислотности 65±2°Т, продолжительность сквашивания составляет 6,3±0,3 ч. При соотношении культур 1:2 и 1:4 при прочих равных условиях отмечается увеличение активной кислотности и продолжительности процесса ферментации молочной сыворотки.

Количественный состав органических кислот после 10±0,03 ч ферментации обезжиренного молока и 8±0,03 ч ферментации пахты и молочной сыворотки представлен в табл. 12. Следует, прежде всего, отметить общую закономерность - присутствие в составе заквасок культуры Man. succiniciproducens позволяет получить напитки с повышенным содержанием янтарной кислоты. Резкое увеличение массовой доли янтарной кислоты в технологическом процессе связано с экспоненциальным размножением микроорганизмов Man. Succiniciproducens, причем массовая доля молочной кислоты как наиболее весомой в относительном содержании всего профиля органических кислот в 2,9; 1,4 и 1,2 раза превосходила аналогичный показатель для сырья (пахта, обезжиренное молоко и молочная сыворотка, соответственно), ферментированного культурой заквасок из St. tennophilus и Man. succiniciproducens и Str. lactis и Man. succiniciproducens. Подобные изменения содержания органических кислот существенно влияли на формирование органолептических показателей ферме тированных напитков.

Таблица 12

Количественное содержание органических кислот_

Органические кислоты Массовая доля, %, после ферментации

пахта молочная сыворотка обезжиренное молоко

контроль опыт контроль опыт контроль опыт

Молочная 0,96±0,060 0,30±0,020 0,80±0,020 0,25±0,001 1,04±0,060 0,32±0,02

Янтарная 0,07±0,004 0,72±0,040 0,06±0,003 0,65±0,040 0,07±0,004 0,78±0,05

Щавелевая 0,04±0,002 0,06±0,003 0,03±0,002 0,05±0,003 0,04±0,024 0,06±0,03

Яблочная 0,01 ±0,001 0,04±0,024 0,01±0,001 0,03±0,001 р,01±0,001 0,04±0,024

Винная 0,01 ±0,001 0,03±0,001 0,01±0,001 0,02±0,001 0,01 ±0,001 0,03±0,001

Муравьиная 0,01±0,001 0,03±0,001 0,01 ±0,001 0,02±0,001 0,01 ±0,001 0,03±0,001

Лимонная 0,01±0,001 0,02±0,001 0,01±0,001 0,01 ±0,001 0,01 ±0,001 0,02±0,001

Другие органические кислоты (щавелевая, яблочная, муравьиная, лимонная) обнаруживаются в молочном сырье в незначительных количествах. Тенденция накопления незначительного количества обнаружена при анализе даже после процесса ферментации, поскольку образование янтарной и молочной кислоты весьма ценно.

Из анализа совокупности результатов экспериментальных данных, связанных с уточнением видового и количественного состава микрофлоры закваски для ферментированных напитков установлено, что качественный состав закваски должен быть представлен культурами St. termophilus и Man. succiniciproducens в количественном соотношении 1:2 и дозой 5±0,01% для обезжиренного молока и пахты. Закваску, состоящую из Str. lactis и Man. succiniciproducens в соотношении 1:1 в количестве 5±0,01% целесообразно использовать для молочной сыворотки. Наиболее активной средой для продуцирования янтарной кислоты является обезжиренное молоко, затем пахта и молочная сыворотка.

Глава 6. Анализ особенностей бпотрансформацми дрожжей Saccha-romyces cerevisiae и получение ферментных препаратов этанолметаболизи-рующего действия с их использованием. Одним из перспективных направлений создания гармонизирующих ингредиентов является подбор рациональных параметров культивирования микроорганизмов, являющихся продуцентами биологически активных веществ, обеспечивающих увеличение выхода целевых продуктов, повышение продуктивности, увеличение стойкости при хранении, а также обеспечение свойств, связанных со способностью легко отделяться от культуральной жидкости. Исследования направлены на изучение закономерностей культивирования дрожжей на питательной среде, содержащей молочную сыворотку, для определения оптимальных параметров, обеспечивающих высокий выход целевого продукта - этанолметаболизирующей мультиферментной системы. В качестве объектов исследования выбраны дрожжи Candida maltosa Б-1, Candida tropicalis Б-2, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica и Endomycopsis fibuligera C-2, которые, исходя из литературных данных, обладают наибольшей степенью каталитической активности в отношении этилового спирта и ацетальдегвда.

В табл. 13 представлена характеристика изменения каталитической активности этанолокисляющего мультиферментного комплекса, выделенного из культуральной жидкости, при культивировании дрожжей штаммов С. maltosa Б-1, С. tropicalis Б-2, S. cerevisiae, Y. lipolytica и Е. fibuligera С-2.

Таблица 13

Характеристика микроорганизмов по активности этанолокисляющего мультиферментного комплекса_

Название культуры Каталитическая активность, Е/мг белка Массовая доля белка, %

АДГ АлДГ

С. maltosa Б-1 85,05±5,10 9,50±0,57 38,60±2,31

S. cerevisiae 540,50±32,40 32,36±1,98 41,55±2,49

С. tropicalis Б-2 103,35±6,18 12,45±0,78 46,90±2,81

Y. lipolytica 234,47±14,05 28,55±1,72 54,70±3,28

Е. fibuligera С-2 146,50±8,76 31,25±1,87 35,65±2,14

Полученные результаты, представленные в табл. 13, свидетельствуют о том, что наиболее перспективным сырьем для получения этанолокисляющего ферментного комплекса являются дрожжи 8. сегеу15!ае. Этот вид дрожжей содержит ферменты, обладающие наибольшей каталитической активностью по отношению к этиловому спирту и ацетальдегиду. Кроме того, он остается жизнеспособными в течение нескольких недель, а при хранении в замороженном виде его можно использовать через несколько месяцев без потерн его каталитической активности при температуре хранения минус 20±2°С (табл. 14).

Таблица 14

Динамика жизнеспособности дрожжей S. cerevisiae прп хранении

Показатель Продолжительность хранения, сутки

при температуре 4±2°С при температуре мшгус 20±2"С

30 60 90 120 30 60 90 120

Каталитическая активность АДГ, Е/мг белка 486,05± ±29,16 437,45± ±26,22 349,91± ±20,94 321,55± ±19,27 540,50± ±32,40 540,50± ±32,40 540,50± ±32,40 540,50± ±32,40

Каталитическая активность АдДГ, ЕУмг белка 28,85± ±1,73 24,94± ±1,0 23,03± ±1,38 21,89± ±1,31 32,36± ±1,98 32,36± ±1,98 32,36± ±1,98 32,36± ±1,98

Массовая доля белка, % 41,55±2,49

Массовая доля жира, % 11,6±0,70

Хранение при низких положительных температурах сопровождается падением активности ферментов, входящих в ЭМС. Поэтому для дальнейших исследований будем использовать дрожжи штамма в. ссгеу15(ае, хранившихся при минус 20±2Т.

Выбор рациональной концентрации молочной сыворотки в питательной

среде для культивирования дрожжей 8. ссгс\таае представлен в табл. 15. В качестве контроля применяли питательную среду на основе мелассы. Процесс культивирования вели в течение 18±0,5 ч.

Таблица 15

Параметры культивирования дрожжей штамма 8. сеге\Ыае на питательной среде, содержащей молочную сыворотку_

Характеристика Контроль Массовая доля молочной сыворотки, %

25 50 75

Удельная скорость роста, ч'1 0,010± ±0,0007 0,012± ±0,0008 0,017± ±0,0009 0,017± ±0,0009

Выход биомассы, г/г 0,60±0,03 0,70±0,04 1,25±0,07 1,25±0,07

Накопление биомассы дрожжей, г/л 19,8±1,20 24,1 ±1,45 36,5±2,20 36,5±2,20

Удельная активность АДГ, ЕУмг белка 540,50±32,4 540,50±32,4 540,50±32,4 540,50±32,4

Удельная активность АлДГ, Е/мг белка 32,3 6± ±1,98 32,36± ±1,98 32,36± ±1,98 32,36± ±1,98

Состав биомассы дрожжей, %: массовая доля белка массовая доля жира 42,0±2,50 11,6±0,70 50,8±3,05 9,5±0,60 75,3±4,50 3,4±0,25 75,3±4,50 3,4±0,25

Данные, представленные в табл. 15, свидетельствуют о том, что с увеличением массовой доли молочной сыворотки в питательной среде с 0 до 50% при неизменной активности АДГ и АлДГ процессы культивирования дрожжей (по сравнению с контролем) интенсифицировались: удельная скорость роста возросла в 1,4 раза, выход биомассы увеличился в 2,1 раза, накопление биомассы дрожжей увеличилось в 1,8 раза.

