автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Технология биологически активных добавок к пище на основе ферментативного гидролиза гонад гидробионтов

На правах рукописи

ПОЗДНЯКОВА Юлия Михайловна

<

I

I

1

I

(

I

ТЕХНОЛОГИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК К ПИЩЕ НА ОСНОВЕ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА ГОНАД ГИДРОБИОНТОВ

Специальность 05.18.07 - биотехнология пищевых продуктов (биотехнология гидробионтов)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Владивосток - 2003

Работа выполнена в лаборатории прикладной биохимии Федерального государственного унитарного предприятия «Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр» (ФГУП «ТИНРО-Центр).

Научный руководитель - доктор биологических наук, ст. н. сотр.

Пивненко Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты - доктор биологических наук, профессор

Шульгина Лидия Васильевна доктор технических наук, профессор Ким Эдуард Николаевич

Ведущая организация - Дальневосточный государственный университет (ДВГУ).

Защита диссертации состоится 17 декабря 2003 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета ДР 307.012.0.1 во ФГУП «Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр» по адресу: 690950, г. Вла- ч дивосток, ГСП, пер. Шевченко, 4, факс: (4232) 300-751.

ы!

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр».

Автореферат разослан «/£.» //¿11^^2003 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета п к.б.н. Темных О.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и ее низкомолекулярные производные являются перспективными лекарственными средствами и биологически активными пищевыми добавками (БАД). Как установлено, область применения таких препаратов зависит от молекулярной массы ДНК (Каплина, 2000). Наиболее эффективны препараты на основе низкомолекулярной ДНК, содержащие олигонуклеоти-ды, производные тимидина (Хаитов, Игнатьева, 1992; Карамышева и др., 1998).

Основным источником получения БАД на основе ДНК являются молоки лососевых и осетровых. Известно несколько способов получения ДНК, которые основаны на солевой экстракции молок и последующем спиртовом осаждении. Однако ДНК, получаемая таким способом и используемая в качестве БАД, характеризуется высокой молекулярной массой и слабой растворимостью в воде, что ограничивает сферу ее применения. В связи с этим возникла необходимость создания новых препаратов на основе ДНК не только из лососевых или осетровых рыб, но и других видов морского сырья. Использование для этой цели ферментных препаратов позволит регулировать не только физико-химические свойства (растворимость и вязкость, молекулярный состав) (Mahmoud, Î994), но и, возможно, биологическую активность получаемых БАД.

При ферментативном воздействии на ткань гонад гидробионтов важны активность и специфичность ферментов, участвующих в гидролизе нуклео-протеидов (экзогенных, входящих в состав комплексных ферментных препаратов, и эндогенных, содержащихся в молоках).

В качестве источника экзогенных ферментов часто используют препараты из панкреатической ткани животных, в которой имеется широкий набор дезоксирибонуклеаз (ДНКаз). Наиболее полно изученным и широко используемым ферментом этой группы является ДНКаза-НКФ--ЗтЬ4:5) из панкреаса

И ОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ | быка. Известен ряд работ по исследованию ЦНКав HSfeaatmaafcpeaca краба

\ С.Петербург у/ I

03 J0Q5 wfHf I

(Мензорова и др., 1993, 1994; Вакорина и др., 1997), криля (Chou and Liao, 1990). ДНКазы панкреатических органов рыб являются мало изученными (Rasskazov et al., 1975).

В гонадах гидробионтов (рыб и беспозвоночных) обнаружен ряд гидролитических ферментов, выполняющих различные функции клеточного метаболизма, в том числе участие в апоптозе - программируемой клеточной гибели. Однако сведений о протеолитических ферментах, а также ДНКазах, особенно щелочных, содержащихся в гонадах рыб, моллюсков, иглокожих, в литературе недостаточно для выявления механизма их действия и роли в процессах деградации ДНК. В то же время сравнительное изучение ферментов эндогенного и экзогенного происхождения необходимо для обоснования технологии получения препаратов ДНК из данного вида сырья, определения взаимосвязи между свойствами ферментов, составом нуклеиновых кислот и биологической активностью получаемых препаратов.

Цель исследований заключалась в разработке технологии БАД из гонад гидробионтов на основе воздействия ферментов эндогенного и экзогенного происхождения, а также в исследовании состава, свойств и биологической активности полученных БАД. Задачи исследований:

- провести скрининг объектов по содержанию ДНК, активности эндогенных протеаз и дезоксирибонуклеаз в гонадах гидробионтов;

- осуществить подбор рациональных параметров ферментативного гидролиза нукпеопротеидов гонад рыб и беспозвоночных;

- исследовать состав и физико-химические свойства препаратов, полученных в результате ферментативного гидролиза гонад различных видов гидробионтов;

- разработать способ получения БАД из гонад гидробионтов;

- разработать НД на БАД из гонад гидробионтов;

- провести оценку безопасности, исследовать биологическую активность, провести клинические испытания полученных препаратов.

Научная новизна. Разработана и научно обоснована технология получения БАД йз гонад гидробионтов.

Впервые проведено сравнительное исследование протео- и нуклеоли-тических ферментов в мужских гонадах 13 видов гидробионтов.

Проведены сравнительные кинетические исследования микробиальных ДНКаз, а также содержащихся в панкреатической ткани рыб и крабов.

• Исследован состав нуклеиновых компонентов препаратов из гонад гидробионтов, полученных разными способами: ферментативным («Нуклеатин») и методом спиртового осаждения («нуклеопротеидный комплекс»).

Предложена модель механизма влияния ферментов эндогенного и экзогенного происхождения на деструкцию ДНК гонад гидробионтов в технологическом процессе.

Показано, что эндогенные ферменты являются инициаторами ферментативной деструкции нуклеиновых кислот, влияющей на конечный состав препаратов. Установлено, что при отсутствии или следовой активности ферментов эндогенного происхождения степень гидролиза нуклеопротеидов с участием экзогенных ферментов низка.

Установлена безвредность препаратов из гонад гидробионтов и впервые показана стимуляция синтетических процессов на примере метаболизма одноклеточных тест-объектов Tetrahymena pyriformis.

Практическая значимость. Разработан эффективный способ получения БАД, в основу которого положены ферментативный гидролиз гонад гидробионтов и фракционирование олигонуклеотидов с помощью ультрафильтрации.

Способ получения ферментативного гидролизата из молок рыб защищен патентом № 2171066 от 22.03.2000: «Продукт, обогащенный аминокислотами, и способ его получения».

По результатам экспертной оценки и санитарно-химических исследований в федеральном центре Госсанэпиднадзора РФ «Нуклеатин» соответствует требованиям СанПиН 2.3.2.1078-01, МУК 2.3.2.-21-98 и зарегистрирован как БАД (Per. удостоверение № 77.99.02.928.Б.000258.08.03).

Разработана и утверждена нормативная документация на БАД «Нуклеатин» ТУ № 9283-026-00038155-02, ТИ№ 36-215-02.

Выпущена опытно-промышленная партия «Нуклеатина». Проведены медико-биологические испытания «Нуклеатина» и показано, что он может быть использован в качестве БАД в кардиологии, офтальмологии, при лечении острых вирусных заболеваний, а также в качестве радиопротекторного средства.

Апробация работы: основные положения работы были представлены на научно-практической конференции «Состояние здоровья населения Дальнего Востока. Новые медицинские технологии с использованием биоресурсов» (Владивосток, 1999); Международном симпозиуме «Пищевые биотехнологии: проблемы и перспективы в XXI веке» (Владивосток, 2000); межрегиональной научно-практической конференции «Вакцинопрофилактика. Проблемы настоящего и будущего» (Владивосток, 2000); Международной научно-практической конференции «Прибрежное рыболовство - XXI век» (г. Южно-Сахалинск, 2001); Всероссийской конференции молодых ученых «Ры-бохозяйственная наука на пути в XXI век» (Владивосток, 2001); Международной конференции «Морские прибрежные экосистемы: водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки» (Москва, Голицино, 2002), Всероссийской конференции молодых ученых (Мурманск, 2002). Положения, выносимые на защиту:

- сравнительная характеристика субстратной специфичности ферментов из панкреатических органов лососевых рыб, млекопитающих, беспозвоночных, а также микроорганизмов;

- влияние эндогенных ферментов (протеаз и нуклеаз) гонад гидробионтов, являющихся инициаторами гидролиза нуклеопротеидов, на молекулярный состав олигонуклеотидов;

- способ получения олигонуклеотидов из гонад гидробионтов, включающий ферментативный гидролиз и разделение компонентов по молекулярным массам;

- состав препаратов, получаемых методом ферментативного гидролиза из гонад гидробионтов, характеристика биологической активности.

Публикации: по теме диссертации опубликовано 18 работ.

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть, заключение, выводы, список литературы, содержащий 100 источников (в том числе 41 зарубежный). Работа изложена на 160 страницах, содержит 11 таблиц, 15 рисунков и 8 приложений.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

Введение. Обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, научная новизна и практическая значимость работы.

