автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Совершенствование технологии пивного сусла на основе активации гидролитических ферментных препаратов микробного происхождения

На правах рукописи

ЛЫСЮК ВАСИЛИЙ МИХАЙЛОВИЧ

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ПИВНОГО СУСЛА НА ОСНОВЕ АКТИВАЦИИ ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ МИКРОБНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

Специальность: 05.18.07-Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

2 пол 2011

005003332

Москва-2011

005003332

Работа выполнена на кафедре «Процессы ферментации и промышленного биокатализа» ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств».

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор

Гернет Марина Васильевна

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор

Иванова Людмила Афанасьевна

кандидат технических наук, Кобелев Константин Викторович Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет технологий и управления имени К.Г. Разумовского»

Защита состоится/^ декабря 2011 года в 11 — часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.148.04 при ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» по адресу: 125080, г. Москва, Волоколамское шоссе, 11, ауд. 201

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «МГУПП». Автореферат отправлен по адресу referat_vak@mon.gov.ru для размещения в сети Интернет Министерством образования и науки РФ и размещен на сайте www.mgupp.ru.

Отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенный печатью учреждения, просим направлять по адресу: 125080, г.Москва, Волоколамское шоссе, 11, МГУ 1111, ученому секретарю Совета.

Автореферат разослан «>%> кед 2011 года

Ученый секретарь Совета

к.т.н. Тимофеев Д.В.

Ш^зг ха^ггарнетака ¡ааййтьг

Актгуальпастк темы. Пиво является популярным напитком во всем мире, з т. ч. к е России. Несмотря на то, что в последние годы темпы роста его производства несколько скизилясь, пиво остается продуктом повышенного потребительского спроса. Рагвитвз тпюварешюй отрасли направлено кг интенсификацию техколсжеелсого процесса, повышение качества готовой продукции и снижение затрат на se кроизводство.

Производство пина - совокупность сложных процессов, теско связанных ?«жду собой. Это биохимические превращения компонентов зерна при сслодоращеаия. многообразие ферментативные превращения при получения сусла, метаболизм дрожжей при брожении и дображивай®.

Ка основании углубленны;: исследований с биохимических реакциях, протекающих па стадии солодорицеккя к получения гшзного сусла, обоснована целесообразность применений з произведет пива гидролитических ферментных препаратоа(ФП) аикробкого происхождения, как компенсация недостаточной ферментативной активности солодоз пониженного качества и при частичной замене солода на более дешевое, чем солод, несоложеное сырье.

С учетом относительно высокой стоимости ФП актуальными являются исследования, направленные ка повышение эффективности их применения з технологии пивного сусла на основе разработки способов активации ФП и повышения их функциональной к операционной стабильности, внедрение которых позволит уменьшить дозировку ферментных препаратов, интенсифицировать технологический процесс при увеличении выхода экстракта к будет способствовать более полному использованию сырья.

Цель а задаче иесяедошнош.

Цель. работы: научное обоснование, разработка а применение способов активации микробных ферментных препаратов (на примере ФП Laminex BG пшканазвого действия, амилазы Альфалад БИ и культзкзимвой композиция иг их оегтозе) для интенсификации процессов бжжаталяза в технологии пивного сусла.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

s lia основании кинетических исследований обосновать выбор С7-алкилоксибензола (С7-АОБ), относящегося к природным структурным модификаторам белков, для применения s качестве активатора промышленных ФП микробного происхождения.

о Исследовать влияние С7-АОБ на ферментативную активность (ФА) ФП Ьагшпех ВС, его функциональную и операционную стабильность.

о Разработать условия предварительной активации ФП Ьаттех ВО в присутствии С7-АОБ для интенсификации биокаталитических процессов в технологии пивного сусла.

© Обосновать целесообразность формирования мультэнзимной композиции (МЭК) на основе активированных ФП Ьагшпех ВО и Альфалад БН и провести оптимизацию состава МЭК с использованием униформ -ротатабельных планов эксперимента.

э Дать сравнительную оценку физико-химических показателей качества пивного сусла, полученного по традиционной технологии и при использовании на стадии затирания активированных ФП.

© Провести исследования для характеристики пивного сусла по содержанию белка и его фракционного состава.

0 Провести опытно-промышленную апробацию применения разработанных способов активации ФП при получении пивного сусла для оценки физико-химических показателей в сравнении с традиционной технологией.

© Разработать принципиальную технологическую схему и технологические рекомендации по применению предварительной активации исследованных гидролитических ФП для интенсификации технологии пивного сусла из солода и несоложеных материалов.

Научная новизна.

На основании исследования кинетики ферментативной реакции (на примере гидролиза целлюлозы ФП Ьагшпех ВО) установлено, что С7-АОБ, влияет на характер зависимости начальной скорости реакции (У0) от концентрации фермента [Е] и субстрата [8], способствует увеличению максимальной скорости ферментативной реакции (Утах) более, чем в 2 раза, и не изменяет при этом другой кинетический параметр ферментативного процесса - константу Михаэлиса (Кт), что позволяет интерпретировать взаимодействие С7-АОБ - фермент, как неконкурентную активацию, вследствие конформационных изменений белка фермента.

Доказано эффективное стабилизирующее действие С7-АОБ на гидролитические ФП микробного происхождения в широком диапазоне рН и термературы биокатализа и показано увеличение рН- и термостабильности ФП

при сохранении эффекта активации в процессе биокатализа.

4

Выявлены условия предварительной инкубации промышленных ФП микробного происхождения (температура, продолжительность, концентрация С7-АОБ) для повышения их функциональной активности при гидролизе крахмальных и некрахмальных полисахаридов при получении пивного сусла.

Исследованиями с использованием метода гель-фильтрации показано, что применение на стадии затирания зернопродуктов активированной МЭК приводит к изменению соотношения белковых фракций в сусле: уменьшается содержание фракции высокомолекулярных белков с молекулярной массой > 100000, увеличивается доля фракции с молекулярной массой 15000 - 37000, что является существенным фактором для повышения коллоидной стабильности пива и его пеностойкости.

Практическая значимость

На основании проведенных исследований разработан новый подход к интенсификации процесса получения пивного сусла из солода и несоложеного сырья, заключающийся в использовании на стадии затирания предварительно активированных гидролитических ферментных препаратов цитолитического и амилазного действия.

Разработаны способы активации ФП с использованием Ст-АОБ в качестве активатора и стабилизатора ФП, приводящие к увеличению их каталитической активности в 1,7 (ФП Альфалад БН) и 3,8 (ФП Ьапипех ВО) раза.

Применение разработанных способов предварительной активации ФП при их раздельном использовании приводит к сокращению продолжительности осахаривания затора на 30 - 45 %, увеличению выхода экстракта на 4,5 - 11 %, скорости фильтрования в 1,2 - 1,3 раза (в зависимости от качества солода).

Экспериментально обоснована возможность замены 30 % солода (для солода пониженного качества) и 40 % (для солода хорошего качества) на несоложеный ячмень при использовании МЭК на основе активированных ФП Ьаттех ВС и Альфалад БН на стадии затирания зернопродуктов. С использованием униформ-ротатабельных планов эсперимента проведена оптимизация дозировок ФП в МЭК для сокращения продолжительности осахаривания затора и получения сусла с физико-химическими и органолептическими показателями, соответствующими стандарту, и обеспечения выхода экстракта 81 - 84 % . Показано, что проведение предварительной активации МЭК в присутствии С7-АОБ позволяет снизить в 2 раза расход ФП на затирание зернопродуктов при получении пивного сусла.

Результаты лабораторных исследований подтверждены при опытно-промышленной апробации в условиях ООО НТЦ «Солодовые напитки». Показано, что пиво из производственного сусла, полученного с использованием активированных ФП, соответствует (а по ряду показателей превосходит) требованиям ГОСТ к светлому пиву.

Разработаны принципиальная технологическая схема и технологические рекомендации по применению предварительной активации в присутствии С7-АОБ ФП Ьаттех ВС и Альфалад БН для интенсификации технологии пивного сусла из солода и несоложеных материалов. Расчетный экономический эффект составляет 3,68 млн. руб. на 1 млн. дал пива в год.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 3-ей Всероссийской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Пищевые продукты и здоровье человека», секция «Пищевая химия, биотехнология» (Кемерово, 2010); 3-ей межведомственной научно-практической конференции «Товароведение, экспертиза и технология продовольственных товаров» (Москва, 2010); на «Инновационном форуме пищевых технологий», секция «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства их реализации. Эффективное использование ресурсов отрасли» (Москва, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ, в том числе 3 - в журналах по утвержденному списку ВАК.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, списка литературы и приложений. Основное содержание диссертационной работы изложено на 151 листах машинописного текста, проиллюстрировано 36 рисунками и 41 таблицами. Список литературы включает 194 источника отечественных и зарубежных авторов.

1. Обзор литературы.

Представлены современные представления о строении, свойствах и превращениях полисахаридов зернопродуктов при получении пивного сусла, проведен анализ опубликованных данных о роли расщепления гемицеллюлоз и гумми - веществ под действием ферментов ячменного солода и цитолитических ферментных препаратов микробного происхождения в технологии сусла и пива. Рассмотрены научные аспекты активации ферментов и применения активации промышленных ферментных препаратов для

интенсификации биокаталитических процессов в пищевых технологиях.

6

Обсуждены результаты исследований, характеризующих биологическую активность алкилоксибензолов (АОБ), и их роль в рефляции активности ферментных белков.

2. Экспериментальная часть.

2.1. Объекты и методы исследования

В работе в качестве объектов исследования использовали: гидролитические ФП Ьагшпех ВС компании «Даниско» и Альфалад БН Ладыжинского завода ферментных препаратов «Энзим»; лабораторное и производственное сусло, полученное настойным способом затирания ячменных солодов различного качества (табл. 1) и смеси зернопродуктов (при частичной замене солода на ячмень).

Таблица 1

Характеристика зернопродуктов, ячменного солода, применяемых при получении пивного сусла.

Наименование показателя Солод (№1) Солод (№ 2) Солод (№ 3) Солод (№4)

Массовая доля влаги, % 4,0 4,5 5,2 4,5

Экстрактивность, % 73.4 78,2 73,2 79,5

Продолжительность осахаривания, мин 18 22 24 15

В качестве структурного модификатора ферментов, входящих в Ьагшлсх Вв и Альфалад БН, был выбран С7-АОБ, относящийся к природным ауторегуляторным факторам развития микроорганизмов и растений. В работе использовали аналог природного С7-АОБ, полученный ООО «Новые технологии» РХТУ им Д.И. Менделеева совместно с институтом микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.

Целлюлозолитическую активность ФП (АФБ) определяли по количеству редуцирующих веществ (РВ), образующихся при гидролизе фильтровальной бумаги (ФБ), активность эндоглюканазы - вискозиметрическим методом, ксиланазную активность - по определению скорости ферментативной реакции по количеству образовавшихся РВ в результате гидролиза ксилана, амштолитическую активность (АС) - по методу Рухлядевой и Горячевой.

Кинетику действия ферментного препарата Ьаттех ВО изучали по гидролизу некрахмальных полисахаридов модельного субстрата (ФБ). Начальную скорость ферментативной реакции (У0) в каждом варианте гидролиза определяли как тангенс угла наклона касательной, проведенной из

начала координат к кинетическим кривым накопления РВ в начальный период реакции. Утах и Кт определяли на основании представления зависимости У0 от [8] в координатах Лайнуивера -Берка.

