автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Разработка метода количественного определения ДНК в соевых белковых препаратах и оценка влияния генной модификации на функционально-технологические свойства продуктов переработки сои

Московский государственный университет прикладной биотехнологии

На правах рукописи

Логинова Елена Николаевна

РАЗРАБОТКА МЕТОДА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДНК В СОЕВЫХ БЕЛКОВЫХ ПРЕПАРАТАХ И ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ГЕННОЙ МОДИФИКАЦИИ НА ФУНКЦИОНАЛЬНО - ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПРОДУКТОВ ПЕРЕРАБОТКИ СОИ

Специальность 05.18.07- биотехнология пищевых продуктов (перерабатывающие отрасли АПК)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата технических наук

Москва 2004

Работа выполнена в отделе специализированного питания ПНИЛЭФМОПП и на кафедре «Химия пиши и биотехнология» Московского государственного университета прикладной биотехнологии (МГУПБ).

Научный руководитель: академик РАСХН, профессор К.Г. Скрябин

Научный консультант: кандидат химических наук В.В. Сучков

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор АФ.Валихов доктор технических наук, профессор Л.С. Кудряшов

Ведущее предприятие:

Всероссийский государственный научно-исследовательский институт животноводства

Защита диссертации состоится «_»

2004 г. в

часов на заседании

диссертационного совета при Московском государственном университете прикладной биотехнологии по адресу: 109316, Москва, ул. Талалихина, д. 33, Конференц-зал. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУПБ.

Автореферат разослан « »

2004 г.

Учёный секретарь диссертационного совета Д 212.149.01, к.т.н., проф.

Забашта А.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы ■ В настоящее время во всем мире происходит, активное ' внедрение генетически модифицированных растений (ГМР) в практику сельского хозяйства. В период с 1999 по 2001 год площади, занимаемые трансгенными культурами, возросли с 39,9 млн. га до 52,6 млн. га. На сегодняшний день в России сертифицированы 12 сортов -ГМР, в том числе соя, продукта переработки которой широко используются в пищевой промышленности. В 2003 году доля генетически модифицированной сои в общем объёме мирового производства составила 67%. Россия обеспечивает потребности народного: хозяйства в сое и продуктах её переработки па 80% за счёт импортируемого сырья. Таким образом, можно заранее предположить, что не менее 50% сои, поступающей на внутренний российский рынок, является генетически модифицированной.

Существует опасение, что практическое использование генетически

модифицированных источников может быть сопряжено с рядом потенциальных рисков для окружающей среды, здоровья человека и животных, для сохранения устойчивого биологического разнообразия. Государственная система контроля за качеством- и безопасностью продуктов из генетически модифицированных источников, в Российской Федерации нуждается в разработке дополнительных методов исследований. Планируется, что биохимическая часть анализа пищевых продуктов из генетически модифицированных источников будет включать следующие этапы: 1) определение наличия ДНК в пищевых, продуктах, 2) выделение ПЦР-пригодной ДНК, 3) анализ ДНК на содержание генетически модифицированных источников. В данной работе основное внимание будет уделено первому • этапу - выбору и оптимизации наиболее адекватного метода для конкретного продукта (соевого белкового препарата). Данный метод должен отвечать следующим критериям: адаптированность к техническим возможностям лабораторий системы Санитарно-' эпидемиологического надзора, достаточная простота в исполнении, получение достоверных и воспроизводимых результатов.

В соответствии с принятыми порядками проведения анализа пищевой продукции на безопасность и качество и регистрации пищевой продукции, полученной из генетически; модифицированных источников, помимо медико-биологической и медико-генетической экспертизы в Российской Федерации предусмотрено проведение технологической - экспертизы. В нашей стране разрешено использование в пищевых продуктах белковых: препаратов, полученных из семян трансгенной сои трёх сортов - сорт Round Up Ready 40-3-2 производства компании Monsanto Со (США), а также сорта Liberty Link А2704>-^ 12 и .'Liberty Link А5547-127 производства компании Aventis (Германия). Производите-in пищевых продуктов заинтересованы в том, чтобы белковые препараты из трансгеиыой . сои по функциональным свойствам были сопоставимы с аналогичными препаратами из традиционных сортов сои. В связи с этим, большой интерес представляет изучение функциональных свойств соевых белковых препаратов из трансгенной сои в.сравнснии с их аналогами из немодифицированной сои. I'OC НАЦИОНАЛ ЬНАЯ I

библиотека I

С Петер

о» ¡fflsagag 1

Для каждого вида белковых препаратов существует свой набор функциональных свойств, обусловленный спецификой использования в конкретных пищевых технологиях. Отсутствие достоверных различий в функциональных свойствах изученных образцов белковых препаратов может являться подтверждением идентичности генетически модифицированных источников и традиционных аналогов с точки зрения их использования в пищевых технологиях. Наличие существенных различий определит необходимость разработки рекомендаций к использованию белковых препаратов из генетически модифицированной сои в пищевых производствах.

В связи с вышеизложенным, разработка метода количественного определения ДНК в соевых белковых препаратах, а также изучение функциональных свойств белковых препаратов из трансгенной сои представляют собой весьма актуальное направление исследований и имеют большое значение для усовершенствования системы контроля за качеством и безопасностью продуктов, полученных из генетически модифицированных источников.

Цель и задачи исследования Целью настоящей диссертационной работы являлась разработка метода количественного определения ДНК в соевых белковых препаратах и оценка влияния генной модификации на функционально-технологические свойства продуктов переработки сои. В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи.

1. Изучение методов выделения и определения содержания ДНК в различных объектах; теоретически обоснованный выбор наиболее подходящего метода выделения и метода количественного определения ДНК для дальнейших исследований.

2. Разработка и совершенствование метода количественного определения ДНК в соевых белковых препаратах на основании выбранных методов.

3. Сравнение усовершенствованного метода количественного определения ДНК с аналогичными используемыми методами.

4. Определение содержания ДНК усовершенствованным методом в различных белковых препаратах.

5. Сравнение функционально-технологических свойств соевых белковых препаратов из генномодифицированного сырья с их традиционными аналогами.

Научная новизна Заложена основа классификации продуктов питания с точки зрения пищевой безопасности и обязательной маркировки на содержание ГМИ. Выбран и адаптирован к условиям поточного проведения анализов наиболее достоверный метод определения содержания ДНК в исследуемых пищевых продуктах.

На примере модельных систем (соевых белковых препаратов) показано, что выбранный и усовершенствованный метод количественного определения ДНК при помощи дифениламина дает адекватные результаты.

Определено содержание ДНК усовершенствованным методом в соевых белковых препаратах различной степени очистки.

Проведено сравнение аминокислотного состава СБП немодифицированной сои и их трансгенных аналогов. Установлено, что белки ГМ сои по содержанию незаменимых аминокислот не уступают традиционным аналогам.

Изучены функционально-технологические свойства соевых белковых препаратов, полученных из ГМ источников, в сравнении с их традиционными аналогами с целью объективной оценки возможностей их использования в пищевом производстве.

Практическая значимость Разработан прикладной метод количественного определения ДНК в соевых белковых препаратах, адаптированный к техническим возможностям лабораторий системы Санитарно-эпидемиологического надзора. Изучено влияние различных физико-химических факторов на данные методы и даны практические рекомендации по их использованию. Усовершенствованный метод подготовлен к включению в новую редакцию «Методических указаний по медико-биологической оценке новых видов пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников. МУК 2.3.2.970-00». Установлено, что генная модификация не оказала существенного влияния на функциональные свойства белковых препаратов из трансгенной сои и показана возможность использования препаратов из трансгенной сои в пищевой промышленности без изменения технологических режимов и рецептур.

Апробация работы Результаты диссертационной работы обсуждались на межлабораторном коллоквиуме Центра «Биоинженерия» РАН; были представлены на научно-практической конференции «Технологические аспекты комплексной переработки сельскохозяйственного сырья при производстве экологически безопасных продуктов общего и специального назначения» (2002 г., Углич); 2-ой Всероссийской научно-технической конференции «Современные достижения биотехнологии» (2002 г., Ставрополь); 1-м Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (2002 г., Москва); международной научно-практической конференции «Системные технологии продовольственного сырья и пищевых продуктов» (2003 г., Волгоград).

Публикации По результатам проведённых исследований опубликовано 7 работ.

Структура и объём работы Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, глав экспериментальной части, выводов, списка литературных источников и приложения. Работа содержит страниц машинописного текста, таблиц, рисунка. Библиография включает наименований. Приложения к диссертации представлены на страницах.

Список сокращений, используемых в работе

1. ГМ - генетически модифицированный

2. ГМИ - генетически модифицированный

10. ТАЕ - трис-ацетатный буфер

11. ВУС - водоудерживающая

источник

3. ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

4. СБП - соевый белковый препарат

5. СБИ - соевый белковый изолят

6. СБК - соевый белковый концентрат

7. СМ - соевая мука

8. ДФА - дифениламин (-овый)

9. ПЦР - полимеразно-цепная реакция

способность 12. ЖУС - жироудерживающая

способность 13. ККГ - критическая концентрация

гелеобразования 14. ЭС - эмульсионная стабильность

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы диссертации, определена цель и основные задачи работы.

В обзоре литературы изучены современные подходы к оценке безопасности генетически модифицированных источников пищи и рассмотрено законодательное и нормативное регулирование в области генно-инженерной деятельности в России. На основании того, что белковые препараты, полученные из семян ГМ сои, разрешены в России для использования в пищевых продуктах, проанализированы сведения о соевых белках, их питательных характеристиках. и функционально-технологических свойствах СБП. Представлены данные о биохимии нуклеиновых кислот. Проведён аналитический обзор патентной и научно-технической литературы, касающейся методов выделения, очистки и количественного определения ДНК, а также способов очистки, приготовления и хранения химических реактивов.

На основании анализа литературных данных сформулированы цели и задачи исследования.

В главе «Организация экспериментальных исследований» представлена схема проведения эксперимента (рисунок 1), приведены характеристики объектов исследования. Основными объектами являлись соевые белковые препараты различной степени очистки: СМ полножирная Stemsoy (компания Stem Lecitin & Soja GmbH & Co. KG, Германия), CM обезжиренная Nutrisoy 7B (компания ADM, США), CM обезжиренная 200/20 и 200/70 (обе-OOO Агенда, Россия), СМ обезжиренная лецитинированная термически обработанная СОПРОЛЕЦ-8-ТБ-325 и СМ обезжиренная текстурированная СОПРОТЕКС-Н (обе-ЗАО Вобекс- Интерсоя, Югославия), соевый белок тскстурированный Текстратеин (ООО Агенда, Россия), СБК Arcon F, Arcon S (оба-компания ADM, США), СБК Либерти Линк А 2704, Либерти Линк А 2704-12, Либерти Линк А 5547, Либерти Линк А 5547-127 (все четыре концентрата-компания Авентис КропСайенс ГмбХ, США), СБК Кропоткин (ООО Кропоткин ФКХ АККОР-АГРО, Россия), СБК Unico HS (компания Биостар трейд, Россия), СБИ Ardex F

(компания ADM, США), СБИ Supro 500E, Supro 760, Supro EX 33 (все три-компания PTI, США), СБИ Unisol S, Unisol DP (оба-компания Биостар трейд, Россия), СБИ ProSoy YHD-908 (компания Миннесота трейд, США), а также препарат ДНК из молок лосося (компания Pharmacia, США).