При увеличении массовой доли молочной сыворотки в питательной среде до 75% активизации процесса накопления дрожжевой биомассы не отмечалось. В связи с этим можно сделать вывод о том, что увеличение .массовой доли молочной сыворотки свыше 50% считаем нецелесообразным.

С целью установления влияния внесенной молочной сыворотки в питательную среду на продолжительность процесса культивирования проводили серию экспериментов при оптимальной температуре для выращивания дрожжей и концентрации молочной сыворотки 50%. В качестве контроля использовали питательную среду на основе мелассы при культивировании в течение 18 ч. В табл. 16 показана кинетика процесса культивирования дрожжей 8. сегеу1з1ае.

Установлено, что использование молочной сыворотки в качестве источника питательных веществ в среде для культивирования дрожжей позволяет достигнуть накопления биомассы в значительно больших количествах при прочих равных временных условиях.

Таблица 16

Кинетика процесса культивирования дрожжей 8. сегеу!51ае

Характеристика Контроль (18 ч) П родолжительность процесса, ч

12 14 16 18 20

Удельная скорость роста, ч"1 0,010± ±0,0007 0,013± ±0,0007 0,015± ±0,0008 0,016± ±0,0008 0,017± ±0,0009 0,017± ±0,0007

Выход биомассы, г/г 0,60± ±0,03 0,92± ±0,05 0,99± ±0,05 1,08± ±0,06 1,25± ±0,07 1,15± ±0,06

Накопление биомассы дрожжей, г/л 19,80± ±1,20 28,62± ±1,70 29,57± ±1,80 32,33± ±1,95 36,50± ±2,20 35,10± ±2,10

Удельная активность АДГ, Е/мг белка 540,5± ±32,40 540,5± ±32,40 540,5± ±32,40 540,5± ±32,40 540,5± ±32,40 510,5± ±28,40

Удельная активность АЛДГ, Е/мг белка 32,36± ±1,98 32,36± ±1,98 32,3 6± ±1,98 32,36± ±1,98 32,3 6± ±1,98 27,13± ±1,67

Состав биомассы дрожжей, %: массовая доля белка массовая доля жира 42,0±2,50 11,6±0,70 42,0±2,5 11,6±0,7 42,0±2,5 11,6±0,7 42,0±2,5 11,6±0,7 42,0±2,5 11,6±0,7 35,4±2,2 8,9±0,5

На рис. 7 представлена элюащм ЭМСпри ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе белкового раствора, характеризующая десорбцию ЭМС.

0340

12 3 4 3 6 7 8

Рис. 7. Профиль элюцин ЭМС на КМ-целюллозе

Выявлено, что подобранные условия позволили сорбировать на носитель положительно заряженные белки. Показано, что ЭМС вышла в пике несорби-рованных белков, что позволило значительно повысить каталитическую активность АДГ и АлДГ, а также удалить часть примесей белковой природы.

Далее для очистки ЭМС с помощью ионообменной хроматографии выбрали диэтиламиноэтил-целлюлозу (ДЭАЭ-целлюлоза). Применение ДЭАЭ-целлюлозы для очистки ЭМС имеет два преимущества: во-первых, полимерные цепи ионообменной целлюлозы сравнительно сильно разделены в пространст-

ве, поэтому даже очень крупные белки могут свободно диффундировать через ионообменную матрицу, взаимодействуя с заряженными группами; во-вторых, плотность распределения заряженных групп в ДЭАЭ-целлюлозе относительно невелика, следовательно, отдельные молекулы белка взаимодействуют в каждый момент времени лишь с одной или несколькими заряженными группами ионообменника. Это позволяет элюировать белково-ферментный комплекс в сравнительно мягких условиях. Концентрированные активные фракции ЭМС наносили на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную предварительно 0,020 М фосфатным буфером (рН 7,4), затем проводили элюацию сорбированной ЭМС №С1 в ступенчатом градиенте концентраций, в 0,020 М фосфатном буфере (рН 7,4) со скоростью 10,0 с.м3/ч.

На рнс. 8 показана ионообменная хроматограмма активных фракций ЭМС, полученная на колонках ДЭАЭ-целлюлозы.

Рис. 8. Ионообменная хроматограмма активных фракций этанолметаблнзирующего комплекса на колонке ДЭАЭ-целлюлозы

В результате анализа данных, представленных на рис. 8, можно сделать вывод о том, что каталитическая активность ЭМС зарегистрирована в двух пиках, вышедших при концентрации соли 0,4 М. Первый пик характеризуется каталитической активностью по отношению к этиловому спирту. В результате можно сделать вывод о том, что это АДГ. Измерение каталитической активности второго пика показало, что фракция представляет собой АлДГ. Активные фракции объединяли и проводили обессоливание методом диализа.

Электрофоретические исследования фракций (рис. 9) показали наличие двух полос, соответствующих по молекулярной массе АДГ и АлДГ. Результаты, представленные на рис. 9, свидетельствуют о гомогенности н чистоте полученной ЭМС.

П340

1 2 3 4 5 6 7 8 9 лшн

кДа 9/ 67,0

Рис. 9. Электрофореграмма 97,0 —► * очищенной ЭМС в полнакрнла-

мндном геле с додецидсульфа-ТОМ натрия: 1 - контроль; 2 - опытный образец этанолметаболнзирующей 45,0 -► ----- ■ - АЛДГ системы

Согласно литературным АДГ данным дрожжи 8. сегеу181ае

30,0 —► содержат в своем составе АДГ

и АлДГ, отличающиеся между собой аминокислотной после-20,0 —► ■ довательностью и специфично-

^ 2 етью. С целью идентификации

их в полученном растворе проводили секвенированне методом Эдмана. Результаты секвенирования фракций ЭМС представлены на рис. 10.

Ш !!1

т :: и и ш

Рис. 10. Результаты секвенирования фракций после ионообменной хроматографии: 1 - коммерческий фермент АДГ; 2 - коммерческий фермент АлДГ; 3 - полученный фермент АДГ; 4 - полученный фермент АлДГ

По результатам, приведенным на рис. 10, можно сделать вывод о том, что полученная белковая фракция содержит только два фермента АДГ и АлДГ, способных катаболизировать этиловый спирт и ацетальдегид.

Таким образом, изучены основные физико-химические и каталитические

свойства АДГ и АдДГ (табл. 17), входящих в состав ЭМС.

Таблица 17

_Свойства ЭМС, выделенной из 8. ссгсу151ас_

Показатель АДГ АлДГ

Оптимум рН среды 8,0-10,5 8,8-10,5

Оптимальная температура, °С 37±2 37±2

Термостабильность, °С Не более 45 Не более 50

Молекулярная масса, кДа 150,0±9,0 180,0±10,8

Изоэлектрическая точка 5,2±0,31 5,0±0,30

В качестве особого замечания отметим, что белковые молекулы АДГ и АЛДГ состоят из четырех доменов, поэтому результаты оценки молекулярной массы, полученные форезом и показанные в таблице, не совпадают. Расчеты выполнены с учетом данных, обнаруженных в литературе, которые свидетельствуют о четвертичной структуре молекулы белка АДГ и АлДГ.

Таким образом, в результате проведенных исследований подобрана оптимальная концентрация агарозы, при которой достигается высокая каталитическая активность ЭМС, при рН 2,0±0,2 и температуре 37±2"С.

Глава 7. Исследование закономерностей взаимодействия этилового спирта и продуктов его метаболизма с гармонизирующими ингредиентам» и белками молочного сырья. В настоящей главе приведены результаты исследований, показывающие особенности взаимодействия этилового спирта с гармонизирующими ингредиентами, в частности с ферментами, входящими в состав разработанной этанолокисляющей системы, а также казеинамн, сывороточными белкам1 и другими компонентами вторичного молочного сырья.

При выполнении исследований руководствовались температурой хранения, температурой взаимодействия исследуемых веществ в организме человека, а также возможным соотношением компонентов в напитках. С целью облегчения восприятия материала фотографии с электрофоретических камер и аминокислотный профиль опускали. В качестве результирующих критериев выбраны следующие параметры: массовые доли белкового и небелкового азота, молеку-лярно-массовое распределение, водосвязывающая и жироэмульгирующая способность. Контрольные значения параметров (до взаимодействия с этиловым спиртом и продуктами его метаболизма) приведены в диссертации.

На рис. 11 показаны хроматограммы спирта Альфа до и после ферменто-лиза (приведены наиболее характерные пики), в табл. 18 после соответствующей обработки приведена расшифровка результатов хроматографического анализа (фермент-субстратное соотношение 1:1, активность АДГ 4х 10 ЕУг).

Хроматограф» чсски» профиль спирта Альфа до и после ферментолиза показал, что исследуемый препарат АДГ специфичен к этиловому спирту (объемная доля снизилась в 20,3 раза) и изобутиловому спирту (на хроматограмме отсутствует пик этого вещества).

