автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.04, диссертация на тему:Разработка технологии получения хондроитинсульфата из гидробионтов Баренцева моря и изучение его физико-химических свойств

На правах рукописи

УДК 544:664.959 (043.3)

ПОРЦЕЛЬ МАРИЯ НИКОЛАЕВНА

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ХОНДРОИТИНСУЛЬФАТА ИЗ ГИДРОБИОНТОВ БАРЕНЦЕВА МОРЯ И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

05.18.04 - Технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств

02.00.04 - Физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

4оав580

- 3 НОЯ 2011

Мурманск-2011

4858580

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Мурманский государственный технический университет"

Научные руководители:

Кандидат химических наук, Новиков Виталий Юрьевич

Кандидат технических наук, профессор Коновалова Ирина Никандровна

Официальные оппоненты:

Доктор химических наук, профессор Зарембо Виктор Иосифович Кандидат технических наук, доцент Бражная Инна Эдуардовна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Центр "Биоинженерия" РАН

Защита диссертации состоится "3" ноября 2011 г. в 10 час. 00 мин. на заседании диссертационного совета Д 307.009.02. в Мурманском Государственном техническом университете по адресу: 183010, г. Мурманск, ул. Спортивная, д. 13

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Мурманского государственного технического университета по адресу: 183010, г. Мурманск, ул. Спортивная, д. 13

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 183010, г. Мурманск, ул. Спортивная, д. 13, ФГБОУВПО "МГТУ"

Автореферат размещен на сайте www.mstu.edu.ru "26" сентября 2011 г. Автореферат разослан сентября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кайд. техн. наук, профессор

И. Н. Коновалова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Разработка современных технологий переработки гидробионгов является актуальной задачей рыбной отрасли. Создание технологий производства обогащенных пищевых продуктов, профилактических и медицинских препаратов, полученных из морских гидробионгов, включает в себя исследование состава сырья, идентификацию и количественный анализ его компонентов, изучение физико-химических свойств биологически-активных компонентов сырья.

Природный полисахарид хондроитинсульфат (ХС), содержащийся в хрящевой ткани, представляет собой сульфатированный гликозаминогликан, макромолекулы которого состоят из чередующихся мономерных звеньев сульфатированного N-ацетил-О-галактозамина (АцГалА) и D-глюкуроновой кислоты (ГлУ).

Линейные макромолекулы ХС помогают сделать хрящ более устойчивым к давлению, которое оказывает на него вес тела, принимают участие в формировании костной ткани, связок, а также в поддержании упругости и эластичности стенок кровеносных сосудов. ХС является широко используемой пищевой добавкой для лечения дегенеративно-дистрофических заболеваний суставов и позвоночника, например, артроза и остеохондроза. В настоящее время коммерческие препараты ХС получают главньм образом из хрящевой ткани млекопитающих. В последние годы для его производства стали также использовать ткани гидробионгов. Проблемами выделения ХС из различных природных объектов и его применения в медицине и биотехнологии занимаются такие зарубежные ученые как A. Kinoshita,. Н. R. Morris, К. Sugahara, М. J. Miller, С. Е Costello.; Н. Takai,. Т. Копо, С. Amomrut, А. В. Khare, S. A. Houliston, F. Abdel и российские исследователи Т. Н. Шкарина, И. М. Сорокоумов и другие. Современные методы получения ХС представляют собой многостадийные процессы экстракции, а выход конечного продукта и его чистота не всегда высоки. Следует отметить, что физико-химические свойства ХС из гидробионгов, методы их идентификации и количественного анализа, количественные закономерносш химического гидролиза практически не изучены. В связи с этим, разработка новых и совершенствование известных технологий выделения ХС из морских гидробионтов, изучение их физико-химических свойств, методов идентификации и количественного анализа являются актуальными задачами.

Цели работы: изучение содержания и физико-химических свойств ХС гидробионтов Баренцева моря; разработка и совершенствование методов их идентификации и количественного анализа. Разработка технологии получения ХС из гидробионтов.

Для достижения поставленных целей решались следующие задачи:

1. Изучение содержания ХС в гидробионтах Баренцева моря: семге (Salmo salar), черноротой акуле (Galeus melanostomus), длиннорылой акуле

(Deania calceiis), полярной акуле (Somniosus microcephalia), северном скате (Amblyraja hyperborean), морском огурце (Cucumaria frondosa).

2. Разработка методики идентификации и количественного анализа ХС из морских гидробионтов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе солей ГалА и D-глюкозамина в продуктах кислотного гидролиза ХС. Совершенствование методик спек-трофотометрического определения D-галакгозамина (ГалА), АцГалА и ГлУ.

3. Изучение кинетики кислотного гидролиза ХС. Выбор математической модели, адекватно описывающей процесс кислотного гидролиза.

4. Изучение физико-химических свойств водных растворов ХС.

5. Разработка технологии получения ХС с использованием ультрафильтрационных мембран; выбор математической модели, адекватно описывающей технологию получения ХС.

6. Разработка нормативной документации, оценка экономической эффективности технологии получения ХС.

Научная новизна. Впервые разработана мембранная технология получения ХС из гидробионтов Баренцева моря: семги, черноротой акулы, длин-норылой акулы, полярной акулы, северного ската, морского огурца.

Разработана методика идентификации и количественного анализа ХС с помощью ВЭЖХ на обращенной фазе. Методика включает определение ГалА и D-глюкозамина в продуктах кислотного гидролиза ХС. Усовершенствованы методики спектрофотометрического определения ГалА, АцГалА и ГлУ.

Определены спектральные характеристики, фракционный состав, среднемассовая молекулярная масса, поверхностная и оптическая активность ХС из морских гидробионтов; показано влияние концентрации электролита на процесс полиэлектролитного набухания макромолекул полисахарида.

Рассчитаны константы скоростей гидролиза ХС в хлороводородной и серной кислотах. Разработана математическая модель кинетики гидролиза ХС. Предложена методика расчета содержания ХС в исходных объектах с использованием констант скоростей реакции гидролиза ХС.

Впервые показана возможность использования системы ХС-ферментный препарат в качестве биомаркера.

Практическая значимость. Разработана технология получения ХС из гидробионтов Баренцева моря с применением ультрафильтрации.

Выделены ХС из хрящевой ткани семги, черноротой акулы, длинно-рылой акулы, полярной акулы, северного ската, а так же кожных покровов морского огурца.

На основании испытаний на базе учебно-экспериментального цеха ФГБОУВПО "МГТУ", (г. Мурманск) разработана и утверждена технологическая инструкция по получению ХС методом ультрафильтрационного разделения, разработаны Технические условия (ТУ) на "Хондроитин сульфат из тканей морских гидробионтов. Полуфабрикат".

На базе учебно-экспериментального цеха ФГБОУВПО "МГТУ" изготовлена опытная партия ХС, произведенная в соответствии с разработанной

технологической инструкцией.

Подана заявка на патент "Способ получения ХС из тканей морских

гидробионтов".

Основные положения работы, выносимые на защиту:

1. Разработанная технология получения ХС из тканей морских гидробионтов с использованием ультрафильтрационных мембран, имеющих различные молекулярно-массовые пределы задерживания.

2. Разработанные и усовершенствованные методики идентификации и количественного анализа ХС.

3. Результаты изучения закономерностей кислотного гидролиза ХС.

4. Математическая модель кинетики гидролиза ХС, методика расчета содержания ХС в исходных объектах с использованием констант скоростей реакции гидролиза ХС.

5. Результаты изучения физико-химических свойств растворов ХС из тканей морских гидробионтов; возможность применения системы ХС-фермент в качестве биомаркера.

6. Технологическая инструкция на полуфабрикат ХС из тканей морских гидробионтов и ТУ "ХС из тканей морских гидробионтов. Полуфабрикат".

7. Оценка экономической эффективности разработанной технологии.

Внедрение результатов исследований. На основании проведенных

опытно-промышленных испытаний на базе учебно-экспериментального цеха ФГБОУВПО "МГТУ", (г. Мурманск) разработана технологическая инструкция на производство полуфабриката ХС из тканей морских гидробионтов и ТУ "Хондроитинсульфат из тканей морских гидробионтов. Полуфабрикат".

Результаты изучения кинетических закономерностей кислотного гидролиза ХС, методики их идентификации и количественного анализа внедрены в учебный процесс для студентов направлений 020100.62 "Химия" и 260100.62 "Технология продуктов питания", специальности 260302.62 "Технология рыбы и рыбных продуктов" и аспирантов, обучающихся по специальности

02.00.04 "Физическая химия".

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы представлены на научно-технических конференциях профессорско-преподавательского состава, аспирантов, научных и инженерных работников МГТУ "Наука и образование" (г.Мурманск, 2008-2011), Международной научной конференции "Инновации в науке и образовании" КГТУ (г.Калининград, 2009-2010), 10-ой международной конференции молодых ученых "Пищевые технологии и биотехнологии" на базе Казанского государственного технологического университета (г. Казань, 2009), Всероссийской научно-технической конференции "Современные проблемы экологии" (г. Тула, 2008), международной научно-практической конференции "Техника и технологии переработки гидробионтов и сельскохозяйственного сырья" МГТУ

(г. Мурманск, 2008), VIII Всероссийской конференции с международным участием. "Химия и медицина" (Уфа, 2010), 24-th Conference of the European Colloid and Interface Society (Prague, 2010), The 10-th International Conference of the European Chitin Society (г. Санкт-Петербург, 2011).

Экспериментальная часть работы выполнена в Мурманском государственном техническом университете в рамках научно-исследовательской работы по госбюджетной теме "Химический и электрохимический гидролиз гидро-бионтов различной природы" (ГР 01200603803) и Госконтракта № П744.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ, подана заявка на получение патента (№2010153884 (077891)).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, списка литературы (161 наименование) и 4 приложений. Работа изложена на 132 страницах, содержит 15 таблиц, 36 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Во введении обоснована актуальность работы, сформулированы цель исследования, научная новизна, защищаемые положения. Показана практическая значимость результатов работы.

В первой главе "Обзор литературы" приведен анализ отечественной и зарубежной литературы по вопросам строения, свойств, идентификации и применения ХС. Изложены современные технологии получения ХС из тканей млекопитающих и гидробионтов.

Во второй главе "Объекты и методы исследования" определены объекты исследования, методы анализа, и порядок статистической обработки экспериментальных данных.

ХС получали по описанной в литературе технологии и по разработанной технологии с использованием ультрафильтрации.

В качестве сырья были выбраны ткани следующих гидробионтов: семга, черноротая акула, длиннорылая акула, полярная акула, северный скат, морской огурец.

Спектры поглощения образцов ХС в таблетках КВг регистрировали на инфракрасном спектрофотометре IR-420 (Shimadzu Corp., Япония) в диапазоне частот от 4000 до 400 см'1.

