автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ УТИЛИЗАЦИИ ПИВНОЙ ДРОБИНЫ

МИНИСТЕРСТВО ВЫСШЕГО И СРЕДНЕГО СПЕЦИАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ РСФСР

Московский ордена Трудового Красного Знамени технологический институт пищевой промышленности

На правах рукописи

Для служебного пользования

Экз. Л . .■'.-'.•'.«.■Л

ТОЛСТОВА Светлана Викторовна

УДК 663.481 (043.3)4-663.152.321 {043.3)4-+663.14:636.087(043.3)

РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ УТИЛИЗАЦИИ ПИВНОЙ ДРОБИНЫ

Специальность 05.18.07 — Технология продуктов брожения, алкогольных и безалкогольных напитков

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва — 1985

Работа выполнена на кафедре «Технология бродильных производств» Московского ордена Трудового Красного Знамени технологического института пищевой промышленности.

Научный руководитель:

Лауреат Государственной премии СССР, доктор технических паук, профессор Калунянц К. А.

Официальные оппоненты: Доктор технических наук, профессор Кантере В. М. Кандидат технических наук, с. н. с, Кобелев К. В,

Ведущая организация:

Всесоюзный научно-исследовательский биотехнологический институт

Зашита диссертации состоится « » 1985 г.

в . . . час. на , заседании Специализированного Совета-К 063,51.04 при Московском ордена Трудового Красного Знамени технологическом институте пищевой промышленности по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, 11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МТИПП.

Автореферат разослан « -^.Р » г.

Ученый секретарь Специализированного Совета

А. И. Садова

ОНДАЯ ХАРАШгаСГИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. На состоявшемся II июня 1985 г. совещании ЦК КПСС по вопросам ускорения научно-технического прогресса отмечалось, что коренным вопросом экономической политики партии

г

является изыскание и проведение в действие всех резервов повышения эффективности производства, качества продукции. Успешное решение этой проблемы в значительной степени зависит от повышения уровня использования вторичных материальных ресурсов.

Для пивоваренной отрасли пищевой промышленности вопросы разработки малоотходной и безотходной технологии имеют первостепенное значение. По данным МПП СССР в производстве пива степень использования сырья для получения готового продукта составляет примерно. 75%, остальное переходит в технологические отходы. Наиболее значительным отходом пивоваренного производства является пивная /солодовая/ дробина. При среднегодовом выпуске пива по стране 700 млн. дал количество образующейся дробины, влажностью 86%, составляет 1750 тыс.т в год*

Дробина используется для откорма сельскохозяйственных животных. , Однако из-за высокого содержания клетчатки дробина не должна превышать более 1/3 кортового рациона.

Анализ химического состава показал, что дробина богата некрахмальными полисахаридами, и прежде всего гемицеллюлозой.

Возможность целенаправлен© использовать некрахмальные полисахариды пивной дробины предопределила направленность экспериментальной части диссертационной работы.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в разработке эффективных биотехнологических процессов утилизации пивной дробины. Конкретные"задачи исследований сводились к следующему: -изучить химический состав и реакционную способнострр&ДОМСХА

имени К-А. Тимирязева ! ЦНБ имени Н.И. Железное» ) Фонд научный литературы

'-а Л-бУ^б!

-выявить эффективные и экономически целесообразные метода предобработки пивной дробимы для увеличения ее реакционной способности; -изучить и оптимизировать условия ферментативного гвдролиза пивной дробины;

-выявить роль гемицеллюлаэ при ферментативном гидролизе некрахмаль-кых полисахаридов дробины;

-разработать схему вцделешш ферментов с цзлью их многократного использования;

-показать возможность использования ферлентолиз&тов для микробиологического синтеза:

Научная новизна. Детально изучен химический состав и реакционная способность пивной дробины.

Разработаны способы предобработки пивной дробины, направленные на увеличение реакционной способности субстрата при ферментолизе.

Разработан процесс ферментативного гидролиза пивной дробины и получения ферментолизатов.

Показана возможность использования ферментолизатов для шкроби-ологического едатеза.

Разработан способ,получения белкового кормового продукта из пивной дробины.

Научная новизна подтверждена авторскими свидетельствами "Способ получения посевной культуры дрожжей* № 1143777 и "Способ получения белкового корма из отходов пивоваренного производства" № 1163826.

Практическая значимость работы. Разработана принципиально новая биотехнологическая схема утилизации пивной дробины.

Технология предобработки дробины проверена в полупроизводственных условиях опытного спиртового завода г.Москвы.

Технология получения белкового кормового продукта и его питательность и усвояемость животными апробирована в подсобном хозяйстве

Кемеровского филиала Новосибирского сельскохозяйственного института. Расчет ожидаемой экономической эффективности от использования данной технологии составит 37,99 тыс.рублей в расчете на типовой телятник в 400 голов за один откормочный период.

Апробация работы и публикации. Основные полоэкния диссертационной работы были представлены на Всесоюзной научной конференции /ШИШ, 1984г./, на межреспубликанской научно-технической конференции моло.ццх ученых /Тбилиси, 1984г./, на конференции "Использование биомассы микроорганизмов для лицевых целей" /Пусцино, 1984г./, на Всесоюзном симпозиуме "Целлвлолитические микроорганизмы и ферменты" /Москва, 1984г./, на Всесоюзной конференции молодых ученых /Институт биохимии им.А.Н.Баха АН СССР, 1985г./, на У Всесоюзном симпозиуме по инженерной энзимологии /Кобулети, 1985г./, на II Всесоюзной конференции "Биосинтез целлюлозы" /Казань, 1985г./.

По теме диссертации получено 2 авторских свидетельства и опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы и ГУ приложений. Работа изложена на 147 страницах машинописного текста, содержит 22 таблицы и 21 рисунок. Список литературы включает 188 источника отечественных и зарубежных авторов.

КРАТНОЕ ЗДЗРМНИЕ РАБОТЫ

1. Обзор литературы

Обзор литератур состоит из 3 разделов, в которых рассмотрены современные вопроса утилизации растительных полисахаридов с применением биокатализаторов.

2. Экспериментальная часть

2.1. Материалы и метода

Объектом исследования служба дробина, отвечающая требованиям ОСТ 18-341-79 "Дробина пивная сырая".

- б -

В качестве продуцента белка использовали штамм дрожжей £лло6а&7 Ьъор1са6л 431.

В работе использовали ферментные препараты целловиридин ГЕК, пектофовтидин ГЗХ, ксилоглюканофоетидин П10Х, активности которых оценивали по следующим методам: эндо-1,4-^-глюкаиазу /Клесов и др. 1980/, экзо-1,4-^-глюнозидаэу /Сикицын, Клесов,1981/, целлобиазу /Клесов а др.,1980/, протеазу /Йжов,Калунянц.1984/. Определяли также гемицеллюлаэную активность по гемицелляшозе дробины, ^-ксклози-дазнуп по п-ШК и ксиланазную активность по ксилацу березы и окрашенному ксилану береза.

Выделение и очистка ферментов гемицеллюлазного комплекса включала двукратное осаждение сульфатом аммония, гель-фильтрацию на колонке с Ультрагелем АсА-34, ионообменную хроматографию на колонке с дЭАЭ-сфероноы и обе сооливанне на колонке с Еиогелем П-2 и акрилек-сом П-б.

Определение химического состава используемых образцов пивной дробины проводили по "Единой схеме анализа растительного сырья" /Шариов и др.,1976/.

Степень кристалличности /или индекс кристалличности, 1К/ пивной дробины определяли методом рентгенодифрактсметрии /Мартынов, Шлегланина, 1972/. Удельную площадь поверхности образцов пивной дробины, доступной молекулам белка, определяли по изотермам адсорбции инертного по отношению к субстрату белка химотрепсина по методике /Кяесов, Синицын, 1981/. Степень полимеризации /СП/ дробины определяли вискозиметрическим методом /¡Парков, Куйбина, 1972/.

В работе проводили предобработку пивной дробины. Химическая предобработка основана на обработке дробины 1%-нш раствором гидро-ксвда натра в сочетании о термообработкой /121°С, 30 мин./ с отделением продуктов щелочной предобработки и без отделения продуктов щелочной предобработки и обработке дробины 0,8Й-ным раствором серной

кислоты в сочетании с термообработкой /121°С, 30 мин./.

¡Электрохимическая предобработка основана на применении активатора, принцип действия которого аналогичен работе диафрагменного электролизера /Николаев, 1980/. В работе были использованы два экспериментальных типа активаторов: проточной конструкции для обработки водопроводной воды и последующим ее смешиванием с дробиной, и погружной конструкции - для обработки смеси, состоящей из дробины и водопроводной воды. После электрообработки объекты исследования ав-токлавировали при 121°С 30 ютнут.

Предобработка паровой декомпрессией осуществлялась на опытном спиртовом заводе ШйИПрБ в раэварнике периодического действия объемом ЭОО литров.' Процесс предобработки осуществляли в течение 70 мин. при 0,5 Ша С последующим вцдуванием обработанного сырья в осахари-ватель.

После предобработки в смеси устанавливали рН на уровне 4,5 и проводили ферыентолиз. Глубину гидролиза сырья оценивали по выходу редуцирующих веществ /РЕ/.

Отделение высокомолекулярной фракции из феркентолизата /слабо-адссрбирущиеся фертентц/ проводили методом ультрафильтрации с использованием ультрафильтрационного модуля с полиаадднши полыми волокнами УПА-50 и ацетилцеллюлоэных мембран УАЫ с размером пор 5-20 нм. Предварительную очистку фергентолизата осуществляли на фильтрах тонкой очистки. Для регенерации ферментов, прочноадсорбирующихся на поверхности непрогидролизованного субстрата, применяли 0,02 М фосфатный буфер о рН 7,0, дистиллированную воду, I 1Л раствор мочеЕИны, активированную воду, полученную в катодной зоне электроантиватора, с рН 6,0-8,0, повершостно-актившв вещества /0,5-3,ОЙ раствор Тиееп 85/.

Биосинтез белка, используемыми в работе шире организмами, изучали в лабораторных условиях на круговой качалке /180-220 об/мин/.

Количество общего азота определяли методом Кьельдаля /Мальцев,

1976/; аммонийный азот - отгонкой из растворов при освобождении от соединений окисью магния; органический азот - расчетным путем по разности между общим и минеральный азотом; сырой протеин по ГОСТ 17681-72; истинный белок - методом Кьельдаля после осаждения три-хлоруксуеной кислотой./Агеев, Корольков, 1953/, растворимый белок по Лоури /Ледау, 1951/.

Аминокислоты определяли на аминокислотной анализаторе ААА 831 фирш "Микротехника" /ЧССР/ по методике /Бэйм, 1965/.

Оценку суммарного количества нуклеиновых кислот проводили во А.С.Спирину /1958/. Содержание РЗ определяли по модифицированному методу Шомоди-Нельсона /Клесов и др., 1980/,:глюкозы - глюкозо-ок-свдаэно-перокмдазным методом /Береэин и др., 1977/.

Хроматографию Сахаров проводили с помощью высокоэффективной жвдкостной; хроматографии на хроматографе 'Dupont - 850" /США/. Содержание микро-и макроэлементов проводили методом атомной абсорбции на поляризующем зеемановском спектрофотометре фирны "Aifaait " модель 180-80 в воздушно-ацетиленовом пламени по стандартным программам предлагаемым фирмой.

Математические модели результатов экспериментов рассчитаны на ЭШ ОДВА 1204 на алгоритмическом языке "Алгол 60" с использованием ставдартнюс программ одиофакторного корреляционно-регрессионного . анализа. Проверку значимости уравнений проводили на основе критерия Фишера.

2.2. Характеристика химического состава и реакционной способности пивной дробины

■ Для изучения возможности использования пивной дробины дня микробиологического синтеза был детально изучен ее.химический состав. Полученные данные /табл.1/ свидетельствуют о том, что дробина является источником некрахмальных полисахаридов и содержит в своем составе 17,68% гексаэанов, 28,03& пентозанов. Дробина характеризуется

Химический состав пивной дробины

Компонент» | Содержание

Заеьнш вецества, % с.в* 5,50

в том числе натрий, иг/кг с.в. 158,00

калий, мг/кг с.в. 284,00

фосфор« мг/кг с.в. 6500,00

капьцдо,мг/кг о,в; 5527,00

магний, мг/кг с.в. 3745,00

железо, мг/кг с.в. Ж7,00 ,

цинк, мг/кг С.в. 85,40

медь, мг/кг с.в. II;20

марганец, мг/кг с.в. 44,40

Вещества» экстрагируемые этиловым

эфиром, % с.в. 8,15

Вещества, экстрагируемые водой при 90°С, % с.в. , 7,50

Легкогидролизуемга полисахарида, % с.в. ' 21,32

Трудногядролиэуемые полисахарида, % с.в. 24,66

Лишив, % с.в. . 10,05

Гексозаны, % с.в. 17,66

Пентозаны /без уроновьк кислот/, % с.в. 28,03

Урановые кислоты, % с.в. 3,80

Азотсодеккажие вещества в пересчете на белок

Т с.в. • 27,00

Крахмал, % с.в. 1,59

Общий выход РВ пш количественном гвдролиза

/без крахмала/, % с.в. 51,09

Содержание моносахаридов в гидролизате легкогидролизуемых полисахаридов, % с.в.

Д-галактоза 0,20

Д-глвкоза 0,94

Д-маиноза следы

-арабиноэа , - 8,80

Д-ксилоза 14,10

Содержание моносахаридов в гидролизате трудногидролиэуемых полисахаридов, % о.в.

Д-галактоза не обнаружена

2-глюкоза 18,65

Д-манноза ■■ 0,06

-арабиноэа 1,59

Д-ксилоза • * ■ ■ 7,36

высоким содержанием азотистых веществ, фосфора, калия, кальция и т.д.

Эффективность использования дробины для получения продуктов микробиологического синтеза-в значительной степени зависит от ее реакционной способности, которая определяется ИК, СП я величиной удельной поверхности, доступной молекулах ферментов.

В качестве критериев реакционной способности были выбраны начальная скорость образования РБ, а также выход ЕВ после продолжительного гидролиза ферыентнш препаратам целлокониыпш ШОХ /один из наиболее изученных в пивоварении ферментных препаратов, обладающий достаточно высокой активностью ферментов, гидролизукцих некрах-мальные полисахариды растительного сырья/. Концентрация ферментного препарата составляла 40 г/л, концентрация дробины влажность» 84? -625 г/л, {Н 4,5, t^>450C. Гидролиз протекал при непрерывном перемешивании.

Таблица 2

Физико-химические параметры и реакционная способность пивной дробины

Параметры } Численное значение

Индекс кристалличности, %

Удельная площадь поверхности, доступная ферментам/белку/, ы'уг

Степень полимеризации

Начальная скорость образования РБ, г/л ч

Выход РВ через 48 часов гидролиза, % с.в.

Данные табл.2 показывают, что при достаточно развитой удельной плсш^ди поверхности, доступной ферментам /0,79 м^/г/, а также при практически аморфной структуре пивной дробины, начальная скорость образования РВ составила 0,74 г/л ч, выход № через 48 часов гидролиза 7,2 % с.в. ..... -

Практически аморфное вещество

0,79 350 0,74 7,20

Образцы дробины, подвергнуты© ферментативному гадролизу отделяли от жидкого гидролиза та, высушивали и определяли Ж. Оказалось, что после ферментативного гидролиза резко возрастает степень упорядоченности субстрата. Полученные данные дают основание предположить, что в процессе ферментояиза происходит рекристаллизация полисахаридов, что и служит причиной невысокой глубины гидролиза.

Однако потенциальные возможности получения углеводов из неярах-мальных полисахаредов дробины значительно вше, поэтому в дальнейшей работе нами было исследовано влияние различных методов предобработки на эффективность ферментативного гидролиза дробины.

2.2. 'Влияние различных видов предобработки на эффективность ферментативного гидролиза пивной дробины

С большей долей вероятности можно предположить, что основное негативное воздействие на реакционную способность дробины при фер-кентолизе оказывает наличие в ее составе лигнина, инкрустирующего , полисахариды и уменьшающего доступность гликозидных связ.ей полисахаридов гедролигичеслому действию ферментов /Синицын и др., 1984/.

В связи с этим целесообразно было осуществить предобработку пивной дробины, которая была бы направлена на ее делигнификацию /и, следовательно - на увеличение поверхности полисахаридов, доступной ферментам 5ос&мА и др., 1983, Сои&ф ,1975/.

Для предобработки пивной дробины были предложены следуйте виды обработок: химическая, электрохимическая /ЭХО/ и паровая декомпрессия, Подученные результаты представлены в табл.3.

Химическая щелочная предобработка дробины в сочетании о термообработкой приводит к незначительному увеличению реакционной способности - выход га составил 13,к с.в., в случае отделения продуктов предобработки и 13,к с.в. без отделения продуктов предобработки. При этом надмолекулярная структура полисахаридов не изменялась - они оставались практически аморфными веществами. Удельная

Физико-химические параметры пивной дробины после предобработки различными способами*'

1 (Удельная 'Начальная !Ьш>д РВ,

Вид предобработки ) СП

[ !ности,о 1РВ, Г/Л-ч ! г/л/5с _[_{_мУг?_!_

Обработка 155-ным раствором Л^аОН в сочетании с термообработкой /с отделением продуктов предобработки/ 234 0,85 0,82 ' 13,8

Обработка раствором //аОН в сочетании с термообработкой /без отделения продуктов предобработки/ 220 0,87 0,80 13,5

Обработка 0,8%-шм раствором Но$0л в сочетании с термообработкой 142 1,42 1,40 34,5

Обработка активированной Ее^-иЖ^'в сочетании с термообработкой 105 1,20 1,25 23,8

Обработка суспензии дробины в электроактиватове погружной конструкции /рН = 4,5 Хеа= 1150/ в сочетании с термообработкой 88 1,44 1,39 32,8

Паровая декомпрессия 65 3,18 3,05 37,5

^Условия гидролиза: концентрация ферментного препарата - 40 г/л, концентрация субстрата - 625 г/л, влажностью температура -45"С, рй = 4,5, продолжительность - 48 часов.

плошддь поверхности, доступная ферментам увеличилась незначительно-в 1,1 раза по сравнению с исходной дробиной, Ш уменьшилась в 1,55 ■ раза. Незначительное увеличение выхода РВ /примерно в 2 раза/ по сравнению с исходным субстратом вызвано во-первых - удалением геми-целлюлоз /их в дробине более 60% от общего содержания полисахаридов/в случае удаления продуктов предобработки перед фергентолизом; во-вторых - продукты предобработки, не отделенное перед фердантолизом,

вызывают ингибирование активности ферментов. *

В случае предобработки дробины раствором серной кис-

лоты в сочетании с термообработкой происходит частичная делигнифи-кация и диспергирование частиц дробины, что сопровождается увеличением удельной площади поверхности, доступной ферментам примерно в 1,8 раза, меньшая деструкция гемицеллюлоз, образование растворимых олигосахаридов с высокой реакционной способностью - выход РВ составил 34,к с.в., уменьшение СП более чем в 2,5 раза, что способствует созданию условий для действия'зкзо-ферментов. Рентгенострук-туриый анализ показал, что в результате такой предобработки надмолекулярная структура существенно не изменялась, наблюдалось образование единичных рефлексов, которые не вызывали уменьшение реакционной способности.

Электрохимическая предобработка дробины в сочетании с термообработкой оказывает влияние на реакционную способность. Однако, дробина обладает буферными свойствами и при обработке дробины водой, полученной в анодной зоне электрсактиватора проточной конструкции, значение рН в процессе такой обработки изменялось с 1,5 до 2,5. Наиболее эффективным оказался метод предобработки суспензии дробины в электроактиваторе логруиной конструкции. Реакционная способность дробины в этом случае значительно возрасла: начальная скорость образования РВ составила 1,39 г/л ч, выход РВ через 48 часов гидролиза - 32,® к с.в., при этом СП уменьшилась а 3,9 раза, а удельная площадь поверхности увеличилась в 1,8 раза.

В результате предобработки дробины паровой декомпрессией сохранялась аморфная структура, Ш уменьшилась в 5,4 раза, удельная площадь поверхности, доступная ферментам увеличилась в 4 раза. В результате таких физико-химических параметров увеличилась реакционная способность субстрата: начальная скорость гидролиза составила 3,05 г/л ч, а виход НВ - £7,Е$ к С.в.

Таким образом, для увеличения реакционной способности пивной дробины при фериентолизе эффективными оказались еледущие методы предобработки:

- обработка 0,8£-кш раствором серной кислоты в сочетании с термообработкой /121°С, 30 ипщут/;

- обработка суспензии пивной дробины в анодной зоне электроактиватора погружной конструкции в сочетании с термообработкой /121°С, 30 мин^т/;

- паровая декомпрессия.

2.3. Ферментативный гидролиз пивной дробины

Исходя из качественного состава полисахаридов пивной дробины, мы сочли целесообразным использовать ферменты, обладающие целлюлаз-ным и гемицеллюлаэныы комплексом активностей. Из отечественных и оштно-промашгенных препаратов такими свойствами обладают целловири-дин ГЗХ, пектофоетвдин ГЗХ и ксилоглюкзнофоетвдин ШОК. Сравнение данных препаратов по эффективности гидролиза предобработанной дробины показало /рис.1/, что при использовании дробины, предобработан-ной 0,85£-ным раствором серной кислоты в сочетании с термообработкой и дробины, предобработаяной в анодной зоне электроактиватора погружной конструкции в сочетании с термообработкой, наибольший выход РВ наблюдался при ферментолиэе целловиридином ГЗХ и составил, соответственно, через 48 часов гидролиза 39,0 и 37,9% к с.в. При проведении ферлентолиза дробины, предобработанной паровой декомпрессией, наибольший выход РВ за 48 часов пщролиза наблюдался при использовании ферментного препарата ксилоглюванофоетвдина ШОХ и составил 40& к с.в.

Определение оптимальных условий проведения процесса ферченто-лиза показало, что температурный оптимум гидролитического действия целловиридина ГЗХ лежит в интервале 45-50°С, пектофоетидина ГЗХ и

рв.г

с,в

1

I 1 ^ГТ!

„

/ /V ___

—/

*

8 16 24 32 40 48 Продолжительно сть,час.

а/

8 16 24 32 40 48 Продолжительно сть,час. б/

РВД с.в,

35,0 30,0

25,0 20,0 15,0

10,0 5,0

1— ! 1 ;

(л и -

{

/

8 16 24 32 40 48 Продолжительность,час. в/

Рис.1. Гвдратаз пивной дробины микробными ферментными препарами

а/- предобработка дробкны 0,8-н^м раствором серной кислоты в сочетании с термообработкой; б/- предобработка суспензии дробкны в анодной эонз электроактиватора погружной конструкции в сочетании с термообработкой; в/- предобработка дробины паровой декомпрессией

1 - целловирвдин ПЗХ

2 - ксилоглