автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.04, диссертация на тему:Повышение качества сычужных сыров посредством углубления научных основ и разработки практических мер предотвращения фаголизиса заквасочной микрофлоры

РГ Б Ой

• « КМ

На правах рукописи

ПРОТАСОВА Ирина Сергеевна

ПОВЫШЕНИЕ КАЧЕСТВА МЕЛКИХ СЫЧУЖНЫХ СЫРОВ ПОСРЕДСТВОМ УГЛУБЛЕНИЯ НАУЧНЫХ ОСНОВ И РАЗРАБОТКИ ПРАКТИЧЕСКИХ МЕР ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ФАГОЛИЗИСА ЗАКВАСОЧНОЙ МИКРОФЛОРЫ

Специальность 05.18.04 - технология мясных, молочных и рыбных

продуктов

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Вологда - Молочное 1998 г.

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте маслодельной и сыродельной промышленности (ВНИИМС, Углич) и в Госуданственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ГНИИ генетики, Москва)

Научные руководители - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Г.Д. Перфильев

- доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник В.3. Ахвердян

Официальные оппоненты - доктор технических наук, профессор В.Ф. Семенихина - кандидат технических наук, доцент Титов А.Г.

Ведущее предприятие - ЗАО "Вологодский молочный комбинат"

Защита диссертации состоится 1998 г. в !¥. час

ка заседании диссертационного совета К 120.02.01 при Вологодской государственной молочнохозяйственной академии им. Н.В. Верещагина (160901 г. Вологда, пос. Молочное, ул. Шмидта, 2. ВГМХА)

С диссертацией можно .ознакомиться в библиотеке Вологодской государственной молочнохозяйственной академии им. Н.В. Верещагина.

Ваши отзывы ка автореферат, заверенные печатью и подписями, просим направлять в адрес академии.

Автореферат разослан ".4-f" ...<?-£.. 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, профессор ) ' Котова О.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Стабильное качество продуктов питания, в том числе сыров - современное требование отечественного и мирового продовольственного рынка.

Анализ литературы показывает, что в большинстве случаев, снижение качества сыров обусловлено нарушениями в интенсивности и направленности микробиологических процессов во время выработки и созревания сыров, одной из важных причин которых является фаголизис заквасочной микрофлоры. С видовым и штаммовым составом отдельных культур и комбинаций молочнокислых бактерий, входящих в состав заквасочной микрофлоры, связывают большинство полезных изменений, происходящих в молоке во время выработки сырной массы и в процессе ее созревания. В частности, молочнокислые бактерии осуществляют преобразования основных компонентов молока во вкусовые, ароматические, биологически активные вещества сырной массы, участвуют в формировании консистенции, структуры и рисунка сыра, подавляют размножение и метаболизм опасных для здоровья потребителей микроорганизмов.

Научные исследования, направленные на предотвращение фаго-лизиса молочнокислой заквасочной микрофлоры принадлежат области интенсивных поисков как зарубежных, так и отечественных ученых (Teuber M., Германия; JarvisA.W., Новая Зеландия; Saxelin M.А.. Финляндия; Daly С., Fitzgerald G.F., Ирландия; Mata M, Ritzenthaler, Франция, Powell, Австралия; Shich, США, Крылов В.H., Гудков A.B., Докукин В.М., Одегов Н.И, Молотова Н. 0., Россия и другие).

Для предотвращения фаголизиса молочнокислой заквасочной микрофлоры используют различные методы и средства, основанные на уничтожении бактериофага в окружающей и производственной среде, применении многоштаммовых заквасок, ротации заквасочных культур, использовании в составе заквасок фагорезистентных культур и т.д. Однако, несмотря на сравнительно широкий спектр методов и средств борьбы с бактериофагом, проблема предотвращения фаголизиса заквасочной микрофлоры в производстве ферментированных молочных продуктов до настоящего времени остается нерешенной.

