автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Разработка технологии получения комплексных пищевых добавок с использованием кислотообразующих бактерий

На правах рукописи

КУКСОВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА

ООЗ170598

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ КОМПЛЕКСНЫХ ПИЩЕВЫХ ДОБАВОК С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КИСЛОТООБРАЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ

Специальность 05.18.07 - Биотехнология пищевых продуктов (алкогольная и безалкогольная промышленность)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

2 9 [./'.!

Москва - 2008

003170598

Работа выполнена в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИПБТ)

Научный руководитель: Доктор технических наук, профессор,

академик РАСХН Поляков Виктор Антонович

Доктор химических наук, профессор Синицын Аркадий Пантелеймонович

Доктор технических наук, профессор Панасюк Александр Львович

Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ (ОАО «ГосНИИсинтезбелок»)

Защита состоится 2008 г в ^ часов на заседании

объединенного диссертационного совета ДМ 006.025 01 при ГУ «Всероссийский научно - исследовательский институт пивоваренной, безалкогольной и винодельческой промышленности» (ГУ ВНИИ ПБ и ВП) Россельхозакадемии по адресу: 119021, Москва, ул Россолимо, д 7

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ ВНИИ ПБ и ВП Россельхозакадемии

Отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенный печатью учреждения, просим отправлять по адресу: 119021, Москва, ул Россолимо, д. 7, ГУ ВНИИ ПБ и ВП Россельхозакадемии

Автореферат разослан » сМйлЬ 2008 г.

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Ученый секретарь диссертационного совета, к.т н, доцент

Славская С Л

1 Общая характеристика работы

Актуальность темы. В связи с концепцией государственной политики в области здорового питания населения России первостепенное значение приобретает проблема расширения отечественного производства пищевых продуктов и обеспечения их качества и безопасности

Использование для сохранности пищевых продуктов добавок защитно-профилактического действия позволяет получать продукты высокого качества, термическая обработка которых сведена к минимальной, которые не подвергаются быстрой порче и не представляют опасности для здоровья человека Предотвращая порчу продуктов питания, они уменьшают опасность образования токсинов

Это обуславливает возрастающий интерес к использованию пробиотиков для создания новых пищевых биологически активных добавок и функциональных продуктов питания на их основе и находит отражение в работах ряда исследователей Егорова H С, Барановой И П (1998), Нетрусова A M , Стояновой Л Г (2006), Воробьевой Л И (1995, 2003), Шендерова Б А (1998), Полякова В А (2002), Храмцова А Г (1993), Barefood S F ( 1999), Klaenhammer T R ( 1999), Nés I F (1996)

Таким образом, разработка биотехнологий производства и применения комплексных пищевых добавок на основе молочнокислых и пропионовокислых бактерий, содержащих наряду с органическими кислотами, бактериоцины, антиоксидантные и ферментные комплексы, востребована и перспективна

Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы является подбор активных штаммов продуцентов кислотообразующих бактерий, исследование их использования для получения комплексных пищевых добавок на основе L(+)- молочной кислоты и комплекса бактериоцинов молочнокислых и пропионовокислых бактерий Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи: -разработка способа подготовки молочной сыворотки,

-отбор и селекция высокоактивных штаммов молочнокислых бактерий - продуцентов оптически чистой L(+)- молочной кислоты и бактериоцинов с целью расширения спектра антимикробной активности к патогенной микрофлоре, вызывающей порчу пищевых продуктов,

-отбор высокоактивных штаммов пропионовокислых бактерий - продуцентов пропионовой кислоты и бактериоцинов, действие которых направлено против дрожжей и плесеней, для расширения спектра действия комплексного биоконсерванта,

-изучение и разработка оптимальных условий для роста и кислотообразования выбранных микроорганизмов,

-оптимизация параметров управления процессом биосинтеза бактериоцинов, -разработка пищевых и биологически активных добавок, -изготовление опытных образцов препаратов и оценка их качества, -разработка и рекомендации для промышленного внедрения на основании полученных экспериментальных данных унифицированной технологической схемы получения пищевых добавок на основе Ц+)-молочной и пропионовой кислот и комплекса бактериоцинов молочнокислых и пропионовокислых бактерий с использованием в качестве сырья молочной сыворотки

Научная новизна работы. На основании проведенных исследований физиолого-биохимических свойств культур продуцентов, для производства оптически чистой L(+)-молочной кислоты с использованием в качестве сырья молочной сыворотки впервые подобрана и исследована культура Enterococcus faecium

Выявлены основные закономерности биосинтеза культур-продуцентов, получен новый экспериментальный материал по изучению влияния технологических параметров на динамику накопления органических кислот и вторичных метаболитов

Исследована возможность совместного культивирования консорциума молочнокислых и пропионовокислых бактерий для расширения антимикробного спектра действия биоконсерванта

Разработана методика выделения и первичной идентифицикации бактериоцинов, продуцируемых данными культурами, изучены спектры поглощения бактериоцинов и антибиотическая активность отобранных штаммов-продуцентов

Изучены закономерности биосинтеза бактериоцинов, включая низин, при использовании отобранных штаммов-продуцентов Enterococcus faecium, Lactococcus lactis subsp lactis, Lactobacillus acidophilus и Propionibacterium fieudenreichu subs shearman» По результатам проведенной работы получено 5 патентов РФ Практическая значимость работы. На основании результатов проведенных исследований разработана технология производства пищевых и биологически активных добавок с использованием кислотообразующих бактерий, характеризующаяся высоким техническим уровнем Определены оптимальные режимы и новые приемы технологии, обеспечившие высокие продуктивность, выход и качество целевой продукции

Разработана унифицированная технологическая схема получения комплексных пищевых добавок лактата натрия, Ц+)- молочной кислоты и биоконсерванта, на основе оптически чистой Ц+)- молочной и пропионовой кислот, а также комплекса бактерио-цинов, продуцируемых молочнокислыми и пропионовокислыми бактериями, позволяющая

- заменить традиционно используемые ценные сахаросодержащие субстраты (сахар, рафинадная патока, меласса) для получения молочной кислоты, более дешевым и доступным сырьем - молочной сывороткой,

- увеличить выход молочной кислоты по сравнению с традиционной технологией на сахаросодержащих средах с 92,0 до 95,0%,

- получить пищевую молочную кислоту в Ь (+) -форме с оптической чистотой 99,8% и обеспечением высокого качества при значительном снижении себестоимости целевого продукта,

- получить пищевые добавки - биоконсерванты, обладающие защитно-профилактическим и пробиотическим действием,

- расширить спектр действия биоконсервантов за счет использования в комплексе с низином других бактериоцинов, благодаря синергетическому действию специально подобранных культур микроорганизмов,

- получить биологически активные добавки к пище на основе Ь (+)-молочной кислоты, обладающие лечебным и профилактическим действием

Значимость проведенной работы определяется разработкой новых пищевых добавок, содержащих ферментные комплексы и метаболиты молочнокислых и пропионово-кислых бактерий, направленно синтезирующих пищевые кислоты в Ь-форме, бактерио-цины, легкоусвояемые белки и углеводы для создания гигиенически благополучных продуктов питания для детерминированных групп населения, защитно-профилактических препаратов для сохранения пищевой продукции и продовольственного сырья

При этом создается экологически чистое производство с ресурсосберегающей технологией за счет использования нетрадиционного сырья - вторичного ресурса переработки молока. Выработка пищевых добавок, обладающих антимикробными, консервирующими свойствами, позволит заменить химические и синтетические консерванты с неблагополучными последствиями их применения, существенно уменьшить импорт и позволит расширить ассортимент продуктов функционального питания

Результаты проделанной работы подтверждены в производственных условиях на промышленной установке Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (г Пущино), ФГУП ГосНИИгенетика, в промышленных условиях ЗАО «Консэко» (г Москва), ООО «Натурфармацевтическая компания» (г Томск), ООО «Томская фармацевтическая фабрика» Клинические испытания биологически активной добавки «Планта - Хол плюс» проведены в Томском НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН

Апробация работы. Основные положения работы докладывались на российских и международных конференциях и симпозиумах Всероссийской научно-технической конференции-выставке «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (г Москва, 2004 и 2005), Научно-практической конференции «Качество и безопасность сельскохозяйственного сырья и пищевых продуктов» (г Углич, 2004), Научно-практической конференции «Приоритетные направления комплексных научных исследований в области производства, хранения и переработки сельскохозяйственной продукции» (г Углич, 2005), Международной конференции «Научное обеспечение и тенденции развития производства пищевых добавок в России» (г Санкт-Петербург, 2005), Втором международном симпозиуме «Микробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК» (г Москва, 2006), Международной научно-практической конференции «Биотехнология Вода и пищевые продукты» (г Москва, 2008) и на заседаниях Ученого совета ГНУ ВНИИПБТ (2004-2007) Публикации.

Основное содержание диссертации отражено в 14 публикациях и 5 патентах Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, изложения результатов и их обсуждения, выводов и библиографического списка использованной литературы

Диссертационная работа изложена на 220 стр машинописного текста, содержит 28 рисунков и 30 таблиц Библиография включает 353 наименования, из них 197 зарубежных работ

2 Обзор литературы

Освещены вопросы биохимии молочнокислого и пропионовокислого брожения, описаны технологии получения органических кислот и вторичных метаболитов молоч-

нокислых к прогшоновокислых бактерий - бактериоцинов и их применения в различных отраслях народного хозяйства

Анализ литературных данных выявил проблемы, существующие в данной области, и позволил сформулировать цели и задачи данного исследования

3 Экспериментальная часть

3.1 Материалы и методы исследования

Объектами исследований служили штаммы-продуценты органических кислот и бактериоцинов из коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИ пищевой биотехнологии, Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) РАН, Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенетика, ЗАО «Консэко»

Культивирование отобранных штаммов-продуцентов проводили на стендовых установках в ферментерах «АНКУМ-IOJI» (Россия) для получения молочной кислоты и «Biostat» В Braun Melsungen AG (Германия) для получения бактериоцинов В качестве основного углеводсодержащего субстрата для брожения использовалась молочная сыворотка.

Анализ сырья, полупродуктов и готовой продукции осуществляли общепринятыми микробиологическими и физико-химическими методами

Исследования по культивированию культур продуцентов оценивали следующими методами

- определение L-(+) молочной кислоты ферментативным методом с лактатдегид-рогеназой,

- антибиотическую активность низина методом диффузии в агар с использованием тест - культур Micrococcus flavus и Bacillus coagulans № 15,

- антагонистическую активность культур методом лунок по диаметру зон подавления роста патогенных и условно патогенных тест-культур микроорганизмов,

- определение бактериоцинов с использованием метода тонкослойной хроматографии (ТСХ) и метода спектрометрии с использованием спектрофотометра «Specord UV VIS» (Германия),

- ДНК - фингерпринт депонируемых штаммов Enterococcus faecium и Lactococcus lactis проведен методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием модифицированных праймеров рибосомальных последовательностей в соответствии с методикой для молочнокислых бактерий,

- содержание янтарной, молочной кислот и силибина в биологически активной добавке к пище (БАД) «Планта - Хол плюс» методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

Основные этапы исследований представлены на рисунке 1

Статистическую обработку экспериментальных данных, полученных не менее чем в 3-х повторностях, проводили по программе Excel 2003 Microsoft Office

Рисунок 1 - Структура экспериментальных исследований

3.2 Результаты исследований и их обсуждение

3.2.1 Исследование и обоснование выбора сырья

С целью выбора сырья и обоснования оптимального способа его подготовки к ферментации был исследован химический состав образцов молочной сыворотки различной степени очистки заводская нефильтрованная сыворотка, осветленная (получена при сепарировании) и ультрафильтрат

Результаты анализов качественного и количественного состава показали, что по содержанию макро- и микроэлементов, а также лактозы неосветленная творожная сыворотка может использоваться в качестве питательной среды для последующих фермента-ций В ее составе содержатся минеральные компоненты, аминокислоты и витамины, достаточные для роста и развития кислотообразующих бактерий

3.2 2 Сравнительная характеристика микроорганизмов продуцентов молочной кислоты к скрининг наиболее активных штаммов

Проведены сравнительные исследования 33 штаммов микроорганизмов различных таксономических групп (дрожжи, грибы и молочнокислые бактерии) на способность образовывать L-(+) молочную кислоту

Для микроорганизмов одинаковой видовой принадлежности культивирование проводили в одинаковых условиях

По результатам проведенных исследований видно, что наиболее активно образовывали молочную кислоту 3 штамма - Lactobacillus acidophilus ВКМ 1660, Lactobacillus acidophilus var cocoideus ВНИИПБТ M-94 и Enterococcus faecium, у них выход молочной кислоты от использованной лактозы был выше 50%

С этими тремя культурами были проведены более детальные эксперименты по биосинтезу молочной кислоты (таблица 1)

Таблица 1 - Образование молочной кислоты отобранными культурами молочнокислых бактерий

Культура микроорганизма Количество молочной кислоты

г/дм-1 выход от использованного углеводного субстрата, %

Lactobacillus acidophilus ВКМ 1660 (Т) 25,5 55,2

Lactobacillus acidophilus var coccoideus ВНИИПБТ M-94 26,0 56,3

Enterococcus faecium 29,0 62,2

Учитывая наличие таких факторов, как оптическая чистота Ь(+)-изомера, более высокая удельная скорость роста молочнокислых бактерий кокковой формы, высокая бродильная активность, обусловливающая высокий выход молочной кислоты, для дальнейших исследований по биосинтезу молочной кислоты была выбрана культура ЕШегососсиз Гаесшт

Анализ физиолого-биохимических особенностей и антагонистической активности отобранного штамма показал, что использование культуры ЕШегососсив Гаесшт оптимально для ферментации молочной сыворотки

Для штаммоспецифической характеристики культуры (fingerprinting) использовали молекулярно-биологический метод анализа ДНК.

Ш Анализ ДНК-фингерпринта штамма Enterococcus faecium осуществляли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием модифици-

последовательностей (рисунок 2).

Рисунок 2 - ДНК - фингерпринт штамма Етегососсив 1"аесщт

Полученный результат подтверждает, что селекционированный штамм отличается от типовой культуры В-5460 Е. Гаесшт АТСС 8043(фрагмент 11) и близкородственного штамма Е. Гаесшга ОК 2 (фрагменты 4-6,10,13,16) по способности к биосинтезу Ц+)-молочной кислоты и является оригинальным, в коллекции ВКМ ему присвоен номер В-22400. Кроме того, проведенный анализ в сравнении с типовой культурой В-5460 Е. 1аесшт АТСС 8043 показал, что депонируемый штамм Е. Гаесшт В-22400 не содержит гены вирулентности agg, gelE и су1А, обычно присутствующие в культуре Е. Гаесшт, что позволяет использовать его при изготовлении пищевых добавок.

3.2.3 Исследование процесса биосинтеза Ь-молочной кислоты штаммом-продуцентом

Изучено влияние возраста и концентрации посевного материала культуры Е^егососсив Гаесшт на биосинтез молочной кислоты (таблицы 2 и 3).