Определение продолжительности осахаривания (тосах) затора зернопродуктов проводили по йодной пробе, содержание экстрактивных веществ в сусле - пикнометрическим методом, на основании чего рассчитывали выход экстракта по соответствующей формуле. Анализ пивного сусла осуществляли в соответствии с ГОСТ 29294-92 и химико-технологическим контролем производства солода и пива.

Определение содержания общего азота проводили методом Кьельдаля, аминного азота методом формольного титрования с применением смешанных индикаторов (фенолфталеина и бромтимола синего).

Для исследования фракционного состава белков и продуктов протеолиза охмеленного сусла использовали метод гель-фильтрации, основанный на разделении смеси молекул по их молекулярной массе.

РВ определяли методом Шомодьи - Нельсона и колориметрически по реакции с 3,5-динитросалициловой кислотой.

Обработку экспериментальных данных выполняли с использованием методов математической статистики. Результаты исследований в виде средних арифметических представлены на рисунках и оформлены в виде таблиц.

Проведение экспериментов по выбору оптимальных соотношений ферментов в МЭК проводили в соответствии с композиционным униформ ротатабельным планом с последующей математической обработкой с использованием метода корреляционно-регрессионного анализа и пакета программ «Ма1з1аЬ> и «^аикиса 6,0».

2.2. Исследование условий активации ферментного препарата Ьаш'шех ВС в присутствии С7-АОБ.

2.2.1. Влияние С7-АОБ на кинетику реакции гидролиза некрахмальныж полисахаридов ФН Ьапипех

На основании опубликованных в литературе данных по активации и стабилизации ферментных белков животного и растительного происхождения (лизоцина яичного белка, трипсина свиной поджелудочной железы, а и Р-амилазы ячменя) природными химическими шаперенами, относящимися к классу алкилрезорцинов - алкилоксибензолов (АОБ), были проведены

О 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 [Е]104, см3/см3 гмдролмзата

Рис. 1. Зависимость У0= [[В]: \ - контроль; 2 - гидролиз в присутствии С7-АОБ.

исследования по обоснованию выбора С7-АОБ в качестве активатора гидролитических ферментных препаратов микробного происхождения,

Нами было исследовано влияние С7-АОБ на кинетику ферментативной реакции на примере гидролиза ФБ ферментным препаратом Еапнпех ВО.

В результате проведенных исследований были получены кинетические кривые накопления РВ в процессе ферментативного гидролиза при различных концентрациях фермента [Е], субстрата [8] и С7-АОБ, определены начальные скорости ферментативной реакции У0 при различных условиях гидролиза и получены зависимости У0 от концентрации С7- АОБ, от [Е] и [8] (в присутствии и в отсутствие С7-АОБ).

Анализ полученных зависимостей показал, С7-АОБ выполняет роль активатора ФП Ьаттех ВС: проведение гидролиза

-4 0 4 8 12 16 20 24 28 В ^

увеличивает начальную

1/[5] скорость реакции более,

б чем в 2 раза (рис. 1; 2а).

Рис. 2. Зависимость У0=([8] (а); "У0=|[8] в координатах Лайнуивера - Берка (б): 1 - контроль; 2 -ферментативный гидролиз в присутствии СгАОБ.

9

х

3

со 5 о

25 о.

о

>

10

4 2 0

]

х

/

0 0,1

0,2 [5],мг/см

0,3 з

0,4 0,5

О

>

На основании представления экспериментальных данных по зависимости У0 от [8] в координатах Лайнуивера - Берка (рис. 26), определены кинетические параметры - максимальная скорость ферментативной реакции (¥тах ) и кажущаяся константа Михаэлиса (Кт). Установлено, что С7-АОБ не влияет на величину Кт (Кт = 0,25), но существенно увеличивает Утах (0,0167) относительно контроля (Утах = 0,0071). Это является косвенным подтверждением того, что С7-АОБ вызывает определенные конформационные изменения в молекуле белка фермента, следствием чего является увеличение ФА, и это позволяет интерпретировать взаимодействие С7-АОБ - фермент как неконкурентную активацию.

2.2.2. Исследование влияния тепловой обработки ш СУалкилоксйбензвла на активность ФП Ьатгаех ВС. Инкубацию 1%-ого раствора ФП в ультратермостате при температуре 45 °С, 50 °С, 60 °С, 70 °С в течение 90 мин. ФА выражали в процентах к контролю (препарат без предварительной тепловой инкубации) (рис. 3.), активность которого была принята за 100 %. Концентрацию С7-АОБ варьировали в интервале 0,05 —1,5 мг/см3. Было установлено, что проведение предикубации раствора ФП при 50 °С в течение 30 - 60 минут приводит к увеличению активности на ~ 35 - 60% (рис. 3).

Установлено, что во всем диапазоне изученных концентраций С7-АОВ оказывал активирующее действие на ФП. Максимальное увеличение ФП наблюдалось при концентрации С7-АОБ 1 мг/см3, при длительности предин-кубации 60 мин: в 2,5 раза по сравнению с активностью ФП после тепловой обработки без С7-АОБ и в 3,8 раза - по

сравнению с ФА препарата Рис.3. Влияние условий предварительной тепловой

обработки на активность ФП Ьаттех ВО.

О мин 30 мин 60 мин

Время предынкубации, мин ¡Контроль (без С7-АОБ) ЭОпыт

в контроле (ФП без прединкубации) (рис. 4). С учетом результатов кинетических исследований это можно объяснить тем, что С7-АОБ, связываясь с молекулой фермента вне активного центра, приводит к кон-формационным изменениям ферментного белка, увеличивающим доступность активного центра для ферментативной реакции.

Рис. 4. Влияние длительности прединкубации на ФА Ьаттех ВО в присутствии СгАОБ: К-контроль; О - опыт.

2.2.3. Ьатшех ВС.

Установлена стабилизирующая роль С7-АОБ при изучении термостабильности ФП (рис. 5): при прогреве растворов ФП при температурах 55 - 65 °С в течение часа (в отсутствие С7-АОБ) наблюдается существенное снижение и даже инактивация фермента; при прогреве ФП при 55 - 60 °С в при-

400 300 200 100 0

/ 2 V

/ \

■ к-- — —_ _ 1 ~ " 3

Рис. 5. Термостабильность

ФП Ьаттех ВО: 1 - в отсутствие С7-АОБ; 2 - в присутствии С7-АОБ;

3 - максимальная активность в отсутствие

с7-аоб.

15 50 55

80

85 70

¡,°С

сутствии С7-АОБ ФА выше, чем в контроле, в 2,3 - 3,8 раза, а при 65 °С - на уровне контроля. Увеличение рН-стабильности ФП было продемонстрировано проявлением повышенной активности ФП при инкубации в широком диапазоне рН (3,1-7,0).

2.2.4. Влияние Ст-АОБ иа операционную стабильность ФП Ьагашех ВС.

Для изучения влияния АОБ на оптимальные условия действия ФП Ьатшех '!(; температуру реакции гидролиза ФБ варьировали от 45 до 70 °С, а значения рН - от 3,3 до 7,0. Влияние АОБ на стабильность конформации молекул фермента оценивали по изменению рН- и температурного диапазона действия.

Анализ полученных данных показал, что операционная стабильность фермента в результате модификации его структуры Ст-АОБ проявляется в значительном расширении диапазона рабочих значений рЫ и температуры действия ФП с сохранением оптимума катализа: даже при температуре гидролиза 70 °С ФП с С7-АОБ еще достаточно активен, его активность выше, чем в контроле более, чем в 3 раза (рис. 6). Отмечено, что во всем исследованном диапазоне рН ФА выше, чем в контроле в 2,5 — 3,0 раза.

Таким образом,

2 С

300 250 200

о 150

100

50

о

2

/ \ 1

{ \ >-„..,.______*

45 50 55 60 65 Температура,°С

70

проведение прединку-бании Ьагшпех ВО в присутствии Ст~ АОБ позволяет не только активировать фермент, но и в значительной степени расширить диапазон его действия как в области рН, так и температуры, что будет способствовать более эффективному использованию ферментного препарата при получе-

Рис. 6. Влияние С7-АОБ на температурный оптимум действия препарата Ьшшпех ВО: 1 - ФП без прединкубации с С7-АОБ; 2 - ФП после прединкубации нии пивного сусла, с СгАОБ.

2.3. Разработка условий применения предварительной активации ФП Ьят'шех ВС при затирании зерноиродуктов в процессе получения пивного сусла.

Исследования проводили путем проведения лабораторного затирания настойным способом. В качестве примера в табл. 2 представлены результаты исследований при использовании солода № 1.

Таблица 2

Выбор дозировки С7-АОБ для применения активации ФП Ьаттех Вв при получении пивного сусла (солод №1)

№ п/п Вариант опыта Прод осаха олжительность ривания затора Выход экстракта Скорость фильтрования

мин % к контролю % %к контролю см'7с %к контролю

1 Контроль -1 (без ФП) 18 100 73,7 100 0,25 100

2 Контроль -2 (ФП без активации) 14 77,7 75,2 102 0,27 108

3 Концентрация С7-АОБ при прединкубации ФП, % к солоду

0,01 14 77,7 75,8 102,8 0,27 108

0,02 12 66,7 76,4 103,6 0,28 112

0,06 10 55,6 77,3 104,8 0,33 132

0,10 10 55,6 80,0 108,5 0,33 132

На основании проведенных исследований определены следующие условия применения ФГ1 Ьаттех ВО для интенсификации гидролитических процессов при получении пивного сусла: концентрация ФП - 0,3% к массе солода; условия прединкубации раствора ФП: = 50 °С; длительность прединкубации - 1 час; концентрация С7-АОБ - 0,1 % к массе солода.

Продолжительность осахаривания при этом сокращается на 45 %, выход экстракта увеличивается на 8,5 %, скорость фильтрования увеличивается более, чем на 30 %.

Полученные результаты были подтверждены при использовании других солодов, отличающихся большей продолжительностью осахаривания затора (солод № 2 и № 3) (табл. 3).

Однако при замене 30 % солода на ячмень такой показатель, как выход экстракта (ВЭ) существенно ухудшался. Это указывает на то, что активация ФП

Ьагшпех ВО не может компенсировать полностью уменьшение количества солодовых ферментов.

Таблица 3

Результаты использования активированного ФП при затирании солодов различного качества.

Показатели Вариант опыта

Солод № 2 Солод № 3

Контроль Затирание с активированным ФП Контроль Затирание с активированным ФП

Продолжительность осахаривания, мин 22 15 24 15

Выход экстракта, % 78,3 82,5 73,6 81,8

Скорость фильтрования, см3/с 0,25 0,32 0,25 0,29

РН 5,5 5,60 5,60 5,60

Кислотность 0,8 0,70 0,70 0,70

В этой связи были проведены исследования по формированию и активации мультэнзимной композиции (МЭК) с использованием С7-АОБ для интенсификации процесса получения пивного сусла из солодов, различающихся показателями качества, а также при 15, 30 и 40%-ой замене солода на несоложеный ячмень.

2.4. Создание МЭК на основе активированных ФП Ьагшпех ВС и Альфалад БИ для интенсификации биокаталитических процессов при получении пивного сусла из солода и несоложеных материалов.

2.4.1. Влияние прединкубации ФП Альфалад БН в присутствии С7-АОБ на ферментативную активность и операционную стабильность ФП.

