автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Получение, свойства и применение микробной эндо-1,4-β-ксиланазы

На правах рукописи

ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ МИКРОБНОЙ ЭНДО-1,4-р -КСИЛАНАЗЫ

Специальность: 05.18.07 - Биотехнология пищевых продуктов

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Воронеж 2004

Работа выполнена на кафедре микробиологии и биохимии Воронежской государственной технологической академии

Научный руководитель: доктор технических наук,

профессор Григоров Василий Степанович

Официальные оппоненты:

доктор технических наук, профессор Востриков Сергей Всеволодович

кандидат технических наук, доцент Кочергина Наталья Ивановна

Ведущая организация: Московский государственный

университет пищевых производств

Защита диссертации состоится 23 декабря в ю30 на заседании диссертационного совета Д 212.035.04 при Воронежской государственной технологической академии (394000, г. Воронеж, проспект Революции, 19, конференц-зал).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВГТА.

Автореферат разослан <$?» ноября 2004 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

И.А. Глотова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Исследование микробного синтеза ферментов, их физико-химических свойств, специфичности действия имеет важное практическое значение с точки зрения рационального использования ферментных препаратов и интенсификации технологических процессов.

Растительное сырье из-за его большой распространенности находит все большее применение в различных отраслях пищевой промышленности. Так ксиланы достаточно широко распространенные в природе (содержание их в клеточных стенках растений составляет до 40%), рассматриваются как потенциальный источник моно- и олиго-сахаридов, спиртов и других органических соединений, в которые они могут быть превращены под действии систем ферментов, способствующих их расщеплению. Поэтому среди гидролитических ферментов все больше находит свое применение в промышленности эндо-1,4-р-ксиланаза (КФ 3.2.1.8) (1,4-р-Б-ксилан ксиланогидролаза), катализирующая эндогидролиз (1,4) -Р-Б-ксилозидных связей в ксила-нах.

Вопросам исследования свойств эндо-1,4~Р-ксиланаз и их применения в различных отраслях промышлености посвящены работы Ро-дионовой НА (2002), Гужовой Э.П. (1987), Элисашвили В.И. (1999), 8иЬгашашуап 8. (1998), Тепкапеп М. (1997) и многих других отечественных и зарубежных авторов. Так, исследован биосинтез фермента, проведена очистка, изучены некоторые физико-химические свойства. Однако данных исследований не достаточно, в связи с этим остается важным и актуальным вопрос поиска новых высокоактивных продуцентов ферментов, гидролизующих ксилан.

Настоящая работа выполнялась в соответствии с планом научных исследований кафедры микробиологии и биохимии Воронежской государственной технологической академии по теме «Изыскание оптимальных условий микробного синтеза ферментов и исследование их физико-химических свойств» (№ гос. регистрации 01930004491), 2001-2005 гг.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось получение и исследование физико-химических свойств микробной эндо-1,4-Р-ксиланазы. Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих основных задач:

выбор активного продуцента эндо-1,4-Р-ксиланазы; исследование условий биосинтеза и рационального режима культивирования продуцента;

разработка эффективного метода выделения и очистки эндо-1,4~Р-ксиланазы;

изучение некоторых физико-химических свойств фермента; определение кинетических закономерностей и термодинамических параметров кислотной и термической инактивации высокоочищенной эндо-1,4-р-ксиланазы;

использование ферментного препарата при производстве

пива.

Научная новизна. Научные положения диссертационной работы помогают расширить и углубить фундаментальные знания о регуляции метаболизма микромицетов на уровне исследуемого фермента. Изучены физиолого-биохимические особенности штамма ИЬиорш уаг шкюрогш 595 и условия биосинтеза эндо-1,4- Р-ксиланазы. Обоснованы подходы, принципы и методы получения препарата фермента различной степени чистоты. Установлены закономерности процесса биокатализа в зависимости от внешних факторов. Исследована термическая и кислотная инактивация эндо-1,4- р-ксиланазы. Обоснованы параметры и условия применения ферментного препарата при производстве пива.

Практическая значимость работы. Разработаны режимы и компонентный состав питательных сред при твердофазном и глубинном культивировании микромицета . Штамм Шигорш уаг гшсгс^рогш 595 рекомендован в качестве продуцента эндо-1,4- р-ксиланазы для промышленного использования. Реализована технология получения препарата эндо-1,4- Р-ксиланазы и определены его физико-химические и биохимические свойства. Установлены параметры стабильности и максимальной активности фермента. Обоснована необходимость применения ферментного препарата в пивоваренной промышленности при получении пивного сусла. Подобраны: стадия внесения препарата, дозировка, температура и длительность выдержки затора, что положительно сказывается на выходе готового продукта и сокращении затрат на основное сырье.

Промышленная апробация в условиях предприятия ПТК «Вена» подтвердила целесообразность и практическую значимость результатов исследований.

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации докладывались и обсуждались на внутривузовских и международных конференциях. Они были представлены на IV Международный симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 2001), международной конференции «Потребительский рынок: качество и безопасность товаров и услуг»

(Орел, 2001), II Всероссийской научно-технической конференции «Теория конфликта и ее приложения» (Воронеж, 2002), IV научно-практической конференции «Интродукция нетрадиционных и редких сельскохозяйственных растений» (Ульяновск, 2002), 6-ой и 7-ой Путинской школа-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино-2002, 2003), конференции «Современные методы теории функций и смежные проблемы» (Воронеж, 2003), межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные направления развития экологически безопасных технологий производства, хранения и переработки сельскохозяйственной продукции» (Воронеж, 2003) и внутривузовских конференциях ВГТА за 2001-2002 г.

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 13 публикациях.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 166 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (180 источников, в том числе 119 зарубежных авторов) и приложения. Иллюстративный материал включает 39 рисунков и 20 таблиц.

Работа выполнялась на базе кафедры «Микробиологии и биохимии» Воронежской государственной технологической академии. Автор выражает свою искреннюю благодарность научному руководителю д.т.н., профессору Григорову B.C., к.б.н., доценту Шуваевой ГЛ., д.б.н., профессору Корнеевой О.С. за оказанную помощь в выполнении и консультации при написании настоящей диссертационной работы, а также признательность коллективу кафедры за доброжелательное отношение при выполнении работы и содействие при оформлении диссертации.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Обзор литературы. Дана общая характеристика эндо-1,4-Р-ксиланаз. Показана способность микроорганизмов различных таксономических групп к биосинтезу фермента. Проведен сравнительный анализ физико-химических и каталитических свойств эндо-1,4-]3-ксиланаз различного происхождения.

Представлен анализ отечественных и зарубежных исследований, касающихся опыта применения эндо-1,4- fJ-ксиланазы в производстве продуктов питания, в частности по использованию его в хлебопекарной и пивоваренной промышленности. Показано, что данное перспективное направление биотехнологии реализовано в недостаточной мере и требует активного развития.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯЧАСТЬ

II. Объекты и методы исследований. Схема экспериментальных исследований представлена на рис. 1.

Объекты исследований. При выборе продуцента эндо-1,4-р-

ксиланазы исследовали культуры микромицетов, полученных из Всероссийской коллекции микроорганизмов. Культивирование продуцента осуществляли как глубинным, так и в поверхностным способами. В первом случае в колбах объемом 500 см3, содержащих по 100 см3 питательной среды вели выращивание продуцента на лабораторной качалке при скорости 1,7-1,8 с'1, температуре 28-30°С в течение 72 ч. В конце выращивания в отфильтрованной культуральной жидкости и мицелии определяли активность фермента.

При использовании твердофазного способа культивирования продуцент выращивали в термостате при 28-30°С в течение 48 часов. По окончанию культивирования биологическую массу высушивали, готовили вытяжку и определяли активность фермента.

Определение активности эндо-1,4-(5-ксиланазы основано на учете редуцирующих веществ, освобождающихся в процессе гидролиза ксилана под действием фермента. Редуцирующие сахара определяли методом Шомодьи-Нельсона.

За единицу активности принимали такое количество фермента, которое катализирует образование 1 мкмоля редуцирующих веществ за 1 мин в стандартных условиях.

Математическое планирование эксперимента. При подборе оптимального состава питательной среды для достижения максимального биосинтеза эндо-1,4- р-ксиланазы использовали полный факторный эксперимент и симплекс-решетчатое планирование эксперимента.

Выделение и очистка фермента. Для выделения ферментного препарата использовали осаждение различными органическими растворителями, фракционирование сульфатом аммония, ионообменную хроматографию на БЕЛЕ-целлюлозе, гель-громатографию на сефа-дексе в-25 и в-150. Гомогенность полученных фракций фермента определяли с помощью электрофореза в ПААГ по модифицированному методу Дэвиса и Орнстейна.

Определение молекулярной массы осуществляли электрофорезом в ПААГ в присутствии додецилсульфата № (ДСН) согласно методу Лаэммли и гель-фильтрацией на колонке с сефадексом в-150.

Аминокислотный анализ проводили на автоматическом анализаторе аминокислот ААА-339Т (Чехия). Метод основан на предвари-

Рисунок 1- Схема экспериментальных исследований

тельном окислении цистеина и метионина смесью перекиси водорода и муравьиной кислоты с последующим гидролизом соляной кислотой.

Определение конечных продуктов ферментат ивного гидро -лиза ксилана проводили методом восходящей хроматографии на пластинке «8огЫ31».

Для разделения углеводов использовали систему растворителей ацетонитрил - гидроксид аммония - уксусная кислота, проявитель дифениламин-анилиновым реактив.

Статистическая обработка результатов. Опыты проводились в 3-4-кратном повторении. Обсуждаются только те результаты, которые были воспроизведены в каждом опыте.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

III. Исследование биосинтеза ксиланазы К^орш уаг тюго-зрогт 595

Выбор активного продуцентаэндо-1,4-{-ксиланазы. С целью выявления наиболее активного продуцента ксиланазы исследовали 38 штаммов

микромицетов, хранящихся в музее чистых культур кафедры микробиологии и биохимии Воронежской государственной технологической академии.

Таблица 1-Активность ферментных препаратов по отношению к различным субстратам

| Активность, ед/г Штаммы

Л. уапшсго-Бропи 595 А. огугае Р-2096 А. шяег 2092 ТпсЬоёегта уШе 191

Ё-Фрукто-шуранозидазная - - 21,3 -

Йектолитическая - - • -

|Протеолитическая 14,7 - - -

[Целлюлолитическая 10,0 5,3 9,4 9,6

Н-Глкжоназная 17,6 - 4,3 15,8

|Галактоманазная 20,0 5,0 - 4,6

|а-Амилазная 18,1 25,4 15,5 17,2

Так как грибы аэрофилы, применяли наиболее простой в лабораторной практике поверхностный способ. В качестве питательной среды использовали пшеничные отруби, увлажненные водопроводной водой до влажности 60%. Длительность культивирования составляла 72 часа при температуре 28°С.

В результате выявлено 4 наиболее активных штамма: КЬкорш

уаг шюгсйрогш 595, А. снуете Б-2096, А. niger 2092, ТпсЬоёегша ушёе 191. Исходя из цели работы, а именно, использование продуцента в перерабатывающей промышленности, как источника комплекса ферментов, гидролизующих полисахариды клеточных оболочек злаковых, было интересно определить активности сопутствующих энзимов. Результаты исследований приведены в таблице 1. Полученные данные свидетельствуют, что наиболее перспективен по комплексу целевых ферментов штамм К. уаг шюгозрогш 595. Ксиланазная активность штамма КМгорш уаг шюгсйрогш 595 также превышала активности других продуцентов. Это позволило нам в дальнейшем реализовать его генетическую предрасположенность, подобрав наиболее благоприятные условия для биосинтеза целевого фермента.

Разработкаусловий культивирования продуцентаэндо-1,4-/1-ксиланазы Rhizopus гаг microsporus 595 на твердых питательных средах. Главным достоинством поверхностного культивирования является значительный выход (70-80% от массы среды) и высокая активность целевых ферментов.

Важнейшими факторами, влияющими на биосинтез ферментов микроорганизмами, является состав питательной среды, продолжительность выращивания, температура, влажность и рН. Критерием оценки влияния каждого фактора на процесс биосинтеза служила активность ксиланазы.

Исследования показали, что продуцент максимально продуцирует фермент на среде, состоящей из солодовых ростков, измельченной соломы и пшеничных отрубей. Для выбора оптимальных соотношений компонентов среды было применено симплекс-решетчатое планирование эксперимента и по-

0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 078^9 1 лучено уравнение аде-

X, кватно описывающее

Рисунок 2- Зависимость активности ксиланазы процесс биосинтеза

от компонентов среды, ед/г: 1-70,2-80, 3-90, , т-т

4-100, 5-110, где Х1-отруби, Х2-солома, фермента. Построенная

ХЗ-солодовые ростки. по уравнению номо-

грамма (рисунок 2) позволяет на практике выбрать соотношение компонентов среды для максимальной активности энзима.