16 rnAU

¡Capel

2 3 4

ч—Г

3 4 5 6 7

9 10 И мин

124.3 mAU

Capel

1

10

11 мин

Рис. 11. Хроматограммы спирта Альфа до (а) п после (б) ферментолиза (продолжительность 1 мин): 1 - этиловый спирт; 2 - ацетальдегнд; 3 - нзоамнловый спирт; 4 - иэобугнло-вын спирт

Таблица 18

Результаты хроматографпческого анализа спиртов Альфа

Вещество Массовая доля, об%

до ферментолиза после ферментолиза

Этиловый спирт 96,2±0,01187 4,75±0,29

Ацетальдегнд 1,16±0,0601 0,92±0,0,5

Изоамиловый спирт 0,03±0,0002 0,02±0,0001

Изобутиловый спирт 0,01 ±0,0006 -

В препарате имеются примеси АлДГ (снижение концентрации отмечено на уровне 20,7%) и изоамнлдегцдрогеназы (снижение концентрации отмечено на уровне 33,3%). В целом полученные данные свидетельствуют о целесообразности использования АДГ в качестве гармонизирующего ингредиента в тех-НОЛОП1И напитков со специальными свойствами.

Первым продуктом распада этилового спирта является ацетапьдегид. Нами проведены необходимые эксперименты, которые позволяют судить о распаде ацетальдегида в условиях in vitro. На рис. 12 показаны хроматогра.ммы спирта Альфа до и после ферментолиза препаратом АлДГ, в табл. 19 приведена расшифровка результатов хроматографнческого анализа (фермент-субстратное соотношение 1:1, активность АлДГ 4><103 Е/г).

¡21.9 mAU

а

,Capel

2 4

89.5 mAU

10 II

12 М!Ш

Рне. 12. Хроматограммы спирта Альфа до (а) и после (б) ферментолиза (продолжительность I мин): 1 - этиловый спирт; 2 - ацстальдегпд; 3 - шоамиловый спирт; 4 - изобугпло-вый спирт

При выполнении исследований в пробу перед обработкой АлДГ дополнительно вносили 0,01±0,0006 изобутилового спирта.

Таблица 19

Результаты хроматографнческого анализа спиртов Альфа

Вещество Массовая доля, об%

до ферментолиза после ферментолиза

Этиловый спирт 4,75±0,29 -

Ацетальдегид 0,92±0,0,5 0,0102±0,0005

Изоамиловый спирт 0,02±0,001 0,0143±0,001

Изобутиловый спирт 0,01 ±0,0006 0,008±0,0005

Анализ профилей в соответствующих координатах тАи показал, что АлДГ характеризуется специфичностью как в отношении ацетальдегида, так и в отношении других веществ, находящихся в ферментируемой системе. Так, после окончания процесса не отмечается наличие этилового спирта, падение объемной концентрации ацетальдегида в 90,2 раза, нзоамилового и изобутилового спиртов в 1,4 и 1,25 раза. Эти результаты следует учитывать при проектировании рецептур гармонизирующих напитков.

При сопоставлении результатов биохимических изменений и физнко-химическнх анализов впервые доказано, что продукты биотрансформации этилового спирта способны оказывать ингибирующее действие на ферменты, содержащиеся в комплексных энзиматическнх препаратах. Спектр проведенных экспериментов позволил сформулировать направления использования мультн-ферментных препаратов. Убедительно показана целесообразность их использования в технологии гармонизирующих напитков.

Глава 8. Практическая реализация технологий гармонизирующих ингредиентов и напитков на основе молочного сырья. На основании анализа отечественных и зарубежных источников информации, а также результатов собственных исследований, которые приведены в экспериментальных главах настоящей диссертационной работы, теоретически обоснована и практикой научных исследований доказана возможность создания технологий гармонизирующих напитков, полученных из вторичного молочного сырья. Объединяющим принципом получения напитков является использование гармонизирующих ингредиентов, которые представляют собой ферментные препараты, обладающие детоксицирующими свойствами, коферменты и другие биологически активные вещества.

Разработаны, прошли промышленную апробацию и внедрены в производство технологии следующих ингредиентов и напитков: этанолметаболизи-рующий мультиферментный препарат (ТУ 9222-005-02068315-09), биологически активная добавка (заявка на выдачу патента №2008139159/13); способ получения иммобилизованного ферментного препарата (заявка на выдачу патента №2008150962/13); технологии гармонизирующих напитков; эмульсионный ликер «Флирт» (РЦ 10-146564-2000, ТИ 10-146564-00); тонизирующие напилен на молочной основе; напитки молочные тонизирующие (ТУ 9222-055-0268315-01);

напитки сывороточные тонизирующие (ТУ 9222-055-0268315-01); напитки кисломолочные тонизирующие (ТУ 9222-057-0268315-01); способ производства тонизирующих слабоалкогольных напитков на основе молочного белково-углеводного сырья (заявка на выдачу патента №2000128853/13); технология напитка с использованием активированных в роторно-пульсационном аппарате пивных дрожжей (ТИ 9184-065-02068315-02); тонизирующие сывороточные напитки (ТУ 9222-126-02068315-04); способ производства напитка «Валерия» из творожной сыворотки (заявка на выдачу патента №2008123647/13); напитки тонизирующие «Бодрячок» (ТУ 9222-006-02068315-09) и «Тоник-милк» (ТУ 9222-007-02068315-09); напитки с повышенным содержанием янтарной кислоты «Янтарный» (ТУ 9256-008-02055312-09), «Целебный» (ТУ 9256-00802055313-09), «Бодрящий» (ТУ 9256-008-02055314-09); гармонизирующие напитки (ТУ 9222-004-02068315-10).

Результаты работы прошли апробацию и внедрены в производство на предприятиях отрасли: Барнаульский молочный комбинат, Кемеровский молочный комбинат, Мариинский ликероводочный завод, Мастер-Мнлк, Новокемеровский пивобезалкогольный завод, Новокузнецкнй ликероводочный завод, Экспериментальный сыродельный завод и др.

ВЫВОДЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ

1. На основании анализа отечественной н зарубежной информации, а также многочисленных результатов собственных исследований разработана концепция создания технологий гармонизирующих ингредиентов, сущность которой заключается в модификации лактозосодержащих субстратов биотехнологической обработкой, биосинтезе целевых продуктов и придании разрабатываемой продукции гармонизирующих свойств, обеспечивающих новые функциональные характеристики. Раскрыты технологические параметры получения напитков, исследованы биотехнологнче-ские процессы, обеспечивающие формирование их органолептических, физико-химических и микробиологических показателей.

2. Изучены состав и свойства препаратов ß-галактозидаз различной природы. Показано, что минимальной активностью в отношении гидролиза лактозы на уровне 3,8+0,22 Е/мл характеризовался образец из дрожжей К. Lactis, у трансгенного образца Lac. lactis spb. lactis с геном дрожжей К. lactis аналогичный показатель составил 8,5 Е/мл, а у дрожжевого экстракта из К. lactis был на уровне 14,2+0,74 Е/мл. Установлены закономерности гвдролиза лактозы с использованием указанных биопрепаратов. Определены рациональные параметры проведения гидролиза лактозы. Показано, что в случае подбора рациональных условий технологического процесса минимальной степенью гидролиза лактозы характеризуются образцы, полученные с использованием экстракта из К. lactis.

3. Выполнено моделирование технологических параметров получения гармонизирующих напитков на основе сырья с гидролнзованной лактозой. Исследованы закономерности процесса сбраживания углеводов, показа-

но, что для достижения массовой доли этанола 3,5% целесообразно использование 1% дрожжевой закваски S, cerevisiae; 10% moho- и диеахаров и продолжительность брожения не менее 12 ч. Раскрыты закономерности активизации физиолого-биохимических свойств микрофлоры в условиях РПО. Рациональными параметрами выбраны величина зазора 0,3-0,4 мм, число оборотов 2000-3000 мин"', соотношение дрожжи/среда 1:1, продолжительность обработки 1-2 мин.

4. Изучены физиолого-биохимические свойства микроорганизмов для получения янтарной кислоты в лактозосодержащих субстратах с последующим ее использованием в качестве гармонизирующего ингредиента в технологии напитков. Произведен подбор микроорганизмов для ферментации молочного сырья, изучены технологические свойства культур микроорганизмов и особенности их культивирования. Доказана целесообразность использования комплексных заквасок, состоящих из консорциума микроорганизмов, обязательной составляющей которых является Man. succiniciproducens. Установлен состав и количество закваски для производства напитков. Из анализа совокупности результатов экспериментальных данных, связанных с уточнением видового и количественного состава микрофлоры закваски, следует: качественный состав закваски составляют культуры Str. termophilus и Man. succiniciproducens в количественном соотношении 1:2 н дозой 5±0,01% и Str. lactis и Man. succiniciproducens в количественном соотношении 1:1 и дозой 3±0,01%. Проведенные исследования позволяют заключить, что ферментацию сыворотки, обезжиренного молока и пахты под действием молочнокислых микроорганизмов следует осуществлять при значении температуры 38±2°С и 42±2°С, соответственно.