Нами было установлено, что проведение прединкубации ФП Альфалад БН (1° = 50 °С, концентрация СгАОБ - 1 мг/см3, продолжительность прединкубации 1 час) способствует увеличению ФА препарата на ~ 70 %. Температурный оптимум действия фермента при этом не изменяется, но в присутствии С7-АОБ существенно увеличивается операционная стабильность ФП, что проявляется в сохранении повышенной ФА в условиях ферментативного гидролиза в широком диапазоне температур (от 40 °С до 70 °С)(рис. 7).

300 2 250 | 200 § 150 £ 100 50

о

Рис. 7. Влияние С7-АОБ на температурный

оптимум действия

препарата ФП Альфалад БН: 2 - ФП без прединкубации с С7-АОБ; 2 - ФП после прединкубации с С7-АОБ.

Установлено, что проведение предварительной активации ФП Альфалад БН в присутствии С7~АОВ способствует интенсификации последующего ферментного гидролиза крахмала (рис. 8).

Рис. 8. Накопление РВ при гидролизе растворимого картофельного крахмала ФГ1 Альфалад БН: 1 -прединкубация ФП в присутствии С7- АОБ; 2 -контроль

10 20 30 40 50 60 Время гидролиза, мин

2.4,2. Применение активированного ©13 Альфалад БН ш стадии затирания зернопродуктов при получении пивного сусла.

Было установлено, что проведение предварительной инкубации ФП Альфалад БН при тех же условиях, что и в случае Ьаштех ВО, способствует повышению эффективности действия ФП Альфалад БН при получении пивного сусла из солода различного качества. Продолжительность осахаривания сокращается на 40 - 50 %, выход экстракта увеличивается на 7 - 10 %, скорость фильтрования на 8 - )6 % по отношению к контролю (затирание без ФП) и соответственно на 25 - 33 %, 4,5 - 5,0 % и 4 - 11 % по отношению к варианту

затирания солода с неактивированным ФП. Однако, применение ФП Альфалад БН при 30%-ой замене солода на ячмень не показало положительного эффекта по такому показателю, как ВЭ, который составил по отношению к контролю 88 -92%.

2.4.3. Сравнительная характеристика фракционного состава белков пивного сусла, полученного с использованием при затирании ФП Ьаннпех Вв и Альфалад БН.

В процессе получения пивного сусла имеет место не только расщепление крахмала и некрахмальных полисахаридов, но и расщепление белков с образованием средне и низкомолекулярных белков и полипептидов, имеющее значение для пеностойкости и коллоидной стабильности пива, и свободных аминокислот, необходимых для питания дрожжей при брожении. Считается, что для пенообразования имеет значение содержание белка с молекулярной массой 10000 - 60000, а высокомолекулярные белки с молекулярной массой более 60000 влияют на появление в пиве мути.

В свете этого, при модификации традиционной технологии пивного сусла (в частности, за счет применения ФП микробного происхождения и несоложенош сырья) необходимо проверить влияние этой модификации на содержание общего и аминного азота и фракционный состав белков сусла. С этой целью было получено охмеленное сусло без использования ФП (контроль) и с использованием активированных препаратов Ьагшпех ВО и Альфалад БН.

Для исследования фракционного состава белков и продуктов протеолиза охмеленного сусла использовали метод гель-фильтрации на сефадексе С-75.

По полученным профилям элюции белков сусла было сделано заключение, что белки сусла можно разделить на три основные фракции. Анализ распределения водорастворимых белков сусла по фракциям (табл. 4) показывает, что незначительную часть анализируемых белков составляют высокомолекулярные белки. Фракция II включает белки и пептиды с молекулярной массой 37000 - 15000. Фракция III, выходящая с общим объемом колонки, включает аминокислоты, средне- и низкомолекулярные пептиды, фенольные соединения и другие низко-молекулярные продукты.

Сравнение данных по фракционированию белков сусла, полученного при

затирании солода с ФП Ьагшпех ВО, с контролем показало, что соотношение

белковых фракций I, II и III изменилось незначительно. В сусле, полученном с

Альфалад, было отмечено уменьшение фракции II. Однако, уменьшение при

этом в белках сусла доли высокомолекулярных белков и увеличение доли

16

фракции III по сравнению с контролем в комплексе с полученными результатами исследований по влиянию ФП Альфалад БН на тоих. при 30%-ой замене солода на несоложеный ячмень говорит в пользу формирования МЭК на основе этих ФП для интенсификации процесса получения пивного сусла из солодов пониженного качества и несоложеных материалов.

Таблица 4

Фракционирование водорастворимых белков охмеленного сусла на сефадексе С-75

Фракции М. м., Да % от общего количества

Контроль Опыт с Ьаттех ВО Опыт с Альфалад БН

1 >100000 9,9 9,0 9,0

II 15000-37000 15,7 14,5 9,2

III <12500 74,4 76,5 81,8

2.4.4. Оптимизация состава и применение МЭК на основе исследуемых ферментных препаратов при получении пивного сусла.

Формирование МЭК на основе активированных ФП Ьатшех ВО и Альфалад БН проводили методом математического планирования на основе униформ - ротатабельных планов.

Критериями для оценки эффективности действия МЭК являлись ВЭ и

^осах*

В качестве факторов, влияющих на тосах и ВЭ были выбраны: х,-дозировка ФП Ьаттех ВСх, х2- дозировка ФП Альфалад БН (в % к массе зернопродуктов).

Затирание зернопродуктов проводили в соответствии с планом эксперимента. Интервал варьирования дозировки ФП выбирали с учетом ранее установленных оптимальных дозировок ФП (0,3 % для Ьаттех ВО; 0,5 % для Альфалад БН).

Исследования проводили при разных вариантах приготовления затора: из солода различного качества (солод № 2 и № 3) и при частичной замене солода на несоложеный ячмень - 15 % (солод № 2) и 40 % (солод № 4).

На основании математической обработки полученных результатов с использованием метода корреляционно-регрессионного анализа и пакета программ «Ма1з1аъ> и «5ишс1ка 6.0» были получены регрессивные уравнения, достоверно и адекватно описывающие зависимость тосах и ВЭ от исследуемых

факторов и построены поверхности отклика зависимости ВЭ и тосах от

17

исследуемых факторов (рис. 9), анализ которых позволил выбрать концентрации ферментных препаратов в составе активированной МЭК для применения при получении пивного сусла из солода и при частичной замене солода на ячмень: Альфалад БН - 0,20 - 0,25 % к массе зернопродуктов, Ьаттех ВО - 0,12 - 0,15 % к массе зернопродуктов. ВЭ при этом составляет 81 - 84 %, тосах составляет 13-16 мин.

ЕЗю И 81

ЩИ 13,5 □ 13 га 12.5

Рис. 9. Зависимость выхода экстракта (а) и продолжительности осахаривания затора (б) от содержания ФП Ьагшпех ВО и Альфалад БН в составе МЭК (затор: солод 60 %, ячмень 40 %).

Результаты сравнительного анализа физико-химических показателей сусла, полученного по различным вариантам затирания представлены в табл. 5.

Полученные результаты позволяют сделать заключение о целесообразности проведения предварительной активации гидролитических ферментных препаратов для интенсификации процесса получения пивного сусла из солода среднего или пониженного качества, а также для сокращения дозировки ФП в 2 раза при замене до 40 % солода на несоложеный ячмень в заторе зернопродуктов.

Фракционный состав белков сусла (табл. 6) характеризуется по сравнению с контролем существенным уменьшением доли высокомолекулярных белков, и увеличением доли белков с молекулярной массой 150000- 370000, что является положительным фактором для увеличения коллоидной стабильности пива и ценообразования. Содержание общего азота в опытном варианте выше, чем в контроле на 15% (солод №2), 6,5% (яри замене

40 % солода №4 на несоложеный ячмень), аминного - соответственно выше на 11% и 2,2% (табл.5).

Таблица 5

Показатели качества 11%-ого охмеленного сусла.

\ Показатель Й в в Кислотность, см31 н. ] ЫаОН * о о а а СО чс <Ц V к ё * 1 8*1 и

№ п/п Вариант опыта х Выход экстракта. Продолжительное осахарнвання, М1 Цветность, см3 0,1 раствора Ь & сз >> " & а х и РЗ Я и и и а « о п о К л Вязкость Общий азот (мг в 1 см3 сусла) 3,-5 и к 8 £ 3 & л и ® о я § <

Солод № 2 без 78,3 22 0,2 2,1 1:0,36 5,2 1,176 106,9 21,4 73,4

_ ФП

§ а

и Солод №2 + 84,3 15 0,2 2,1 1:0,28 5,3 1,160 124,3 23,8 81,0

активир. МЭК*

Солод № 4 без 79,5 15 0,2 2,0 1:0,35 5,3 1,276 107,1 22,4 74,0

<ч ФП

Я Солод №4 + 78,1 15 0,2 2,1 1:0,33 5,4 1,170 110,1 22,5 75,1

С О МЭК**

Солод №4 + 82,4 13 0,2 2,1 1:0,31 5,3 1,160 114,2 22,8 76,5

активир. МЭК*

* Дозировка ФП в МЭК: Ьаттех ВО 0,12%; Альфалад БН 0,2% к массе солода. ** Дозировка ФП в МЭК: Ьаттех ВО 0,25%; Альфалад БН -0,4% к массе солода.

Таблица б

Фракционирование водорастворимых белков охмеленного сусла на сефадексе в - 75 (опыт с активированной МЭК)

% от общего количества

Фракции М.м., Да Солод + ячмень Солод

I >100000 5,3 6,2

II 15000-37000 19,5 21,5

III <12500 75,2 72,3

Результаты проведенных исследований явились основой для разработки технологических рекомендаций по применению активации ФП Ьаттех ВС и Альфалад БН в процессе затирания зернопродуктов для интенсификации процесса получения пивного сусла.

2.5. Опытно-промышленные испытания и разработка технологических рекомендаций для интенсификации процесса получения пивного сусла.

Результаты лабораторных исследований о возможности интенсификации процесса получения пивного сусла на основе предварительной активации ФП в присутствии С7-АОБ были проверены при опытно-промышленной апробации в ООО НТЦ «Солодовые напитки» при получении светлого пива типа «Жигулевское» (11 %).

Были использованы следующие варианты затирания: контроль (К) -дробленый солод; опыт 1 (Оп 1) - солод + ФП Ьаттех ВО; опыт 2 (Оп 2) -солод + ФП Ьаттех ВО после предварительной активации; опыт 3 (Оп 3) -солод / ячмень в соотношении 70% : 30%; опыт 4 (Оп 4) - солод / ячмень в соотношении 70% : 30% + активированная МЭК на основе Ьаттех ВС и Альфалад БН при сокращении дозировки ФП в МЭК в 2 раза по отношению к дозировке ФП без проведения предварительной активации.

ФП вносили в заторный аппарат в начальный момент затирания (45 °С).

Анализ полученных результатов показывает, что применение активированных ФП положительно влияет на процесс получения пивного сусла по сравнению с контролем (К) и применением ФП без активации (табл. 7).

Таблица 7

Физико-химические показатели производственного сусла (11,0 % СВ).