Результаты показали, что максимальный биосинтез фермента проявлялся на среде, состоящей из солодовых ростков, измельченной соломы и пшеничных отрубей в соотношениях (0,3-0,6: 0-0,1:0,4-0,7) увлажненных фосфатно-цитратным буфером с рН 6,0-6,2 при температуре выращивания 32-34°С и влажности среды 65% за 48 ч культивирования. При таких значениях параметров активность ксиланазы составила 123 ед/г.

Разработка условий культивирования продуцентаэндо-1,4 ксиланазы Rhizopus var microsporus 595 при глубинном способе выращивания. Глубинное культивирование на жидких питательных средах также находит широкое применение как наиболее перспективный способ, обладающий преимуществами с точки зрения автоматизации и высоким санитарно-гигиеническим уровнем производства.

Исследование влияния углеродного питания на биосинтез кси-ланаз микромицетами проводили на фоне среды Чапека. Анализируя полученные данные все исследованные источники углерода можно расположить по способности к биосинтезу ксиланазы в следующий нисходящий ряд: ксилоза > галактоза > арабиноза > ксилан> глюкоза > мальтоза > лактоза > рафиноза > сахароза > инозит > крахмал > целлюлоза (рисунок 3).

Влияние отдельных соединений не ограничивалось только изменением активности препаратов, но сказывалось также на количестве образующейся биомассы. Наибольшее накопление мицелия наблюдалось при выращивании на среде с крахмалом. Надо отметить, что активность фермента в культуральной жидкости значительно превышает этот показатель в мицелии, что позволяет пренебречь последней.

" 12

Рисунок 3- Влияние различных источников углерода на биосинтез ксиланазы: 1-инозит, 2-ксилоза,3-галактоза, 4-мальтоза, 5-глюкоза,

6-арабиноза, 7-рафиноза, 8-сахароза, 9-лактоза, 10-ксилан, 11-крахмал, 12-целлюлоза

Ксилоза, по всей видимости, является индуктором синтеза кси-ланазы микромицетом, что позволяет отнести с определенной долей вероятности исследованную нами ксиланазу к индуцибельным ферментам.

Наряду с углеродом в процессе биосинтеза ферментов большое значение имеют также источники азота.

Влияние минеральных источников азота изучали на фоне ксилозы, ее концентрация составила 3% по массе среды. Неорганические и органические азотсодержащие соли вносили в количестве, эквивалентном по азоту.

Из таблице 2 видно, что используемые источники оказывали различное влияние на биосинтезэндо-1,4-Р-ксиланазы.

Таблица 2 -Влияние различных источников азота на биосинтез

эндо-1,4- -ксиланазы

Источник азота Концентрация, рН в кон- Рост Активность,

% це роста ед/см3

ЫаЫОз(контроль) 3,0 4,2 Слабый 12,3

КШз 3,9 3,9 ' Средний 11,4

ЫНДРОд 4,2 4,1 Средний 7,9

(МШВД 2,4 6,2 Средний 6,5

(МШ04 2,4 3,4 Слабый 14,2

N¡»N02 • 2,5 4,7 Слабый -

(МША 4,1 1,6 Слабый 4,0

ЬШ4С1 1,9 3,1 Слабый 7,9

№>2С204 2,5 4,9 Средний 7,8

(КНЛСЛОб 2,9 4,8 Средний 7,8

(МНЖСДО, 3,3 4,3 Средний 1,7

Лучшей оказалась среда, где в качестве неорганического источника азота использовался сернокислый аммоний. Их всех прочих солей высокий уровень биосинтеза фермента обеспечивал нитрат натрия.

Для нормального развития микромицетов и синтеза ими ферментов в питательной среде должны содержатся, кроме перечисленных, такие компоненты как фосфор, магний, калий, микроэлементы и различные стимуляторы роста. Функцией минеральных элементов является, в основном, активация различных ферментов. Большое значение в клеточном метаболизме играет фосфор, он непосредственно влияет на размножение микромицетов и тем самым обеспечивает синтез ферментов.

В таблице 3 представлены результаты исследований по влиянию различных источников минерального фосфора на модифициро-

ванной среде Чапека, где в качестве источника углерода использовали ксилозу, а источника азота - сернокислый аммоний.

Таблица 3- Влияние различных источников фосфора на биосинтез _эндо-1,4-Р-ксиланазы___

Источник фосфора Концентрация, % рН в конце роста Рост Активность, ед/см3

КН2Р04 1,0 3,4 Слабый 15,3

К2НР04 13 6,0 Средний 7,9

ЫаН2Р04 1,0 4,7 Средний 6,8

Ка2НР04 1,1 5,9 Слабый 5,5

Ш,Н2Р04 0,9 3,4 Средний 6,6

(Ш4)2НР04 1,0 5,6 Средний 6,8

М^НРС^ 1,1 5,4 Средний 6,2

СаНР04 1,3 5,3 Слабый 7,7

Данные показывают, что максимум содержания ксиланазы в фильтрате культуральной жидкости достигается на среде, где в качестве источника фосфора использовали калий фосфорнокислый одно-замещенный.

Известно, что различные органические добавки, такие как пептон, дрожжевой экстракт, пшеничная солома, пшеничные отруби, солодовые ростки, кукурузный экстракт, положительно влияют на активность фермента. В них находятся в различных соотношениях углерод и азот, а также соли фосфора, магния, кальция; ростовые вещества, такие как аминокислоты и витамины оказывающие стимулирующее действие на развитие культуры и биосинтез конечного продукта.

Наибольшая активность ксиланазы была отмечена на среде с кукурузным экстрактом в концентрации 0,5%, что согласуется с литературными данными.

Отмечено, что при добавлении в среду сульфата магния, активность фермента возрастала на 15%, что не противоречит данным других авторов.

На основании полученных результатов, используя методы статистической обработки, было изучено взаимное влияние различных факторов на процесс биосинтеза ксиланазы. Подобрана оптимальная среда для выращивания продуцента, (г/л): ксилоза-18,6, сульфат аммония -2,3, калий фосфорнокислый однозамещенный -2,7, сульфат магния-0,5 и кукурузный экстракт - 0,03 % объемных. В этом случае активность фермента составила 25 ед/см3.

Надо отметить, что результаты исследований по влиянию начального значения рН среды и температуры культивирования на активность ксиланазы при глубинном способе выращивания совпадали с аналогичными исследования при твердофазном культивировании продуцента.

На среде лучшего состава нами была исследована динамика накопления биомассы, белка, изменения рН и активности фермента, продуцируемого изучаемым штаммом, так как именно эти параметры наиболее полно характеризуют морфо-физиологическое развитие микроорганизма (рисунок 4).

Таблица 4-Сравнительная характеристика условий выращивания продуцента при поверхностном и глубинном способах культивирования

Условия Поверхностный способ выращивания Глубинный способ выращивания

Продолжительность культивирования,ч 48 72

Температура, °С 32-34

рН среды 6,0-6,2

Влажность среды, % 65 -

Состав питательной среды отруби: солома: солодовые ростки (0,3-0,6:0-0,1:0,4-0,7) Ксилоза-18,6 г/л (ЫН4)2804-2,Зг/Л КН2РО4 - 2,7 г/л 1^04-0,5г/л кукурузный экстракт -0,03%

Активность фермента 123 ед/г 25 ед/см'

Таким образом, найден активный продуцент ксиланазы и разработаны условия, оптимальные для биосинтеза фермента при поверхностном и глубинном способах культивирования.

10 20 30 40 $0 60 70 80 90 Т,ч

Рисунок 4- Динамика биосинтеза ксиланазы на оптимизированной среде, где Ьбиомаси (М,%),

Ш-акгивность фермента (А, ед/см'), ¡У-рН.

IV, Получение препарата эндо-1,4-ф-ксиланазы Rhizopus уаг шicгospoгus 595 и исследование его Физико-химических свойств

Для исследования свойств ферментов обязательным условием является получение препарата высокой степени очистки.

Для выделения ферментного препарата использовали осаждение этиловым спиртом, ионообменную хроматографию на ББАБ-целлюлозе (рисунок 5) и гель-хроматографию на се-фадексе в-25 и в-150 (таблица 5).

I 26Фракпин

Рисунок 5 - Очистка эндоксиланазы на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой: 1-белок, мг/см3, Н-активность фермента, ед/см1

Таблица 5 - Очистка эндо-1,4-|$-ксиланазы

Этапы очистки Объем, см3 Общий белок, мг Активность Степень очистки Выход по активности, %

общая, ед удельная, ед/мг белка

Культуральная жидкость 80 96 1920 20,00 1 100

Осаждение этанолом 4,00 9,60 277,30 28,90 1,44 14,4

Сефадекс й-25 3,00 2,31 94,30 40,90 2,04 4,91

ДЭАЭ-целлюлоза 3,00 0,18 86,40 480,00 24,00 4,50

Сефадекс 0-150 3,00 0,06 71,30 1188,90 59,44 3,70

Гомогенность ксиланазы исследовалась несколькими методами, что свидетельствует о достоверности полученных результатов. Так, при повторной хроматографии на сефадексе в-150 фермент элюиро-вался в виде одного симметричного пика белка и ксиланазной активности. При проведении электрофореза в полиакриламидном геле ксиланаза давала одну полосу белка, что подтверждает ее однородность (рисунок 6).

Было рассчитано, что фермент элюировался с колонки сефадек-са в-150 с удерживаемым объемом, отвечающим 100-110 кДа.

Изучение строения молекулы ксиланазы показало, что фермент состоит из двух субъединиц различной молекулярной массы что со-

Рисунок 6- Электрофореграмма ксиланазы различной степени очистки 1-спиртоосажденный фермент,2-белок после очистки на G-25, 3-очищенный на ДЭАЭ-целлюлозс, 4 ксиланаза после очистки на G-150

*' р-

Рисунок 7- Электрофорез ксиланазы с ДСН Маркерные белки 1-целлюлаза (94,5 кДа), 2-бычий сывороточный альбумин (66,2 кДа), 3-яичный альбумин(45 кДа), 4-карбоангидраза (31 кДа), 5-ингибитор трипсина (21,5 к Да), 6-лизоцим (14,4 кДа),7- ксиланаза

гласуется с некоторыми литературными данными по другим продуцентам Исследуемый белок давал две полосы, соответствующие молекулярным массам 50 и 56 кДа (рисунок 7).

В ходе исследования был определен аминокислотный состав ксиланазы Шгор^ уаг ташрогш 595. Полученные данные показывают, что массовая доля глутаминовой и аспарагиновой кислот, лейцина, лизина варьируется в пределах 5,8-9,3 %, а содержание таких аминокислот, как цистеин, метионин, тирозин составляет небольшой процент от их суммы.

ВлияниерН и температуры на активность фермента.

рН и температура -наиболее существенные факторы, от которых зависит применение фермента в пищевой технологии.

Влияние температуры на активность фермента имеет двоякое действие. С одной стороны, она приводит к денатурации белка и снижению каталитической функции, с другой - интенсифицирует скорость образования фермент-субстратного комплекса и все последующие этапы преобразования субстрата.

Определение оптимальной температуры действия ксиланазы проводили в диапазоне 20-70°С. По кривой зависимости активности ксиланазы от температуры, представленной на рис.8 видно, что температурный оптимум действия ксиланазы 50-55°С.

Изучение рН-оптимума действия ксиланазы Миорш уаг шгсго-8рогц8 595 проводили в интервале рН 4,0-9,0. Из рис. 9 видно, что в

Рисунок 8 - Влияние температуры инкубирования на активность ксиланазы

Рисунок 9- Влияние рН инкубирования на активность ксиланазы

диапазоне рН 4,0-9,0 кривая зависимости имеет колокообразный вид с максимумом активности фермента в точке с рН 6,0.

Кислотная и термическая инактивация эндо-1,4-ф-ксиланазы. Термо- и рН стабильность ферментов является важной характеристикой в технологии ферментных препаратов и их использовании в биотехнологии пищевых продуктов на различных стадиях технологического процесса. Данные характеристики ксиланаз изучены мало, поэтому исследование этих величин заслуживает особого внимания.

При исследовании термо- и рН-стабильности препарата ксиланазы его раствор выдерживали в фосфатно-цитратном буфере в диапазоне рН от 3,0 до 8,0 в интервале температур 30-65°С. Растворы инкубировались при указанных условиях и через опреде-Рисунок 10- Динамика инактивации ксиланазы ленные промежутки времени при температуре 30° и различных значениях определялась активность фер-рН: 1-3,0; 2-4,0; 3-5,0; 4-6,0; 5-7,0; 6-8,°. ментов, что позволило рассчитать константы скорости инактивации (таблица 6).

Результаты показали, что рН существенно влияет на активность ксиланазы. Скорость инактивации незначительна в пределах рН 5,0-

6,0 и увеличивается при отклонении рН как в области более кислых, так и щелочных значений.

Наибольшая стабильность ксиланазы отмечена в диапазоне рН5,0-6,0 и температуре 30-50°С . При рН 6,0 и температуре 30°С активность ксиланазы снижалась на 32% за 144 ч, а при 60°С за 4 ч.

