автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.04, диссертация на тему:Разработка технологии бактериальных концентратов на основе бифидобактерий B. longum DK-100, B. bifidum 83

На правах рукописи У

гамзякова ильяна вячеславовна

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КОНЦЕНТРАТОВ НА ОСНОВЕ БИФИДОБАКТЕРИЙ В. кн^ит БК-ЮО, В. ЫГк!ит 83

Специальность 05.18.04 - Технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств

автореферат СИЯ ЯЗЙ1 5

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

5 ДЕК 2013

005541659

Улан-Удэ-2013

005541659

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления» (ВСГУТУ)

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор

Хамагяевя Ирина Сергеевна

Официальные оппоненты: Анцупова Татьяна Петровна,

доктор биологических наук, профессор кафедры «Неорганическая и аналитическая химия» ВСГУТУ

Занданова Туяна Нимбуевна,

кандидат технических наук, доцент кафедры специальных дисциплин Бурятского филиала НГОУ ВПО Центросоюза РФ «Сибирский университет потребительской кооперации»

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Бурятская государственная

сельскохозяйственная академия им. В.Р. Филиппова» (г. Улан-Удэ)

Защита диссертации состоится 25 декабря 2013 г. в Ю00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.039.05 при ФГБОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления» по адресу: 670013, г. Улан-Удэ, ул. Ключевская, 40в, ауд. 8-124.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВСГУТУ. Автореферат разослан <(22.» ноября 2013 года.

Ученый секретарь /, у

диссертационного совета /

Столярова Анна Сергеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В настоящее время наиболее изученным и практически реализованным направлением поддержания микробной экологии человека на оптимальном уровне, является использование для этих целей препаратов бифидобактерий. Многолетние клинические наблюдения за лечебной и профилактической эффективностью бифидобактерий показали, что они не обладают побочными эффектами при их длительном применении и могут быть рекомендованы для производства продуктов функционального питания для ежедневного использования людьми всех возрастов.

Бифидобактерии. присутствующие в пищевых продуктах, очень чувствительны к факторам окружающей среды, к низким значениям рН, отсутствию ростовых факторов, поэтому для удлинения сроков сохранения бифидобактерий в жизнеспособном состоянии необходимо исследовать факторы, повышающие их устойчивость в процессе производства и хранения.

Для улучшения технологических и функциональных характеристик отобранных для производства пробиотиков, а также для конструирования новых препаратов с заданными свойствами необходимо использовать различные биотехнологические приемы, повышающие биохимическую активность и пробио-тические свойства.

Известно, что пребиотики активизируют рост бифидобактерий и играют важную роль в поддержании их жизнедеятельности.

Однако до настоящего времени остаются неизученными вопросы, касающиеся влияния пребиотиков на физиолого-биохимические и технологические свойства бифидобактерий. В связи с этим детальное исследование данной проблемы и создание бактериальных концентратов с высокими функциональными свойствами открывает широкие перспективы для расширения ассортимента инновационных пробиотических продуктов и отвечает запросам потребителей.

Цель и задачи исследовании. Целью данной работы является разработка технологии пробиотических бактериальных концентратов с высокими функционально-технологическими свойствами.

Для достижения указанной цели были определены следующие задачи исследований:

- изучить влияние пребиотиков на биохимическую активность Bifidobacterium longum DK-100 и Bifidobacterium bifidum 83;

- исследовать влияние пребиотиков на процессы адгезии и когезии бифидобактерий;

- исследовать устойчивость бифидобактерий к низким значениям рН;

- исследовать антимутагенную и холестеринметаболизирующую активность бифидобактерий;

- обосновать технологические параметры получения бактериальных концентратов;

- исследовать сроки хранения бактериальных концентратов бифидобак-

терий.

Научная новизна. В результате проведенных исследований выбраны оптимальные дозы пребиотиков, обеспечивающие активный рост бифидобак-терий. Установлено, что высокомолекулярные полисахариды повышают адгезивные свойства, приводят к агрегации клеток бифидобактерий и формируют микроколонии. Ферментация бифидобактериями сложных углеводов способствует повышению их антимутагенной и холестеринметаболизирующей активности. Выявлено, что адгезия и агрегация бифидобактерий на биоволокнах повышают их устойчивость к низким значениям рН и пролонгируют сроки хранения бактериальных концентратов.

Практическая ценность работы. Основные результаты исследований нашли практическую значимость в разработке технологии производства жидких бактериальных концентратов. Разработаны проекты технической документации и проведена опытно-промышленная проверка технологии производства жидких бактериальных концентратов в условиях МИП «Бифивит»

Апробация работы. Результаты работы были доложены и обсуждены на научных конференциях ВСГУТУ (Улан-Удэ, 2010-2012), международных и всероссийских конференциях: «Пищевые продукты и здоровье человека» (Кемерово, 2009, 2011), «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань. 2010), «Технологии и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности» (Бийск, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе одна статья в журнале, рекомендованном ВАК Министерства образования и науки РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, аналитического обзора, методической части, результатов эксперимента и их анализа, списка литературы и приложений. Основная часть работы изложена на 127 страницах машинописного текста, включает 27 таблиц, 10 рисунков, 2 приложения. Список литературы включает 135 наименований.

МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

Экспериментальная часть исследований проводилась в лабораториях кафедры «Технология молочных продуктов. Товароведение и экспертиза товаров» и МИП «Бифивит» ВСГУТУ.