Спектры ЯМР получали на спектрометрах Bruker Avance 600 и DRX 500 при 303-306 К после однократной лиофилизации образцов из D20 и последующего растворения их в 99,96 % D20. Анализ проводился в Институте органической химии им. Н. Д. Зелинского Российской академии наук.

Количество АцГалА определяли спектрофотометрическим методом, основанном на образовании окрашенного комплекса АцГалА с п-диметиламинобензальдегидом. Оптическую плотность растворов измеряли

на спектрофотометре UV-3101PC (Shimadzu Corp., Япония) при длине волны 585 нм. Содержание восстанавливающих Сахаров определяли спектрофо-тометрическим методом с гексацианоферратом калия.

Количество азота определяли методом Кьельдаля на автоматической системе определения общего азота/белка Kjeltec Auto System 1043 (Tecator, Швеция).

Количественное определение ХС проводили усовершенствованными методами: спектрофотометрическим методом определения уроновых кислот (расчет значения оптической плотности по трем точкам) и спектрофотометрическим методом определения ГалА с использованием п-диметиламино-бензальдегида. ГалА, образующийся при полном кислотном гидролизе ХС, определяли разработанным методом с использованием ВЭЖХ на обращенной фазе.

Для изучения фракционного состава полученных ХС использовали эксклюзионную ВЭЖХ. Хроматографирование растворов образцов проводили на жидкостном хроматографе LC-10AVP (Shimadzu Corp., Япония) с использованием эксклюзионной колонки TSK-gel Alpha-4000 (30x0,78 см) с предколон-кой TSK-guardcolumn Alpha (6x0,4 см) (TOSOH, Япония). Анализ выполняли в лаборатории биохимии и технологии ПИНРО (г. Мурманск).

Содержание сульфатов определяли титриметрическим методом (определение неорганического сульфата по ГОСТ 28478-90).

Среднемассовую молекулярную массу ХС определяли нефеломегтриче-ским методом.

Гидродинамический радиус макромолекул оценивали методом дисперсии светорассеяния.

Оптическую активность растворов оценивали по углу вращения плоскости поляризации плоско поляризованного света, который измеряли на поляриметре СП-3 (Россия) на длине волны излучения паров натрия.

Поверхностную активность водных растворов ХС на границе с воздухом определяли по кривой зависимости поверхностное натяжение-концентрация. Поверхностное натяжение водных растворов определяли методом Вильгельми.

Экзогликозидазную активность рассчитывали по выходу восстанавливающих Сахаров, образующихся при гидролизе ХС. Содержание восстанавливающих Сахаров определяли по реакции с гексацианоферратом калия.

В третьей главе "Результаты и их обсуждение" приведены результаты исследований и их обсуждение и разработанная технология получения ХС из гидробионтов методом ультрафильтрации.

1. Разработка и совершенствование методов идентификации ХС

По описанной в литературе технологии получения ХС из гидробионтов были выделены ХС из семги, черноротой акулы, длиннорылой акулы, полярной акулы, северного ската и морского огурца. Полученные ХС были

идентифицированы следующими методами: инфракрасной спектроскопии (ИКС), ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и разработанным методом с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

1.1. Идентификация ХС методом инфракрасной спектроскопии

На рис. 1 приведены инфракрасные спектры поглощения ХС, полученных из морских гидробионтов Баренцева моря (кривые 1-5), в сравнении с литературными данными (кривая 6). На кривой 6 имеются три характерных пика, которым соответствуют частоты 1550, 1350-1300, 1160-1120 см , что свидетельствует о соответствии спектров полученных препаратов приведенным в литературе. ИКС дает возможность определить источник получения ХС по специфическим полосам поглощения - 850 см"1 (ХС-4, преобладающий в сырье из тканей млекопитающих и птиц) или 820 см"1 (ХС-6, характерный для хрящей рыб).

Т-1-1-1-г

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 Волновое число, сыт1

Рис. I - Инфракрасные спектры ХС из хрящей:

1 - черноротой акулы; 2 - длиннорылой акулы; 3 - северного ската; 4 - семги;

5 - из покровов морского огурца; 6 - литературные данные (семга)

1.2. Идентификация ХС методом ЯМР

Для образцов ХС были зарегистрированы спектры ЯМР 'Н и 13С. Эти спектры были идентичны для разных образцов по положению сигналов, однако отличались интегральной интенсивностью последних. На рис. 2 приведены спектры ХС из семги, полярной акулы, черноносой акулы, длиннорылой акулы, северного ската.

ЛьМл.

___I

д

-J|_

5.5 4.5 3.5 2.5 5 м.д.

5.5 4.5 3.5 2.5 8 м.д.

Рис. 2 - 'Н ЯМР спектры ХС (303-306 К) из (А) семги, (Б) полярной акулы, (В) черноносой акулы, (Г) длиннорылой акулы, (Д) северного ската

На основании данных по химическим сдвигам *Н и 13С ЯМР моноса-харидных остатков и внутрициклических КССВ между протонами было установлено, что первая группа сигналов (= 4,57/102,4 м.д.) в аномерной области НБС^С спектра отвечает остаткам Р-ГалА, а вторая группа (~ 4,48/105,4 м.д.) - остаткам ГлУ. Химические сдвиги *Н и 13С в остатках Р-ГалА свидетельствовали о том, что они полностью Ы-ацетилированы и сульфатированы по положениям С6 (большинство остатков) или С4 (минорное количество остатков), что характерно для ХС, полученных из рыб.

ЯМР анализ образцов ХС, полученных из исследованных гидробионтов, выявил в их структуре три дисахаридных блока (А, Б и С), которые помимо ацетильной группы могут содержать аминокислотные заместители (в основном глицин), связанные с атомом азота Р-ГалА. На рис. 3 приведены соответствующие схемы строения.

блок А

блок Б

"°°С о'°18иСОНо "°°С ГС0"3'

ноа^-Т-Д^О-Л»—0 ---(«Л _

НО д он мня)

гЛ0

блок С

но ос

но

■0350 он

мня

он

ЫОЕ Н2С-

I

ынг

Рис. 3 - Дисахаридные блоки ХС, полученных из гидробионтов Баренцева моря

Я = Ас, СОСН2ЬЖ21 другиа аминокислоты, п + т-13-18

БлокА 5-8% Блок Б - 62-70%, Блок С - 22-32%

1.3. Физико-химические свойства растворов ХС

В образцах ХС, полученных из морских гидробионтов, были определены среднемассовая молекулярная масса (ММ), поверхностная (в) и оптическая активность ([а]20с) (табл. 1).

Таблица 1

Среднемассовая молекулярная масса, оптическая и поверхностная активность ХС

Источник ММ, Da MV G, Джхм/моль Ю1

семга -60000 -30,4 55,9

черноротая акула -65000 -62,4 61,1

длиннорылая акула -80000 -19,2 66,3

полярная акула -85000 -73,6 56,5

северный скат -50000 -40 94,9

морской огурец -120000 -16 136,3

Из данных, приведенных в таблице, следует, что свойства полученных по описанной в литературе технологии препаратов ХС зависят от вида сырья и, по всей видимости, наличия остаточных примесей, например, веществ белковой природы.

Изучена экзогликозидазная активность ферментного препарата из ге-патопанкреаса камчатского краба с использованием ХС как субстрата. Активность фермента на чистом ХС составляет 7,01x1o"4 мкмоль/мин-мг, на загрязненном нефтью - 3,65x1o"4, ПАВ - 5,37x10"4, при комплексном загрязнении - 2,28хЮ"4. Полученные результаты показали, что систему ХС (субстрат) - фермент можно использовать в качестве биомаркера Состояние системы, которое определяется и факторами окружающей среды, может использоваться в качестве показателя биологического состояния организма.

1.4. Идентификация ХС разработанным методом с помощью ВЭЖХ

Для качественного определения ХС часто применяется спекгрофото-метрический метод Дише, основанный на цветной реакции уроновых кислот с карбазолом. ГлУ, входящая в состав ХС, реагирует с карбазолом, образуется розовое окрашивание. Так как почти все виды гликозаминогликанов (гиа-луроновая кислота, дерматансульфат, ХС) содержат в своем составе уроновые кислоты, метод Дише не является избирательным, а показывает суммарное содержание гликозаминогликанов. Поэтому дня избирательного определения ХС использовали разработанный метод идентификации и количественного анализа ГалА, образующегося при кислотном гидролизе ХС. С помощью ВЭЖХ на обращенной фазе разделяли пики производных ГалА и D-глюкозамина, полученных восстановлением с NaBHt и последующей реакцией с ортофталевым альдегидом (OPA). Были подобраны соответствующие градиенты и состав буферных растворов.

На рис. 4 приведены хроматограммы гидролизата ХС из хрящей семги в сравнении с хроматограммами гидролизата хитина, содержащего В-глюкозамин, и смеси аминокислот. Как видно из- рис. 4, хроматограммы гидролизатов ХС содержат четкий пик ГалА, что идентифицирует полученный полисахарид как ХС.

Время, мин.

Рис. 4-Хроматограммы гидролизатов полисахаридов: гидролизатхитина(1), гидролизат ХС (2) и смесь аминокислот (3)

Подобранные условия хроматографирования позволили полностью разделить пики ОРА-производных восстановленных ГалА и О-глюкозамина. Из приведенного графика так же следует, что пики аминокислот не накладываются на пики изучаемых углеводов, что позволяет проводить идентификацию продуктов гидролиза полисахаридов. Количество ГалА в пробе пропорционально площади соответствующего пика на хроматограмме. Таким образом, разработанный метод позволяет определить количество ХС в анализируемой пробе.

Разработанный метод может быть применен для анализа других гликоза-миногликанов (например, гиалуроновой кислоты), полисахаридов (например, хитина) и сырья, содержащего ХС. Содержание ХС (масса ХС/масса сухого сырья, %) в изучаемых гидробионтах приведено в таблице 2.

Таблица 2

Содержание ХС в сухой обезжиренной хрящевой ткани гидробионтов

Баренцева моря

Сырье ХС, (%)

Семга 10,31

Полярная акула 13,96

Черноносая акула 7,53

Длиннорылая акула 6,66

Северный скат 15,51

Из данных таблицы следует, что наиболее перспективными видами для получения ХС являются полярная акула и северный скат.

Разработанным методом были проанализированы новые пищевые продукты из северного ската (разработка кафедры "Технологий пищевых производств" МГТУ - заливное, запеканка и бульон).

Поскольку количественный анализ ХС с помощью разработанного метода ВЭЖХ основан на определении мономерных фрагментов ГалА, были изучены закономерности кислотного гидролиза ХС, полученного из хрящей семги.

2. Кинетика кислотного гидролиза ХС

Кислотный гидролиз гликозидных связей в ХС в зависимости от концентрации кислоты, времени гидролиза и температуры сопровождается образованием олигомеров с различной молекулярной массой, дисахарида хондрозина и мономеров ГлУ и АцГалА.