Таблица 2 - Влияние возраста посевного материала на биосинтез молочной кислоты в динамике

Возраст культуры, час Количество молочной кислоты, %

Продолжительность культивирования, часы

0 6 12 24 30 36 42 48

4 0,15 0,8 1,1 • 1,6 1,8 2,2 2,4 2,45

8 0,15 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8

12 0,15 1,6 2,0 2,4 2,7 2,9 3,1 3,3

16 0,15 1,8 2,35 2,7 3,0 3,4 3,55 3,60

20 0Л5 2,0 2,4 2,7 2,9 3,2 3,5 3,65

24 0,15 2,0 2,2 2,7 2,9 3,0 3,3 3,5

Таблица 3 - Влияние концентрации посевного материала на накопление молочной кислоты в динамике

Концентрация посевного материала, % Количество молочной кислоты, г/дм1'

Продолжительность культивирования, сутки

1 2 3

5 2,0 15,2 22,0

10 5,4 26 6 30,2

20 7,8 30,6 36,0

30 8,0 31,0 36,5

50 4,6 24,4 28,3

Оптимальными условиями процесса накопления молочной кислоты с наибольшим выходом является внесение 30%-ной дозы посевного материала 16-20-часового возраста

Исследования зависимости биосинтеза молочной кислоты от внесения нейтрализующих агентов показали, что отобранная культура хорошо растет и накапливает достаточное количества молочной кислоты при условии ежедневной подтитровки - накопление кислоты до З6,5г/дм3 против 20г/дм3 без подтитровки (рисунок 3)

- - - без подтитровки -с подтитровкой

0 12 3

Продолжительность ферментации .сутки

Рисунок 3 - Зависимость биосинтеза молочной кислоты от внесения титрантов

По результатам накопления культурой молочной кислоты, полученных после 3 суток культивирования, при внесении различных добавок (таблица 4), установлено, что оптимальным для биосинтеза молочной кислоты штаммом-продуцентом ЕШегососсиз Гаесшт В-2240 О является внесение в питательную среду дрожжевого ферментолизата в количестве 2%, подбор концентрации которого определен методом аддитивно-решетчатого математического описания объекта при конструировании питательной среды для проведения последующих ферментации

Таблица 4 - Влияние органических и минеральных различных добавок на накоп-

ление молочной кислоты и выход от использованной лакзозы

Характеристика Кол-во Параметры

питательной Количество Выход от используе-

среды внесенных молочной мого углеводного

добавок, % кислоты, % субстрата, %

Без внесения добавок - 3,65 85,68

С внесением добавок

(маднрод 0,1 3,72 87,33

КН2Р04 0,1 3,7 87,86

МЙ804'7Н20 0,1 3,65 85,68

Ре804'7Н20 0,1 3,65 85,68

Мп804'4Н20 0,1 3,67 86,2

Экстракт солодовых ростков 0,5 3,78 88,73

Дрожжевой экстракт 0,5 3,8 89,2

Кукурузный экстракт (40%-ный) 0,01% 0,01 3,8 89,2

Дрожжевой автолизат 0,5 4,02 94,37

Дрожжевой ферментолизат 0,5 4,08 95,78

Сывороточный ферментолизат 0,5 4,0 93,9

Ферментолизат пшеничного глютена 0,5 4,0 93,9

Ферментолизат белатина 0,5 3,81 89,43

Ферментолизат биотрина 0,5 3,8 89,21

Гидролизат пшеничного глютена 0,5 3,82 89,68

Гидролизат белатина 0,5 3,83 89,9

Гидролизат биотрина 0,5 3,76 88,27

В таблице 5 представлены результаты по изучению отношения культуры ЕЫегососсив Гаесшш к различным начальным концентрациям лактозы и дополнительному внесению лактозы в питательную среду по мере ее исчерпания

Таблица 5 - Влияние концентраций лактозы на накопление целевого продукта

Концентрация лактозы (начальная и внесенная), % Параметры

Продолжительность ферментации, сут Количество свободной молочной кислоты, % Количество лактата натрия, % Выход от использованного углеводного субстрата, %

4,4 3 0,2 3,6 82,0

4,4+5,0 6 0,5 9,3 98,9

4,4+10,0 6 0,8 13,8 95,83

10,0 6 1,0 9,2 92,0

15,0 6 4,5 9,2 61,4

4,4+5,0+5,0 6 0,5 14,0 97,22

Из полученных данных можно сделать вывод, что культура хорошо реагирует на умеренную начальную концентрацию лактозы от 4,4% При исходной концентрации лактозы в питательной среде 10-15% тормозится процесс кислотообразования и снижается выход молочной кислоты, при этом увеличивается продолжительность ферментационного цикла, а в сброженном растворе остаются большие количества неиспользо-

10

ванной лактозы

Дополнительное внесение концентрированной сыворотки показало целесообразность ее дробной подачи в питательную среду в процессе ферментации, при этом наблюдается значительное увеличение выхода молочной кислоты от используемого углеводного субстрата

В исследованиях по воздействию различных температурных режимов на биосинтез молочной кислоты установлено, что оптимальной температурой для эффективной конверсии лактозы до молочной кислоты является 45°С

С соблюдением выявленных оптимальных условий были проведены ферментации на стендовой установке (рисунок 4)

Полученный после ферментации раствор содержал 18,6% лактата натрия, 0,56% свободной молочной кислоты и 0,25% несброженной лактозы, а также биомассу клеток культуры

Выход лактата натрия от используемого субстрата составил 95,8% Это позволяет сделать вывод о целесообразности использования данного штамма и подобранных условий культивирования для получения молочной кислоты из молочной сыворотки

1 2°] а

5 18 - — о- Динамика накопления

Л ? 16 ■ — лактата натрия

" Л 1А

2 14 х' —«—Динамика потребления

Рисунок 4 Динамика накопления лактата натрия и потребления лактозы в процессе биосинтеза молочной кислоты

Проведен химический и микробиологический анализ молочной сыворотки, молочной кислоты и осадка, получено заключение о нетоксичности культуры продуцента и целевого продукта

3 3 Сравнительные исследования штаммов-продуцентов бактериоцинов Известно, что многие молочнокислые и пропионовокислые бактерии наряду с образованием органических кислот, синтезируют антибиотические (антимикробные) вещества белково-пептидной природы, которые убивают или тормозят рост родственных

лактозы

О 20 40 60 80 1001 20140 Продолжительность ферментации, часы

видов или штаммов, или имеют более широкий спектр антибактериального действия и являются бактериоцинами

С целью получения пищевых добавок, обладающих защитными и пробиотиче-скими свойствами, была поставлена задача подбора микроорганизмов, способных к биосинтезу бактериоцинов различных классов

Наряду с изучением Lactococcus lactis subsp lactis культуры-продуцента бакте-риоцина I класса - лантибиотика низина, исследовали и другие культуры продуценты бактериоцинов И-го и Ш-го классов, а также рассматривалась возможность подбора культур для создания консорциума микроорганизмов для расширения спектра антибиотической активности

33.1. Отбор штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis и исследование возможности повышения их ннзинообразующей активности

Эксперименты по изучению биосинтеза низина культурой Lactococcus lactis subsp lactis в лаборатории проводили с 7 штаммами-продуцентами Исследуемые штаммы оценивались по их антибиотической активности (рисунок 5)

Как видно из полученных результатов, лучшей ннзинообразующей способностью обладали Lactococcus lactis subsp lactis ВКПМ- 7430, Lactococcus lactis subsp lactis BKM- 1662, Lactococcus lactis subsp lactis 1500T, Lactococcus lactis subsp lactis 119/05

С целью повышения способности штаммов-продуцентов к низинообразованию в ходе дальнейших экспериментов применялся метод пересева культуры с добавлением коммерческого препарата Nisaplin "Aplin & Barrett Ltd" (Великобритания) в первом пассаже и использованием в промежуточном пассаже так называемой «обедненной» среды, что привело при последующем культивировании в ферментере с обогащенной средой к резкому повышению роста клеток и, соответственно, к повышению низинообразуюшей способности культуры

После активации для сохранения полученной активности производилась консервация штаммов путем лиофильного высушивания

Известно, что в процессе ферментации Lactococcus lactis subsp lactis 85% бакте-риоцина накапливается в клетках, поэтому важной характеристикой культуры является количество жизнеспособных клеток Для подтверждения этого после выращивания культуры в ферментере и после высушивания определяли количество жизнеспособных клеток в наиболее активных штаммах-продуцентах

Перед высушиванием культур количество живых клеток составляло: штамм 119/05 - 1,2-109 в 1 см3, штамм 1662 - 3,0-Ю9 в 1 см3, штамм 1500Т- 1,6-109 в 1 см3,

Титр жизнеспособных клеток сразу после лиофильного высушивания составил: штамм 119/05 - 0,4Т09 в 1 см3, штамм 1662 - 1,0-Ю9 в 1 см3, штамм 1500Т- 0,5-Ю9 в 1см3, штамм 7430-1,1-109 в 1 см3. После лиофильной сушки процент выживаемости составил: штамм 119 - 33,3%, штамм 1662 - 37,5%, штамм 1500Т- 31,3%, штамм 7430-50%.

Данные по повышению низинообразующей способности отобранных штаммов, до и после высушивания представлены рисунке 5.

бооо

0 24/48 В119/05 В1500Т □ 4591 Ш74Э0 ■ 1662

Рисунок 5 - Характеристика отобранных штаммов продуцентов низина по антибиотической активности

1- антибиотическая активность штаммов до активирования

2- антибиотическая активность штаммов после активирования

3- антибиотическая активность активированных штаммов после лиофильного высушивания

Полученные данные свидетельствуют о том, что активированные штаммы Lactococcus lactis subsp. lactis 1500T, 119/05, ВКПМ- 7430 и Lactococcus lactis subsp. lactis BKM- 1662 синтезируют низин на уровне 4200-5200 МЕ/см3 или 100-130 мкг/см3.

Наиболее высокую низинообразующую активность имеет штамм В-1662 .

В ГосНИИгенетика были проведены исследования ДНК-фингерпринта этих штаммов методом ПЦР и при поступлении в коллекцию ВКПМ им присвоены следующие номера: В-1662- В-8023; 1500Т - В-8024; 119/05 - В-8025 и 2448 - В-8026.

3.3.2 Обнаружение и первичная идентификация бактериоциноподобных веществ, обладающих защитными (биопротекторными) свойствами

Исследования по обнаружению, выделению и исследованию свойств бактериоци-ноподобных веществ культур Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus acidophilus var.

coccoideus, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrueckn, Lactobacillus plantarum, Enterococcus faecium, Propionibacterium freudenreichn subsp shermanu проводили в одинаковых условиях

Для первичной идентификации антибиотического вещества в биомассе и фильтратах культуральных жидкостей использовали метод определения с помощью тонкослойной хроматографии и спектрометрии В качестве контроля служил раствор низина концентрацией 12,5мг/дм3

Наличие бактериоциноподобных веществ устанавливали на хромато грамм ах визуально, биоавтографически и по свечению в ультрафиолетовом свете

При первичной идентификации бактериоциноподобных веществ из исследуемых культур установлено, что они содержатся преимущественно в биомассе и в меньшей степени в фильтратах культуральных жидкостей По полученным данным ТСХ на пластинах «Sulufol» и биоавтографии можно сделать вывод, что антибиотические комплексы из биомассы состоят не менее чем из двух компонентов В фильтратах культуральных жидкостей в ходе проведения эксперимента было обнаружено по одному активному компоненту Пятна компонентов бактериоцинов, содержащихся в биомассе, имели величины Rf 0,63 и 0,25, во всех фильтратах культуральных жидкостей величина Rf была 0,81 и Rr низина-0,56

Спектры поглощений компонентов из биомассы и культуральных жидкостей характеризуются различным максимумом поглощения, но все находятся в ультрафиолетовой области спектра при длинах волн от 190 до 320 нм, что соответствует спектрам поглощения веществ белковой природы

Из данных по изменению оптической плотности и характера кривых спектров поглощения, представленных на рисунке 6, видно, что максимальная оптическая плотность бактериоциноподобных веществ наблюдается при длине волны 284 нм у четырех культур - Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Enterococcus faecium и Propionibacterium freudenreichn subsp shermanu Затем идет постепенное падение величины оптической плотности до длины волны равной 320 нм

Динамика изменения оптической плотности у трех культур - Lactobacillus acidophilus var coccoideus, Lactobacillus casei, и Lactobacillus delbrueckn и характер кривых спектров поглощения показали, что максимум величины оптической плотности наблюдается при длине волны 286 нм и постепенно снижается до длины волны 320 нм Показатели величин у этих культур примерно равные

По калибровочной кривой (рисунок 6), составленной по соотношению концентрации низина и соответствующего ей показания оптической плотности, определяли концентрации образующихся культурами бактериоциноподобных веществ

Как видно из таблицы 6, исследуемые культуры синтезируют значительное количество бактериоциноподобных веществ, особенно культуры Lactobacillus acidophilus, Enterococcus faecium и Propionibacterium freudenreichn subsp shermann

Рисунок 6 - Зависимость величины оптической плотности бактериоцинов, продуцируемых исследуемыми штаммами, от длины волны спектров поглощения Таблица 6 - Количество бактериоцинов в исследуемых культурах

Культура-продуцент Количество бактериоцино-

подобного вещества, мг/дм3

Lactobacillus acidophilus ВКМ 1660 (Т) 7,91

Lactobacillus acidophilus var coccoideus ВНИИПБТ M-94 2,85

Lactobacillus casei subsp casei BKM 536 3,0

Lactobacillus delbrueckn BKM 1954 2,22

Lactobacillus plantarum ВНИИПБТ 314 4,27

Enterococcus faecium BKM B-2240D 5,45

Propionibacterium freudenrachii subsp shermanii Ac-103 M 5,7

На основании проведенных экспериментов установлено, что изучаемые в данной работе молочнокислые и пропионовокислые бактерии при своем росте и развитии наря-

ду с накоплением биомассы клеток, синтезом органических кислот (молочной или про-пионовой), выделяют бактериоциноподобные вещества

33.3 Исследование образования молочной и пропноновой кислот и бакте-риоцннов в динамике роста клеток культуры

Для исследования были отобраны культуры Lactobacillus acidophilus и Propionibacterium freudenreichn subsp shermann, образующие наибольшее количество бактериоцинов Полученные данные представлены на рисунках 7 и 8

-»— Кривая роста культуры ОП ,ед

-»- Изменение рН среды в ходе ферментации

—♦—Накопление культурой

молочной кислоты, %

—л— Накопление культурой бактериоцина,%

Рисунок 7 - Накопление молочной кислоты и бактериоцинов в динамике роста культуры Lactobacillus acidophilus

Как видно из рисунка 7, накопление бактериоцинов культурой Lactobacillus acidophilus идет одновременно с ростом биомассы Наибольший синтез молочной кислоты, также как накопление бактериоцина, в культуральной жидкости наблюдается в фазе замедления роста культуры (20часов), их количество остается неизменным в стационарной фазе развития культуры Показатель рН среды во время роста культуры изменялся в кислую сторону из-за накопления молочной кислоты от 6,0 до 1,5 при увеличении концентрации кислоты от 0,2 до 3,3%

Тот факт, что по достижении культурой стационарной фазы, количество молочной кислоты и бактериоцина не уменьшается, может иметь большое значение для хранения культуральной жидкости и использования ее по мере необходимости в качестве защитного (биопротекторного) вещества

Как видно из результатов, представленных на рисунке 8, культура Propionibacterium freudenreichu subsp shermanii развивается значительно медленнее культуры Lactobacillus acidophilus У нее наблюдается затянутая лаг-фаза (18часов) и, так как образуемая клетками пропионовая кислота является более сильным веществом,

тормозящим размножение клеток, биомассы образуется меньше в 1,3 раза Наибольшее

16

4 8 12 16 20 24 28 32 Продолжительность ферментации,час

накопление в культуральной жидкости пропионовой кислоты, так же как и накопление бактериоцинов, наблюдается в фазе замедления роста культуры, и их количество сохраняется неизменным и в стадии позднего (стационарного) развития культуры

Показатель активной кислотности рН изменился от величины 7,0-до 4,0, при накоплении пропионовой кислоты от 0,1 до 1,5%

I I

-Изменение рН среды е ходе ферментации

- Кривая роста культуры ОП ед

-Накопление культурой пропионовой кислоты % -Накопление культурой бактериоцина %

4 12 20 28 36 44 52 60 68 Продолжительность ферментациит, час

Рисунок 8 - Накопление пропионовой кислоты и бактериоцинов в динамике роста культуры Propionibacterium freudenreicha subsp shermanu

Синтез и экскреция в культуральную жидкость бактериоцинов обеими культурами начинается при активном сдвиге pH среды в кислую сторону

3.3.4 Исследование образования органических кислот и бактериоцинов в динамике роста консорциума микроорганизмов Lactobacillus acidophilus u Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii

За время ферментации 48-64 часов получена культуральная жидкость, содержащая около 4,0% органических кислот и 12,4 мг/дм3 бактериоцинов (рисунок 9)

'Количество органических Ь, ~ ^ / кислот.%

s 8 • /

я * \ j -в—Количество

§ © б - / бактериоцинов, мг/дмЗ

1*1

? 6" а

■3 = "

a * 10 8 16 24 32 40 48 56 64 72

Продолжительность ферментации, ч

Рисунок 9 - Накопление органических кислот и бактериоцинов в культуральной жидкости консорциумом микроорганизмов

Результатами проведенных исследований (таблица 7) показано, что антибиотические вещества, выделяемые клетками культур Lactobacillus acidophilus и Propionibacterium freudenreichn subsp shermanu, обладают выраженными антимикробными свойствами, особенно в отношении бактериальных форм микроорганизмов, сильное угнетение наблюдалось при воздействии на Nocardia asteroids, возбудителя порчи овощей и фруктов

В отличие от препарата низина, комплекс бактериоцинов из изучаемых культур угнетал рост дрожжей и плесневых грибов

Препарат из культуральной жидкости с биомассой Lactobacillus acidophilus в 1,11,3 раза действовал эффективнее, чем препарат из фильтрата культуральной жидкости Препарат фильтрата культуральной жидкости, полученный при совместном культивировании исследуемых культур, в 1,3-2,0 раза был эффективнее, чем препараты, полученные после ферментации Lactobacillus acidophilus

Таблица 7 - Антимикробное действие бактериоцинов ассоциата Lactobacillus acidophilus и консорциума Lactobacillus acidophilus Propionibacterium freudenreichu subsp

shermanu

Ttcr культуры Зоны угнетения роста, мм

L acidophilus (фильтрат культуральной жидкости) L acidophilus (культуральная жидкость с биомассой) L acidophilus*- Р freudenreichn subsp shermanu (фильтрат культуральной жидкости консорциума микроргангамов)