Экспериментальные исследования по разработке метода количественного определения ДНК, а также изучения функциональных свойств соевых белковых препаратов проводились в отделе специализированного питания ПНИЛЭФМОПП, а также на кафедре «Химия пищи и биотехнология» Московского государственного университета прикладной биотехнологии.

Очистка химических реактивов производилась в лаборатории тиофосфорорганических соединений Института элементоорганических соединений РАН им. А.Н. Несмеянова.

Выделение и количественное определение ДНК альтернативным методом для сравнения с модифицированными в данной работе методами осуществлялось в лаборатории молекулярной генетики и цитогенетики животных отдела биотехнологии Всероссийского государственного научно-исследовательского института животноводства РАСХН.

Для разработки метода количественного определения ДНК в соевых белковых препаратах использовались: метод спектрофотометрического определения суммарного содержания нуклеиновых кислот (в модификации А.С. Спирина) (1) и метод количественного определения ДНК с дифениламином (по Гловеру) (2).

Очистка химических реактивов осуществлялась согласно установленным методам, используемым в научной практике (3,4).

Для сравнения с усовершенствованным методом количественного определения ДНК были выбраны: выделение ДНК при помощи фенола и хлороформа (5), выделение ДНК перхлоратным методом (6) и спектрофотомерическое определение концентрации ДНК при 260 нм (7). Оценка качества выделенной ДНК и степени ее деградации осуществлялась электрофоретическим методом (8). Для определения содержания ДНК в соевых белковых препаратах использовался усовершенствованный метод количественного определения ДНК (9). При сравнении функциональных свойств белковых препаратов из транс генной и нетрансгенной сои определяли: рН суспензий препаратов (10) - потенциометрическим методом, растворимость белка (11) - спектрофотометрическим методом, критическую концентрацию гелеобразования препаратов (12) - методом, разработанным в МГУПБ, водоудерживающую (13), жироудерживающую (14) способности препаратов, эмульсионные свойства препаратов (15) - методом центрифугирования. Определение аминокислотного состава исследуемых белков (16) осуществлялось на автоматическом анализаторе аминокислот ААА 339М (Microtechna, Praha).

Обработка экспериментальных данных осуществлялась методами математической статистики. Повторность измерений 3-10 - кратная.

Рисунок 1 - Схема проведения эксперимента

б

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Разработка требований к качеству используемых реактивов

Целью первого этапа работы было формулирование требований к качеству используемых реактивов, поскольку качество поступающих в продажу препаратов в ряде случаев не достаточно для проведения эксперимента. В результате проведённых исследований сформулированы следующие требования к качеству реактивов:

дифениламин квалификации хч свежеперекристаллизованный в токе аргона (ГОСТ 5825-51), t„„=54°C;

кислота уксусная ледяная квалификации хч свежеперегнанная, предварительно очищенная от примесей карбонильных соединений (ГОСТ 61-75), tBm=118-119°C; кислота хлорная квалификации хч (ТУ 6-09-2878-78), 1™,,=110°С; ацетальдегид квалификации хч в запаянных ампулах (ГОСТ 9585-77), tkl,n'= 20,2°С; вода бидистиллированная или деионизированная (ГОСТ 6709-72) 1кИП:= 100°С.

По физико-химическим характеристикам используемые в эксперименте реактивы соответствовали характеристикам, приводимым в справочной литературе.

Модификация методов выделение и количественного определения ДНК

В результате рассмотрения ряда способов выделения ДНК из тканей был выбран метод выделения при помощи хлорной кислоты по Шмидту и Таннгаузеру в модификации А.С. Спирина.

Количественное определение ДНК осуществлялось дифениламиновым методом, что позволило исключить при выделении ДНК стадии осаждения и ресуспендирования ДНК, и, соответственно, повысить точность эксперимента.

Выделение ДНК при помощи хлорной кислоты из соевых белковых

препаратов

На данном этапе работы осуществлялся подбор режимов экстракции ДНК.

Экстракция ДНК из препарата проводилась 0,5М раствором хлорной кислоты, т.е. в условиях, при которых белки, являющиеся основной составляющей частью соевых препаратов и мешающие определению ДНК, не экстрагируются.

В качестве объекта исследований для этого и последующих экспериментов был выбран соевый белковый препарат мука обезжиренная Nutiisoy 7B производства компании ADM. Мука является одной из наименее очищенных форм соевых белковых препаратов и, следовательно, должна сохранять большее количество ДНК в наименее поврежденной форме.

Определено влияние температуры на экстракцию ДНК из соевых белковых препаратов (рисунок 2).

В соответствии с результатами эксперимента выбрана температура процесса 85°С, стабильно поддерживаемая термостатом и обеспечивающая достаточную полноту экстракции ДНК из препарата.

Рисунок 2 - Влияние температуры на экстрагируемость ДНК из соевой обезжиренной муки NutIisoy 7В

Установлено оптимальное соотношение соевого препарата и экстрагента. Зависимости концентрации ДНК в экстракте от выбранного соотношения, представленные на рисунке 3, отображают два режима экстракции: при температуре 20°С. и при температуре 85°С. В результате исследований выбрано соотношение препарата и экстрагента 1:20, позволяющее наиболее полно выделять ДНК и получать результаты в области максимальной точности показаний спектрофотометра.,

Рисунок 3 - Влияние соотношения • препарата и экстрагента на экстрагируемость ДНК из соевой обезжиренной муки ШйшУ 7B

Определена продолжительность экстракции ДНК. Результаты, приведенные на рисунке 4, показывают, что обработка соевого препарата в течение 1 часа достаточна для полной экстракции ДНК.

Рисунок 4 — Влияние продолжительности экстракции на экстрагируемость ДНК из соевой обезжиренной муки ШйкСУ 7B

Количественное определение ДНК дифениламиновым методом

На данном этапе исследований осуществлён подбор оптимального соотношения раствора проэкстрагированной ДНК и дифениламинового реактива, что позволило повысить чувствительность метода. Результаты эксперимента, представленные на рисунке 5, показывают, что оптимальной дозой вносимого экстракта является 0,5 мл на 5 мл дифениламинового реактива, т.е. в соотношении 1:10.

Рисунок 5 - Выбор соотношения экстракта ДНК и дифенил-аминового реактива. Удфа реактива=5 мл

Установлены пределы линейной зависимости оптической плотности реакционной смеси от содержания ДНК в пробе для построения калибровочной кривой. С этой целью был приготовлен ряд разведений стандартной ДНК с концентрацией 0,05-0,5 мг/мл и приготовлены пробы, содержащие 0,5 мл раствора ДНК и 5 мл дифениламинового реактива. Результаты, представленные на рисунке 6, показывают, что линейная зависимость сохраняется в интервале концентраций ДНК 0-0,3 мг/мл (в исходных разведениях), а при концентрации ДНК выше 0,35 мг/мл происходит насыщение дифениламинового реактива. Следовательно, для построения калибровочной кривой рекомендуются разведения стандартной ДНК объёмом 0,5 мл в интервале концентраций 0,05-0,3 мг/мл. Определено максимально возможное количество ДНК, реагирующее с единицей объёма дифениламинового реактива. Оно составило 0,035 мг/мл дифениламинового реактива.

Рисунок 6 - Зависимость оптической плотности пробы при 600 нм от концентрации вносимого р-ра ДНК Ур-ра днк=0,5 мл, Удфа реактива=5мл

Хлорная кислота 0,5М является сильным гидролизующим агентом, разрушающим N гликозидные связи в молекуле ДНК. Расщепление К-гликозидных связей в молекулах ДНК влечёт за собой их деполимеризацию. В этой связи было исследовано влияние

0.5М хлорной кислоты на результаты определения содержания ДНК. Для исследования был взят раствор стандартного препарата очищенной ДНК из молок лосося в известной концентрации 0.5 мг/мл. Результаты, представленные на рисунке 7, показывают, что гидролиз молекулы ДНК под действием 0.5М хлорной кислоты не влияет на данные, получаемые при определении ДНК дифениламиновым методом.

о. г

Л X ¡1 ¡1

к гГ га и

О

X Х

£ ч: »-

с га О о-

0,6 0.5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

□ Контрольная проба (раствор ДНК в дистиллированной воде).

□ Раствор ДНК в 0,5 М хлорной кислоте.

Рисунок 7 - Влияние обработки ДНК из молок лосося 0,5 М хлорной кислотой на результаты определения содержания ДНК

0,5 1 1.5 2

Продолжительность обработки, час.

Определение концентрации ДНК запасного раствора

Количественное определение содержания ДНК в препарате дифениламиновым методом осуществляется посредством сравнения оптической плотности пробы, содержащей проэкстрагированную ДНК, при 600 нм с калибровочной кривой, построенной по значениям известных разведений стандартной ДНК. В связи с этим необходимо точно знать концентрацию ДНК в запасном растворе, из которого готовятся разведения для построения калибровочной кривой. Для определения содержания ДНК в запасном растворе была использована следующая формула:

где:

~1япяного р-ра

- расчётная концентрация ДНК в запасном растворе, мг/мл;

Огбо'см - оптическая плотность разбавленного раствора при 260 нм в кювете толщиной 1 см;

Азбо - коэффициент экстинкции раствора ДНК с концентрацией 1 мг/мл при 260 нм, равный 20,0;

УоОш. - объём раствора ДНК после разбавления, 5 мл; ^пробы - объём исходного раствора ДНК (с концентрацией к 1 мг/мл). За истинную концентрацию ДНК в запасном растворе принимается среднее арифметическое из рассчитанных по формуле концентраций (готовится не менее 6 разведений исходного раствора).

На основании результатов проведённых исследований предложена следующая методика количественного определения ДНК, выделенной из соевых белковых препаратов.

Дифениламиновый метод количественного определения ДНК

Реактивы.

1. Раствор хлорной кислоты с концентрацией 0,5 моль/л. Полученный раствор хранить в закрытой посуде в вытяжном шкафу.