Сульфатированный АцГалА, входящий в состав ХС, в условиях кислотного гидролиза десульфатируется и деацегилируется с образованием ГалА.

На рис. 5 приведены кинетические кривые гидролиза ХС из хрящей семги с образованием ГалА при концентрации НС14-12 моль/дм3. Концентрацию ГалА определяли разработанным методом с использованием ВЭЖХ.

Рис. 5 - Кинетика кислотного гидролиза ХС с образованием ГалА.

Концентрация HCl: 1-12 моль/дм5; 2-6 моль/дм3; 3-4 моль/дм3; сплошная линия -кинетическая кривая, рассчитанная с помощью константы гидролиза, маркеры - экспериментальные значения

Из данных, приведенных на рис. 5, следует, что при концентрации HCl 12 моль/дм3 через 100-120 минут после начала гидролиза происходит уменьшение концентрации ГалА в гидролизате (кривая 1). По всей видимости, в условиях гидролиза происходит разрушение ГалА. При концентрации HCl 4 и 6 моль/дм3 концентрация ГалА возрастает, достигая практически

постоянных значений за время гидролиза 100-120 минут (кривые 2,3), при этом разрушения ГалА не наблюдается.

Анализ кинетических кривых образования ГалА показал, что реакция может быть описана кинетическим уравнением первого (псевдопервого) порядка. В реакциях псевдопервого порядка истинный второй порядок снижен благодаря значительному избытку одного из реагентов, концентрация которого практически не меняется в ходе реакции и порядок реакции вследствие этого равен порядку по одному из реагентов.

В условиях эксперимента соотношение раствор кислоты : ХС было 100:1. Для расчета константы скорости реакции гидролиза ХС с образованием ГалА использовали кинетическое уравнение первого порядка:

b(t) = Aa-(l-e-b ),

где t- время;

Ъ - концентрация ГалА;

Ао - начальная концентрация ХС;

к— константа скорости реакции.

Гидролиз гликозидных связей в ХС начинается с протонирования гликозидного атома кислорода. При этом образуется оксониевый катион, который затем нуклеофильно атакуется гидролизующим агентом. Рассчитанные константы гидролиза гликозидных связей в ХС зависят от концентрации катализатора - кислоты и гидролизующего агента - воды.

Для расчета константы скорости реакции гидролиза ХС использовали программное обеспечение Microsoft Excel.

Для определения содержания ХС в исходных образцах предложена методика расчета с использованием констант скоростей реакции гидролиза гликозидных связей в молекуле ХС. Так, для гидролиза ХС в НС1 с концентрацией 12 моль/дм3, константа скорости гидролиза равна К = 136,9х104 с~~\А0- исходная навеска в пересчете с ХС составляет 1,00 ммоль/дм3, Aq.^ - расчетное содержание ХС составляет 1,02 ммоль/дм3. Для других концентраций НС1 получены аналогичные результаты.

Кинетика гидролиза ХС по изменению концентрации ГлУ в гидролизатах при различной концентрации НС1 приведена на рис. 6. Концентрацию ГлУ определяли усовершенствованным методом Дише.

D-глюкуроновая кислота после гидролиза гликозидных связей практически сразу начинает разрушаться и ее концентрация уменьшается. Для расчета константы скорости реакции гидролиза ХС с разрушением ГлУ использовали кинетическое уравнение первого порядка

c(t) = C0-e-k",

где t - время,

С — концентрация ГлУ,

С0 - начальная концентрация ГлУ;

к^ - константа скорости реакции.

50 100 150 200 Время гидролиза, мин.

250

Рис. 6 - Изменение концентрации ГлУ во времени при кислотном гидролизе ХС. Сплошная линия - кинетическая кривая, рассчитанная с помощью константы гидролиза,

маркеры -экспериментальные значения. Концентрация HCl: 1.-4 моль/дм3;

2.-6 моль/дм3, 3. -12 моль/дм5

На основе кинетических кривых рассчитаны константы скоростей реакции разрушения ГлУ в ХС. Как следует из кинетических кривых, приведенных на рис. б, экспериментальные данные практически совпадают с кривыми, рассчитанными с помощью констант гидролиза.

С использованием констант разрушения ГлУ были рассчитаны начальные концентрации ХС в исходных образцах. Так, при концентрации HCl = 12 моль/дм3, константа скорости гидролиза равна К= 24,2* 10'3 с"1, начальная концентрация ГлУ Со (навеска в пересчете с ХС) составляет 0,50 ммоль/дм3, а расчетная концентрация ГлУ составляет Со.раОЧ 0,40 ммоль/дм3.

Таким образом, оценить содержание ХС в исходном образце можно с помощью кинетических кривых образования ГалА и разрушения ГлУ в процессе гидролиза ХС. При использовании кинетических кривых гидролиза с разрушением ГлУ, полученных методом Дише, результат может быть завышен за счет ГлУ, входящей в состав других гликозаминогликанов, например, гиалуроновой кислоты и дерматан сульфата. При использовании кинетики образования ГалА, содержание которого определяется методом ВЭЖХ, полученный результат характеризует содержание только ХС в исследуемом препарате.

3. Фракционный состав ХС

Фракционный состав ХС изучали с использованием эксклюзионной ВЭЖХ. На рис. 7 представлены хроматограммы образцов ХС из хрящей семги в зависимости от концентрации NaCl в элюенте.

Рис. 7 - Хроматограммы образцов ХС в зависимости от концентрации ИаС1 в элюенте: 1-0 моль/дм3,2 - 0,001 моль/дм3,3 - 0,005 моль/дм3,4 - 0,1 моль/дм3

При хроматографировании растворов, содержащих ХС, было обнаружено смещение пиков одной хроматограммы относительно другой. Было показано, что на положение пиков влияет ионная сила раствора элюента - хлорида натрия. С увеличением ионной силы пики сдвигаются вправо. При уменьшении ионной силы раствора более выгодными являются развернутые кон-формации макромолекул полиэлектролитов (так называемое полиэлектролитное набухание). Среднестатистические размеры молекул растут, и это приводит к уменьшению удерживаемых объемов в эксклюзионной ВЭЖХ. Избежать полиэлектролитного набухания можно добавлением в раствор нейтрального электролита, экранирующего ионные группы. В этом случае хроматограмма образцов будет соответствовать их молекулярно-массовому распределению. Было установлено, что полное подавление полиэлекгролитного набухания наблюдается при концентрации №С1, превышающей 0,05 моль/ дм3 (ионная сила раствора равна 0,05 моль/дм3). При меньшей ионной силе раствора наблюдается несколько пиков на хроматограммах, обусловленных различными конформациями молекул ХС. При концентрации хлорида натрия больше 0,05 моль/дм3 наблюдаются два основных перекрывающихся пика с удерживаемыми объемами 10 и 10,8 мл, соответствующими двум фракциям полисахарида. Явление полиэлектролитного набухания ХС может быть использовано при его получении и очистке с помощью ультрафильтрационных мембран, имеющих различный молекулярно-массовый предел задерживания.

4. Выделение ХС из морских гидробионтов с использованием ультрафильтрации

Разработанный метод выделения ХС из морских гидробионтов с использованием мембран заключается в том, что для разделения смеси солей,

аминокислот, низкомолекулярных пептидов и целевого полисахарида -ХС, содержащихся в гидролизате хрящевой ткани, используется разделение на ультрафильтрационных мембранах.

С помощью таких мембран повышается степень очистки ХС. Это объясняется тем, что макромолекулы ХС в значительной степени способны изменять гидродинамический радиус при изменении ионной силы раствора. Степень очистки ХС повышается путем последовательного пропускания гидролизата, полученного из хрящевой ткани морских гидробионтов, через мембраны с различным молекулярно-массовый пределом задерживания.

В качестве сырья для получения ХС с помощью мембран использовали хрящевую ткань семги. Подготовленное сырье измельчали и загружали в реакционную емкость, в которой проводили щелочной, затем ферментативный гидролиз. Использовали ферментный препарат (ФП), полученный из гепа-топанкреаса камчатского краба, по технологии, разработанной в ПИНРО (г. Мурманск)

Гидролизат хрящевой ткани, полученный после щелочной и ферментативной обработки сырья содержит продукты расщепления белков, соли, высокомолекулярные полисахариды (ХС, гиалуроновую кислоту, дерматан сульфат, кератан сульфат). Данный раствор направляли на стадию мембранной очистки, которая заключается в следующем.

Раствор сначала пропускали через ультрафильтрационную мембрану с мо-лекулярно-массовым пределом задерживания менее 50 кДа для отделения оставшихся после гидролиза высокомолекулярных белков и взвешенных частиц. После этого полученный раствор ХС, низкомолекулярных пептидов, аминокислот и солей разделяли на мембране с молекулярно-массовым пределом задерживания 5 кДа, обеспечивающей задержание молекул ХС и отделение молекул солей, аминокислот и низкомолекулярных пептидов.

Методом дисперсии светорассеяния был определен гидродинамический радиус макромолекул ХС из хрящей семги. Было установлено, что при концентрации №С1 0,001 моль/дм3 молекулы ХС разворачиваются. Максимальный гидродинамический радиус молекул ХС наблюдается в дистиллированной воде, поэтому удержанный на мембране с молекулярно-массовым пределом задерживания 5 кДа раствор ХС промывали дистиллированной водой. В результате этой операции концентрация соли снижается и значительно увеличивается гидродинамический радиус молекулы ХС. Далее этот раствор переносили на мембрану с молекулярно-массовым пределом задерживания 50 кДа, где высокомолекулярные фракции ХС концентрировались, а низкомолекулярные пептиды и аминокислоты проходили без задерживания. Сконцентрированный на этой мембране раствор ХС далее использовали для выделения сухого препарата ХС. Выделение сухого ходроитин сульфата из концентрированного раствора проводили методом осаждения при добавлении к раствору избытка осадигеля - этилового спирта с концентрацией 96 %.

На рис. 8 приведены молекулярно-массовые распределения ХС, полученного по известной технологии и по разработанной ультрафильтрационной технологии.

Рис. 8 - Молекулярно-массовое распределение ХС; 1 - ХС получен по известной технологии, 2 - ХС получен по разработанной технологии

Полученный по технологии с использованием ультрафильтрации ХС характеризуется более узким молекулярно-массовым распределением и более высокой степенью очистки.

В четвертой главе "Разработка технологии получения ХС из морских гидробионтов с использованием мембран" определены близкие к оптимальным технологические параметры стадии осаждения ХС из раствора очищенного гидролизата.