Повышение температуры до 60°С приводило к резкому снижению активности фермента (рисунок 10).

Таблица 6 - Влияние температуры и рН на константу скорости инак-

Температура, °С К(ч"') при рН

3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0

30 0,0127 0,0098 0,0039 0,0025 0,0055 0,0076

40 0,0223 0,0169 0,0070 0,0049 0,0101 0,0141

50 0,0692 0,0537 0,0200 0,0145 0,0304 0,0398

60 0,4074 0,3090 0,1202 0,0955 0,1763 0,2292

65 0,7586 0,5754 0,2328 0,1945 0,3312 0,4169

Следует отметить, что инактивация ксиланазы носит сложный характер.

На рисунке 11 представлены графики Аррениуса, где зависимость 1§К=Щ/Т) представляет собой две прямые линии с различным углом наклона к оси абсцисс (одна из них соответствует интервалу температур 30-45°С , другая - 45-65°С), что предполагает существование двух параллельных процессов инактивации с различными температурными коэффициентами. Скорость реакции, характеризующаяся более высоким температурным коэффициентом, увеличивается с ростом температуры быстрее, чем скорость второй реакции. Очевидно что при более высоких значениях температуры первая становится доминирующей.

Термодинамические расчеты проведены для следующих интервалов температур: 30-45°С и 45-65°С. Поскольку инактивация в условиях наших опытов была необратима, то

Рисунок 11- График Аррениуса щ=1(1/Т)

для различных значений рН 1-3,0,2-4,0, °ПределИГЬ ее ИСТИН-

3- 8,0,4-7,0,5-5,0.6-6,0 ные термодинамиче-

ские параметры - энергию активации (Е,„) энтальпию АН, свободную энергию Дв, энтропию Д8 не представляется возможным. Но, воспользовавшись теорией абсолютных скоростей реакций, можно дать характеристику основных термодинамических функций (Е^т), (дН^, ис*), (дБ*), описывающих переходное состояние ксиланазы из активной в инактивную форму.

Рассчитанные термодинамические характеристики ксиланазы представлены в таблице 7.

Таблица 7 -Термодинамическая характеристика переходного комплекса в _процессе инактивации эндо-1.4-р-ксиланазы_

рН Температура, Еакт лН* дО* дБ*

°С кДж-моль'1 Дж-град'-моль"'

3 30-45 39,83 37,27 86,00 -158,21

45-65 142,86 140,11 84,95 166,65

4 30-45 40,22 37,66 86,69 -159,19

45-65 143,63 140,88 85,69 166,74

5 30-45 45,96 43,4 89,00 -140,45

45-65 153,2 150,45 88,30 187,76

6 30-45 53,62 51,06 90,05 -126,59

45-65 161,41 158,66 88,97 210,54

7 30-45 44,05 41,49 88,37 -152,21

45-65 149,37 146,62 87,24 179,40

8 30-45 42,13 39,57 87,23 -154,74

45-65 145,54 142,79 86,53 169,97

Как видно из таблицы 7, для ксиланазы £„„, ДН* и существенно возрастают при повышении температуры от 45°С. Увеличение дБ* свидетельствует о снижении степени упорядоченности информации белковой глобулы, что приводит к переходу глобулы в хаотический клубок. Для ксиланазы такое состояние наступает при температуре 45-65°С, что свидетельствует о достаточно высокой прочности структуры этого фермента, видимо, за счет гидрофобных взаимодействий.

Изучение действияэндо-1,4--р-ксилашзы на ксилан. Условно эндо-1,4$-ксиланазы микроорганизмов могут быть разделены на ферменты, гидролизующие субстраты до ксилозы и ксилоолигосаха-ридов, и на ферменты, гидролизующие субстраты только до ксило-олигосахаридов, среди которых основным продуктом является ксило-биоза.

Для определения конечных продуктов гидролиза ксилана эндо-1,4- р-ксиланазой йкорш уаг ш1сго8рогте 595 был использован метод восходящей тонкослойной хроматографии.

Результаты показали, что в составе гидролизата преобладают ксилоолитосахариды со степенью полимеризации больше трех. Этот факт достоверно подтверждает, что фермент относится к эндо-1,4-р-ксиланазам, катализирующим эндогидролиз (1,4)-Р~Б-ксилозидных связей в ксиланах.

Величину константы Михаэлиса (Кт) и максимальную скорость гидролиза ксилана под действием эндо-1,4-р-ксиланазы определяли экспериментально методом двойных обратных величин по Лайнуве-ру-Берку.

Кщ для ксилана составила 5 мг/мл. Результаты исследований коррелируют с литературными данными, где отмечается, что константа Михаэлиса по этому субстрату варьируется в пределах 3-24 мг/мл.

Исследование ферментативного гидролиза ксилана. Ферментативный гидролиз ксилансодержащего сырья в настоящее время рассматривается как одно из наиболее перспективных направлений в пищевой промышленности, особенно важен он при производстве пива, т.к. при гидролизе ксилана создаются условия выхода крахмала из крахмальных зерен и повышается количество сбраживающих Сахаров в сусле.

В связи с этим нами исследован процесс гидролиза ксилана сг,% сг.%

24 ^ 48 60 И 24 ^ 48 60 И

Рисунок 12-Динамика ферментативного гидролизаксилана а) при рН 6,0, дозировке препарата 10 ед/г и температурах (°С): 1-50; 2- 60; 340 б) при50оС, рН 6,0 и дозировке препарата, ед/г: 1-6; 2-8; 3-10; 4-12.

спиртоосажденным препаратом ксиломикроспорин ПОх.

Основными факторами, влияющими на процесс гидролиза кси-лана, являются температура, рН реакционной среды, концентрация субстрата и дозировка ферментного препарата.

Нами проводилось исследование влияния температуры на динамику гидролиза ксилана ферментным препаратом ксиломикроспорин при оптимальном значении рН для действия фермента

Необходимо отметить, что при температуре 50°С, рН 6,0 и дозировке препарата 10 ед/г за 60 ч ксилан гидролизуется на 47%, тогда как при 40 и 60°С степень гидролиза субстрата значительно ниже.

Увеличение концентрация ксилана до 6% и более снижает начальную скорость реакции.

Одним из основных факторов, оказывающих значительное влияние на процесс гидролиза ксилана, является дозировка ферментного препарата. Нами исследовано влияние концентрации ксиланазы на процесс гидролиза раствора ксилана с массовой долей 1%. Концентрацию субстрата выбирали исходя из содержания ксилана в заторе при получении пивного сусла. Фермент вносили в дозировке 6,8,10 и 12 единиц активности на 1 г ксилана. Гидролиз проводили при температуре 50°С и рН 6,0. Влияние дозировки ксиломикроспорина на степень гидролиза ксилана представлен на рисунке 12.

По результатам исследований получена вполне логическая закономерность накопления редуцирующих веществ в зависимости от дозировки ферментного препарата. За весь исследованный период процесс идет равномерно и не достигает полного гидролиза, степень гидролиза при этом составляет 45-47%. Максимальная степень гидролиза наблюдалась при дозировке ферментного препарата 10 ед/г ксилана за 60 ч; уменьшение или увеличение концентрации фермента нецелесообразно.

Идентификация аминокисл отных остатков активного цен -тра фермента показала, что карбоксильные группы аспарагиновой, либо глютаминовой кислот вносят существенный вклад в проявление ферментативной активности ксиланазы и входят в активный центр фермента или находятся в непосредственной близости от него, что не противоречит литературным данным.

V. Применение эндо-1,4-В-кснланазы при производстве пива.

Для производства пива основным сырьем является солод. Ксиланаза переводит нерастворимые клеточные стенки эндосперма ячменя в растворимое состояние, обеспечивая гидролиз ксилана. Действие ге-мицеллюлаз, в том числе эндо-1,4-р-ксиланазы, делает доступным со-

держимое крахмальных зерен для воздействия амилолитических ферментов. Для более полного растворения клеточных стенок эндосперма ячменя мы вносили ксиломикроспорин и исследовали его влияние на качество пивного сусла.

Исследование влиянияразличныхфакторов на качественные показатели пивного сусла. Основными факторами, определяющими действие фермента при получении пивного сусла, являются: количество фермента ксиломикроспорина в кг/т засыпи, температура и длительность выдержки затора.

Рисунок 13- Зависимость содержания РВ от дозировки препарата и температуры

Рисунок 14- Зависимость выхода экстракта от дозировки препарата и температуры

На рисунках 13-16 представлены данные по влиянию температуры, дозировки ферментного препарата и выдержки затора на содержание коллоидов, СВ в сусле, РВ и выход экстракта I сусла.

Дозировка,

Рисунок 15 -Зависимость содержания СВ от дозировки препарата и продолжительности паузы

Дозировка, кг/т

Рисунок 16- Зависимость количества коллоидов от дозировки препарата и продолжительности паузы

Таким образом подобраны: количество фермента ксиломикрос-

порина в 0,28 кг/т засыпи, температура 55°С и длительность выдержки затора 20 мин.

Разработка технологии получения пивного сусла с применением ксиломикроспорина. Получение пивного сусла осуществляли диффузионным способом. Ферментный препарат вносили во время белковой паузы при температуре 55 °С и выдержке 20 мин. Далее сусло готовили по традиционной технологии.

По всем показателям пиво, полученное с применением ксиломикроспорина (таблица 8), имело хороший, оригинальный вкус и соответствовало стандарту, при этом необходимо отметить, что использование ксиломикроспорина позволяет снизить себестоимость готового продукта, полученного по предложенной технологии, что немаловажно в условиях рыночных отношений.

Таблица 8 - Показатели экспериментального и контрольного пива

/ Показатели Ярпиво «Элитное» Экспериментальное

Концентрация начального сусла, % 13,0

Действительный экстракт пива, % 3,5 3,9

Содержание алкоголя, % 5,9 5,6

Кислотность, к. ед. 1,8 2,2

Цвет, ц. ед. 1,1 0,8

Содержание коллоидов, г/100 0,9 1,2

Пенообразование: 40 60

высота пены, мм

стойкость, мин 4. более 4

Содержание летучих компонентов, мг/дм3: 0,42 0,52

диацетила

альдегидов 16,2 16,5

высших спиртов 105,4 119,5

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Выбран микромицет Ишорив \аг нисговрогив 595, осуществляющий интенсивный биосинтез эндо-1,4-Р-ксиланазы.

2. Методом математического планирования эксперимента оптимизирован состав питательной среды для твердофазного способа культивирования продуцента при температуре - 32-34°С; рН-6,0-6,2; влажность среды - 65%; продолжительность биосинтеза бермента -48ч. Активность эндо -1,4 - ^-ксиланазы составила 123-130 ед/г.

3. Определены оптимальные условия эффективного биосинтеза эндо-1,4$-ксиланазы К. \аг писговрогив 595 при глубинном культиви-

ровании продуцента: температура - 32-34°С; рН среды - 6,0-6,2; продолжительность биосинтеза - 72ч. Подобран оптимальный состав среды (г/дм3): ксилоза-18,6, сульфат аммония -2,3, калий фосфорнокислый однозамещенный -2,7, сульфат магния-0,5 и кукурузный экстракт - 0,03 % объемных. Активность фермента составила 24-28 ед/см3.

4. Разработана эффективная схема очистки ксиломикроспорина, позволяющая получить высокоочищенный гомогенный ферментный препарат эндо-1,4-р-ксиланазы с удельной активностью 1190 ед/мг белка и степенью очистки 59,4. Установлено, что фермент является димером с молекулярной массой 110 кДа.

5. Изучены физико-химические и каталитические свойства фермента. Дана термодинамическая характеристика процесса кислотной и термической инактивации, установлены режимы ферментативного гидролиза ксилана.

6. Предложена технология производства пива с использованием эндо-1,4-^-ксиланазы Rhizopus var microsporus 595 на стадии получения сусла, позволяющая повысить выход экстракта и готового продукта.

Списокработ, опубликованных по теме диссертации

1. Sysoeva, M. Thermostable hemicellulasa producer selection [Текст]/Материалы научно-практической конференции аспирантов и соискателей ВГТА на иностранных языках "Актуальные проблемы научно-практических исследований и методологий",- Воронеж, 2001.-С.21.

2. Григоров, В. С. Изучение ксиланазы из Rhizopus var microsporus 595[Текст]/ B.C. Григоров, Г.П.Шуваева, М.Г.Сысоева// Материалы международной научно-практической конференции «Потребительский рынок: качество и безопасность товаров и услуг». - Орел, 2001. -Т.2.-С.182-183.

3. Григоров, В. С. Исследование биосинтеза ксиланазы Rhizopus var microsporus [Текст]/ В.С.Григоров, Г.П.Шуваева, М.Г.Сысоева// Материалы XL отчетной научной конференции за 2001 год. - Воро-неж,2002.-Т. 1-С.113-114.