2. Раствор дифениламина в ледяной уксусной кислоте. Все компоненты этого раствора относятся к вредным веществам, в особенности дифениламин, поэтому готовить реактив необходимо под тягой:

а) в конической колбе, обернутой алюминиевой фольгой, для защиты приготовленного раствора от света, смешать 250 мл ледяной уксусной кислоты, 15,2 мл хлорной кислоты (43%) и 2 мл (16 мг/мл) ацетальдегида;

б) взвесить (используя перчатки) 7,5 г дифениламина, внести навеску в раствор ацетальдегида и встряхивать смесь, пока весь дифениламин не растворится. Этот раствор можно хранить в течение шести недель при комнатной температуре в темноте. Колбу или кислотницу с раствором следует держать в вытяжном шкафу.

3. Запасной раствор ДНК с концентрацией 0,1%. Измерить в нём точное содержание ДНК на спектрофотометре при длине волны 260 нм. Из запасного раствора приготовить ряд разведений ДНК с концентрациями 20-500 мкг/мл для построения калибровочной кривой.

Навеску исследуемого препарата массой 0,5 г диспергировать в 10 мл 0,5 М хлорной кислоты на магнитной мешалке. Колбу закрыть пробкой с воздушным холодильником и термостатировать суспензию при 85°С в течение 1 часа. Эта процедура обеспечивает количественную экстракцию нуклеиновых кислот из исследуемого материала. Экстракт охладить до комнатной температуры и центрифугировать при 4000 об./мин. в течение 20 минут (использовалась центрифуга МР^^-340). Супернатант используется для количественного определения ДНК дифениламиновым методом.

Супернатант и растворы стандартной ДНК смешать с дифениламиновым реактивом в соотношении 1:10. Пробы термостатировать при температуре 37°С в темноте в течение 16-20 часов. В том случае, если время инкубации точно не выдерживается, калибровочная кривая с использованием стандартных растворов ДНК каждый раз строится заново.

Центрифугировать пробы (центрифуга МР^^210, 7000 об/мин., 15 мин.) и определить оптическую плотность растворов при 600 нм и 700 нм. Построить калибровочную кривую по разнице оптических плотностей (между оптической плотностью при 600 нм и фоновой при 700 нм). Оптическую плотность исследуемой пробы соотнести с калибровочной кривой и определить концентрацию ДНК в растворе.

Результат пересчитать при необходимости на навеску препарата, на сухой вес препарата, либо на содержание белка в препарате.

В таблице 1 приведено содержание ДНК в различных соевых белковых препаратах. В соевых белковых препаратах ДНК находится в комплексе с белком, поэтому в таблице 1 показано содержание белка как в мг/г препарата, так и в мг/г белка.

Таблица 1 - Содержание ДНК в соевых белковых препаратах

№ • Наименование препарата Содержание белка, % Содержание ДНК в препарате

мг/г препарата мг/r белка

1 СМ полножир. Stemsoy 42,0 2,8±0,13 7,3±0,36

2 СМ обезжир. лецитинированная терм. обр. Сопролец-8-ТБ-325- 49,0 2,9±0,14 5,9±0,29

3 СМ обезжир. 200/20 50,0 3,7±0,18' 7,4±0,37

4 СМ обезжир. 200/70 50,0 3,6±0,18 7,2±0,3б

5 СМ обезжир. текстурированная Сопротекс-Н 52,0 2,6±0,13 5,0±0,25

6 СМ обезжир. текстурированная Текстратеин 54,0 2,8±0,14 5,2±0Д6

7 СМ обезжир. Nutrisoy 7В 53,0 3,2±0,13 6,0i0,30

8 СБК Либерти Линк А 2704 70,0 3,9±0,19 5,б±0,28:

9 СБК Либерти Линк А 2704-12 70,0 3,8±0,18 5,4±0,27

10 СБК Либерти Линк А 5547 68,0 3,7±0,18 5,4±0,27.

11 СБК Либерти Линк А 5547-127 68,0 3,7±0,18 5,4±0,27

12 СБК ArconF 69,0 2,9±0,14 4,2±0 Л

13 СБК Arcon S 72,0 3,2±0,16 4,4±0,22

14 СБК Кропоткин 64,0 4,0±0,20 6,2±0,31

15 СБК Unico HS 70,0 3,2±0,16 5,0±0,25

16 СБИ Ardex F 90,0 3,0±0,14 3,3±0,15

17 СБИ Supra 500Е 90,0 ЗД±0,15 3,5±0,16

IS СБИ Supro 760 90,0 3,4±0,17 3,8±0,19

19 СБИ Supro EX 33 90,0 3,1±0,14 3,4±0,17

20 СБИ Unisol S 90,0 3,5i0,17 3,9±0,19

21 СБИ Unisol DP 90,0 3,8±0,19 4,2±0,21

22 СБИ ProSoy YHD-908 • 90,0 3,1±0,15 3,4±0,16

Результаты, пересчитанные на содержание белка, показывают, что концентрация ДНК максимальна в препаратах, не подвергавшиеся при изготовлении физико-химическому воздействию т.е. в муке, и составляет порядка 6,0-7,5 мг/г белка. Наименьшее количество ДНК содержится в изолятах и находится в диапазоне 3,0-4,5 мг/г белка. В целом, содержание ДНК не превышает 10,0 мг/г белка. -

В ходе исследований определена точность метода, представляющая собой его суммарную относительную погрешность. Объектами для вычисления погрешности являлись СМ обезжиренная МйПБоу 7В, так как мука - одна из наименее очищенных форм СБП, и соевый белковый изолят 8ирго 500Е. Изоляты являются максимально очищенной формой соевого белка и при изготовлении подвергаются интенсивному физико-химическому воздействию.

Для СМ обезжиренной Nutгisoy 7В экспериментальная погрешность метода составила 4,20%, а для СБИ 8ирго 500Е - 4,77%. Было сделано предположение, что общая погрешность данного метода для СБП различной степени очистки не превышает 5,00%.

Сравнение существующих методов экстракции ДНК с усовершенствованным методом количественного определения ДНК

В настоящее время существует ряд практикуемых методов выделения - ДНК из биологических объектов.

Выделение ДНК при помощи фенола и хлороформа

Одним из классических способов выделения ДНК является метод с использованием фенола и хлороформа. Данный метод характеризуется большими потерями ДНК. Учитывая это обстоятельство, а также то, что белковые препараты содержат небольшие количества ДНК, на стадии освоения метода в качестве объекта исследований оказалось целесообразным использовать - стандартную ДНК из молок лосося. Содержание ДНК определялось спектрофотометрически при длине волны 260 нм и дифениламиновым методом при длине волны 600 нм.

Эксперимент, проведённый в трёх повторениях, показал, что во всех пробах практически вся ДНК теряется во время поэтапной очистки и осаждения. Оказалось очевидным, что для получения реальных результатов необходимо увеличить во много раз количества расходуемых реактивов и исследуемого препарата. Данный метод показал свою неэффективность для работы с малыми количествами ДНК, выделяемыми из соевых белковых препаратов.

Выделение ДНК перхлоратным методом

Усовершенствованный в данной работе метод количественного определения ДНК сравнивали с перхлоратным методом выделения ДНК, разработанным и используемым во ВНИИ животноводства. Данный метод позволяет использовать образцы, содержащие деградированную ДНК (высушенные ткани, консервы, белковые препараты и т.п.). Определение содержания ДНК после выделения её перхлоратным методом осуществлялось

посредством измерения оптической плотности её раствора при 260 нм. Измерения проводились на спектофотометре GeneQuant RNA/DNA Calculator, Pharmacia Biotech (США).

В ходе исследований проведен анализ пяти образцов соевых белковых препаратов. Результаты исследований, представленные в таблице 2, показывают, что прямое спектрофотометрическое определение ДНК при 260 нм даёт завышенные результаты из-за сложностей выделения ДНК.

Для оценки качества выделенной ДНК и степени ее деградации был осуществлен визуальный контроль результата электрофореза полученных образцов ДНК в ультрафиолете после их разделения в 1,8% агарозном геле в буфере ТАЕ (при напряженности электрического поля 6 V/см) С добавлением бромистого этидия до конечной концентрации 30 нг/мл. Анализ изображения и его архивирование осуществляли с использованием программы BioTest, Биоком (рисунок 8). Анализ полученных электрофореграмм позволил сделать вывод о более высокой молекулярной массе ДНК, выделенной из соевой муки обоих наименований, по сравнению с образцами концентрата Arcon F и изолятов Supro 500 Е и ProSoy YHD-908.

При выделении ДНК перхлоратным методом следует учитывать потери, обусловленные, с одной стороны, неполным снятием верхней ДНК-содержащей фракции, с другой стороны, неполной степенью осаждения ДНК спиртосодержащими растворами. Потери ДНК сами по себе не являются недостатком данного метода. Существенным недостатком метода является невозможность точно количественно определить потери ДНК при экстракции существующими стандартными аналитическими методами. В этой связи, исходное количество ДНК в препаратах может быть оценено лишь приблизительно с учетом потерь от 5 до 50% (таблица 2).

Таблица 2 - Содержание ДНК, выделенной перхлоратным и модифицированным методами, в соевых белковых препаратах_

«Г Перхлоратный метод Модифицированный метод

№ образца Название. препарата 5 ю 0 S 1 s? « ° к 6. Содержание ДНК, определённое при 260 нм Содержание ДНК, определённое дифениламиновым методом Содержание ДНК, определённое дифениламиновым методом

О э и мг/г препрата мг/г белка . мг/г препрата мг/г . белка мг/г препрата мг/г белка

1 СБИ Supro500E 90,0 10,5-19,2. 12,3-22,6 2,9-5,6 3,4-6,6 3,2±0,15 3,5±0,16

2 СБИ ProSoy YHD-908 90,0 8,5-15,6 10,1-18,5 3,1-5,8 3,6-6,8 3,1±0,15 3,4±0,16

з: СБК Arcon F 69,0 6,8-12,4 10,8-19,7 2,7-5,2 4,2-8,2 2,9±0,14 4,2±0,21

4 СМ обезжир. NutriSoy 7B 53,0 4,7-8,6 9,8-18,0 2,6-5,0 5,4-10,5 3,2±0,13 6±0,30

5 CM полножйр. SternSoy 42,0 6,4-11,8 16,5-30,4 2,1-4,0 5,4-10,3 2,8±0,13 7,3±0,36

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 7 8 9 10 И 7 8 9 10 11

1а 1Ь 1с

1а: 1-4 -маркер молекулярной массы, ПЦР-фратаент, размер 400 п.н.