№ п/п Вариант опыта Показатель К Оп 1 Оп 2 Оп 3 Оп 4

1 Продолжительность осахаривания, мин 20 17 12 20 15

2 Выход экстракта,% 75,63 77,05 80,38 71,81 79,93

3 Содержание общего азота, мг/100см3 сусла 97,20 99,41 101,30 95,11 105,8

4 Содержание аминного мг/100см3 сусла 19,72 20,81 21,30 19,00 21,83

5 Содержание РВ, г/100см3 сусла 7,63 7,89 8,14 7,12 8,36

6 РН 5,28 5,20 5,20 5,31 5,30

7 Кислотность, см'' 1М КаОН / 100см3 сусла 2,0 2Д 2,1 2,0 2,1

8 Цветность, см3 0,1М 12/ 100см3 сусла 0,54 0,53 0,54 0,53 0,54

9 Вязкость 1,80 1,72 1,71 1,89 1,68

При 30%-ой замене солода на несоложеный ячмень применение активированной МЭК позволило не только сохранить, но даже улучшить показатели качества сусла по сравнению с контролем (К): тосах сокращается на 25 %, ВЭ выше на 5,7 %, содержание РВ - на 9,5 %. При этом содержание общего азота увеличивается на 8,9 %, аминкого - на 10,5%.

Результаты оценки качества пива, полученного по контрольной (К) и опытной (Оп. 4) варкам представлены в табл. 8 и на рис. 10.

Таблица 8

Сравнительные показатели пива.

№ л/п ~~--—------- Вариант опыта Показатель " ~ ~--—_______ К Оп 4

1 Массовая доля спирта, % 3,85 4,0

2 _рН_ 4,45 4,43

3 Кислотность, см'1 1 М р-р №ОН на 100 см3 2,4 2,3

4 Цветность; 0,1 М р-ра 32 на 100 см3 1,0 1,0

5 Стойкость пены; мин. ^6,0 7,0

6 Высота пены, мм. 60 70

Пенообразование

—1 2

Рис. 10. Профилограмма органолепткческой оценки пива: 1 - «К» (контроль); 2 - «Оп. 4».

Анализ этих данных дает основание сделать заключение, что при замене 30 % солода на ячмень применение на стадии затирания активированной МЭК позволяет получить пиво, отвечающее по показателям качества требованиям ГОСТ Р 51174 - 2009, и которое по большинству физико-химических и

органолептических показателей не отличается от пива, полученного по классической технологии (контроль), а по таким показателям, как высота пены и пеностойкость даже выше, чем контроль.

На основании результатов лабораторных исследований и опытно-промышленной проверки разработаны принципиальная технологическая схема и технологические рекомендации по применению предварительной активации ФП Ьагшпех ЕЮ и МЭК на основе Ьаттех ВО и Альфалад БН в присутствии С7-АОБ для интенсификации процессов биокатализа при получении пивного сусла из солода и несоложеных материалов (ячмень).

Расчетный экономический эффект от применения разработанной технологии составляет 3,68 млн. руб. на 1 млн. дал пива. Экономический эффект достигается за счет сокращения дозировки ФП в МЭК при использовании несоложеного сырья для получения пивного сусла.

Выводы

В результате проведенных исследований теоретически и экспериментально обоснована и подтверждена при опытно-промышленной апробации возможность интенсификации процесса получения пивного сусла из ячменного солода и несоложеных материалов за счет активированных в присутствии С7-АОБ ФП Ьаттех ВО и Альфалад БН:

1. Изучено влияние СгАОБ на скорость реакции гидролиза ФБ препаратом Ьагшпех ВО при различных концентрациях ФГ1, субстрата и С7-АОБ. Показано, что начальная скорость гидролиза ФБ в присутствии СгАОБ увеличивается более чем в 2 раза. Определены кинетические параметры ферментативного процесса - Угоах и Кга. Установлено, что С7-АОБ не изменяет Кш при увеличении Утах в 2,3 раза, что является косвенным подтверждением того, что увеличение ФА препарата Ьатшех ВО в присутствии С7-АОБ является следствием определенных конформационных изменений в молекуле белка фермента, а взаимодействие фермент - СгАОБ может быть интерпретировано как неконкурентная активация.

2. Исследованы условия активации ФП Ьаттех ВО в присутствии С7-

АОБ.

Показано, что проведение предварительной тепловой активации ФП

Ьаштех ВО в присутствии С7-АОБ при ^ = 50 °С в течение 30 - 60 мин

способствует увеличению его каталитической активности по отношению к

исходному (неактивированному) препарату в 3,2 - 3,8 раза. Установлено, что

22

С 7- АОБ способствует повышению функциональной и операционной стабильности ФП в широком диапазоне температуры и pH.

3. Изучено влияние предварительной тепловой активации ФП Laminex BG в присутствии С7-АОБ на гидролитические процессы при затирании ячменного солода. Установлено, что прединкубация раствора ФГ1 при t°= 50°С в течение 1 часа в присутствии С7-АОБ (концентрация 0,1 % к массе солода) дает возможность сократить продолжительность осахаривания затора при использовании солодов различного качества на 32 - 45 %, увеличить при этом выход экстракта на 5,3 - 11,0 % при одновременном увеличении скорости фильтрования на 12 - 32 %.

4. Показана эффективность применения разработанного способа активации ФП Laminex BG для ФП Альфалад при получении пивного сусла.

Обоснована целесообразность формирования активированной МЭК с использованием ФП Laminex BG и Альфалад БН при получении сусла из ячменного солода и несоложеных материалов. Проведена оптимизация состава МЭК методом математического планирования эксперимента на основе униформ - ротатабельных планов при использовании в заторе смеси зернопродуктов и солода различного качества. На основании математической обработки результатов получены регрессионные уравнения достоверно и адекватно описывающие зависимость продолжительности осахаривания и выхода экстракта от соотношения ФП Laminex BG и Альфалад БН в МЭК, построены поверхности отклика и определены оптимальные соотношения ФП в МЭК для интенсификации процесса получения пивного сусла с выходом экстракта 81-84 %.

5. На основании исследования физико-химических показателей пивного сусла, полученного при затирании ячменного солода и ячменя с использованием МЭК на основе ФП Laminex BG и Альфалад БН, было установлено, что проведение предварительной активации МЭК в присутствии С7-АОБ способствует сокращению продолжительности осахаривания затора зернопродуктов на ~ 15 - 30 %, увеличению выхода экстракта на ~ 4 - 7 %, увеличению в сусле содержания общего и аминного азота и РВ в экстракте (соответственно на ~ 7 - 15 %; на ~ 2 - 11 % и на ~ 4 - 10 %), позволяет снизить в 2 раза расход ферментов при использовании несоложеного сырья.

6. Исследованиями с использованием метода гель-фильтрации показано, что применение на стадии затирания зернопродуктов активированной МЭК

приводит к изменению соотношения белковых фракций в сусле: на 37 - 47 % уменьшается содержание фракции высокомолекулярных белков с молекулярной массой > 100000, увеличивается доля фракции с молекулярной массой 15000 - 37000 на 24 - 37 %, что является существенным фактором для повышения коллоидной стабильности пива и его пеностойкости.

7. Опытно-промышленные испытания в условиях ООО НТЦ «Солодовые напитки» подтвердили целесообразность проведения предварительной активации ФП Ьагшпех ВО и МЭК с использованием Ьаттех ВО и Альфалад БН в присутствии С7-АОБ для интенсификации процесса получения пивного сусла из ячменного солода и несоложеных материалов (30 - 40 %) и повышения его качества.

8. Разработаны технологические рекомендации и принципиальная технологическая схема по применению предварительной активации МЭК на основе ФП Ьагшпех Вв и Альфалад БН в технологии пивного сусла. Расчетный экономический эффект от внедрения разработанных технологических рекомендаций составляет 3,68 млн. руб. на 1 млн. дал пива / год.

Список работ, опубликованных но материалам диссертации.

1. Лысюк В.М. Исследование условий активации ферментного комплекса Laminex BG Clucanase Complex // В сб. матер. 3-ей Всероссийской конф. студентов, аспирантов и молодых ученых «Пищевые продукты и здоровье человека». Кемерово, 2010. С. 38-39.

2. Лысюк В.М., Шаненко Е.Ф., Гернет М.В., Эль - Регистан Г.И. Активация ферментного комплекса Laminex BG Glucanase Complex в производстве пива. // Пиво и напитки. 2010. № 1. С. 12 - 14.

3. Лысюк В.М. Применение С7- алкилоксибензола для активации и стабилизации ферментных препаратов при производстве пива // В сб. матер. 3-ей межведомственной научно-практической конф. «Товароведение, экспертиза и технология продовольственных товаров». Москва. 2010. С. 216 -219.

4. Лысюк В.М., Шаненко Е.Ф., Гернет М.В, Эль-Регистан Г.И. Практические аспекты применения активации ферментных препаратов при получении пивного сусла // Пиво и напитки. 2010. № 2. С. 44 - 45.

5. Лысюк В.М. Активация ферментного препарата Ьагшпех ВО как фактор интенсификации гидролиза некрахмальных полисахаридов. // В сб. матер. «Инновационного форума пищевых технологий». Москва. 2010. С. 175 - 177.

6. Лысюк В.М., Гернет М.В., Вяльцева И.В., Шаненко Е.Ф. Кинетика гидролиза некрахмальных полисахаридов под действием ферментного препарата Ьатшех ВО // Известия вузов. Пищевая технология. 2011. № 1 (319). С. 20 - 24.

Принятые обозначения и сокращения

АОБ - алкилоксибензол ФГ1 - ферментный препарат

АС - амилолитическая способность [Е] - концентрация фермента

АФБ - целлюлозолитическая актив- Кт - константа Михаэлиса

ность по гидролизу фильтровальной [S] - концентрация субстрата

бумаги V0 - начальная скорость фермента-

ВЭ - выход экстракта тивной реакции

М.м. - молекулярная масса Vmax - максимальная скорость фер-

МЭК - мультэнзимная композиция ментативной реакции

ФА - ферментативная активность tocx - продолжительность осахарива-

ФБ - фильтровальная бумага ния затора

Подписано в печать 10.11.11. Формат 60x90 '/16. Печ. л. 1,1. Тираж 100 экз. Изд. № 124. Заказ 151. Издательский комплекс МГУПП 125080, Москва, Волоколамское ш., 11

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Полисахариды: современные представления о строении, свойствах и превращениях при получении пивного сусла.

1.1.1. Крахмал: общие сведения о строении, свойствах и превращениях под действием ферментов солода.

1.1.2. Современные представления о строении и свойствах некрахмальных полисахаридов.:.

1.1.3. Расщепление гемицеллюлоз и гумми—веществ под действием ферментов ячменного солода и его значение для технологического процесса получения сусла и пива.

1.2. Применение цитолитических ферментных препаратов микробного происхождения в технологии пива.

1.3. Научные и практические аспекты'активации и стабилизации ферментов.

1.3.1. Конформационные изменениями активность ферментов

1.3.2. Алкилоксибензолы и их роль в регуляции активности ферментов.

1.3.3. Кинетика ферментативной реакции и практические аспекты применения активации ферментов.

Актуальность темы. Пиво является популярным напитком во всем мире, в т. ч. и в России. Несмотря на то, что в последние годы темпы роста его производства несколько снизились, пиво остается продуктом повышенного потребительского спроса. Развитие пивоваренной отрасли направлено, в первую очередь, на интенсификацию технологического процесса, повышение качества готовой продукции и снижение затрат на ее производство.

Производство пива — совокупность сложных процессов, тесно связанных между собой. Это биохимические превращения компонентов зерна при солодоращении, многообразные ферментативные превращения при получении сусла, метаболизм дрожжей при-брожении и дображивании.