4. Григоров, В. С. Оптимизация состава питательной среды при глубинном способе выращивания продуцента ксиланазы из Rhizopus var microsporus 595 [Текст]/ Г.П.Шуваева, В.С.Григоров, М.Г.Сысоева// Материалы II Всероссийской научно-технической конференции «Теория конфликта и ее приложения». - Воронеж, 2002.-С.252.

5. Григоров, В. С. Биосинтез ксиланазы на среде из нетрадиционного сырья [Текст]/ В.С.Григоров, Г.П.Шуваева, М.Г.Сысоева// Материалы

IV научно-практической конференции <<Иш|11;рщ||я91е^>аДщион-ных и редких сельскохозяйственна:» растений».-Ульяновск, 2002.-С.325-326.

6. Сысоева, М. Г. Оптимизация состава питательной среды и условий культивирования продуцента ксиланазы при поверхностном способе выращивания [Текст]/ М.Г.Сысоева, Г.П.Шуваева, Ю.С.Сербулов, В.С.Григоров // 6-ая Путинская школа-конференция молодых ученых «Биология-наукаХХ1 века». -Пущино, 2002.-Т1.-С.194-195.

7. Сысоева, М. Г. Применение ксиланазы при производстве пива [Текст]/ М.Г.Хысоева, Г.П.Шуваева, В.С.Григоров// 7-ая Путинская школа-конференция молодых ученых «Биология-наука XXI века». -Пущино, 2003.-С.132.

8. Григоров, В. С. Разработка условий культивирования продуцента ксиланазы Rhizopus var microsporus 595 [Текст]/ В.С.Григоров, Г.П.Шуваева, Ю.С.Сербулов, М.Г. Сысоева// Хранение и переработка сельхозсырья, 2003. - №3,- С.42-45.

9. Григоров, В. С. Выделение и очистка ксиланазы из Rhizopus var microsporus [Текст]/ В.С.Григоров, Г.П.Шуваева, М.Г.Сысоева/ Материалы XLI отчетной научной конференции за 2002 год. - Воронеж, 2003.-С 103-104.

10. Сысоева, М. Г. Направленный биосинтез ксиланазы [Текст]/ Материалы конференции «Современные методы теории функций и смежные проблемы».-Воронеж.- 2003 .-С.26.

11. Шуваева, Г. П. Применение ксиломикроспорина в пивоварении [Текст]/Г,П. Шуваева, А.Н. Федоров, М.Г. Сысоева, B.C. Григоров// Материалы межрегиональной научно-практической конферении по-свещенной 90-летию ВГАУ имени К. Д. Глинки «Актуальные направления развития экологически безопасных технологий производства, хранения и переработки сельскохозяйственной продукции».- Воронеж, 2003.- Т2.- Ч.2 .-С 197.

12. Шуваева, Г. П. Очистка эндоксиланазы из Rhizopus var microsporus 595 [Текст]/ Г.П. Шуваева, B.C. Григоров, А.Т. Епринцев, М.Г.Сысоева, А. Н.Ивентьев //Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов, 2003.- Вып 5.- С.151-155.

13. Сысоева, М.Г. Ферменты в пивоварении [Текст]/ М.Г. Сысоева Г.П. Шуваева, B.C. Григоров, В.А.Федоров, А.А.Еныпин // Материалы Ш научно-практической конференции «Совершенствование техники, технологии и методов управления на предприятиях пищевой и перерабатывающей промышленности».--Воронеж, 2004.-С.61-62.

Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Таймс. Ризография. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 152 С. Воронежский ЦНТИ. Свидетельство № 4509 от 28.12.93. 394030, Воронеж, пр. Революции, 30

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава I. Характеристика эндо-1,4-0-ксиланазы.

1.1 Ксиланы зерна злаков: структура, состав.

1.2 Продуценты эндо-1,4-/2-ксиланаз.

1.3 Направленный биосинтез эндо-1,4-/3-ксиланазы.

1.3.1 Влияние состава среды на биосинтез эндо-1,4-/£-ксиланазы.

1.3.2. Влияние условий культивирования на биосинтез эндо- 1,4-|(3-ксиланазы.

1.4 Выделение и очистка препаратов эндо-1,4-^-ксиланазы.

1.5 Физико-химические свойства эндо-1,4-/3-ксиланаз.

1.5.1 Молекулярная масса эндо-1,4-/3-ксиланаз и их структура.

1.5.2 Влияние рН и температуры на активность эндо-1,4-/£-ксиланаз.

1.5.3 Исследования каталитических центров.

1.6 Субстратная специфичность действия эндо-1,4-/3-ксиланаз.

1.7 Применение гемицеллюлозолитических ферментных препаратов в пищевой промышленности.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 2. Материалы и методы исследований.

2.1 Объекты исследований.

2.2 Методы определения активности фермента.

2.3 Определение количества белка.

2.4 Математическое планирование экспериментов.

2.5 Получение технического препарата эндо-1,4-/3-ксиланазы.

2.6 Гель-фильтрация и ионообменная хроматография.

2.7 Фракционирование ферментного препарата методом электрофореза.

2.8 Определение молекулярной массы фермента методом гель-фильтрации.

2.9 Определение субъединичной структуры белка методом электрофореза.

2.10 Тонкослойная хроматография конечных продуктов ферментативного гидролиза ксилана.

2.11 Анализ состава аминокислот.

2.12 Методы определения показателей солода, сусла и пива.

Глава 3. Исследование биосинтеза эндо-1,4-/5-ксиланазы Rhizopus var microsporus 595.

3.1. Получение активного продуцента эндо-1,4-/3-ксиланазы.

3.2 Разработка условий культивирования продуцента эндо-1,4-/3-ксиланазы R. var microsporus 595 на твердых питательных средах.

3.3 Разработка условий культивирования продуцента эндо-1,4-/3-ксиланазы R. var microsporus 595 при глубинном способе выращивания.

Глава 4. Получение препарата эндо-1,4-/3-ксиланазы

R. var microsporus 595 и исследование его физико-химических свойств.

4.1 Выделение и очистка эндо-1,4-/3-ксиланазы.

4.2. Определение молекулярной массы и субъединичного строения фермента.

4.3 Аминокислотный состав эндо-1,4-/3-ксиланазы.

4.4 Влияние рН и температуры на активность фермента.

4.5 Кислотная и термическая инактивация эндо-1,4-/3-ксиланазы.

4.6 Изучение действия эндо-1,4-0-ксиланазы на ксилан.

4.7 Определение константы Михаэлиса эндо-1,4-/3-ксиланазы.

4.8 Исследование ферментативного гидролиза ксилана.

4.9 Идентификация аминокислотных остатков активного центра.

Глава 5. Применение ксиланазы в технологии пива.

5.1 Исследование влияния различных факторов на качественные показатели пивного сусла.

5.2 Разработка технологии получения пивного сусла с применением ксиломикроспорина.

Актуальность работы. Исследование микробного синтеза ферментов, их физико-химических свойств, специфичности действия имеет важное практическое значение с точки зрения рационального использования ферментных препаратов и интенсификации технологических процессов.

Растительное сырье из-за его доступности находит все большее применение в различных отраслях пищевой промышленности. Так ксиланы достаточно широко распространенные в природе (содержание их в клеточных стенках растений составляет до 40%), рассматриваются как потенциальный источник моно- и олигосахаридов, спиртов и других органических соединений, в которые они могут быть превращены под действии систем ферментов, способствующих их расщеплению. Поэтому среди гидролитических ферментов все больше находит свое применение в промышленности эндо-1,4-/3-ксиланаза (КФ 3.2.1.8) (1,4-/£-0-ксилан ксиланогидролаза), катализирующая эндогидролиз (1,4) -jS-D-ксилозидных связей в ксиланах.

Вопросами исследования свойств эндо-1,4-/3-ксиланаз и их применения в различных отраслях промышлености посвящены работы Родионовой Н.А. (2002), Гужовой Э.П. (1987), Элисашвили В.И. (1999), Subramaniyan S. (1998), Tenkanen М. (1997) и многих других отечественных и зарубежных авторов. Так, исследован биосинтез фермента, проведена очистка, изучены некоторые физико-химические свойства. Однако данных исследований не достаточно, в связи с этим остается важным и актуальным вопрос поиска новых высокоактивных продуцентов ферментов, гидролизующих ксилан.

Настоящая работа выполнялась в соответствии с тематикой научных исследований кафедры биохимии и микробиологии Воронежской государственной технологической академии по проблеме «Изыскание оптимальных условий микробного синтеза ферментов и исследование их физико-химических свойств» (№ гос. регистрации 01930004491) , 20012005 гг.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось получение и исследование физико-химических свойств микробной эндо-1,4-/3-ксиланазы.Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих основных задач:

- выбор активного продуцента эндо-1,4-/3-ксиланазы;

- исследование условий биосинтеза и рационального режима культивирования продуцента;

- разработка эффективного метода выделения и очистки эндо-1,4-/3-ксиланазы;

- изучение некоторых физико-химических свойств фермента;

- определение кинетических закономерностей и термодинамических параметров кислотной и термической инактивации высокоочищенной эндо-1,4-/3-ксиланазы;

- использование ферментного препарата при производстве пива.

Научная новизна. Научные положения диссертационной работы помогают расширить и углубить фундаментальные знания о регуляции метаболизма микромицетов на уровне исследуемого фермента. Изучены физиолого-биохимические особенности штамма Rhizopus var microsporus 595 и условия биосинтеза эндо-1,4-/3-ксиланазы. Обоснованы подходы, принципы и методы получения препарата фермента различной степени чистоты. Установлены закономерности процесса биокатализа в зависимости от внешних факторов. Исследована термическая и кислотная инактивация эндо-1,4-/3-ксиланазы. Обоснованы параметры и условия применения ферментного препарата при производстве пива.

Практическая значимость работы. Разработаны режимы и компонентный состав питательных сред при твердофазном и глубинном культивировании микромицета . Штамм Rhizopus var microsporus 595 рекомендован в качестве продуцента эндо-1,4-/3-ксиланазы для промышленного использования. Реализована технология получения препарата эндо-1,4-/3-ксиланазы и определены его физико-химические и биохимические свойства. Установлены параметры стабильности и максимальной активности фермента. Обоснована необходимость применения ферментного препарата в пивоваренной промышленности при получении пивного сусла. Подобраны: стадия внесения препарата, дозировка, температура и длительность выдержки затора, что положительно сказывается на выходе готового продукта и сокращении затрат на основное сырье.

Промышленная апробация в условиях предприятия ПТК «Вена» подтвердила целесообразность и практическую значимость результатов исследований.

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации докладывались и обсуждались на внутривузовских и международных конференциях. Они были представлены на IV Международный симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 2001), международной конференции «Потребительский рынок: качество и безопасность товаров и услуг» (Орел, 2001), II Всероссийской научно-технической конференции «Теория конфликта и ее приложения» (Воронеж, 2002), IV научно-практической конференции «Интродукция нетрадиционных и редких сельскохозяйственных растений» (Ульяновск, 2002), 6-ой и 7-ой Пущинской школа-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино-2002, 2003), конференции «Современные методы теории функций и смежные проблемы» (Воронеж, 2003), межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные направления развития экологически безопасных технологий производства, хранения и переработки сельскохозяйственной продукции» (Воронеж, 2003) и внутривузовских конференциях ВГТА за 2001-2002 г.

Публикации, Основные результаты диссертационной работы изложены в 13 публикациях.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 166 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (180 источников, в том числе 119 зарубежных авторов) и приложения. Иллюстративный материал включает 39 рисунков и 20 таблиц.

ВЫВОДЫ

1. Выбран мнкромнцет Rhizopus var microsporus 595, осуществляющий интенсивный биосинтез эндо-1,4-/3-ксиланазы.

2. Методом математического планирования эксперимента оптимизирован состав питательной среды для твердофазного способа культивирования продуцента при температуре - 32-34°С; рН-6,0-6,2; влажность среды - 65%; продолжительность биосинтеза бермента - 48ч. Активность эндо-1,4-/3-ксиланазы составила 123-130 ед/г.

3. Определены оптимальные условия эффективного биосинтеза эндо-1,4-/3-ксиланазы R. var microsporus 595 при глубинном культивировании продуцента: температура - 32-34°С; рН среды - 6,0-6,2; продолжительность биосинтеза - 72ч. Подобран оптимальный состав среды (г/дм3): ксилоза-18,6, сульфат аммония -2,3, калий фосфорнокислый однозамещенный -2,7, сульфат магния-0,5 и кукурузный экстракт - 0,03 % объемных. Активность фермента составила 24-28 ед/см3.

4. Разработана эффективная схема очистки ксиломикроспорина, позволяющая получить высокоочшценный гомогенный ферментный препарат эндо-1,4-/3-ксиланазы с удельной активностью 1190 ед/мг белка и степенью очистки 59,4. Установлено, что фермент является димером с молекулярной массой 110 кДа.

5. Изучены физико-химические и каталитические свойства фермента. Дана термодинамическая характеристика процесса кислотной и термической инактивации, установлены режимы ферментативного гидролиза ксилана.