7 - проба ДНК из изолята 8ирго500 Е

8 - проба ДНК из изолята Рго8оу УИЭ-908

9 - проба ДНК из концентрата Агсоп Б

10 - проба ДНК из муки обезжиренной №и;п8оу 7В

11 - проба ДНК из муки полножирной 81егп8оу

1Ь, 1с - пробы ДНК из исследуемых образцов при меньшем накоплении

Рисунок 8 - Электрофорез ДНК в 1,8 % агарозном геле

Наличие комплексов частично денатурированных белков с нуклеиновыми кислотами может препятствовать разделению ДНК и белка при экстракции ДНК. Часть белков вместе с ДНК осаждается в спиртосодержащих растворах. Таким образом, при использовании данного метода экстракции не может быть исключено загрязнение препаратов ДНК белками.

Поскольку для измерения концентрации использовался стандартный спектрофотометрический метод, суть которого заключается в измерении степени поглощения ДНК-содержащими растворами ультрафиолетовых лучей с длиной волны 260 нм, наличие примесей белка в растворах может значительно искажать результаты, так как белки также поглощают свет с такой длиной волны. Это может служить объяснением завышенных количеств ДНК в исследуемых образцах по сравнению с разработанным нами методом. Исходя из перечисленных выше недостатков, следует сделать вывод, что стандартные молекулярно-биологические методы экстракции ДНК, в частности, метод экстракции перхлоратом, не может быть использован для количественной оценки содержания ДНК в препаратах.

Изучение функциональных свойств соевых белковых препаратов, полученных из генномодифицированных источников

В данной работе проведено исследование функциональных свойств ряда препаратов с целью установления различий или идентичности между трансгенными и традиционными образцами. Количество функциональных свойств, оцениваемых при контроле качества белковых продуктов, обусловлено областью применения этих препаратов.

Для образцов соевой муки определены следующие характеристики: рН 10%-ной водной суспензии, растворимость и водоудерживающая способность в воде и в 2,5 %-ном растворе хлорида натрия; а также жироудерживающая способность сухих препаратов. Объектами

исследований являлись образцы СМ обезжиренной и СМ текстурированной обезжиренной марки Текстратеин из ГМ сои линии 40-3-2, а также СМ обезжиренная Nutrisoy 7B в качестве традиционного аналога. Результаты определений представлены в таблице 3. Растворимость белка является одной из основных характеристик СБП и определяет его функционально-технологические свойства. Она обусловлена особенностями получения препарата и определяет его использование в пищевых технологиях. Изученные образцы существенно различаются по растворимости. Наиболее высокие значения демонстрируют препарат Nutrisoy 7B из не ГМ сои и 200/70 (ГМ). Наименьшая растворимость - у СМ текстурированной обезжиренной Текстратеин (ГМ). Присутствие хлорида натрия снижает растворимость Nutrisoy 7В, однако, практически не влияет на данный показатель у его ГМ аналогов. Термическая обработка . суспензий в течение 15 мин. при 72°С позволяет значительно повысить растворимость белка (таблицаЗ).

Водоудерживающая способность (ВУС) белкового препарата отражает его способность необратимо связывать и удерживать свободную воду в процессе изготовления пищевых продуктов. ВУС образцов соевой муки из нетрансгенного и ГМ сырья не имеет существенных различий и является достаточно низкой, что характерно для данного класса соевых продуктов (таблица 3).

Жироудерживающая способность (ЖУС) белкового препарата представляет собой максимальное количество добавленного масла, при котором не наблюдается отделения масляной фазы в процессе испытания, в пересчете на 1 г препарата. ЖУС образцов соевой муки 200/20 и 200/70 (ГМ) одинакова и сопоставима со значением данного показателя у соевой муки Nutrisoy 7В из немодифицированного сырья. ЖУС текстурированной муки Текстратеин ниже, чем у остальных образцов,. что, очевидно, объясняется способом изготовления данного продукта (таблица 3).

Рассмотрение продуктов одного класса, изготовленных по разным технологиям, демонстрирует зависимость функциональных свойств препаратов от производственных режимов. Данная особенность подчёркивается при изучении препаратов, полученных из одного сорта сои (в данном случае линии 40-3-2).

Для образцов соевых белковых концентратов определены следующие показатели: рН 5%-ной водной суспензии, водоудерживающая способность, критическая концентрация гелеобразования в воде и в 2,5%-ном растворе хлорида натрия; седиментационная устойчивость эмульсий в воде и в 2,5%-ном растворе хлорида натрия; а также жироудерживающая способность сухих препаратов. Объектами исследований являлись СБК Либерти Линк А2704 и Либерти Линк А5547, и их трансгенные аналоги Либерти Линк А2704-12 и Либерти Линк А5547-127, а также Arcon F (ГМ) и Unico HS (ГМ). По способу изготовления все концентраты серии Либерти Линк и Arcon F относятся к традиционным концентратам, a Unico HS является высокофункциональным. Результаты определений представлены в таблице 4

Растворимость препаратов Либерти Линк по значениям сравнима с растворимостью коммерческого препарата Arcon F, изготовленного по традиционной технологии, и

Таблица 3 - Функционально-технологические свойства соевой муки обезжиренной, изготовленной из нетрансгенного сырья, в сравнении с генномодифицированными аналогами

Название препарата Характеристика препарата

рН 10%-ной суспензии Растворимость, % Водоудерживающая способность, в г воды на г препарата Жироудерживающая способность, в г масла на г препарата

при г=20°С после обработки при Г=72°С

СМ обезжиренная ЫШг^оу 7В в 1юде 6,4±0,1 78,9±3,9 88,9±5,1 3,00±0,25 1,00.Ц>,15

и растворе №С1 2,5% 6,0±0,1 68,9±3,4 76,9±3,8 2,5010,25

СМ обезжиренная 200/20 (ГМ) в воде 6,8*0,2 41 ¿±2,8 69,8±4,0 3,25±0,25 0,75±0,15

в растворе №С1 2,5% ' 6,2А0,1 43Д±2,7 66,4±4,2 3,25±0,25

СМ обезжиренная 200/70 (ГМ) в воде 6,810,1 60,6±3,0 79,5±4,9 3,50*0,25 0,7510,15

в рас творе №С1 2,5% 6,2±0,2 56,8±2,8 81,4±4,7 2,50±0,25

СМ текстуриро ванная обезжиренная Текетратеин (ГМ) в воде 6,91:0,2 31,0±2,1 44,0±2,7 2,50-1-0,25 0,50-4.0,10

в растворе ЫаС1 2,5% 6,3±0,1 26,4±1,9 43,4±2,9 2,5010,25

существенно уступает растворимости высокофункционального концентрата Unico HS. Данные значения растворимости можно объяснить традиционным способом получения концентратов Либерти Линк и Arcon F, при котором соевую муку или обезжиренный шрот подвергают денатурирующему воздействию различных физико-химических факторов, что снижает функциональные свойства соевого белка. Высокофункциональный концентрат Unico HS обладает наилучшей растворимостью, что, очевидно, объясняется новой технологией его изготовления, разработанной специалистами компании (таблица 4).

Исследования ВУС показали, что экспериментальные препараты из трансгенной сои серии Либерти Линк А2704-12 и А5547-127 имеют более высокие значения, чем традиционный концентрат Arcon F, но существенно уступают по аналогичным показателям высокофункциональному концентрату Unico HS (таблица 4).

Критическая концентрация гелеобразования (ККГ) является важнейшей характеристикой гелеобразователей, в данном случае белков. Величина ККГ определяет минимальную концентрацию гелеобразователя в системе, достаточную для образования пространственной сетки во всём объёме системы. ККГ всех экспериментальных образцов СБК серии Либерти Линк сопоставима со значениями данного показателя концентрата Arcon F, изготовленного традиционным способом, и существенно превышает значения высокофункционального концентрата Unico HS (таблица 4).

Эмульсионные и жироудерживающие свойства белка определяют уровень введения в продукт белковых препаратов, который обеспечивает получение устойчивых эмульсий и препятствует отделению жира в процессе технологической обработки. Изучение эмульсионной стабильности (ЭС) показало способность всех исследованных белков, за исключением препарата Arcon F, образовывать устойчивые эмульсии в соотношении препарат:вода:масло 1:5:5. Для препарата Arcon F при введении в суспензию 2,5%-тов хлорида натрия после термообработки и центрифугирования наблюдалось отделение водной фазы (таблица 4). Показатели ЖУС всех концентратов серии Либерти Линк превышают соответствующие значения у коммерческих образцов (таблица 4).

Результаты исследований показали, что по комплексу функциональных "свойств все экспериментальные концентраты серии Либерти Линк соответствуют соевым" белковым концентратам, вырабатываемым по традиционной технологии.

Различия технологических режимов изготовления соевых белков обуславливают разницу в значениях функциональных характеристик для препаратов одного типа, что можно наблюдать при сравнении экспериментальных образцов концентратов серии Либерти Линк, изготовленных по традиционной технологии, и их коммерческого аналога - концентрата Arcon F.

Для образцов соевых белковых изолятов определен тот же комплекс функциональных свойств, что и для соевых белковых концентратов.

Объектами исследований служили: СБИ Unisol S и Unisol DP, полученные из ГМ сои, а также СБИ Supro 500E из немодифицированной сои. Результаты определений представлены в таблице 5.

Таблица 4 - Функционально-технологические свойства соевых белковых концентратов, изготовленных из нетрансгенного сырья, в сравнении с генномодифицированными аналогами

Название препарата Характеристика препарата

рН 5%-ной суспензии Растворимость, % : Водоудержива-ющая способность, в г воды на г препарата Эмульсионная стабильность Критическая концентрация гелсобразо ван и я,% Жироудержи- вающая способность, в г масла на г птзепаоата

С СЧ л после обработки при Т=726С о-Й л после обработки при 1 Х=12ЬС при г=20°С

СБК Либерти Линк А 2704 в воде 6,9Ю,2 51,0±2,6 57,012,9 5,010,5 устойчива устойчива 18,2±1,2 18,211,2 1,0010,15

в растворе ЫаС12,5% 6,3±0,1 48,012,4 51,012,6 4,5±0,5 устойчива устойчива 16,711,1 16,711,1

СБК Либерти Линк А 2704-12 (ГМ) в воде 6,7±0,1 57,012,9 74,013,7 5,5Ю,5 устойчива устойчива 18,211,2 19,011,2 1,0010,15

в растворе КаС] 2,5% 6,210,1 4й,0±2,3 61,013,1 5,010,5 устойчива устойчива 16,711,1 16,7И,1

СБК Либерти Линк А 5547 в иоде б,8±0,2 54,012,7 73,013,7 5,510,5 устойчива устойчива 13,310,8 14,310,9 1,25ЮД0

в растворе №С1 2,5% 6,010,1 52,0±2,6 63,0±3,2 4,5Ю,5 устойчива устойчива 18,211 а 18,211,2 0,5010,10