Обзор литературы. Проанализированы результаты исследований по способам получения препаратов ДНК, олигонуклеотидов, нуклеозидов и их применению, рассмотрена биологическая активность нуклеиновых кислот. Большое внимание уделено свойствам и применению белков, входящих в состав нуклеопротеидов различных видов рыб, биологической активности аминокислот и известным способам получения белковых гидролизатов. Рассмотрены используемые для получения гидролизатов ферменты и ферментные системы, в том числе протеазы и нуклеазы. Подробно проанализирован механизм действия нуклеаз. Охарактеризован ряд эндогенных гидролитических ферментов, участвующих в гидролизе нуклеопротеидов. В заключении главы резюмированы факторы, от которых зависит эффективность биологического действия ДНК, и предложены подходы к получению низкомолекулярной ДНК. Сделано заключение о необходимости проведения комплексного исследования активности экзогенных и эндогенных ферментов при биотехнологическом производстве препаратов из гонад гидробионтов с целью повышения эффективности БАД.

Экспериментальная часть включает описание объектов, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения.

Объектами исследования являлись: - молоки горбуши ОпсогИупсИш §огЬи5с1га, кеты ОпсогЬупскш к&а, омуля Соге%опш аШитпаЫз, сельди Оиреа ра11ая1 ра11ая1, трески Сайт тасго-серИЫия, наваги Е/е^гпг« g. Тйе$Ш5, минтая Theragra chalcogramma, мак-руруса Coryphaenoid.es реМогаШ, лемонемы Ро(Ьпета 1ощ1рез, акулы

Squalus acanthias, мужские гонады приморского гребешка Patinopecten yes-soensis, осьминога Paroctopus conispediceus, кукумарии Cucumaria japónica;

- ферментные препараты: пилорин, гепатопанкреатин, панкреатин, мегатерии;

- препараты, полученные ферментативным способом из гонад гидробионтов.

Схема проведения экспериментальных работ и методы исследования. Экспериментальные работы выполняли в соответствии со схемой исследований (рис. 1).

Определение химического состава и биологического действия ферментативных гидролизатов из гонад проводили в сравнении с препаратом ДНК, полученным методом спиртового осаждения, который в дальнейшем обозначали как «нуклеопротеидный комплекс».

В ходе исследований количественное содержание ДНК в сырье определяли по методу Дише (Карклиня и др., 1989), в препарате — по разнице поглощения азотистых оснований (при 270 и 290 нм), полученных в результате гидролиза ДНК 0,5 %-ной хлорной кислотой при 100-105 °С (Folch et al., 1957).

Удельную активность кислой и щелочной ДНКаз определяли по количеству кислоторастворимых олигонуклеотидов, образующихся в процессе ферментативного гидролиза нативной ДНК (Kunitz, 1950). Для определения общей протеолитической активности использовали метод Е.Д.Каверзневой (1971), эстеразной активности трипсина и химотрипсина — метод Шверта и Такенака (Schwert and Takenaka, 1955).

Определение содержания белка проводили по методу Лоури (Lowry et al., 1951). Содержание общего азота определяли рефрактометрически (Грачева и др., 1982), аминного азота — методом формольного титрования (Шапиро, 1976). Степень гидролиза определяли как соотношение содержания аминного азота к общему. Определение состава свободных аминокислот проводили на аминокислотном анализаторе «Hitachi-935» (Япония).

Анализ состава нуклеопротеидных комплексов и ферментативных гидролизатов из гонад осуществляли методами гель-хроматографии, ионообменной хроматографии (Гафуров, 1999), гель-электрофореза (Остерман, 1981).

Рис. 1. Схема исследований

Для разделения олигонуклеотидов использовали метод ультрафильтрации, применяя колонки с мембранами волоконного типа ВПУ-15 с пределом пропускания молекул 15 кДа. Параметры процесса: скорость - 6 л/ч; давление - 0,1 кПа; температура — 5 °С; время — от 2,0 до 2,5 ч.

Определение антиокислительной активности препаратов проводили по Глевинду (Glavind, 1963). Острую и хроническую токсичность определяли в Пермской фармацевтической академии в соответствии с требованиями Фармакопеи (ГФ XI, 1990, вып. 2, стр. 182). Биологическую активность препаратов оценивали по влиянию на физическую работоспособность (длительность вынужденного плавания крыс), а также на простейших тест-организмах (прирост инфузорий Tetrahymena pyriformis) (Игнатьев и др., 1980).

Клинические испытания БАД «Нуклеатин» проводили на базе поликлиники Медобъединения ДВО РАН, применяя в дозе 0,4 г 2 раза в день перед приемом пищи в течение 3 нед в комплексном лечении больных гипертонической болезнью, ИБС, с дистрофическими изменениями сетчатки, миопией высокой степени, сахарным диабетом, острыми вирусными заболеваниями.

Статистическую обработку результатов эксперимента проводили с помощью пакета программ Statistica в среде Windows (фирма-производитель StatSoft Inc., USA), определяя стандартное отклонение (8), среднюю квадра-тическую ошибку (ш) и доверительный интервал (р).

Характеристика сырья по содержанию ДНК, активности протеазных и нуклеазных ферментов Для установления перспективных сырьевых источников получения биологически активных добавок в гонадах различных видов гидробионтов определяли содержание ДНК, протеазную и дезоксирибонуклеазную активности, так как активность эндогенных ферментов может играть большую роль в деградации ДНК, в основном на начальных стадиях проведения ферментативного гидролиза - гомогенизации и экстракции.

По содержанию ДНК условно выделены три группы: наиболее перспективные объекты для получения БАД, перспективные и неперспективные.

К наиболее перспективным (табл. 1,1) отнесли объекты, в гонадах которых содержание ДНК не менее 4,5 %. Перспективными для получения БАД явились виды с содержанием ДНК в гонадах 3,0-4,5 % (табл. 1, П), неперспективными — осьминог, акула-катран, макрурус (содержание ДНК менее 3 %).

Таблица 1

Удельная активность нуклеаз и протеаз содержание ДНК

Объект Активность щелочных Активность Содержание

дезоксирибонуклеаз, Е/г протеаз, Е/г ДНК, %

Омуль 140,0+6,35 0,40±0,018 10,0010,450

Кета 105,5±5,12 0,33±0,016 7,8010,335

Горбуша 63,0±3,05 0,27±0,012 5,0010,200

Сельдь 160,0±7,25 0,45±0,023 4,5010,235

Кукумария 94,2±4,60 0,8010,039 4,4010,220

Треска 85,3+4,01 3,2010,150 3,7510,157

Лемонема 6,7±0,32 0,82Ю,037 3,6010,170

Навага 36,1±1,70 3.20ЮД35 3,4010,159

Минтай Следы* 0,1310,006 3,0010,147

Гребешок Следы 0 З.ООЮДЗО

Макрурус ма- 124,8±6,20 1,8010,089 2,4010,103

логлазыи

Акула-катран 20,5+0,82 0 2,1310,100

Осьминог Следы 0 1,1910,051

II

Г III

I

* Активность не превышает 0,01 Е/г.

Установлено (табл. 1), что протеолитическая активность не проявлялась в гонадах гребешка, осьминога и акулы-катрана, а активность щелочных Са, М»-зависимых ДНКаз в гонадах гребешка, осьминога и минтая обнаружена в следовых количествах. Наиболее высок показатель активности ДНКаз в молоках сельди, омуля и макруруса.

При сопоставлении активности щелочных ДНКаз и содержания ДНК в гонадах установлена взаимосвязь между этими показателями, за некоторыми исключениями (макрурус).

Кроме щелочных ДНКаз, в гонадах содержатся и кислые ДНКазы, которые также могут играть определенную роль в деградации ДНК на первых стадиях ферментативного гидролиза, когда рН гомогенизированной ткани находится в слабо кислой или нейтральной области; обнаружено (рис. 2), что активность кислых ДНКаз является преобладающей в большинстве объектов (кроме лемонемы).

В отличие от молок минтая, активность и щелочных, и кислых ДНКаз в которых крайне низка, в гонадах гребешка при следовой активности щелочных ДНКаз в кислой среде активность сравнима с таковой в молоках сельди и горбуши, что может играть большую роль в последующей деградации ДНК при воздействии экзогенных ферментов.

ш

А I-

и о х т х

£ <

1000 600 600 400 200 ■ О

а

3 &

а о

л

э I

(О X о

X

о

2 ф

с:

о Э о ю о а

Рис. 2. Удельная активность щелочных и кислых ДНКаз в гонадах гидробионтов

Учитывая возможное участие протеолитических ферментов в качестве регуляторов функционирования эндогенных ДНКаз (Солдатенков и др., 1991), можно полагать, что ядерные протеазы могут устранять структурное р<13общение ДНКаз с ДНК в составе хроматина. Расщепляя белки, связанные с ДНК, протеазы могут создавать условия для прямого контакта ДНК с эндогенными ДНК азами, что способствует ее последующей деградации.