При моделировании процесса осаждения ХС из гидролизата было использовано центральное ортогональное композиционное планирование. В качестве функции отклика У было выбрано содержание ХС, в качестве влияющих факторов: количество этанола в растворе ху, %, и продолжительность процесса х2, час. Математическая модель, описывающая процесс выпадения полисахаридов из раствора ферментного гидролизата хрящевой ткани была получена с помощью компьютерной программы Бй^йса 8.0, позволяющей получать уравнение регрессии, связывающее функцию отклика с выбранным количеством влияющих факторов.

Поверхность функции отклика У в зависимости от влияющих факторов при осаждении полисахарида представлены на рис. 9.

Рис. 9 - Поверхность функции отклика Y- выход ХС

Уравнение регрессии процесса осаждения ХС:

Y= -28,16+ 0,355х/ - 0,007л:,2 + 1,055 х2 - 0,008 х22.

Расчетные значения влияющих факторов, наиболее близкие к оптимальным: приху=75 %;х2=20 часов.

Анализ полученных данных показал, что продолжительность процесса осаждения ХС из раствора имеет оптимум на поверхности функции отклика, для получения максимального количества ХС достаточно 20 часов. Поэтому, рациональными условиями протекания процесса осаждения ХС являются: соотношение гидролизат: спирт - 1:3, продолжительность - 20 часов.

Технологическая схема процесса получения ХС из гидробионтов с использованием ультрафильтрационных мембран, имеющих различный мо-лекулярно-массовый предел задерживания, представлена на рис. 10.

Рис. 10 - Технологическая схема получения ХС из гидробионтов с использованием мембран.

Полученные данные оптимизации были использованы при разработке технологической инструкции "Хондроитинсульфат из тканей морских гид-робионтов. Полуфабрикат" и Технических условий "Хондроитинсульфат из тканей морских гидробионтов. Полуфабрикат".

В таблице 3 приведена характеристика ХС, на соответствие требованиям ТУ "Хондроитинсульфат из тканей морских гидробионтов. Полуфабрикат".

Таблица 3

Характеристика ХС

Наименование показателя Требования ТУ 928013-00472182-И Значение показателя

Массовая доля воды, % не более: 10 9±0,5

Массовая доля ХС, % не менее 70 75±5

Массовая доля сульфатов, % не менее 15 17*2

Экономический эффект разработанной технологии ожидается за счет уменьшения количества спирта на стадии осаждения ХС из раствора, так как гидролизат концентрируется на мембране до конечного объема 1,5-2 дм3. Кроме того, на выходе получается продукт с заданным диапазоном средней молекулярной массы, очищенный от солей, что позволяет исключить из технологического процесса стадию длительного диализа, присутствующую в известных технологиях.

ВЫВОДЫ

1. Впервые изучено содержание ХС в гидробионтах Баренцева моря: семге (Salmo salar), черноротой акуле (Galeus melanostomus), длиннорылой акуле (Deania calceus), полярной акуле (Somniosas microcephalus), северном скате (Amblyraja hyperborean), морском огурце (Cucumaria frondosa). Показано, что наиболее перспективными видами для получения ХС являются полярная акула, северный скат и семга. Содержание ХС в этих гидробионтах соответственно составляет 13,96 %, 15,51 % и 10,31 % (масса ХС/масса сухого сырья).

2. Разработан метод идентификации и количественного анализа ХС из морских гидробионтов с помощью ВЭЖХ на обращенной фазе по содержанию ГалА в продуктах кислотного гидролиза ХС. Усовершенствованы спекгрофотометрические методики анализа ГалА, АцГалА и ГлУ. Предложены методы количественного определения ХС в исходном сырье, конечном продукте и пищевых продуктах.

3. Рассчитаны константы скорости реакции гидролиза ХС с образованием ГалА и разрушения глюкуроновой кислоты при концентрациях НС1 4, 6, 12 моль/дм . Выбрана математическая модель, адекватно описывающая процесс кислотного гидролиза ХС.

4. Определены среднемассовые молекулярные массы ХС из гидро-бионтов Баренцева моря, поверхностная и оптическая активность их водных растворов. Показано, что при добавлении NaCl с концентрацией 0,05 моль/дм3 полиэлектролитное набухание макромолекул ХС подавляется. Установлена возможность использования системы ХС-фермент в качестве биомаркера.

5. Разработана технология получения ХС из гидробионтов с использованием ультрафильтрационных мембран, имеющих различный молекуляр-но-массовый предел задерживания. Определены близкие к оптимальным параметры стадии осаждения ХС из раствора. Показано, что ХС, полученный по технологии с использованием ультрафильтрационных мембран, характеризуется высокой степенью очистки и более узким молекулярно-массовым распределением по сравнению с ХС, полученным по известной технологии.

6. Разработана технологическая инструкция для получения ХС из гидробионтов, и технические условия на полуфабрикат "Хондроитин сульфат из тканей морских гидробионтов". Оценена экономическая эффективность разработанной технологии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК РФ:

1.Порцель, М. Н. Мембранное разделение полисахаридов и белков при извлечении хондроигинсульфата из морских гидробионтов / М. Н. Порцель, В. Ю. Новиков, И. Н. Коновалова// Рыбное хоз-во. - 2009. - № 4. - С. 116-118.

2. Порцель, М. Н. Хондроитинсульфаты морских гидробионтов Баренцева моря / М. Н. Порцель, В. Ю. Новиков, И. Н. Коновалова // Рыбное хоз-во. - 2010. -№ 3. - С. 78.

3. Порцель, М. Н. Кинетика кислотной деполимеризации хондрои-тинсульфата / М. Н. Порцель, В. Ю. Новиков, И. Н. Коновалова // Изв. вузов. Сер. Химия и хим. технол. - 2010. - Т. 53, № 6. - С. 67-70.

4. Крылов, В. Б. Предварительная структурная характеристика, противовоспалительная и антикоагулянтная активности хондроигинсульфатов из хрящей морских рыб / В. Б. Крылов, А. А. Грачев, Н. Е. Устюжанина, Н. А. Ушакова, М. Е. Преображенская, Н. И. Козлова, М. Н. Порцель, И. Н. Коновалова, В.Ю. Новиков, X.X. Зиеберт, A.C. Щашков, Н.Э. Нифантьев // Изв. Акад. наук. Сер. Хим. - 2011. - № 4. - С. 731-738.

Статьи в журналах и материалы конференций:

1.Снегерева, М. Н. Выделение хондроитина сульфата из хрящевой ткани рыб и изучение его физико-химических свойств / М. Н. Снегерева, В. Ю. Новиков, К. В. Реут, И. Н. Коновалова // Всерос. науч.-техн. конф. "Современные проблемы экологии", 30 июня 2008 г. - Тула, 2008. - С. 20-21.

2. Снегерева, М. Н. Изучение физико-химических свойств хондроитина сульфата из хрящевой ткани рыб / М. Н. Снегерева, В. Ю. Новиков, И. Н. Коновалова // Материалы Мурман. науч.-пракг. конф. "Техника и технология переработки гидробионтов и сельскохозяйственного сырья", 24-25 апр. 2008 г. - Мурманск, 2008. - С. 56.

3. Снегерева, М. Н. Физико-химические свойствахондроитин сульфата, полученного из хрящевой ткани семги / М. Н. Снегерева, В. Ю. Новиков, К. В. Реут, И. Н. Коновалова // Материалы науч. сессии "Применение ПАВ в пищевой промышленности", 15-17 сентября 2008 г. - Мурманск, 2008. - С. 111.

4. Снегерева, М. Н. Получение хондроитина сульфата из хрящевой ткани рыб и изучение его свойств / М. Н. Снегерева, В. Ю. Новиков, И. Н. Коновалова // Материалы Междунар. науч.-техн. конф. "Наука и образование 2008", г. Мурманск, 1-9 апр. 2008 г. / МГТУ. - Мурманск, 2008. - С. 311-313.

5. Снегерева, М. Н. Фракционирование полисахаридов и белков из хрящей семги / М. Н. Снегерева, В. Ю. Новиков, И. Н. Коновалова// Сборник 10-ой междунар. конф. молодых ученых "Пищевые технологии и биотехнологии", г. Казань, 12-15 мая 2009 / Казанский гос. технолог, ун-т. - Казань, 2009. - С. 338.

6. Снегерева, М. Н. Кислотный гидролиз хондроигинсульфата / М. Н. Снегерева, В. Ю. Новиков, И. Н. Коновалова // Материалы Междунар. науч.-техн. конф. "Наука и образование 2009", г. Мурманск, 1 -9 апр. 2009 г. / МГТУ. -Мурманск, 2009. - С. 319-322.

7. Порцель-Снегерева, М. Н. Гидролиз гликозидных связей в хонд-роитинсульфате / М. Н. Порцель-Снегерева, В. Ю. Новиков, И. Н. Коновалова // Труды 7-ой междунар. науч. конф. "Инновации в науке и образовании-2009" / КГТУ. - Калининград, 2009. - С. 257-260.

8. Порцель, М. Н. Кинетика химического гидролиза полисахаридов, полученных из гидробионтов / М. Н. Порцель, Н. В. Долгопятова // Материалы школы молодых ученых "Научно-прикладные проблемы химической технологии минерального сырья и гидробионтов Кольского региона", 27 октября 2009 г. - Мурманск, 2009. - С. 61-66.

9. Порцель, М. Н. Выделение хондроигинсульфата из кукумарии / М. Н. Порцель, В. Ю. Новиков, И. Н. Коновалова // Наука и образование-2010 [Электронный ресурс] : междунар. науч.-техн. конф., Мурманск, 5-9 апр. 2010 г. / МГТУ. - Электрон, текст дан. (139 Мб). - Мурманск : МГТУ, 2010. -1 электрон, опт. диск (CD-ROM). - С. 489-491. - Гос. per. НТЦ "Ин-формрегистр" № 0321000362.

10. Изучение строения антикоагулянтной и противовоспалительной активности хондроитин сульфатов из хрящей семги и полярной акулы / В. Б. Крылов, Н. Е. Устюжанина, А. А. Грачев, Н. А. Ушакова, М. Н. Порцель, В. Ю. Новиков, И. Н. Коновалова, М. Е. Преображенская, Н. Э. Нифантьев И Химия и медицина: Материалы VIII Всерос. конф. с междунар. участием, 68 апр. 2010 г. - Уфа, 2010. - С. 213.

11. Порцель, M. H. Исследование фракционного состава хондроитин-сульфатов из морских гидробионтов методом ВЭЖХ / M. Н. Порцель, В. Ю. Новиков, И. Н. Коновалова // Материалы конф. "Инновации в науке и образовании - 2010", Калининград, 19-21 окг. 2010 г. - Калининград, 2010. - С. 88-90.