На основании углубленных исследований о биохимических реакциях, протекающих на стадии солодоращения и получения пивного сусла, обоснована целесообразность применения в производстве пива гидролитических ферментных препаратов (ФП) микробного происхождения как компенсация недостаточной ферментативной активности солодов пониженного качества и при частичной замене солода на более-дешевое, чем солод, несоложеное сырье.

Известно, что ферменты являются катализаторами с регулируемой каталитической активностью, которая может изменяться- под действием различных факторов, влияющих на конформацию белка фермента или структуру его активного центра.

С учетом относительно высокой стоимости ФП актуальными являются исследования, направленные на повышение эффективности их применения в технологии пивного сусла на основе разработки способов активации ФП и повышения их функциональной и операционной стабильности, внедрение которых позволит уменьшить дозировку ферментных препаратов, интенсифицировать технологический процесс при увеличении выхода экстракта и будет способствовать более полному использованию сырья.

Цель и задачи исследования.

Цель работы: научное обоснование, разработка и применение способов активации микробных ферментных препаратов (на примере Ьагшпех Вв глюканазного действия, амилазы Альфалад БН и мультэнзимной композиции на их основе) для интенсификации процессов биокатализа в технологии пивного сусла.

Для. достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

• На основании кинетических исследований обосновать выбор С7-алкилоксибензола (С7-АОБ), относящегося к природным структурным модификаторам белков, для применения' в качестве активатора промышленных ФИ микробного происхождения.

• Исследовать влияние (С7-АОБ) на ферментативную активность (ФА) ФПЬаттех ВС, его функциональную и операционную стабильность.

•г Разработать условия.' предварительной' активации ФП Ьагшпех ВО в присутствии С7-АОБ для интенсификации биокаталитических процессов в технологии пивного сусла

• Обосновать целесообразность формирования мультэнзимной композиции (МЭК) на основе активированных ФП Ьагшпех ВО и Альфалад БН и провести оптимизацию состава МЭК с использованием униформ -ротатабельных планов эксперимента.

Дать сравнительную оценку физико-химических показателей качества пивного сусла, полученного по традиционной технологии и при использовании на стадии затирания активированных ФП.

• Провести исследования для характеристики пивного сусла по содержанию белка и его фракционного состава.

• Провести опытно-промышленную апробацию применения разработанных способов активации ФП при получении пивного сусла для оценки физико-химических показателей в сравнении с традиционной технологией.

• ' Разработать принципиальную технологическую схему и технологические рекомендации по применению предварительной активации исследованных гидролитических ФП для интенсификации технологии пивного сусла из солода и несоложеных материалов.

Научная новизна.

На основании исследования кинетики ферментативной реакции (на примере гидролиза целлюлозы ФП Ьагшпех ВО) установлено, что С7-АОБ, 6 влияет на характер зависимости начальной скорости реакции (У0) от концентрации фермента и субстрата, способствует увеличению максимальной скорости ферментативной реакции (Утах) более, чем в 2 раза и не изменяет при этом другой кинетический параметр ферментативного процесса - константу Михаэлиса (Кт), что позволяет интерпретировать взаимодействие С7-АОБ — фермент, как неконкурентную активацию, вследствие конформационных изменений белка фермента.

Доказано эффективное стабилизирующее действие С7-АОБ на гидролитические ФП микробного происхождения в широком диапазоне рН и термературы биокатализа и показано увеличение рН- и термостабильности ФП при сохранении эффекта активации в процессе биокатализа.

Выявлены условия предварительной инкубации промышленных ФП микробного происхождения (температура, продолжительность, концентрация С7-АОБ) для повышения их функциональной активности при гидролизе крахмальных и некрахмальных полисахаридов при получении пивного сусла.

Исследованиями с использованием метода гель-фильтрации показано, что применение на стадии затирания зернопродуктов активированной МЭК приводит к изменению соотношения белковых фракций в сусле: уменьшается содержание фракции высокомолекулярных белков с молекулярной массой > 100000, увеличивается доля фракции с молекулярной массой 15000 — 37000, что является существенным фактором для повышения коллоидной стабильности пива и его пеностойкости.

Практическая значимость

На основании проведенных исследований разработан новый подход к интенсификации процесса получения пивного сусла из солода и несоложеного сырья, заключающийся в использовании на стадии затирания затора предварительно активированных гидролитических ферментных препаратов цитолитического и амилазного действия.

Разработаны способы активации ФП с использованием С7-АОБ в качестве активатора и стабилизатора ФП, приводящие к увеличению их каталитической активности в 1,7 (ФП Альфалад БН) и 3,8 (ФП Ьаттех ВО) раза.

Применение разработанных способов предварительной активации ФП при их раздельном использовании приводит к сокращению продолжительности осахаривания затора на 30 — 45 %, увеличению выхода экстракта на 4,5 — 11%, скорости фильтрования в 1,2 - 1,3 раза (в зависимости от качества солода).

Экспериментально обоснована возможность замены 30 % солода (для солода пониженного качества) и 40 % (для солода хорошего качества) на несоложеный ячмень при использовании МЭК на основе использования активированных ФП Ьагшпех ЕЮ и Альфалад БН на стадии затирания зернопродуктов. С использованием униформ-ротатабельных планов эсперимента установлены дозировки ФП в МЭК для сокращения продолжительности осахаривания затора и получения сусла с физико-химическими и органолептическими показателями, соответствующими стандарту, и обеспечения выхода экстракта 81 — 84 % . Показано, что проведение предварительной активации МЭК в присутствии С7-АОБ позволяет снизить в 2 раза расход ФП на затирание зернопродуктов- при получении пивного сусла.

Результаты» лабораторных исследований подтверждены при- опытно-промышленной апробации В' условиях ООО НТЦ «Солодовые напитки». Показано, что пиво из производственного сусла, полученного с использованием активированных ФП, соответствует (а по ряду показателей превосходит) требованиям ГОСТ к светлому пиву.

Разработаны, принципиальная технологическая схема и технологические рекомендации по применению предварительной активации в присутствии С7-АОБ ФП Ьатлпех Вв и Альфалад БН для интенсификации технологии пивного сусла из солода и несоложеных материалов. Расчетный экономический эффект составляет 3,68 млн. руб. на 1 млн. дал пива в год.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 3-ей Всероссийской конференции студентов, аспирантов- и молодых ученых «Пищевые продукты и здоровье человека», секция «Пищевая химия, биотехнология» (Кемерово, 2010); 3-ей межведомственной научно-практической конференции «Товароведение, экспертиза и технология продовольственных товаров» (Москва, 2010); на «Инновационном форуме пищевых технологий», секция «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства их реализации. Эффективное использование ресурсов отрасли» (Москва, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ, в том числе 3 — в журналах по утвержденному списку ВАК.

1. Обзор литературы

Выводы

В результате проведенных исследований теоретически и экспериментально обоснована и подтверждена при опытно-промышленной апробации возможность интенсификации процесса получения пивного сусла из ячменного солода и несоложеных материалов за счет активированных в присутствии С7-АОБ ФП Ьаттех ВО и Альфалад БН:

1. Изучено влияние С7-АОБ на скорость реакции гидролиза ФБ препаратом Ьаттех ВО при различных концентрациях ФП, субстрата и С7-АОБ. Показано, что начальная скорость гидролиза ФБ в присутствии С7-АОБ увеличивается более чем в 2 раза. Определены кинетические параметры ферментативного процесса - Утах и Кт. Установлено, что С7-АОБ не изменяет Кт при увеличении Утах в 2,3 раза, что является косвенным подтверждением того, что увеличение ФА препарата Ьаттех ВО в присутствии С7-АОБ является следствием определенных конформационных изменений в молекуле белка фермента, а взаимодействие фермент - С7-АОБ может быть интерпретировано как неконкурентная активация.

2. Исследованы условия активации ФП Ьаттех ВО в присутствии С7

АОБ.

Показано, что проведение предварительной тепловой активации ФП Ьаттех ВО в присутствии С7-АОБ при I:0 = 50 °С в течение 30 - 60 мин способствует увеличению его каталитической активности по отношению к исходному (неактивированному) препарату в 3,2 — 3,8 раза. Установлено, что С7- АОБ способствует повышению функциональной и операционной стабильности ФП в широком диапазоне температуры и рН.

3. Изучено влияние предварительной тепловой активации ФП Ьаттех ВО в присутствии С7-АОБ на гидролитические процессы при затирании ячменного солода. Установлено, что прединкубация раствора ФП при 1:° = 50°С в течение 1 часа в присутствии С7-АОБ (концентрация 0,1 % к массе солода) дает возможность сократить продолжительность осахаривания затора при использовании солодов различного качества на 32 — 45 %, увеличить при этом выход экстракта на 5,3 - 11,0 % при одновременном увеличении скорости фильтрования на 12 - 32 %.

4. Показана эффективность применения разработанного способа активации ФП Ьаттех ВО для ФП Альфалад при получении пивного сусла.

Обоснована целесообразность формирования активированной МЭК с использованием ФП Ьаттех ВО и Альфалад БН при получении сусла из ячменного солода и несоложеных материалов. Проведена оптимизация состава МЭК методом математического планирования эксперимента на основе униформ - ротатабельных планов при использовании в заторе смеси зернопродуктов и солода различного качества. На основании математической обработки результатов получены регрессионные уравнения достоверно и адекватно описывающие зависимость, продолжительности осахаривания и выхода экстракта от соотношения ФП Ьаттех ВО и Альфалад БН в МЭК, построены поверхности отклика и определены соотношения ФП в МЭК для интенсификации процесса получения пивного сусла с выходом экстракта 81 — 84 %.

5. На основании исследования физико-химических показателей пивного сусла, полученного при затирании ячменного^ солода и ячменя с использованием МЭК на основе ФП Ьаттех ВО и Альфалад БН, было установлено, что проведение предварительной активации МЭК в присутствии С7-АОБ способствует сокращению продолжительности осахаривания затора зернопродуктов на ~ 15 — 30 %, увеличению выхода экстракта на ~ 4 — 7 %, увеличению в сусле содержания общего и аминного азота и РВ в экстракте (соответственно на ~ 7 — 15 %; на ~ 2 -11% и на ~ 4 — 10 %), позволяет снизить в 2 раза расход ферментов при использовании несоложеного сырья.

6. Исследованиями с использованием метода гель-фильтрации показано, что применение на стадии затирания зернопродуктов активированной МЭК приводит к изменению соотношения белковых фракций в сусле: на 37 — 47 % уменьшается содержание фракции высокомолекулярных белков с молекулярной массой > 100000, увеличивается доля фракции с молекулярной массой 15000 — 37000 на 24 - 37 %, что является существенным фактором для повышения коллоидной стабильности пива и его пеностойкости.

7. Опытно-промышленные испытания в условиях ООО НТЦ «Солодовые напитки» подтвердили целесообразность проведения предварительной активации ФП Ьаттех ВО и МЭК с использованием Ьаттех ВО и Альфалад 1

БН в присутствии С7-АОБ для интенсификации процесса получения пивного сусла из ячменного солода и несоложеных материалов (30-40 %) и повышения его качества.

8. Разработаны технологические рекомендации и принципиальная технологическая схема по применению предварительной активации МЭК на основе ФП Ьаттех ВО и Альфалад БН в технологии пивного сусла. Расчетный экономический эффект от внедрения разработанных технологических рекомендаций составляет 3,68 млн. руб. на 1 млн. дал пива / год.