Таким образом, можно предположить схему возможного механизма влияния ферментов эндогенного и экзогенного происхождения на процесс деструкции ДНК:

эндогенные протеазы

I

белок------ДНК

А

ДНК <— эндогенные ДНКазы

I

низкомолекулярная ДНК экзогенные нуклеазы,

протеазы

олигонуклеотиды, нуклеозиды, нуклеотиды

Подбор рациональных параметров для ферментативного гидролиза нуклеопротеидов гонад гидробионтов

Предварительная оценка активности ферментных препаратов различного происхождения показала, что в препаратах протеолитического действия, выделенных из панкреатических органов млекопитающих, рыб, крабов, а также микроорганизмов, обнаружена ДНКазная активность (табл. 2).

Результаты исследований (рис. 3) показали, что рациональное время, которое определялось по накоплению азота аминогрупп, для гидролиза белков молок лососевых составило 2-3 ч при прочих равных условиях (температура, концентрация фермента, субстрата и др.).

Таблица 2

Удельная активность ферментов в препаратах различного __происхождения, Е/мг _

Препарат Протеазная активность Дезоксирибонуклеазная активность

Пилорин 0,1810,007 29,611,036

Гепатопанкреатин 0,34±0,015 17,410,832

Панкреатин 0,21+0,002 7,310,285

Мегатерии 1,0510,047 2,ЗЮ,092

О X

5 §

40

30 20 10 ^ 0

2 4

Время, час

--пилорин - - - -панкреатин ■

- гепатопанкреагтин

Рис. 3. Зависимость степени гидролиза белков от времени на примере белков молок лососевых

Подобные результаты были получены при обработке этими же ферментными препаратами ткани гонад других объектов — сельди, минтая, гребешка.

При температуре 37 °С происходило наибольшее накопление свободных аминокислот. рН среды, соответствующее наибольшей активности ферментов, варьировало от 8 до 9 для протеаз крабов, рыб и млекопитающих и от 7 до 10 — для микробиальных протеаз.

Наибольшая степень гидролиза наблюдалась в гидролизатах, соотношение фермент—субстрат в которых составляло 2 Е/г субстрата (рис. 4).

50 п

я

в

к 25 -I-1-1-1-1

° 0 2 4 6 8

Активность, Е/г

Рис. 4. Зависимость степени гидролиза белков молок горбуши от протеоли-тической активности ферментных препаратов различного происхождения (1 - пи-лорин; 2 - гепатопанкреатин; 3 - мегатерии), время реакции — 3 ч

Наблюдаемое снижение степени гидролиза с увеличением концентрации ферментного препарата могло быть связано с ингибированием ферментов продуктами реакции.

Сравнительные кинетические параметры процесса гидролиза под влиянием различных ферментных препаратов исследованы на примере высокополимерной ДНК (не менее 106 Да) в качестве субстрата (1С1Ч, США). Установлено, что с увеличением концентрации субстрата происходит снижение активности ДНКаз, но наиболее ярко выражена данная тенденция для ферментов панкреатических органов лососевых рыб (рис. 5).

При расчете кинетических параметров установлено, что наибольшим сродством к нуклеиновым кислотам молок обладали ДНКазы пилорина и ге-патопанкреатина: Кл/У^щ соответственно равны 52,1 и 2,3.

Таким образом, установлено, что при получении гидролизатов из гонад гидробионтов целесообразно применение пилорина и гепатопанкреатина как наиболее специфичных при концентрации ферментного препарата 2 Е/г. При пересчете концентраций субстрата (р5>) на количество нуклеолитических

единиц установлено, что рациональное фермент-субстратное соотношение составляет 0,87-2,3 нуклеолитических единицы на 1 г субстрата.

-----

___2___

10

9,8

9,6 9,4 рв

9,2

%

Рис. 5. Зависимость начальной скорости гидролиза нуклеиновых кислот ДНКазами ферментных препаратов различного происхождения от концентрации субстрата (рБ = -[Б]): 1 - пилорин; 2 - мегатерии; 3 - гепатопанкреатин; 4 - панкреатин

Характеристика химического состава гидролизатов из гонад гидробионтов

При разделении белковых фракций гидролизатов молок методом гель-хроматографии выявлено, что преобладающими являются белки с молекулярной массой в диапазоне 20,0-15,0 кДа.

Исследование состава свободных аминокислот показало высокое содержание лизина и аргинина, что объясняется, во-первых, преобладанием этих аминокислот в протамине, во-вторых, специфичностью действия проте-

аз, входящих в используемые ферментные препараты. Наибольшее количество свободных аминокислот образуется при обработке молок ферментами, выделенными из пилорических органов лососевых рыб.

Разделение олигонуклеотидов ферментативных гидролизатов молок горбуши, сельди и минтая методом ионообменной хроматографии показало очень малое содержание низкомолекулярных олигонуклеотидов в гидролиза-те молок минтая, что может быть связано как с составом нуклеопротеидов данного биологического материала, так и с низкой активностью эндогенных ферментов. В молоках остальных видов рыб обнаружено значительное содержание как низкомолекулярных олигонуклеотидов, так и высокомолекулярных компонентов.

Сравнение молекулярных масс нуклеиновых компонентов в составе ферментативных гидролизатов и нуклеопротеидных комплексов из гонад горбуши, сельди, минтая и гребешка методом гель-электрофореза показало, что в нуклеопротеидных комплексах из горбуши, сельди и гребешка содержатся нуклеиновые кислоты массой около 300 кДа (рис. 6).

Кроме того, в нуклеопротеидных комплексах из молок сельди обнаружена фракция олигонуклеотидов (около 17 кДа), а из гонад гребешка - высокомолекулярная фракция (около 500 кДа); нуклеопротеидный комплекс из молок минтая отличается от остальных отсутствием фракций с молекулярной массой ниже 550 кДа.

После ферментативного гидролиза гонад в составе нуклеиновых компонентов обнаружены существенные различия. В гидролизате молок сельди содержались только олигонуклеотиды (ниже 16 кДа). В составе гидролизата молок горбуши установлено содержание как олигонуклеотидов (6-68 кДа), так и ДНК массой около 300 кДа. ДНК гребешка гидролизовалась в большей степени, чем минтая, что может быть связано с обнаруженной высокой активностью кислых ДНКаз в гонадах гребешка.

Таким образом, разделение нуклеиновых кислот методом как электрофореза, так и ионообменной хроматографии показало, что при низкой активности эндогенных ДНКаз степень гидролиза нуклеопротеидов под влиянием экзогенных ферментов невысока.

I

I

Рис. 6. Денситограммы препаратов из молок гидробионтов: А — сельдь С. ра11аз'1 pa.lla.sv, Б — горбуша О. gorbuscha■, В — минтай ТН. сЫ1со§гатта\ Г — гребешок Р. уеюоеиш; 1 — нуклеопротеидные комплексы; 2 — гидролизаты

Исследование состава гидролизатов гонад гидробионтов подтвердило предполагаемый механизм воздействия эндогенных ферментов на процесс деградации ДНК с участием экзогенных ферментов. Эндогенные протеазы и нуклеазы молок гидробионтов инициируют процесс гидролиза нуклеиновых кислот и облегчают доступность субстрата для экзогенных ферментных препаратов. Полученные результаты явились основанием для разработки технологии получения БАД из гонад гидробионтов, которая получила название «Нуклеатин».

Метод получения БАД «Нуклеатин» включает: измельчение ткани гонад гидробионтов, экстракцию, ферментативный гидролиз, инактивацию, фильтрацию. Установлено, что ферментативный гидролизат из молок горбуши, полученный данным способом, содержит как олигонуклеотиды (6-68 кДа), так и низкомолекулярную ДНК (около 300 кДа), что послужило основанием для дальнейшего разделения его на фракции.

Для разделения компонентов гидролиза был применен метод фракционирования полинуклеотидов с помощью ультрафильтрации (рис. 7).

Технологическая схема получения БАД «Нуклеатин»

Ферментативный гидролизат

Ультрафильтрация (мембраны волоконного типа, 15 кДа)

Фильтрат («Нуклеатин», олигонуклеотиды с молекулярной массой ниже 15 кДа)

Концентрат (низкомолекулярная ДНК, молекулярная масса выше

15кДа)

Сушка

Рис. 7. Схема фракционирования олигонуклеотидов гидролизата молок

Для сушки препаратов применяли вакуумные сушильные аппараты с температурой в зоне выпаривания от 75 до 80 °С до массовой доли воды не более 10 %. Хорошие результаты получены при сублимационной сушке при температуре от 30 до 50 °С.

Срок хранения высушенных препаратов регламентирован технической документацией и составил 12 мес. Разделение нуклеиновых компонентов и определение их молекулярной массы (рис. 8) показало, что в «Нуклеатине» преобладающими являлись компоненты с молекулярной массой около 6 кДа, а в низкомолекулярной ДНК - компоненты с молекулярной массой около 300 кДа.