12. Порцель, M. Н. Хроматографический анализ хондроитинсульфа-тов из гидробионтов / M. Н. Порцель, В. Ю. Новиков, И. Н. Коновалова // Наука и образование-2011 [Электронный ресурс] : междунар. науч.-техн. конф., Мурманск, 4-8 апреля 2011 г. / МГТУ. - Электрон, текст дан. (30 Мб). - Мурманск : МГТУ, 2011.-1 электрон, опт. диск (CD-ROM). - С. 365-368. - Гос. per. НТЦ "Информрегистр" № 0321100504.

13. Portsei, M. N. Polysaccharide analysis by reversed-phase HPLC / M. N. Portsei, V. Yu. Novikov, I. N. Konovalova // Advances in Chitin Science. Vol. XI. Proc. of the 10-th Int. Conf. of the European Chitin Society, 20-24 May 2011 y./ ed. by V. Varlamov, S. Bratskaya, I. Yakovleva, S. Senel. - S.Petersburg, 2011. - P. 219-223.

Автор благодарит сотрудников лаборатории биохимии и технологии Полярного научно-исследовательского института морского рыбного хозяйства и океанографии им. Н.М. Книповича (г.Мурманск) и лаборатории химии гликоконьюгатов Института органической химии им. Н. Д. Зелинского Российской академии наук (г.Москва) за помощь в проведении физико-химических анализов.

Издательство МГТУ. 183010 Мурманск, Спортивная, 13. Сдано в набор 19.09.2011. Подписано в печать 23.09.2011. Формат 60х841Лб. Бум. типографская. Усл. печ. л. 1,39. Уч.-изд. л. 1,03. Заказ 335. Тираж 100 экз.

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Строение хондроитинсульфата

1.2 Свойства хондроитинсульфата

1.3 Получение хондроитинсульфата

1.3.1 Источники хондроитинсульфата

1.3.2 Основные стадии получения хондроитинсульфата

1.4 Идентификация хондроитинсульфата

1.4.1 Идентификация методом РЖ спектроскопии

1.4.2 Метод капиллярного электрофореза

1.4.3 Метод ядерного магнитного резонанса

1.4.4 Другие методы идентификации хондроитинсульфата

1.5 Методы количественного анализа хондроитинсульфата

1.6 Терапевтические роли хондроитинсульфата

1.7 Выводы. Постановка задачи исследований

Глава 2. Объекты и методы исследования

2.1 Характеристика объектов исследования

2.2 Методы исследования

2.2.1 Методика определения массовой доли хондроитинсульфата в образце

2.2.2 Количественное определение восстанавливающих Сахаров

2.2.3 Методика количественного определения Н-ацетил-0-глюкозамина

2.2.4 Методика количественного определения Б-галактозамина в присутствии Б-глюкозамина

2.2.5 Количественное определение О-галактозамина и Б-глюкозамина методом ВЭЖХ

2.2.6 Методика идентификации хондроитинсульфата

2.2.7 Определение экзогликозидазной активности

2.2.8 Методика определения среднемассовой молекулярной массы хондроитинсульфата '

2.2.9 Определение физико-химических свойств водных растворов хондроитинсульфата

2.2.10 Методики определения качественных показателей препаратов . хондроитинсульфата

2.3 Математическая обработка данных

3 Результаты и их обсуждение:

3.1 Выделение хондроитинсульфата из гидробионтов Баренцева моря 56 3 .2 Разработка и совершенствование методов идентификации хондроитинсульфатов

3.2.1 Идентификация хондроитинсульфатов методом инфракрасной спектроскопии" 59 3.2.2. Идентификация хондроитинсульфата методом ЯМР 63 3.2.3 Идентификация хондроитинсульфата методом ВЭЖХ

3.3 Кинетика кислотного гидролиза хондроитинсульфата 73 . 3:3.1 Кинетика гидролиза хондроитинсульфата по образованию восстанавливающих'Сахаров

3.3.2 Кинетика гидролиза хондроитинсульфата по содержанию 1> галактозамина

3.3.3 Кинетика гидролиза хондроитинсульфата;по данным ВЭЖХ 79 3 3.4 Кинетика гидролиза хондроитинсульфата по изменению концентрации О-глюкуроновой кислоты в гидролизатах 82 3.3.5 Кинетика образования и разрушения №ацетил-В-галактозамина в ходе гидролиза хондроитинсульфата

3.4'Математическое моделирование процесса кислотного гидролиза хондроитинсульфата

3.5 Физико-химические свойства растворов хондроитинсульфатов 88 3.5.2 Система хондроитинсульфат-фермент как биомаркер

3.6 Фракционный состав хондроитинсульфата

3.7 Выделение хондроитинсульфата из морских гидробионтов с использованием ультрафильтрации

Глава 4. Разработка технологии получения хондроитинсульфата из морских гидробионтов с использованием мембран

4.1 Обоснование рациональных режимов технологических процессов

4.2 Технология получения хондроитинсульфата и его характеристики 110 4.3. Расчет экономической эффективности технологии получения хондроитинсульфата из морских гидробионтов с использованием ультрафильтрации

ВЫВОДЫ

Актуальность темы

Разработка современных технологий переработки гидробионтов является актуальной задачей рыбной отрасли. Создание технологий производства обогащенных пищевых продуктов, профилактических и медицинских препаратов, полученных из морских гидробионтов, включает в себя исследование состава сырья, идентификацию и количественный анализ его компонентов, изучение физико-химических свойств биологически активных компонентов сырья.

Природный полисахарид хондроитинсульфат, содержащийся в хрящевой ткани, представляет собой сульфатированный гликозаминогликан, макромолекулы которого состоят из чередующихся мономерных звеньев сульфатированного 1Ч-ацетил-0-галактозамина и D-глюкуроновой кислоты.

Линейные макромолекулы хондроитинсульфата помогают сделать хрящ более устойчивым к давлению, которое оказывает на него вес тела, принимают участие в формировании костной ткани, связок, а также в I поддержании упругости и эластичности стенок кровеносных сосудов. Хондроитинсульфат является широко используемой пищевой добавкой для лечения дегенеративно-дистрофических заболеваний суставов и позвоночника, например, артроза и остеохондроза. В настоящее время коммерческие препараты хондроитинсульфата получают главным образом из хрящевой ткани млекопитающих. В последние годы для его производства стали также использовать ткани гидробионтов. Проблемами выделения хондроитинсульфата из различных природных объектов и его применения в медицине и биотехнологии занимаются такие зарубежные ученые как А Kinoshita, Н. R. Morris, К. Sugahara, М. J. С. Miller, С. Е Costello, П. Takai, Т. Копо, С. Amornrut, А. В. Khare, S. А. Houliston, F. Abdel и российские исследователи Т. Н. Шкарина, И. М. Сорокоумов, С. В. Немцев и другие.

Современные методы получения хондроитинсульфатов представляют собой многостадийные процессы экстракции, а выход конечного продукта и его чистота не всегда высоки. Следует отметить, что физико-химические свойства хондроитинсульфатов из гидробионтов, методы их идентификации и количественного анализа, количественные закономерности химического гидролиза практически не изучены. В связи с этим, разработка новых и совершенствование известных технологий выделения хондроитинсульфатов из морских гидробионтов, изучение их физико-химических свойств, методов идентификации и количественного анализа являются актуальными задачами.

Цели работы: изучение содержания и физико-химических свойств хондроитинсульфатов гидробионтов Баренцева моря; разработка и совершенствование методов их идентификации и количественного анализа. Разработка технологии получения хондроитинсульфатов из гидробионтов.

Для достижения поставленных целей решались следующие задачи:

1. Изучение содержания хондроитинсульфата в гидробионтах Баренцева моря: сёмге (Salmo salar), черноротой акуле (Galeus melanostomus), длиннорылой акуле (Deania calceus), полярной акуле (Somniosus microcephalus), северном скате (Amblyraja hyperborean), морском огурце (Cucumaria /rondos а).

2. Разработка методики идентификации и количественного анализа хондроитинсульфата из морских гидробионтов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе солей D-галактозамина и D-глюкозамина в продуктах кислотного гидролиза хондроитинсульфата. Совершенствование методик спектрофотометрического определения D-галактозамина, N-ацетил-О-галактозамина и D-глюкуроновой кислоты.

3. Изучение кинетики кислотного гидролиза хондроитинсульфата. Выбор математической модели, адекватно описывающей процесс кислотного гидролиза.

4. Изучение физико-химических свойств водных растворов хондроитинсульфатов.

5. Разработка технологии получения хондроитинсульфата с использованием ультрафильтрационных мембран; выбор математической модели, адекватно описывающей технологию получения хондроитинсульфата.

6. Разработка нормативной документации, оценка экономической эффективности технологии выделения хондроитинсульфата.

Научная новизна

Впервые разработана мембранная технология выделения хондроитинсульфатов из гидробионтов Баренцева моря: сёмги (Salmo salar), черноротой акулы {Galeus melanostomus), длиннорылой акулы (Deania calceus), полярной акулы (Somniosus microcephalics), северного ската (Amblyraja hyperborean), морского огурца (Cucumaria frondosa).

Разработана методика идентификации и количественного анализа хондроитинсульфата с помощью ВЭЖХ на обращенной фазе. Методика включает определение D-галактозамина и D-глюкозамина в продуктах кислотного гидролиза хондроитинсульфата. Усовершенствованы методики спектрофотометрического определения D-галактозамина, М-ацетил-Б-галактозамина и D-глюкуроновой кислоты.

Определены спектральные характеристики, фракционный состав, среднемассовая молекулярная масса, поверхностная и оптическая активность хондроитинсульфата из морских гидробионтов; показано влияние концентрации электролита на процесс полиэлектролитного набухания макромолекул полисахарида.

Рассчитаны константы скоростей гидролиза хондроитинсульфата в хлороводородной и серной кислотах. Разработана математическая модель кинетики гидролиза хондроитинсульфата. Предложена методика расчета содержания хондроитинсульфата в исходных объектах с использованием эффективных констант скоростей реакции гидролиза хондроитинсульфата.

Впервые показана возможность использования системы хондроитинсульфат-ферментный препарат в качестве биомаркера.

Практическая значимость

Разработана технология получения хондроитинсульфата из гидробионтов Баренцева моря с применением ультрафильтрации.

Выделены хондроитинсульфаты из хрящевой ткани сёмги {Salmo salar), черноротой акулы (Galeus melanostomns), длиннорылой акулы (Deania calceus), полярной акулы (Somniosus microcephalics), северного ската {Amblyraja hyperborean), а таюке кожных покровов морского огурца (Cucumaria frondosa).

На основании испытаний на базе учебно-экспериментального цеха ФГБОУВПО «МГТУ», (г. Мурманск) разработана и утверждена технологическая инструкция по получению хондроитинсульфата методом ультрафильтрационного разделения, разработаны Технические условия (ТУ) на «Хондроитин сульфат из тканей морских гидробионтов. Полуфабрикат».