2.5.3. Заключение

Опытно-промышленные испытания в условиях ООО НТЦ «Солодовые напитки» подтвердили целесообразность проведения предварительной активации ФП Ьапппех ВО и МЭК с использованием Ьаттех ВО и Альфалад БН в присутствии С7-АОБ для интенсификации процесса получения пивного сусла из ячменного солода и несоложеных материалов, более полной переработки сырья в конечный продукт и сокращения расхода ферментных препаратов в 1,5-2 раза (в зависимости от качеста солода) на стадии затирания смеси зернопродуктов (при 30 - 40 %-ой замене ячменного солода на несоложеный ячмень).

Разработаны технологические рекомендации и принципиальная технологическая схема по применению предварительной активации ФП в технологии пивного сусла.

Рис. 2.36. Принципиальная технологическая схема применения активации ФП при получении пивного сусла.

Расчетный экономический эффект от внедрения разработанных технологических рекомендаций составляет 3,68 млн. руб. на 1 млн. дал пива / год.

1. Андреева O.A., Усанов И.В. (а) Оценка эффективности использования ферментных препаратов фирмы «Квест» (QUEST 1.t, Нидерланды). Пиво и напитки. — 1997. — № 1. — С. 12-13.

2. Бадичко Е.А. Исследование условий получения продуктов ферментативной модификации соевой муки и их биохимическая характеристика. Дисс. . канд. техн. наук. — Москва, 2009. — 179 с.

3. Батраков Г., Эль-Регистан Г.И., Придачина H.H. и др. Тирозол — ауторегуляторный фактор d, Saccharomyces cerevisiae II // Микробиология. — M., 1993. Т. 62. — № 4. — С. 633-638.

4. Бахматова И.В., Бальсис А.Б., Чюрлис Т.К. и др. Очистка и некоторые свойства ос-амилаз морфологических вариантов Bacillus subtilis. // Прикл. биохим. и микробиология. — М., 1984. 20. — № 6. — С. 804-809.

5. Березин И.В. Действие ферментов в обращенных мицеллах // Баховские чтения. XXXIX. 1985. 25-33 с.

6. Березин И.В., Мартинек К. Введение в прикладную энзимологию. — М., Изв-во МГУ. 1982. — 383с.

7. Беспалов М.М., Колпаков А.И., Лойко Н.Г. и др. Функции аутоиндукторов анабиоза микроорганизмов при создании метаболического блока в клетке // Микробиология. — М., 2000. Т. 69. — № 2. — С. 217-223.

8. Блеквел Дж., Мармессо Р. Исследование структуры целлюлозы и ее производных. В кн.: Целлюлоза и ее производные / Под ред. Байклза, JI. Сегала. — М. : Мир, 1999. Т. 1. — С. 9^3.

9. Борисенко В.А. Разработка технологии пива с повышенной коллоидной и вкусовой стабильностью : Автореферат дис. . канд. техн. наук. — Кемерово, 2006. — 21 с.

10. Бражникова Е.А. Исследование влияния сульфацетамина на ферментативную активность холода. / Материалы студ. науч. конф. BETA. — Воронеж: BFTA, 2006: — С. 141.

11. Бурштейн Э:А. Собственная, люминисценция белка как метод изучения быстрой структурной динамики. // Молекуляр. биология: — М., 1983. 17. — № 3. —С. 455^67.

12. Витол И.С., Кобелева И.Б., Траубенберг С.Е. Ферменты и их применение в пищевой промышленности. — М. : Издательский комплекс МГУПП, 2000. — 80 с. '

13. Волькенштейн М.В. Биофизика. — М.: Наука, .1988. — С. 592!

14. Гаджиева Д.А. Влияние hohobi металлов^ на каталитическую, активность пероксидазы из хрена и концентрационные колебания* при. пероксидазномокислении аскорбиновой кислоты. Дисс.канд. хим.- наук. — Махачкала,2002. — 125 с.

15. Галимова М.Х. Ферментативная кинетика: Справочник по механизмам реакций: 50s механизмов ферментативных реакций и их кинетическое поведение. — М:, Ком. К., 2007. С. 320:

16. Гамаюрова B.C., Зиновьев М.Е., Васина К.Л. Активация и стабилизация ферментных препаратов неорганическими соединениями // Вестник Казан, техн. ун-та. — Казань, 2009. — № 6. — С. 121-129.

17. Герасимене Г.Б., Макарюнайте Ю.П., Кулене В.В. и др. Некоторые свойства фосфолипаз из Bacillus cereus. Прикл. биохим. и микробиология. 1985.21, —№2, —С. 184-189.

18. Гернет М.В., Пичугина Т.В., Шаненко Е.Ф.и др. Изучение влияния препарата «Сидовит» на качество солода // Пиво и напитки. — М., 2009. — № 4. —С. 46-47.

19. Грачев Ю. П., Плаксин Ю.М. Математические методы планирования экспериментов. —М: Изд во Дели принт, 2005. — 198 с.

20. Грачева И.М., Грачев Ю.П., Мосичев М.С., Борисенко Е.Г., Богатков С.Е., Гернет М'.В. Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов.

21. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1982. — 238 с.

22. Дедечкаев А.Т., Афонин Д.В., Меледина Т.В. Комплексный подход к повышению коллоидной стойкости пива. Изв. вузов. Пищевая технология, 2007, №1, —С. 54-56.

23. Демченко А.П. Ультрафиолетовая спектрофотометрия и структура белков. — Киев, Наукова думка, 1981. — С. 208.

24. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты : в 3- т.; пер. с англ. Л.М. Гинодмана и М.И. Левянта / под ред. В.К. Антонова и А.Е. Браунштейна. — М. : Мир, 1982.1118с.

25. Дроздова Г.Г. Пектиновые вещества ячменя и их ферментативный гидролиз на стадии приготовления пивного сусла. Автореферат дисс. . канд. техн. наук. —Киев, 1977. — 23 с.

26. Ермаков А.И., Арасимович В.В., Ярош Н.ПП. и др. Методы биохимического исследования растений / Под ред. А.И. Ермакова.— Л. : Агропромиздат, 1987. — 430 с.

27. Ермолаева Г.А. Основные процессы пивоварения. Приготовление сусла. Пиво и напитки. — 1997. № 4. — С. 10-13.

28. Жашко К.Т. Технологические основы использования обрушенного ячменя,в пивоварении., Автореферат дисс. . канд. техн. наук — М. 1977. — 26 с.

29. Жеребцов H.A. Амилолитические ферменты в пищевой промышленности.

30. М.: Легкая и пищевая пром-сть, 1984. — С.Л 69.

31. Иванова Л.А. Разработка и обоснование способов совершенствования, биотехнологии и повышения качества светлого пива. Дисс. . докт. техн. наук.1. Москва, 1999. —546 с.

32. Ильина Н.М., Жеребцов H.A., Бузов И.П. Основные свойства, протеиназ препарата «Элегентин». Фермент и спирт пром-сть, 1984; №1, — С. 31- 34.

33. Ильина Е.В. Интенсификация производства пивного сусла. Новое направление // Пиво и напитки. — М., 2005. — № 5. — С. 26.

34. Казаков Е.Д., Карпиленко Г.П. Биохимия зерна и зернопродуктов. — СПб.: ГИОРД, 2005. — С.512!

35. Калунянц К.А., Ваганова М.С. Характеристика препаратов, выделенных из культуральной жидкости Вас. mesentericus. В кн.: Ферменты микроорганизмов.

36. М.: Наука, 1973. — С. 235-242.

37. Калунянц К.А. Химия солода и пива. — М. : Агропромиздат, 1990. — 176 с.

38. Калунянц К.А., Яровенко В.Л., Домарецкий В.А., Колчева P.A. Технология солода, пива и безалкогольных напитков. — М. : Колос, 1992. — 446 с.

39. Кислухина О.В. Ферменты в производстве пищи и кормов. — М. : ДеЛи принт, 2002. — 335 с.

40. Клесов A.A., Герасимас В.Б. Термостабилизация растворимой и иммобилизованной глюкоамилазы под действием субстрата. — Биохимия, 1979. 44, № 6. — С. 1084-1092.

41. Клесов A.A. Ферменты целлюлотического комплекса: В кн. : Проблемы биоконверсии растительного сырья. — М. : Наука, 1986. — С. 93—135.136

42. Косминский Г.И. Технология солода, пива и безалкогольных напитков. Лабораторный практикум по технохимическому контролю производства. — Минск.: Дизайн ПРО, 1998. — С. 352.

43. Косминский Г.И., Моргунова Е.М., Иванчикова О.И. Влияние степени насыщения пивного сусла на накопление этилового спирта в ходе сбраживания // Известия вузов. Пищевая технология. — М., 2007. — № 1. — С. 52—54.

44. Конаныхина И.Л., Шаненко Е.Ф. и др. Стабилизация» дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Хранение и переработка с/х сырья. — М.', 2007. — № 8. — С. 44-46;

45. Конаныхина И.А. Разработка интенсивной технологии солода^ и пива с использованием алкилоксибензолов природного происхождения для улучшения качества готовой продукции: автореф. дис. . канд. тех. наук. — Mi, 2007. — 24 с.

46. Конаныхина И.А., Шаненко Е.Ф., Лойко Н.Г., Николаев Ю.А., Эль-Ренистан Г.И. Регулирующее действие микробных алкилоксибензолов разной структуры на стрессовый ответ дрожжей' // Прикладная биохимия и микробиология. —М., 2008. — № 5. — С. 571-575.

47. Коротина O.A., Крупянский Ю.Ф: Изменение структуры, динамики и функциональной активности ферментов при взаимодействии с химическими шаперонами // Научная сессия МИФИ: — М., 2008. — С. 128 129.

48. Кошкина H.A., Мелентьев А.Е. Активность ферментов солода при приготовления пивных заторов. — Изв. вузов СССР. Пищ«технология, 1985, — №1, —С. 119.

49. Кретович В.Л., Яровенко В.Л. и др. Ферментные препараты в пищевой промышленности. — М.: Пищевая промышленность, 1975. — 535 с.

50. Кретович В.Л. Биохимия растений. — М.: Высшая школа, 1986. — 502 с.137

51. Кретович B.C. Введение в энзимологию. — М. : Наука, 1986. — 232 с.

52. Крупянский Ю.Ф., Лойко Н.Г. и др. Влияние химических шаперонов на свойства лизоцима и белка реакционного центра бактерий Rb. Sphaeroides / Тезисы докладов на XVIII-ой международной конф. «Математическое и компьютерное образование».—- Пущино, 2011.

53. Кунце Bi Технология солода и пива. — СПб. : Профессия, 2001. — 912 с.

54. Кутузова Г.Д., Угарова Н.Н. Стабилизация пероксидазы хрена при ацетилировании фермента и в присутствии ионов кальция. — Биоорганическая химия, 1981, 7, —№ 1, —С.75-85.

55. Куцакова В.Е., Белов М.А. Исследование возможности использования ферментативного гидролиза рисовой лузги в пивоварении // Проблемы пищевой инженерии. — С.-Петербург, гос. ун-т низкотемперат. и пищ. технол. — СПб., 2006. — С. 29-31.

56. Липмаа Э.Т., Оливсон А.И, Ярвет Ю.И.: и др. Исследование карбоангидразы В крупного рогатого скота методом 13 С—ЯМР—спектроскопии. — Молекуляр; биология, 1983, 17, № 3, — С. 484- 492.