Содержание ДНК в полученных «Нуклеатине» и низкомолекулярной ДНК составило соответственно 30,3 и 55,8 %.

Исследование растворимости препаратов, полученных ферментативным способом («Нуклеа-тин» и низкомолекулярная ДНК) (рис. 9) и методом спиртового осаждения (нуклеопротеидный комплекс) показало, что скорость растворения «Нуклеатина» и низкомолекулярной ДНК в 20-60 раз выше, чем нуклеопротеидного комплекса.

Испытания острой и хронической токсичности БАД «Нуклеатин» показали ее безопасность (ДЦ50 превышает 1000 мг/кг массы животных).

Низкомолекулярная ДНК

Л/1

т—г-1-1-

6 41 68 300

Молекулярная масса, кДа

"Нуклеатин"

Л

300

Молекулярная масса, кДа

Рис. 8. Разделение фракций гидро-лизата молок лососевых методом гель-электрофореза

Проведенные медико-биологические испытания препаратов, полученных из гонад различных видов гидробионтов, показали выраженные биологические эффекты: стимуляция синтетических процессов (повышение физической работоспособности у млекопитающих, активизация метаболических процессов инфузорий ТеГгаИутепа руп/огтгя), антиокислительное и радиопротекторное действие.

Клинические испытания «Нуклеатина» продемонстрировали его общеукрепляющее действие при комплексной терапии различных заболеваний (ИБС, дистрофические изменения сетчатки, миопия высокой степени, острые вирусные инфекции и др.).

Таким образом, в результате проведенных исследований разработан метод получения новой БАД из гонад гидробионтов комплексного состава (олигонуклеотиды, пептиды, свободные аминокислоты),

обладающей широким спектром биологической активности.

Разработанный метод отличается от известного метода получения нук-леопротеидного комплекса по многим параметрам: во-первых, для производства не требуется применение органических растворителей, во-вторых, получаемый препарат обладает хорошей растворимостью в широком диапазоне рН, что расширяет сферу его применения, в-третьих, за счет комплексного состава «Нуклеатина» проявляются новые биологические свойства. Кроме того, для производства можно использовать не только молоки лососевых рыб, но и другие распространенные виды сырья. По результатам исследований разработаны рекомендации по применению препаратов, полученных из гонад разных видов гидробионтов.

Выводы

1. Разработана технология получения БАД из гонад гидробионтов на основе ферментативного гидролиза белков и нуклеиновых кислот.

2. При сравнительном исследовании состава ферментов эндогенного происхождения в гонадах 13 видов гидробионтов обнаружено: преобладание кислых ДНКаз в большинстве объектов (кроме лемонемы), следовая активность щелочных Са, К^-зависимых ДНКаз у минтая, гребешка,

осьминога и отсутствие протеолитической активности в гонадах гребешка, акулы-катрана и осьминога.

3. На основании исследования кинетических параметров ферментативного гидролиза нуклеиновых кислот установлена целесообразность применения ферментных препаратов, выделенных из панкреатических органов рыб и крабов, как наиболее эффективных и специфичных для получения растворимых олигонуклеотидов.

4. Показано влияние активности протеаз и ДНКаз эндогенного происхождения гонад гидробионтов на состав олигонуклеотидов при получении БАД.

В составе ферментных гидролизатов, полученных из гонад с высокой активностью протеаз и ДНКаз, обнаружены и олигонуклеотиды, и низкомолекулярные нуклеиновые кислоты, в гидролизатах, полученных из гонад с низкой активностью ферментов и/или ее отсутствием, преобладают высокомолекулярные нуклеиновые компоненты.

5. Предложена модель механизма влияния эндогенных ферментов на процесс деструкции ДНК из гонад гидробионтов, которая основана на активации эндогенных ДНКаз протеазами, существенно увеличивающий доступность субстрата для экзогенных ферментных препаратов, используемых в технологическом процессе.

6. Показано, что БАДы из гонад гидробионтов обладают широким спектром биологической активности, выражающейся в стимуляции синтетических процессов на примере метаболизма одноклеточных тест-объектов Т. руп/огт1я и высших животных, а также антиоксидантном и радиопротекторном действии.

7. Утверждена нормативно-техническая документация на БАД «Нук-леатин», выпущена его опытно-промышленная партия.

Основное содержание диссертации отражено в следующих публикациях:

1. Эпштейн Л.М., Пивненко Т.Н., Молодцов Г.П., Позднякова Ю.М. Влияние ферментных добавок на гидролиз кормовых белков и продуктивность животных // Междунар. сельскохоз. журн. - 1994. - № 3. - С. 51-54.

2. Пивненко Т.Н., Эпштейн Л.М., Позднякова Ю.М., Давидович В.В. Получение и характеристика белковых гидролизатов с использованием ферментных препаратов различной специфичности // Изв. ТИНРО. - 1997. - Т. 120. - С 23-31.

3. Пивненко Т.Н., Эпштейн Л.М., Позднякова Ю.М., Давидович В.В. Ферментативные способы приготовления белковых гидролизатов с использованием ферментных препаратов различной специфичности // Вопр. питания. - 1997. - № 5. - С. 34-38.

4. Позднякова Ю.М., Давидович В.В. Исследование субстратной специфичности панкреатических сериновых протеиназ различного происхождения // Тез. докл. конф. молодых ученых ТИНРО. - Владивосток: ТИНРО-Центр, 1997.

5. Давидович В.В., Позднякова Ю.М. Получение и характеристика гидролизатов с использованием ферментных препаратов различной специфичности // Тез. докл. конф. молодых ученых ТИНРО. - Владивосток: ТИНРО-Центр, 1997.

6. Позднякова Ю.М., Пивненко Т.Н., Эпштейн Л.М. Влияние ферментативного гидролиза на нуклеотидный состав молок различных видов рыб // Изв. ТИНРО.-1999.-Т. 125.-С. 147-151.

7. Позднякова Ю.М., Давидович В.В. Влияние специфичности ферментных препаратов на нуклеотидный состав гидролизатов молок различных видов рыб // Тез. докл. конф. молодых ученых ТИНРО. - Владивосток: ТИНРО-Центр, 1999.

8. Позднякова Ю.М., Давидович В.В. Ферментативный гидролизат из молок рыб семейства лососевых как биологически активный препарат // Сб. материалов науч. конф. "Состояние здоровья населения Дальнего Востока. Новые медицинские технологии с использованием биоресурсов». - Владивосток, 1999. - С. 87.

9. Пивненко Т.Н., Позднякова Ю.М., Давидович В.В. Ферментативный ДНК-содержащий продукт из молок лососевых как лечебно-профилактическая пищевая добавка. // Сб. тез. докл. Междунар. симпоз. «Пищевые биотехнологии: проблемы и перспективы в XXI веке». - Владивосток, 2000. - С. 73.

10. Пивненко Т.Н., Эпштейн Л.М., Позднякова Ю.М. Препараты комплексного действия из морских гидробионтов, полученные методом ферментативного гидролиза // Сб. тез. докл. межрегион, науч.-практ. конф. «Вакцинопрофи-лактика. Проблемы настоящего и будущего». - Владивосток, 2000.

11. Пат. РФ № 2171066. Продукт, обогащенный аминокислотами, и способ его получения / Эпштейн Л.М., Пивненко Т.Н., Позднякова Ю.М., Давидович

B.В. От 22.03.2000.

12. Дроздова Л.И., Якуш Е.В., Пивненко Т.Н., Позднякова Ю.М. Профилактический продукт из молок лососевых // Материалы Междунар. науч.-практ. конф. «Прибрежное рыболовство - XXI век». - Южно-Сахалинск, 2001. -

C. 259-262.

13. Позднякова Ю.М. Активность эндогенных ферментов в молоках различных видов рыб и моллюсков // Тез. докл. Всерос. конф. молодых ученых «Рыбо-хозяйственная наука на пути в XXI век». — Владивосток: ТИНРО-Центр, 2001.-С. 143.

14. Позднякова Ю.М., Пивненко Т.Н., Эпштейн Л.М., Касьяненко Ю.И. Исследование активности эндогенных и экзогенных ферментов при получении

i t

t

препаратов из молок различных видов рыб и моллюсков // Изв. ТИНРО. -

2001.-Т. 129.-С. 197-202.

15. Викторовская Г.И., Пивненко Т.Н., Ковалев H.H. Позднякова Ю.М. К вопросу о стадиях полового цикла кукумарии японской: биохимический подход // Тез. докл. Междунар. конф. «Морские прибрежные экосистемы: водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки». — М., Голицино, 2002.

16. Эпштейн J1.M., Пивненко Т.Н., Гуляков М.Б., Позднякова Ю.М. Новые на' правления в технологии переработки гидробионтов // Тез. докл. Междунар.

конф. «Морские прибрежные экосистемы: водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки». — М., Голицино, 2002.

17. Позднякова Ю.М. Исследование нуклеотидного состава препаратов из гонад гидробионтов различных видов // Тез. докл. Всерос. конф. молодых ученых, посвященной 140-летию со дня рождения Н.М. Книповича. — Мурманск,

2002, —С. 162-163.