Цель исследований Целью настоящей работы является повышение качества сыров с низкой температурой второго нагревания на основе разработки и применения в практике сыроделия системы фагового мониторинга производства и фагорезистентных заквасок составленных из штаммов, полученных конъюгативной передачей генов фагоустойчивости.

Рабочая гипотеза Рабочей гипотезой является концепция о том, что существует возможность получения сыров гарантированного качества на основе стабилизации молочнокислого процесса, достигаемой путем системного и систематического контроля и оценки фаговой ситуации на конкретном предприятии, выбора доступного и эффективного способа и (или) средств защиты молочнокислой заквасочной микрофлоры от фаголизиса, использования в составе бактериальных заквасок фагоустойчивых культур, полученных методом коньюгативного переноса фактора фагорезистентности.

Задачи исследований Для достижения поставленной цели и проверки сформулированной рабочей гипотезы в диссертационной работе решались следующие задачи:

- провести выделение производственных лактококкофагов на сыродельных предприятиях, изучить свойства фаголизатов, поддерживаемых в отделе микробиологии ВНИИМС, вновь выделенных фагов и создать систематизированную коллекцию лактококкофагов;

- изучить генетические аспекты взаимодействия коллекционных фагов с лактококками, в том числе спектр литического действия, фагоустойчивосгь, фаготип, мутабильность системы "бактериофаг-хозяин" и разработать тест-систему для индикации и количественного определения лактококкофагов в производственных условиях;

- исследовать фаговую ситуацию на ряде сыродельных предприятий, определить контрольные критические точки сыродельного производства;

- изучить возможность конъюгативной передачи плазмид в клетки лактококков из E.coli, как методическую модель селекции лактококков конъюгацией;

- получить фагоустойчивые зкс-конъюганты лактококков. изучить их производственно-ценные свойства и провести производственные испытания фагоустойчивых штаммов в качестве заквасочных культур;

- разработать методические указания по селекции молочнокислых микроорганизмов генетическими методами;

- разработать методические рекомендации по проведению фагового мониторинга сыродельного производства и провести их апробацию на ряде сыродельных заводов.

Научная новизна. Создана систематизированная-коллекция лак-тококкофагов. Определена практическая возможность изменения фа-гоустойчивости лактококков конъюгацией и эффективного использования фагоустойчивых рекомбинантов в производстве сыров. Получены новые данные о возможности использования в генной инженерии лактококков генетических маркеров антибиотикоустойчивости и фагоспецифичности. С помощью конъюгативной передачи получены штаммы лактококков с повышенной фагоустойчивостью.

Разработан систематический фаговый мониторинг на сыродельном производстве, включающий контроль фаговой ситуации в контрольных критических точках (ККТ), ее анализ и адекватное реагирование санитарными мероприятиями.

Практическая ценность работы. Разработаны методические указания "Селекция молочнокислых микроорганизмов генетическими методами" и "Методические рекомендации по проведению фагового мониторинга на сыродельных предприятиях". Полученные 8 штаммов генетически модифицированных фагоустойчивых лактококков. эффективность применения которых в производстве сыров подтвеждена результатами производственных испытаний, переданы на Угличскую экспериментальную биофабрику для использования в составе заква-сочной микрофлоры бакпрепаратов. Разработан проект нормативно-технической докуметации на тест-культуры для определения лактококкофага, комплект "Фаготест- ЛК" для контроля лактокок-кофага на молочных предприятиях и, совместно с ТОО "Квадра", налажено производство "Фаготест-ЛК". Экспериментальные материалы, полученные при проведении работы, использованы в составе "Инструкции по подбору микрофлоры бактериальных заквасоку и концентратов, используемых в производстве сыра".

Апробация работы публикации. Результаты работы доложены и обсуждены на заседании секции ученого совета ВНИИМС по вопросам сыроделия в 1995 г, на 24 Международном молочном конгрессе в Мельбурне, Австралия, сентябрь 1994 г.; на научно-технической конференции "Вклад науки в развитие маслодения и сыроделия", г.

Углич, октябрь 1994 г.; на семинаре микробиологов молочных предприятий Гродненского объединения сельскоко хозяйства и про-довольсвия , Щучин, 23 мая 1996 г.; на научно-практической конференции "Образование в условиях реформ: опыт, проблемы, научные исследования", Кемерово, 1997 г.

По материалам диссертации опубликовано 11 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, аналтического обзора, экспериментальной части, выводов, списка использованной литературы, включающего 130 литературных источников и И приложений. Основное содержание работы изложено на 105 страницах машинописного текста. В диссертации имеется таблиц, 10 рисунков.

СОДЕРЙАНИЕ РАБОТЫ В обзоре литературы проведен анализ публикаций о значении молочнокислой заквасочной микрофлоры в сыроделии, лактококкофа-гах и методах борьбы с фаголизисом. Экспериментальная часть

Организация работы, объекты и методы исследования Объектами исследований являлись: коллекционные культуры лактококов (417 штаммов), лактококофаги, поддерживаемые во ВНИ-ИМС (168 фаголизатов), а также выделенные в процессе выполнения данной работы (89 фаголизатов), культуры Е. coll, плазмида pLFVM2, сборное и подвергнутое температурной обработке молоко, бактериальные закваски и концентраты, оборудование и производственная атмосфера сыродельных цехов и заквасочных помещений, сыворотка, сыры, рассол.

При выполнении экспериментальной части работы использовали стандартизированные и общепринятые, а также модифицированные методы микробиологических, физико-химических и генетических исследований.

Математическую обработку экспериментальных данных осуществляли мотодами дисперсионного и регрессионного анализов с использованием персональных компьютеров IBM PCIAT по программам "Statgraphics" и "Стадия", а также программируемого микрокалькулятора "Электроника МК-57" по стандартным программам Схема проведения исследований приведена на рис 1.

Анализ литературы выбор направлений исследований

Селекция лактококков генетическими методами

Конъюгативная передача из Е. соН в Ь. 1асИз

Контяогативная передача из Ь. 1ас115 в Ь. 1асМз

Получение фагоустойчивых рекомбинантов и анализ их свойств

Производственные испытания фагоустойчивых рекомбинантных гсультур

Выделение, изучение свойств и классификация производственных лактококкофатов

Изучение морфологии, геномов, спектра литичес-кого действия фагов и влияния на них некоторых физико-химических факторов

Изучение взаимодействия фагов с лактококками и разработка тест-системы фагового мониторинга

Изучение распространения

лактококкофатов на сыродельных предприятиях

Фаговый мониторинг1 сыродельного производства

Разработка методических указаний по проведению • фагового мониторинга сыродельного производства

Разработка методических указаний по селекции молочнокислых микроорганизмов генетическими методами

Рис. 1. Обш,ая схема проведения исследований

Выделение фагов, создание систематизированной коллекции лактококкофагов и изучение влияния на коллекционные Фаги некоторых Физико-химических Факторов

С целью создания систематизированной коллекции лактококкофагов, являющейся базой данных генетических исследований и научно-практических разработок противофаговых мероприятий, на первом этапе работы проводили выделение, идентификацию, изучение свойств и классификацию бактериофагов лактококков, действующих на предприятиях вырабатывающих сыры.

В соответствии с требованиями Международной комиссии по таксономии вирусов, для систематизации коллкций бактериофагов проводили: морфологический (рис. 2) и морфометрический анализ лактококкофагов (табл 1, рис. 3) с использованием бактериофагов международных коллекций Тойбера (Германия) и Джарвис (Нов. Зеландия), ДНК/ДНК гибридизацию и рестрикционный анализ геномов фагов (рис. 4) и определение спектра литического действия.

Систематизированная коллекция лактококкофагов, насчитывающая 262 неповторяющихся изолятов, состоит из 4 неродственных, достоверно отличающихся по вышеуказанным признакам таксона (вида):

- Сходные с фагом Р001 из коллекции Тойбера, включающие 83,2 % коллекционных лактококкофагов и принадлежащие морфотипу с удлиненными головками В2.

- Сходные с фагом Р008 из коллекции Тойбера - вид, включающий коллекционные фаги (16,8 %) морфогрупп В1 -1 и В1 -2 (с изометрической головкой).

- Два малочисленных таксона, для которых не найдено зарубежных аналогов, что свидельствует о эволюционных рекомбинаци-онных процессах, происходящих на современных отечественных сыродельных предприятиях.

Определение спектра литического действия коллекционных бактериофагов позволило осуществить отбор наиболее активных штаммов для последующего использования в ■ научных' исследованиях и практической работе по отбору культур лактококков в состав бактериальных заквасок и концентратов.

Изучение устойчивости лактококкофагов к таким физико-химическим воздействиям, как температурная обработка, УФ-излучение и солеустойчивость фагов, проводимое в целях оптимицации

X 'eojDáonasiMpa хтнавотгэиззи иузаэ ояонсиаи oioioofr

g

S.

оЗпЗгЗсЗяЗпЗсЗЙо t^i I^I iôi f© fï

•^wri-^LOtONC)

Таблица 1

Морфометрические характеристики лактококкофагов

Морфо-тип

Морфо-группа

Размер фагошх частиц и отдельных их элементов, нм

длина фаговой частицы

диаметр головки

длина хвостового

отростка

толщина хвостового от ростка

Соотношение

диаметров головки фага

длины хвостового

отростка и диаметра головки

В1

В2

1

2

3

4

195+13 217+12 266+19 325+14 147+17

56+5 135+12

58+4 160+13

65+2 200+15

70+2 255+15

37+4 89+11 58+5

7+1 8+2 14+2 10+1 7+1

1,1+0,1 1,1+0,0 1, 1+0,1 1,0+0,0 1,6+0, 1

2, 4+0, 1 2,8+0,1

3, 3+0, 4 3,6+0,1 2, 0+0, 6

средств защиты сыродельного производства от фаголизиса, показало:

- Высокий бактерицидный эффект УФ-излучения для инактивации бактериофагов при соблюдении правил его эффективного применения, в том числе экспозиции 30 мин, рассоянии до лампы не более

2 м, что особенно важно для дезинфекции воздуха.

- Доступность и эффективность санитарных мероприятий, включающих мойку, дезинфекцию оборудования помещений заквасочного отделения и сыродельного цеха (в том числе УФ-облучение воздуха) в соответствии с разработанными рекомендациями. В течение 4-х месяцев, проводимых на УПЭЗ-150 (Углич), исследований в производственной закваске титр фага упал от 109 до 102 фаговых частиц в см3.

- Потенциальную опасность рассола солильного бассейна, как экзогенного источника бактериофага (вследствие его солеустойчи-вости) на сыродельном предприятии и необходимость включения рассола в состав ККТ фагового мониторинга.

Разработка и проведение фагового мониторинга сыродельного производства

Тест-система для индикации и количественного определения включает: набор тест-культур с максимальной фагочувствитель-ностью, отобранных по результатам испытаний и анализу совпадения спектров фагов, действующих на эти культуры; модифицирован-

- и -

ной методики определения бактериофага чашечным методом, с заменой, сложно выполнимого в условиях производства, этапа освобождения анализируемой суспензии от микроорганизмов с помощью бактериального фильтра на обработку 1 % хлороформа или прогревание (60 + 2 С в течение 20+2 мин); а также упрощенный, без использования разведений, метод оценки титра фага.•

Разработана нормативно-техническая документация на тест-культуры в сухом виде, проект нормативно-технической документации на комплект "Фаготест-ЛК" для определения лактококко-фага в производственных условиях.

С использованием разработанной тест-системы обследовано 8 заводов по производству сыров. Результаты исследований (рис. 5) позволили отобрать ККТ (основные - эффективные и дополнительные - неабсолютные) для систематического контроля фагового мониторинга. Разработаны "Методические указания по проведению фагового мониторинга на сыродельных предприятиях", производственная апробация которых показала возможность систематического осуществления его в производственных лабораториях.

Селекция фагоустойчивых рекомбинантных культур конъюгатив-ной передачей Фактора фагорезистентности и их производственные испытания

Селекция микроорганизмов генетическими методами (в т. ч. конъюгацией), в отличие от малопроизводительного отбора мутантов из вторичного роста или полученных воздействием мутагенов, включает анализ произошедших генетических рекомбинаций, направленный на поиск хорошо разработанных стратегий модификации важных свойств штаммов, верный прогноз их стабильности. Детерминанты антибиотикоустойчивости - классические маркеры генетического анализа. Один из использованных методов для маркировки лактококков и методического освоения генетического анализа -конъюгативный перенос (мобилизация) плазмид (pLFRI, pLFYM2, pSB20mob) устойчивости к хлокомфениколу (Cm), эритромицину (Егш), линкомицину (Lmr) и др. из Е. coli в лактококки (табл.2).

Используемые в конъюгативных переносах варианты донор-реципиент привели к получению эксконъюгантов лактококков, содержащих одну из конъюгативных (мобилизуемых) плазмид антибиотикоустойчивости. Частота мобилизации во всех осуществленных случаях

переноса составила от 1 X 10"6 до 1 X 10"7 на одну донорную клетку.

Не все рекомбинанты антибиотикоустойчивости сохранили способность сбраживать лактозу и все приобрели более низкую активность кислотообразования.

В исследовании коньюгативной передачи свойства фагоустойчи-вости культурам лактококков с производственно-ценными для сыроделия свойствами для селекции рекомбинантов классические маркеры антибиотикоустойчивости заменены на маркеры фагоспецифичнос-ти.

Таблица 2 Конъюгационный перенос (мобилизация) из Е. coli в лактококки

Донорный штамм E.coli / маркер

Реципиентный штамм / маркер

Трансконъюгант

S171 (pSB20mob)/ Erm,5 мг/мл Lmr. 100 мг/мл

НВ101 (Rp4, pLFRI)/

Cm 10 МГ/МЛ

C600* (Rp4, pLFYM2)/ Cm

10 мг/мл

L. lactis subsp. cremoris 613/ Птг

L. lactis subsp. lactis Lpl 16/ Sm ,

L. lactis subsp. lactis Lpl Т6/ Sm

L. lactis subsp. cremoris 613/ (pSB20mob)

L. lactis subsp. lactis Lpl T6 (pLFRI)

L. lactis subsp. lactis Lpl T6 (pLFYM2)

HB101 (Rp4, pLFRI)/ Cm

10 мг/мл

C600 (Rp4, pLFYM2)/ Cm

10 МГ/МЛ

C600 (Rp4, pLFYM2)/ Cm

10 МГ/МЛ

L. lactis subsp. lactis 195/ Sm

L. lactis subsp. lactis 195/ Sm

L. lactis subsp. cremoris 613/ Птг

L. lactis subsp. lactis 195 (pLFRI)

L. lactis subsp. lactis 195 (pLFYM2)

L. lactis subsp. cremoris 613/ (pLFYM2)

Рис. 4. Злокгрофоретическоо разделенно Лпагменгов ДНК лактококкофатов* /номера фагов по реестру коллекции ВНИИМС/

( г з

Рис. 6. Плазмидный профиль ДНК лактококков

1. Ь. 1ас|лз зиЬзр. сНасеШасиз 013 г. Ь. ас^з зиЬзр. (ИасоШаЫлз 351/1 о. Ь. 1асЬ13 зиЬзр. сИасеШасиз 613/351

закваски закваски

Рис; 7

Производственные испытания закваски, составленной из фагоустойчивых штаммов (б) полученных конъюгацией

воздух .-------

в сыродельном цехе 63 75

« сыродельные -------

ванны после до мойки

мойки и пропа-риваиия 100 75 20 20 1с пол

е сыродельном ---

цехе после до мойки

, мойки и дезинфекции 90 80 4,2 43 28 1,8

* молоко сырое от отдельных сборное

поставщиков

91 56 2,7

• молоют пастеризованное

65 С 73 С 92 О

30 мин 20 - 25 с 40 мин

84 24 1,8 13 0,2 О. 0. О

смесь для выработки сыра после внесения закваски 81 65 2,8

—сыворотка 100 71 6,2

сырное зерно 48 68 5,0

""I

сыр после прессования 100 66 6,4

> производственная закваска 18 22_ 4,6

---9 воздух

в заквсочном помещении 28 30

—• заквасочники 30 25

пол

-« в закЕасочном отделении 36 25 1,5

--* рассол 100 83 5,7

частота обнаружения фагоЕ, % ^ ,■ . ширина спектра обнаруженных фагов, % логарифм титра фаговых частиц, см1*' (г)

• основные КИТ фагового мониторинга »дополнительные ККТ

I

Рис. 5. Характеристика фагового состояния производства сыра

В качестве исходных штаммов использовали фагочувствительные культуры Ь. 1асИз эиЬБр. 1асиБ, Ь. 1асиБ виЬзр. с!1асе111ас-113, I. 1асиз зиЬвр. сгешог1з с изученными спектром литическо-го действия и фаготипами.

Рекомбинацию считали достоверной, если как минимум в 3-х повторностях число рекомбинантов на селективных чашках превышало не менее чем на два порядка количество мутантных клонов каждой из родительской культур на контрольных чашках. Результаты приведены в таблице 3.

Для определения стабильности фагоустойчивости проводили. 15 пассажей в молоке. Затем культуры рассевали на чашки с МГА. Среди 10 колоний подсчитывали процент устойчивых к 51 коллекционному бактериофагу. Значения трех повторностей не усреднялись, и в случае различий приведены все. Частота рекомбинации составила 10~6 - 1О"8 на донорную клетку.

Сравнение плазмидных профилей выделенных методом щелочной депротеснизации плазмидных ДНК исходных культур и рексмбинанта 613/352/1 показало увеличение в рекомбинантном штамме до трех плазмид по сравнению с единичной в обоих родительских культурах (рис. 6). Отличие плазмидного состава рекомбинантного штамма от родительского свидетельствует о том, что произошла не просто передача плазмиды, а более сложные генетические перестройки.

Производственные испытания фагоустойчивых рекомбинантных культур лактококков, полученных коньюгативным переносом проведены на Брейтовском сырзаводе Ярославской области, Пружанском сырзаводе и Шумилинском сырзаводе Белоруссии. Вырабатывались сыры Волжский, Голландский. Опытные сыры с использованием закваски, состоящей из 1 - 6 рекомбинантных штаммов. Контрольные -с закваской, приготовленной из бактериального препарата для мелких сычужных сыров используемого первый день после ротационного цикла.

Эффективность применения, в качестве заквасочных, штаммов, полученных генетической рекомбинацией, определялась исходя из анализа скорости появления и развития (времени и прироста титра) гомологичного производственного бактериофага, по сравнению с таковыми же, культур, входящих в состав бактериального препарата опытных сыров. Результаты анализа, приведенные на рис. 7, показывают, что. в первый же день использования в сос-

Таблица 3 Результаты проведения рекомбинаций

Донор Реципиент Наименование рекомбинантной культуры Стабильность признака фагорезис-тентности, %

Ь. 1асиз БиЬзр. с31а-сеШасПв 613 Ь.1асив виРвр. 1асИз 710/4 Ь.1асиБ эиЬзр. lactxs 613/710 100 100 90

Ь. 1асиБ БиЬБр. 61а-сеШаШБ 613 Ь.1асиэ эиЬзр. (ПасеШасиэ 361/6 Ь.1асШ зиЬгр. сИасе^ 613/361 0

Ь. 1асиз зиЬэр. (11а-сеШасиз 613 ЬЛасиэ зиЬзр,-(ЛасеШасШ 352/1 Ь.1асШ гиЬзр. dlacet. 613/352 100

1. 1асиз зиЬэр.сИа- сеШасиз Ь.1асиэ зиЬзр. 1ас tl.fi 722/3 Ь.1асиз зиЬзр. 1асиз 613/722 0

Ь. 1асиэ эиЬзр.й1а-сеШасиг 613 Ь.1асиэ эиРэр. 1асПз 509 Ь.1асиз виРэр. 1асШ 613/509 0

Ь. 1асиэ зиЬэр.с11а-сеШасиэ 613 Ь.1асиэ БиЬзр. сгетог1з 93 Ь.lactls виЬзр. Й1асе1. 613/93 100 70 0

Ь. 1асШ виввр. <31а-сеШасив 613 Ь.1ас11з зиЬэр сИасеШасиэ 563 Ь.1асИз эиЬзр. сИасег. 613/563 100 40 0

таве производственной закваски, 80 % штаммов, влючаемых в бактериальный препарат, лизируются производственным бактериофагом, тогда как из 6 рекомбинантных штаммов гомологичный фаг за 2 дня испытаний обнаружился только к 1 штамму. Длительные производственные испытания (20 дней) фагоустойчивого штамма, полученного методом конъюгативной передачи при параллельном контроле появления гомологичного штамму бактериофага в подсырной сыворотке, в условиях Брейтовского сырзавода, показали эффективность его

использования без появления гомологичного фага в течение всего времени испытаний (от 40 до 100 % штаммов бакпрепатата лизиро-валось на 2 день его использования).

При невысоком показателе экономического эффекта (50 тыс руб в ценах 1996 г. за каждую тонну произведенного сыра), стабильное качество сыра - важнейший компонент его - маркетинга в условиях формирующейся рыночной конкуренции.

Вью оды

1. Изученные и собранные в коллекцию лактококкофаги, распространенные на сыродельных заводах России, Белоруссии, Молдовы, Литвы, Казахстана по морфометрии, ДНК/ДНК гомологии и рест-рикционному анализу ДНК относятся к 4 видам (таксонам).

2. Фаговая ситуация исследованных 8 заводов России и Белоруссии характеризуется 100 %-ным обнаружением лактококкофага, высокими титрами обнаруживаемых фагов, лизирующих большую часть (около 60 %) лактококков. включаемых в бактериальные препараты (до использования бак-препарата в производстве).

3. Разработана необходимая и достаточная система фагового мониторинга, предупреждающая фаголизис заквасочной микрофлоры сыродельных предприятий, включающая контроль фага в критических точках, адекватное реагирование санитарными мероприятиями и применение фагоустойчивых культур (в частности, полученных методом конъюгации).

4. Проведено изучение возможности использования конъюгации для создания рекомбинантных штаммов молочнокислых бактерий с использованием в качестве модели пазмид, способных мобилизоваться и реплицироваться в Escherichia coll и Lactococcus lac-tls.

5. Показана возможность конъюгативной передачи генов, контролирующих фагоустойчивость с использованием генетических маркеров антибиотикоустойчивости и фагоспецифичности, для создания рекомбинантных бактерий L. lactls.

6. Методом конъюгации из производственных фагочувствитель-ных штаммов получена группа рекомбинантных штаммов L. lactls, обладающих повышенной фагоустойчивостью. Показано, что полученные рекомбинантные штаммы обладают свойствами, позволяющими эф-

фективно использовать их в составе заквасок для сыров.

7. Применение заквасок с повышенной фагоустойчивостью, полученных методом коньюгации, в производстве сыров ведет к повышению качества сыров, имеющему определенный экономический эффект.

Основные положения диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Ахвердян В.3., Протасова И.С., Перфильев Г.Д.,Ожгихина H.H. и др. Разработка генетических методов получения фагоустой-чивых штаммов лактококков // Образование в условиях реформ: опыт, проблемы, научные исследования: Тез. докл. - Кемерово, 1997. - С. 75.

2. Суслов В.Н., Сорокина Н.П., Медведева 3.П., Протасова И.С. и др. Коллекция молочнокислых бактерий и бактериофагов ВНИИМС- УЗБ // образование в условиях реформ: опыт, проблемы, научные исследования: Тез. докл. - Кемерово, 1997. - С. 74.

3. Рогов Н.Г., Перфильев Г.Д., Протасова И.С., Гудко H.H. и др. Частота обнаружения фагов лактококков на сыродельных заводах // Вклад науки в развитие маслоделия и сыроделия: Тез. ДОКЛ. - Углич, - 1994. - С. 204 - 205.

4. Рогов Г.Н., Перфильев Г.Д., Протасова И.С., Гудков A.B. и др. Совершенствование метода индикации бактериофагов лактококков в окружающей среде // Вклад науки в развитие маслоделия и сыроделия: Тез. докл. - Углич, - 1994. - С. 203.

5. Перфильев Г.Д., Гудков A.B., Рогов Г.Н., Протасова И.С. Фаговый мониторинг в системе интегрального микробиологического контроля в сыроделии // Вклад науки в развитие маслоделия и сыроделия: Тез. докл. - Углич, - 1994. - С. 202.

6. Ахвердян В.3., Протасова И.С., Перфильев Г.Д. Изучение антибиотикоустойчивости лактококков с целью использования ее в качестве метки в генетической инженерии // Вклад науки в развитие маслоделия и сыроделия: Тез. докл. - Углич, - 1994. - С. 212.

7. Ахвердян В.З., Протасова И.С., Перфильев Г.Д. Модификация методики получения фагоустойчивых экс-конъюгантов лактококков // Вклад науки в развитие маслоделия и сыроделия: Тез. докл. - Углич, - 1994. - С. 213.

8. Ахвердян В.3., Лобанов А.0., Протасова И.С., Перфильев Г.Д. Получение рекомбинантных фагорезистентных культур , лакто-кокков модифицированным методом конъюгативного переноса и изучение их свойств // Вклад науки в развитие маслоделия и сыроделия: Тез. докл. - Углич, - 1994. - С. 214.

.9. Akhwerdyan V.Z.. Frelzon Е. V., GudkovA. V., Protasova I.S. Morhological and classification of phages of lactococci isolated during cheese production // 24 International dairy congress Melbourne, Australia 18TH - 22ND September 1994. - S. 241.

10. Перфильев Г.Д., Ожгихина H. H., Протасова И.С., Головков В.П. Новые бактериальные концентраты для сыров // Образование в условиях реформ: опыт, проблемы, научные исследования: Тез. докл. - Кемерово, 1997. - С. 21.

11. Головков В.П., Перфильев Г.Д., Ожгихина H.Н., Протасова И.С. и др. Бактериальные концентраты для сыров на основе генетически модифицированных штамов молочнокислых бактерий //Научные основы прогрессивных технологий хранения и переработки сельзозпродукции для создания продуктов питания человека: Тез. докл. - Углич. - 1995. - С. 152.

Заказ № 386-Р Тираж 100 экз. Подписано в печать 24.03.98 г. ИЦ ВГМХА 160901 г.Вологда, п.Молочное, ул.Емельянова,!