57. Лисюк Г.М., Горегова О.В. Влияние температуры и длительности прогрева на бродильную активность и активность а-глюкозидазы пивных дрожжей. — Изв. вузов. СССР. Пищ. технология, 1985, № 1, — С. 115-116.

58. Лифшиц. Д.Б., Василенко О.М., Мелетьев А.Е. и др. Значимость отдельных групп ферментов при переработке несоложеного ячменя в пивоварении.;—Изв. вузов. Пищевая технология, 1989, № 4, — С. 44.

59. Мальцев П.М., Великая Е.И., Зазирная М.В., Колотуша П.М. Химико-технологический контроль' производства .солода и пива. — М. : Пищевая промышленность, 1976.—447 с.

60. Мартиросова Е.И. Изучение роли алкилоксибензолов в стабилизации и модуляции активности ферментных белков. Дисс. канд. биол. наук. — М., 2007. —150 с.

61. Мартиросова Е.И., Николаев Ю.А. и др. Использование алкилоксибензолов для повышения активности и стабильности ферментов // Химическая технология; — М., 2007. — № 6. — С. 250—256.

62. Микробиология пива / под. ред. Ф.Д. Приста, и: Кэмпбелла. — СПб: Профессия. 2005. — С. 368.

63. Мелентьев А.В., Нгуен Тхи Хоай Чам. Интенсификация протеолиза кукурузы и риса; в производстве пива. Известия вузов. Пищевая технология. 1992, — № 3-4, — С. 17-20.

64. Милорадова E.B. Продукты ферментативной модификации соевой муки: научные и практические аспекты получения и применения в пищевых технологиях. Дисс. докт. техн. наук. — М., 2010. — 385 с.

65. Мулюкин A.JI. Влияние микробных аутоиндукторов анабиоза — алкилосибензолов — на структурную организацию ДНК Pseudomonas aurantiaca и индукцию фенотипической диссоциации // Микробиология. — М., 2005. Т. 74. — №2. — С. 157-165.

66. Нарцисс JI. Технология солода. — М.: Пищевая промышленность. — 1980, —504 с.

67. Нарцисс JI. Краткий курс пивоварения. Научные основы и-технологии. — СПб: Профессия, — 2007. — 640 с.

68. Нгуен В.Х., Разумовская Р.Г. Технология получения солода из риса-зерна с применением ЭХА-растворов. Известия вузов. Пищевая технология, — 2011, №1(315). —С. 53-56.

69. Неверова O.A., Голерикова Г.А., Позняковский И.М. Пищевая биотехнология продуктов из сырья растительного происхождения. — Новосибирск : Сиб. Унив. изд-во, 2007. — 408 с.

70. Нечаев А.П., Траубенберг С.Е., Кочеткова» А.А. и. др. Пищевая химия. — СПб.: ГИОРД, 2007. — 636 с.

71. Николаев Ю.А. Ауторегуляция стрессового ответа микроорганизмов. Автореферат дисс. .докт. биол. наук. — М., 2011. — 48 с.

72. Николаев Ю.А., Тарасов A.JL, Борзенков И.А., Гальченко В.Ф., Эль-Регистан Г.И. Роль алкилоксибензолов в адаптации бактерий к неблагоприятным условиям роста.// Микробиология. — 2010. Т. 79. № 6. — С. 760- 766.

73. Николаев Ю.А., Лойко Н.Г., Степаненко И.Ю. и др. Изменения физико-химических свойств белков, модифицированных алкилоксибензолами // Прикладная биохимия и микробиология. — М., 2008. Т. 44 — № 2. — С. 159— 167.

74. Огурцова В.Е., Лифшиц Д.Б., Яровенко В.Л. Содержание гемицеллюлоз в пивоваренном ячмене и солоде // Прикладная биохимия и микробиология. — М., 1975, XI. — Вып. 3. — С. 433-436.

75. Огурцова В.Е., Лифшиц Д.Б., Яровенко В.Л. Изучение углеводного состава ферментативных гидролизатов гемицеллюлоз, выделенных из эндосперма ячменя // Прикладная биохимия и микробиология. — М., 1977. Т. 13. Вып. 2. —С. 315-318.

76. Органическая химия (под ред. H.A. Тюкавкиной) — М.: Дрофа, 2008. — 592 с.

77. Осипов Г.А., Эль-Регистан Г.И., Светличный В.А. и др. О химической природе ауторегуляторного фактора di Pseudomonas carboxydoflava // Микробиология. — М., 1985. Т. 54. — № 2. — С. 186-190.

78. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. — М. : Наука, 1985. — 536с.

79. Патент (Россия) 2294361. Способ производства пива / Борисенко Т.Н., Маюрникова Л.А., Борисенко В.А., — 2007.

80. Патент (Россия) 2319737. Способ приготовления затора из частично несоложеного сырья / Квасенков О.И., Христюк A.B., Касьянов Г.И., — 2008.

81. Петров К.П. «Практикум по биохимии пищевого растительного сырья». — М.: Пищевая промышленность, 1965. — 330с.

82. Петровский A.C., Дерябин* Д.Г., Лойко Н.Г. и др. Регуляция алкилоксибензолами функциональной активности- лизоцима // Микробиология. — М., 2009. Т. 78. —№2. —С. 176-185.

83. Петушкова Е.В. Введение в кинетику ферментативных реакций. — М:: Изд-во МГУ им. Ломоносова, 1972. — 200 с.

84. Поляков В.А., Угрюмова В.Н., Веселов.И.Я. Определение содержания ß-глюкана в ячмене и солоде // Ферментная и спиртовая промышленность. — М., 1976. —№ 1. —С. 38-39.

85. Полыгалина Г.В., Чередниченко B.C., Римарева Л.В. Определение активности ферментов. — М.: ДеЛи принт. 2003. — 298 с.

86. Рихванов Е.Г., Варакина H.H., Русалева T.Mi и др. Изменение; дыхания при действии • теплового шока на дрожжи Saccharomyces cerevisiae // Микробиология.—Mi, 2001. Т. 70.—№ 4.

87. Румянцева Г.Н. 1 емицеллюлазы и пектиназы микроорганизмов:. свойства и аспекты применения // Хранение и переработка, сельхозсырья. — Mi, 1994.— №2:— с.30-32.

88. Рухлядева А.Ш, Нролыгалина? F.B: Методы^ определения: активности гидролитических ферментов: —Mi : Легкая и пищевая промышленность, 1991. —288 с.

89. Рябченюк Л.М. Динамика? тумми-веществг и полигликозидазной активности ферментовячменя в процессе производства солода. Автореф. дисс. . к.т.н. — Киев : 1971. — 24 с.

90. Савина А.Г. Оптимизация технологии пива с применением ферментных препаратов // Пищевые продукты и здоровье: человека:; Тезисы? докладов; 7 Региональной; конференции студентов? и аспирантов, Кемерово, 2007.— Кемерово : КемТИПП, 2007. — С. 58-59.

91. Салманова?Л:С Щитолитические: ферментыsв>пищевой:промышленности.

92. Mi: Легкая и пищевая пром-сть, 1982, — 208 с.

93. Салманова Л .С., Соболевская Т.Н:,. Терешина Э.В. и др; Действие ферментативных препаратов на пивные заторы с повышенным количеством несоложеного ячменя. — М. : Пищевая промышленность, 1991, Инф-выпуск 3.1. С.14-18.

94. Сапожников: Е.В: Пектиновые вещества и: пектолитические ферменты.

95. М. : Биологическая химия, 1971. — 45 с.

96. Сергиенко М.А., Христюк В.Т. Современные тенденции и пути интенсификации:! технологических процессов пивоваренного производства и142повышения качества готового продукта. Изв. вузов. Пищ. технологии. 2006, Юс. Деп. в ВИНИТИ 31.03.2006г., № 354-В2006.

97. Слюсаренко Т.П., Решетник Л.Р. Основы микробиологии, гигиены и санитарии пивоваренного и безалкогольного производств. — М. : Агропромиздат, 1989. — 183 с.

98. Таблицы химического состава и калорийности' российских продуктов питания / Под ред. И.М1 Скурихина, В.А. Тутельяна. — М. : ДеЛи принт, 2007.275 с.

99. Траубенберг С.Е. Научное обоснование, разработка и применение способов активации ферментных препаратов для интенсификации промышленного биокатализа: Автореф. дис. . докт. техн. наук. — М. : 1985.51 с.

100. Траубенберг С.Е., Осташенкова Н.В., Попадич И.А. Изучение спектров флуоресценции а-амилазы Bac.subtilis. — Изв. Вузов GGCP: Пищ. Технология, 1985, №4. —С. 31-35.

101. Траубенберг С.Е., Осташенкова1 Н.В:, Попадич №А. Изучение конформационных изменений' а-амилазы методом кругового' дихроизма. — Изв. Вузов СССР: Пищ. Технология, 1985; №-5: — С. 24-27.

102. Степаненко И.Ю: Изучение роли алкилоксибензолов в стрессовом ответе микроорганизмов. Дисс. . канд. биол. наук. — М., 2005. — 178 с.

103. Федосеева И.В., Варакина Н.Н:, Русалева Т.М. и др. Эффект ионов1. Ca насинтез Hsp 104 и термотолерантность дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Микробиология, 2010, 79, № 2. С. 173-179.

104. Фрайфелдер Д. Физическая«биохимия: — М. : Мир, 1980, — 582 с.

105. Фурсова Т.И., Корнеева О.С., Востриков С.В. Влияние ферментных препаратов »целлюлазы и ксиланазы на сбраживание кукурузного сусла // Пр-во спирта и ликероводочных изделий. — М., 2008. — № 1. — С. 32-33, 47.

106. Химический состав пищевых продуктов / Под ред. И.М. Скурихина, М.Н. Волгарева. —М. : Агропромиздат, 1987. — 359 с.

107. Хлыновский М.Д., Ермолаева Г.А. Углеводный состав пивного сусла иферментолизатов крахмала // Пиво и напитки. — М., 2008. — № 2. — С. 19.143

108. Хлыновский М.Д. Разработка интенсивной технологии сусла на современных пивоваренных заводах: Автореф. дис. на соиск. уч. степ. канд. техн. наук. — М., 2008. — 26 с.

109. Чага С. Влияние на рН и температура върху активността на глюкозооксидаза от P. chysoqenum термоустойчивост на ензима. — Научн. Тр. НИИ коне. Пром., Пловдив (НРБ). 1974, 11. — С. 225-250.

110. Чернобровина А.Г. Ферментативный гидролизат красной смородины, его биохимическая характеристика и применение при получении пищевых продуктов. Дисс. . канд.техн. наук. — М., 2008. — 183 с.

111. Шпилко А.Г. Исследование основных процессов производства сусла и разработка рациональной технологии пива и кваса на заводах малой мощности: Дисс. . канд. техн. наук. — Москва. 2008. — 132 с.

112. Штрауб Ф.Б, Сабольчи Г. Обратимые конформационные переходы белков в области физиологических температур. — В сб. : Молекулярная биология. Проблемы и перспективы. — М.: Наука. 1964. — С. 182-198.

113. Шульгин К.К., Попова Т.Н., Рахманова Т.И., Агаркова А.А. Влияние ионов некоторых металлов на активность глутатионпероксидазы. // Фундаментальные исследования. 2008. № 7. — С. 50—51.

114. Arakawa Т., Timasheff S.N. Mechanism of polyethylene glycol interaction with proteins.//Biochemistry. — 1985. T. 24. —p. 6756 6762.