18. Позднякова Ю.М., Пивненко Т.Н., Касьяненко Ю.И. Влияние эндогенных ферментов на состав олигонуклеотидов при их выделении из гонад гидробионтов // Прикладная биохимия и микробиология. — 2003. — № 5.

Подписано в печать 11.11.2003 г. Формат 60x90/16. Уч.-изд. л. 1. Тираж 100. Заказ № 23. Типография ТИНРО-Центра

2 ось g - Д Р 18 62 4

Список сокращений

Введение

1 Обзор литературы

1.1 Характеристика состава и свойств нуклеопротеидов, входящих в состав гонад гидробионтов

1.2 Биологическая активность компонентов нуклеопротеидов

1.3 Характеристика эндогенных ферментов в мужских гонадах гидробионтов

4 1.4 Способы получения белковых гидролизатов

1.5 Ферментные комплексы, используемые для получения гидролизатов

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2. Объекты, материалы и методы исследований

2.1 Объекты и материалы исследований

2.2 Методы исследований 49 3 Результаты и их обсуждение

3.1 Характеристика сырья по содержанию ДНК, активности эндогенных ферментов 60 3.1.1 Оценка сырья по содержанию ДНК

3.1.2 Исследование активности протеолитических ферментов в гонадах гидробионтов

3.1.3 Исследование активности дезоксирибонуклеаз в гонадах гидробионтов

3.1.4 Кинетические параметры действия щелочных и кислых дезоксирибонуклеаз в гонадах гидробионтов

3.2 Подбор оптимальных параметров для ферментативного гидролиза нуклеопротеидных комплексов гон£д гидробионтов

3.2.1 Исследование параметров протеолиза исходного сырья

3.2.2 Исследование кинетики гидролиза нуклеиновых кислот

3.3 Характеристика химического состава гидролизатов из гонад гидробионтов

3.3.1 Белково-пептидный и аминокислотный состав 79 3.3.2 Сравнительная характеристика состава олигонуклеотидов в препаратах из молок рыб

3.3.2.1 Сравнение состава нуклеопротеидных комплексов и гидролизатов из молок рыб

3.3.2.2 Сравнительный состав гидролизатов, полученных с применением различных ферментных препаратов

3.3.2.3 Сравнение состава олигонуклеотидов гидролизатов молок различных видов рыб

3.3.2.4 Фракционный состав низкомолекулярных нуклеиновых кислот в препаратах из гонад различных видов гидробионтов

3.4 Технологическая схема получения БАД «Нуклеатин»

3.4.1 Условия ферментативного гидролиза

3.4.2 Разделение олигонуклеотидов методом ультрафильтрации

3.4.3 Обоснование возможности применения разработанного метода для гонад различных видов гидробионтов 96 3.5 Исследование медико-биологической активности препаратов из гонад гидробионтов

Актуальность работы. В настоящее время ДНК и ее низкомолекулярные производные являются перспективными лекарственными средствами и биологически активными пищевыми добавками (БАД). Для получения препаратов ДНК используют различные сырьевые источники: бактериальные клетки, эритроциты цыплят, тимус телят, селезенка и печень мышей и крыс, молоки сельди, карпа, осетровых и других видов рыб (Пашук и др., 1995). Препараты ДНК из молок лососевых и осетровых обладают наиболее эффективным фармакологическим действием (Патент РФ № 915446; Каплина, 2000).

Анализируя известные литературные данные, можно сделать заключение о том, что область применения ДНК зависит от ее молекулярной массы. Например, ДНК со сравнительно низкой молекулярной массой применяется в кардиологии при лечении ишемической болезни сердца (Патент РФ № 95103961), в онкологии при профилактике и лечении рака (А.С. 1804852 SU), для профилактики инфекционных заболеваний (Патент РФ № 2063228). Олигонуклеотиды, нуклеозиды и производные тимидина могут использоваться при лечении ВИЧ-инфекции (Хаитов, Игнатьева, 1992).

Основным источником получения БАД на основе ДНК являются молоки лососевых и осетровых. Известно несколько способов получения ДНК, которые основаны на солевой экстракции молок и последующем спиртовом осаждении. Однако ДНК, получаемая таким способом и используемая в качестве БАД, характеризуется высокой молекулярной массой и слабой растворимостью в воде, что ограничивает сферу ее применения.

Актуальность проблемы, поставленной в данной работе, определяется необходимостью создания биодоступных препаратов ДНК из распространенных видов сырья. Использование для этой цели ферментативного гидролиза позволит регулировать не только физико-химические свойства (растворимость и вязкость, молекулярный состав) (Mahmoud, 1994), но и, возможно, биологическую активность получаемых БАД.

При ферментативном воздействии на ткань гонад гидробионтов важны определение активности и специфичности ферментов, участвующих в гидролизе нуклеопротеидов (экзогенных, входящих в состав комплексных ферментных препаратов, и эндогенных, содержащихся в молоках).

Известно, что в панкреатической ткани большинства видов животных, в том числе ракообразных, имеется широкий набор ДНКаз (Вакорина и др., 1997). Наиболее полно изученным и широко используемым ферментом этой группы является ДНКаза I (КФ 3.1.4.5), выделенная из панкреаса быка. Основной ее функцией является деградация ДНК. Имеется ряд работ по исследованию ДНКаз, выделенных из гепатопанкреаса краба (Вакорина и др., 1997; Мензорова и др., 1993; Мензорова и др., 1994), криля (Chou and Liao, 1990). ДНКазы панкреатических органов рыб являются мало изученными (Rasskazov et al., 1975).

В гонадах гидробионтов обнаружен ряд гидролитических ферментов, выполняющих различные функции клеточного метаболизма. Например, из молок чавычи (Yamomoto, 1971), скумбрии (Cordonnier and Bernardi, 1968), кеты, минтая (Галкин и др., 1991) выделены кислые ДНКазы, различающиеся между собой по свойствам. Спермии морского ежа S. Intermedius содержат три разные ДНКазы: кислую и две щелочные металлозависимые (Сибирцев и др., 2001). Как полагают многие исследователи, роль этих ферментов -участие в апоптозе - программируемой клеточной гибели. Однако сведений о протеолитических ферментах а также ДНКазах особенно щелочных, содержащихся в гонадах рыб, моллюсков, иглокожих в литературе недостаточно для выявления механизма их действия и роли в процессах деградации ДНК.

Сравнительное изучение ферментов эндогенного и экзогенного происхождения необходимо для обоснования технологии получения препаратов ДНК из данного вида сырья, определения взаимосвязи между свойствами ферментов, составом нуклеиновых кислот и биологической активностью получаемых препаратов.

Цель исследований заключалась в разработке технологии БАД из гонад гидробионтов на основе воздействия ферментов эндогенного и экзогенного происхождения, а также в исследовании состава, свойств и биологической активности полученных БАД.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

- провести скрининг объектов по содержанию ДНК, активности эндогенных протеаз и нуклеаз в гонадах гидробионтов;

- осуществить подбор рациональных параметров ферментативного гидролиза нуклеопротеидов гонад рыб и беспозвоночных;

- исследовать состав и физико-химические свойства препаратов, полученных в результате ферментативного гидролиза из гонад различных видов гидробионтов;

- разработать способ получения БАД из гонад гидробионтов;

- разработать НД на БАД из гонад гидробионтов;

- провести оценку безопасности, исследовать биологическую активность, провести клинические испытания полученных препаратов.

Научная новизна: Разработана и научно обоснована технология получения БАД из гонад гидробионтов.

Впервые проведено сравнительное исследование протео- и нуклеолитических ферментов в мужских гонадах 13 видов гидробионтов.

Проведены сравнительные кинетические исследования микробиальных, а также содержащихся в панкреатической ткани рыб, крабов ДНКаз.

Исследован состав нуклеиновых компонентов препаратов из гонад гидробионтов, полученных разными способами: ферментативным («Нуклеатин» и низкомолекулярная ДНК) и методом спиртового осаждения нуклеопротеидный комплекс).

Показано, что эндогенные ферменты являются инициаторами ферментативной деструкции нуклеиновых кислот, влияющими на конечный состав препаратов. Установлено, что при отсутствии или следовой активности ферментов эндогенного происхождения степень гидролиза нуклеопротеидов с участием экзогенных ферментов низка.

Практическая значимость. Разработан эффективный способ получения БАД, в основу которого положен ферментативный гидролиз гонад гидробионтов и фракционирование олигонуклеотидов с помощью ультрафильтрации.

Способ получения ферментативного гидролизата из молок рыб защищен патентом №2171066 от 22.03.2000: «Продукт, обогащенный аминокислотами и способ его получения».

По результатам экспертной оценки и санитарно-химических исследований в федеральном центре Госсанэпиднадзора РФ «Нуклеатин» соответствует требованиям СанПиН 2.3.2.1078-01, МУК 2.3.2.- 21-98 и зарегистрирован как БАД (Per. удостоверение № 77.99.02.928.Б.000258.08.03).