6. Предложена технология производства пива с использованием эндо-1,4-/3-ксиланазы Rhizopus var microsporus 595 на стадии получения сусла, позволяющая повысить выход экстракта и готового продукта.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Эндо-1,4-/3-ксиланаза катализирует эндогидролиз (1,4) -/3-D-ксилозидных связей в D-ксиланах.

Вопросы поиска эффективных продуцентов эндо-1,4-/3-ксиланаз и исследование их физико-химических свойств является актуальным как в нашей стране, так и за рубежом. В качестве продуцентов эндо-1,4-0-ксиланаз используются культуры микроорганизмов из различных таксонометрических групп. Микроскопические грибы и бактерии являются наиболее изученной группой микроорганизмов среди продуцентов данного фермента.

Представляет интерес в исследовании особенностей биосинтеза эндо-1,4-/3-ксиланазы: рационального состава питательной среды и режима культивирования продуцента.

Фермент чаще всего имеет индуцибельную природу, поэтому в состав сред для культивирования продуцентов включают соответствующий индуктор. Как правило, роль индуктора при биосинтезе эндо-1,4-(8-ксиланазы выполняет ксилан или его структурный аналог.

Некоторые эндо-1,4-/3-ксиланазы получены в гомогенном состоянии. Из представленного литературного обзора видно, что биохимические и физико-химические свойства фермента мало изучены. Сравнительный анализ физико-химических и каталитических свойств отдельных представителей эндо-1,4-/3-ксиланаз наряду со сходными чертами характерны существенные отличия (оптимальная температура действия, рН-оптимум, термо- и рН-стабильность).

Эндо-1,4-/3-ксиланаза в последнее время находит применение в различных отраслях промышленности (комбикормовой, хлебопекарной, пивоваренной). В связи с этим исследования ферментативного гидролиза ксилана с помощью микробной эндо-1,4-/3-ксиланазы весьма актуальны и имеют теоретическую и практическую значимость.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Объекты исследований

Основным объектом исследований служила чистая культура микромицета Rhizopus microsporus var microsporus 595, взятая из Всероссийской коллекции микроорганизмов.

Чистую культуру выращивали на сусло-агаре в течение 6-7 сут. при температуре 28-30°С и затем хранили в холодильнике при 3-4°С. Пересевы проводили через определенные промежутки времени с таким расчетом, чтобы наилучшим образом сохранить физиолого-биохимические свойства штамма. [ 9]

Для биосинтеза ксиланазы использовали как глубинный, так и поверхностный способы культивирования. В первом случае среды готовили на водопроводной воде, заполняли колбы Эрленмейера объемом 500 см3 по 100 см3, использовали тройную стерилизацию в автоклаве при давлениии 0,10-0,12 МПа в течение 40 мин., охлаждали до 30-35°С и засевали водной суспензией микромицета в количестве 1% к объему питательной среды. Выращивание продуцента при глубинном методе вели на лабораторной качалке при скорости 1,7-1,8 с"1, температуре 28-30°С в течение 72 ч. В конце выращивания в отфильтрованной культуральной жидкости определяли активность фермента.

При использовании твердофазного способа культивирования продуцент выращивали в термостате при 28-30°С в течение 48 часов. По окончанию культивирования биологическую массу высушивали, готовили вытяжку и определяли активность фермента [9 ].

2.2 Методы определения активности ферментов

Метод основан на определении редуцирующих веществ, освобождающихся в процессе гидролиза ксилана под действием фермента.

За единицу активности принимали такое количество фермента, которое катализирует образование 1 мкмоля редуцирующих веществ за 1 мин в данных условиях.

Активность эндо-1,4-/3-ксиланазы определяли по отношению к ксилану. Для этого реакционную смесь, состоящую из 0,2 мл 1% раствора ксилана и 0,1мл раствора фермента, инкубировали в течение 1 часа при 40°С.

Параллельно готовили контрольный опыт, в котором использовали инактивированный раствор фермента.

По истечении времени инкубации реакцию останавливали добавлением 1 мл реактива Шомодьи. Затем пробирки с содержимым взбалтывали и погружали в кипящую водяную баню, охлаждали и определяли образовавшиеся восстанавливающие сахара по микрометоду Шомодьи-Нельсона, используя при этом калибровочный график, построенный по ксилозе [ 52 ].

Активность эндо-1,4-/3-ксиланазы расчитывали по формуле:

А = ———, (2.1)

М-п-х

•j где А-активность фермента, ед/г или ед/см ;

Ао- количество редуцирующих веществ, образовавшихся в результате гидролиза ксилана, мкг;

М - молекулярная масса ксилозы; г- время гидролиза, мин.

Для определения целлюлазной активности по отношению к бумаге инкубационную смесь, содержащую 50 мг бумаги, 2,75 мл 0,1 М ацетатного буфера рН 4,7 и 0,25 мл раствора фермента инкубировали в течение 60 мин при 40°С и определяли восстанавливающие сахара, используя калибровочную кривую, построенную по глюкозе.

2.3 Определение количества белка

Определение общего количества белка проводили по методу Лоури, используя калибровочный график, построенный по бычьему сывороточному альбумину. Оптическую плотность растворов определяли на ФЭК при длине волны 750 нм.

Содержание белка в высокоочшценных препаратах определяли также по поглощению при 280 и 260 нм.

2.4 Математическое планирование экспериментов

При подборе оптимального состава питательных сред и условий культивирования продуцента ксиланазы использовали полный факторный эксперимент с применением центрального композиционного рототабельного униформпланирования. Значения выходных параметров процесса и интервалы варьирования выбирались с таким расчетом, чтобы они перекрывали интересующий нас диапазон изменения факторов и располагались бы равномерно внутри этого интервала.

При обработке результатов экспериментов были применены следующие статистические критерии: для однородности - критерий Кохрена, значимости коэффициентов уравнения регрессии - критерий Стьюдента, адекватности уравнений регрессии - критерий Фишера. Определение оптимальных режимов проводили методом «ридж»-анализа, основанном на методе неопределенных множителей Лагранжа.

Все опыты, описанные в данной работе, проводились в 3-х кратной повторности. В таблицах и на рисунках показаны данные типичных опытов, причем каждое значение есть среднее из двух или четырех определений.

2.5 Получение технического препарата ксиланазы

Для выделения фермента ксиланазы использовали культуральную жидкость Rhizopus microsporus var microsporus 595. Фермент осаждали различными органическими растворителями, а также методом высаливания при температуре смеси 2-4°С. Для формирования осадка смесь выдерживали 15-20 мин. Осадок отделяли на центрифуге при частоте вращения 5000 об/мин и высушивали до воздушно-сухого состояния [9].

При исследовании влияния концентрации Н^-ионов на полноту осаждения фермента величину рН культуральной жидкости доводили 1М раствором HCI и NaOH до требуемого значения. В полученных препаратах определяли активность ксиланазы и сопутствующих ферментов, а также содержание белка по методу Лоури.

2.6 Гель-фильтрация и ионообменная хроматография

Из фильтрата культуральной жидкости фермент осаждали этанолом в соотношении 1:2,5 при температуре 2-4°С. Осадок отделяли центрифугированием, высушивали и растворяли в 0,5М Tris/HCI буфере, рН 6,5.

Для проведения гель-фильтрации использовали сефадексы G-25 и G-150 (Pharmacia; Швеция). Колонки готовили из стекла, при этом стремились к наличию минимального холостого объема. Сефадекс G-150 набухал в течение 3 суток в 0,5М Tris/HCI буфере, а сефадекс G-25- не менее трех часов в 0,5М Tris/HCI буфере, рН 6,5. Перед использованием для опытов колонки выдерживали в холодильнике и промывали соответствующими средами элюции.

Через готовую колонку пропускали 2 мл 0,2% раствора «голубого декстрана 2000», для измерения свободного объема колонки.

Объем наносимого образца не превышал 4мл. После нанесения пробы колонку заполняли буферным раствором и начинали элюирование.

На каждой стадии проводили определение активности ксиланазы, содержание белка на спектрофотометре при 260 и 280 нм и по Лоури.

Низкомолекулярные примеси из раствора фермента удаляли методом гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-25. Обессоленный раствор фермента наносили на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную 0,5М Tris/HCI буфером рН6,5. Элюцию осуществляли линейным градиентом KCI 0,2М в том же буфере.

На заключительном этапе фермент очищали гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-150 [ 9 ].

2.7 Фракционирование ферментного препарата методом электрофореза

Электрофоретической исследование проводили по модифицированному методу Дэвиса и Орнстейна. Разделение белкового раствора осуществляли на разделяющем (мелкопористом) геле, который содержал 6% и 10% полиакриламида. Применение концентрирующего (крупнопористого) геля, обеспечивало концентрацию белка. Растворы мелко- и крупнопористого гелей готовили, как описано у Мауэра. Разделение исследуемых белков проводили в основной буферной системе, рН 8,3. Для контроля за движением фронта в пробу вносили 0,1% раствор бромфенолового синего. Исследуемый образец наносили на гель вместе с 40% раствором сахарозы. Электрофоретическое разделение белков проводили на холоду (4°С). Подавали постоянный электрический ток- 10 мА. После проведения электрофореза гели окрашивали нитратом серебра. После окрашивания избыток красителя удаляли многократным погружением их в раствор 7% уксусной кислоты до полной прозрачности участков геля, не содержащих белки.

2.8 Определение молекулярной массы фермента методом гель-фильтрации

Для определения молекулярной массы ксиланазы использовали гель-фильтрацию через сефадекс G-150. Для этого колонку, откалиброванную с помощью голубого декстрана, наносили предварительно очищенный фермент.

При определении молекулярной массы фермент пропускали через колонку, заполненную сефадексом G-150 и измеряли объем его выхода (Ve). Расчет молекулярной массы изучаемого фермента определяли по формуле:

LgMr= 6,0404-0,8032(Ve/Vo), (2.2) где М - молекулярная масса фермента, Да;

Ve - объем выхода фермента, мл;

Vo- свободный объем колонки, мл.

2.9 Определение субъединичной структуры и молекулярной массы белка методом электрофореза

Для определения молекулярной массы методом электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия пользовались детергенной системой, описанной Леммли. Детергенная система состояла из следующих компонентов: Разделительный гель: 12,5% акриламид, 1,5И трис-НС1-буфер, рН8,8; 10% додецилсульфат натрия (ДСН); 0,025% N,N,N\]Sr-тетраметилэтилен диамид (ТЕМЕД); 10% персульфат аммония. Концентрирующий гель: 6% акриламид; 0,5М трис-НС1-буфер, рН6,8; 10% SDS; 0,025% ТЕМЕД и 10% персульфат аммония. Электродный буфер содержал 0,01 М трис-HCI; 0Д92М глицина; 1% ДСН, рН8,3. Образец готовили на 0,0625 М трис-НС1-буфере, рН 6,8, содержащем 2% ДСН, 10% глицирина, 5% меркаптоэтанола и 0,001% бромфенолового синего. После 10 минутного прогрева на водяной бане при температуре 80°С образец наносили на гель. Для построения калибровочной кривой и определения молекулярной массы субъединиц использовали стандартные маркерные белки.

После электрофореза гели окрашивали нитратом серебра. Гели хранили в 7% уксусной кислоте.

Большинство белков в присутствии ДСН диссоциирует на субъединицы. При электрофорезе в ПААГ комплексы мигрируют в соответствии с молекулярной массой. Длину полипептидной цепи определяли путем сравнения электрофоретической подвижности комплекса с подвижностью белков-маркеров с известными молекулярными массами [17].

2.10 Тонкослойная хроматография конечных продуктов ферментативного гидролиза ксилана

Смесь, содержащую 0,2 мл раствора 1-% ксилана и 0,1 мл раствора фермента инкубировали при 40°С в течение 8 часов и наносили на хроматографическую пластинку «Sorbfil».

В качестве углеводов-стандартов на бумагу наносили растворы ксилозы, арабинозы, ксилобиозы, ксилотриозы.

Для разделения углеводов использовали систему растворителей ацетонитрил - гидроксид аммония - уксусная кислота (40:5:5). Разделение проводили методом восходящей хроматографии при комнатной температуре. По окончании пропускания растворителей хроматограмму высушивали и проявляли сахара дифениламин-анилиновым проявителем, после чего прогревали в сушильном шкафу при 110°С в течение 5-10 мин. При этом на хроматограмме проявлялись пятна углеводов.

2.11 Анализ состава аминокислот

Метод определения аминокислот в белке основан на предварительном окислении цмстеина и метионина смесью перекиси водорода и муравьиной кислоты с последующим гидролизом соляной кислотой.

Аминокислотный анализ проводили на автоматическом анализаторе аминокислот ААА-339Т (Чехия). Подготовку пробы осуществляли следующим образом: в выпарительеную чашку помещали 100 мг ферментного препарата и 5 см3 смеси перекиси водорода и муравьиной кислоты ( соотношение их в растворе 1:9). Смесь выпативают при температуре 50°С до постоянной массы. Высушенный осадок подвергали о гидролизу 10 см 6н соляной кислотой при температуре 110°С в течение 24 ч с добавлением хлорида олова. Полученный гидролизат фильтровали и выпаривали 2 см в течение 4 ч. Осадок растворяли в 10 см 0,1н соляной кислоте и фильтровали.

Разделение аминокислот осуществляли на хроматографической колонке, заполненной ионоодменной смилой катеонитом Na+ «Oction AIVB №22», которую последовательно промывали ацетатным буферным раствором рН 3,5; 4,25; 9,55. На выходе из колонки аминокислоты, взаимодействуя с нингидрином, дают характерную окриску, которая регистрируется прибором и выдается в виде хроматограмы. Интенсивность окрашивания прямо пропорциональна концентрации данной аминокислоты в растворе. Количественной содержание аминокислот определяется по формуле с = 8,Мь-п.10-10-10-9

S2-H v где С-концентрация аминокислоты, %; Si-высота пика исследуемого образца, мм; S2 -высота пика стандарта, мм; Мь-молекулярная масса аминокислоты, моль; n-содержание белка, мг/см [17].

2.12 Методы определения показателей солода, сусла и пива

Определение содержания растворимых сухих веществ сусла Содержание растворимых сухих веществ определяют пикнометрическим методом.

Измерив массу пикнометра с водой, суслом, а также пустой пикнометр при t=20 °С. Плотность раствора при t находят по формуле т2-т)/(т 1 -т), (2.4) где т-масса пустого пикнометра, г; mi-масса пикнометра с дистиллированной водой, г; т2-масса пикнометра с исследуемым раствором, г. Зная величину плотности, по приложению находят эквивалентное содержание сухих веществ [35].

Определение экстрактивности солода

Сущность метода заключается в переводе в раствор экстрактивных веществ солода под действием его собственных ферментов при условиях, близких к оптимальным, с последующим фильтрованием раствора. В фильтрате с помощью пикнометра определяют относительную плотность и по приложению 1 находят соответствующее ей содержание экстрактивных веществ в лабораторном сусле (в масс. %) [10]. Зная влажность солода оз, рассчитывают экстрактивность солода (в %) на воздушно-сухое вещество Е по формуле:

Е = е(800 + со), (2.5)

100-е v 7 где е - содержание экстрактивных веществ в лабораторном сусле, % w - влажность солода Определение содержания общего экстракта

Затирание солода вели в заторном аппарате Ш-4. Дробленый солод массой 50 г затирали с 200 г воды. После этого закрепляли мешалку и стакан с затором устанавливали в водяную баню аппарата. Одновременно в специальный цилиндр наливали 100 г воды для разбавления затора и также устанавливали в водяную баню. Включали аппарат в сеть и запускали программу. По достижении 46 °С начиналось постепенное нагревание затора до температуры 70 °С в течение 55 минут. По достижении температуры 70 °С к затору прибавляли 100 г воды и переводили аппарат в режим осахаривания, т.е. температура 70 °С поддерживалась автоматически в течение 55 минут. Далее после завершения осахаривания массу содержимого стакана доводили до 450 г и переносили в центрифугу после чего определяли содержание сухих веществ в прозрачном сусле, а затем рассчитывали выход экстракта [35].

Определение массовой доли коллоидов

Для определения массовой доли коллоидов 1 см сусла смешивали с

•а

10 см спирта. Смесь встряхивали в течение трех минут. Затем раствор выливали на предварительно высушенный и взвешенный фильтр. После того как вся жидкость проходила через фильтр, его вторично высушивали и взвешивали. Массовую долю коллоидов находили по разности масс фильтра с осадком и без осадка.

ГЛАВА III. ИССЛЕДОВАНИЕ БИОСИНТЕЗА КСИЛАНАЗЫ RHIZOPUS VAR MICROSPORUS 595

3.1. Получение активного продуцента эндо-1,4-Д-ксиланазы

При разработке метода и режима производства ферментов целесообразно начать с поиска наиболее активного штамма. Поэтому важное значение приобретает тщательный выбор исходной формы гриба, которая должна обладать наивысшей способностью к образованию целевого фермента.

С целью выявления наиболее активного продуцента ксиланазы исследовали 38 штаммов микромицетов, полученных из Всероссийской коллекции микроорганизмов и хранящихся в музее чистых культур кафедры микробиологии и биохимии Воронежской государственной технологической академии.

Так как грибы аэрофилы, использовали наиболее простой в лабораторной практике поверхностный способ. Продуценты выращивали в колбах Эрленмейера объемом 500 см в термостате при относительной влажности воздуха 98-100%. В качестве питательной среды использовали пшеничные отруби, увлажненные водопроводной водой до влажности 60%. Длительность культивирования составляла 72 часа при температуре 28°С.

В таблице 3.1 представлены экспериментальные данные по определению активности ксиланаз.

В результате выявлено 4 наиболее активных штамма: Rhizopus var mi-crosporus 595, A. oiysae F-2096, A. niger 2092, Trichoderma viride 191. Исходя из цели работы, а именно, использование продуцента в перерабатывающей промышленности, как источника комплекса ферментов, гидроли-зующих полисахариды клеточных оболочек злаковых, было интересно определить активности сопутствующих энзимов. Результаты исследований приведены в таблице 3.2.

1. Андреева О.В Оценка эффективности использования ферментных препаратов фирмы "Квест'7 О.В. Андреева, И.В. Усанов // Пиво и напитки.- 1997.- №1.-С.12-13.

2. АпрасюхинаН.И. Множественные формы гемицеллюлаз в фильтрате культуральной жидкости Trichoderma viride 1310./ Н.И.Апрасюхина, И.М. Тавобилов, И.А. Родионова //Прикладная биохимия и микробиология.- 1987.- №5.- С. 624-629.

3. Березин И.В. Исследования в области ферментного катализа в инженерной энзимологии. Избранные труды/ И.В. Березин -М.: Наука, 1990.-384с.

4. Брустовецкая Т.П. Образование и свойства грибных целлюлаз и ксиланаз в жидкой среде и в условниях твердофазного культивирования/ Т.П. Брустовецкая, О.Н. Окунев, А.В. Шульга// Прикладная биохимия и микробиология.- 1991.-№4.- С.577-583.

5. Вавилова Е.А. Индукция синтеза Эндо-1,4- /3-ксиланазы и /3-галактозидазы в исходных и рекомбинантных штаммах гриба Penicillium canescens! Е. А. Вавилова, Ю. П. Винецкий// Прикладная биохимия и микробиология.- 2003.- № 2.- С. 167-172 .

6. Варфоломеев С.Д. Биокинетика: Практический курс/ С.Д.Варфоломеев, К.Г.Гуревич. М.: ФАИР-ПРЕСС, 1999.-720 с.

7. Голубев A.M. Выделение и свойства эндоксиланазы и /3-ксилозидазы из Aspergillus oryzae/ А.М. Голубев, Ф.М. Ибатулин, А.Ю.

8. Килимник, Н.А. Родионова, К.Н. Неустроев //Биохимия.- 1993.- №6.-С.845-851.

9. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов/ И.М.Грачева,

10. A.Ю. Кривова.-3-е изд., перераб. и доп.- М.:Изд-во «Элевар», 2000.-512с.

11. Гужова Э.П. Целлюлозолитические ферменты и ксиланаза Myceliophthora thermophila/ Э.П. Гужова, Л.Г. Логинова // Прикладная биохимия и микробиология.- 1987.- №6.- С.820-825.

12. Дадашко В. Ферментные добавки Фекорд в рационах птицы/

13. B.Дадашко, В.Царук// Комбикорма.-2001.-№4.-С.40-41.

14. Дзедзюля Е. Водные экстракты злаков и активность ферментных препаратов/ Е.Дзедзюля, Е.Федорова, А.Гусаков, А.Синицын// Комбикорма.-2003.-№7.-С.51.

15. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты/ М.Диксон , Э. Уэбб -М.: Мир, 1982.-670с.

16. Егоров И. Ферменты фирмы БАСФ помогают птицеводам/ И.Егоров, Ш.Имангулов, Б.Авдохин, А.Кузнецов// Комбикорма.-2002.-№7.-С.39-40.

17. Жеребцов Н.А. Амилолитические ферменты в пищевой промышленности/ Н.А. Жеребцов -М.: Легкая и пищевая промышленность, 1982. -158с.

18. Исмаилова Д.Ю. Влияние некоторых веществ на биосинтез целлюлазы термотоллерантного гриба Aspergillus terreus 17Р/ Д.Ю.

19. Исмаилова, JI.Г. Логинова //Прикладная биохимия и микробиология. -1975.-№5.- С.676-681.

20. Казакова Е.А. Определение активности цитолитических ферментов солода/ Е.А. Казакова, И.Н. Грибкова, Е.Ф. Шаненко, Г.А. Ермолаева// Пиво и напитки.- 2001.- №1.-С.18-19.

21. Калашина Е. Ферментные препараты для трудноперевариемых компонентов/ Е.Калашина, Е.Черникова// Комбикорма.-2003.-№8.-С.51.

22. Калунянц К.А. Химия солода и пива: Учеб. пособие /К.А. Калунянц. -М.: Агропромиздат, 1990. 176 с.

23. Камышова Н.В. Новые ферментные препараты для производства сусла и пива/ Н.В. Камышова, Е.А. Чернова // Пиво и напитки. 1996.-№2.-С.18-19.

24. Каробонов А. МЭК В комбикормах для свиней/ А.Каробонов// Комбикорма.-2001 .-№5.-С.38.

25. Кирилов М. Эффективность мультиэнзимных композиций/ М.Кирилов, В.Крохина// Комбикорма.-2001.-№2.-С.46-47.

26. Кирилов М. МЭК СХ-3 В рационах животных/ М.Кирилов, В.Крахина// Комбикорма.-2001 .-№7.-С.37.

27. Клесов А.А. Ферментотивный катализ, ч.1. Специфичность ферментативного катализа/ А.А. Клесов, И.Ф. Березин. -М.: Изд-во Моск. ун-та, 1980.-264 с.

28. Кондратьев И. Использование ферментных препаратов на мукомольных заводах/И. Кондратьев// Хлебопродукты.-2002.-№6.- С.26-28.

29. Корячкина С. Применение целловиридина для получения хлеба их нешелушенных зерен/ С. Корячкина, Е.Кузнецова, А.Синицын// Хлебопродукты.-2003.-№9.- С.25-26.

30. Кравченко Н. Эффективные ферменты нового поколения/ Н.Кравченко, М.Монин// Комбикорма.-2002.-№8.-С.53.

31. Крошина В. Мультиэмзимная композиция в комбикормах для поросят/ В.Крошина, В.Антошин, Э.Удалова// Комбикорма.-2000.-№7.-С.47-48.

32. Кузнецов А. Новинка на российском рынке ферментных препаратов/ А.Кузнецов// Комбикорма.-2001 .-№5.-С.51.

33. Кунце В. Технология солода и пива: пер. с нем/ В. Кунце, Г. Мит.-СПб.: Издательство «Профессия», 2001. 912 с.

34. Леберле Г. Технология пивоварения/ Г. Леберле. -М.:Пищепромиздат, 1937.-502 с.

35. Логинова Л.Г. Целлюлозолитическая активность термотолерантного гриба Aspergillus terreus 17Р при поверхностном культивировании/ Л.Г. Логинова, Ж. Ташпулатов //Прикладная биохимия и микробиология.- 1978,- №3.- С. 361-365.

36. Мальцев П.М. Химико-технологический контроль производства солода и пива/ П. М. Мальцев.- М.: Пищевая пром-ть, 1976.-248с.

37. Мальцев ПМ. Технология бродильных производств / П.М. Мальцев М.: Пищевая пром-сть, 1980. 560 с.

38. Мальцев П.М. Технология солода и пива: Учебник для вузов пищ. промышленности/ П.М.Мальцев М.: Пищевая пром-сть, 1964. - 858 с.

39. Мартьянова А. Проблемы качества российского зерна и хлебопекарной муки. Пути их решения/ А. Мартьянова, Е.Мелешкина, X. Акбаба// Хлебопродукты.-2003.-№9.- С.32-33.

40. Молоскин С. Универсальный фермент для зерновых рационов/ С.Молоскин// Комбикорма.-2003 .-№ 1 .-С.56-67.

41. Мышакин А. Препарат Авизим в комбикормах с овсом/ А.Мышакин, И.Егоров// Комбикорма.-2001.-№7.-С.38-39.

42. Нарцисс Л. Технология солода/ Л. Нарцисс.-М.: Пищевая промышленность, 1980. -523 с.

43. Некрасова К. Ферментные препараты «Ф. Хоффманн-ля Рош» в комбикормах для цыплят-бройлеров/ К.Некрасова, И.Егорова, АЛавленко// Комбикорма.-2001 .-№4.-С.38-39.

44. Никульщина Л.Г. Ферментные препараты концерна Genencor на службе у пивоваров/ Л.Г. Никульщина. // Пиво и напитки.- 2000.- №1.-С.16-17.