Объектами исследований служили чистые культуры пробиотических бактерий: штамм Bifidobacterium longum DK-100 и Bifidobacterium bifidum 83, полученные из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИ «Генетика», активизированные уникальным биотехнологическим методом, разработанным в ВСГУТУ. В исследованиях использовали растительные добавки: из злаковых культур (ячменная мука по ТУ 9293-002-

43175543-03, овсяная мука по ГОСТ 27168-86) и жмых ядра кедрового ореха по ТУ 9146-001-53163736-06.

Для культивирования пробиотических микроорганизмов применяли питательную среду на основе осветленной творожной сыворотки с внесением ростовых компонентов, разработанную в ВСГУТУ.

Общая схема проведения экспериментов представлена на рисунке 1.

I

Исследование антимутагенной активности бифидобактерий 7

Показатели

1. Органолептические показатели

2. Активная кислотность

3. Оптическая плотность

4. Количество -жизнеспособных клеток бифидобактерий

5. Микроскопический препарат

6. Адгезивные свойства

7. Антимутагенная активность

8. Холестеринметаболизиругощая активность

9. Показатели безопасности

10. Контаминация

11. Определение БГКП

I

Исследование холестеринметаболизи-рующей активности бифидобактерий 8

I

Обоснование технологических параметров получения бактериальных концентратов

_1,2,4, 6,7, 8,9,10,11_

1

Исследование сроков хранения бактериальных концентратов бифидобактерий _14_

Рисунок 1 - Общая схема проведения эксперимента

Оптическую плотность определяли фотоколориметрическим методом на фотоколориметре КР - 77 при >.=550 нм; антимутагенную активность - по тесту Эймса; адгезивные свойства - по развернутому методу Брилис; активную кислотность определяли по ГОСТ Р 53359-2009; контаминацию по ГОСТ Р

53430-2009; морфологию клеток бактерий - путем приготовления препаратов, окрашенных метиленовым синим, или по Граму с последующим микроскопированием в иммерсионной системе; количественный учет бифидобактерий - по МУК 4,2.999-00; в исследованиях использовали микроскоп марки МИКМЕД-6 (видимое увеличение 1000-кратное).

Для определения концентрации общего холестерина использовали ферментативный метод. Принцип метода заключается в том, что под действием фермента холестеринэстеразы эфиры холестерина распадаются на холестерин и жирные кислоты. Далее холестерин под воздействием холестериноксидисмута-зы дает окрашенное соединение и перекись водорода. Интенсивность окраски в реакционной смеси прямо пропорциональна концентрации холестерина в пробе. После этого измеряли оптическую плотность опытной пробы (Е) и калибровочной пробы (Ек) против рабочего реагента, состоящего из смеси ферментов при длине волны 500 нм. Концентрацию холестерина в пробе определяли расчетным методом по формуле С=Е/ЕК*4,65, где 4,65 - это концентрация холестерина в калибраторе (моль/л). При измерении опытных образцов, дающих интенсивный цвет, допускается разбавление образцов физиологическим раствором в два раза. Полученные данные в расчете умножают на 2. При исследовании холестеринметаболизирующей активности пробиотических микроорганизмов использовали питательную среду на основе молочной сыворотки, разработанную ранее в ВСГУТУ с добавлением очищенной сыворотки крови в качестве источника холестерина.

В таблицах обсуждены статистически достоверные различия при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение влияния пребиотиков на биохимическую активность Bifidobacterium longum DK-100 и Bifidobacterium bifidum S3

Одной из проблем использования пробиотических препаратов является потеря бифидобактериями жизнеспособности в процессе хранения при воздействии неблагоприятных технологических факторов или в агрессивной среде желудка. Поэтому важной биотехнологической задачей, имеющей коммерческую значимость, является повышение устойчивости бифидобактерий в пробиотических концентратах.

Известны эффективные лечебные препараты, созданные путем адсорбции молочнокислых бактерий на различных биоволокнах, повышающих их жизнеспособность.

В связи с этим нами выдвинута гипотеза о возможности повышения стрессоустойчивости бифидобактерий путем непосредственного культивирования в питательной среде с субстратом - адсорбентом, в качестве которого могут служить злаковые культуры и жмых ядра кедрового ореха, обладающие пребиотическими свойствами.

На первом этапе исследований изучали влияние ячменной, овсяной муки и жмыха ядра кедрового ореха на биохимическую активность ранее не изученных штаммов бифидобактерий В. Ыйс1ит 83 и В. 1оп§ит ОК-ЮО.

При подборе условий культивирования бифидобактерий для получения пробиотических концентратов руководствовались следующими требованиями: низкая себестоимость процесса; высокий титр бифидобактерий в стационарной фазе роста; высокая устойчивость при неблагоприятных факторах внешней среды.

Для культивирования бифидобактерий использовали ранее разработанную питательную среду на основе осветленной творожной сыворотки, в которую вместо агара вносили различные дозы злаковых культур и жмыха ядра кедрового ореха.

В результате проведенных исследований с учетом количества жизнеспособных клеток бифидобактерий и органолептических свойств, были выбраны оптимальные дозы вносимых компонентов: для жмыха ядра кедрового ореха -2%, для ячменной муки — 1,5 %, для овсяной муки - 1%. В дальнейших исследованиях выбранные дозы использовали при изучении биохимической активности бифидобактерий. Полученные результаты представлены на рисунке 2.

Рисунок 2 - Динамика роста В. ]ongum ДК-100

Данные, представленные на рисунке 2, показывают, что внесение растительных компонентов ускоряет рост бифидобактерий В. 1оп§ит ЭК-100.

Анализ динамики роста бифидобактерий показывает, что при внесении ячменной и овсяной муки количество жизнеспособных клеток бифидобактерий через 18 ч достигает 1011 КОЕ/см3, тогда как в контроле такое значение наблюдается через 24 ч культивирования. Следует отметить, что при внесении жмыха ядра кедрового ореха стационарная фаза наступает через 18 ч культивирования, при этом количество жизнеспособных клеток бифидобактерий составляет 1012 КОЕ/см3, что свидетельствует об его более высоких пребиотических свойствах (рис. 2). Такая же динамика отмечена при культивировании бифидобактерий В. ЫШшп 83.

В результате проведенных исследований выбраны оптимальные дозы пребиотиков, обеспечивающие активный рост бифидобактерий.

Исследование влияния пребиотиков на процессы адгезии и когезии бифидобактерий

Адгезия к слизи, гликопротеинам и эпителиальным клеткам, а также колонизация в желудочно-кишечном тракте человека являются основополагающими характеристиками микроорганизмов, обладающих пробиотическими свойствами.

Злаковые культуры и жмых ядра кедрового ореха содержат высокое количество растворимых и нерастворимых пищевых волокон и могут адсорбировать и колонизировать бифидобактерии в процессе культивирования. В связи с этим в дальнейших исследованиях изучали адгезивные свойства бифидобактерий при их культивировании на питательной среде с внесением пребиотиков. Адгезию бифидобактерии оценивали по среднему показателю адгезии (СПА), коэффициенту участия эритроцитов (КУЭ), индексу адгезивности микроорганизмов (ИАМ). Микроорганизмы считаются высокоадгезивными при ИАМ более 4,0; среднеадгезивными - при ИАМ от 2,51 - 4,0; малоадгезивными - при ИАМ от 1.76 - 2,54. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Влияние пребиотиков на адгезивные свойства бифидобактерий В. 1оп§ит ДК-100 и В. Ыйс1ит 83

Наименование штамма микроорганизмов СПА КУЭ, % ИАМ Адге-зивность

В. 1огщит ДК-100 1. Контроль 2. Овсяная мука 1,0 % 3. Ячменная мука 1,5 % 4. Жмых ядра кедрового ореха 2,0 % 4.2 4.3 4,5 4.4 84 83 85 86 4,76 5,18 5,29 5,11 >3 и о

В. ЫМит 83 я

1. Контроль 3,6 82 4,12 С

2. Овсяная мука 1,0 % 4,3 85 5,05 2

3. Ячменная мука 1,5 % 4,4 85 5,17

4. Жмых ядра кедрового ореха 2,0 % 4,6 88 5,22

Результаты исследований, представленные в таблице 1, свидетельствуют о том, что исследуемые штаммы бифидобактерий в присутствии пребиотиков обладают более высокими адгезивными свойствами.

Вероятно, высокомолекулярные полисахариды, содержащиеся в исследуемых растительных добавках, повышают адгезивные свойства бифидобактерий.

К механизмам, гарантирующим стабильность микробного консорциума, кроме адгезии относится также когезия (агрегация клеток). В литературных источниках недостаточно сведений о межклеточных контактах микроорганизмов, отражающих закономерности развития микробных популяций как саморегулирующих многоклеточных систем.

Дальнейшие исследования посвящены изучению влияния пребиотиков на когезию бифидобактерий.

Результаты исследований представлены на рисунке 3.

в) ячменная мука 1,5% г) жмых ядра кедрового ореха 2 %

Рисунок 3 - Микрокартина бифидобактерий В. 1огщит ДК-100 (видимое увеличение микроскопа 1000-кратное)

Из представленного выше рисунка 3 б-г видно, что внесение пищевых волокон приводит к агрегации клеток бифидобактерий и формированию микроколоний. Согласно современным данным, механизм позитивного эффекта пищевых волокон, растворимых Р-глюканов овса и ячменя и нерастворимых высокомолекулярных полисахаридов, заключается в создании дополнительной площади для фиксации бифидобактерий и биотрансформации пищевых волокон с образованием доступных источников углерода и энергии. Из литературных данных известно, что адсорбция и иммобилизация на биоволокнах защищают клетки бифидобактерий при стрессовых воздействиях.

В результате проведенных исследований установлено, что исследуемые штаммы бифидобактерий обладают высокими адгезивными свойствами, колонизируются на поверхности пищевых волокон злаковых культур и жмыха ядра кедрового ореха с образованием агрегатов, что повышает их устойчивость к неблагоприятным факторам среды.

Дальнейшие исследования были посвящены изучению устойчивости бифидобактерий к низким значениям рН. Для этого проводили модельные опыты. Результаты представлены на рисунке 4.

|>Н

« Жмыкядра кедрового орека 2°и - Овсяная мука 1"° * Ячменная мука 1 *" ч «Контроль

Рисунок 4 - Влияние различных значений рН на выживаемость клеток В. ^ишБК-ЮО

Как видно из рисунка 4, внесение пребиотиков в питательную среду повышают устойчивость бифидобактерий к снижению рН в сравнении с контролем. Наиболее высокой устойчивостью к низким значениям рН среды характеризуются бифидобактерии выращенные на среде со жмыхом ядра кедрового ореха. Так, например, при рН=5 выживаемость бифидобактерий составляет 96,6 %, тогда как в контроле без добавления жмыха ядра кедрового ореха количество жизнеспособных клеток снижается до 83%. Отмечена достаточно высокая выживаемость бифидобактерий на среде с пребиотиками в сравнении с контролем при рН=3. При этом количество жизнеспособных клеток на питательной среде со жмыхом ядра кедровог о ореха составляет 77,2%, со злаковыми культурами находится в пределах (70,3-71)%, тогда как в контроле - 60%.

Полученные результаты подтверждают, что процессы адгезии и когезии влияют на метаболизм бифидобактерий и повышают их жизнеспособность при низких значениях рН среды.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что внесение пребиотиков в питательную среду не только стимулирует рост бифидобактерий, но и повышает их устойчивость при экстремальных условиях культивирования.