Разработана и утверждена нормативная документация на БАД «Нуклеатин» ТУ № 9283-026-00038155-02 , ТИ№ 36-215-02.

Выпущена опытно-промышленная партия «Нуклеатина».

Проведены медико-биологические испытания «Нуклеатина» и показано, что он может быть использован в качестве БАД в кардиологии, офтальмологии, при лечении острых вирусных заболеваний, а также в качестве радиопротекторного средства.

Апробация работы: основные положения были представлены и доложены на научно-практической конференции «Состояние здоровья населения Дальнего Востока. Новые медицинские технологии с использованием биоресурсов» (Владивосток, 1999); Международном симпозиуме «Пищевые биотехнологии: проблемы и перспективы в XXI веке» (Владивосток, 2000); межрегиональной научно-практической конференции «Вакцинопрофилактика. Проблемы настоящего и будущего» (Владивосток, 2000); Международной научно-практической конференции «Прибрежное рыболовство - XXI век» (г. Южно-Сахалинск, 2001); Всероссийской конференции молодых ученых «Рыбохозяйственная наука на пути в XXI век» (Владивосток, 2001); Международной конференции «Морские прибрежные экосистемы: водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки» (Москва, Голицино, 2002), Всероссийской конференции молодых ученых (Мурманск, 2002).

Положения, выносимые на защиту: сравнительная характеристика субстратной специфичности ферментов панкреатических органов лососевых рыб, млекопитающих, беспозвоночных, а также микроорганизмов; влияние эндогенных ферментов (протеаз и нуклеаз) гонад гидробионтов, являющихся инициаторами гидролиза нуклеопротеидов, на молекулярный состав олигонуклеотидов; способ получения олигонуклеотидов из гонад гидробионтов включающий ферментативный гидролиз и разделение компонентов по молекулярным массам; состав препаратов, получаемых методом ферментативного гидролиза из гонад гидробионтов, характеристика биологической активности.

Публикации: по теме диссертации опубликовано 18 работ.

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть, заключение, выводы, список литературы, содержащий 100 источников (в том числе 41 зарубежный). Работа изложена на 160 страницах, содержит 11 таблиц, 15 рисунков и 8 приложений.

Выводы

1. Разработана технология получения БАД из гонад гидробионтов на основе ферментативного гидролиза белков и нуклеиновых кислот.

2. При сравнительном исследовании состава ферментов эндогенного происхождения в гонадах 13 видов гидробионтов обнаружено: преобладание кислых ДНКаз в большинстве объектов (кроме лемонемы), следовая активность щелочных Са, Mg-зависимых ДНКаз у минтая, гребешка, осьминога и отсутствие протеолитической активности в гонадах гребешка, акулы-катрана и осьминога.

3. На основании исследования кинетических параметров ферментативного гидролиза нуклеиновых кислот установлена целесообразность применения ферментных препаратов, выделенных из панкреатических органов рыб и крабов, как наиболее эффективных и специфичных для получения растворимых олигонуклеотидов.

4. Показано влияние активности протеаз и ДНКаз эндогенного происхождения гонад гидробионтов на состав олигонуклеотидов при получении БАД.

В составе ферментных гидролизатов, полученных из гонад с высокой активностью протеаз и ДНКаз, обнаружены и олигонуклеотиды, и низкомолекулярные нуклеиновые кислоты, в гидролизатах, полученных из гонад с низкой активностью ферментов и/или ее отсутствием, преобладают высокомолекулярные нуклеиновые компоненты.

5. Предложена модель механизма влияния эндогенных ферментов на процесс деструкции ДНК из гонад гидробионтов, которая основана на активации эндогенных ДНКаз протеазами, существенно увеличивающий доступность субстрата для экзогенных ферментных препаратов, используемых в технологическом процессе.

6. Показано, что БАДы из гонад гидробионтов обладают широким спектром биологической активности, выражающейся в стимуляции синтетических процессов на примере метаболизма одноклеточных тест-объектов Т. pyriformis и высших животных, а также в антиоксидантном и радиопротекторном действии.

7. Утверждена нормативно-техническая документация на БАД «Нуклеатин», выпущена опытно-промышленная партия.

Заключение

Полученные результаты позволили разработать новые БАД, содержащие водорастворимую форму ДНК, набор свободных аминокислот, в том числе незаменимых, и пептидов и обладающие широким спектром лечебно-профилактических и общеукрепляющих для организма человека свойств. В работе был использован метод ферментативного гидролиза гонад гидробионтов и осуществлен поиск его оптимальных параметров. Проведено сравнение как протеолитических, так и нуклеазных активностей эндогенных и экзогенных ферментов.

С целью выяснения структурных особенностей того или иного вида сырья, способности к ферментативной деструкции, а также для выявления новых источников получения БАД, из гонад различных видов гидробионтов были приготовлены ферментативные гидролизаты. По накоплению низкомолекулярных продуктов оценивали перспективность использования молок различных видов рыб и беспозвоночных для выделения водорастворимой ДНК.

В гонадах рыб и беспозвоночных выявлены протеолитические и нуклеазные ферменты, оказывающие значительное влияние на состав препаратов, получаемых ферментативным способом. Значения скорости гидролиза белков и нуклеиновых кислот зависели от вида объектов, рН среды, концентрации ткани в реакционной смеси. Во всех исследуемых объектах преобладающей явилась активность кислых дезоксирибонуклеаз.

Наибольшее значение активности кислых ДНКаз наблюдалось в молоках горбуши, показатели активности щелочных ДНКаз самые высокие в молоках сельди.

При исследовании дезоксирибонуклеазной активности используемых ферментных препаратов были рассмотрены кинетические закономерности. На основании кинетических характеристик пары фермент - субстрат определены приоритеты по применению ферментных препаратов. Если для гидролиза белков могут быть использованы все исследуемые в работе препараты, то для того, чтобы добиться высокой степени гидролиза нуклеиновых кислот, целесообразнее применять пилорин и гепатопанкреатин. Дезоксирибонуклеазы, выделенные из пилорических придатков лососей обладали наибольшим сродством к ДНК молок рыб этого вида при самой высокой скорости гидролиза.

Состав препаратов, получаемых из гонад различных видов гидробионтов с помощью ферментативного гидролиза, определялся активностью эндогенных протеолитических и нуклеазных ферментов. Эндогенные нуклеазы и протеазы молок гидробионтов инициировали процесс гидролиза нуклеиновых кислот и облегчали доступность субстрата для экзогенных ферментных препаратов. Таким образом, показана взаимосвязь активности эндогенных нуклеаз в молоках гидробионтов, молекулярной массы продуктов ферментативного гидролиза нуклеиновых кислот и биологической активности препаратов на их основе.

На основании проведенных исследований разработана технология получения водорастворимой формы ДНК из гонад гидробионтов «Нуклеатин», в которую была включена стадия фракционирования олигонуклеотидов посредством ультрафильтрации. Данная стадия позволила получить более очищенные препараты, на основе которых можно будет в дальнейшем проводить разработки новых лекарственных форм. Разработанный метод выгодно отличается от известного метода (спиртового осаждения) получения нуклеопротеидного комплекса из молок лососевых по многим параметрам: во-первых, для производства не требуется применение органических растворителей, во-вторых, получаемый препарат обладает хорошей растворимостью в широком диапазоне рН, что расширяет сферу его применения, в-третьих, за счет комплексного состава «Нуклеатина» проявляются новые биологические свойства. Кроме того, для производства можно использовать не только молоки лососевых, но и другие распространенные виды сырья. По результатам исследований разработаны рекомендации по применению препаратов, полученных из гонад разных видов гидробионтов.

Медико-биологические испытания БАД «Нуклеатин» показали ее безопасность. Были исследованы следующие показатели биологической активности: антиокислительная и влияние на физическую работоспособность. Кроме того, было исследовано влияние препаратов на рост и развитие инфузорий Tetrahymena pyriformis. Добавка препаратов к основному субстрату в низких дозах стимулировала усвоение его питательных составляющих, что совпадает с биологической активностью компонентов препарата.

Таким образом, «Нуклеатин» можно рекомендовать как общеукрепляющее средство, обеспечивающее интенсификацию внутриклеточного метаболизма как отдельных систем, так и всего организма в целом, и активно влияющее на общие и местные механизмы его регуляции.

1. Абрамова Ж.И., Оксенгендлер Г.И. Человек и противоокислительные вещества. Л.: Наука, 1985. - 229 с.

2. А.С. 1804852 SU. Способ лечения лимфогрануломатоза: / Ильяшенко В.В., Сусулева Н.А., Махонова Л.Н., Вайнберг Ю.П., Шагалов Л.Д., Фетисова Н.И.- Заявл. 13.05.94. Опубл. 10.03.96. Бюл. № 7.

3. Белоус A.M., Годин В.П., Панков Е.Я. Экзогенные нуклеиновые кислоты и восстановительные процессы. М.: Медицина. - 1974. - 200 с.