На базе учебно-экспериментального цеха ФГБОУВПО «МГТУ» изготовлена опытная партия хондроитинсульфата, произведенная в соответствии с разработанной технологической инструкцией.

Подана заявка на патент «Способ получения хондроитинсульфата из тканей морских гидробионтов».

Основные положения работы, выносимые на защиту:

1. Разработанная технология получения хондроитинсульфата из тканей морских гидробионтов с использованием ультрафильтрационных мембран, имеющих различные молекулярно-массовые пределы задерживания.

2. Разработанные и усовершенствованные методики идентификации и количественного анализа хондроитинсульфатов.

3. Результаты изучения закономерностей кислотного гидролиза хондроитинсульфата.

4. Математическая модель кинетики гидролиза хондроитинсульфата, методика расчета содержания хондроитинсульфата в исходных объектах с использованием эффективных констант скоростей реакции гидролиза хондроитинсульфата.

5. Результаты изучения физико-химических свойств растворов хондроитинсульфата из тканей морских гидробионтов; изучение возможности применения хондроитинсульфатов из морских гидробионтов в качестве биомаркеров.

6. Технологическая инструкция на полуфабрикат хондроитинсульфата из тканей морских гидробионтов и ТУ «Хондроитин сульфат из тканей морских гидробионтов. Полуфабрикат»

7. Оценка экономической эффективности разработанной технологии.

ВЫВОДЫ

1. Впервые изучено содержание хондроитинсульфатов из гидробионтов Баренцева моря: сёмги (Salmo salar), черноротой акулы {Galeus melanostomus), длиннорылой акулы (Deania calceus), полярной акулы (Somniosus microcephalus), северного ската (Amblyraja hyperborean), морского огурца (Cucumaria frondosa). Показано, что наиболее перспективными видами для получения хондроитинсульфата являются полярная акула (Somniosus microcephalus) и северный скат {Amblyraja hyperborean) и сёмга {Salmo salar). Содержание хондротинсульфата в этих гидробионтах соответственно составляет 13,96 %, 15,51% и 10,31% (масса хондроитинсульфата / масса сухого сырья).

2. Разработан метод идентификации и количественного анализа хондроитинсульфата из морских гидробионтов с помощью ВЭЖХ на обращенной фазе по содержанию D-галактозамина в продуктах кислотного гидролиза хондроитинсульфата. Усовершенствованы спектрофотометрические методики анализа D-галактозамина, ТЧ-ацетил-О-галактозамина и глюкуроновой кислоты. Предложены методы количественного определения хондроитинсульфата в исходном сырье, конечном продукте и пищевых продуктах.

3. Рассчитаны эффективные константы скорости реакции гидролиза хондроитинсульфата с образованием D-галактозамина и разрушения глюкуроновой кислоты при концентрациях НС1 4, 6, 12 моль/дм3. Выбрана математическая модель, адекватно описывающая процесс кислотного гидролиза хондроитинсульфата.

4. Определены среднемассовые молекулярные массы хондроитинсульфатов из гидробионтов Баренцева моря, поверхностная и оптическая активность их водных растворов. Показано, что при добавлении 2

NaCl с концентрацией 0,05 моль/дм полиэлектролитное набухание макромолекул хондроитинсульфата подавляется. Установлена возможность использования системы хондроитинсульфат-фермент в качестве биомаркера.

5. Разработана технология выделения хондроитинсульфата из гидробионтов с использованием ультрафильтрационных мембран, имеющих различный молекулярно-массовый предел задерживания. Определены близкие к оптимальным параметры стадии осаждения хондроитинсульфата из раствора. Показано, что хондроитинсульфат, полученный по технологии с использованием ультрафильтрации, характеризуется более узким молекулярно-массовым распределением и более высокой степенью очистки.

6. Разработана технологическая инструкция для получения хондроитинсульфата из гидробионтов, и технические условия на полуфабрикат «Хондроитинсульфат из тканей морских гидробионтов». Оценена экономическая эффективность разработанной технологии.

1. Алексеева, Л.И. Хондроитинсульфат (Структум) при лечении остеоартроза: патогенетическое обоснование и клиническая эффективность / Алексеева Л.И., Беневоленская Л.И., Насонов Е.Л. // Терапевтический архив. 2001.- №11. -С. 87-89.

2. Биологически активная добавка для профилактики ревматоидных заболеваний : пат. 1Ш 2250047 / В. М. Быкова, С. В. Немцев, Е. А. Ежова, И. М. Сорокоумов, К. Н. Панов, А. И. Албулов, Е. В. Шмидт. № 2008103435/13 ; заявл. 04.02.08.

3. Вещества поверхностно-активные. Определение содержания неорганического сульфата. Титриметрический метод : ГОСТ 28478-90 Введ. 01.07.91. -М. : Стандартинформ, 2005. 7 с.

4. Государственная фармакопея Российской Федерации часть 1 / под ред. Н. В. Юргель / 12-е изд. М. : Научный центр экспертизы средств медицинского применения, 2007. — 704 с.

5. Государственная фармакопея СССР. Вып. 1. Общие методы анализа / сост. Бабаян Э.А. и др. /11-е изд. — М. : Медицина, 1987. 336 с.

6. Деркач, С. Р. Практикум по аналитической химии. Классические методы количественного анализа: учеб. пособие для студ. направл. 020100 -Химия и спец. 020101.65 Химия: в 2 ч. / С. Р. Деркач. - Мурманск: Изд-во МГТУ, 2006.-Ч. 1.-124 с.

7. Дерфель, К. Статистика в аналитической химии / К. Дерфель. — М.: Мир, 1994.-268 с.

8. Куценко, С. А. Основы токсикологии / С. А. Куценко. СПб : Фолиант, 2004. - 570 с.

9. Мусил, Я. Современная биохимия в схемах / Я. Мусил, О. Новакова, К. Кунц. М. : Мир, 1984. - 215 с.

10. Никитин, В. Н. Возрастная и эволюционная биохимия коллагеновых структур / В. Н. Никитин, Е. Э. Перский, Л. А. Утевская. -Киев : Наукова Думка, 1977. — 242 с.

11. О контроле качества посторонних примесей в препаратах гепарина : письмо Росздравнадзора от 8 сентября 2008 г. № 03И-578/08.

12. Панасюк, А. Ф. Влияние свободных радикалов на пролиферацию и обмен хондроцитов и на чувствительность клеточного монослоя к действию протеаз / А. Ф. Панасюк, Г. В. Ярошук, Д. Митрович // Вопросы мед. химии. 1995. - Т. 41, № 6. - С. 19-22.

13. Пентин, Ю. А. Физические методы исследования в химии / Ю. А. Пентин, Л. В. Вилков. М. : Мир, 2003. - 683 с.

14. Перевозников, М. А. Тяжелые металлы в пресноводных экосистемах / М. А. Перевоников, Е. А. Богданова. СПб. : ГосНИОРХб, 1999.-228 с.

15. Рациональное питание : Рекомендуемые уровни потребления пищевых и биологически активных веществ : метод, рекомендации МР 2.3.1. 19150-04.

16. Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Методы анализа : ГОСТ 7636-85. — Введ. 01.01.1986. -М.: Изд-во стандартов, 1985. 141 с.

17. Саутин, С. Н. Планирование эксперимента в химии и химической технологии / С. Н. Саутин. — Л., «Химия», 1975. 41 с.

18. Серов, В. В. Соединительная.ткань / В. В. Серов, А. Б. Шехтер. -М. : Медицина, 1981. -312 с.

19. Слуцкий, Л. И. Биохимия нормальной и патологически измененной соединительной ткани / Л. И. Слуцкий. Л. : Медицина, 1969. -375 с.

20. Смит, А. Прикладная ИК-спектроскопия : 'пёр. с англ. / А. Смит. -М. : Мир, 1982.-328 с.

21. Способ выделения хондроитинсульфата из животных тканей : пат. 2061485 . А61К35/22 / Васюков С. Е., Кирьянов Н. А. ; заявитель и патентообладатель Васюков С. Е., Кирьянов Н. А.- № 92014708/14 ; заявл. 28.12.1992; опубл. 10.06.1996.

22. Способ экстракции и очистки протеогликана хрящевого типа : пат. 2270023 . МПК6 А61К35/60, А61К35/32 / Такагаки К. ; заявитель и патентообладатель Какухиро КО., ЛТД., Такагаки Кейити № 2002104499/13 ; заявл. 20.02.02 ; опубл. 20.09.2003.

23. Стейси, М. Углеводы живых тканей / М. Стейси, С. Баркер. — М. : Мир, 1965.-324 с.

24. Фащук, Д. Я. Антропогенная нагрузка на геосистему море-водосбор и ее последствия для рыбного хозяйства / Д. Я. Фащук, В. В. Сапожников. М. : ВНИРО, 1999. - 124 с.

25. Хондроитинсульфат из хрящей рыб / И. М. Сорокоумов и др. // Рыбпром. 2007. - № 3. - С. 18-22.

26. Хрящ / В. Н. Павлова и др.. М. : Медицина, 1988. - 317 с.

27. Ягафарова, Г. Г. Биотехнологический способ утилизации нефтешламов и буровых отходов / Г. Г. Ягафарова, М. Мавлютов, В. Б. Барахнина // Горный вестник. — 1998. — № 4 .— С. 43-46.

28. A combined intravesical therapy with hyaluronic acid and chondroitin for refractory painful bladder syndrome/interstitial cystitis / M. Cervigni et al. // International Urogynecology Journal and Pelvic Floor Dysfunction. — 2008. — № 19.-P. 943-947.

29. A metaanalysis of chondroitin sulfate in the treatment of osteoarthritis / B. F. Leeb et al. // Journal of Rheumatology. 2000. - № 27. - P. 205-211.

30. A randomized, double blind, placebo controlled trial of a topical cream containing glucosamine sulfate, chondroitin sulfate, and camphor for osteoarthritis of the knee / M. Cohen et al. // Journal of Rheumatology. — 2003. — №30.-P. 523-528.

31. Age-related changes in the sulphation of the chondroitin sulphate linkage region from human articular cartilage aggrecan / R. M. Lauder et al. // Biochemical Journal. 2001. - № 358. - P. 523-528.

32. Anil B. Khare, Isolating chondroitin sulfate / patent US 20040146993A1 . МГЖ C12P019/30; A61K031/737 / Anil B. Khare, Stephen A. Houliston, Timothy J. Black № 10/704866 ; заявл. 10.10.2003 ; опубл.: 29.07.2004.

33. Antibodies to CD44 enhance adhesion of normal CD34+ cells and acute myeloblasts but not lymphoblastic leukaemia cells to bone marrow stroma / L. J. Bendall et al. // British Journal of Haematology. 1997. - № 98. - P. 828837.

34. Antoni, C. Infliximab for psoriasis and psoriatic arthritis / C. Antoni, B. Manger // Clinical & Experimental Rheumatology. 2002. - № 20. - P. 122125.