Bacillus lichinoformis 15,0 20,0 30,0

Bacillus mesentericus(iiiT 1) 22,5 25,0 26,2

Bacillus mesentencus (шт 2) 24,0 25,0 25,5

Bacillus sporoginesis 6,0 20,0 28,0

Bacillus subtilis 25,0 25,0 26,0

Escherichia cdi 25,0 25,0 27,5

Escherichia cdi шт 76/1 18,0 20,5 23,0

Klebsiella pneumonia 23,5 26,0 29,0

Mycobacterium smegmatis 24,0 27,7 31,0

Pseudomonas aeruginosa 24,0 25,5 30,0

Proteus vulgaris 23,5 24,0 27,0

Proteus mirabilis 18,0 20,0 22,0

Salmonella tuphimurium 25,0 26,5 28,7

Shigella flexneri 25,0 27,5 28,0

Staphylococcus aureus 19,8 22,0 24,0

Nocardia asteroides 30,0 30,0 30,5

Candida utihs 15,0 16,5 18,0

Aspergillus niger 10,0 20,0 25,0

Это свидетельствует о том, что культуры консорциума выделяют в среду при своем росте отличные друг от друга бактерицидные комплексы, которые при совместном

18

использовании против нежелательной микрофлоры действуют синергетически Предположительно, что один из видов бактериоцинов действует на мембранные оболочки клеток, нарушая их проницаемость, а другой вид действует на репродуктивные механизмы клеток, нарушая их генный аппарат Полученные результаты дают основание заменить термин антимикробные вещества на бактериоцины и с определенностью утверждать, что они обладают биопротекторными свойствами, что позволяет их использовать в качестве биоконсервантов

4 Создание унифицированной технологической схемы производства комплексных пищевых добавок

Рисунок 10 - Принципиальная технологическая схема получения комплексных пищевых добавок лактата натрия и /или Ц+)-молочной кислоты и/или биоконсерванта на основе Ц+)-молочной кислоты и комплекса бактериоцинов

Установленные закономерности биосинтеза были подтверждены в производственных условиях и подобраны оптимальные параметры процесса

На основании полученных результатов разработана унифицированная технологическая схема производства пищевых добавок на основе молочной сыворотки с использованием кислотообразующих бактерий (рисунок 10)

В основу разработки положены научные знания по физиологии и биохимии выбранных культур микроорганизмов - продуцентов и достижения в области управляемого культивирования

На примере переработки молочной сыворотки показано, что разработанная схема является универсальной и при ее реализации в производственных условиях она отражает все особенности ведения технологического процесса

Возможна выработка конечного продукта в виде лактатов, Ь-молочной кислоты и комплексных пищевых добавок защитного и лечебно-профилактического действия, содержащих органические кислоты и комплекс бактериоцинов

5 Проверка в производственных условиях технологической схемы получения пищевых добавок

Согласно разработанной технологической схеме производства пищевых добавок из молочной сыворотки были проведены производственные испытания по получению пищевых добавок в виде лактата натрия, Ц+)-молочной кислоты и биоконсерванта

С соблюдением всех технологических параметров получены образцы готовой продукции, результаты оформлены актом производственных испытаний Определен выход молочной кислоты 95% от сбраживаемого субстрата.

В сравнительном плане были получены спектрограммы образцов молочной кислоты В качестве стандарта использовали образец молочной кислоты, полученной по традиционной технологии из сахаросодержащего сырья, производства Задубровского завода молочной кислоты

По сравнению с традиционной образец молочной кислоты, полученной на сыворотке, соответствует требованиям ГОСТ 490, но имеет более широкие зоны пропускания, что свидетельствует о наличии органических компонентов, которые, видимо, и придают молочной кислоте приятный специфический вкус и цвет

Аналогичным образом в производственных условиях были получены образцы культуральных жидкостей, содержащих Ц+)- молочную и пропионовую кислоты и ком-

плекс бактериоцинов молочнокислых и пропионовокислых бактерий Полученные таким образом концентраты являлись компонентами для биоконсервантов

Разработана нормативная и технологическая документация по производству указанной продукции «Пишевые добавки Ц+)-молочная кислота и лактат натрия» ТУ 9199-067-00334586-05 и ТИ 10-030-00334586-05, «Пищевые добавки защитно- профилактического действия на основе молочнокислого и пропионовокислого брожения» ТУ 9191-045-00334586-05 и ТИ 10-033-00334586-05, БАД к пище «Планто-Хол плюс» ТУ 9197-001-20885466-06 и технологическая инструкция на ее производство, биоконсервант «Низолакт» ТУ 9199-001-45885556-99, на пищевую добавку биоконсервант «Консэко» ТУ 9199-001-45885556-01 и технологические инструкции на их производство Технические условия и технологические инструкции на плодоовощные консервы пастеризованные ТУ 9161-002-45885556-02, ТУ 9161-005-45885556-02 , ТУ 9161-003-45885556-02, ТУ 9161-003-45885556-02, ТУ 9161-007-45885556-02, ТУ 9161-006-45885556-02

6 Испытание комплексных пищевых добавок в различных отраслях промышленности

Наработаны опытные партии комплексного биоконсерванта, которые переданы потребителям для испытаний в производстве в производстве рыбной продукции в Атлантический НИИ рыбного хозяйства и океанографии (г Калининград), а также во ВНИИРО (г Москва), плодоовощной продукции во ВНИИ холодильной промышленности (г Москва), в производстве плодоовощных консервов во ВНИИ консервной и ово-щесушильной промышленности (г Видное), для обработки оболочек колбас на Московский мясоперерабатывающий завод им Микояна и обработки корне- и клубнеплодов на Люблинскую плодоовощную базу Получены положительные результаты

Промышленный выпуск пастеризованной плодоовощной продукции с использованием биоконсервантов налажен на ЗАО «Консэко» (г Москва) С использованием Ц+)- молочной кислоты осуществлен серийный выпуск БАД «Планта-Хол плюс» капсулы на ООО «Томская фармацевтическая фабрика» и ООО «Натурфармацевтическая компания» (г Томск), а также выпуск водок «Родник» и «Правда» (г Самара)

7 Экономическая эффективность производства пищевых добавок Экономическая эффективность производства пищевых добавок по разработанной

технологии подтверждена расчетами по калькуляции себестоимости, капитальным затратам и рентабельности производства Экономический анализ производства молочной кислоты на основе молочной сыворотки показал, что при использовании указанного сы-

рья для культивирования молочнокислых бактерий себестоимость готовой продукции по сравнению с традиционным способом снижается на 54,9% Окупаемость затрат составляет 14,7 месяцев Годовой экономический эффект от внедрения технологии для завода с объемом производства 337 т составил 4536,0 тыс рублей

Выводы:

1. На основании проведенных исследований отобранных и селекционированных штаммов Enterococcus faecium, Lactococcus Iactis subsp lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus acidophilus var cocoideus, Lactobacillus casei subsp casei, Lactobacillus plantarum, Propionibacterium freudenreichu subsp shermanii установлена возможность их использования для получения комплексных пищевых добавок

2 Оптимизирован состав питательной среды для проведения процессов ферментации методом аддитивно-решетчатого математического описания объекта, что позволило увеличить выход молочной кислоты на 13,7%

3 Подобраны опгимальные условия биосинтеза органических кислот и бакте-риоцинов селекционированными культурами Изучены закономерности влияния начальной концентрации углеводов в питательной среде, дозы и возраста посевного материала и других параметров на динамику накопления L-молочной и пропионовой кислот, а также бактериоцинов

4 На основе анализа биотехнологических свойств ассоциатов создан новый консорциум микроорганизмов, содержащий Lactobacillus acidophilus и Propionibacterium lreudenreichn subsp shermanii, позволяющий в максимальной степени реализовать фи-зиолого-биохимичский и технологический потенциал используемых микроорганизмов

5 Изучено совместное культивирование культур консорциума микроорганизмов Lactobacillus acidophilus и Propionibacterium shermanii subsp shermanii и установлено их синергетическое действие

6 Установлено, что антагонистическая активность консорциума по отношению к патогенным и условно патогенным бактериям, изменениям pH среды значительно выше по сравнению с ассоциатами, входящими в их состав

7 Разработана унифицированная технологическая схема и технология ресур сосберегающего производства комплексных пищевых добавок лактата натрия, пищевой L(+)- молочной кислоты и биоконсервантов на молочной сыворотке с использованием кислотообразующих бактерий,

8 Разработана технология получения биологически активной добавки к пище

на основе L-молочной, янтарной кислоты и силибина, обладающая лечебно-профилактическим действием при заболеваниях печени и желудочно-кишечного тракта

9 Проведены производственные испытания пищевых и биологически активных добавок, подтверждающие возможность получения по разработанной технологии комплексных пищевых добавок, обладающих защитно-профилактическими и пробиоти-ческими свойствами

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1 Исакова Д М , Куксова Е В Консервант сельскохозяйственной продукции Патент РФ№2159553 -БИ,2000, №33

2 Исакова Д М, Куксова Е В Способ консервирования сельскохозяйственной продукции Патент РФ №2157635 - Б И, 2000, №29

3 Галкина Г В , Илларионова В И , Волкова Г С , Горбатова Е В , Куксова Е В Перспективные направления в обеспечении безопасности и качества пищевой продукции - Сборник докладов научно-практической конференции «Качество и безопасность сельскохозяйственного сырья и пищевых продуктов», г Углич, 2004, с 75-78

4 Галкина Г В , Волкова Г С, Куксова Е В , Горбатова Е В Ферментативный гидролиз белковых компонентов питательной среды для получения биоконсерванта на основе молочной кислоты и комплекса метаболитов молочнокислых бактерий Микробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК под общей редакцией В А Полякова, М Пищепромиздат, 2004, с 157-162

5 Куксова Е В , Галкина Г В , Волкова Г С , Горбатова Е В Разработка метода получения биоконсерванта на основе Ь(+)-формы молочной кислоты, низина и комплекса бактериоцинов - Хранение и переработка сельскохозяйственного сырья, 2004, № 8, с 53-55

6 Галкина Г В , Куксова Е В , Илларионова В И , Волкова Г С , Горбатова Е В Разработка производства нового поколения пищевых защитно-профилактических добавок с L-формой кислот Научное обеспечение и тенденции развития производства пищевых добавок в России - Материалы докладов международной конференции «Научное обеспечение и тенденции развития производства пищевых добавок в России», г Санкт-Петербург, 2005, с 36-39

7 Куксова Е В , Галкина Г В, Илларионова В И , Волкова Г С, Горбатова Е В Усовершенствование биотехнологии получения защитно-профилактических препа-

ратов на основе культивирования консорциума кислотообразующих микроорганизмов -Вестник РАСХН, 2005, № 8, с 55-58

8 Галкина Г В , Илларионова В И , Волкова Г С , Горбатова Е В , Куксова Е В Новая технология переработки послеспиртовой барды с применением кислотообразующих бактерий. - Ликероводочное производство и виноделие, 2004, № 6, с 55-57

9 Галкина Г В, Илларионова В И , Куксова Е В , Горбатова Е В , Волкова Г С Штамм - Lactobacillus acidophilus продуцент белка Патент РФ № 2244000 - Б И , 2005, №1

10 Галкина Г В, Илларионова В И, Куксова Е В, Горбатова Е В , Волкова ГС, Шевандин С Н Штамм - Propionibacterium frcudenreichii subsp shermann продуцент белка Патент РФ № 2247149 - Б И, 2005, № 6

11 Галкина Г В, Илларионова В И, Куксова Е В , Горбатова Е В , Волкова Г С Штамм - Lactobacillus plantarum продуцент белка Патент РФ № 2244001 - Б И, 2005, № 1

12 Куксова Е В , Волкова Г С, Галкина Г В , Илларионова В И , Горбатова Е В Получение защитно-профилактических препаратов на основе культивирования консорциума кислотообразующих микроорганизмов - Вестник РАСХН, 2006, № 1, с 60-63

13 Галкина Г В , Куксова Е В, Илларионова В И , Волкова Г С , Горбатова Е В Новая конкурентоспособная технология производства молочной кислоты - Тезисы научной конференции «Стратегия научного обеспечения развития конкурентоспособных производств отечественных продуктов питания высокого качества», г Волгоград, 2006, с 15-19

14 Галкина Г В , Куксова Е В , Волкова Г С , Илларионова В И, Горбатова Е В Биотехнология производства пищевых добавок с защитно-профилактическими свойствами - Сборник научных трудов ГНУ ВНИИПБТ «Теоретические и практические аспекты развития спиртовой, ликероводочной промышленности», 2006, с 258-268

15 Куксова Е В , Волкова Г С , Галкина Г В , Илларионова В И , Горбатова Е В Новая эффективная технология производства Е(+)-молочной кислоты - Сборник научных трудов ГНУ ВНИИПБТ «Теоретические и практические аспекты развития спиртовой, ликероводочной промышленности», 2006, с 268-275

16 Галкина Г В, Илларионова В И , Куксова Е В , Волкова Г С, Горбатова Е В Пищевые добавки на основе использования бактериоцин - продуцирующих стартерных культур и их использование в агропищевых технологиях - Сборник статей материалов научно-практической конференции «Интеграция фундаментальных и прикладных исследований - основа развития современных аграрно-пищевых технологий», г Углич, 2007, с 61-63

17 Поляков В А , Галкина Г В , Илларионова В И, Куксова Е В , Волкова Г С Бактериоцины молочнокислых бактерий и их использование в производстве продуктов функционального назначения НИИ хранения и переработки сельхозпродукции -Сборник статей конференции «Нано- и биотехнологии в производстве продуктов функционального назначения», г Краснодар, 2007, с 34-36

18 Поляков В А , Куксова Е В Исследование и разработка процесса получения комплексных пищевых добавок на основе культивирования кислотообразующих бактерий - Хранение и переработка сельскохозяйственного сырья, 2007, № 12, с 57-61

19 Галкина Г В , Куксова Е В , Волкова Г С , Илларионова В И , Горбатова Е В Белковые биологически активные продукты на основе кислотообразующих микроорганизмов и их использование ВНИТИБ - Сборник материалов международной научно-практической конференции «Научные основы производства биологических препаратов», г Щелково, 2007, с 298-304

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Молочная кислота: основные свойства, получение и применение

1.2 Продуценты молочной кислоты

1.2.1 Род Lactobacillus

1.2.2 Род Streptococcus

1.2.3 Применение смешанных культур - продуцентов молочной кислоты

1.2.4 Использование других культур продуцентов при получении 25 молочной кислоты

1.3 Пропионовая кислота: основные свойства, получение и применение 26 1.3.1 Род Propionibacterium

1.4 Бактериоцины: основные понятия и свойства

1.4.1 Основные понятия, классификация

1.4.2 Бактериоцины молочнокислых бактерий и их применение

1.4.3 Лантобиотик низин

1.4.4 Бактериоцины пропионовокислых бактерий и их применение

1.5 Молочная сыворотка - сырьевой ресурс микробиологического производства молочной кислоты, пропионовой кислоты и бактериоцинов

2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1 Материалы и методы исследований

2.1.1 Объекты исследований

2.1.2 Условия культивирования

2.1.3 Анализ сырья, промежуточных полупродуктов и готовой продукции

2.2 Структура экспериментальных исследований

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 66 3.1 Исследование и разработка технологии получения пищевой L(+)молочной кислоты на основе молочной сыворотки

3.1.1 Определение оптимального режима подготовки сыворотки

3.1.2 Выбор штамма продуцента

3.1.3 Культурально-морфологические и биохимические свойства культу- 72 ры-продуцента ЕгЛегососсш Гассшт

3.1.4 Количество и качество посевного материала

3.1.5 Изучение влияния показателя кислотности среды на накопление мо- 77 лочной кислоты

3.1.6 Влияние неорганических и органических добавок

3.1.7 Оптимизация состава питательной кислоты для биосинтеза молочной 80 кислоты методом аддитативно-решетчатого математического описания объекта

3.1.8 Влияние исходной концентрации лактозы

3.1.9 Исследование влияния температурных режимов

3.1.10 Исследование процесса биосинтеза молочной кислоты культурой Еп

1егососсиз Гаесшт на стендовой установке в полупроизводственных условиях

3.1.11 Разработка метода очистки молочной кислоты, полученной на основе 88 молочной сыворотки

3.1.12 Изучение состава молочной кислоты, полученной на молочной 91 сыворотке и осадка

3.1.13 Токсилогические исследования штамма-продуцента и готового про- 92 дукта

3.2 Сравнительные исследования штаммов-продуцентов бактериоцинов

3.2.1 Повышение низинообразующей активности с целью получения про- 93 изводственных штаммов-продуцентов низина

3.2.1.1 Оценка свойств лабораторных штаммов Ьа^ососсиэ 1асНз

3.2.1.2 Проведение селекционной работы с отобранными штаммами- 95 продуцентами для повышения их низинообазующей способности

3.2.1.3 Проведение ДНК фингерпринта с помощью ПЦР

3.2.1.4 Исследование антибиотической способности отобранного штамма 103 продуцента низина

3.2.2 Обнаружение и первичная идентификация бактериоциноподобных 106 веществ II и III класса, обладающих защитными (биопротекторными) свойствами

3.2.2.1 Обнаружение бактериоциноподобных веществ

3.2.2.2 Первичная идентификация бактериоциноподобных веществ

3.2.2.3 Изучение роста и образования бактериоцинов в динамике

3.2.2.4 Исследование культивирования консорциума микроорганизмов

3.2.2.5 Изучение антибиотической активности, отобранных штаммов про- 119 дуцентов бактериоцинов

3.3 Разработка технологии получения биоконсерванта

4 Создание унифицированной технологической схемы производства 126 комплексных пищевых добавок: лактата натрия, Ь(+)-молочной кислоты и биоконсерванта на основе молочной сыворотки.

5 Проверка в производственных условиях технологической схемы про- 128 изводства пищевых добавок

6 Экономическая эффективность пищевых добавок, полученных на 131 основе молочной сыворотки

7 Применение комплексных пищевых добавок для создания продуктов 135 функционального питания

8 Использование исследованных культур молочнокислых и пропионо- 141 вокислых бактерий в качестве пробиотиков в медицинской практике ВЫВОДЫ 146 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 148 ПРИЛОЖЕНИЯ

В связи с концепцией государственной политики в области здорового питания населения России первостепенное значение приобретает проблема расширения отечественного производства пищевых продуктов и обеспечения их качества и безопасности.

Сложившаяся в настоящее время структура питания населения, отсутствие сбалансированных продуктов приводит к возникновению различных форм иммунодефицита, снижению сопротивляемости организма инфекциям и другим неблагоприятным факторам окружающей среды, к увеличению частоты заболеваний, вызываемых дефицитом макро- и микронутриентов.

При разработке продуктов нового поколения широко используются различные пищевые добавки, в том числе направленного действия.

Кроме того, обеспечение безопасности пищевых продуктов обусловливается необходимостью защиты пищевых продуктов и продовольственного сырья относительно неблагоприятного воздействия на них при производстве и хранении как потенциально опасных микроорганизмов и выделяемых ими токсичных веществ, так и приемов технологии (стерилизация, пастеризация и другие).

Потери при хранении пищевых продуктов и продовольственного сырья от микробиологической порчи составляют до 30% товарного веса.

В настоящее время наиболее распространен способ защиты пищевых продуктов термической обработкой, с использованием химических консервантов и синтетических органических кислот, что отрицательно отражается на качестве пищевых продуктов (ухудшаются их вкусовые и другие потребительские свойства, в продукты вносятся не органичные им химические вещества).

Использование для защиты пищевых продуктов добавок защитно-профилактического действия позволяет получать пищевые продукты высокого качества, термическая обработка, которых сведена к минимальной, которые не подвергаются быстрой порче и не представляют опасности для здоровья человека. Предотвращая порчу продуктов питания, они уменьшают опасность образования токсинов. Такая профилактика тем более важна, что образовавшееся ядовитое вещество не может быть удалено из пищевых продуктов[1].

Перспективным направлением для этих целей служит использование биотехнологии микробиологического синтеза с помощью кислотообразующих бактерий с получением органических кислот и продуктов метаболизма, а также самих культур, внимание к которым значительно усилилось последнее время, как за рубежом, так и в России.

Все возрастающий интерес проявляется к использованию пробиотиков для создания новых пищевых биологически активных добавок, функциональных продуктов питания, используемых для лечения и профилактики кишечных инфекций.

Однако при всем многообразии применяемых биологических средств защиты продуктов питания они имеют оганиченное действие против тех или иных патогенных микроорганизмов, не охватывая всю область неблагоприятного воздействия. Поэтому использование комплексных препаратов для биологической защиты продуктов питания имеет особое значение.

Это направление основывается на изучении антибиотических веществ, продуцируемых определенной группой микроорганизмов.

Пробиотики - препараты и продукты питания, в состав которых входят вещества микробного и немикробного происхождения, оказывающие при естественном способе введения благоприятные эффекты на физиологические функции и биохимические реакции организма хозяина через оптимизацию его микроэкологического статуса. Это определение предполагает, что любые микроорганизмы, их структурные компоненты, метаболиты, а так же вещества другого происхождения, позитивно влияющие на функционирование микрофлоры организма, способствующие лучшей адаптации последнего к окружающей среде в конкретной экологической нише, могут рассматриваться как пробиотики [2-6].

Многие бактерии, в том числе молочнокислые и пропионовокислые, синтезируют антибиотические вещества белково-пептидной природы, убивающие родственные виды или штаммы или тормозящие их рост, или имеющие более широкий спектр антибактериального действия. Эти вещества с весьма специфическим действием получили название бактериоцинов.

Наиболее перспективными для исследования являются бактериоцины молочнокислых и пропионовокислых бактерий, т.к. осуществляют естественное предохранение пищевых продуктов, в том числе полученных путем ферментации и могут быть использованы как природные консерванты пищевых продуктов.

Поэтому разработка пищевых добавок функционального действия, обладающих защитно-профилактическими и консервирующими свойствами, является чрезвычайно актуальной.

Средством решения проблемы является подбор более активных штаммов-продуцентов кислотообразующих бактерий, разработка технологии производства пищевых и биологически активных добавок к пище, обладающих защитно-профилактическими и функциональными свойствами.

Основной целью данной работы является подбор активных штаммов продуцентов кислотообразующих бактерий, исследование их использования для получения комплексных пищевых добавок на основе Ц+)- молочной кислоты и комплекса бактериоцинов - внеклеточных и внутриклеточных метаболитов молочнокислых и пропионовокислых бактерий с использованием вторичного ресурса пищевой промышленности - молочной сыворотки.

Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи: -разработка способа подготовки молочной сыворотки;

-отбор микроорганизмов продуцентов, способных эффективно осуществлять конверсию углеводов молочной сыворотки в молочную кислоту более предпочтительной оптической формы;

-изучение и разработка оптимальных условий для роста и кислотообразова-ния выбранных микроорганизмов;

-выбор микроорганизмов продуцентов, обладающих антагонистической способностью к патогенной микрофлоре, вызывающей порчу пищевых продуктов;

-отбор и селекция высокоактивных штаммов - продуцентов оптически чистой L(+)- молочной кислоты и бактериоцинов с целью расширения спектра антимикробной активности биоконсерванта;

-селекция высокоактивных штаммов Lactococcus lactis- продуцентов низина;

-отбор высокоактивных штаммов Propionibacterium freudenreichii subsp. sher-manii - продуцентов пропионовой кислоты и бактериоцинов, действие которых направлено против дрожжей и плесеней, для расширения спектра действия комплексного биоконсерванта;

- оптимизация параметров управления процессом биосинтеза бактериоцинов;

- разработка пищевых и биологически активных добавок;

-наработка опытных образцов препаратов и оценка их качества;

-разработка и рекомендации для промышленного внедрения на основании полученных экспериментальных данных унифицированной технологической схемы получения пищевых добавок на основе Ь(+)-молочной и пропионовой кислот и комплекса бактериоцинов молочнокислых и пропионовокислых бактерий с использованием в качестве сырья молочной сыворотки.

На основании проведенных исследований физиолого-биохимических свойств культур продуцентов, для производства оптически чистой Ц+)-молочной кислоты впервые подобрана и исследована культура Enterococcus faecium с использованием в качестве сырья молочной сыворотки.

Выявлены основные закономерности биосинтеза культур-продуцентов, получен новый экспериментальный материал по изучению влияния технологических параметров на динамику накопления органических кислот и вторичных метаболитов.

Исследована возможность совместного культивирования консорциума молочнокислых и пропионовокислых бактерий для расширения антимикробного спектра действия биоконсерванта.

Разработана методика выделения и первичной идентифицикации бактериоцинов, продуцируемых данными культурами, изучены спектры поглощения бактериоцинов и антибиотическая активность отобранных штаммов-продуцентов.

Изучены закономерности биосинтеза бактериоцинов, включая низин, при использовании отобранных штаммов-продуцентов Enterococcus faecium, Lactobacillus acidophilus, Propionibacterium freudenreichii subs, shearmanii и Lactococcus lactis subsp. lactis.

По результатам проведенной работы получено 5 патентов РФ.

На основании результатов проведенных исследований разработана технология производства пищевых и биологически активных добавок с использованием кислотообразующих бактерий, характеризующаяся высоким техническим уровнем. Определены оптимальные режимы и новые приемы технологии, обеспечившие высокие продуктивность, выход и качество целевой продукции.

Разработана унифицированная технологическая схема получения комплексных пищевых добавок: лактата натрия, L(+)- молочной кислоты и биоконсерванта, на основе оптически чистой L(+)- молочной и пропионовой кислот, а также комплекса бактериоцинов, продуцируемых молочнокислыми и пропионовокислыми бактериями, позволяющая:

- заменить традиционно используемые ценные сахаросодержащие субстраты (сахар, рафинадная патока, меласса) для получения пищевых добавок с использованием молочной кислоты, более дешевым и доступным сырьем - молочной сывороткой;

- увеличить выход молочной кислоты по сравнению с традиционной технологией на сахаросодержащих средах с 92,0 до 95,0 %;

- получить пищевую молочную кислоту в L (+) -форме с оптической чистотой 99,8% и обеспечением высокого качества при значительном снижении себестоимости целевого продукта;

- получить пищевые добавки - биоконсерванты, обладающие защитно-профилактическим и пробиотическим действием;

- расширить спектр действия биоконсервантов за счет использования в комплексе с низином других бактериоцинов, благодаря синергетическому действию специально подобранных культур микроорганизмов;

- получить биологически активные добавки к пище на основе Ь (+)-молочной кислоты, обладающие лечебным и профилактическим действием.

Значимость проведенной работы определяется разработкой новых пищевых добавок, содержащих ферментные комплексы и метаболиты молочнокислых и про-пионовокислых бактерий, направленно синтезирующих пищевые кислоты в Ь-форме, бактериоцины, легкоусвояемые белки и углеводы для создания гигиенически благополучных продуктов питания для детерминированных групп населения, защитно-профилактических препаратов для сохранения пищевой продукции и продовольственного сырья.

При этом создается экологически чистое производство с ресурсосберегающей технологией за счет использования нетрадиционных видов сырья, отходов и вторичных ресурсов переработки сельхозсырья. Выработка пищевых добавок, обладающих антимикробными, консервирующими свойствами позволит заменить химические и синтетические консерванты с неблагополучными последствиями их применения, существенно уменьшить импорт и позволит расширить ассортимент продуктов функционального питания.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В последние годы проявляется все более возрастающий интерес к использованию кислотообразующих молочнокислых и пропионовокислых бактерий (МКБ и ПКБ) для защиты пищевых продуктов. Одна из главных причин интереса к биологической защите - это сокращение использования химических консервантов при производстве продуктов питания. Потребители заинтересованы в натуральных пищевых продуктах высокого качества, которые при этом являлись бы безопасными при минимальной обработке. Эта задача может быть решена методом биоконсервации, при котором используются микроорганизмы и/или их метаболиты. Молочнокислые и пропионовокислые бактерии являются наиболее подходящими для реализации этого метода. Они имеют естественный потенциал для использования в биоконсервации, потому что, как правило, безопасны, играют существенную роль в большинстве ферментативных процессов при обработке продуктов и являются преобладающей микрофлорой во многих пищевых продуктах, сохраняемых естественным образом. Это обусловлено их ингибирующим эффектом в отношении нежелательных бактерий, который, главным образом, проявляется в образовании органических кислот, в конкуренции за субстрат, в образовании перекиси водорода и, для некоторых штаммов, в синтезе бактериоцинов. Комбинации различных физических, химических и микробиологических способов консервирования - важные факторы в "барьерной концепции" для защиты пищевых продуктов. Бактериоцины и/или бак-териоцин-синтезирующие культуры выступают как два защитных барьера при консервировании пищевой продукции и могут использоваться как в виде готовых препаратов, так и в виде микроорганизмов, которые продуцируют бактериоцины непосредственно в пищевом продукте, обеспечивающих пробиотический эффект[1-23].

Пищевая молочная кислота принадлежит к самым старым из известных продуктов микробиологического синтеза. Из двух изомеров Ь(+)-молочная кислота является основным продуктом метаболизма в организме человека и играет важную роль в окислительных процессах обмена веществ, а также в процессах синтеза глюкозы, гликогена, аминокислот и промежуточных продуктов цикла лимонной кислоты, являющихся натуральными метаболитами и участвующими в коррекции клеточного обмена. Естественное обогащение Ь(+)-молочной кислотой продуктов питания в ходе молочнокислого брожения повышает их питательную ценность.

В последние десятилетия значительно вырос интерес к различным аспектам получения и применения молочной кислоты. Это обусловлено как значительным увеличением спроса в традиционных областях применения молочной кислоты, так и возможным расширением сфер ее использования для производства поверхностно-активных, фармацевтических, биологически активных веществ [9,10,24-31]. Получение оптически чистых растворов молочной кислоты при низкой себестоимости позволит реализовать ее применение в качестве биодеградабельных полимеров [32,33].

Общеизвестно, что пропионовая кислота и ее соли проявляют антимикробное действие. Некоторые микроорганизмы вырабатывают пропионовую кислоту как продукт обмена веществ, многие другие могут ее метаболизировать. Если пропионовая кислота присутствует в достаточной концентрации (как при консервировании пищевых продуктов), то она, угнетая ферменты, блокирует обмен веществ. К тому же пропионовая кислота снижает рН межклеточной среды, что также способствует угнетению роста и гибели клеток. Практика показала, что пропионовая кислота и пропионаты эффективны преимущественно против плесневых грибов. Пропионовая кислота, как и подобает жирной кислоте, используется организмом в качестве источника энергии. Часть ее превращается в глюкозу, гликоген и другие продукты. Наряду с этим возможно превращение пропионовой кислоты (через сук-цинат) в В-аланин. Тем самым она не чужеродна организму, а является естественным промежуточным продуктом обмена веществ. Пропионовая кислота и ее соли применяются при консервировании хлебобулочных изделий и сыра [1,9,17,18].

Бактериоцины в пищевой промышленности стали активно применяться в течение последних десятилетий. Бактериоциногения - биологический феномен, широко распространенный в природе и связанный с антагонизмом у бактерий. Исследования последних лет позволили выделить в самостоятельную категорию явлений антагонистическую активность микроорганизмов, характеризующуюся синтезом белковоподобных антибактериальных веществ с ограниченным диапазоном активности. Считают, что с практической точки зрения эти антибактериальные препараты, действующие на микрофлору избирательно, могут использоваться для нормализации микробного ценоза при некоторых патологиях у человека и животных [7].

Бактериоцины представляют собой белки, продуцируемые бактериями и инактивирующие другие бактерии. Бактериоцины могут использоваться в консервировании, как в виде готовых препаратов, так и в виде микроорганизмов, которые продуцируют бактериоцины непосредственно в пищевом продукте (защитные культуры). Консервирование с применением бактериоцинов, как и с ферментами, называют биоконсервированием. Наибольший практический интерес представляют бактериоцины молочнокислых и пропионовокислых бактерий, добавление которых к пищевым продуктам позволяет предотвратить развитие патогенной или другой нежелательной микрофлоры [1-23]. Лучше всех известен и наиболее исследован бак-териоцин - низин, одобренный ФАО/ВОЗ (ШСБА) как пищевой консервант[1].

Таким образом, кислотообразующие бактерии и продукты их метаболизма представляют большой интерес для использования в качестве защитно-профилактических препаратов при производстве и хранении пищевых продуктов и продовольственного сырья.

выводы

1. На основании проведенных исследований отобранных и селекционированных штаммов Enterococcus faecium, Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus acidophilus var. cocoideus, Lactobacillus casei subsp. casei, Lactobacillus plantarum, Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii установлена возможность их использования для получения комплексных пищевых добавок.

2. Оптимизирован состав питательной среды для проведения процессов ферментации методом аддитивно-решетчатого математического описания объекта, что позволило увеличить выход молочной кислоты на 13,7%.

3. Подобраны оптимальные условия биосинтеза органических кислот и бактериоцинов селекционированными культурами. Изучены закономерности влияния начальной концентрации углеводов в питательной среде, дозы и возраста посевного материала и других параметров на динамику накопления L-молочной и пропионовой кислот, а также бактериоцинов.

4. На основе анализа биотехнологических свойств ассоциатов создан новый консорциум микроорганизмов, содержащий Lactobacillus acidophilus и Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii, позволяющий в максимальной степени реализовать физиолого-биохимичский и технологический потенциал используемых микроорганизмов.