115. Arakawa Т., Ejima D., Kita Y., Tsumoto K. Small molecule pharmacological chaperones: From thermodynamic stabilization to pharmaceutical drugs // Biochim. Biophys. Acta. Proteins & Proteomics. —2006. V. 1764. —p. 1677 1687.

116. Asano K., and Hashimoto N. Isolation and characterization of foaming proteins of beer/J. Am. Soc. Brev.Chem. —1980. 38.—p. 129-137.144

117. A spinall G.O., Grunwood C.T. Aspects of Chemistry of ceral polysaccharides. J. Inst: Brew. — 1962,68. — № 2.—p. 167-178.

118. Back W. Die verschiedenen Bierstabilitäten als Qualltätssaulen. Oster. Getränke Inst— 2007,61.--№4. —p. 72-73. '

119. Basaveswara Rao V., Sastri N.V.S., SubbaORao P;V: Thermal stabilization of qlucose oxidase and qlucoamylase by physical entrapment. Biochem. J. — 1981, 193. — № 2. — p. 389-394.

120. Basaveswara; Rao V., Sastri N.V.S., Subba Rao P.V.Purification and characterization of thermostable qlucoamylase from the thermophilic funqus Thermomyces lanuqinosus. Biochem. J. — 1981,193. — № 2. — p.: 379 387.

121. Butcher D.M. Enzymes for efficiency. Brewer. —1987. —73, —№ 868. —p. 61 -64. • " •.'.';■ .•:;. ■

122. Era! M., Sakiroqlu H:, Kufrevioqlü J. Purification1 and characterization of polyphenoloxidase from Ferula sp.// Food Chem. — 2006. — 95.— № 3— pi 503— 508.

123. Curioni A., Prcssi G., Füregon E., Peruffo, A. Major proteins, in beer and their precursors' in barley; electroforetic and immunological studies. J. Aqr. And Food Chem. —1995, —№ 10. — p; 2620 - 2626.

124. Einsiedler F., Schwill-Miedauer A., Sommer R. Experimentelle Untersuchungen und Modellierung1: komplexer biochemischer und technologischer Prozesse am Beispiel des Maischens: Teil L Proteolyse/ Monatsschr. Brauwiss. -1997. -50.— №№9-10,.—p. 164-171.

125. Evans D.E., Hejgaard J. The impact of malt derived proteins on beer foam quality. Part I. The effect of germination and kilning on the level of protein Z4, protein Z7 and LTP1. — J. Inst. Brew., 1999. — 105. — p. 159-169.

126. Fontes R., Ribeiro I., Silltro A. Inhibition and activation of enzymes. The effect of a modifier on the reaction rate and on kinetic parameters. Acta Biochimica Polonica. — Vol. 47. — No. 1/2000. — p. 233-257.

127. Gekko K., Timasheff S.N. Mechanism of Protein Stabilization by Glycerol: Preferential Hydration in Glycerol-Water Mixtures // Biochemistry, — 1981. — №20. —p. 4667-4676.j

128. Gjersten P. Filtration of beer and factors influencing ist filterability // Brewers Digest. — 1970. — 45. — № 9. — p. 68-80.

129. Goldanskii V.l., Krupyanskii Yu.F. Protein and protein-bound water dynamics studied by RSMR // Quart. Rev. of Biophysics. — 1989. — V. 22. — p. 39-92.

130. Grujie O., Kokic B. Wort production from using different portion of Malt triticale and commercial enzyme Part 1. Biotechnology / Abstract International Symposium on new Research in Brotechnology — Nov. 2008 Bucharest, Romania.1. P. 97.

131. Grujie O., Kokic B. Wort production from using different portion of Malt triticale and commercial enzyme Part 2. Biotechnology / Abstract International Symposium on new Research in Brotechnology — Nov. 2008 Bucharest, Romania.1. P. 98.

132. Heppcs P. Problematik der Homogenitat des Malzes. — Brauwelt. — .1994. — 134.—№№ 51 52, — p.2741—2742.

133. Jahan M., Batterworth P.J. Studies of chick kidney alkaline phosphatase.— Biochem. Soc Trans., — 1984. — 12. — № 5,—p. 792-793.

134. Janaq K., Ischibashi Y.,. Kondo H, Oka K., Uchida M: Neue Methoden; zur Beurteilung von .Geschmacksstabilität, Schaumeigenschaften und Stabilität von Bier.

135. Klopper W.J. Foam stability and foam cling // Eur. Brew. Gonv. Gongr. Proc.

136. Salzburg. — 1973. — 14. —p. 363-371,

137. Knuckles B.E., Chin M:C. ß-qlucan enrichment of barley fractions by air classification? and» sieving. — J; FoodSci;— 1995, — 60; — № 5.—p. 1070-1074.

138. Koshland D.E. Conformation chanqes at the active: site durinqi enzyme action.

139. Fed. Proc ,.1964,23, jYo 3, p. 719-726.154; Kozubek A., Tyman J.H.P. Resorcinolic: lipids, the natural non-isoprenoid phenolic amphiphiles and their biological activity II Chem. Rev. — 1999. — V. 99.1.—p. 1-31.

140. Krapyanskii Yu.F., Mikhailyuk M.G., Esin S.V. etal. Effects of hydration and interactions: with chemical chaperones on protein dynamics. European Biophysics J. —2005,—V. 34, —№6, —P. 615.

141. Levy H;Mi, Sharon N., Ryan E.M., Koshland D.E. Effect of temperature on therate of hydrolysis of adenosine triphosphate, by myosin with' and, without modifiers.147

142. Evidence for a chanqe in protein conformation. — Biochim. Biophys. Acta; — 1972.56. — № 1, — p. 118- 126.

143. Matsuoka K., Kimura K. Conformational changes in mycobacterium smcqmatis qlutamine synthetase induced by certain divalent cations. — J. Biochem., — 1985, 97, —№ 4,—;p. 1033-1042.

144. Monod J., Wyman J., Chanqeux J.-P. On the nature oßallosteric;transitions: a^ plausible model.—J. Mol. Biol., — 1965, 12,--№ 1,—p: 88- 118.

145. Morita F., Kondo S., Tomari K. etal. Calcium bindinq and conformation of requlatory liqht chains of smooth muscle myosin of scallop. — J. Biochem., — 1985.95, — № 2. — p. 553- 561.

146. Narziss L., LitzenburgerK.ß-glucane und ¡ihre Beinflüssung beim »Maischen //Brauwelt:—1976. — 116. —№ 25. —p. 818-822, 824.

147. Narziss,, L. Modern Wort Boiling. Proc. Inst. Brew. Conv., Somerset West, South Africa. — 1993. — p. 195-212.

148. Narziss L. 150 Jahre seit 1858 — Brautechnologie im Wandel der Zeit, und was kommt jetzt? Teil 2. Mitt. Öster. Getränke Inst. —2009. — 63. — № 1. — p. 410.

149. Neue Aspekte in der Brautechriologie // Brauindustrie.—2008: — №12.— p. 38-41. (

150. Olenson: T., Pommer K., Stentebjerg — Olensen B. New enzymes for brewing: promozyme, a debranching enzyme and SP 249"; a glucanase: — J. Amer. Soc. Brew. Chem. —1984. —42.—№2.—^85-89? v

151. Pazur J.H., OkadatSJiPropertiesofthe; glucoamylase fromiRhizopus delemer.

152. J;.CarbohydlRes.— 1967.— 4; —p: 371^-379: , : ;

153. PierceY.S. Horace Brown Memorial Lecture. The role of nitrogen in brewing. —J. Inst. Brew. — 1987. — № 5. — p. 371-381. ' ''

154. Preece I.A., Bhuijan;M.A.M: i.Enzym ic degradation of cereal hemicelluloses. V. ß-glucan. degradation by a malt enzyme // J! Inst; Brew; — 1964v — 70) — № 4.p. 321-328.

155. Schein C.H. Solubility as a fuctionofproteinstructure and solvent components //Biotechnology. — 1990. — V. 8. — p. 308-317.

156. Shen Dechao, Wang Zhihua; YimYanghao; Chin. Soc. Agr. Eng. — 2006.— 22.—№ 12 —p. 234- 237.

157. Schmitt B. Neu Weg zur enzymatischen Verflüssigung von Obst und Gemüse // Flussiges Obst. —1983. — № 1. — p. 23-27.

158. Silva F., Noqueira L., Gonqcalves C., etal. Electrophoretic and HPLC methodsfor comparative study of the protein fractions of malts, worts and beers produced149from Scarlett and Prestiqe Barley // Food Chem. — 2008. — 106. № 2. — P. 820 -829.

159. Sommer G. Malt protein and beer quality. Brewers Diq. — 1973. — № 9. — p. 47, 60, 62, 66, 68.

160. Streibuch E., Deelen W. Zur enzymatischen Saftgewimiung aus Germuse and Fruchten // Confructa. — 1986. — № 1. — p. 15-23.

161. Strubi P. et al. Neuere Arbeiten über dieTechnologie der Apfelnektar. Herstellung // Ind. Obst und Gemuseverwertung. — 1975. — № 13. — p. 349—351.

162. Takahashi T., Inokuchi N., Irie M. Purification» and characterization of a qlucoamylase from Asperqillus saitoi. — J. Biochem. — 1981. — 89. — № 1. — p. 125-134.

163. Tatzelt J., Prusiner S.B., Welch WJ. Chemical chaperones interfere with the formation of scrapie prion protein // Moll. Cell. Biol. — 1996. —Y. 15. — № 23. — p. 6363-6373.

164. Tiwari A., Bhat R. Stabilization of yeast hexokinase A by polyol osmolytes: Correlation with the physicochemical properties of aqueous solutions // Biophys. Chem. — 2006. — V. 124. — p. 90-99.

165. Timasheff S.N. The control of protein stability and association by weak interactions with water. How do solvents- affect these processes? // Annu. Rev/ Biophys. Biomol. Struct. — 1993. — V. 22. — p. 67-97.

166. Toth M., Laszlo E., Mollo Y. Brewing beer with enzymes and starch analysis. — Stärke. — 1984. — 36, — № 11. — p. 374-378.

167. Vaag P., Molskov Bech L., Cameron-Mills V., Svendsen I. Characterization of a beer foam protein originating from barley // Eur. Brew. Conv. Congr. Proc., Cannes, IRL Press: Oxford, 1999. — 21. — P. 157-165.

168. Van Nierop S.N.E., Evans D.E., Axcell B.C. etal. Impact of different wort boiling temperatures on the beer foam stabilizing properties of lipid transter protein. J. Agric. Food Chem. — 2004, — 52. — p. 3210-3129.

169. Vijayakumar E.K., Weidemann M.J. Kinetic properties of a maqnesium ion-and calcium ion-stimulated adenosine triphosphatase from the outer membranefraction of rat spleen mitochondria. Biochem. J. — 1977, 165, — № 2 — p. 355365.

170. Volkin D.B., Klibanov A.M. A practical approach. In: Protein function / Ed. Creigton T.E. IRL Press, Oxford, UK. — 1989. — p. 1-24.

171. Welch W.J., Brown C.R. Influence of molecular and chemical chaperones on protein folding // Cell Stress and Chaperones. — 1996. — V. 1. — № 2. — p. 109115.

172. Zheng Y.-J., Ornstein R.L. // Biopolimers. — 1996. — V. 38. — p. 791-799.