35. Arabelovic, S. Considerations in the treatment of early osteoarthritis / S. Arabelovic, Т. E. McAlindon // Current Rheumatology Reports. 2005. - № 7. -P. 29-35.

36. Balassa; Leslie L. Method of processing animal cartilage: patent 4656137, МПК C07G 17/00; A61K 35/32 / № 06/775,492; заявл. 12.09.1985; опубл. 07.04.1987.

37. Bali, J. P. Biochemical basis of the pharmacologic action of chondroitin sulfates on the osteoarticular system / J. P. Bali, H. Cousse, E. Neuzil // Seminars in Arthritis and Rheumatism. 2001. - № 31(1) (aug.). - P. 58-68.

38. Bioiberica (2002) Chondroitin sulfate General Information. Электронный ресурс. : Bioberica. — Режим доступа: http://www.bioberica. com/eng/mp/condroitin.htm. — Загл. с экрана

39. Bjelle, А. О. Fractionation of the glycosaminoglycans of human articular cartilage on estiola cellulose in aging and in osteoarthrosis / A. O. Bjelle, C. A. Antonopoulos // Calcifid Tissue Res. 1972. - Vol. 8, № 3. - P. 237-246.

40. Campo, R. D. The composition of bovine cartilage and bone / R. D. Campo, C. D. Tourtellotte // Biochimica et Biophysica Acta. 1967. — Vol. 141, № 3 - P. 614-624.

41. Caperna, T. Biochemical and molecular roles of nutrients somatotropin alters collagen metabolism in growing pigs / D. Gavelek J. Vossoughi // The Journal of nutrition. 1994. - № . 32. - P. 770-778.

42. Cessi, C. A method for the determination of D-Galactosamine in the presence of D-Glucosamine / C. Cessi, F. Serafini-Cessi // Biochemical Journal-1963. -№88. -P. 132-136.

43. Characteristic hexasaccharide sequences in octasaccharides derived from shark cartilage chondroitin sulfate D with a neurite outgrowth promoting activity / S. Nadanaka et al. // The Journal of Biological Chemistry— 1998. — № 273.-P. 3296-3307.

44. Characterization of oligosaccharides from the chondroitin sulfates. (l)H-NMR and (13)C-NMR studies of reduced disaccharides and tetrasaccharides / T. N. Huckerby et al. // European Journal of Biochemistry- 2001. № 268. - P. 1181-1189.

45. Chondroitin and glucosamine sulfate in combination decrease the pro-resorptive properties of human osteoarthritis subchondral bone osteoblasts: a basic science study / Tat. S. Kwan et al. // Arthritis Research and Therapy. — 2007. № 9.-P. 117.

46. Chondroitin sulfate extracted from the Styela clava tunic suppresses TNF-alpha-induced expression of inflammatory factors, VCAM-1 and iNOS by blocking Akt/NF-kappaB signal in JB6 cells / С. X. Xu et al. // Cancer Letters-2008.-№264.-P. 93-100.

47. Chondroitin sulfate in the management of hip and knee osteoarthritis: an overview / G. Bana, B. Jamard, E. Verrouil, B. Mazieres // Advances in Pharmacology. 2006. - № 53. - P. 507-522.

48. Chondroitin sulfate inhibits the nuclear translocation of nuclear factor-kappaB in interleukin-1 beta-stimulated chondrocytes / C. Jomphe et al. // Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology 2007. - № 102. — P. 59-65.

49. Chondroitin sulfate intake inhibits the IgE-mediated allergic response by down-regulating Th2 responses in mice / S. Sakai et al. // The Journal of Biological Chemistry-2006. -№ 281. P. 19872-19880.

50. Chondroitin sulfate modulation of matrix and inflammatory gene expression in IL-1 beta-stimulated chondrocytes-study in hypoxic alginate bead cultures / F. Legendre et al. // Osteoarthritis and Cartilage. — 2007. — № 27. P. 205-211.

51. Chondroitin sulfate up-regulates the expression of the aggrecan core protein and inhibits that of IL-1 induced matrix proteinases and inflammatory mediators / F. Legendre et al. // Annals of the Rheumatic Diseases. 2006. - № 65.-P. 460-1460.

52. Chondroitins 4 and 6 sulfate in osteoarthritis of the knee: a randomized, controlled trial / B. A. Michel et al. // Annals of the Rheumatic Diseases. 2005. - № 52. - P. 779-786.

53. Chvapil, M. Physiology of connective tissue. Butterworths / M. Chvapil. London et al. : Medical Press, 1967. - 417 p.

54. Clinical and histopathological improvement of psoriasis with oral chondroitin sulfate: a serendipitous finding / J. Verges et al. // Dermatology Online Journal 2005. - № 11. - P. 31.

55. Clinical inquiries: do glucosamine and chondroitin worsen blood sugar control in diabetes? / P. D. Marshall et al. // The Journal of Family Practice. -2006.-№55.-P. 1091-1093.

56. Complement activation triggered by chondroitin sulfate released by thrombin receptor-activated platelets / O. A. Hamad et al. // Journal of Thrombosis and Haemostasis 2008. - Vol. 8.-P. 1413-1421.

57. Conrozier, T. Chondroitin sulfate (CS 4&6) : practical applications and economic impact / T. Conrozier // Presse Med. 1998. — Vol. 27, № 36. — P. 1866-1868.

58. Conrozier, T. Death of articular chondrocytes. Mechanisms and protection / T. Conrozier // Presse Med. 1998. - Vol. 27, № 36. - P. 1859-1861.

59. Contaminated heparin associated with adverse clinical events and activation of the contact system / T. K. Kishimoto et al. // The New England Journal of Medicine. 2008. - № 23. - P. 2457-2467.

60. Davidson, E. Chodroitin, A New Mucopolysaccharide / E. A.J. Davidson, A. K Meyer // Biochem. 1954. - Vol. 211, № 2. - P. 605-611.

61. Deal, C. L. Nutraceuticals as therapeutic agents in osteoarthritis. The role of glucosamine, chondroitin sulfate and collagen hydrolysate / C. L. Deal, R. W. Moskowitz // Rheumatic Disease Clinics of North America. — 1999. — Vol. 25, №2.-P. 379-395.

62. Diagnostic test for mucopolysaccharidosis. I. Direct method for quantifying excessive urinary glycosaminoglycan excretion / С. B. Whitley et al. //Clin. Chem. 1989. - № 35. - P. 374-379.

63. Dische, Z. A new specific color reaction of hexuronic acids / Z. Dische // The Journal of Biological Chemistry 1947. - Vol. 167, № 1. - P. 18998.

64. Effect of chondroitin sulfate on murine splenocytes sensitized with ovalbumin / S. Sakai et al. // Immunology Letters 2002. - № 84. - P. 211-216.

65. Effects of chondroitin sulfate on colitis induced by dextran sulfate sodium in rats / Y. Hori et al. // Japanese Journal of Pharmacology, The — 2001. — №85.-P. 155-160.

66. Effects of chondroitin sulfate on immune response in mice / S. Sakai et al. // Glycobiology. 2004. - № 14. - P.' 1160-1160.

67. Extraction, separation and purification of chondroitin sulfate from chicken keel cartilage / ShuangLi Xiong, AnLin Li, ZhaoMin Wu, Ming Wei //

68. Journal Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering. — 2009. — Vol. 25, № l.-P. 271-275.

69. Fourier transform infrared imaging of focal lesions in human osteoarthritic cartilage / E. David-Vaudey et al. // European Cells & Materials-2005.-Vol. 10.-P. 51-60.

70. Fried, M. Plasmodium falciparum: adhesion of placental isolates modulated by the sulfation characteristics of the glycosaminoglycan receptor / M. Fried, R. M. Lauder, P. E. Duffy // Experimental Parasitology 2000. - № 95. - P. 75-78.

71. Resorbable extracellular matrix for reconstruction of cartilage tissue : patent 6326029. МПК A61K 35/32 / Geistlich et al.. заявитель и патентообладатель Geistlich [et al.]. № 08/894517. заявл.: 22.02. 1996 ; опубл. 10.10.1997.

72. Glade, M. J. Polysulphated glucosaminoglycans accelerates net synthesis of collagen and glycosaminoglycan by arthritic equine cartilage tissues and chondrocytes / M. J. Glade // American Journal of Veterinary Research — 1990. -№51. -P. 779-785.

73. Glucosamine, chondroitin sulfate, and the two in combination for painful knee osteoarthritis / D. O. Clegg et al. // The New England Journal of Medicine 2006. - № 354. - P. 795-808.

74. Gohel, M. Electrophoretic separation and characterization of urinary glycosaminoglycans and their roles in urolithiasis / M. Gohel, D. Shum, P.Tam // Carbohydrate Research 2007. - № 342. - P. 79-86.

75. Hardingham, T. Chondroitin sulfate and joint disease / T. Hardingham // Osteoarthritis and Cartilage. 1998. - № 6 (suppl. A). - P. 3-5.

76. Hardingham, Т. E. Proteoglycans: many forms and many functions / E. T. Hardingham, A. J. Fosang // THE FASEB JOURNAL 1992. - № 6. - P. 861-870.

77. Hardingham, Т. E. Proteoglycans: their structure, interactions and molecular organisation in cartilage / E. T. Hardingham // Biochemical Society Transactions 1981. - № 9. - P. 489-497.

78. Hardingham, T. Proteoglycans / T. Hardingham // Biochemical Society Transactions 1981. - Vol. 9, № 6. - P. 489-497.

79. Hathcock, J. N. Risk assessment for glucosamine and chondroitin sulfate / J. N. Hathcock, A. Shao // Regul Toxicol Pharmacol. 2007. - № 47. -P. 78-83.

80. Hop wood, H. The Molecular-Weight Distribution of Glycosaminoglycans / H. Hopwood, C. Robinson // Biochemical Journal — 1973. — № 135.-P. 631-637.

81. Howell, D.S. Pathogenesis of osteoarthritis / D. S. Howell // The American Journal of Medicine 1986. -№ 80. - P. 24-28.

82. Huckerby, T. N. Recent studies on the chondroitin sulfate/dermatan sulfate polymer systems using NMR spectroscopy / T. N. Huckerby, R. M. Lauder, I. A. Nieduszynski // Abstracts of Papers of the American Chemical Society -2003. -№ 225. U653—1653.

83. Identification of the origin of chondroitin sulfate in "health foods" / S. Sakai et al. // Chemical & Pharmaceutical Bulletin (Tokyo). 2007. - № 55. -P. 299-303.

84. Improved and simple micro assay for sulfated glycosaminoglycans quantification in biological extracts and its use in skin and muscle tissue studies /1. Barbosa et al. / Glycobiology. 2003. - vol. 13, № 9. - P. 647-653.