Продолжение таблицы 4

Характеристика препарата

Название препарата ^ н 2 s 4 £ Растворимость, % rt А * и ¿ 3 я) s о к н S у о й о. 8 « 8* Эмульсионная стабильность Критическая концентрация гелсобразован и я,% Жироудержи- вающая способность, в г масла на г ггоепапата

йч U £ 5 ЕС S-. а " и 55 о I« В 1 после обработки при t=72 С й S u g S¡s 0 о, £ i e! <§ 2 У U к E <N B i после обработки при t=72°C CVrl- в II при t=20°C

СБ К Либерти ЛипкА 5547-127 (ГМ) в воде 6,8Ю,1 01,013, 1 78,0±3,9 4,5Ю,5 устойчива устойчива 18,2il,2 18,2±1,2 1,0010,15

в pací ворс NaCl 2,5% 6,ЗЮ,1 44,013,2 56,0±3,8 4,5Ю,5 устойчива устойчива 18,211,2 20,01.1,2

СБК Лгсоп F в коде 6,710,2 67,4±3,4 75,1 ¿4,1 2,510,5 устойчива устойчива 22,0-tl,3 22,0±l,2 0,50*0,10

(ГМ) в растворе NaCl 2,5% 6,1 ±0,1 66,713,3 74,613,7 2,5Ю,5 устойчива не устойчива 22,011,3 22,0±1,3

СБК Unico I1S в воде 7,310,1 76,0±3,8 97,0±4,9 9,010,5 устойчива устойчива 11,510,8 11,510,8 0,8010,15

(ГМ) в pací ворс NaCl 2,5% 6,810,2 51,0±3,0 64,0*4,2 7,310,5 ' устойчива устойчива 9,510,7 9,510,7 0,5010,10

Таблица 5 - Функционально-технологические свойства соевых белковых изолятов, изготовленных из нетрансгенного сырья, в сравнении с генномодифицироваиными аналогами

Название препарата Характеристика препарата

рН 1%-ной суспензии Растворимость, % Водоудержива-ющая способность, в г воды на г препарата Эмульсионная стабильность Критическая концентрация гслсобразовапия,% Жироудержи- вающая способность, в г масла на г поепаоата

о. о с 11 после прогрева при с=72°С и 52 о С ГЧ 1 после прогрева при 1=72°С &х О ж = о.1 = V

СБИ 5ирга 500Е и воде 7,010,1 66,7±3,3 92,4±4,6 7,010,5 устойчива устойчива 12,0*0,9 12,010,9 1,1010,15

в растворе №С1 2,5% 6,510,1 23,6±2,2 28,412,4 9,010,5 устойчива не устойчива 11,0Ю,8 11,010,8

СБИ ипЬо1 5 (ГМ) в иоде 7,ЗЮ,2 44,012,2 100,015,0 12,010,5 ПС устойчива устойчива 12,5±1,0 12,5± 1,0 0,80Ю,15

в растворе №С1 2,5% №0,1 23,012,2 29,012,5 10,1±0,5 ПС устойчива устойчива 8,5±0,7 8,510,7

СБИ 11т*о1 ПР (ГМ) в иоде 6,9±0,2 24,012,2 51,0±2,6 8,110,5 устойчива устойчива 11,5Ю,8 11,510,8 0,8010,15

в растворе №С1 2,5% 6,510,1 24,012,2 27,0±2,4 6,210,5 устойчива устойчива 12,0Ю,9 12,010,9 0,5010,10

Изоляты 8ирго 500Е и Uniso1 8 обладают схожими значениями растворимости, значительно превышающими значение этого показателя у изолята Uniso1 ЭР. Термообработка препаратов, диспергированных в дистиллированной воде, позволяет увеличить растворимость соевых белков. В то же время, термообработка препаратов, диспергированных в 2,5%-ном р-ре хлорида натрия, весьма незначительно повышает значения растворимости (таблица 5).

Все исследованные изоляты демонстрируют высокие значения ВУС, схожие между собой Присутствие хлорида натрия в системе незначительно снижает ВУС для препаратов Uniso1 8 и Uniso1 ЭР, а для 8ирго 500Е, напротив, повышает (таблица 5).

Для изучения эмульсионных свойств исследуемых изолятов были приготовлены эмульсии в соотношении препарат: вода масло 1:9:9. Все изоляты, за исключением 8ирго 500Е, после термообработки образовывали устойчивые эмульсии. Для препарата 8ирго 500Е при введении в суспензию 2,5%-тов хлорида натрия после термообработки и центрифугирования наблюдалось отделение водной фазы (таблица 5).

По значениям гелеобразующей способности исследованные изоляты не демонстрировали достоверных различий (таблица 5).

Жироудерживающая способность изолятов Uniso1 8 и Uniso1 ЭР незначительно уступает ЖУС 8ирго 500Е (таблица 5).

Рассмотрение однотипных белковых продуктов показывает, что препараты из немодифицированных сортов сои и их трансгенные аналоги, изготовленные по сходным технологиям, не проявляют существенных различий в функциональных свойствах. В то же время, препараты, изготовленные по разным технологиям, могут обладать заметными различиями в функциональных свойствах. Проведенные исследования показали, что для СБП основным фактором, определяющим значения функциональных характеристик, является способ изготовления препаратов.

ВЫВОДЫ

1. Теоретически обоснован выбор методов выделения и количественного определения ДНК для исследований в соответствии с поставленной целью. Выбраны: метод выделения ДНК при помощи хлорной кислоты и дифениламиновый метод количественного определения ДНК.

2. Установлены оптимальные режимы, обеспечивающие полную экстракцию ДНК из соевых белковых препаратов: температура экстракции 85*С, продолжительность экстракции 1 час, соотношение препарат: экстрагент 1:20. Определено оптимальное соотношение экстракта ДНК и дифениламинового реактива 1:10, обеспечивающие высокую чувствительность метода и достоверность получаемых результатов.

3. Проведено сравнение усовершенствованного метода количественного определения ДНК с аналогичными используемыми методами. Установлено, что методы выделения ДНК, использованные для сравнения (экстракция при помощи фенола и хлороформа, перхлоратный метод) не могут быть рекомендованы для количественного определения ДНК в белковых препаратах при проведении массовых анализов.

4. Определено содержание ДНК модифицированным методом в соевых белковых препаратах различной степени очистки. Установлено, что концентрация ДНК максимальна в препаратах, не подвергавшихся при изготовлении интенсивному физико-химическому воздействию т.е. в муке, и составляет порядка 6,0-7,5 мг/г белка. Наименьшее количество ДНК содержится в изолятах и находится в диапазоне 3,0-4,5 мг/г белка. В целом, содержание ДНК в соевых белковых препаратах не превышает 10,0 мг/г белка.

5. Установлено, что продукты из немодифицированной сои и её ГМ аналогов не обладают существенными различиями в функциональных свойствах. В то же время, продукты одного класса, но изготовленные по различным технологиям, демонстрируют более высокие различия в функциональных свойствах. Отсутствие существенных различий в свойствах испытанных образцов СБП из семян ГМ сои и контрольных образцов подтвердило возможность применения продуктов из ГМ источников в пищевой промышленности без изменения технологических режимов и рецептур.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы.

1. Кикоть Е.Н. (Логинова Е.Н.). Проблемы социального и этического характера в сфере создания и применения трансгенных растений // Материалы Международной научно-технической конференции «Пищевой белок и экология» - М.- 2000.- С. 176.

2. Логинова Е.Н. Метод выделения и количественного определения ДНК в белковых препаратах, вырабатываемых из генетически модифицированных растений // Научно-практическая конференция «Технологические аспекты комплексной переработки сельскохозяйственного сырья при производстве экологически безопасных продуктов общего и специального назначения».Труды (Углич, 11-14 сент. 2002 г.).-Углич, 2002.- С. 340-343.

3. Логинова Е.Н. Модификация метода выделения и количественного определения ДНК в белковых препаратах // Материалы 2-ой Всероссийской научно-технической конференции «Современные достижения биотехнологии» (Ставрополь, 12-13 сент. 2002 г.).-Ставрополь, 2002.- Т. 2.- С. 27-29.

4. Гурова Н.В., Логинова Е.Н. Методологические подходы к определению функциональных свойств белков, полученных из генетически модифицированных растений // Материалы 1-го Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 14-18 окт. 2002 г.).- М.: ЗАО «ПИК «Максима», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2002.-С. 331.

5. Логинова Е.Н. Выделение и количественное определение ДНК в соевых белковых препаратах // Материалы международной научно-практической конференции «Системные технологии продовольственного сырья и пищевых продуктов» ГУ ВНИТИ ММС и ППЖ РАСХН, Волгоград, «Вестник РАСХН», 2003, с. 36-37.

6. Сучков В.В., Логинова Е.Н., Кузнецов Б.Б., Скрябин К.Г. Модификация метода выделения и количественного определения ДНК в соевых белковых препаратах // Известия ВУЗов. Пищевая биотехнология, 2003. - № 5-6, с. 109-111.

7. Рогов И.А., Логинова Е.Н., Гурова Н.В., Кроха Н.Г., Попелло И.А., Сучков В.В. Функциональные свойства - соевых белков, полученных из генетически модифицированных источников // Мясная индустрия, 2004. - № 1, с. 28-30.

Автор искренне благодарен сотрудникам отдела специализированного питания ПНИЛЭФМОПП д-ру техн. наук Гуровой Н.В., канд. хим. наук Попелло И.А., а также заведующему лабораторией молекулярно-биологической идентификации генно-инженерной модификации Центра «Биоинженерия» РАН Кузнецову Б.Б. за помощь в проведении экспериментов и обсуждении результатов работы.

Отпечатано в типографии ООО "Франтэра" ПД № 1-0097 от 30.08.2001г. Москва, Талалихина, 33

Подписано к печати 21.04.2004г. Формат 60x90/8. Бумага "Офсетная № 1" 80г/м2. Печать трафаретная. Усл.печ.л. 1,50. Тираж 100 Заказ 086 МГУПБ. 109316, Москва, ул. Талалихина, 33

WWW. БКАКТЕКА.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Мировые тенденции в области создания и использования трансгенных растений.

2. ДНК как носитель генетической информации в клетке.

2.1. Биологическая роль.

2.2. Химический состав и структура молекул ДНК.

2.3. Свойства молекул ДНК в растворе.

2.3.1. Кислотно-основные свойства.

2.3.2. Вязкость.

2.4. Денатурация ДНК.

2.4.1. Условия денатурации ДНК.

2.4.2. Стадии денатурации ДНК.

2.4.3. Гиперхромный эффект.

3. Соя: питательные свойства и возможности применения.

3.1. Историческая справка.

3.2. Важность продуктов из соевых белков.

3.3. Продукты из соевых белков.