4. Бердышев Г.Д. Нуклеазы. Биологическая роль и практическое использование. Киев: Наукова Думка. - 129 с.

5. Беседнова Н.Н., Эпштейн Л.М. ДНК. Владивосток: ТИНРО-центр. -2002. 39 с.

6. Буш Г. Гистоны и другие ядерные белки. М.: Мир. - 1967.- 286 с.

7. Вакорина Т.И., Мензорова Н.И., Рассказов В.А. Исследование конформационной стабильности ДНКазы гепатопанкреаса краба // Биохимия. 1997. - Т. 62. - № 12. - С. 1642-1647.

8. Газиев А.И., Малахова Л.В., Куцый М.П. Пострадиационная активацияпротеиназ, ассоциированных с ядерным матриксом гепатоцитов крыс // Радиобиология. 1987. - т. 27. - С. 166-170.

9. Гафуров Ю.М. Дезоксирибонуклеазы, Владивосток: Дальнаука. 1999.230 с.

10. Гафуров Ю.М., Терентьев JI.JL, Рассказов В.А. Выделение и некоторые свойства АТФ-зависимой ДНКазы из эмбрионов морского ежа Strongylocentrotus intermedius. II Биохимия. 1979. - Т. 44. - № 6. - С.996 -1004.

11. Государственная фармокопея СССР. М.: Медицина .- 1987. XI издание, вып. 2, стр. 182.

12. Грачева И.М., Грачев Ю.П., Мосичев М.С., Борисенко Е.Г., Богатков С.В., Гернет М.В. Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов. М.: Легкая и пищевая промышленность. 1982. - 239 с.

13. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. -М.:Мир. 1982: В 3 т./Т. 2. - 805 с.

14. Дэвидсон Дж. Биохимия нуклеиновых кислот. М.: Мир. - 1968. - 333 с.

15. Заленский А.О., Буххольц П., Ибрагимов Р.Х. Сравнительное исследование протаминов лососевых рыб // Цитология. 1980. - Т. 22. - №6.1. С. 727-729.

16. Земскова A.M. Рибонуклеиновая кислота. М.: Наука. - 1997. - 251 с,

17. Зенгер В. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот. -М.: Мир. 1987. - 584 с.

18. Игнатьев А.Д., Исаев М.К., Долгов В.А., Шабий В.Я., Нелюбин В.П. Модификация метода биологической оценки пищевых продуктов с помощью реснитчатой инфузории тетрахимена пириформис // Вопросы питания. -1980.-№ 1,-С. 70-71.

19. Исаева И.В., Ковалева С.В., Патрики Е.В., Сеничева Н.А., Плетень А.П., Прохоров Б.С., Плохой В.И. Физико-химические свойства и антигепариновая активность протаминов лососевых и осетровых рыб // Хим. Фарм. Журн. -1989.-Т. 23.-№6.-С. 686-691.

20. Каверзнева Е.Д. Стандартный метод определения протеолитической активности для комплексных препаратов протеаз // Прикладная биохимия и микробиология. 1971. Т. 7. - № 2. -С. 225-228.

21. Каплина Э.Н. Некоторые итоги клинического применения препарата Деринат с 1976 по 2000 г. // Использование препарата Деринат в различных областях медицины: Тез. докл. I Всероссийской конф. Москва. -2000 г. С. 3 - 6.

22. Карклиня В.А., Бирска И.А., Лимаренко Ю.А Количественное определение нуклеиновых кислот в молоках лососевых различными методами // Химия природных соединений. 1989. - Т. 1. - С. 122-126.

23. Касьяненко Ю.И., Ковалева Ю.В., Эпштейн Л.М., АртюковА.А. Получение и свойства производных ДНК из молок лососевых // Изв. ТИНРО-центра. -1997. -Т. 120. -С. 37 43.

24. Касьяненко Ю.И., Пивненко Т.Н. Сравнительные физико-химические характеристики низкомолекулярной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из морских гидробионтов // Изв. ТИНРО-центра. -1999.- Т. 125. -С.152-164.

25. Колодзейская М.В., Пивненко Т.Н. Трипсин-, химотрипсиноподобные протеиназы рыб // Укр. биохим. журн. 1988. - Т. 60,. - №. 4. - С. 103-117.

26. Корниш-Боуден. Основы ферментативной кинетики. М.: Мир.,.- 1979.280 с.

27. Кошланд Д.Е. Регуляция ферментативной активности и путей метаболизма // В кн.: Перспективы биохимических исследований. М.: Мир. - 1987.-С. 82-91.

28. Куцый М.П., Кузнецова Е.А., Газиев А.И. Участие протеаз в апоптозе // Биохимия.- 1999. Т. 64. - № 2. - С. 149-163.

29. Лебедева Л.Г., Александрова С.С., Банаскьян А.Г., Вотрин И.И. Характеристика ядерных эндо- ДНКаз печени крыс по молекулярной массе икатионной зависимости // Биохимия. -1995. -Т. 60. № 5. - С. 798 - 804.

30. Лобарева Л.С., Денисов Л.Н., Якушева О.Е. Витамины антиоксидантного действия и ревматические заболевания // Вопр. Питания. -1995. №4.- С. 24-29.

31. Машковский М.Д. Лекарственные средства: Пособие для врачей: В 2 т./ 13-е издание, новое Харьков: Торсинг. - 1997. - Т.2 . - 590 с.

32. Мензорова Н.И., Маркова А.В., Рассказов В.А. Высокостабильная Са, Mg-зависимая ДНКаза из гепатопанкреаса краба // Биохимия. Т.59. - 1994. -№ 3. - С.449-456.

33. Мензорова Н. И., Зинатулин Р.Ф., Фаворов В. В., Рассказов В.А. Выделение и исследование свойств Са, Mg-зависимой эндонуклеазы из гепатопанкреаса краба Paralithodes camtschatica. // Биохимия. Т. 58. - 1993. -№5.-С. 681 - 691.

34. Мецлер Д. Биохимия. М.: «Мир». - 1980: В 3 т./ Т. 2. - 606 с.

35. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Бердутина А.В. Получение и очистка белковых гидролизатов // Прикл. биохим. и микробиол.-2000. Т.36. - № 4. -С. 371 -379.

36. Нечаевский Ю.В., Иванов В.А. ДНК-аза II в сперматозоидах вьюнов (Misgurnus fossilis L.) // Биохимия. 1999. - Т. 64. - № 5. - С. 587-593.

37. Номенклатура ферментов. Рекомендации (1972 г) Международного биохимического Союза по номенклатуре и классификации ферментов, а также по единицам ферментов и символам кинетики ферментативныхреакций. / Под. ред. Браунштейна А.Е. М: Наука. 1979.

38. Оруджев Я.С., Ростовщиков В.В. Применение медиаторных аминокислот (таурин) во внебольничной геронтологической практике // Социальная и клиническая психиатрия. 1998. - № 3. - С. 78-81.

39. Остерман JI.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: Наука. 1981. - 286 с.

40. Патент РФ № 2005724. Способ производства натриевой соли ДНК из животного сырья и установка для его осуществления / Вайнберг Ю.П., Каплина Э.Н., Каплин В.Ю., Ладыгин А.Е. Заявл. 29.04.93. - Опубл. 15.01.94.

41. Патент СССР № 915446 Способ получения ДНК из молок рыб / Гаймула М.А., Кална В.Х., Микстайс У.Я., Эпштейн Л.М. Заявл. 10.10.80; Опубл. 01.07.91.

42. Патент РФ № 2034028. Способ получения протеолитического комплекса / Пивненко Т.Н., Жданюк В.М., Эпштейн Л.М. 1992. - БИ № м.

43. Патент РФ № 2055482. Способ получения белково-нуклеинового гидролизата / Гафуров Ю.М., Козловская Э.П., Рассказов В.А., Галкин В.В., Артюков А.А., Козловский А.С., Арзамасцев Е.В.- Заявл. 13.05.94. Опубл. 10.03.96.

44. Патент РФ № 2063228. Способ лечения гемопоэза / Вайнберг Ю.П., Каплина Э.Н. Опубл. 04.02.93.

45. Пат. РФ № 2072855. Способ получения натриевой соли ДНК из молокрыб: / Урманов И.Х., Серпинский О.И., Татьков С.И., Сиволобова Г.Ф., Кочнева Г.В., Гражданцева А.А., Иваницкий B.JL, Иваницкий С.Б. Заявл. 21.09.95.-Опубл. 10.02.97.

46. Патент РФ № 95103961. Лечение хронической ишемической болезни сердца / Литасова Е.Е., Караськов A.M., Семенов И.И., Горбатых Ю.Н.-Опубл. 20.03.95.

47. Пашук Л.К., Апрышко Г.Н., Трещалина Е.М. Препараты ДНК как потенциальные терапевтические средства // Хим.- фармац. ж. 1995. - Т.29. -№ 6. - С. 61-64.

48. Пивненко Т.Н., Позднякова Ю.М., Давидович В.В. Получение и характеристика белковых гидролизатов с использованием ферментных препаратов различной специфичности // Изв. ТИНРО. Т. 120. 1997. С. 2331.

49. Пивненко Т.Н Трипсиноподобные протеазы дальневосточных лососей // Дис. .канд. биол. наук Киев. - Инст. Биохимии им. Палладина. -1986. -176 с.

50. Пивненко Т.Н., Эпштейн Л.М., Колодзейская М.В., Кудинов С.А. Получение и свойства трипсина из пилорических придатков тихоокеанского лосося // Прикладная биохимия и микробиология. 1989. - Т. 25, №. 4. - С. 490 - 497.

51. Рыбин В.К., Григорова Л.В., Матросович Т.Ю., Величко Т.И., Макаров Н.В. Использование красителя кумасси G-250 для определенияантигепариновой активности протаминов (стелинов А и В) in vitro // Хим. Фарм. Журн. № 10. - 1997.

52. Рыкова Е.Ю., Лактионов П.П., Власов В.В. Активирующее влияние ДНК на иммунную систему // Успехи современной биологии. Т. 121. № 2. -2001. - С. 160-171.

53. Сахаров И.Ю., Литвин Ф.Е. Субстратная специфичность коллагенолитических протеаз из гепатопанкреаса камчатского краба // Биохимия. 1992. - Т. 57. -№ 1. - С. 61-67.

54. Сибирцев Ю.Т., Мензорова Н.И., Шастина В.В., Рассказов В.А. Множественность ДНКаз в спермиях морского ежа Strongylocentrotus intermedius // Доклады академии наук. 2001. - Т. 376, № 1. - С. 117-119.

55. Сибирцев Ю.Т., Рассказов В.А. Влияние ионной силы на оптимум рН, специфичность и механизм действия кислой ДНК-азы из зрелых яйцеклкеток морского ежа Strongylocentrotus intermedius. // Биохимия. 2000 - Т. 65. - № 8.- С. 1121-1129.

56. Соколова И.А., Ходарев Н.Н., Александрова С.С., Вотрин И.И. Выделение и исследование Ca/Mg-зависимой эндонуклеазы из клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека // Биохимия. Т. 53. 1988. - № 7. - С. 1163-1173.

57. Солдатенков В.А., Денисенко М.Ф., Алферова Т.М., Филлипович И.В. Деградация хроматина при гибели лимфоцитов тимуса, индуцированной радиацией или дексаметазоном: необходимость этапа предварительногопротеолиза//Радиобиология. Т. 31. - 1991. - С. 180-187.

58. Торкунов П.А., Сапронов Н.С. Кардиопротекторное действие таурина // Экспериментальная и клиническая фармакология. 1997. - Т. 60. - №5. - С. 72-77.

59. ТУ № 00479942-002-94. Протомегатерин (металлопротеиназа). Технические условия на опытную партию.

60. Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов. М.: Мир 1980.432 с.

61. Филатов М.В., Варфоломеева Е.Ю. Изучение упаковки хроматина в ядрах клеток млекопитающих методом прочной цитометрии. // Цитология. -Т. 32. 1990. - № 4. - С. 343-350.

62. Филимонова М.Н, Губская В.П., Нуретдинов И.А., Бенедик М.Дж., Богомольная Л.М., Андреева М.А., Лещинская И.Б. Изоформы нуклеазы Serratia marcescens. Роль ионов Mg в механизме гидролиза. // Биохимия. -1997.-Т.62,№9.-С. 1148-1154.

63. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А. СПИД. М.: Народная академия культуры и общечеловеческих ценностей. - 1992. - 243 с.

64. Шапиро Д.К. Практикум по биологической химии. Минск: Высшая школа, 1976. 285 с.

65. Эпштейн J1.M., Пивненко Т.Н., Позднякова Ю.М., Гуляков М.Б. Новые направления в технологии переработки гидробионтов // Перспективы развития рыбохозяйственного комплекса России XXI век: Тез. научно-практической конференции. - Москва. - июнь. - 2002.

66. Bendigs S., Salzer U., Lipford G.B., Wagner H., Heeg K. Induction of NK Activity in Murine and Human cells by CpG Motifs in oligodeoxynucleotides and Bacterial DNA // Europ. J. Immonol. 1999. V. 29. № 4. P. 1209.

67. Bendjennat M., Blanchard A., Loutfi M., Montagnier L., Bahraoui E. Purification and Characterization of Mycoplasma penetrans Ca2+, Mg2+-dependent Endonuclease 11 Journal of Bacteriology. - 1997. № 4- P. 2210-2220.

68. Bonner J., T'so P.O.P. The Nucleohistones. San Francisco. Holden Hay. -1964.

69. Branden C., Tooze J. Introduction to protein structure. New York, London; Garland Publ. Inc. - 1991.

70. Cordonnier C., Bernardi Giorgio. A comparative study of acid deoxyribonucleases extracted from different tissues and species. // Canadian Journal of biochemistry. V. 46. - 1968. - P. 989 - 995.

71. Chou M.-Y., Liao T.-H. Shrimp hepatopancreatic deoxyribonuclease -purification and characterization as well as comparison with bovine pancreatic deoxyribonuclease // Biochim. Biophys. Acta, 1990. V.1036, № 2, P. 95-100.

72. Felix К., Fischer H., Krekels A. Protamines and nucleoprotamines. // Progr. Boiphys. Chem. 1956. - V. 6.- № 2.

73. Folch J., Less M., Sloane-Stanley G.H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues // J. Biol. Chem. 1957. - V. 226. -№ 1. - P. 497-509.

74. Hashida Т., Tanaka Y., Matsunami N., Yoshihara K., Kamiya Т., Tanigawa Y., Koide S.S. Purification and properties of bull seminal plasma Ca, Mg -dependent endonuclease. // The Journal of Biological Chemistry. 1982. -V. 257. -№21. -P. 13114-13119.

75. Hummel B.C.W. A modified spectrophotometric determination of chymotrypsin, trypsin and trombine // Can. J. Biochem. Physiol. 1959. - V. 37. -№ 12. - P. 1393-1399.

76. Johnson P. H., Laskowski M. Sr. Mung Bean Nuclease I // J. Biol. Chem. -1970. -V.245. № 4.- P. 891.

77. Kartha G.,Bdlo J., Harker D. Tertiary Structure of Ribonuclease // Nature1.ndon). 1967,- V.213.- № 5079. - P. 862.

78. Koshland D.E., Goldbeter A., Stock J.B. Amplification and adaptation in regulatory and sensory systems // Science. 1982. - V. 217. - № 4556. - P. 220225.

79. Mahmoud M. Physicochemical and functional properties of protein hidrolysates in nutritional product // Food Technol. 1994. V. 48. № 10. - P. 8995.

80. Mcllwain H. Poiybasic and polyacidic substances or aggregates and the excitability of cerebral tissues, electrically stimulated in vitro. // Biochem. J. -1963. -V. 90. P. 442-448.

81. Muggleton P., MacLaren J.G., Dyke W.J.C. Effect of protamine sulfate on experimental tumours in mice. // Lancet. 1964. - № 1. - P. 409-410.

82. Nakamura M., Sakaki Y., Watanabe N., Takagi Y. Purification and characterization of the Ca, Mg- dependent endodeoxyribonuclease from calf thymus chromatin. // J. Biochem. V. 89. - 1981. - P 143 -152.

83. Rasskazov V.A., Anisimov M.M., Berdyshev G. D. Some properties and specificity of acid doexyribonuclease from plaice liver // Сотр.Biochem. Physiol. 1968. -V. 26.-P. 639-649.

84. Rasskazov V.A., Anisimov M.M., Berdyshev G. D. Some properties and specificity of deoxyribonucleases from marine invertebrates and fishes // Comp.Biochem. Physiol.- 1975. -V. 51.- P. 343-347.

85. Shwert G. W. and Takenaka Y. A spectrophotometric determination of trypsin and chymotrypsin // Biochem. Biophys. Acta. 1955. - V. 16. № 4. - P. 570-575.

86. Stollar B.D. // CRC Crit. Rev. Biochem. 1986. V. 20. № 1. P. 1.

87. Tomlinson R.V., Tener G.M. The use of urea to eliminate the secondary binding forces in ion exchange chromatography of polynucleotides // J. Amer. Chem. Soc. -1962. -V. 84. -№ 15.- P. 2644-2645.

88. Yamamoto M. Purification and some properties of an acid deoxyribonuclease from testes of Chinook salmon ONCORHYNCHUS TSHA WYTSCHA //Biochimica et Biophysica Acta.-V. 228. 1971. - P. 95-104

89. Zhang D., Pasternack M.S., Beresford P.J., Wagner L., Greenberg A.H., Lieberman J. Induction of Rapid Histone Degradation by the Cytotoxic T1.mphocyte Protease Granzyme A // J.Biol.Chem. 2001, 276, № 5, P. 36833690