Исследование антимутагенной активности бифидобактерий

Известно, что бактерии эволюционно наиболее древние существа, постоянно подвергающиеся мутагенным и инактивирующим факторам среды. Это обстоятельство предполагает, что бактерии должны обладать надежными средствами защиты для сохранения стабильности своего генома. В настоящее время доказано, что бифидобактерии обладают антимутагенными свойствами, которые зависят от различных факторов. Одним из факторов, влияющих на антимутагенную активность пробиотических микроорганизмов, является состав питательных сред.

В связи с этим нами изучено влияние пребиотиков на антимутагенные свойства В.ЫШит 83 и В. Iongum БК-ЮО. Полученные результаты исследований представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Влияние пребиотиков на антимутагенную активность бифидобактерий

Среднее число

Наименование штамма микроорганизмов ревертантов Ингибирование, %

на чашку

В. ЫПсЬнп 83:

1. Контроль 751 40

2. Жмых ядра кедрового ореха 2,0% 648 56

3. Ячменная мука 1,5% 606 54,4

4. Овсяной муки 1,0 % 603 51,3

В. 1оп§ит ОК-ЮО:

1. Контроль 1013 43

2. Жмых ядра кедрового ореха 2,0% 915 54,6

3. Ячменная мука 1,5% 982 51,3

4. Овсяная мука 1% 752 54

Из данных, представленных в таблице 2, видно, что культивирование бифидобактерий на питательной, среде с внесением пребиотиков повышает антимутагенные свойства бифидобактерий. Это, вероятно, связано с биотрансформацией сложных углеводов и изменением метаболизма бифидобактерий, что способствует более высокому синтезу антимутагенных веществ.

Следует отметить, что полученные нами результаты согласуются с литературными данными о высокой антиоксидантной активности Р-глюкана и нерастворимых пищевых волокон, содержащихся в пребиотиках и повышающих антимутагенные свойства бифидобактерий.

Исследование холестеринметаболизирующей активности бифидобактерий

Проведенные ранее исследования показали, что В. ЫМшп 83 и В. 1оп§ит ОК-ЮО обладают достаточно высокой холестеринметаболизирующей активностью. В ходе исследований нами было отмечено, что способность бифидобактерий снижать концентрацию холестерина в среде культивирования зависит от времени инкубации, концентрации субстрата и состава среды. Поэтому на следующем этапе исследований изучено влияние пребиотиков на хо-лестеринметаболизирующую активность бифидобактерий. Результаты исследований представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Влияние пребиотиков на холестеринметаболизирующую активность бифидобактерий

Пребиотики Содержание холестерина в питательной среде, ммоль/л Уровень разрушения холестерина, %

Продолжительность культивирования, ч

0 | 4 | 8 | 12 | 16 | 20 | 24

В. bifidum 8i

Контроль 4,85 4,85 4,63 4,52 4,3 3,68 3,13 35,46

Овсяная мука 1% 4,85 4,85 4,75 4,45 4,11 3,48 2,84 41,27

Ячменная мука 1,5% 4,85 4,85 4,57 4,17 3,7 3,25 2,93 39,54

Жмых ядра кедрового ореха 2% 4,85 4,85 4,55 4,12 3,48 3,05 2,71 44,12

В. longum DK-100

Контроль 4,85 4,85 4,6 4,41 4,11 3,55 2,95 39,12

Овсяная мука 1% 4,85 4,83 4,5 4,1 3,8 2,92 2,5 48,38

Ячменная мука 1,5% ' 4,85 4,85 4,57 4,23 3,8 3,15 2.60 46,36

Жмых ядра кедрового ореха 2% 4,85 4,82 4,53 4,15 3,63 2,7 2,42 50,1

Как видно из таблицы 3, исследуемые штаммы бифидобактерий в процессе культивирования в питательной среде с добавлением пребиотиков обладают более высокой холестеринметаболизирующей активностью. Вероятно, холестерин адсорбируется на пищевых волокнах и разрушается при биотрансформации субстрата бифидобактериями.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что культивирование бифидобактерий в среде с пребиотиками повышает биохимическую активность и пробиотические свойства микроорганизмов.

Обоснование технологических параметров получения бактериальных концентратов

В результате проведенных исследований нами установлено, что оптимизация питательной среды пребиотиками повышают функционально-технологические свойства бифидобактерий. На основании полученных результатов разработана технологическая схема производства бактериальных концентратов (рис. 4).

Качественная характеристика бактериальных концентратов на основе В. 1оп§ит ОК-ЮО представлена в таблице 4.

Предварительная подготовка

злаковых культур 1= (85±5) °С

1

Внесение пребиотиков —»] Приготовление питательной среды

т

Жмых ядра кедрового ореха | Перемешивание 5 мин

Розлив, упаковка, маркировка

_А_

Хранение при 1= 4-6 °С

Рисунок 4 - Технологическая схема производства бактериальных концентратов

Таблица 4 - Качественная характеристика бактериальных концентратов на основе В. longum DK-100

Наименование показателя Значение показателя

Концентрат В. 1оп§игп ЭК-100 со жмыхом ядра кедрового ореха Концентрат В. 1огщит ОК-ЮО с ячменной мукой Концентрат В. 1огщит ОК-ЮО с овсяной мукой

Консистенция и внешний вид Однородная, допускается отделение сыворотки Однородная, без отделения сыворотки Однородная, в меру вязкая, без отделения сыворотки

Цвет От белого до светло-желтого с белыми вкраплениями

Вкус и запах Чистый, слегка сладковатый, с привкусом и запахом кедрового ореха. Чистый, слегка кисловатый, с привкусом и запахом ячменной муки. Чистый, слегка кисловатый, с привкусом и запахом овсяной муки.