3.4. Питательные качества соевых белков.

3.5. Функциональные свойства продуктов из соевых белков в пище.

3.6. Применение соевых белковых препаратов в системе питания.

4. Современные подходы к оценке безопасности генетически модифицированных источников пищи (ГМИ).

4.1. Оценка безопасности продуктов из ГМИ по принципу композиционной эквивалентности.

4.2. Оценка безопасности продуктов из ГМИ, принятая в Российской

Федерации.

4.2.1. Медико-генетическая оценка.

4.2.2. Медико биологическая оценка.:.

4.2.3. Технологическая оценка.

4.3. Маркировка пищевой продукции из генно-модифицированных источников.

5. Законодательное и нормативное регулирование в области генно-инженерной деятельности в России.

6. Методы выделения, очистки и количественного определения ДНК.

6.1 Выделение и очистка.

6.2 Определение концентрации ДНК.

В настоящее время во всем мире происходит активное внедрение генетически модифицированных растений (ГМР) в практику сельского хозяйства

Создание и использование трансгенных растений может способствовать решению целого ряда проблем растениеводства. В частности, устойчивость растений к болезнетворным микроорганизмам, вирусам и насекомым, а также к неблагоприятным условиям внешней среды достигается введением в геном растения целевых генов, обеспечивающих устойчивость растения.

В международном экономическом сообществе существует чёткое понимание того, что в связи с ростом народонаселения Земли, которое по прогнозам учёных должно достичь в 2050 году 9-11 млрд. человек, необходимо удвоение или даже утроение мирового производства с/х продукции, что невозможно без применения трансгенных растений, создание которых многократно ускоряет процесс селекции культурных растений, а также позволяет получить растения с такими свойствами, которые не могут быть получены традиционными методами.

Учёные полагают также, что в ближайшие десятилетия использование трансгенных растений сможет в значительной степени изменить процессы производства пищевых продуктов, так как сделает возможным выращивание культур с улучшенными пищевыми качествами (обогащённых белками, с лучше усваиваемыми сахарами и жирами), с большим сроком хранения, обеспечивающим эффективность транспортировки.

Возможно и использование растений в качестве «живых фабрик» - для производства лекарственных веществ (в том числе природных белков человека) и специфических химических соединений (например, замена полимеров, получаемых сегодня из нефтепродуктов, на растительные полимеры).

Широкий спектр возможностей применения генномодифицированных оганизмов обуславливает постоянно растущий интерес к их использованию в питании людей, а также созданию новых видов трансгенных растений. Вместе с тем растёт количество противников данного метода селекции. Аргументами «против» в таком случае являются теоретически возможные риски негативного влияния на человеческий организм, религиозные принципы и т.д.

На сегодняшний день в Российской Федерации существует государственная законодательно оформленная система контроля и регулирования в области генноинженерной деятельности. Однако определённые аспекты данной системы не разработаны. Государственная система контроля за качеством и безопасностью продуктов из генетически модифицированных источников в Российской Федерации нуждается в разработке дополнительных методов исследований. Планируется, что биохимическая часть анализа пищевых продуктов из генетически модифицированных источников будет включать следующие этапы: 1) определение наличия ДНК в пищевых продуктах, 2) выделение ПЦР-пригодной ДНК, 3) анализ ДНК на содержание генетически модифицированных источников. В данной работе основное внимание будет уделено первому этапу — выбору и оптимизации наиболее адекватного метода для конкретного продукта (соевого белкового препарата). Данный метод должен отвечать следующим критериям: адаптированность к техническим возможностям лабораторий системы Санитарно-эпидемиологического надзора, достаточная простота в исполнении, получение достоверных и воспроизводимых результатов.

В соответствии с принятыми порядками проведения анализа пищевой продукции на безопасность и качество и регистрации пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников, помимо медико-биологической и медико-генетической экспертизы в Российской Федерации предусмотрено проведение технологической экспертизы. В нашей стране разрешено использование в пищевых продуктах белковых препаратов, полученных из семян трансгенной сои трёх сортов - сорт Round Up Ready 403-2 производства компании Monsanto Со (США), а также сорта Liberty Link А2704-12 и Liberty Link А5547-127 производства компании Aventis (Германия). Производители пищевых продуктов заинтересованы в том, чтобы белковые препараты из трансгенной сои по функциональным свойствам были сопоставимы с аналогичными препаратами из традиционных сортов сои. В связи с этим, большой интерес представляет изучение функциональных свойств соевых белковых препаратов из трансгенной сои в сравнении с их аналогами из немодифицированной сои. Для каждого вида белковых препаратов существует свой набор функциональных свойств, обусловленный спецификой использования в конкретных пищевых технологиях. Отсутствие достоверных различий в функциональных свойствах изученных образцов белковых препаратов может являться подтверждением идентичности генетически модифицированных источников и традиционных аналогов с точки зрения их использования в пищевых технологиях. Наличие существенных различий определит необходимость разработки рекомендаций к использованию белковых препаратов из генетически модифицированной сои в пищевых производствах.

В связи с этим разработка метода количественного определения содержания ДНК в соевых белковых препаратах и изучение функциональных свойств соевых белковых препаратов, полученных из генетически модифицированной сои, являются актуальными направлениями исследований.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Мировые тенденции в области создания и использования трансгенных растений.

Массовое коммерческое производство трансгенных растений началось с 1996 года. В том году во всём мире было засеяно трансгенными культурами 2.8 млн. га, из них 1.5 млн. га в США, 1.1 млн. га в Китае, 0.1 млн. га в Канаде, далее по убыванию - в Аргентине, Австралии, Мексике /1/.

К настоящему времени получены трансгенные растения более, чем 80 с/х культур, среди которых соя, пшеница, кукуруза, рис, томаты, картофель, хлопок и др. В 1998 году площади под трансгенными растениями во всём мире составляли уже 30 млн. га, что превышает территорию Великобритании /1/.

Среди основных трансгенных культур, выращиваемых во всех странах мира, в 1996 году лидировали табак (35% всех площадей), хлопок (27%), соя (18%), кукуруза (10%), рапс (5%), томаты (4%) и картофель (менее 1%) /1/.

В 1997 году произошло резкое увеличение площадей под трансгенными культурами до 12.8 млн. га (в 4.5 раза по сравнению с 1996 годом). По прежнему, по размеру площадей под трансгенными растениями впереди США (8.1 млн. га), Китай (1.8 млн. га), Аргентина (1.4 млн. га), Канада (1.3 млн. га), Австралия и Мексика /2/.

Изменилось и соотношение площадей под различными культурами: на первое место вышла трансгенная соя (40% всех площадей), затем следовали кукуруза (25%), табак (13%), хлопок (11%), рапс (10%) и томат (1%) /2/.

В 1998 году произошло дальнейшее, более, чем в два раза, увеличение площадей под трансгенными растениями. При этом 82% всех площадей приходилось на несколько основных культур: трансгенную сою, устойчивую к гербициду (52%), трансгенную кукурузу, устойчивую к насекомым (24%), трансгенный рапс, устойчивый к гербициду (9%), транс генный хлопок, устойчивый к насекомым (9%) и трансгенную кукурузу, устойчивую к гербицидам (6%). Более всего (почти в три раза) увеличились площади под трансгенной соей /3/. В 1998 году в США трансгенные сорта основных сельскохозяйственных культур занимали уже значительную часть всех площадей под этими культурахми: соя, устойчивая к гербициду, - 36% (10.2 млн. га), кукуруза, устойчивая к насекомым, - 22% (6.5 млн. га), хлопок, устойчивый к насекомым, - 20% (>1.0 млн. га) /3/. В период с 1999 по 2001 год площади, занимаемые трансгенными культурами, возросли с 39,9 млн. га до 52,6 млн. га /4/.

С 1986 года проведено более 25000 опытов по выращиванию генетически модифицированных растений. В то время как первоначальные опыты имели целью справиться с важными проблемами болезней или сорняков, последующие разработки предусматривают композиционные изменения с улучшенными белками и маслом, а также углеводами, ферментами и различными пищевыми добавками. Сегодня около 20% сортов генетически модифицированных растений соответствуют культурам с качественными изменениями их состава. В частности, имеющиеся разработки связаны с регулированием жирнокислотного состава масла из семян рапса и сои /1,5/.

Одними из наиболее перспективных исследований являются работы по модификации аминокислотного состава белков семян зернобобовых культур и, в частности, сои. Семена сои перерабатываются с целью получения широкого ассортимента белковых продуктов - муки, концентратов, изолятов, текстуратов. Несмотря на существующие технологические разработки производства пищевого белка из семян гороха, кормовых бобов, люпина, пшеницы и других культур, эти технологии пока не могут конкурировать с технологией переработки семян сои по экономическим показателям. По-видимому, в ближайшем будущем соя будет оставаться основной культурой, перерабатываемой с целью получения пищевого растительного белка.

На основании представленных данных становится очевидным, что соя является приоритетной культурой среди трансгенных растений.

выводы

1. Теоретически обоснован выбор методов выделения и количественного определения ДНК для исследований в соответствии с поставленной целью. Выбраны: метод выделения ДНК при помощи хлорной кислоты и дифениламиновый метод количественного определения ДНК.

2. Установлены оптимальные режимы, обеспечивающие полную экстракцию ДНК из соевых белковых препаратов: температура экстракции 85 °С, продолжительность экстракции 1 час, соотношение препарат: экстрагент 1:20. Определено оптимальное соотношение экстракта ДНК и дифениламиного реактива 1:10, обеспечивающие высокую чувствительность метода и достоверность получаемых результатов.

3. Проведено сравнение модифицированных методов выделения и количественного определения ДНК с аналогичными используемыми методами. Установлено, что стандартные методы выделения ДНК не могут быть рекомендованы для количественного определения ДНК в белковых препаратах при проведении массовых анализов.

4. Определено содержание ДНК модифицированным методом в соевых белковых препаратах различной степени очистки. Установлено, что концентрация ДНК максимальна в препаратах, не подвергавшихся при изготовлении интенсивному физико-химическому воздействию т.е. в муке, и составляет порядка 6,0-7,5 мг/г белка. Наименьшее количество ДНК содержится в изолятах и находится в диапазоне 3,0-4,5 мг/г белка. В целом, содержание ДНК в соевых белковых препаратах не превышает 10,0 мг/г белка.

5. Установлено, что продукты из немодифицированной сои и её ГМ аналогов не обладают существенными различиями в функциональных свойствах. В то же время, продукты одного класса, но изготовленные по различным технологиям, демонстрируют более высокие различия в функциональных свойствах. Отсутствие существенных различий в свойствах испытанных образцов СБП из семян ГМ сои и контрольных образцов подтвердило возможность применения продуктов из ГМ источников в пищевой промышленности без изменения технологических режимов и рецептур.