45. Окомлова Т. Универсальный фермент для птицы/ Т.Окомлова,

46. B.Бевзюк, С.Молоскин, Д.Грачев// Комбикорма.-2003.-№6.-С.55-56.

47. Околелова Т. Целловиридин в комбикормах нестандартной рецептуры/Т.Околелова// Комбикорма.-2003.-№5.-С.46-47.

48. Панкратов А .Я. Биосинтез ферментов грибами рода Ризопус/ А.Я. Панкратов, Л.П. Антипова, Г.П. Шуваева, С.К. Сванидзе.- Воронеж: Изд-воВГУ, 1993.-184с.

49. Поппер Л. Улучшение муки/ Л.Поппер // Хлебопродукты.-2003.-№11.- С.22-23.

50. Правленко А. Использование кормовых ферментов компании Рош/ А.Правленко, Я. Кослач, А.Теняев// Комбикорма.-2003.-№8.-С.53-55.

51. Родионова Н.А. Гемицеллюлозы зерна злаков и ферменты, катализирующие их расщепление/ Н.А. Родионова, Л.В. Капрельянц, П.В. Середницкий, А.Ю.Килимник// Прикладная биохимия и микробиология.-1992.- №5.

52. Родионова Н.А. Ферментные препараты некоторых мицелиальных грибов, расщепляющие полимеры зерна злаков/ Н.А. Родионова, А.Ю. Килимник, Л.В. Капрельянц, П.В. Середницкий, Л.И.

53. Мартинович, Н.А. Загустина, A.M. Безбородое// Прикладная биохимия и микробиология.- 1995.- №4.- С.433-440.

54. Рухлядева А.П. Методы определения активности гидролитических ферментов/ А.П. Рухлядева, Г.В. Полыгалина.- М.: Легкая и пищевая пром-ть, 1981.-288 с.

55. Салманова Л.С. Цитолитические ферменты в пищевой промышленности/ Л.С. Салманова. -М.: Легкая и пищевая пром-сть, 1982.-208 с.

56. ТавобиловИ.М. Очистка эндо-1,4-/3-ксиланазы из гриба Aspergillus Niger штамм 15/ И.М. Тавобилов, И.В. Горбачева, Н.А. Родионова, A.M. Безбородое// Прикладная биохимия и микробиология.-1981.-№3.- С.436-440.

57. Тимираев В. Использование ферментов с зерном бобовых культур/ В. Тимираев// Комбикорма.-2003.-№7.-С.40.

58. Удалова Э. Многокомпонентные ферментные препараты в кормлении животных/ Э.Удалова, Г.Бравова, М.Кирилов, В.Крахина,

59. B.Виноградов, Н.Стрекозов, Л.Ахкозов, Н.Нестеров, Б.Кальницкис// Комбикорма.-2003.-№4.-С.43-46.

60. Уильяме В. Физическая химия для биологов/ В. Уильяме, X. Уильяме. М.: Мир, 1979.-600 с.

61. Улнг Д. Ферментация и технология ферментов. / Д. Улнг, Ч. Кооней, А. Демайн.-М.: Легкая и пищевая промышленность, 1983.-С.

62. Хорлин А.Я. Активные центры карбогидраз. Структура и функции активных центров ферментов/ А.Я. Хорлин.-М.: Наука, 1974.1. C.39-69

63. Шубаков А.А. Образование ксиланазы дрожжами Cryptococcus podzolicust А.А. Шубаков, Н.И. Михалева, А.В. Боев, О.Н. Окунев//Прикладная биохимия и микробиология.-1994.- 30.- №6.- С.812-820.

64. Элисашвили В.И. Целлюлазная и ксиланазная активность высших базидиомицетов/ В.И.Элисашвили, Т.Ш.Хардзиани, Н.Д. Циклаури, Е.Т. Качлишвили // Биохимия.- 1999.-№6.- С.858-863.

65. Akila G. A novel cold-tolerant Clostridium strain PXYL1 isolated from a psychrophilic cattle manure digester that secretes thermolabile xylanase and cellulase/ G. Akila, T. S. Chandra// FEMS Microbiology Letters.- 2003.-Vol. 219, № l.-P. 63-67.

66. Anthony T. High molecular weight cellulase-free xylanase from alkali-tolerant Aspergillus fumigatus AR1/ T.Anthony, R. Chandra, A. Rajendran, P. Gunasekaran// Enzyme and Microbial Technology.- 2003.- Vol. 32, №20.- P. 647-654.

67. Badal C. Saha Production, purification and properties of xylanase from a newly isolated Fusarium proliferatumf C. Badal // Process Biochemistry.- 2002.- Vol. 37, №11-. P. 1279-1284.

68. Bakir U. An endo-#-1,4-xylanase from Rhizopus oryzae: production, partial purification and biochemical characterization/ U. Bakir, S. Yavascaoglu, F. Guvenc, A. Ersayin// Enzyme and Microbial Technology.-2001.- Vol.29, №6-7 .- P. 328-334.

69. Baldrian P. Lignocellulose degradation by Pleurotus ostreatus in the presence of cadmium/ P. Baldrian, J. Gabriel// FEMS Microbiology Letters.-2003.- Vol. 220, № 2.- P. 235-240.

70. Jedrychowska B. Przydatnosc enzymatycznuch hydrolizaton plalka sojowego jako skladnikow podlozy do bistyntezy ksylanaz przez szczepy Aspergillus awamori A.a.Bsk-111-2 I Chaetomium globosum Ch. g. 5/ B.

71. Jediychowska, R. Sawicka-Zukowsca, J. Czakaj // Pr. Inst. I lab. przem. spoz. -1996.-Vol. 51.- P.42-57.

72. Bandivadekar K. R. Structure-function relationship of xylanase: fluorimetric analysis of the tryptophan environment/ K. R. Bandivadekar, V. V. Deshpande // Biochem. J.-1996.-Vol. 315.-P.583-587.

73. Bataillon M. Purification and characterization of a moderately thermostable xylanase from Bacillus sp. strain SPS-О/ M. Bataillon, A. -P. Nunes Cardinali, N. Castillon, F. Duchiron// Enzyme and Microbial Technology.-2000.- Vol. 26, № 2-4.- P. 187-192.

74. Bialasiewicz D. Wplyw obnizenia temperatuty na aktywnosc enzymow hydrolitycznych Geotrichum candidum Link/ D. Bialasiewicz // Przem. spoz.-1997.- Vol. 51, №11.-P.34-36.

75. Blanco A. Purification and Properties of Xylanase A from Alkali-Tolerant Bacillus sp. Strain ВР-23/ A. Blanco, T. Vidal, J.F. Colom, F.J. Pastor// Appl. Environ. Microbiol.-1995.- Vol. 61, № 12 .-P. 4468-4470.

76. Cardoso O. Purification and characterization of a novel cellulase-free xylanase from Acrophialophora nainiana/ O. Cardoso and E. Filho// FEMS Microbiology Letter.- 2003.- Vol.223, № 2.- P.309-314.

77. Cesar T. Purification and properties of the xylanase produced by Thermomyces lanuginosus/ T. Cesar, V. Mrsa // Enzyme and Microb. Technol. -1996.- Vol. 19 №4- C. 289-296.

78. Chavez R. Differences in expression of two endoxylanase genes (xynA and xynB) from Penicillium purpurogenuml R. Chavez, K. Schachter, C. Navarro, A. Peirano, C. Aguirre, P. Bull, J. Eyzaguirre// Gene.-2002.- Vol. 293, № 1-2.-P. 161-168.

79. Chivero E. T. Partial purification and characterisation of a xylanase enzyme produced by a micro-organism isolated from selected indigenous fruits of Zimbabwe/ E. T. Chivero, A. N. Mutukumira, R. ZvauyaЛ Food Chemistry.-2001.- Vol. 72, № 2.-P. 179-185.

80. Cobos A. Effect of polyhydroxylic cosolvents on the thermostability and activity of xylanase from Trichoderma reesei QM 9414/ A. Cobos, P. Estrada// Enzyme and Microbial Technology.- 2003.- Vol. 33, №6.- P. 810-818.

81. Curotto E. Enzymatic pretreatment of kraft pulps from Pinus radiata D don with xylanolytic complex of Penicillium canescens (CP1) fungi/ E. Curotto,

82. A. Nazal, С. Aguirre, V. Campos, N. Duran // Appl. Biochem. and Biotechnol. A.-1998.- Vol. 73,№1.-P. 29-42.

83. Dervilly-Pinel G. Investigation of the distribution of arabinose residues on the xylan backbone of water-soluble arabinoxylans from wheat flour/ G. Dervilly-Pinel, V. Tran and L. Saulnier// Carbohydrate Polymers.-2004.- Vol. 55, № 2.- P. 171-177.

84. Dhillon A Production of a thermostable alkali-tolerant xylanase from Bacillus circulans AB 16 grown on wheat straw/ A. Dhillon and S. Khanna// World Journal of Microbiology and Biotechnology.- 2000.- Vol. 27, №3.- P. 325-327.

85. Dhiman T. R. Performance of dairy cows fed forage treated with fibrolytic enzymes prior to feeding/ T. R. Dhiman , M. S. Zaman, R. R. Gimenez, J. L. Walters , R. Treacher// Animal Feed Science and Technology.-2002.- Vol. 101, № 1-4.- P. 115-125.

86. Dijck P. W. M. On the safety of a new generation of DSM Aspergillus niger enzyme production strains/ P. W. M. van Dijck, G. С. M. Selten, R. A.

87. Hempenius// Regulatory Toxicology and Pharmacology.-2003.- Vol. 38, № l.-P. 27-35.

88. Elegir G. Purification, Characterization, and Substrate Specificities of Multiple Xylanases from Streptomyces sp. Strain В-12-2/ G. Elegir, G. Szakaacs, T.W. Jeffries// Appl. Environ. Microbiol.-1994.- Vol. 60, № 7.-P.2609-2615.

89. Garcia-Campayo V. Mode of action, kinetic properties and physicochemical characterization of two different domains of a bifiinctional (1-4)-beta-D-xylanase from Ruminococcus flavefaciens expressed separately in

90. Escherichia coli/ V. Garcia-Campayo, S.I. McCrae, J.X. Zhang, H.J. Flint, T.M. Wood // Biochem. J.-1993.- Vol. 296.-P.235-243.

91. Gawande P.V. Preparation,characterization and application of Aspergillus sp. xylanase immobilized on Eudragit S-100/ P.V. Gawande, M.Y. Kamat//J. Biotechnol.-1998.- Vol. 66, №2-3.-P.165-175.

92. George S. P. A novel thermostable xylanase from Thermomonospora sp.: influence of additives on thermostability/ S. P. George, A. Ahmad, M. B. Rao// Bioresource Technology.- 2001.- Vol. 78, № 3.- P. 221-224.

93. George S. P. Involvement of a Lysine Residue in the Active Site of a Thermostable Xylanase from Thermomonospora sp/ S. P. George, A. Ahmad, M. B. Rao// Biochemical and Biophysical Research Communications.-2001.-Vol. 282, № 1.- P. 48-54.

94. Gessesse A. Purification and Properties of Two Thermostable Alkaline Xylanases from an Alkaliphilic Bacillus sp./ A. Gessesse// Applied and Environmental Microbiology.-1998.- Vol. 64, №9.- P. 3533-3535.

95. Ghosh M. Purification and some properties of a xylanase from Aspergillus sydowii MG49/ M. Ghosh, G. Nanda// Appl. Environ. Microbiol.-1994.-Vol. 60, № 12.-P. 4620-4623.

96. Graessle S. Regulated system for heterologous gene expression in Penicillium chrysogenum/ S. Graessle, H. Haas, E. Friedlin, H. Kurnsteiner, G. Stoffler, B. Redl// Appl. Environ. Microbiol.-1997.- Vol. 63, № 2.-P. 753-756.

97. Gupta N. Cloning, Expression, and Sequence Analysis of the Gene Encoding the Alkali-Stable, Thermostable Endoxylanase from Alkalophilic, Mesophilic Bacillus sp. Strain NG-27/ N. Gupta, V. Shiva Reddy, S. Maiti, A.

98. Ghosh// Applied and Environmental Microbiology.-2000.- Vol. 66, № 6.- P. 2631-2635.

99. Irwin D. Characterization and sequence of a Thermomonospora fusca xylanase/ D. Irwin, E.D. Jung, D.B. Wilson// Appl. Environ. Microbiol.-1994.-Vol. 60, № 3.-P. 763-770.

100. Jeffries T. Method of removing colors from wood pulp using xylanase from Streptomyces roseiscleroticus NRRL В-11019/ T. Jeffries, A. Grabski, R. N. Patel, G. Elegir, G. Szakacs // Biotechnol. A.-1997.- Vol. 15,№1.-P. 296-301.

101. Kang M.K. Purification and Characterization of Two Xylanases from Alkalophilic Cephalosporium sp. Strain RYM-202/ M.K. Kang, P.J. Maeng, Y.H. Rhee// Appl. Environ. Microbiol.- 1996.-Vol. 62, № 9.-P. 3480-3482.

102. Keskar S.S. Characterization and sequencing of an active-site cysteine-containing peptide from the xylanase of a thermotolerant Streptomyces/.

103. S.S.Keskar, M.B. Rao, V.V. Deshpande // Biochem. J.-1992.- Vol. 281.-P.601-605.

104. Ко E.P. Site-directed mutagenesis at aspartate and glutamate residues of xylanase from Bacillus pumilus/ E.P. Ко, H. Akatsuka, H. Moriyama, A. Shinmyo, Y. Hata, Y. Katsube, I .Urabe, H. Okada // Biochem. J.- 1992.-Vol. 288.-P.l 17-121.

105. Kohli U. Thermostable, alkalophilic and cellulase free xylanase production by Thermoactinomyces thalophilus subgroup С/ U. Kohli, P. Nigam, D. Singh, K. Chaudhary// Enzyme and Microbial Technology.- 2001.- Vol. 28, № 7-8.- P. 606-610.

106. Kumar A. R. Structural changes enhance the activity of Chainia xylanase in low urea concentrations/ A. R. Kumar, S. S. Hegde, K. N. Ganesh and M. I.

107. Khan// Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Proteins & Proteomics.- 2003.-Vol. 1645, №2.-P. 164-171.p

108. Kurzatkowski W. Glucose-induced secretion of Trichoderma reesei xylanases/ W. Kurzatkowski, A. Torronen, J. Filipek, R.L. Mach, P. Herzog, S. Sowka, C.P. Kubicek// Appl. Environ. Microbiol.- 1996, Vol. 62, № 8.-P. 28592865.

109. Laidler K.Y. The Chemical Kinetica of Enzyme Astion/ K.Y. Laidler, P.S. Bunting// Oxford University Press.- 1973.- Vol. 2.- P.220.

110. Lam S. K. A xylanase from roots of sanchi ginseng {Panax otoginseng) with inhibitory effects on human immunodeficiency virus-1 reverse transcriptase /S. K. Lam, Т. B. Ng// Life Sciences.- Volume 70.- Issue 25.- 10 May 2002.- Pages 3049-3058.

111. Lappalainen A. Endoxylanase II from Trichoderma reesei has several isoforms with differens isoelectric poins / A. Lappalainen, M. Siika-Aho, N. Kalkkinen, R. Fagerstrom// Biotechnol. Appl. Biochem.-2000.- Vol. 31.-C.61-68.

112. Lee Y.E. Gene cloning, sequencing, and biochemical characterization of endoxylanase from Thermoanaerobacterium saccharolyticum B6A-RI/ Y.E. Lee, S.E. Lowe, J.G. Zeikus// Appl. Environ. Microbiol.-1993.-Vol. 59, №9.-P. 3134-3137.

113. Leggio L. L. Substrate specificity and subsite mobility in T. aurantiacus xylanase 10А/ L. L. Leggio, S. Kalogiannis, K. Eckert, S. С. M. Teixeira, M. K. Bhat, C. Andrei, R. W. Pickersgill, S. Larsen// FEBS Letters.-2001.- Vol. 509, № 2.- P. 303-308.

114. Li X.L Purification and characterization of a new xylanase (APX-II) from the fungus Aureobasidium pullulans Y-2311-1/ X.L. Li, Z.Q. Zhang, J.F. Dean, K.E. Eriksson, L.G. Ljungdahl// Appl. Environ. Microbiol.- 1993.- Vol .59, No. 10.-P.3212-3218.

115. Lin J. Purification and biochemical characteristics of /?-D-xylanase from a thermophilis fungus, Thermomyces lanuginosus-SSBP/ J. Lin, L. M. Ndlovu, S. Singh, B. Pillay // Appl. Biochem. and Biotechnol. A.-1999.- Vol. 30.-C. 73-79.

116. Liu X. Studies on the key amino acid residues responsible for the alkali-tolerance of the xylanase by site-directed or random mutagenesis/ X. Liu, Y. Qu, F. You, Y. Liu// Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic.-2002.-Vol. 18, №4-6.-P. 307-313.

117. Lopez C. Xylanase production by a new alkali-tolerant isolate/C. Lopez, A. Blanco, F.I.J.Pastor//Biotechnol. Lett.-1998.- № 3.-P.243-246.

118. MacCabe A. P. Improving extracellular production of food-use enzymes from Aspergillus nidulans / A. P. MacCabe, M. Orejas, E. N. Tamayo, A. Villanueva, D. Ramon //Journal of Biotechnology .-2002.- Vol.96, № l. p. 43-54.

119. Martinez-Trujillo A. Enzymatic properties of a purified xylanase from mutant PN-120 of Cellulomonas flavigena /А. Martinez-Trujillo, O. Perez

120. Avalos, Т. Ponce-Noyola// Enzyme and Microbial Technology.-2003.- Vol. 32, № 3-4.- P. 401-406.

121. Medeiros R. G. Production of xylan-degrading enzymes from Amazon forest fungal species/ R. G. Medeiros, R. Hanada, E. X. F. Filho// International Biodeterioration & Biodegradation.-2003.- Vol. 52, № 2.-P. 97100.

122. Mesta L. Construction of a chimeric xylanase using multidomain enzymes from Neocallimastix frontalis/ L. Mesta, C. Rascle, R. Durand, M. Fevre// Enzyme and Microbial Technology.- 2001.- Vol. 29, № 6-7.- P. 456463.

123. Milagres A. Evaluating the basidiomycetes Poria medula-panis and Wolfiporia cocos for xylanase production/ A. Milagres, R. M. Sales// Enzyme and Microbial Technology.-2001.- Vol. 28, № 6.- P. 522-526.

124. Morales P. Purification and Characterization of Alkaline Xylanases from Bacillus polymyxa/ P. Morales, A. Madarro, J.A. Perez-Gonzalez, J.M. Sendra, F. Pinaga, A. Flors// Appl. Environ. Microbiol.- 1993.- Vol. 59, № 5.-P. 1376-1382.

125. Nakamura S. Purification and some properties of an alkaline xylanase from alkaliphilic Bacillus sp. strain 41М-1/ S. Nakamura, K. Wakabayashi, R. Nakai, R. Aono, K. Horikoshi// Appl. Environ. Microbiol.-1993.- Vol 59, № 7.-P. 2311-2316.

126. Nath D. pH dependent conformational and structural changes of xylanase from an alkalophilic thermophilic Bacillus sp (NCIM 59)/ D. Nath, M. Rao// Enzyme and Microbial Technology.-2001.- Vol. 28, № 4-5.- P. 397-403.

127. Nazareth S. W. Nazareth Production and characterisation of lignocellulases of Panus tigrinus and their application/ S. W. Nazareth, J. D. Sampy //International Biodeterioration & Biodegradation.- 2003.- Vol. 52, № 4.- P. 207-214.

128. Passoth V. Production of a heterologous endo-1,4-0-xylanase in the yeast Pichia stipitis with an 02-regulated promoter/ V. Passoth, B. Hahn-Hagerdal// Enzyme and Microbial Technology.-2000.- Vol. 26, № 9-10.- P. 781784.

129. Qu Y. Production, characterization and application of the cellulase-free xylanase from Aspergillus niger/ Y. Qu, P. Gao, D. Wang, X. Zhao, X. Zhang//Biochem. and Biotechnol.-1996.-Vol.57-58.-C.375-381.

130. Rani R. R. Production and characterization of xylanase from a /3-amylolytic strain of Bacillus megaterium/ R. R. Rani, N. Geeta //Microbios.-1997.- Vol.90,№ 362.-C.7-16.

131. Rao M. Structural environment of an essential cysteine residue of xylanase from Chainia sp. (NCL 82.5.1)/ M. Rao, S. Khadilkar, K. R. Bandivadekar, V. Deshpande// Biochem. J.- 1996.- Vol. 316.- P.771-775.

132. Ratanakhanokchai K. Purification and Properties of a Xylan-Binding Endoxylanase from Alkaliphilic Bacillus sp. Strain К-l/ K. Ratanakhanokchai, K. L. Kyu, M. Tanticharoen// Applied and Environmental Microbiology.- 1999.-Vol. 65, № 2.- P. 694-697.

133. Salles B.C. Purification and characterization of a new xylanase from Acrophialophora nainiana! В. C. Salles, R. B. Cunha, W. Fontes, M. V. Sousa, E. X. F. Filho// Journal of Biotechnology.-2000.- Vol. 81, № 2-3.- P. 199-204.

134. Sa-Pereira P. Enzymatic properties of a neutral endo-1,3(4)-/3 -xylanase Xyl II from Bacillus subtilis /Р. Sa-Pereira, M. Costa-Ferreira, M. R. Aires-Barros// Journal of Biotechnology.- 2002.- Vol. 94, № 3.- P. 265-275.

135. Sardar M. Simultaneous purification and immobilization of Aspergillus niger xylanase on the reversibly soluble polymer Eudragit™ L-100/ M. Sardar, I. Roy, M. N. Gupta// Enzyme and Microbial Technology.-2000.-Vol. 27, № 9.- P. 672-679.

136. Gessesse A. Purification and Properties of Two Thermostable Alkaline Xylanases from an Alkaliphilic Bacillus sp./ A. Gessesse// Applied and Environmental Microbiology.-1998.- Vol. 64, №9.- P. 3533-3535.

137. Shao W. A High-Molecular-Weight, Cell-Associated Xylanase Isolated from Exponentially Growing Thermoanaerobacterium sp. Strain JW/SL-YS485/ W. Shao, S. DeBlois, J. Wiegel// Appl. Environ. Microbiol.-1995.- Vol. 61, № 3.-P. 937-940.

138. Silverman P. Screen for inhibitors of xylanase/P. Silverman, J. Sanford // Biotrchnol. Adv. -1997.- Vol. 15, №2.- P.454.

139. Simpson D. J. Structure and Function of Cereal and Related Higher Plant (l-4)-P-Xylan Endohydrolases/ D. J. Simpson, G. B. Fincher, A. H. C. Huang, V. Cameron-Mills// Journal of Cereal Science.-2003.- Vol. 37, № 2.- P. 111-127.

140. Singh S. Thermomyces lanuginosus: properties of strains and their hemicellulases/ S. Singh, A. M. Madlala, B. A. Prior// FEMS Microbiology Reviews.- 2003.- Vol. 27, №1.- P. 3-16.

141. Subramaniyan S. Optinization of cultura parameters for the synthesis of endo-xylanases from Bacillus SSP-34/ S. Subramaniyan, P. Prema//J. Sci. and Res. -1998.- Vol. 57, №10-11.-P.611-616.

142. Sungurtas J. Xylan-degrading enzymes and arabinoxylan solubilisation in barley cultivars of differing malting quality/ J. Sungurtas , J. S. Swanston , H. V. Davies, G. J. McDougall// Journal of Cereal Science.-2004.-Vol. 39, №2.- P. 273-281.

143. Taneja K. Properties and application of a partially purified alkaline xylanase from an alkalophilic fungus Aspergillus nidulans KK-99/ K. Taneja, S. Gupta, R. Chander //Kuhad Bioresource Technology.- 2002.- Vol.85, №1.- P. 39-42 .

144. Tenkanen M. Use of acid-tolerant xylanase for bleaching of kraft pulp / M. Tenkanen, L. Viikari, J. Buchert // Biotechnol. Techn. 1997.- Vol. 11, №12.-P. 935-938.

145. Usui K. Cytoplasmic xylanase (XynX) of Aeromonas caviae ME-1 is released from the cytoplasm to the periplasm by osmotic downshock/ K. Usui, T. Suzuki, T. Akisaka, K. Kawa// Journal of Bioscience and Bioengineering.-2003.- Vol. 95, № 5.- P. 488-495.

146. Wang S. Production of xylanases from rice bran by Streptomyces actuosus A-151/ S. Wang, Y. Yen, I. Shih, A. Chang, W. Chang, W. Wu, Y. Chai// Enzyme and Microbial Technology.- 2003.- Vol. 33, № 7.- P. 917-925 .

147. Weaver J. Genetic analysis of a locus on the Bacteroides ovatus chromosome which contains xylan utilization genes/ J. Weaver, T.R. Whitehead, M.A. Cotta, P.C. Valentine, A.A. Salyers// Appl. Environ. Microbiol.-1992.-Vol 58, № 9.-P. 2764-2770.

148. Winterhalter С. Two Extremely Thermostable Xylanases of the Hyperthermophilic Bacterium Thermotoga maritima MSB8/ C. Winterhalter, W. Liebl// Appl. Environ. Microbiol.-1995, Vol 61, № 5.-1810-1815.

149. Xu J. Xylanase induction by L-sorbose in fungus Trichoderma reesei РС-3-7/ J. Xu, M. Nogawa, H. Okada, Y. Morikawa // Appl. Biochem. and Biotechnol. A.-1998.- Vol. 62,№8.-P. 1555-1559.