5. Изучены закономерности процесса культивирования дрожжей S. cerevisiae на молочной сыворотке в связи с получением ЭМС, определены рациональные условия культивирования дрожжей: концентрация молочной сыворотки 50%, температура 36±2°С, рН 4,5-5,0 и продолжительность не менее 18±0,5 ч. Разработана технология выделения и очистки ЭМС из дрожжей S. cerevisiae. Рациональными параметрами очистки от балластных соединений являются рН 8,0-9,5, мембрана УПМ-67, для очистки от контаминирующей микрофлоры целесообразно использовать мембраны «Millipore» с диаметром пор 0,22 мкм. Подобраны условия проведения ионообменной хроматографии на колонке с КМ-целлюлозой и ДЭАЭ-целлюлозой.

6. Изучены физико-химические свойства ферментов АДГ и АлДГ, входящих в состав ЭМС. Молекулярная масса фермента АДГ составила 150 кДа, изоэлектрическая точка 5,2, оптимальная температура 37±2°С, рН 7,5-10,0, каталитическая активность АДГ 1293,0 Е/мг белка; молекулярная масса фермента АлДГ составила 180 кДа; изоэлектрическая точка 5,0; оптимальная температура 37±2°С, рН 8,8-10,5; каталитическая активность 92,5 Е/мг белка. Обоснованы направления использования АДГ и АлДГ в технологии гармонизирующих напитков. Для по-

вышения активности в рецептуры дополнительно вносили НАДФ в окисленной или восстановленной форме, показана целесообразность иммобилизации препаратов на полимерной матрице, состоящей из ага-розы.

7. Исследованы закономерности взаимодействия этилового спирта и продуктов его метаболизма с гармонизирующими ингредиентами и белками лактозосодержащего сырья. Показано, что продукты биогрансформацин этилового спирта способны оказывать ингибирующее действие на ферменты, содержащиеся в комплексных энзиматпческнх препаратах. Сформулированы направления использования гармонизирующих мультифер-ментных препаратов, обоснована возможность управления их составом и свойствами путем дополнительной очистки на мембранах.

8. Сформулированы принципы актуализации ассортимента гармонизирующих напитков, заключающиеся в расширении спектра используемых ингредиентов, сырьевой базы для производства напитков, видов используемой заквасочной микрофлоры со специально отобранными свойствами, а также ферментных препаратов, способных целевым образом трансформировать лактозосодержащие субстраты. Разработана схема классификации новых видов продукции, основу которой составляют технологические уровни, определяющие многообразие свойств и характеристик гармонизирующих напитков, а также учитываются закономерности и принципы формирования их качества, физико-химические свойства ингредиентов, их функции в организме человека; намечены направления дальнейшего совершенствования ассортимента и технологии гармонизирующих напитков.

9. Теоретически обоснованы и экспериментально установлены технологические принципы выработки гармонизирующих молочных напитков, которые состоят в подготовке молочного сырья, пастеризации, ферментации ß-галактозидазами (при необходимости) или микрофлорой, накопления или внесения гармонизирующих ингредиентов, охлаждения, созревания. Созданы оригинальные технические решения, новизна которых подтверждена положительными решениями и патентами РФ. Большинство из них использовано при разработке технической документации на новые виды продукции, которые внедрены на предприятиях отрасли в гг. Барнаул, Кемерово, Маршшск, Новокузнецк и др.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы: Монографии

1. Крупнн, A.B. Теория и практика создания продуктов специального назначения/ A.B. Крупнн, С.Г. Козлов,- Издательское объединение «Российские университеты» -«Кузбассвуппдат - ACTULI».- Москва - Кемерово, 2006.- 144 с.

2. Крупнн, A.B. Биотехнологии гармонизирующих ингредиентов и напитков на основе вторичного молочного сырья.- Кемерово: КемТИПП, 2009.-259 с.

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК

3. Крупиц, A.B. Молочные напитки со спиртовыми морсами / A.B. Крупик, С.Г.Козлов// Молочная промышленность.-2003.- №5.- С. 42-43.

4. Изучение основных парамешэв гидролиза лактозы ферментными препаратами / А.В.Круппн, И.С. Разумникова, О.В. Козлова, Л.С. Солдатова// Достижения гаукн и техники АПК.- 2009,- №5,- С. 68-69.

5. Крупнн, A.B. Гармонизирующие налитки на основе молочного сырья / A.B.Крупин, С.А. Сухих //Пиво и напнпси.- 2009,- №5,- С. 22-23.

6. Крупнн, A.B. Влияние этилового спирта на белковые компоненты молочной сыворотки//Достижения науки и техники АПК,- 2009,- №6.- С. 71-72.

7. Крупнн, A.B. Физико-химические принципы гелеобразования при производстве напитков / A.B. Крупнн, М.В. Баканов, С.А. Равнюшкин // Пиво и напитки,- 2009.-К«6,- С. 44-46.

8. Крупнн, A.B. Разработка технологии производства напитков вторичного молочного сырья / A.B. Крупнн, Л.А. Остроумов, U.C. Разумникова II Достижения науки н техники АПК,- 2009.- №7,- С. 64-65.

9. Крупин, A.B. Стабилизаторы в продуктах специального назначения / A.B. Крупнн, C.Ä. Равнюшкин, О.В. Козлова // Молочная промышленность,- 2009.- №8.- С. 5960.

10. Крупин, A.B. Влияние продуктов пиролиза на активность ферментных систем микроорганизмов // Достижения науки и техники АПК.- 2009.- №8,- С. 66-68.

11. Крупин, A.B. Получение н очистка этанолметаболизнруюшего мультифермент-пого препарата устраняющего токсическое действие алкоголя / A.B. Крупин, С.А. Сухих // Достижения науки и техники АПК.- 2009.- №9,- С. 67-68.

12. Крупин, A.B. Тонизирующие напитки с ферментными препаратами // Молочная промышленность,- 2009,- .N»10.- С. 59-60.

13. Крупин, A.B. Генетически модифицированные микроорганизмы в продуктах питания / A.B. Крупин, С.А. Равнюшкин, К.Е. Киреева // Молочная промышленность,- 2009.- Л»11.- С. 74-75.

Научные труды институтов

14. Остроумов, Л.А. Технология активации дрожжей с использованием молочной сыворотки / С.Г. Козлов, A.B. Крупнн, Л.А. Остроумов И Проблемы питания и рациональное использование сырьевых ресурсов: Сборник научных работ.- Кемерово, 2002.- Выпуск5,-С. 18-20.

15. Крупин, A.B. Разработка бнотехнологических основ производства гармонизирующих компонентов нового поколения // Стратегия развития PK в XXI веке: Сборник научных работ.- Алматы, 2003,- С. 45-48.

16. Крупин, A.B. Биотехнология продуктов на основе сыворотки; Кемеровский технологический институт пищевой промышленности, Кемерово, 2004,- 5 е.- Деп. в ВИНИТИ 23.08.2004,- №1075,- В2004.

17. Крупин, A.B. Разработка технологии производства гелеобразных продуктов // В кн. «Техника и технология пищевых продуктов»: Сборник научных работ,- Кемерово: КемТИПП, 2006,-С. 76-83.

18. Крупнн, A.B. Разработка технологии производства гелеобразных продуктов / A.B. Крупин, Л.А. Остроумов // В кн. «Техника и технология пищевых продуктов»: Сборник научных работ,- Кемерово: КемТИПП, 2006,- С. 83-88.

19. Киреева, К.Е. Технология молочных продуктов повышенной пишевой ценности без генетически-модифицнрованных источников / К.Е Киреева, A.B. Крупин // Продукты питания и рациональное использование сырьевых ресурсов: Сборник научных работ.- Кемерово, 2009.-Выпуск 18.-С. 52-56.

20. Киреева, К.Е. Микроорганизмы с новыми свойствами для решения задач биотехнологии / К.Е. Киреева, A.B. Крупнн // Продукты питания н рациональное использование сырьевых ресурсов: Сборник научных работ,- Кемерово, 2009- Выпуск 18,-С.56-57.

21. Леоненко, Ю.В. Фракционный состав белков сухой подсырной сыворотки / Ю.В. Леоненко, A.B. Крупнн // Продукты питания и рациональное использование сырьевых ресурсов: Сборник научных работ,- Кемерово, 2009,- Выпуск 18.-С.67-68.

22. Шония, Г.В. Анализ распределения сырья для выработки молочных продуктов / Г.В. Шония, A.A. Байбикова, A.B. Крупин // Продукты питания и рациональное использование сырьевых ресурсов: Сборник научных работ.- Кемерово, 2009.- Выпуск 18 - С. 151-152.

23. Крупин A.B. Анализ влияния технологических факторов на закономерности гидролиза лактозы в связи с производством напитков // Техника и технология пищевых протводств: Сборник научных трудов КемТИПП,-№2.- Кемерово, 2009.- С. 8487.

24. Крупиц A.B. Физико-химические процессы при гел со б разов шиш молочной сыворотки // Техника и технология шпцевых производств.- 2009.- №.3- Кемерово, 2009,-С. 79-82.

25. Крупин A.B. Анализ влияния пектина на закономерности гидролиза лактозы в связи с производством напитков // Техника н технология пищевых производств.-2009,- Л2.3- Кемерово, 2009,- С. 90-93.

26. Крупин A.B. Анализ закономерностей старения гелеобразных компонентов в связи с производством из них напитков // Техника и технология пищевых производств.- №4,- Кемерово, 2009- С. 19-22.

27. Крупин A.B. Анализ изменений физико-химических показателей молока при пиролизе лактозы // Техника и технология пищевых прошводств: Сборник научных трудов КемТИПП,- ЛЫ.- Кемерово, 2009,- С. 74-77.

28. Остроумов, JI.A. Разработка технологии тонизирующих молочных напитков И Техника и технология пищевых производств,- ЛаЗ.- Кемерово, 2009,- С. 3-6.

29. Крупин, A.B. Особенности влияния этилового спирта и его метаболитов на белки молока / A.B. Крупин, Л.А. Остроумов // Актуальные проблемы техники и технологии переработки молока: Сборник научных трудов с международным участием.-Барнаул, 2009.-С. 149-153.

30. Крупин, A.B. Зависимость физико-химических свойств гелей на основе молочной сыворотки от условии гелеооразовання / A.B. Крупин, Л.А. Остроумов // Актуальные проблемы техники и технологии переработки молока: Сборник научных трудов с международным участием.-Барнаул, 2009,-С. 153-155.

31. Крупин, A.B. Основные закономерности управления процессом гелеобразования в дисперсных системах на основе молочной сыворотки / A.B. Крупин, Л.А. Остроумов // Актуальные проблемы техники и технологии переработки молока: Сборник-научных трудов с международным участием.-Барнаул, 2009.- С. 158-160.

32. Разумникова, U.C. Изучение фнзиолого-бнохнмическнх свойств микроорганизмов в связи с биосинтезом янтарной кислоты / И.С. Разумникова, А.В.Крушш // Продукты питания и рациональное использование сырьевых ресурсов: Сборник научных работ,- Кемерово, 2009,- Выпуск 19.-С. 107-109.

33. Разумникова, И.С. Биосинтез янтарной кислоты микроорганизмами / И.С. Разумникова, A.B. Крупин // Продукты питания и рациональное использование сырьевых ресурсов: Сборник научных работ.- Кемерово, 2009.- Выпуск 19.- С. 105-106.

34. Крупин, A.B. Механизм сорбции воды на белковых молекулах / A.B. Крупин, С.Е. Димитриева, С.Г. Козлов // Научное обеспечение молочной промышленности (ВШ1МИ - 80 лет): Сборник научных трудов,- М.: ГНУ ВНИМИ, 2009,- С. 197-205.

35. Крупин, A.B. Ферментация в технологии продуктов специального назначения / A.B. Крутшн, С.Е. Димитриева II Научное обеспечение молочной промышленности (ВНИМИ - 80 лет): Сборник научных трудов,- М.: ГНУ ВНИМИ, 2009,- С. 206-214.

¿Материалы симпозиумов, конгрессов, конференций

36. Крупин, A.B. О возможности использования молочного белково-углеводного сырья в производстве тонизирующих слабоалкогольных напитков // Продовольственный рынок и проблемы здорового питания,- Орел, 2000.-С. 111-114.

37. Крупин, A.B. Перспективные направления производства тонизирующих напитков на молочной основе // Новые технологии в научных исследованиях и образовании: Материалы Всероссийской научно-практической конференции,- Юрга, 2001,- С. 17-20.

38. Козлов С.Г. Пищевая и биологическая ценность продуктов на молочной и зерновой основе / С.Г. Козлов, A.B. Крупин // Достижения науки и практики в деятельности образовательных учреждений: Материалы Всероссийской научно-практической

конференции.- Кемерово, 2003.-С. 14.

39. Козлов С. Г. Функциональный продукт с гадролизованной лактозой / С.Г. Козлов, И.И. Муругова, А.В.Крупин // Технологические и экономические аспекты обеспечения качества продукции и услуг в торговле и общественном питании: Материалы Всероссийского конгресса - Кемерово, 2003,-С. 24-25.

40. Остроумов Л.А. Новые подходы к проектированию комбинированных молочных продуктов / A.B. Крулик, Л.А. Остроумов, С.Г. Козлов II Пища в современном мире: Труды Ш Международной научно-практической конференции,- Новосибирск, 2007.-С. 44-52.

41. Козлов С.Г. Использование растительного сырья при выработке молочных продуктов / С.Г. Козлов, Л.А. Остроумов, A.B. Крупин // Перспективы производства продуктов питания в условиях глобализации: Сборник материалов международной научно-практической конференции.- Омск, 2008.- С. 25-27.

42. Сухих, С.А. Выделение и очистка ферментных препаратов в пищевой промышленности / С.С. Сухих, A.B. Крупин // Пищевые продукты п здоровье человека: Сборник тезисов докладов И Всероссийской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых.- Часть 1,-Кемерово.- 2009.-С. 54-55.

43. Разумникова, И.С. Генетическая модификация для улучшения характеристик штаммов бактерий / И.С. Разумникова, A.B. Крупин // Пищевые продукты и здоровье человека: Сборник тезисов докладов II Всероссийской конференции студентов, аспирантов« молодых ученых,- Часть2,-Кемерово,- 2009.-С. 165-166.

44. Леоненко, Ю.В. Влияние сухой подсырной сыворотки на качество молочных продуктов // Ю.В. Леоненко, A.B. Крупин, Л.С. Солдатова: Новые идеи п решения молодых исследователей в развитии АПК: Наука и молодежь: новые идеи и решения Материалы Ш Международной научно-практической конференции (г. Волгоград, 1315 мая 2009 г).-Волгоград, 2009.-С. 342-344.

45. Крупин, A.B. Спиртосодержащие напитки, получаемые при переработке молочного сырья // Молодежная наука - пищевой промышленности России: Материалы I Всероссийской студенческой научной конференции,- Ставрополь: СевКавГТУ, 2009.-С. 78-80.

46. Крупин, A.B. Коагуляция белков молока этиловым спиртом // Окружающая среда и здоровье: Сборник статен VI научно-практической конференции, посвященной 50-летию Пензенской государственной технологической академии,- Пенза, 2009,- С. 172-175.

47. Крупии, A.B. Влияние этилового спирта на кислотное свертывание молока // Разработка н широкая реализация современных технологий производства, переработки н создания пищевых продуктов: Сборник материалов Международной научно-практической конференции (24-26 июня 2009 г). - Волгоград, 2009,- С. 309-311.

48. Крупин, A.B. Получение иммобилизованных ферментов дня молочной промышленности / А.В.Крушш, Л.С. Солдатова // Инновационные технологии в пищевой промышленности: Сборник тезисов докладов Всероссийской конференции с международным участием: Самара, 2009,- С. 15-18.

49. Крупин, A.B. Влияние дрожжей Saccharomyces cerevisiae на процесс сбраживания углеводов пгдролпзованной молочной сыворотки // Инновационные технологии в пищевой промышленности: материалы Всероссийской конференции с международной участием,- Самара, 2009,- С. 107-110.

50. Крутит, A.B. Технология получегпгя антипохмельного напитка // Инновационные технологии в пищевой промышленности: Сборник тезисов докладов Всероссийской конференции с международггьтм участием: Самара, 2009.- С. 110-113.

51. Крупин A.B. Активация дрожжевых клеток при получении тонизирующих напитков 1 A.B. Крупин, С.Г. Козлов // Пищевая промышленность: состояние, проблемы, перспективы: Материалы Международной научно-практической конференции.-Оренбург, 2009,- С. 187-189.

52. Остроумов Л.А. Изменение физико-химических показателен при ферментации молочной сыворотки / Л.А. Остроумов, A.B. Крупин, К.Е. Киреева // Пищевая промышленность: состояние, проблемы, перспективы: Материалы Международной научно-практической конференции,-Оренбург, 2009,- С. 220-223.

53. Крупин, A.B. Влияние этилового сптта на кислотное свертывание молока // Пищевая промышленность: состояние, проблемы, перспективы: Материалы Международной наушо-практической конференции,- Оренбург, 2009,- С. 309-311.

54. Крупин, A.B. Основные закономерности управления процессом гелеобразовання в молочной сыворотке в связи с созданием сывороточных продуктов функционального назначения / A.B. Крупиц, JI.A. Остроумов // Инновационный путь развития экономики России: власть, регионы, наука, отнес: Материалы 1 научно-практической конференции (Кемерово, 19-22 мая 2009 г.).-С. 44-46.

55. Крупиц, A.B. Основные закономерности старения сывороточных гелей в связи с созданием продуктов функционального назначения // Управление инновационным развитием современных социально-экономических систем: Сборник статен Всероссийской тучно-практической конференции.- Волгоград.- С. 215-219.

56. Крупиц, A.B. Изучение основных параметров пиролиза лактозы в молочной сыворотке в связи с разработкой технологий функциональных продуктов / A.B. Крупиц, К.Е. Кнреева // Управление инновационным развитием современных социально-экономических систем: Сборник статей Всероссийской научно-практической конференции.-Волгоград,- С.219-223.

57. Крупин, A.B. Влияние условий гелеобразовання молочной сыворотки на свойства полученных гелей // Пнновацнонные технологии и оборудование для пищевой промышленности (приоритеты развития): материалы 111 Международной научно-технической конференции.- Воронеж, 2009,- С. 428-431.

58. Крупин, A.B. Технологические параметры гидролиза лактозы в молочной сыворотке с целью создания продуктов функционального назначения / A.B. Крупин, Л.С. Солдатова // Теория и практика инновационной стратегии региона: Международный межвузовский сборник научных трудов,- Кемерово, 2009,- Выпуск 5,-С. 261-266.

59. Крупин, A.B. Основные аспекты взаимодействия обезжиренного молока с этиловым спиртом в связи с производством напитков на основе молочных компонентов (/ A.B. Крупин, Л.С. Солдатова // Теория и практика инновационной стратегии региона: Международный межвузовский сборник научных трудов,- Кемерово, 2009.- Выпуск 5.-С. 261-266.

60. Крупин, A.B. Физический способ активации дрожжевых клеток в технологии ферментированных напитков // Актуальные проблемы производства продуктов питания в условиях глобализации экономики: Материалы Международной конференции (15-16 октября).- Семипалатинский государственный университете им. Шакарима: Семен, 2009,- С. 88-89.

61. Крупин, A.B. Влияние продуктов трансгликознлировання на активность ферментных систем микроорганизмов в сыворотке с гидролизованной лактозой // Актуальные проблемы производства продуктов питания в условиях глобализации экономики: Материалы Международной конференции (15-16 октября).- Семипалатинский государственный университете им. Шакарима: Семей, 2009,- С. 89-90.

62. Основные закономерности формирования гндратных слоев в продуктах на основе молочной сыворотки / A.B. Крушш, С.Г. Козлов, Л.С. Солдатова, АЛО. Просеков // Чистая вода: Сборник научных работ международной конференции.- Кемерово, 2009.-С. 471-475.

63. Крупин, A.B. Технологическая схема производства тонизирующих напнтков на молочной основе // Инновационный потенциал молодых ученых в развитии АПК Сибири: Сборник научных трудов VII региональной научно-практической конференция молодых ученых и специалистов СФО. Новосибирск.- С. 143-144.

64. Крупин, A.B. Теоретическое обоснование взаимодействия белковых компонентов молока с этиловым спиртом // Вклад молодых ученых в развитие инновационной аграрной науки: Тезисы докладов Международной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов.- Москва, 2009,- 78-83.

65. Крупин, A.B. Некоторые закономерности биотрансформацни белков молока под влиянием этилового спирта / A.B. Крушш, Л.А. Остроумов // Инновационные подходы в производстве, переработке и хранении продукции сельского хозяйства: Сборник научных статей Международной научно-практической конференции.- Астана, 2009.-С. 45-48.

66. Крушш, A.B. Основные аспекты взаимодействия этанола и его метаболитов с компонентами молочного сырья / A.B. Крупин, Л.А. Остроумов // Инновационные подходы в производстве, переработке и хранен ни продукции сельского хозяйства: Сборник научных статей Международной научно-практической конференции.- Астана, 2009,-С. 234-237.

67. Крушш, A.B. Оптимальные параметры процесса сбраживания углеводов гидро-

лизованноп молочной сыворотки в связи с созданием ферментированных напитков / A.B. Крупнн, Л.А. Остроумов // Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты: Материалы VIII Международной научно-практической конференции,- М.: МГУПП,- С. 257-261.

68. Крупин, A.B. Особенности активизации фтиолого-биохимнческих свойств микрофлоры в технологии ферментированных напитков / A.B. Крупнн, Л.А. Остроумов //Инновационные технологии в области качества и безопасности пищевых продуктов: Сборник научных работ Первой научно-практической конференции молодых ученых.- М.: МГУПП,- С. 75-80.

Патенты РФ

69. Способ производства тонизирующих слабоалкогольных напитков на основе молочного белково-углеводного сырья / Л.А. Остроумов, C.B. Жуков, Л.И. Вождаева, М.Ю. Литвинова, A.B. Крупнн; заявитель и патентообладатель Кемеровский технол. ин-тпшц. пром-ти. 200128853/13.заявл. 17.11.2000.

70. Способ производства напитка «Валерия» из творожной сыворотки / Л.А. Остроумов, С.М. Лупинская, Е.В. Байматова, A.B. Крупнн; заявитель и патентообладатель Кемеровский технол. нн-т пищ. пром-ти. №2008123647/13; заявл. 02.06.08. Положительное решение о выдача патента от 1)1.07.2009.

71. Биологически активная добавка тонизирующего действия / А.Ю. Просеков, С.А. Сухих, A.B. Крупнн; заявитель и патентообладатель Кемеровский технол. нн-т пищ. пром-ш. №2008*139159/13; заявл. 01.10.2008.

72. Способ получения иммобилизованного ферментного препарата / А.Ю. Просеков, U.C. Разумникова, С.А. Равнюшкип, Л.А. Остроумов, О.О. Бабич, С.А. Сухих, A.B.Kpvniin; заявитель и патентообладатель Кемеровский технол. ин-т пищ. пром-ти. 200815Ö962/13 приоритет от 22.12.2008.

73. Способ производства мультнферментного препарата / A.B. Крупнн, О.О. Бабич, С.А. Сухих, А.Ю. Просеков, Е.В. Короткая К» 2009133995 от 10.09.09

74. Способ производства ферментированного напитка / А.Ю. Просеков, И.С. Разумникова, A.B. Крупнн, Е.В. Короткая. Отправлен 06.09.09 №2009134620/13 от 15.09.09.

Подписано в печать 28.12.2009. Формат 60х90""\ Тираж 120 экз. Объем п.л. 2,5. Заказ №129. Кемеровский технологический институт пищевой промышленности, 650056, г. Кемерово, б-р Строителей, 47. Отпечатано в рсдакционно-издательском центре Кемеровского технологического института пищевой промышленности, г. Ксмсрово-10, ул. Красноармейская, 52

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР.

1.1. Перспективы использования вторичного молочного сырья в производстве ферментированных напитков.

1.2. Ассортимент и направления совершенствования технологии алкогольных напитков на основе молочного сырья.

1.3. Характеристика состава и свойств основных ферментов, участвующих в технологии изготовления напитков.

1.3.1. p-D-галактозидаза.

1.3.2. Алкогольдегидрогеназа.

1.3.3. Альдегиддегидрогеназа.

1.4. Роль АДГ и АЛДГ в метаболизме алкоголя живого организма.

1.5. Биохимические аспекты производства янтарной кислоты и ее применение в отраслях народного хозяйства.

1.6. Обоснование направлений собственных исследований, их цель и задачи.

Глава 2. ОРГАНИЗАЦИЯ, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Организация и схема эксперимента.

2.2. Объекты исследований.

2.3. Методы исследований.

Глава 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ МОДИФИКАЦИИ СУБСТРАТОВ ЛАКТОЗОСОДЕРЖАЩЕГО СЫРЬЯ ПУТЕМ ГИДРОЛИЗА ЛАКТОЗЫ ПРЕПАРАТАМИ р-ГАЛАКТОЗИДАЗ РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ.

3.1. Исследование состава и свойств Р-галактозидазных препаратов.

3.2. Анализ влияния технологических факторов на закономерности гидролиза лактозы.

3.3. Исследование изменения физико-химических показателей молока при гидролизе лактозы.

3.4. Изучение взаимосвязи продуктов трансгликозилирования с активностью микроорганизмов в молоке с гидролизованной лактозой.

По прогнозам экспертов, население планеты уже в ближайшем будущем достигнет 8-10 млрд. человек. В связи с этим производство продукции сельского хозяйства в дальнейшем будет все более отставать от темпов роста населения планеты. Поэтому внимание специалистов привлекают новые способы создания продуктов питания, которые позволяют обеспечить сохранение и укрепление здоровья населения, способны осуществлять профилактику заболеваний, обусловленных отклонениями от норм здорового питания. Особую значимость приобретают исследования по интенсификации производства и увеличению объемов производимого продовольствия, а также расширению ассортимента вырабатываемых продуктов.

Важнейшее место в обеспечении рационального питания отводится молочной промышленности, поскольку молоко и молочные продукты, являясь продуктами повседневного потребления всех возрастных групп, занимают одно' из ведущих мест в рационе человека. Молочные продукты, благодаря своему составу, характеризуются высокой пищевой ценностью, легкой усвояемостью, а также возможностью проектирования требуемых показателей с учетом современных принципов физиологии питания [273].

Несмотря на успехи, достигнутые в технологии молочных продуктов, а также в области обеспечения их качества, до сих пор в полной мере не решена проблема переработки обезжиренного молока, пахты и молочной сыворотки, и часть этого молочного сырья расходуется нерационально [50, 359]. Между тем обезжиренное молоко, пахта и молочная- сыворотка являются ценным белково-углеводным сырьем. Содержащиеся в нем белки по своему составу относятся к наиболее важным белкам животного происхождения, являясь источником незаменимых аминокислот [246].

Полезным компонентом этого сырья является лактоза. Она представляет собой уникальный углевод, который кроме молока не встречается в природе нигде [361]. Кроме того, молочная сыворотка, пахта и обезжиренное молоко характеризуются богатым минеральным составом, а также содержат широкий спектр минеральных элементов и витаминов [106].

Среди пищевых продуктов особое место занимают напитки, содержащие этиловый спирт. По разным оценкам в структуре этих напитков около 60% приходится на долю крепкого алкоголя, 25% на долю пива, 11% на долю вина и шампанского. В их ассортименте превалируют крепкие напитки, которые потребляются в существенно больших количествах. В то же время отмечается тенденция снижения спроса на водку и увеличение доли потребления слабоалкогольных напитков (главным образом пива и значительно в меньших количествах вина, коктейлей, газированных напитков) [147, 148, 196].

На сегодняшний день накоплены убедительные данные о губительном воздействии чрезмерного потребления алкогольных напитков на продолжительность жизни населения, его смертность, работоспособность, социально-культурное поведение. Выход из создавшегося положения специалисты видят в разработке последовательного осуществления научно обоснованной и реально экономически обеспеченной, четко сбалансированной государственной алкогольной политики, учитывающей условия жизни народа, а также его опыт, культурные традиции и обычаи [197].

Известно, что производство и употребление алкоголя имеют глубокую историю и широко распространены во многих культурах человеческой цивилизации. Во многих социумах употребление алкогольных напитков является важной частью определенных событий семейного и общественного плана. Уровень потребления алкоголя в России в пересчете на чистый этанол составляет 15-18 литров в год на человека, что превышает средние европейские показатели примерно на 50%.

Этанол в силу своих химических свойств и особенностей биотрансформации оказывает токсическое и наркотическое воздействие на живой организм. Одним из наиболее важных и загадочных последствий потребления алкоголя является абстинентный алкогольный синдром, признаками которого являются головная боль, озноб, сухость во рту, тошнота, рвота, отсутствие аппетита, дрожание рук, депрессия и общее чувство нездоровья. Такое состояние длится обычно не более суток, но может продолжаться и дольше. При этом наблюдаются многочисленные изменения в балансе гормонов, медиаторов и других биологических веществ в живом организме. Также это приводит к учащению пульса и повышенной нагрузке на сердце, что может вызвать инсульт или сердечный приступ. Существенно, что человек, злоупотребляющий алкогольными напитками, не ощущает потребности в пище, а для купирования недугов, связанных с интоксикацией, организму требуется новая порция этилового спирта, возникает алкогольная зависимость [394, 396].

Негативные последствия потребления этилового спирта связаны с накоплением высокой концентрации высокотоксичного вещества - аце-тальдегида. Токсическое и наркотическое действие уменьшается по мере его окисления. Основным местом метаболической трансформации этанола является печень и эпителий желудка. Метаболическое окисление алкоголя происходит с участием мультиферментной системы, состоящей из двух энзимов: цитозольной алкогольдегидрогеназы (АДГ) и митохондриальной ацетальдегидрогеназы (АЛДГ). Скорость катаболизма алкоголя и альдегида уксусной кислоты различна у каждого человека и определяется генетическим фактором. Низкая каталитическая активность этанолметаболизи-рующей системы обусловлена мутацией в гене АЛДГ2, вызвавшей в свою очередь замену некоторых остатков глутаминовой кислоты в молекуле АЛДГ на фрагменты лизина. Носителями мутантных генов, являются 6575% людей с европейским генотипом. У людей с такими мутациями нук-леотидных последовательностей после потребления спиртного отмечается очень высокое содержание альдегида уксусной кислоты, который, выводится из организма более 1,0 суток [289].

В нашей стране продукты питания м препараты, направленные на снижение токсического действия- этанола и продуктов его метаболизма (аце-тальдегида) на живой организм, в достаточном количестве и ассортименте не производятся. В связи с этим создание конкурентоспособных отечественных гармонизирующих ингредиентов, предназначенных для связывания и выведения токсических продуктов метаболизма этилового спирта из организма, является актуальным и практически важным [395].

Другим, важным направлением можно считать исследования британского профессора Дэвида Harra (David Nutt). Он полагает, что можно изменить состав алкогольных напитков таким образом, что похмелья не будет: «. .нет никакой научной причины, по которой это не может быть теперь сделано». По его словам, алкоголь воздействует на мозг, главным образом опираясь на сигнальные молекулы - рецепторы GAB А-А. У этих молекул имеется множество подтипов, и не все они связаны с определёнными эффектами алкоголя. Но, например, потеря памяти может произойти из-за того, что алкоголь в гиппокампе связывается с подтипом рецептора а-5. Если в составе алкогольных напитков, будут молекулы, не соединяющиеся с данным подтипом рецепторов (антагонисты), зато соединяющиеся с «хорошими» подтипами, то с памятью проблем не будет.

Точно так же и с другими побочными эффектами. Даже такая проблема, как цирроз печени, может быть устранена. Некоторые такие молекулы уже существуют: бретазенил и пагоклон. Они были созданы как успокоительные препараты. К тому же существует препарат, который позволяет мгновенно «выключить» эти препараты, - флумазенил, применяемый как антидот при передозировке успокоительных. Натт полагает, что фармакологи могут подобрать смесь молекул, которые при приёме вызовут радостные эффекты алкоголя,- особенно расслабление и общительность, без агрессии, тошноты, потери*координации и амнезии [181-183, 341].

В дополнение к перечисленным особенностям снижения похмельного синдрома существует традиционно вырабатываемая группа молочных продуктов, содержащих небольшое количество этилового спирта. К продуктам с молочнокислым и спиртовым брожением относятся кефир, кумыс и другие. Содержание алкоголя в них может достигать 2-3%. Имеются технологии по получению содержащих спирт продуктов из молочной сыворотки. Однако по ряду причин они не нашли широкого применения в промышленности. Весьма существенно, что помимо алкоголя в таких напитках накапливаются ценные метаболиты, которые в значительной степени стимулируют обменные процессы в организме и облегчают похмельный синдром. Как отмечается в литературе, к таким компонентам относятся гармонизирующие ингредиенты, а именно ферментные препараты, обладающие детоксицирующими свойствами, а также коферменты, в роли которых часто выступают витамины, такие как, например, янтарная кислота.

До настоящего времени требования к гармонизирующим напиткам были весьма неясными. Условно к ним можно отнести напитки по ГОСТ

52844-2007, который разработан рабочей группой Некоммерческой организации «Национальный фонд защиты потребителей» при участии НИИ питания РАМН, ГУ ВНИИ ПБ и ВП РАСХН, ООО «ХЭППИЛЭНД», ООО «Браво-Премиум». Согласно'этому документу в составе безалкогольных напитков должно присутствовать не более двух тонизирующих компонентов (на выбор: кофеин, мате, женьшень, гуарана, элеутерококк). Для кофеина установлено отдельное требование: его содержание должно быть в о пределах 0,151-0,4 мг/см . Кроме того, содержание витаминов не должно превышать допустимых уровней суточного потребления. При изготовлении напитков внимание должно уделяться и калорийности продукта, что определяется количеством сухих веществ (не менее 10%).

Что касается слабоалкогольных тонизирующих напитков (ГОСТ

52845-2007), то требования к ним почти такие же. Отдельно оговорено содержание этилового спирта (от 1,2 до 9%) и Сахаров (не менее 10%). В напитки разрешено добавлять только один тонизирующий компонент, так как алкоголь сам по себе обладает сильным возбуждающим действием.

Слабоалкогольные тонизирующие напитки по внешнему виду подразделяют на виды: прозрачные (жидкость без осадка и посторонних включений, допускается опалесценция, обусловленная особенностями используемого сырья) и замутненные (непрозрачная жидкость, допускается наличие осадка и взвесей, обусловленных особенностями используемого сырья, без посторонних включений, не свойственных продукту); слабоалкогольные тонизирующие напитки по степени насыщения двуокисью углерода подразделяют на типы: негазированные и газированные, в зависимости от способа обработки подразделяют на непастеризованные и пстери-зованные; напитки с применением консервантов и напитки без применения консервантов; напитки холодного розлива и напитки горячего розлива, наI питки асептического розлива [205].

С одной стороны, разнообразие подходов к проектированию напитков с гармонизирующими и тонизирующими (более узкое понятие) свойствами, а с другой - отсутствие четкой системы и требований к созданию таких напитков в молочной отрасли обусловливают необходимость проведения соответствующих исследований, в том числе поиск дополнительных возможностей использования в качестве природных биостимуляторов ингредиентов и компонентов молочного сырья [390].

В настоящее время отечественный рынок насыщен аналоговыми напитками импортного и отечественного производства, в технологии которых в качестве действующего начала используются различные синтетические ингредиенты. Тем не менее, уникальный химический состав молочного сырья и его терапевтическое влияние на человека определяют возможность создания гармонизирующих ингредиентов и напитков с целевым назначением (тонизирующим, антистрессовым и др.). Перспективным считается создание технологий гармонизирующих напитков, способствующих повышению иммунитета и укреплению организма, улучшению работы пищеварительной и выделительной систем, улучшению самочувствия и снижению усталости, антитоксичному действию, ясности мысли и крепким нервам, продлению молодости' [399,.400].

Все вышеизложенное указывает на актуальность выбранного направления исследований.

Отдельные этапы работы выполнены в рамках Федеральных целевых программ «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы и «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы».

При выполнении исследований автор основывался на трудах отечественных ученых в области молочных продуктов: В.И. Ганиной, Г.Б. Гав-рилова, Н.Б. Гавриловой, М.В. Гернет, JI.B. Голубевой, М.Б. Данилова, Н.И. Дунченко, И.А. Евдокимова, П.Ф. Крашенинина, H.H. Липатова, H.H. Липатова (мл.), A.M. Маслова, П.Г. Нестеренко, Л.А. Остроумова, В.А. Павлова, В.А. Полякова, К.К. Полянского, В.А. Помозовой, Ю.Я. Свириденко, В.Ф. Семенихиной, И.А. Смирновой, H.A. Тихомировой, М.С. Уманского, И.С. Хамагаевой, В.Д. Харитонова, A.A. Храмцова, А.Г.Храмцова, A.M. Шалыгиной, Г.Г. Шилера и др.

Выводы: на основании результатов дегустации установлено, что продукт полностью соответствует всём показателям, лриведенняеав нормативной ^ай^екташи.

Комиссия рекомендует:

1 Утвердить проект нормативной документации, назшзколактозный напиток

2 Рекомендовать низколактозный напиток к внедрению в производства

Щедеед^ель комиссии: Члены.комиссии: Фролов » Савич 'А. Крючкова

А.Ю. Просеков К.Е. Киреева ci; CS5VK»

Директор ООО «НПО Щ^чшйе технологии» СЛ. Фролов

ТеятожР Iff 1 V- s производственной выработки ш©колак^Щ§5ре(&итка Составлен комиссией:

Предеедателыдиректор ОО0«ЙПО«Инновационные технологии»

И.К. Савин тех^о дотщоновым видам продукции A.A. Крючкова проректор поНИОР, д,т,н;,профеесор АЛО. Просеков докторант кафедры Технология молока п молочных про^ров>>,к.'Г.н А.В.Крупин аешзрдо на^ К&«Киреева

1 Комиссией была произведена промышленная выработка низколактоз-. ного напитка, разработанного аспирантом научно-образовательного центра К.Е. Киреевой под руководством доктора технических наук, профессора А.Ю. Просекова^Выработканапитка производилась поразработанной техно-догическЩсхемеирецевдра^

ПОСТАНОВИЛИ: На основании того, та низколдаозный напиток обладает вые м .показателями, а так же лечебно, рекомендоватьегок внедрениюв произвол

Предшдателькомиссш: Ще&вхкоьшсед. ;

Фролов Савич А. А. Крючкова А-Ю. Просеков A.B. Крупин KJB. Киреева

Директор ООО «НПО ^^^¿^-^иионкМ^гхнологии»

Фролов акт ввода.» прс«йаводогё.ншкол^^ЙЙ^1апйтка

Данный акт составлен комиссией:

Председатель: директор ООО «НПО «Инновационные технологии» С.В. Фролов ^^

Члены комиссии: начальник производства, к.т.н. ШС. Савич технолог по новым видам продукции А. А. Крючкова проректор по НИР, д.т.н., профессор А.Ю. йраьеков докторант кафедры «Технология молока и молочных продуктов», к.т.н А.В, Крупин аспирант научно-образовательного центра К.Е. Киреева

Комиссией быда произведена одна экспериментальная промышленная партия кизколактозного напитка, разработанного аспирантом научно-образовательного центра К.Е. Киреевой под руководством доктора технических наук, профессора А.Ю. Просекова. Выработка производилась по технологической схеме и рецептурам, приведенным в проекте стандарта организаЦИИ.

На основании проведенных физико-химических, микробиологических исслШШ§йий, показателям безопасности и исследований на подтверждение сроков годности» протокола дегустации комиссия рекоменду^^

1. Утвердить проект нормативной документации на низколактозный напиток

2. Утвердить ввод в производство с ноября 2009 г низколактозного напитка

Акт составлен в 3-х экземплярах: 1й - председателю комиссии С.В. Фродову 2" - аспиранту научно-образовательного. центра К.Е. Киреевой 3й - докторанту кафедры «Технология молокан молочных продуктов», к.т.н А.В. Крупину

С^вЯЙвз.

Председатель комиссии-: | I Фролов

Члены комиссии: к^^вич рючкова Ю. Просеков "кВ. Крупин К.Е. Киреева

МЙр'ЛВ.Ф. Хавров

200

CKÜSS®»!»

АКТ О ВНЕДРЕНИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Шиссия в составе директора В.Ф. Хаврова, главного инженера A.A. Заречнева, проректора по НИР, доктора технических наук, профессора А.Ю. Просекова, докторанта кафедры «Технология молока и молочных продук- * тов», кандидат технических наук A.B. Крупин, аспиранта научно-образовательного центра К.Е. Киреевой рассмотрела результатьТпроизводст-венной проверки.

Место проведение производственной проверки: ООО «Экспериментальный сыродельный завод», Алтайский край, г. Барнаул.

На предприятии ООО «Экспериментальный сыродельный завод» были проведены испытания технологии производства низколактозногго напитка на основе молочного сырья с целью выявления причин возможных отклонений и доработки технологии. *

Была произведена опытная партия низколактозного напитка и прове

QtßS&a». дена проверка эффективности предложенного метода контроля качества продукции. Для осуществления контроля использовали значения физико-химических, органолептических, реологических свойств по ГОСТ, которые позволили объективно оценить полученные результаты.

Директор ООО «Экспериментальный сыродельный завод»

Главный инженер ООО «Экспериментальный сыродельный завод»,

Проректор по НИР, д.т.н., профессор

Докторант кафедры «Технология молока и молочных продуктов», к.т.н

Аспирант Научно-образовательного центра

В.Ф. Хавров

А.А. Заречнев Просеков

А.В. Крупин

К.Е. Киреева и

Утверждаю»

Проректор по НИР, д.т.н., профессор ГОУ ВПО Кемеровский технологический технологический институт пищевой

Ш. [) промышленности Г^и А.Ю. Просеков Щк/е^ъ^. 200 г.

МЕТОДИКА БАЛЬНОЙ ОЦЕНКИ МОЛОЧЕНЫХ НАПИТКОВ

Органолептические показатели качества ферментированных напитков оценивают по условной системе баллов:

Вкус и запах - 10 баллов

Консистенция - 8 баллов

Цвет - 10 баллов

Внешний вид - 2 балла

Итого - 30 баллов

Нзгщтки оценивают в соответствии с обнаружением в момент осмотра показателями качества в соответствии с табл. 1, после чего результаты суммируют. При наличии нескольких пороков в одном показателе оценка делается по наиболее оценивающему пороку.