85. Imoto, T. A simple activity measurement of lisozyme / T. Imoto, K. Yagishita // Agricultural and Biological Chemistry. — 1971. Vol. 35, № 7. — P. 1154-1156.

86. In vitro intestinal degradation and absorption of chondroitin sulfate, a glycosaminoglycan drug / L. Barthe et al. // Arzneimittelforschung. — 2004. — № 54.-P. 286-292.

87. Inhibition of human elastase from PMN leukocytes by glycosaminoglycan polysulphate (arteparon) / A. Baici, P. Salgam, K. Fehr, A. Boni // Biochemical Pharmacology 1980. - № 29. - P. 1723-1727.

88. Inhibitory effects of chondroitin sulfate prepared from salmon nasal cartilage on fat storage in mice fed a high-fat diet / L. K. Han et al. // International Journal of Obesity 2000. - № 24. - P. 1131-1138.

89. Interaction of 1,9-dimethylmethylene blue with glycosaminoglycans / J. E. Stone et al. // Annals of Clinical Biochemistry. 1994. - № 31. - P. 147152.

90. Joint Cartilage Degradation. Basic and clinical aspects / ed. J. F. Woessner, D. S.Howell. N. Y. - Basel - Hong Kong : Marcel Dekker Inc., 1993. -557 p.

91. Kalbhen, D. A. Pharmacological studies on the anti-inflammatory effect of a semisynthetic polysaccharide (pentosan poly sulfate) / D. A. Kalbhen // Pharmacology. 1973. - № 9. - P. 74-79.

92. Kelly, G. S. The role glucosamine sulfate and chondroitin sulfate in the treatment of degenerative joint disease / G. S. Kelly // Alternative Medicine Review 1998. - Vol. 3, № 1. - P. 27-39.

93. Khan, S. R. Modulators of urinary stone formation / S. R. Khan, D. J. Kok // Frontiers in Bioscience 2004. - № 9. - P. 1450-1482.

94. Knudsen, J. F. Potential glucosamine-warfarin interaction resulting in increased international normalized ratio: case report and review of the literature and MedWatch database / J. F. Knudsen, G. H. Sokol // Pharmacotherapy. — 2008. -№28.-P. 540-548.

95. Komano, T. Studies on the chemical structure of mucopolysaccharides / T. Komano Kyoto: Kyoto University, 1962. - p. 106.

96. Kyker, K. D. Exogenous glycosaminoglycans coat damaged bladder surfaces in experimentally damaged mouse bladder / K. D. Kyker, J. Coffman, R. E. Hurst // BMC Urology 2005. - № 5. - P. 4.

97. Lauder, R. M. A fingerprinting method for chondroitin/dermatan sulfate and hyaluronan oligosaccharides / R. M. Lauder, T. N. Huckerby, I. A. Nieduszynski // Glycobiology. 2000. - № 10. - P. 393-401.

98. Lauder, R. M. Analysis of proteoglycans and glycosaminoglycans / R. M. Lauder ; ed. R. A. Myers // Encyclopaedia of Analytical Chemistry. -Chichester : John Wiley & Sons Ltd, 2000. P. 860-895.

99. Maccari, F. Structural characterization of chondroitin sulfate from sturgeon bone / F. Maccari, F. Ferrarini, N. Volpi // Carbohydrate Research -2010.-Vol. 345.-P. 1575.

100. Martin B. Mathews. Sodium chondroitin sulfate-protein complexes of cartilage. I. Molecular weight and shape / Martin B. Mathews, Irene Lozaityte // Archives of Biochemistry and Biophysics. 1958. - Vol. 74, № 1. - P. 158-174.

101. Meta-analysis: chondroitin for osteoarthritis of the knee or hip / S. Reichenbach et al. // Annals of Internal Medicine 2007. - № 146. - P. 580-590.

102. Modification of copper-catalyzed oxidation of low density lipoprotein by proteoglycans and glycosaminoglycans / G. Camejo et al. // The Journal of Lipid Research- 1991.-№ 32.-P. 1983-1991.

103. Nadanaka, S. Chondroitin sulfate: structure, function, and biosynthesis / S. Nadanaka // Trends in Glycoscience and Glycotechnology 1999. - № 11.-P. 233-238.

104. Nandini, C. D. Role of the sulfation pattern of chondroitin sulfate in its biological activities and in the binding of growth factors / C. D. Nandini, K. Sugahara //Advances in Pharmacology. 2006. - № 53: - P. 253-279.

105. Optimization of shark (Squatina oculata) cartilage hydrolysis for the preparation of chondroitin sulfate / J.-H. Jo // The Food Science and Biotechnology 2005. - № 14 (5). - P. 651-655.

106. Osteoarthritis an untreatable disease? / H. A. Wieland et al. // Nature Reviews Drug Discovery - 2005. - № 4. - P. 331-344.

107. Osterman, M. T. Current and future anti-TNF therapy for inflammatory bowel disease / M. T. Osterman, G. R. Lichtenstein // Current Treatment Options in Gastroenterology — 2007. № 10. — P. 195-207.

108. Oversulfated chondroitin sulfate is a contaminant in heparin associated with adverse clinical events / M. Guerrini et al. // Nature Biotechnology 2008. - № 26. - P. 669-675.

109. Palylyk-Colwell, E. Chondroitin sulfate for interstitial cystitis / E. Palylyk-Colwell // Issues Emerg Health Technol. 2006. - 84. - P. 1-4.

110. Quantification of glycosaminoglycans by reversed-phase HPLC separation of fluorescent isoindole derivatives / Daniel R. Studelska et al. // Glycobiology. 2006. -Vol. 16, № l.-P. 65-72.

111. Recent advances in the structural biology of chondroitin sulfate and dermatan sulfate / K. Sugahara et al. // Current Opinion in Structural Biology — 2003.-№ 13.-P. 612-620.

112. Reissig, J. L. A modified colorimetric method for the estimation of N-acetylamino sugars / J. L. Reissig, J. L. Strominger, L. F. Leloir // The Journal of Biological Chemistry. 1955. - Vol. 217, № 2. - P. 959-966.

113. Retention and removal of a new viscous dispersive ophthalmic viscosurgical device during cataract surgery in animal eyes / T. Oshika et al. // British Journal of Ophthalmology. 2006. - № 90. - P. 485-487.

114. Reissig, J. L. A modified colorimetric method for the estimation of N-acetylamino sugars / J. L. Reissig, J. L. Strominger, L. F. Leloir // The Journal of Biological Chemistry. 1955. - Vol. 217, № 2. - P. 959-966.

115. Salmon-origin chondroitin sulfate : patent US 20030162744, МПК A61K 031/737, C08B 037/00 / M. Takai, H. Kono ; заявитель и патентоообладатель M. Takai, Н. Kono № 220539; заявл. 17.12.2002; опубл. 28.08.2003.

116. Setnikar, I. Antiarthritic effect of glucosamine sulfate studied in animal models / I. Setnikar, M. A. Pacini, L. Revel // Arzneimittel Forschung -1991.-№41.-P. 542-545.

117. Siegmeth, W. Comparison of glycosaminoglycan polysulfate (Arteparon) and physiological saline solution in arthrosis of the large joints. Results of a multicenter double-blind study / W. Siegmeth, I. Radi // Z. Rheumatol. 1983.-№42.-P. 223-228.

118. Spectrophotometric determination of sodium chondroitin sulfate in eye drops after derivatization with 4-amino-3-hydrazino-5- mercapto-l,2,4-triazole /К. Kamata et al. //Analyst. 1995. -№ 120. - P. 2755-2758.

119. Stone Prosthetic articular cartilage: patent US 5306311, МПК A61F 232 / Kevin R Stone et al. ; заявитель ReGen Corporation. № : 809003; заявл: 17.12.1991; опубл. 26.04.1994.

120. Structural and symptomatic efficacy of glucosamine and chondroitin in knee osteoarthritis: a comprehensive metaanalysis / F. Richy et al. // Archives of Internal Medicine-2003.-№ 163.-P. 1514-1522.

121. Structure of a fucoidan from the brown seaweed Fucus evanescens C.Ag. / M. I. Bilan et al. // Carbohydrate Research 2002. - Vol. 337. - P. 719.

122. Sugahara, K. Chondroitin/dermatan sulfate in the central nervous system // К Sugahara, T. Mikami // Current Opinion in Structural Biology 2007. -Vol. 17, № 5.-P. 536-545.

123. Suppression of active collagenase from calcified lapine synovium by arteparon / P. B. Halverson et al. // The Journal of Rheumatology. 1987. - № 14.-P. 1013-1017.

124. Systemic administration of glycosaminoglycan polysulphate (arteparon) provides partial protection of articular cartilage from damage produced by meniscectomy in the canine / H. Hannan et al. // Journal of Orthopaedic Research. 1987. - № 5. - P. 47-59.

125. The interaction of pentosan polysulphate with human neutrophil elastase and connective tissue matrix components / J. L. Andrews, P. Ghosh, A. Lentini, B. Ternai // Chemico-Biological Interactions. — 1983. № 47. — P. 157173.

126. Theoharides, T. C. A pilot open label study of Cystoprotek in interstitial cystitis / T. C. Theoharides, G. R. Sant // International Journal of Immunopathology and Pharmacology. — 2005. — № 18. — P. 183-188.

127. Treatment of knee osteoarthritis with oral chondroitin sulfate / D. Uebelhart et al. // Advances in Pharmacology. 2006. - № 53. - P. 523-539.

128. Tsuneo Okubo. Surface Tension of Biological Polyelectrolyte Solutions / Tsuneo Okubo, Kenji Kobayashi // Journal of Colloid and Interface Science. 1998. - Vol. 205, № 2. - P. 433-442.

129. Varum, K. M. Acid hydrolysis of chitosans / K. M. Varum, M. H. Ottoy, O. Smidsrod // Carbohydrate Polymers. 2001. - Vol. 46, № 1. - P. 89-98.

130. Tully, S. E. Discovery of a TNF-alpha antagonist using chondroitin sulfate microarrays // S. E. Tully, M. Rawat, L. C. Hsieh-Wilson // Journal of American Chemical Society. 2006. - № 128. - P. 7740-7741.

131. Volpi, N. Inhibition of human leukocyte elastase activity by chondroitin sulfates / N. Volpi // Chemico-Biological Interactions. 1997. — № 105.-P. 157-167.

132. Xiong, S. L. Bioactive composition of pig laryngeal cartilage extracts and their free radical-scavenging activity / S. L. Xiong, Z. Y. Jin, A. L. Li // Food Science and Technology International. 2006. — № 12. — P. 371-377.

133. Xiong, S. L. The free radical-scavenging property of chondroitin sulfate from pig laryngeal cartilage in vitro / S. L. Xiong, Z. Y. Jin // Journal of Food Biochemistry. 2007. - № 31. - P. 28-44.