5. Изучено совместное культивирование культур консорциума микроорганизмов Lactobacillus acidophilus и Propionibacterium shermanii subsp. shermanii и установлено их синергетическое действие.

6. Установлено, что антагонистическая активность консорциума по отношению к патогенным и условно патогенным бактериям, изменениям pH среды значительно выше по сравнению с ассоциатами, входящими в их состав.

7. Разработана унифицированная технологическая схема и технология ресурсосберегающего производства комплексных пищевых добавок: лактата натрия, пищевой L(+)- молочной кислоты и биоконсервантов на молочной сыворотке с использованием кислотообразующих бактерий;

8. Разработана технология получения биологически активной добавки к пище на основе Ь-молочной, янтарной кислоты и силибина, обладающая лечебно-профилактическим действием при заболеваниях печени и желудочно-кишечного тракта.

9. Проведены производственные испытания пищевых и биологически активных добавок, подтверждающие возможность получения по разработанной технологии комплексных пищевых добавок, обладающих защитно-профилактическими и пробиотическими свойствами.

1. Люк Э., Ягер М. Консерванты в пищевой промышленности.- СПб.: ГИОРД, 1998.-256 с.

2. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание, ч. 3.- Москва.: изд. Грантъ 2001.-704 с.

3. Шевелёва С.А. Пробиотики, пребиотики и пробиотические продукты. Современное состояние вопроса // Вопросы питания. 1999. - №2. - С.32-39.

4. Шендеров Б.А, Манвелова М.А. Пробиотики и функциональное питание. Микроэкологические аспекты: Тез. докл. межд. конф. «Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространённых заболеваний человека». М., 1999. С.55.

5. Fooks L. J., Fuller R., Gibson G. R. Prebiotics, probiotics and human gut microbiology // Inter. Dairy J. 1999, - Vol. 9. - №1. - p. 53-61.

6. Бондаренко B.M., Рубакова Э.И., Лаврова B.A. Иммуностимулирующее действие лактобактерий, используемых в качестве основы препаратов пробиотиков// Микробиология-1998.-№5 .-с. 107-112.

7. Егоров Н.С., Баранова И.П. Бактериоцины. Образование, свойства, применение //Антибиотики и химиотерапия, 1999-№ 6. с. 33-40

8. Воробьева Л.И. Промышленная микробиология. М.: Изд-во МГУ, 1989.-294с.

9. З.А. Аркадьева, A.M. Безбородов, И. Н. Блохина и др.; Под ред. Н.С.Егорова. Промышленная микробиология.- М.: Высш. шк., 1989.- 688с.

10. Куксова Е.В., Галкина Г.В., Волкова Г.С., Горбатова Е.В. Разработка метода получения биоконсерванта на основе L(+)-формы молочной кислоты, низина икомплекса бактериоцинов. Хранение и переработка сельскохозяйственного сырья. №8, 2004г., с. 53-55.

11. Куксова Е.В., Волкова Г.С., Галкина Г.В., Илларионова В.И., Горбатова Е.В. Получение защитно-профилактических препаратов на основе культивирования консорциума кислотообразующих микроорганизмов. Вестник РАСХН, 2006г. №1, с.60-63.

12. Л.И. Воробьева Пропионовокислые бактерии М.: Изд-во МГУ,1995.-285с.

13. Работка технологии бактериального концентрата пропионовокислых бактерий: Автореф. дисс. / Тумурова С.М.- Вост.-Сиб. гос. техн. ун-т, Улан-Уде, 2004.-22с.

14. Создание ассоциации из молочнокислых и пропионовокислых бактерий, активной в отношении возбудителей колибактериоза и сальмонеллеза. / Гаврилова H.H., Ратникова И.А., Бьякшова К., Захаренко Л.И.// Биотехнология-2005.-№2-с.26-32.

15. Protective cultures and use thereof for preserving foodstuffs: Пат. 6916647 США, МПК7 C12N 1/20. / Elssen Dieter, Danisco A/S.- N 09/958051. Заявл. 05.04.2000. Опубл. 12.07.2005.

16. Bacteriocins produced by lactic acid bacteria and their use ror food preservation / Yo-neyama Hiroshi, Ando Tosure, Katsumata Ryoichi // Tohoky J. Agr. Res-2004.- 55, N. 1-2.-P. 51-55.

17. Антимикробная активность бактериоцинов класса П-а / Мицкевич Е.В., Мицкевич И.П., Ерусланов Б.В., Светоч Э.А.//3 Моск. Межд. Конгр. «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 14-18 марта, 2005: Мат. Конгр. 4.1.-М., 2005. -с.120.

18. Галкина Г.В., Илларионова В.И., Короткая Н.Г. Разработка технологии получения молочной кислоты из молочной сыворотки // Инф.сб. АгроНИИТЭИПП. Пищевая промышленность.-1992.-вып.5.-с.26-31.

19. Галкина Г.В.Дудряшов В.Л.,Устинников В.А. Унифицированная технологическая схема экологически чистого производства пищевых кислот и подкислителей // Инф.сб. АгроНИИТЭИПП. Пищевая промышленность.-1993.-вып.б.-с. 15-17.

20. Галкина Г.В., Илларионова В.И., Горбатова Е.В. Возможность получения пищевых кислот из отходов крахмального сырья// Инф.сб. АгроНИИТЭИПП. Пищевая промышленность.-1993 .-вып.2.-с. 18-20.

21. Евлеева В.В., Саенко А.Н., Гаджиев З.А. Пищевая молочная кислота// Пищевая промышленность. 1994. -№11.-с.29.

22. Евлеева В.В., Саенко А.Н., Кремнева Н.П. Получение молочной кислоты Пищевая молочная кислота// Пищевая промышленность. 1994. -№10.-с. 38-39.

23. Евлеева В.В., Саенко А.Н., Кремнева Н.П. Получение подкислителей из нестандартного и дефектного плодово-ягодного сырья // Инф.сб. АгроНИИТЭИПП. Пищевая промышленность.-1992.-вып.5 .-с.21 -25.

24. Синеокий С.П. Перспективы биотехнологического производства молочной кислоты. Материалы докладов II Московского Международного конгресса. «Биотехнология: Состояние и перспективы развития» г. Москва, 10-14 ноября 2003г., с.260.

25. Lipinsky Е.С., Sinclair R.G. Is lactic acid a commodity chemical? // Chem. Eng. Progr. 1986. - V. 82, N 8.- P. 26-32.

26. Pasteur L. Report on lactic fermentation // Microbial metabolism. Benchmark papers in Microbiology / Ed. H.W. Doelle Stroudsburg, Pensylvania, 1974. - P.53-55.

27. Смирнов B.A. Пищевые кислоты. M.: Легкая и пищевая промышленность, 1983. -264с.

28. Квасников Е.И., Нестеренко О.А. Молочнокислые бактерии и пути их использования. -М.: Наука, 1975.-389с.

29. Шлегель Г. Общая микробиология: Пер. с нем. М.: Мир, 1987.-567с.

30. Major N.C., Bull А.Т. The physiology of lactate produc- tion by Lactobacillus delbrueckii in a chemostat with cell recycle // Biotechnol. Bioeng.- 1989.- V. 34.-P.592-599.

31. Thomas T.D., Ellwood D.C., Longyear V.M.C. Change from homo- to hetero-lactic fermentation by Streptococcus lactis resulting from glucose limitation in anaerobic chemostat culture/J. Bacteriol.- 1979.- V.138.-P.109-117.

32. Шамцян М.М., Яковлев В.И., Мизоками К., Ямамото Т., Африкян Э.Г. Микробиологическое получение молочной кислоты из крахмалистого сырья // Биолог. Журнал Армении.-1994-Т.47, №1.-с.З-8.

33. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды: Пер. с англ. М.: Мир, 1997-441с.

34. Arnold M. Acidulans for food and beverages.-London: Food trade press, 1975.- 232p.

35. Цирульников JÏ.C. Эффективность производства пищевых кислот// Обзор инф. АгроНИИТЭИПП.-1987-вып. 5 .-24с.

36. Kitchell I.P., Wise D.L. Poly (lactic/glycolic acid) biodégradable drug-polymer matrix sistems //Meth. Enzimol. -1985. V.112, N 1.- P.436-448.

37. Porous biodégradable microspheres for parenterale administration / P.P. Deluca, A.J. Hickey, A.M. Hazrati // Top. Pharm. Sci., Proc. 47 th Int. Congr., Amsterdam 31 Aug. 4 Sept., 1987. - Amsterdam, 1987. - P.429-442.

38. Складнева Г.Н. Современное состояние и перспективы развития биотехнологии в США // Микробиологическое производство за рубежом. Экспресс информ. ВНИИСЭНТИ.-2001.-вып.6.-с.5.

39. Складнева Г.Н.Биотехнология для сельского хозяйства. // Микробиологическое производство за рубежом. Экспресс информ. ВНИИСЭНТИ.-2000.-вып.15.-с.5-6.

40. Смирнова Г.В. Исследования по биологическому разложению пластмассовых отходов // Микробиологические производства за рубежом. Экспресс информ. ВНИИСЭНТИ.-2004.-Вып. 18.-е. 17.

41. Определитель бактерий Берджи. Пер. с анг. под ред. Г.А.Заварзина М.: Мир, 1997.-т. 1., 429 с.

42. Колеснов А.Ю., Володина Е.М., Альперович Е.Д. Ферментативный анализ изомеров молочной кислоты в молочных продуктах и сырье // Пищевая промышлен-ность-1997.-№3.-с.32-34.

43. Studies of the fermentation of lactic acid in pilot scale / Z.-P. Yang, Y.-R. Cheng, D.B. Yuan et al. // ICCC -VII, Beijing, Oct. 12-16, 1992.- Beijing, 1993.- P.103.

44. Никулина И. Д., Голубкина Р. Н., Бондаренко JI.H., Смирнов В.А. Интенсификация процесса молочнокислого брожения // Микробиологическая промышленность. -1979 -№5.- с. 18-21.

45. Никулина И.Д. Повышение эффективности молочнокислого брожения и очистка молочной кислоты: Автореф. дис. канд. тех. наук. М., 1980.-30с.

46. Патент 1243354 Россия, МКИ6С 12Р 7/56, С 12 R 1/125 Способ получения молочной кислоты/ Никулина И.Д., Евлеева В.В., Берестной Ю.Д., Маштакова ЛНИ-ИПП (Россия) № 3812495/13, опубл. 09.06.95.

47. Голубчина Л.И., Никулина И.Д., Кременева Н.П. и др. Селекция высокопродуктивных штаммов молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii // Прикладная биохимия и микробиология.-1984.-т.20,№4.-с.518-522.

48. Штамм молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii продуцент молочной кислоты. Пат. 2283345 Россия, МПК7С 12N 1/20, С 12Р 7/56, Бочкова А.П., Евлева В.В. N 2004129918/13. Заявл. 14.10.2004. Опубл. 10.09.2006.

49. Major N.C., Bull А.Т. Lactic acid productivity of continuous culture of Lactobacillus delbrueckii // Biotechnol. Lett. 1985.- V.7, N 6.- P.401-405.

50. Fridman M.R., Gaden E.L. Growth and acid production by Lactobacillus delbrueckii in dialysis culture system // Biotechnol. Bioeng. 1970.- V. 12.- P.961-979.

51. Ragout A., Sineriz F. Influence of dilution rate on the morphology and technological properties of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus // Appl. Microbiol. Biotechnol. -1994. -V.41.-P.461-464.

52. Pat. 159 303 Polska, Int. CI. C12P 7/56. Sposob wytwar zania kwasu mleko wego. / M. Brzozowska, 0. Ilnika-Olejniczak, B. Ciecierska et al. Publ. 31.12.1992

53. Childs C.G., Welsby B. Continuous lactic fermentation //Process Biochem. 2006.-N 1.-P. 441-444.

54. Hastings J. Development of the fermentation industries in Great Britain //Advan. Appl. Microbiol. 1971.- V.14.-. P. 1-45.

55. Stenroos S.L., Linko Y.Y., Linko P. Production of L-lactic acid with immobilized1.ctobacillus delbrueckii // Biotechnol. left.- 1982,- V.4, N 3.- P.159-164.

56. Насруллаева P.3., Калунянц K.A., Садова А.И. Интенсификация способа получения молочной кислоты с использованием ковалентно иммобилизованных клеток: Моск. технол. ин-т ПП.-М., 1987. -5с.- деп. В АгроНИИТЭИПП 12.01.88, № 1721.

57. Насруллаева Р.З., Калунянц К.А., Садова А.И. Современные микробиологические способы получения лимонной и молочной кислот// Обз. Инф. АгроНИИТЭИПП.-1987.-№3.-24с.

58. Lalitagauri R., Gouri М., Mejumdar S.K. Production oflactic acid from potato fermentation //Ind. J. Exp. Bi-Ol. 1991. - V.29. - P.681-685.

59. Залашко M.B. Биотехнология переработки молочной сыворотки. М.: ВО Агро-промиздат, 1990.- 192 с.

60. Buyukgungor Н., Buschelberger G.G. Vergurung von Milchsaure durch freie und immobilisierte Zellen von Lactobacillus bulgarikus //Biotechnol. Forum. 1986.- N 3.-P.81-85

61. Pat. 4467034 Us, Int .CI C12P 7/56. Process for theproduction of D-lactic acid with the use of Lactobacillus DSM 2129/ H. Woelskow, D. Sukatsch (Germany). Publ. 21.08.1984.

62. Исследование процессов ферментации отходов переработки сельхозсырья с помощью кислотообразующих бактерий для получения молочной кислоты и ее производных: Автореф. дисс. / Волкова Г.С.- ГНУ ВНИИПБТ РАСХН, Москва, 2002-21с.

63. Basic characteristics, ecology and application of lactobacillus plantarum. A review /М. Vescovo, S. Torriani, F. Dollagio, V. Bottazzi // Ann. Microbiol ed Enzi-mol.-1993.-V.43, № 2.- P.261-284.

64. Tseng C.P., Montville T.J. Metabolic regulation of end product distributionin lactobacilli; couses and consequences // Biotechnol. Progr.- 1993.- V.9, N 2.- P.113-121.

65. A kinetic method for calculating the viability of lactic starter culturs /J.S. Almeida, M.T.O. Barreto, E.P. Melo, M.J.T. Carrondo //J. Ind. Microbiol.-1993.-12, N 3-5.-P.348.

66. Пробиотические свойства бактериоциногенного шт. Lactobacillus plantarum Г-3/3(13) / Д1мова M.I. //Микробюл. Журнал 2006. 68, № 4, с.47-54.

67. Gatye G., Gottschalk G. Limitation of growth and lactic acid production in butch and continuous culture of lactobacillus helveticus //Appl. Microbiol. Biotechnol. -1991.-V.34.- P .446-449.

68. Gatye G., Muller V., Gottschalk G. Lactic acid excretion via carrier —mediated facilitated diffusion in Lactobacillus helveticus //Ibid.- P.778-782.

69. Roy D., Goulet J., LeDuy A. Continuous production of lactic acid from whey permeate by free and calcium algi-nate entrapped Lactobacillus helveticus // J. Dairy Sci.-1987.-V.70, N 3.- P.506-513.

70. Timmer J.M.K., Kromkamp J. Efficiency of lactic acid production by Lactobacillus helveticus in membrane cell recycle reactor // Ferns Microbiol. Rev.-1994.- V.14, N 1,-P.29-38.

71. Production of lactic acid from sorghum juice (Sorghum bicolor) / Shindo S., Naka-mura T., Kiuchi K. // J. Jap. Soc. Food Sci. and Technol,- 1990.- V.37, N 2.- P.98-103.

72. Effect of age, amount of inoculum and inoculation from glucose by Lactobacillus ca-sei subsp. rhamnosus /L. Mar-tincovic, F. Machek, E. Ujcova et al. // Folia Microbiol. (CSSR). -1991.- V.36, N 3.- P.246-248.

73. Batch production of L-(+) lactis acid production from whey by Lactobacillus casei (NRRL B-441). Biyikkileci A.O., Tokatli F., Harsa S. / J. Chem. Technol. and Biotechnol. 2004.- 79, N. 9.-P. 1036-1044.

74. Kinetic modeling of lactis acid production from whey by Lactobacillus casei (NRRL B-441). /Altiok D., Tokatli F., Harsa S. // J. Chem. Technol. and Biotechnol. 2006. - 81, N. 7.-P. 1190-1197.

75. L (+)-lactic acid production using Lactobacillus casei in solid-state fermentation. / Ro-jan Pappy John, Nampoothiri Kesavan Madhavan// Biotechnol. Lett 2005. - 27, N. 21.-P.1685-1688.