Предельное значение рН, ед 5,5-7,5 5,5-7,5 5,5-7,5

Холестеринметаболизи-рующая активность, % 50,1 46,36 48,38

Антимутагенная активность (ингибирование), % 54,6 51,3 54

Адгезивные свойства: СПА КУЭ,% НАМ 4,4 86 5,11 4,5 85 5,29 4,3 83 5,18

Количество бактерий, КОЕ/см5 1012 10" 10"

Температура при выпуске с предприятия, °С, не более 4-6 "С

Объем продукта (см'), в котором не допускаются: БГКП (коли формы) S. aureus Патогенные микроорганизмы (в т.ч. сальмонеллы) Дрожжи, КОЕ/см3, не более Плесени, КОЕ/см3, не более 10 100 100 5 5

Как видно из данных, представленных в таблице 4, бактериальные концентраты обладают высокими пробиотическими свойствами, и количество жизнеспособных клеток составляет 10и-1012 КОЕ/см3.

Исследование сроков хранения бактериальных концентратов бифидобактерий

На следующем этапе изучали сроки хранения бактериальных концентратов бифидобактерий. Бактериальные концентраты хранили при температуре (4-6) °С. О качестве бактериальных концентратов судили по количеству жизнеспособных клеток бифидобактерий и органолептическим показателям. Результаты исследований представлены на рисунке 5.

Продол Ж! ггельность хранения, мес

—г>— Жмых ядра кедрового ореха 2°'о Ячменная мука 1.?°о

~~*Ь~Овсянаямука 1°ь —1—Контроль

Рисунок 5 - Исследование предельных сроков хранения бактериальных концентратов В. 1оп£ит ВК-100.

Как видно из рисунка 5, культивирование бифидобактерий в питательной среде с пребиотиками повышает их устойчивость при хранении. Наиболее высокая жизнеспособность бифидобактерий обнаружена при культивировании на питательной среде со жмыхом ядра кедрового ореха. Через 5 мес хранения количество жизнеспособность клеток бифидобактерий в концентрате с пребиотиками составляет 108-109 КОЕ/см3, тогда как в контроле количество клеток снижается до 106 КОЕ/см\ При дальнейшем хранении концентрата с овсяной мукой отмечено ухудшение органолептических свойств через 5 мес, а в концентратах с ячменной мукой и жмыхом кедрового ореха - через 7 мес.

В результате проведенных исследований установлено, что культивирование бифидобактерий на питательной среде с внесением пребиотиков пролонгирует сроки хранения концентратов.

Выводы

В результате проведенных исследований разработана технология бактериальных концентратов с высокими функциональными свойствами и пролонгированными сроками хранения.

1. Подобраны условия культивирования, обеспечивающие высокую биохимическую активность бифидобактерий.

2. Установлено, что бифидобактерии фиксируются на поверхности биоволокон с образованием агрегатов, что повышает их устойчивость к неблагоприятным факторам среды.

3. Отмечено, что процессы адгезии и когезии влияют на метаболизм бифидобактерий и повышают их устойчивость к низким значениям pH.

4. Биотрансформация сложных углеводов субстрата способствует более высокому синтезу антимутагенных веществ и повышает холестеринметаболи-зирующую активность бифидобактерий.

5. На основании проведенных исследований обоснованы технологические параметры и разработана технологическая схема жидкого бактериального концентрата.

6. Установлено, что бактериальные концентраты обладают высокой биохимической активностью и устойчивостью к экстремальным факторам внешней среды.

7. Опытно-промышленная проверка на базе МИП «Бифивит» показала, что они соответствуют требованиям технической документации.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Гамзякова И.В. Влияние кедрового жмыха на рост бифидобактерий / И.В. Гамзякова, С.Н. Хазагаева, И.С. Хамагаева: — Мат-лы II Всерос. конф. студентов и аспирантов «Пищевые продукты и здоровье человека». Кемерово: Изд-во КемТИПП, 2009. С. 37-39.

2. Гамзякова И.В. Влияние пищевых волокон на качественную характеристику продукта / И.В. Гамзякова, H.A. Замбалова, И.С. Хамагаева: — Сб. науч. тр. ВСГТУ. Сер.: Химия и биологически активные вещества природного происхождения. Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2010. С. 43-45.

3. Гамзякова И.В. Антимутагенная активность пробиотических микроорганизмов / И.В. Гамзякова, И.С. Хамагаева: — Мат-лы XI Междунар. конф. молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии». Казань, Изд-во КГТУ, 2010. С. 68-69.

4. Гамзякова И.В. Влияние ячменной муки на рост бифидобактерий / И.В. Гамзякова, Веньи Занг, И.С. Хамагаева: - Мат-лы IV Всерос. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых «Пищевые продукты и здоровье человека». Кемерово: Изд-во КемТИПП, 2011. С. 76-77.

5. Гамзякова И.В. Влияние пищевых волокон на адгезивные и антимутагенные свойства бифидобактерий / И.В. Гамзякова, H.A. Замбалова, Сан Ти-ансонг, И.С. Хамагаева: — Мат-лы IV Всерос. науч.-практ. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых с международным участием «Технологии и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности». Бийск: Изд-во Алт. ГТУ, 2011. С. 308-311.

6. Гамзякова И.В. Влияние пищевых волокон на адгезию и когезию бифидобактерий / И.В. Гамзякова. Веньи Занг, И.С, Хамагаева; - Сб. науч. тр. с

междунар. участием. Сер.: Химия и биологически активные вещества природного происхождения. Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2011. С. 29-33.

7. Гамзякова И.В. Качественная характеристика бактериального концентрата, обогащенного пищевыми волокнами / И.В. Гамзякова, H.A. Замбало-ва, И.С. Хамагаева: - Вестник ВСГУТУ. Улан-Удэ, 2012. №1 (36). С. 72-77.

8. Гамзякова И.В. Влияние пребиотиков на холестеринметаболизи-рующую активность бифидобактерий / И.В. Гамзякова, H.A. Замбалова, И.С. Хамагаева: - Сб. науч. тр. с междунар. участием. Секция: Биоорганическая и пищевая химия. Улан-Удэ: Изд-во ВСГУТУ, 2012. С. 119-121.

9. Гамзякова И.В. Холестеринметаболизирующая активность синбио-тических БАД / И.В. Гамзякова, И.С. Хамагаева: - Мат-лы II Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием «Биотехнология в интересах экологии и экономики Сибири и Дальнего Востока», посвящ. 50-летию со дня образования университета ВСГУТУ, Улан-Удэ: Изд-во ВСГУТУ, 2012. С. 76-78.

Подписано в печать 21.11.2013 г. Формат 60x84 1/16. Усл.п.л.1,16. Тираж 100 экз. Заказ Na 374.

Издательство ВСГУТУ 670013, г. Улан-Удэ, ул. Ключевская, 40 в

ФГБОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный университет

технологий и управления»

Л, Л Л На правах рукописи

04201454862 „

ГАМЗЯКОВА ИЛЬЯНА ВЯЧЕСЛАВОВНА

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КОНЦЕНТРАТОВ НА ОСНОВЕ БИФИДОБАКТЕРИЙ В. 1о1^ит БК-ЮО, В. ЫГк1ит 83

Специальность 05.18.04 - Технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата технических наук

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор И.С. Хамагаева

Улан-Удэ-2013

Содержание

Введение..........................................................................................................................................................................4

Глава 1. Состояние вопроса и задачи исследований................................................................6

1.1 Современные представления о пробиотиках и пребиотиках..................................6

1.2 Холестеринметаболизирующая активность бифидобактерий..............................23

1.3 Антимутагенные свойства бифидобактерий.................................................................35

1.4 Особенности технологии получения бактериальных концентратов..............41

1.5 Заключение по обзору литературы и задачи исследования....................................46

Глава 2. Организация проведения эксперимента. Материалы и методы

исследования................................................................................................................................................................48

2.1 Объекты и методики постановки эксперимента................................................................48

2.2 Методы исследований................................................................................................................................50

2.2.1 Физико-химические методы.исследований........................................................................50

2.2.2 Микробиологические методы исследований................................................................50

2.3 Статистическая обработка результатов................................................................................53

Глава 3 Исследование влияния пребиотиков на метаболизм бифидобактерий Bifidobacterium longum DK-100 и Bifidobacterium bifidum 83........................................54

3.1 Изучение влияния пребиотиков на биохимическую активность Bifidobacterium longum DK-100 и Bifidobacterium bifidum 83........................................54

3.2 Исследование влияния пребиотиков на процессы адгезии и когезии бифидобактерий......................................................................................................................................................62

3.3 Исследование устойчивости ^ бифидобактерий к низким значениям

рН............................................................................................................................................................................................71

3.4 Исследование антимутагенной активности бифидобактерий........................75

3.5 Исследование холестеринметаболизирующей активности

бифидобактерий........................................................................................................................................................79

Глава 4 Разработка технологии бактериальных концентратов

Bifidobacterium longum DK-100 и Bifidobacterium bifidum 83........................................83

4.1 Разработка технологической схемы производства бактериальных концентратов..............................!..........................................................................................................83

4.2 Исследование сроков хранения бактериальных концентратов бифидо-бактерий............................................................................................................................................................................88

4.3 Технология получения бактериальных концентратов................................................92

Глава 5 Расчет себестоимости бактериальных концентратов на основе

Bifidobacterium bifidum 83, Bifidobacterium longum DK-100..........................................96

Выводы..............................................................................................................................................................................110

Библиография..............................................................................................................................................................Ill

Приложения..................................................................................................................................................................125

Введение

Научные подходы к оздоровлению человека и его активной жизнедеятельности, основанные на использовании функциональных продуктов, базируются на результатах современных исследований в области биотехнологии, медицины и нутрициологии.

Организм человека неразрывно связан с населяющими его микроорганизмами, представляющими собой нормальную микрофлору и формирующими его микробиоценоз. Равновесие этой системы зависит от физиологических и иммунных особенностей макроорганизма и в то же время от видового и количественного состава микроорганизмов, а также их биохимической активности.

К безусловно полезным микроорганизмам относятся бифидобактерии. Многочисленными исследованиями установлено, что в кишечнике здорового взрослого человека содержание бифидобактерий составляет более 60% общего количества кишечной микрофлоры, а у детей раннего возраста оно достигает 90%. Особая роль бифидобактерий состоит в регулировании состава кишечной микрофлоры, поскольку при их нормальном количестве и качественном состоянии отмечается баланс всех остальных членов микробиоты, в свою очередь опосредованно обеспечивающий состояние непроницаемости кишечного барьера для чужеродных антигенов и других патогенных агентов. Известно, что потребление в качестве корректоров нарушенной кишечной микрофлоры пищевых продуктов или препаратов, содержащих только бифидобактерии, эффективно устраняет явления дисбактериоза и дисбиоза в целом.

В связи с этим, учитывая огромное количество воздействующих на человека факторов экзогенного характера, угнетающих бифидобактерии и другие анаэробные индигенные бактерии в кишечнике, необходимо поддерживать их постоянно, всю жизнь, а в случае расстройств - своевременно восстанавливать с помощью фармакопейных препаратов, БАД и функциональ-

ных пищевых продуктов. Эффективность бактериальных препаратов во многом зависит от уровня жизнеспособности пробиотических микроорганизмов в процессе хранения, при воздействии технологических факторов и в агрессивной среде желудка.

Известно, что пребиотики стимулируют активность бифидобактерий и способствуют адгезии лакто- и бифидобактерий на внутренней поверхности кишечника. Пребиотики устойчивы к действию пищеварительных соков и ферментов, благодаря чему они не адсорбируются и не гидролизуются в верхнем отделе ЖКТ, доходя без изменений до места обитания лакто- и бифидобактерий. Пребиотики из группы пищевых волокон быстрее и в большем количестве доставляют пробиотические бактерии в нижние отделы кишечника.

Поэтому приоритетной био.технологической задачей является создание пробиотического препарата, содержащего высокое количество жизнеспособных клеток бифидобактерий, способных адаптироваться в желудочно-кишечном тракте человека и возобновить активный метаболизм. Для повышения функциональных свойств бифидобактерий используют различные технологические приемы, в частности микрокапсулирование, иммобилизацию клеток бактерий на различных носителях, таких как альгинат кальция, активированный уголь, оксид алюминия. Перспективным способом является использование пищевых волокон для адсорбции на них бифидобактерий.

Ценным источником пищевых волокон являются жмых кедрового ореха и злаковые культуры. Повышенное содержание в кедровом жмыхе белковых фракций, микроэлементов, жира, незаменимых аминокислот и витаминов свидетельствует о высоком пребиотическом потенциале.

Благодаря химическому составу и свойствам злаковые культуры являются ценным сырьем и применяются в производстве продуктов функционального питания. В связи с этим исследование их бифидогенных свойств -перспективное направление, благодаря которому появляется возможность создания эффективных пробиотических препаратов.

Глава 1. Состояние вопроса и задачи исследования

1.1 Современные представления о пробиотиках и пребиотиках

Пробиотики и пребиотики в настоящее время широко применяют в производстве БАДов и функциональных продуктов питания ежедневного рациона человека [2, 8, 11].

Пробиотики, по определению термина, приведенного в российском терминологическом стандарте ГОСТ Р 52349-2005, - это функциональные пищевые ингредиенты в виде препаратов, БАД или в составе пищевых продуктов,.состоящие из полезных живых микроорганизмов, оказывающие благоприятное воздействие на организм благодаря нормализации состава или повышению активности нормальной микрофлоры кишечника [63]. Соответственно, пробиотическим пищевым продуктом называют функциональный пищевой продукт, содержащий в качестве физиологически функционального пищевого ингредиента специально выделенные штаммы полезных для человека (непатогенных и нетоксигенных) живых микроорганизмов, которые благоприятно воздействуют на организм человека через нормализацию микрофлоры пищеварительного тракта. Сегодня пробиотические культуры, рекомендованные НИИ питания РАМН, представлены микроорганизмами родов Bifidobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Propionibacterium [84, 85, 134].

В России до 80% используемых пробиотических культур представлено бифидобактериями, в частности видами: В. bifidum, В. longum, В. adolescen-tis, В. breve, В. infantis, В. lactis, В. animals.

Применяемые на практике препараты пробиотиков должны иметь четкие физиолого-биохимические и генетические маркировки, а также стабильные характеристики клинической и технологической эффективности [70, 86].

Необходимым качеством пробиотиков, обеспечивающим их физиологическое действие, являются высокая скорость роста и совместимость с другими микроорганизмами, присутствующими в желудочно-кишечном тракте,

минимальная способность микроорганизмов-пробиотиков к транслокации из просвета пищеварительного тракта во внутреннюю среду организма. Длительное использование пробиотических препаратов не должно вызывать побочных эффектов [23, 52, 82].

К основным процессам, обеспечивающим положительные эффекты пробиотиков, относятся: ингибирование роста потенциально вредных микроорганизмов в результате продукции антимикробных субстанций, активации иммунокомпетентных клеток; стимуляция роста представителей микрофлоры в результате продукции витаминов и других ростостимулирующих факторов; нейтрализация токсинов и нормализация рН; изменение микробного метаболизма, проявляющееся в повышении или снижении активности ферментов [8, 18, 59].

Специфическая активность разных пробиотических микроорганизмов заключается в наличии антибактериальной и антимутагенной, антиканцерогенной активности; способности к снижению уровня сывороточного холестерина, улучшения метаболизма лактозы; стимуляции иммунной системы [19].

В настоящее время идентифицированы 44 вида бифидобактерий (от лат. bifidus — раздвоенный, расщепленный надвое), объединенных в род Bifidobacterium, который относится к семейству Actinomycetaceae.

Наиболее изучаемыми видами бифидобактерий являются В. bifidum, В. longum, В. adolescentis, В. breve, В. infantis, В. lactentis, В. liberorium и т.д.

Бифидобактерии - это грамположительные, анаэробные, бесспоровые, неподвижные палочки, (0,5-1,3) х (1,5-8) мкм. Бифидобактерии представляют собой чрезвычайно вариабельные по форме палочки - прямые, изогнутые, разветвленные, раздвоенные Y- или V-формы, булавовидные и лопатовид-ные. Полиморфизм является характерным свойством бифидобактерий: в мазках молодой культуры встречались неразветвленные особи, а более старой -ветвящиеся или с булавовидными утолщениями на концах, иногда неравномерно окрашенные, гранулированные палочки.

Среди штаммов, выделенных из кишечника взрослых людей, преобладают палочковидные и булавовидные формы: ветвящиеся палочки чаще встречаются у детей грудного возраста. На ранних стадиях развития преобладают палочковидные формы, а при дальнейшем культивировании образуются разветвленные нити с многочисленными перегородками и в основном стволе, и ответвлениях [58].

Форма клеток микроба зависит от различных факторов: условий культивирования, возраста культуры, изменения состава питательных сред, изменения рН среды и др. И если многие авторы, описывая морфологию бифидо-бактерий, были единодушны, отмечая их полиморфизм, то в отношении причин, его вызывающих, мнения были противоречивы [11, 50, 132].

Все виды бифидобактерий при первичном выделении являются строгими анаэробами. В присутствии углекислого газа они могут быть толерантными к кислороду. При лабораторном культивировании эти микроорганизмы приобретают способность развиваться в присутствии некоторого количества кислорода, а высокопитательных средах - расти в полностью аэробных условиях [50]. Чувствительность к кислороду у многих штаммов варьирует, что обусловлено различиями в механизме брожения. Некоторые виды могут расти в атмосфере воздуха, обогащенного 10%-ным СОг. Оптимальной является температура (37-41)°С. Оптимальное значение рН (6-7), при рН ниже 4,5 и выше 8,5 рост микроорганизмов прекращается.

Бифидобактерии являются хемоорганотрофами, активно сбраживают сахарозу, галактозу, фруктозу, мелибиозу, раффинозу, лактозу и др., с образованием в основном уксусной и молочной кислот в молярном соотношении 3:2. Образуют примеси муравьиной и янтарной кислот, а также этанола. Масляную, пропионовую кислоты и СОг не образуют. Для роста на питательных средах нуждаются в добавлении витаминов.

Бифидобактерии не продуцируют каталазы, не образуют индол и сероводород, не восстанавливают нитраты, не разжижают желатин. Они не продуцируют фенол, не образуют аммиак из аргинина. При развитии в лакмусо-

вом молоке бифидобактерии вызывают частичное или полное его восстановление.

Бифидобактерии сбраживают сахар с образованием молочной кислоты в качестве основного конечного продукта. Однако суммарное уравнение носит особый характер и не соответствует ни гомоферментативному, ни типичному гетероферментативному молочнокислому брожению (формула 1).

2 глюкоза----------------------3 ацетат + 2 Ь-лактат. (1)

Этот вид брожения имеет единственный в своем роде биохимический механизм превращения глюкозы.

Как и при расщеплении по Т[ути Эмбдена-Мейергоффа, глюкоза сначала фосфорилируется в положении 6, а затем превращается во фруктозо-6-фосфат. Расщепление связи С2-С4 во фруктозо-6-фосфат сопровождается присоединением неорганического фосфата. Последующей реакцией между эритрозо-4-фосфатом и фруктозо-6-фосфатом начинается сложный ряд взаимных превращений сахарофосфатов, в результате чего в конечном счете образуются 2 моля ацетилфосфата и 2 моля глинеральдегида-3-фосфата. Из ацетилфосфата получается ацетат, а триазафосфат через пируват превращается в лактат. В энергетическом отношении это брожение несколько более эффективно, поскольку оно дает 5 молей АТФ на каждые 2 моля сброженной глюкозы. Имеются данные, указывающие, что бифидобактерии продуцируют Ц+) молочную кислоту, которая является для млекопитающих физиологически активной формой, целенаправленно используется организмом, тогда как Б-молочная кислота не устанавливается. В организме человека молочная кислота образуется в больших количествах и играет важную роль в метаболизме. Однако следует отметить, что только Ц+)-молочная кислота служит источником энергии для сердца, скелетных мускул, печени, почек, мозга и сжигается до СО2 и воды, а также используется в цикле глюкозы для образования гликогена и животного крахмала [81].

Некоторые штаммы бифидобактерий растут при наличии азотфикси-рующих олигасахаридов - М-ацетил-глюкозамина, М-ацетил-галактозамина

1Ч-ацетил-манозамина и др., которые отсутствуют в коровьем молоке (содержатся в женском молоке). Присутствие таких соединений в молоке делает его наиболее благоприятной средой для бифидобактерий, и, вероятно, именно этим объясняется их преобладание в кишечной микрофлоре грудных детей. Благодаря исследованиям японских ученых бифидофактор был идентифицирован и компоненты его выделены в чистом виде. В последующем оказалось, что стимулирующей рост активностью в отношении к различным штаммам бифидобактерий обладают различные производные пантотеновой кислоты. Констатировано, что бифидобактерии, подобно молочнокислым бактериям, обнаруживают абсолютную зависимость от производных пантотеновой кислоты. Имеются сведения о выделении бифидус-факторов или их синтеза на основе аминокарбонильных реакций [132].

Особый интерес в последние годы проявляется к олигосахаридам женского молока. Как известно, главным углеводом молока является лактоза. Установлено, что этот дисахарид сопровождается небольшим количеством других олигосахаридов. Различные группы олигосахаридов женского молока обладают различными видами активности. Считают, что олигосахариды, содержащие М-ацетил-глюкозамин, обладают действием, стимулирующим рост В. Ыйскдт. В настоящее время установлено, что микроорганизмы В. ЫАёит нуждаются в качестве ростового фактора в Ы-ацетил-О-глюкозамине в виде Р-гликозидов или концевого восстанавливающего сахара в 4-0-Р замещенных ди- и олигосахаридов. Причина ростовой активности этих двух типов производных заключается, по-видимому, в том, что они могут превращаться в обычный предшественник мурамовой кислоты, который является важным компонентом клеточных стенок некоторых бактерий [10,