1. Новые технологии в агро-индустрии. Трансгенные растения / К.Г. Скрябин, И.А. Соловьёва, Ю.Л. Гончарова, Л.Ф. Матяш и др.- Центр «Биоинженерия» РАН, 1999.- 50 с.

2. С. James. Global Status of Transgenic Crops in 1997 // ISAAA (International Servise for the Aquisition of Agri-Biotech Application).- 1997.-Briefs No.S.Ithaca, NY, USA.- p.30.

3. C. James. Global Review of Commercialized Transgenic Crops: 1998 // ISAAA (International Servise for the Aquisition of Agri-Biotech Application).-1998.-Briefs No.8.- Ithaca, NY, USA.- p.43.

4. Nap J.-P., Metz P., Escaler M., Conner A.J. The Release of genetically modified crops into the environment. The Plant Journal. — 2003, v. 33, p. 1-18.

5. Bottermann J., Leemans J. Trends Genet 1998, v 4, p 219-222.

6. А. Ленинджер. Биохимия. Молекулярные основы структуры и функций клетки: Пер. с англ./ Под ред. и с предисл. акад. А.А. Баева и д-ра хим наук Я. М. Варшавского. М.: Мир, 1974. - 957 с.

7. Stent G.S., W.H. Freeman. Molecular Biology of Bacterial Viruses, San Francisco, 1963.- 345 p.

8. Ueda Т., Fox J.J. The Mononucleotides // Advan. Carbogydrate Chem. — 1980, Vol. 22. P. 307-419.

9. Дэвидсон Дж. Биохимия нуклеиновых кислот. М.: Мир, 1976. - 362 с.

10. Cantoni G.L., Devies D. Procedures in Nucleic Acid Research, Harper and Row Publshers Inc., New York, 1966. 254 p.

11. М.И. Булатов, И.П. Калинкин. Практическое руководство по фотометрическим и спектрофотометрическим методам анализа.- Л.: Химия, 1976.- 132 с.

12. Michelson A.M. The Chemistry of Nucleosides and Nucleotides, Academic Press Inc., New York, 1963.- 396 p.

13. Хаггис Дж., Михи Д., Мюик А., Роберте К., Уокер П. Введение в молекулярную биологию: Пер. с англ. М.: Мир, 1967.- 248 с.

14. Felsenfeld G., Miles H.T. Physical and Chemical Properties of Nucleic Acids I I Ann. Rev. Biochem. 1967. Vol. 36. P. 407-448,.

15. Watson J.D., Molekular Biology of the Gene, New York, 1965. 165 p.

16. Watson J.D., The Double Helix, Atheneum, New York, 1968. 422 p.

17. Srb A., Owen R.D., Edgar R.S., General Genetics, W.H. Freeman, San Francisco, 1965. 208 p.

18. Методы исследования нуклеиновых кислот. М.: Мир, 1970. — 167 с.

19. Dawidson J.N. (eds.), Biochemistry of Nucleic Acids, Wiley, New York, 1969. 198p.

20. Nucleic Acids / Florkin M., Stotz E.H. and ets. American Elsewier Publishing Company // Comprehensive Biochemistry. - New York, 1963. Vol. 8. - P. 102110.

21. Сингер M., Берг П. Гены и геномы: В 2 т: Пер. с англ. М.: Мир, 1998. -Т 1.-373 с.

22. Шабарова З.А., Богданов А.А. Химия нуклеиновых кислот и их компонентов. М.: Химия, 1978. 178 с.

23. Стент Г. Молекулярная генетика: Пер. с англ. / Под ред. д.б.н. С.И. Алиханяна. М., Мир, 1974. - 525 с.

24. Продукты из соевых белков: характеристики, питательные свойства и применение. Совет производителей соевых белков, Вашингтон, 1987. -57с.

25. Растительный белок: Пер. с фр. В.Г.Долгополова / Под. ред. Т.П.Микулович. М.: Агропромиздат, 1991. - 684с.

26. Dubois D.K., Hoover, W.J. // J. Am. Oil Chem. Soc., 1981. Vol. 58. - 343 p.

27. Fukushima D. Recent progress of soybean protein foods: chemistry, technologe and nutrition // Food Rev. Int., 1991. Vol.7. P. 323-351.

28. Waggle D.H., Kolar C.W. Types of soy protein products / In: Soy proteins and human nutrition / Eds. Wilcke H.L., Hopkins D.T., Waggle D.H., New York, Academic Press, 1979. P. 19-51.

29. Wolf W.J. Purification and properties of the proteins / In: Soybeans: chemistry and technology / Eds. Smith A.K. and Circle S.J., Westport / USA, AVI Publishing Co. Inc., 1972. Vol.1. P. 93-143.

30. Высоцкий В.Г., Зилова И.С. Роль соевых белков в питании человека // Вопросы питания, 1995. №5. - С. 20-27.

31. Fridman М. Natritional value of proteins from different food sources. A review. J. Agric // Food Chem., 1996. Vol.44. - P.6-29.

32. Soy proteins and human nutrition. Eds. Wilcke H.L., Hopkins D.T., Waggle D.H. New York, Academic Press., 1979. - P. 369.

33. Kies C., Fox H.M. Comparison of protein nutritional value of TVP, methionine enriched TVP and beaf at two levels of intake for human adults // J. Food Sci., 1971.-Vol.36.-P.841-845.

34. Young V.R. Soy protein in relation to human protein and amino acid nutrition //J. Am. Diet Assoc., 1991. Vol. 91. - P. 828-835.

35. Виробен Г., Бертран Д. Питательная ценность белковых растительных продуктов. В кн. Растительный белок. М.: Агропромиздат, 1991. С. 568595.

36. Толстогузов В.Б. Искусственные продукты питания. — М.: Наука, 1978. 231 с

37. Толстогузов В.Б. Новые формы белковой пищи. М.: Агропромиздат, 1987.303 с.

38. Protein functionality in food systems. Eds. Hettiarachchy N.S. and Ziegler G.R., Marcel Dekker Inc., New York, 1994. P. 402.

39. Functional properties of food marcomolecules. Eds. Mitchel J.R. and Ledward D.A., Elsevier Applied Science. London, 1986. - P. 182.

40. Tolstoguzov V.B., Gurov A.N., Braudo E.E. On the protein functional properties and the methods of their control. Part 1. Nahrung, 1981. Vol. 25. -P. 186-194.

41. Tolstoguzov V.B., Gurov A.N., Braudo E.E. On the protein functional properties and the methods of their control. Part 2. Nahrung, 1981. Vol. 25. -P. 195-211.

42. Kinsella J.E. Functional properties of soy proteins // J. Am. Oil Chem. Sci. -1975.-Vol. 56. P. 242-258.

43. Hutton C.W., Campbell A.M. Functional properties of a soy concentrate and soy isolate in simple systems. Nitrogen solubility index and water absorption // J. Food Sci., 1977. Vol. 42. P.454-456.

44. Shen J.L. Soy protein solubility: the effect of experimental conditions on the solubility of soy protein isolates // Cereal Chem,. 1976. Vol.53. - P.902-909.

45. Morr C.V., German В., Kinsella J.E., Regenstein J.M., van Buren J.p., Kilara A., Lewis B.A., Mangino M.T. A collaborative study to develop a standardized food protein solubility procedure // J. Food Sci., 1985. Vol.50. - P.1715-1718.

46. Shen J.L. Protein functionality in foods. Solubility and viscosity // ACS Symp. Ser., 1981. Vol.147. - P.89-109.

47. Wang C.R., Zayas J.F. Water retention and solubility of soy proteins and corn germ proteins in model system // J. Food Sci. 1991. Vol.56. - P.455-458.

48. Колпакова B.B., Нечаев А.П. Растворимость и водоудерживающая способность белковой муки из пшеничных отрубей // Известия ВУЗов. Пищевая технология.- 1995.- №1-2.- С.31-33.

49. Kinsella J.E., Damodaran S., German В. Physicochemical and functional properties of oilseed proteins with emphasis on soy protein // New Food Proteins, 1985. Vol.5. - P.107-178.

50. Гурова H.B., Токаев Э.С., Гуров A.H. Методы определения эмульсионных свойств белков. -М.: АгроНИИТЭИММП, 1994. -32с.

51. Hutton C.W., Campbell A.M. Functional properties of a soy concentrate and a soy isolate in simple systems and in a food system. Emulsion properties, thickening function and fat absorption //J. Food Sci., 1977.-Vol.42. P.457-461.

52. Колпакова В.В., Волкова А.Е., Нечаев А.П. Эмульгирующие и пенообразующие свойства белковой муки из пшеничных отрубей // Известия ВУЗов. Пищевая технология.- 1995.- №1-2.- С.34-37.

53. Tornberg Е., Lundh G. Functional characterization of protein stabilizied emulsions: standardized emulsifying procedure7/ J.Food Sci., 1989. Vol.43. -P.l 553-1558.

54. Kang I.J., Matsumura Y., Mori T. Characterization of texture and mechanical properties of heat-induced soy protein gels // J. Amer. Oil Chem. Soc., 1991. -Vol.68. P.339-345.

55. Hsu S. Reological studies on gelling behavior of soy protein isolates // J. Food Sci., 1999. Vol.64, № 1. - P.136-140.

56. Толстогузов В.Б. Новые формы белковой пищи. М.: Агропромиздат, 1987.-303с.

57. Morris E.R. Mixed polymer gels. In: Food gels. Ed. Harris P., Elsevier. -London, 1990. P.291-359.

58. Tolstguzov V.B. Functional properties of protein-polysaccharide mixtures. In: Functioanal properties of food macromolecules. Eds. Mitchell J.A. and Ledward D.A., Elsevier. London, 1986. - P.385-415.

59. Puppo M.C., Anon M.C. Structural properties of heat induced soy-protein gels as affected by ionic strength and pH // J. Agric. Food Chem., 1998. Vol.46. -P.3583-3589.

60. Chronanis I.S. Network formation and viscoelastic properties of commercial soy protein dispersions: effect of heat treatment, pH and calcium ions // Food Res. Int., 1996. Vol.29. P. 123-134.

61. Hamann D.D. Rheology a tool for understanding thermally induced protein gelation // Interaction of Food Proteins, 1991. - Vol.454. - P.212-227.

62. Puppo M.C., Anon M.C. Rheological properties of acidic soybean protein gels: salt addition effect // Food Hydrocolloids, 1999. Vol.13. - P.l67-176.

63. Arakawa T., Prestrelski S.J., Denney W.C., Carpenter J.F. Factors affecting short term and long term stabilities of proteins // Adv. Drug. Del. Rev., 1993. -Vol.10. -P.l-21.

64. Visser A., Thomas A. Review: Soya protein products their processing, functionality and application aspects // Food Rev. Int., 1987. Vol.3. - P. 1-32.

65. Hamada J. Deamidation of food proteins to improve functionality // Crit. Rev. Food Sci. Nutr.,1994. Vol.34. - P.283-292.

66. Damodaran S. Structure-function relationship of food proteins. In: Protein functionality in food systems. Eds. Hettriarachchy N.S. and Ziegler G.R. Marcel Dekker Inc., New York, 1994. P. 1-38.

67. Casella M.L., Whitaker J.R. Enzymatically and chemically modified zein for improvement of functional properties // J. Food Biochem., 1990. Vol.14, P.453-475.

68. Campbell N.F., Shih F.F., Marshall W.E. Enzymatic phosphorylation of soy protein isolate for improved functional properties // J. Agric. Food Chem., 1992.-Vol.40.-P.403-406.

69. Seguro K., Motoki M. Functional properties of enzymatically phosphorylated soybean protein// Agric. Biol. Chem., 1990. Vol.54. - P.1271-1274.

70. Hamada J., Marshall W. Preparation and functional properties of enzymatically deamidated soy protein // J. Food Sci., 1989. Vol.54. - P.598-601.

71. Shen J.L. Soy protein solubility: the effect of experimental conditions on the solubility of soy protein isolates // Cereal Chem., 1976. Vol.53. - P.902-909.

72. Chou D.M., Morr C.V. Protein-water interactions and functional properties // J.A.O.C.S., 1979. Vol.56. - P.53-58.

73. Rhee K.C. Functionality of soy proteins. In: Protein functionality of food systems. Eds. Hettiarachchy N.S., Ziegeer G.R., Marcel Dekker Inc., New York, 1994.-P.311-324.

74. Lawson М.Л. Food proteins: properties, functionality and utilization. Ingredient Technology Short Course. Annual Meeting of the Inst. // Food Technologists, Chicago, III, July 9, 1993. P. 531-539.

75. Statement of policy: Foods derived from new plant varieties: Notice // Federal Register. Vol. 57 (104). - P. 22984-23005. 18.

76. Biotechnology and food safety. Report of a Joint FAO/WHO Consultation. -Rome, 1996.-№61.-P. 31

77. The safety assessment of nowel foods. ILSI Europe Report Series, 1995. — P. 112.

78. Mae-Wan Ho, Steinbrecher R. Aoint. Environmental Nutr // Inter, 1998. -Vol. 1-2.-P. 51-84.

79. Report on the use of antibiotic resistance markers in genetically modified food organisms. ACNFP (Advisory committee on novel foods and processes). -London, 1994.-P. 12.

80. Detection methods for novel foods derived from genetically modified organisms. ILSI Europe Report Series, 1999. P. 53.

81. Медико-биологические исследования углеводородных дрожжей / Под ред. А.А. Покровского.- М.: Наука, 1972. 184 с.

82. Методические рекомендации по изучению безвредности и пищевой ценности продуктов животноводства, полученных с использованием кормовых добавок микробиологического происхождения.- М: Минздрав СССР, 1982.-224 с.

83. Nordlee J.A. Neu Engl J Med. 1996. Vol. 14. - P. 688-728.

84. Falco S.C. Biotechnology. 1995. Vol. 5. - P. 577-582.

85. JI.B. Донченко, В.Д. Надыкта. Безопасность пищевой продукции. М.: Пищепромиздат, 2001.- 525 с.

86. Современные подходы к оценке безопасности генетически модифицированных источников пищи. Опыт изучения соевых бобов линии 40-3-2 / Г.Г. Онищенко, В.А. Тутельян, А.И. Петухов и др. // Вопросы питания. 1999. № 5/6. - С.3-8.

87. Санитарно-противоэпидемические правила «Безопасность работы с рекомбинантными молекулами ДНК».- М.: Изд-во Минздрава СССР, 1989.-20с.

88. Федеральный Закон Российской Федерации «Об экологической экспертизе».- № 174-ФЗ от 23.11.95г.

89. Федеральный Закон Российской Федерации «О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности» №86-ФЗ от 5.06.96г.

90. Постановление правительства Российской Федерации «О Межведомственной комиссии по проблемам генно-инженерной деятельности».- № 464 от 22.04.97г.

91. Федеральный Закон Российской Федерации «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».- № 52-ФЗ от 30.03.99г.

92. Постановление Главного санитарного врача Российской Федерации «О порядке гигиенической оценки и регистрации пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников».- №7от 06.04.99г.

93. Федеральный Закон Российской Федерации «О качестве и безопасности пищевых продуктов» январь 2000г.

94. Федеральный Закон «О внесении изменений и дополнений в Федеральный Закон «О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности», касающихся генотерапии и генодиагностики» от 28.06.2000 г.

95. Медико-биологическая оценка пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников.- Методические указания

96. Минздрава Российской Федерации (МУК 2.3.2.970-00).- М.: Изд-во Минздрав России, 2000.- 94 с.

97. Положение об оценке воздействия намечаемой хозяйственной и иной деятельности на окружающую среду в Российской Федерации.-Приложение к приказу Госкомэкологии Российской Федерации № 372 от 16.05.2000г.

98. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации «О нанесении информации на потребительскую упаковку пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников» № 13 от 8.11.2000г.

99. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации «О порядке проведения санитарно-эпидемиологической экспертизы пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников» № 14 от 8.11.2000 г.

100. Постановление правительства Российской Федерации «О государственной регистрации генно-инженерно-модифицированных организмов» № 120 от 16.02.01г.

101. Нуклеиновые кислоты: Сб. ст.: Пер. с англ. Ф.Ф. Ходжеванова / Под ред. и с предисл. И.Б. Збарского.- М.: Мир, 1966.- 415 с.

102. Marko A.M., Butler G.C. // J. Biol. Chem., 1951. Vol. 190. - P. 165.

103. Kay E. R. M., Simmons N.S., Dounce A. L. // J. Am. Chem. Soc., 1952. Vol. 74.-P. 1724.

104. Simmons N.S., Chavos S., Orbach H.K. // Federation Proc., 1952. Vol. 11.-P.390.

105. Zamenhof S., in "Biochemical Preparations" (C.S. Vestling, ed.).- Wiley, New York, 1958. Vol. 6.- P. 8.

106. Kirby K.S. Isolation of ribonucleic acid // Biochem. J., 1957.- Vol. 66. P. 495.

107. Kirby K.S. // Biochem. J., 1958. Vol. 70. - P. 260.

108. Kirby K.S.//Biochem. Biophys. Acta, 1959. Vol. 36, P. 117.

109. Kirby K.S. A new method for the isolation of ribonucleic acid from mammalian tissue // Biochem. J., 1956. Vol. 64. - P. 405.

110. Gierer A., Schramm G. Infectivity of ribonucleic acid from tobacco mosaic virus // Nature, 1956. Vol. 177. - P. 702.

111. Техника биохимического исследования субклеточных структур и биополимеров / Под ред. А.С. Вечера.- Минск: Наука и техника, 1977.150 с.

112. Современные методы в биохимии / Под ред. В.Н. Ореховича.- М.: Медицина, 1977.- 392 с.

113. Гловер Дэвид М. Клонирование ДНК. Методы.- М.: Мир, 1988.- 486 с.

114. Schmidt G., Thannhauser S.J. A method for the determination of desoxyribonucleic acid, ribonucleic acid, phosphoprotein in animal tissue // J. Biol. Chem., 1945. Vol. 161. - №1. - P. 83.

115. Практикум по биохимии / Под ред. Н.П. Мешковой и С.Е. Северина. М.: Изд-во Моск. Ун-та, 1979.- 430 с.

116. Методы современной биохимии: Сб. ст.- М.: Наука, 1975.- 176 с.

117. Murrau M.G., Thompson W.F. Nucleic Acids Res., 1980. Vol. 8. P. 4321.

118. Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных. Школа-практикум / Под ред. д.б.н. Зиновьевой Н.А.- Изд-во ВНИИ животноводства, 2002.- 78 с.

119. Манниатис Г., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. — М.: Мир, 1984. — 453 с.

120. Химический энциклопедический словарь. / Гл. ред. И.Л. Кнунянц.- М.: Сов. Энциклопедия, 1983. 792 с.

121. Рабинович В.А., Хавин З.Я. Краткий химический справочник. — Л: Химия, 1977. 376 с.

122. Крешков А.П. Основы аналитической химии. Теоретические основы. Количественный анализ, книга2-я, изд. 4-е, перераб. М.: Химия, 1976, 480с.

123. Химические реактивы и высокочистые химические вещества. Каталог. 2-е изд. перераб. и доп. М.: Химия, 1983. - 704 с.

124. А. Гордон, Р. Форд. Спутник химика. Физико-химические свойства, методики, библиография: Пер. с англ. Е.А. Розенберга и С.И. Коппель. -М.: Мир, 1976.-542 с.

125. А. Вайсбергер, Э. Проскауэр, Дж. Риддик, Э. Тупс. Органические растворители. Физические свойства и методы очистки: Пер. с англ. H.H. Тихомировой / Под ред. Я.М. Варшавского. М.: Изд-во иностранной литературы, 1958. - 518 с.

126. ГОСТ Р 8.563-96. ГСИ. Методики выполнения измерений. — М.: Изд-во стандартов, 2001. 9 с.

127. Зейдель А.Н. Погрешности измерений физических величин. — JL: Наука, 1985.- 112 с.

128. Кассандрова О.Н., Лебедев В.В. Обработка результатов наблюдений. — М.: Наука, 1970.-104 с.

129. Кондратов А.П., Шестопалов Е.В. Основы физического эксперимента и математическая обработка результатов измерений. — М.: Атомиздат, 1977.-197 с.

130. Тейлор Дж. Введение в теорию ошибок: Пер. с англ. Л.Г. Деденко. — М.: Мир, 1985.-272 с.

131. Брянский Л.Н., Дойников A.C. Краткий справочник метролога. — М.: Изд-во стандартов, 1991. 89 с.

132. Сквайре Дж. Практическая физика. — М.: Мир, 1971. 163 с.

133. Худсон Д. Статистика для физиков. М.: Мир, 1970. - 134 с.

134. Кунце Х.-И. Методы физических измерений. М.: Мир, 1989. — 228 с.

135. Тойберт П. Оценка точности результатов измерений. М.: Энергоатомиздат, 1988. - 109 с.

136. Берштейн И.Я., Каминский Ю.Л. Спектрофотометрический анализ в органической химии. 2-е изд., перераб. и доп. Л.: Химия, 1986. — 200 с.

137. Медико-биологическая оценка пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников: Методические указания. — М.: Федеральный реестр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2000.