76. Enhancement of lactic acid production with ram harn peptone by Lactobacillus casei. / KurbanoglyEsabil Basaran // World J. Microbiol.and Biotechnol. 2004. - 20, N. 1.-P.3742.

77. Brodelius P., Vandamme E.J. Immobilized cell sistems //Biotechnology, V.7a (Enzime technology)/ Vol. ed. J.F.Kennedy.-1987.- VCH.- P.405-464.

78. Krischke W., Schroder M., Trosch W. Continuous production of L-lactic acid from whey permeate by immobilized Lactobacillus casei subsp. casei // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1991. - V.34. - P.573-578.

79. Kulozik U., Kessler H.G. Kontinuierliche fermentative Milchsaur eproduktion im Rohreaktor // Ptsch. Milchmirt.-1991. V.42, N 47. - P. 1567-1571.

80. Lactic acid production from whey permeate by immobilized Lactobacillus casei /А. Tuli, R.P. Sethi, P.K. Khanna, S.S. Marwaha // Enzyme Microbiol. Technol.- 1985.- N 7.-P.164-168.

81. Ohleyer Е., Blanch Н. W., Wilke C.R. Continuous production of lactic acid in a recycle reactor //Appl. Biochem. Biotech. 1985. - V.ll, N 4,- P.317-332.

82. Ohleyer E., Wilke C.R., Blanch H.W. Contiuous production of lactic acid from glucose and lactose in a cell- recyce reactor // Ibid. 1985,- V.ll, N 6.- P.457-463.

83. The application of cell recycle to continuous fermentative lactic acid production / T.B. Vick Roy, D.K. Mandel, D.K. Dea et al. // Biotechnol. lett.- 1983.- V.5, N 10.-P.665-670.

84. Vonktaveesuk P., Tonokawa M., Ishizaki A. Stimulation of the rate of L-lactate fermentation using Lactobacillus lactis 10-1 by periodic electrodialysis // J. Ferment.and Bioeng. 1994.- V.77, № 5.- P.508-512.

85. Каданцева H.C., Прокофьева H.B., Марквичев H.C. и др. Культивирование молочнокислых бактерий в мембранном биореакторе // Тез. докл. Всес. конф. «Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов», 12-14 дек. 1989. -Пущино, 1989. с. 2.

86. Карпов A.M., Ракитин В.Ю., Каданцева Н.С. и др. Культивирование молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus в мембранном биореакторе. //Биотехнология.-1991.-№3.-с.30-33.

87. Каданцева Н.С., Марквичев Н.С., М.Н.Манаков и др. Непрерывное получение молочной кислоты в мембранном биореакторе // Биотехнология. -1991.-№:6-с. 5759.

88. Карпов A.M., Каданцева Н.С., Ракитин В.Ю., и др. Оптимизация процесса культивирования бактерий Lactobacillus acidophilus в мембранном биореакторе// Биотехнология. -1991.-№2-с. 41-43.

89. Aeshliman A., Stockar U. von. The effect of yeast extract supplementation on the production of lactic acid from whey permeate by Lactobacillus helveticus //Appl. Microbiol. Biotechnol.-1990.-V.32.- P.398-402.

90. Bhovnik Т.К., Steele J.L. Cloning of D (-) lactate dehyd-rogenase gene from Lactobacillus helveticus //J. Dairy Sci.-1991.-V. 74, N 1,- P. 122.

91. Mehaia M.A., Cheryan M. Immobilization of Lactobacillus bulgaricus in a hol-low fiber bioreactor for production of lactic acid from acid whey permeate //

92. Appl. Biochem. Biotechnol. 1987.- V.14.- P.21-27.

93. Lee D.A., Collins E.B. Influences of temperature ongrowth of Streptococcus cremo-ris and Streptococcus lactis. // J. Dairy Sei.- 1976. V.59. - P.405-409.

94. Yergensen M-H., Nicolaysen K. Mathematic model for lactic acid fermentation with Streptococcus cremoris from glucose //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1987.- V. 25.-P.313-316.

95. Ishizaki A., Ohta T. Batch culture kinetics of L-lactate fermentation employing Streptococcus sp. IO-l //J. Ferment, and Bioeng. 1989.- V.67, N 1.- P.46-51.

96. Ishizaki A., Ohta Т., Kobayashi G. Batch culture growth model for lactate fermentation// Ibid.- 1989.-V.68, N 2.-P.123-130.

97. L-lactate production from xylose employing Lactococcus lactis 10-1. / A. Ishizaki, U. Toraoko, T. Kenje, P.F.Stanburg//Biotechnol.Lett.- 1992.- V.14, N 7.- P.599-604.

98. Yamamoto K., Ishizaki A., Stanburg P.P. Reduction in the length of the lag phase of L-lactate fermentation by the use of inocula from electrodiaysis seed cultures // J. Ferment. and Bioeng.- 1993.- V.76, N 2.- P. 151-152.

99. Vonktaveesuk P., Tonakawa M., Ishizaki A. Stimulation of the rate of L-lactate fermentation using Lactobacillus lactis 10-1 by periodic electrodialis // J.Ferment, and Bioeng.- 1994.- V.77, N 5.- P.508-512.

100. Yamamoto T. Specificities and Action Patterns of Amylolytic Enzymes // Enzyme Chemistry and Molecular Biology of Amylases /Ed. T. Yamamoto.- Tokyo: CRC Press, 1994.-P.7-45.

101. Rogers P.L., Bramall L., Mcdonald I .J. Kinetic analysis of batch and continuous culture of Streptococcus cremoris HP // Can. J. Microbiol.- 1978,- V.24.- P.372-380.

102. Yergensen M-H., Nicolaysen K. Mathematic model for lactic acid fermentation with Streptococcus cremoris from glucose // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1987.- V. 25.-P.313-316.

103. Continous culture of Streptococcus cremoris on lactose using various medium compositions / B. Bibal, C. Kapp, C. Goma, A. Paroilleus // Appl. Microbiol. Biotechnol.-1989.- V. 32.-P.155-159.

104. Control of cell and lactate concentration in a hollow-fiber bioreactor for lactic acid fermentation/E. Wang, H. Hatanaka, S. Iejima et al. //J. Chem. Eng. Japan.- 1988.- V.21, N 1.- P.36-40.

105. Aurangzeb M., Qadeer M.A., Igbal J. Production of raw starch hydrolyzing amylolytic enzymes by Streptococcus bovis PCSIR-7B // Pacistan J. Sei. and Ind. Res.-1992.-V.35, N 12.- P.520-523.

106. Mizokarai K. Streptococcus bovis a-amylase // Handbook of Amylases and Related Enzymes / Ed. The Amylase Recearch Society of Japan.- Tokyo: Pergamon Press, 1988.- P.49-50.

107. Ohara H., Hiyama K. Lactic acid production by membrane reactors // Ann. N.Y. Acad. Sci.-1990.- N 613.- P.832-838.

108. Ohara H., Hiyama K., Yoshida T. Non-competitive product inhibition in lactic acid fermentation from glucose // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1992.-V. 36.-P.773-776.

109. Ohara H., Hiyama K., Yoshida T. Kinetics of growth and lactic acid production in continuous and batch culture // Ibid.- 1992.- V.37,- P.544-548.

110. Ohara H., Hiyama К., Yoshida T. Kinetic study on pH dependence of growth and death of Streptococcus Faecalis // Ibid,- 1992.- V.38.- P.403-407.

111. Ohara H., Hiyama K., Yoshida T. Lactic acid production by a Filter-Bed-Type Reactor // J. Ferment. Bioeng. -1993. V.76, N 1.- P.73-75.

112. Pat. 2 635 334 France, Int. Cl. C12P 7/56. Procédé de production d'acide lactique par fermentation / D. Schneider, H. Lumonerie /France/. Publ. 16.02.1990.

113. Simultaneous saccharification and L(+)-lactis acid fermentation of protease-tread wheat bran using mixed culture of lactobacilli. John Rojan P., Nampoothiri K., Madhavan Pandey Ashok. / Biotechnol. Lett. 2006,- 28, N. 22.-P. 1823-1826.

114. Яковлева Е.П. Совместное культивирование продуцентов биологически активных веществ с другими микроорганизмами // Прикладная биохимия и микро-биология.-1983.-т.19,№3.-с.330-346.

115. Tiwari К.Р., Pandey A., MishraN. Lactic acid production from molasses by mixed population of lactobacilli // Zbl. Bacterid., Parasitenk., Infectionkrankh und Hyg. Abt. 1-1979.- V.134, N 6.- P.544.

116. Рыбальский Н.Г., Лях С.П. Консорциумы микроорганизмов: Библлиографиче-ский справочник ВНИИПИ.-1990.-с.229.

117. Boyaval Р., Согге С, Terre S. Continuous lactic acid fermentation with concentrated product recovery by ultrafiltration and electrodialisis //Biotechnol. Lett.-1987.-V.9, N 3.-P.207-212.

118. Boyaval P., Terre S., Corre С. Prodaction d'acide lactique a partir de permeat de lactosérum par fermentationcontinue en reacteur a membrane // Lait.- 1988.-V.68, N 1 .P. 65-84.

119. Use of sugar care bogasse hemicellulosic hydrolysate for lactic acid production /S.S. Silva, I.M. Mancilha, M.C.P. Vaneth, M.F.S- Barbosa // Biomass Energy and Ind.: 5th Eur. Conf., Lisbon 9-13 Oct., 1989. London, New York, 1990.- P.1005-1009.

120. Процесс получения рацемической молочной кислоты. Пат. 206521 Венгрии, МПК7 С12Р 07/56 HU. Process for producing racemic lactic acid. /Bago I., Szabo A., Fuerdoes L., Szabo S-J., Strokay A., Lengyel T. N 206521В; Заявл. 11.08.2003. Опубл. 05.11.2004

121. Production of L(+)-lactic acid from a mixture of xylose and glucose by co-cultivation of lactic acid bacteria./ Taniguchi M., Tokunaga Т., Horiuchi К., Tanaka T.// Appl. Microbiol. and Biotechnol. 2004. - 66, N. 2.-P.160-165.

122. Harrison d., Wren S. Mixes microbial cultures as a basis for future fermentation processes //Process Biochem. -1976.- V. 11, N 8,- P.30-32.

123. Atta J.A., Khattal A.A., Abou-Donia S.A. The effect of medium composition on the growth and activities of Lactobacillus casei and Streptococcus lactis strains // Egipt. J. Dairy Sci.-1987.-V. 15, N 1.- P.39-50.

124. Выделение аммилотических молочнокислых бактерий и их использование для получения молочной кислоты из кухонных отходов. Wang Xu-ming, Wang Qun-hui, Ren Nan-gi. Huanjingkexue = Environ. Sci. 2006. 27, N. 4,- P.800-804.

125. Production of L(+)-lactic acid from raw cassava starch in a circulating loop bioreac-tor with cells immobilized in loofa (Luffa cylindrica) / Roble Noel D., Ogbonna James C., Tanaka Hideo.// Biotechnol. Lett. 2003. - 25, N. 13.-P. 1093-1098.

126. Lactobacillus concavus sp. nov., isolated from the walls of a distilled spirt fermenting cellar in China./ Tong Huichun, Dong Xiuzhu // Jnt. J. Syst. and Evol. Microbiol. 2005. -55, N.5.-P. 2199-2202.

127. Guo Hua, Zhou Jian-ping, Yang Ying. Hunan nongue daxue xuebao = J. Hunan Agr. Univ. 2006. 32, N1, p. 57-59.

128. Молотов C.B. Разработка генетических методов создания штаммов молочнокислых стрептококков с повышенной В-галактозиазной активностью: Автореф. дис. канд. биол. наук. -М., 1990. 23с.

129. Суходолец В.В. Изучение коллекции штаммов мезофильных и термофильных стрептококков с целью выделения и клонирования генов р-галактозидазы различного происхождения // Сб. реф. НИР и ОКР.-1992-сер. 5.-е. 17.

130. Benateya A., Bracqari P., Linden G. Galactose-fermenting mutants of Streptococcusthermophilus //Can. J. Microbiol .-1991.-V.37, № 2.- P. 136-140.

131. Kinetics of lactic acid fermentation on glucose and corn by Lactobacillus amylophi-lus / P. Mercier, L. Yerushalmi, D. Rouleau, D. Dochain //J. Chem. Technol. and Biotech-nol.- 1992.- V.55,N2.-P.111-121.

132. Isolation and characterization of plazmid DNA in Lactobacillus acidophilus / K. Kanatani, K. Yoshida, T. Tahara et al. // Agr. and Biol. Chem.- 2001.- V.55, N 8.-P.2051-2056.

133. Constraction of a new shuttle wector for Lactobacillus /Р. Chagnaud, K.C.C.K.N. Chan, R. Duran et al. //Can J.Microbiol.- 2002.- V.38, N 1.- P. 69-74.

134. Polzin K.M., Homg J.S., Mckay L.L. Constraction of a lactococcal integration vector using a lactococcal plasmid encoding temperature-sensitive maintenance // J. Dairy Sci.-2005. V.74, N 1. - P.121.

135. Chen B.Z. Studies on lactic acid fermentation of Rhizopus //J. Tsinghua Univ.-1993.-V.33, N 6.- P.91-96.

136. The fermentation of polyols and fatti acids during L-lactic acid fermentation by Rhizopus Arrhizus / M. Rosenberg, L. Kristobikova, B. Proksa, P. Magdolen // Biotech-nol. Lett.- 1992.- V.14, N 1.- P.45-48.

137. Selection of Rhizopus strains for growing on raw cassa-wa / C.Soccol, M.A. Cabrero, S. Roussos, M. Raimbault // 6th Int. Symp. Microb. Ecol. (JSME-6), Barcelona 6-11 Sept. 1992. Abstr. (Barselona).- P.l.

138. Derect fermentation of potato starch wastewater to lactic acid by Rhizopus oryzae and Rhizopus arrhizus/ Huang L.: Ping, Jin Bo, Lant Paul //Bioprocess and Biosyst. Eng. -2004.-27, N4.-p. 229-238.

139. Optimization of L- lactis acid fermentation with immobilized Rhizopus oryzae by polyurethane / Chen Yum, Xia Liming, Cen Peilin // J. Natur. Sci / Nanjing Norm. Univ.-2004-6, N. 2.-P.34-36.

140. Production of optically purre L(+)-lactic acid from various carbohydrates by batch fermentation of Enterococcus faecalis RKY1/ Yun J.-S., Wee Y.-J., Kim D., Run H.-W./ Enzyme and Microbiol. Technol.- 2003.- 33, N. 4.-P. 416-423.

141. Batch and repeated batch production of L(+)-lactic acid by Enterococcus faecalis RKY1 using wood hydrolyzate and corn steep liguor. Wee Y.-J., Yun J.-S., Kim D., Run H.-W. / J. Ind. Microbiol, and Biotechnol.- 2006.- 33, N. 6.-P. 431-435.

142. Dinarieva Т., Netrusov A. Lactic acid fermentation by free and immobilized cells of an obligate methilotroph // Biotechnol. Progr. -1991.- V.7, N 3.- P.234-236.

143. Новикова A.C., Кантере В.И., Челекбаев М.Д. Степень гидролиза крахмала и синтез молочной кислоты дрожжами Endomycopsis fibuliger С-24// Изв. вузов пищ. техн. 1991-№1-3.-с.32-33.

144. Effect of culture conditions on lactic acid production of Tetragenococcus species. Kobayashi Т., Kajiwara M., Wahyuni M., Hamada Sato N., Imada C., Watanabe E./ J. Appl. Microbiol. - 2004. - 96, N. 6. -P.1215-1221.

145. Bodie E. et. al. Propionic acid fermentation of ultra-high-temperature sterilized whey using mono and mixed-cultures// Appl. Microbiol. Biotechnol. 1987.- vol. 25.№5.-P.434-437.

146. Emde R., Schink B. Oxidation of glycerol, lactate and propionate by Propionbacte-rium freudernreichii in poised-potential amperometric culture system// Arch. Microbiol.1990.vol.153, №5.-P.506-512.

147. Emde R., Schink B. Enhanced propionate formation by Propionbacterium freudernreichii in a three-electrode culture system// Appl. Environm. Microbiol. 1990.vol.56, N9. -P. 2771-2776.

148. Babuchowski A., Hammond E.G. Production of propionic acid by Propionbacterium spp. Grown on various carbohydrate sources// Abstr. Ann. Meet. Soc. Microbiol.-1987. P.265.

149. Lewis Y.P., Yang S.T. A novel extractive process for propionic acid production from whey lactose. //Biotechnol. Progr. 1992. - V. 8, N 4-P. 104-110.

150. Tyree R.W., Clausen E., Gaddy J.L. Production of propionic acid from sugars by fermentation through lactis acid as an intermediate// J. Chem. Technol. and Biotechnol.1991.-V. 50. N2.-P. 157-166.

151. Proc. 1-st Int., Symp. «Dairy propionibacteria», may 17-19, 1995, Rennes, France

152. Пробиотический потенциал штаммов Lactobacillus plantarum и Lactobacillus fermentum. Potencial probiotico de linajes de Lactobacillus plantarum у Lactobacillusfermentum. / Pereira C.A.C., Valadao R.C.// Alimentaria.-41, N352, p.53-59.

153. Научно-экспериментальное обоснование новых биотехнологий антибиотических молочных продуктов. Автореф. дисс. Артюхова С.И. Улан-Уде: Вост.-Сиб. гос. технол. ун-т. 2006, 44с.

154. Штамм Enterococcus faecium L-3 для изготовления продуктов лечебно-профилактического назначения. Пат. 2220199 Россия, МПК7, С 12N 1/20, А23С 9/12./ Алехина Г.Г., Суворов А.Н.; N 2002118758/13. Заявл. 03.07.2002. Опубл. 27.12.2003.

155. Лантобиотик: Пат. 2279481 Россия, МПК7 С 12Р21/00, С 12N 15/31, Блис Тех-нолоджес Лимитед, Тегг Джон Роберт, Дирксен Карен Патрисия, Антон Метью. N 2002112327/13. Заявл. 12.10.2000. Опубл. 10.07.2006.

156. Консорциум микроорганизмов пробиотического действия: Пат. 2273662 Россия, МПК7С 12N1/20, А 23С 9/12, Рожков A.B., Шестаков А.И. N 2004118804/13. Заявл. 22.06.2004. Опубл. 10.04.2006.

157. Бактериоцины молочнокислых бактерий. Бактерпццини молочнокислих бак-терш. ДiмoвaM.I. Коваленко Н.К., Наук. Bích. Ужгор. Ун-ту. Сер. Бюл. 2006, №18, с. 109-113.

158. Introduction to pre and probiotics / Holzapfel Wilhelm H., Schillingtr Urlrch // Food Rec. Jnt.-2002.-35, N 2-3.- P. 109-116.

159. Stady on probiotic lactic acid bacteria and their applications to new functional foods

160. Saido Tadao, Kitazawa Haruki, Kawai Yasushi // Tohoky J. Agr. Rec. -2004.-55, N 1-2.-P.57-65.

161. Probiotic properties of human lactobacilli strains to be used in the gastrointestinal tract. / Fernandez M.F., Boris S., Barbes C. // J. Appl. Microbiol. 2003. - 94, N. 3.-P. 449455.

162. Probiotic composition containing Lactobacillus casei ATCC PTL-3945: Пат. 6797266 США, МПК7 A01 N 63/00, С 12N 1/00 /Naidu A. Satyanarayan : Probiohealth -N10/ 021871. Заявл. 17.12.2001. Опубл. 28.09.2004.

163. Jndintification and characterization of enterococci from bryndza cheese/ Jurkovic D., Krizkova L. // Lett Appl. Microbiol. -2006.-V.42, N 6.- P.553-559.

164. Антагонистические штаммы лактобацилл. Червинец Ю.В., Бондаренко В.М., Сфмоукина A.M. Материалы 3 Съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, Москва 25-27 окт., 2005. М. 2005, с.91-92.

165. Исследование ауто- изо- и гомо- антогонизма пробиотических штаммов лактобацилл. Глушакова Н.А., Вербицкая Н.Б., Блинов А.И., Шендеров Б.А. Бюл. Вост. -Сиб. научн. Центра СЩ РАМН. 2005., N 6.- с.138-148.

166. Пробиотик. Пат. 2284354 Россия, МПК7С 12N 1/20, А61К 35/74. Тартуск. Ун-т, Микелсаар М., Зилмер М., Куллисаар Т., Аннук Х.,Соргисепт Е. N 003137810/ Заявл. 21.06.2002. Опубл. 27.09.2006.

167. Способ приготовления пробиотика. Пат. 2280465 Россия, МПК7С 12N 1/20, А61К 35/74., А 23С 9/12. Соловьева И.В., Соколова К .Я., Ефимов Е.И., Белова И.В. N 20041310097/13. Заявл. 25.10.2004. Опубл. 27.07.2006.

168. Разработка комплексного пробиотического препарата на основе лактобактерий: Автореф. дисс./ Фадеева И.В.-Пермь: ин-т экол. и генет. микроорганизмов УрО РАН, 2004-21 с.

169. Production of antimicrobial substances by bacteria isolated from fermented table olives. Rubia-Soria Ana, Abrionel Hikmate, Lucas Rosario. World J. Microbiol.and Biotech-nol. 2006.- 22, N. 7.-P. 765-768.

170. Совершенствование биотехнологического производства и методов контроля качества пробиотиков на основе бифидобактерий и лактобацилл: Автореф. дис./ Младзиевская Ю.А.- СПб: С. Петербург, гос. хим.-фарм. акад.,2005-23с.

171. Casein-derived antimicrobial peptides generated by Lactobacillus acidophilus DPS 6026/ Hayes M., Ross R.P., Fitzgerald G.F., Hill C., Station C. // Appl. and Environ. Microbiol. 2006.-V.72, N 3.- P.2260-2264.

172. Manufacturing of fermented goad mulk with a mixed starter culture of Bifidobacterium animalis and Lactobacillus acidophilus in a controlled bioreactor / Kongo J.M., Malcata F.X. // Lett. Appl. Microbiol. 2006. -V.42, N 6. - P.595-599.

173. Wessels S., Jelle В., Nes Ingolf F. Bacteriocins of the Lactic Acid Bacteria:

174. An Overlooked Benefit for Food. Denmark: DanishToxicology Centre, -1999.- 85 p.

175. Klaenhammer T. R. // FEMS Microbiol. Rev.- 1993.- 12- p. 39-85.

176. Nes I.F., Dzung Bao Diep, Havarstein L.S., et al. // J. Gen. & Molec. Mikrobiol. -1996.-70-p. 17-32.

177. Бактериоцины: критерии, классификация, свойства, методы выявления / Блинникова Л.П. //Микробиология, эпидемиология и иммунобиология.-2003-№3.с.109-113.

178. Медикобиологические требования к пробиотическим продуктам и биологически активным добавкам к пище / Шевелева С.А. // Инф. болезни- 2004.-2, №3-с.86-90.

179. Gobetti М., Fox P.F., Stepaniak L. Isolation and characterization of a tributyrin esterase from Lactobacillus plantarum 2739. // Arch Oral Biol. 2006 Sep, 51(1)- p.784-786. Deportment of Food Chemistry, University Colledge Cork, Ireland

180. Mortivedt-Abildgaa C.I., Nissen-Meyer J., Jelle В., Grenov В., Skaugen M., Nes I.F. Production and pH-Dependent Bactericidal Activity of Lactionin S, a Lantibiotic from Lactobacillus sace L45. //Arch Oral Biol. 2005 Sep, 55(2) p. 386-388.

181. Barefoot S.F., Klaenhammer T.R. Purification and characterization of the Lactobacillus acidophilus bacteriocin lactocin B. //Arch Oral Biol. 2006 Sep, 51(9) p.1084-1093.

182. Barefoot S.F., Klaenhammer T.R. Detection and activity of lactacin B, a bacteriocin produced Lactobacillus acidophilus. //Arch Oral Biol. 2006 Sep, 54(2) -p.482-485.

183. Wolf C.E., Gibbons W.R. Improved method for quantification of the bacteriocin nisin. // Arch Oral Biol. 2005 Sep, 51(3)- p.693-695. Biology-Microbiology Department, South Dacota State University, Brookings 57007, USA

184. Bogovic-Matijasic B., Rogelj I., Nes I.F., Holo H. Isolation and chacterization of two bacteriocins of Lactobacillus acidophilus LF 221. // J. Appl. Bacteriol. 2004.- 96(5).-1082-1089. Biotechnical Faculty, Zotechnical Department, Domzale, Slovenia.

185. Barefoot S.F., Klaenhammer T.R. Purification and characterization of the Lactobacillus acidophilus bacteriocin lactacin B. //Arch Oral Biol. 2004 Sep, 51(9) p.888-893.

186. Tobiassen R.O., Sorhaug T., Stepaniak L. Characterization of an intracellular oli-gopeptidase from Lactobacillus paracasei. //Arch Oral Biol. 2006 Sep, 51(9)- p.784-793. Deportment of Food Science, Agricultural University of Norway, As, Norway

187. Park S.H., Iton K., Kikuchi E., Niwa H., Fujisawa T. ^identification and characteristics of nisin Z-producing Lactococcus lactis subsp. lactis isolated from Kimchi. //Arch

188. Oral Biol. 2004 Sep, 51(9) p.654-656. Laboratory of Veterinary Public Health, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokiy, Japan

189. Chumchalova J., Stiles J., Josephsen J., Plockova M. Chacterization and purification of acidocin CH5, a bacteriocin of produced Lactobacillus acidophilus CH5. // J.Appl.Bacteriol. 2006 May.- 72(5).-3383-3389.

190. Zendo Т., Koga S., Shigeri Y., Nacayama J., Sonomoto K. Lactococcin Q, a novel two-peptide bacteriocin produced by Lactococcus lactis QU 4. // Int. J. Food Microbiol. 2005. Dec 15; 105(3): 389-398.

191. Ghrairi Т., Frere J., Berjeaud J.M., Manai M. Lactococcin MMT 24, a novel two-peptide bacteriocin produced by Lactococcus lactis isolated from rigouta cheese // Letters in Appl. Microbiol. 1998.-26.- p. 297-304.

192. Yildirim Z., Johnson M.G. Detection and characterization of a bacteriocin produced by Lactococcus lactis subsp. cremoris R isolated from radish. // J. Nutr. Sci Vitaminol (Tokyo) 2005 Jun 51(3) p.187-193.

193. Miyari N., Sakai H., Konomi Т., Imanaka H. Enterocin, a new antibiotic taxonomy, isolation and characterization. // J. Fntibiot (Tokyo) 1976 Mar; 29(3) -p. 227-235.

194. Delves-Broughton, J.// J. Soc. Dairy Technol- 1990.-v.43, № 3.- p.73-77.

195. Delves-Broughton, J. and M. Fiis. Nisin preparation Production, Specification and assay procedure. In: The use of nisin in cheesemaking. Bulletin of the International Dari Federation (IDE) - 1998.- №. 329.- p. 18-19.

196. Выделение и идентификация новых низинообразующих штаммов Lactococcus Iactis subsp. lactis из молока. Л.Г., Е.Д. Сультимова, С.Г. Ботина, А.И.Нетрусов// Прикладная биохимия и микробиология, 2006, т.42, №5.-с.505-568.

197. Баранова И.П., Егоров Н.С., Стоянова Л.Г. // Антибиотики и химиотерапия, -1997.-т. 42, № 3.-с. 37-44.

198. Hurst A.// Adv. Appl. Microbiol.-1981.- v.27- p.85-125.

199. Engelke. G.ll Appl. Environ. Microbiol. -1992. 11.- p. 3730-3743.

200. Синтезирующие низин штаммы Lactococcus lactis, выделенные из женского молока. Nisin-producing Lactococcus lactis strains isolated from Humman milk / Beasly Shea S., Saris Per E.J. //Appl. and Environ Microbiol. -2004.-V.70, N 8.- P.5051-5053.

201. Henning S., Metz R., Hammens W.P./Ant.J.Food Microbiol., -1986.- 3 (3).- p.121-134.

202. Wincovski K., Ludescher R., Montville T. // IFT Ann Meeting '95: Book of Ab-stracts.-1995.- 81, D-4.

203. Russell A.D. The destruction of bacterial spores. In: Hugo WB: Inhibition and destruction of the microbial cell. Academic Press, London New York. - 1971.- S 555-556.

204. Stevens K.A., Sheldon B.W., Klapes N.A., Klaenhammer T.R. // J.Food Protect.,-1992,- 55.-p. 763-766.

205. Calderon C., Collins-Tompson D.L., Usborne W.K. // J. Food Protection. -1985. -48, -p. 330-333.

206. Kozak W., Dobrganski W.T./7 Acta microbiol. polonica. 1977. -26,- p. 361-368.

207. Баранова И.П., Егоров H.C., и др.// Антибиотики, -1980.- №10,с. 755.

208. Липинска Е., Ростен Е., и др. Международный конгресс по молочному делу. -М.: Пищепромиздат, 1971.- 272 с.

209. Липинска Е., Гудков А., и др. Применение низина в сыроделии.- М.: Пищевая пром-ть, 1972, с. 96.

210. Красникова JI.B., Воронина Л.Н., Силёва М.Н. Влияние растительных экстрактов на биосинтез низина культурой Str. lactis // Известия вузов. Пищевая технология, -1982, -2, с. 24-27.

211. Кудряшов В.Л., Сергеева И.Д., Стоянова Л.Г. и др. // Биотехнология,-199 5.12.- с. 25-28.

212. Регуляция синтеза бактериоцина рекомбинантного штамма Lactococcus lactis subsp. lactis F-l 16 компонентным составом среды. Стоянова Л.Г., Левина H.A. Микробиология. 2006. 75, N 3. С. 171-175.

213. Штамм бактерий Lactococcus lactis subsp. lactis ВКПМ- 8558, используемый в производстве молочной продукции, и способ получения стартерной культуры. Пат. 2295563 Россия, МПК7С 12N 1/20, АС 23С9, Галина В.И., Рожкова Е.В.

214. N 2005125605/13. Заявл. 12.08.2005. Опубл. 20.03.2007.

215. Бирюков В.В., Щеблыкин И.Н., Шушеначева Е.В., Стехновская Л.Д., Минаева Л.П., Биггеева М.Б. Совершенствование технологии получения пищевого консерванта низина: Тез. докл. III международной научно-технической конференции

216. Пища, экология, человек» -М.: МГУПБ, 1995.-c.105.

217. Минаева Л.П., Бирюков В.В., Щеблыкин И.Н., Биггеева М.Б., Шушеначева Е.В., Стехновская Л.Д. Штамм бактерий Streptococcus lactis-продуцент низина/Патент России № 2115724, БИ №20, 1998.

218. Биттеева М.Б., Бирюков В.В., Щеблыкин И.Н., Шушеначева Е.В., Осипова В.Г., Минаева Л.П., Штамм бактерий Lactococcus lactis-продуцент бактериоцина низина./Патент России № 2151796, БИ №18, 2000.

219. Минаева Л.П., Бирюков В.В., Биттеева М.Б., Щеблыкин И.Н., Шушеначева Е.В., Стехновская Л.Д., Архипов М.Ю. Пищевой полипептидный консервант низин: Тез. докл.П Международного симпозиума молодых ученых, аспирантов и студентов

220. Техника и технология экологически чистых производств» -М.: ЮНЕСКО,-1998-с.З.

221. Храмцов А.Г. Переработка и использование молочной сыворотки: Технологическая тетрадь. М., Росагропромиздат, 1982г.-189с.

222. Храмцов А.Г. Молочный сахар. -М.: Агропромиздат, 1987г.-224с

223. Hurst A., Hoover D. Nisin. In: Davidson M., Branen A.: Antimicrobials in Food. Dekker: New York.- 1993.- S. 369-394.

224. Chinachoti N., Zaima Т., Matsisaki H., Sonomoto K., Ishizaki A. Nisin Z Production by Lactoococcus lactis 10-1 Using Xilose as a Carbon Sourse. // Bioscl., Biotechnol. and Biochem.- 1998.-62, 15-p. 1022-1024.

225. Chinachoti, N., Endo, N., Sonomoto, K. and Ishizaki A. // J. Fac.Agr. Kyushi. Univ.-1997. -V.43 N 3-4,- P. 421-436.

226. Chinachoti N., Zaima Т., Matsisaki H., Sonomoto K., Ishizaki A. // J. Fac.Agr., Kyushi. Univ.- 1997.-V.43 N 3-4,- P. 437-448.

227. Попов А.Ю., Исакова Д.М. Бисинтез низина при периодическом культивировании Streptococcus lactis.// Биотехнология, 1989,- №5, с. 585-587.

228. Исакова Д.М., Литвинова М.Н., Буленков Г.И. Отчет о НИР: Разработать и внедрить усовершенствованную опытно-промышленную технологию производства ни-роса. //ВНИИбиотехнология.-М.-1989.- 29 с. 150.

229. Минаева Л.П. Интенсификация технологии пищевого полипептидного консерванта низина. Автореф. дис. канд. тех. наук.-М., 2000.-140с.

230. De Vuyst L., Vandamme E.J.// In: Bacteriocins of Lactis AcidBacteria, ed. by L.de Vuyst, and E.J. Vandamme, Blackie Academic and Professional, Glasgow,- 1994.-p. 151221.

231. Красникова Л.В., Васильев Н.Ф., и др. Условия биосинтеза низина молочнокислыми стрептококками при непрерывном культивировании// Известия вузов. Пищевая технология, 1979, -№5, с.35-37.

232. Chinachoti N., Sonomoto К., Ishizaki А. // J.Fac.Agr., Kyushu Univ.- 1997.-v.42., N 1-2.-p. 151-169.

233. Production of nisin with continuous adsorption to Amberlite XAD-4 resin using Lac-tococcus lactis №8 and Lactococcus lactis LAC48./ Tolonen M., Saris P.E.J., Siika-aho M. // Appl. Microbiol, and Biotechnol.- 2004.- 63, N. 6.-P. 659-665.

234. Cultivation of Lactococcus lactis in a polyelectrolyte-neutral polymer aqueous two phase system. Dissing Ulla, Mattiasson Bo. // Biotechnol. Lett. 1994. - 16, N 4. - p. 345348.

235. Evaluatuon of culture medium for nisin production in a repeated-batch biofilm reactor. /Pongtharangkul Thunyarat, Demirci Ali // Biotechnol. Progr.-2006.-v.22, Nl.-p. 217224.

236. Jmpovement of nisin production in pH feed-back controlled, fed-batch culture by Lactococcus lactis subsp. lactis. / Lu Wenhua, Cong Wei, Cai Zholing // Biotechnol. Lett. -2004.-26, N. 22.1. P. 1713-1716.

237. Oberman J., Jakubowska L. // Acta milcrobiol. polonica. -1976. -25, p. 78-82.

238. Oberman J., Jakubowska L., Kipinska E.// Acta microbiol.Polonica. -1974. 23,-p. 3-9.

239. Красникова Л.В. Получение и применение регуляторов роста. МедВУЗ. Сборник науч. трудов ЛТИ, Л.: 1992, с.90-94.

240. Минаева Л.П., Архипов М.Ю., Чередникова Е.В., Бирюков В.В., Щеблыкин И.Н. Экстракция низина из культуральной жидкости различными кислотами. //Труды МГУИЭ,-1999.-т.4.-с.236-240.

241. Щеблыкин И.Н., Бирюков В.В., Минаева Л.П., Смирнова С.Н. Особенности аппаратурного оформления и масштабирования процесса биосинтеза низина: Тез. докл. III международной научно-технической конференции «Пища, экология, человек» -М.: МГУПБ, 1999.-c.126.

242. Wlimowska-Pele A., Olichurier Z., Malicka-Blaskiewic M.// Acts Microbiol. Pol. -1976. -25, p. 71-77.

243. Баранова И.П., Клюева Jl.M., Егоров P.C. Исаева H.C., Ходжаев М.Н., Барто-шевич Ю.Э. Выделение низина из нативного раствора и его очистка на катеонитах.// Антибиотики и химиотерапия, 1995- т. 37., №3. с. 5-6.

244. Bower С.К., Mcquire J., Daeschel M.A. // Appl. Envioron.Mikrobiol.,- 1995.- 61.-p. 992-997.

245. Baranova I.P., Grushina V.A., Nikitin IuS, EgorovN.S., Polin A.N. Nisin adsorption on silica adsorbents. //Arch Oral Biol. 2006 Sep, 51(9) p.784-793.

246. Baranova I.P., Kozlova I.I., Grushina V.A., EgorovN.S. Method of determining the concentration of the antibiotic nisin. // Arch Oral Biol. 2006 Sep, 51(9)- p.795-797.

247. Воробьева Л.И., Ходжаев Е.Ю., Пономарева Г.М. Внеклеточный белок Luteo-coccus Japonicus subsp. casei реактивирует клетки, инактивированные ультрафиолетовым облучением и нагреванием. //Микробиология, 2003-Т.72, №4, с.482-487.

248. Воробьева Л.И., Ходжаев Е.Ю., Пономарева Г.М. Внеклеточный белок про-пионовых бастерий ингибирует индуцируемые мутации у штаммов Salmonella ty-phimurium. //Микробиология, 2001-Т.70, №1, с.39-44.

249. Miescher Schwenniger S. / Antimicrobial and autolytic systems of dairy propioni-bacteria. //Ph.D. -ThesisN 13486, 1999.- p.1253-1265, ETH Zurich, Switzerland.

250. Holo H., Faye T., Brede D.A., Nilsen T., Odegard I., Langrud T., Brendehaud J. and Nes I.F./ Bacteriocins of propionic acid bacteria.// Lait, 2003, N82.-p.59-68

251. Miescher S., Stierli M.P., Teuber M. and Maile L. / Propionicin SM1, a bacteriocin-from Propionibacterium jensenii DF1: isolation and characterization of the protein and its gene. System. Appl. Microbiol., 2000, N 23.- p. 174-184.

252. Противоопухолевая активность Propionii avidum 1 на мышах BALB/c. /Огай Д.К., Исмаилова Д.А., Маметов Ф.Ю. // 3 Моск. Межд. Контр. «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 14-18 марта, 2005: Мат. Конгр. Ч.1.-М., 2005. -с.92.

253. Нефедова Н.В., Гуревич С.М., КозаченкоА.И., Наглер Л.Г. Супероксиддисму-тазная активность молочнокислых бактерий и дрожжей. // Хранение и переработка сельхозсырья, 2003- №10,с.71-73

254. Комаров В.И., Лебедев Е.И., Мануйлова Т.А. Проблемы использования вторичных сырьевых ресурсов отраслей пищевой и перерабатывающей промышленности и их влияние на окружающую среду. // Хранение и переработка сельскохозяйственного сырья. №2, 1998 г.

255. Галкина Г.В. и др. Перспективы производства пищевых органических кислот и подкислителей биотехнологическим способом на основе нетрадиционного сырья. АгорНИИТЭИПП,1990,-36с.

256. Храмцов А.Г. Научно-технические аспекты рационального использования молочной сыворотки. //Молочная промышленность, 1993г., № 2;

257. Сенкевич Т., Рид ель К.-Л. Молочная сыворотка: переработка и использование в агропромышленном комплексе. Пер. с немецкого, М.:Агропромиздат,1989г.-270 с.

258. Храмцов А.Г., Нестеренко П.Г. Технология продуктов из молочной сыворотки: Учебное пособие- М.: -ДеЛи принт, -2004. -587с.

259. Храмцов А.Г. Молочная сыворотка.2-е изд., М., Агропромиздат, 1990г.

260. Leh М.В., Charles М. Lactic acid production by batch fermentation of whey permeate: a mathematical model // J. Ind. Microbiol. 1989. - V.4, N 1, - P.65-70.

261. Leh M.B., Charles M. The effect of whey protein hydrolyzate average molecular weight on the lactic acid fermentation // Ibid. P.77-80.

262. Roy D., LeDuy A., Goulet J. Kinetics of growth and lactic acud production from whey permeate by Lactobacillus helveticus // Can J. Chem. Eng.- 1987.- V.65, N 4.-P.597-603.

263. Lactose continuous fermentation with cells recycled by ultrafiltration and lactate separation by electrodialysis: model identification / A. de Raucourt, D. Girard, Y.Prigent, P. Boyaval //Appl. Microbiol. Biotechnol. -1989.- V.30.- P.528-534.

264. Lund В., Norddahl В., Ahrig B. Production of lactic acid from whey using hydro-lysed whey protein as nitrogen sours // Biotechnol. Lett. 1992.- V.14, N 9.- P.851-856.

265. Pat. 2 623 402 France, Int. CI. A61L 21/00. Antule en polymere d'acide lactiqe utilisable netamment comme prot-hese biodegradable et procede pour sa realisation /

266. Delcommune, P. Ghyselinch. Publ. 24.05.1985.

267. Daffonchio D., Sorlini C. Produzione microbica di acidi organic da siero latte //Ind. latte. 1993. - V.29, N 1. -P.25-38.

268. Полянский K.K., Глаголева Л.Э., Яковлев В.Ф. Методы исследования свойств сырья и продуктов питания. Учебн. пособие. Воронеж, 1999 г-309с.

269. Методы биохимического исследования растений. Под ред. А.И.Ермакова Л.: «Колос», 1972.- 456 с.

270. Практикум по микробиологии / A.M. Нетрусов, М.А. Егорова, Л.М. Захарчук и др.; Под. ред. А.И. Нетрусова.- М.: Издательский центр «Академия», 2005.-608с.

271. Практикум по биохимии. Под ред. С.Е.Северина и Г.А. Соловьевой-М.: Изд. МГУ,1989.-509с.

272. Бекер М.Е., Лиепинып Г.К., Райпулис Е.П. Биотехнология. М.: Агропромиздат. 1990. с.334.

273. И.А. Рогов, В.И. Ганина, М.М.Данилова, А.М.Лысенко, С.П. Синеокий, М.Ю. Гудима, В.В.Самсонов, С.А.Самсонова Идентификация и отбор культур Lactobacillus для биотрансформации молочного сырья. Биотехнология, 2003, №4, с.45-51.

274. Ратникова И.А., Гаврилова Н.Н., Колоколова Н.Н. Идентификация антибиотических веществ молочнокислых бактерий. //Биотехнология, 1995.- №6, с. 19-20.

275. Agarose/agar assay system for the selection of bacteriocin producing lactic fermentation bacteria/ Somkuti G.A., Steinberg D.H. // Biotechnol. Lett. - 2002.-V.24, N 4.-P.303-308.

276. Методы общей бактериологии. Пер. с анг. под ред. Ф.Герхарда М.: Мир, 1983.-т. 1., 535 с.

277. Егоров Н. С. Основы учения об антибиотиках. М. Высшая школа, 1979 г. -479 С.

278. Stephen Wessels, Ph. D., Birthe Jelle, M. Sc., Ingolf F. Nes, Ph. D. Bactereriocins of the Lactic Acid Bacteria: An Overlooked Benefit for Food. //Danish Toxicoljgy Centre, 1999, p.85

279. De Waard H., Stadhaouders J. //Voedingsmiddelentechnologie.-1983.-v.16.-N.22/23-p.141-145.

280. S.M. Cusich, D.J. О Sullivan. Use of a single, triplicate arbitralry primed-PCR procedure for molecular fingerprinting of lactic acid bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 2000.-v. 66(5), p.2227-2231.

281. Отечественные штаммы энтерококков, используемые в качестве заквасок, не содержат гены верулентности, обычно присутствующие в штаммах Enterococcus faecalis/ Ботина С.Г., Суходолец В.В.// Биотехнология -2005.-№2-c.33-37.

282. Суворов А.Н., Захаренко С.М., Алехина Г.Г. Энтерококки как пробиотики выбора// Клин, питание (СПб). 2003. №1.С.26-29.

283. UV- method for the determination of L-lactic acid in foodstaffs and other materiales. Instructions for performance of assay. Cat. N 139084. Boehringer Mannheim GMBH, Biochemica, 1987. 3p.

284. Патент 2159553 Россия, МПК7 CI А 23 В 7/14, 7/10, А 23 L 1/212, 3/3463 Консервант сельскохозяйственной продукции /Исакова Д.М., Куксова Е.В. № 2000100617/13, опубл. 27.11.2000.

285. Патент 2157635 Россия, МПК7 CI А 23 В 7/14, 7/10, A 23L1/212, 3/3463 Способ консервирования сельскохозяйственной продукции /Исакова Д.М., Куксова Е.В. № 2000100618/13, опубл. 20.10.2000.

286. Патент 2202893 Россия, МПК7 С2 1 А 23 В 7/00, 7/10, А 23 L 1/212, 3/34 Способ консервирования растительного сырья /Бондарь А.И., Приходько А.В., Соловьев А.Ю., Куликов П.Н., Куксова Е.В. № 2001115855/13, опубл. 27.04.2003.

287. Johnson J.L., Phelps C.F., Cummins C.S., London J., Gasser F. Taxonomy of the Lactobacillus acidophilus Group. // International Jornal of Systematic Bacteriology, Jan. 1980, p. 53-68.

288. Ishida Т., Yokota A., Umezawa Y., Yamada K. Identification and characterization of lactococcal and Acetobacter strains isolated from traditional Caucasusian fermented milk. // J. Nutr. Sci Vitaminol (Tokyo) -2005. May -v.51(3)- p.108-82.

289. Durancin L 28-1 A, a new bacteriocin from Enterococcus durans L 28-1 A, isolated from soil / Yanagida F., Chen Y., Onda Т., Shinohara T. // Lett. Appl. Microbiol. 2005. - 40, N. 6.-P.430-435.

290. Jnfluence of growth medium on hudrogen peroxide and bacteriocin production of Lactobacillus strains /Zalan Zsolt, Halasz Anna // Food Technol. and Biotechnol. 2005.43, N.3.-P. 219-225.

291. Effect of growth medium on bacteriocin production by Lactobacillus plantarum ST 194 BZ, a strain isolated from Boza./ Todorov S.D., Dicks L.M.T. //Food Technol. and Biotechnol. 2005.- 43, N. 2.-P. 165-173.

292. Поляков B.A., Куксова E.B. Исследование и разработка процесса получения комплексных пищевых добавок на основе культивирования кислотообразующих бактерий. Хранение и переработка сельскохозяйственного сырья. № 12, 2007г., с. 57-61.

293. Патент 2244000 Россия, МПК7 С1 7 С 12 N 1/20, С 12 Р 21/00 Штамм Lactobacillus acidophilus продуцент белка /Галкина Г.В, Илларионова В.И., Куксова Е.В., Горбатова Е.В., Волкова Г.С. № 2003115714/13, опубл. 10.01.2005.

294. Патент 2244001 Россия, МПК7 С1 7 С 12 N 1/20, С 12 Р 21/00 Штамм Lactobacillus plantarum продуцент белка /Галкина Г.В, Илларионова В.И., Куксова Е.В., Горбатова Е.В., Волкова Г.С., № 2003115716/13, опубл. 10.01.2005.

295. Крусь Г.Н., Тиняков В.Г., Фофанов Ю.Ф. Технология молока и оборудование предприятий молочной промышленности, Москва, Агропромиздат, 1986 г.

296. В.И. Евлеева, Т.М. Черпалова, А.П. Бочкова, И. Н. Филимонова/Молочная кислота и лактаты в производстве продуктов питания.// Пищевые инградиенты, сырье и добавки, 2000г., № 2; с.60-61.

297. Композиция микроорганизмов (варианты): Пат. 2270855 Россия, МПК7С 12N 1/20, А 61/К 35/74./ Валио Лтд. Мяйря-Мякинен Анника, Суомалайкен Тарья; Ваа-рала Оути -№ 2003125858/13. Заявл. 17.01.2002. Опубл. 20.01.2007.

298. Способ получения биологически активной добавки: Пат. 2267968 Россия, МПК7А 23L1/30, А 61К./ Саян В.Ш., Дубенко А.Я., Заерко В.И.,Сурмило А.П. -№ 2004108634/13. Заявл. 24.03.2004. Опубл. 20.01.2006.

299. Оптимизация технологии получения препаратов пробиотиков. Автореф. дис./ Тимербаева Р.Х.- Президиум АН РБ, Уфа, 2005-23с.

300. Автор благодарит коллег сотрудников лаборатории интенсификации производства пищевых кислот и уксуса ГНУ ВНИИПБТ за оказанную помощь при выполнении работы.

301. Автор выражает глубокую признательность сотрудникам ЗАО «Консэко» профессору д.б.н. ¡Исаковой Долорес Михайловне| и д.м.н. Приходько Александру Викторовичу за оказанную помощь при выполнении работы.1.ujw?u emt Í 184

302. ПАСПОРТ ДЕПОНИРУЕМОГО ШТАММА Депонирование культуры Enterococcus fnccium шт. 3 осуществляется с цёлью оформления патента. Депозитор Морозов Василий Юрьевич

303. Адрес: 163002, г. Архангельск, наб. Северной Двины, д. 2/1, кв. 39

304. Авторское обозначение штамма Enterococcus faecium шт. 3

305. Используемое свойство штамма продуцент L(+)- молочной кислоты2. Происхождение штамма

306. Штамм выделен из молочной сыворотки3. Идентиф.икания .

307. Морфология клеток: клетки сферические d 0.7-0.8 мкм , парные или

308. Kopoi кие цепочки в жидкой среде.

309. Реакция по Граму положительная.

310. Спорооорл кжапие отсутствует.1. Пигмеи im пс образует.

311. Оптимальная температура роста 37 С.4 4. Услокия поддержания и хранения: ежемесячные пересевы наагарнюиаиноп среде; метод хранении лиофилизация в сепарированноммолоке,

312. Сведения о'биологической безопасности штамма:

313. Штамм не патогенен и нетоксичен для человека. Справка прилагается.шлошетг Z1. УТВЕРЖДАЮ1. Л.H. Сернов1. Zv^ 2000 г.

314. ЗАКЛЮЧЕНИЕ о результатах исследования непатогенности микроорганизма Enterococcus faecium штамм 3

315. Зав. лабораторией фармакокинетики, антибактериальных средств и микробиологической токсикологии1. В.И. Бобров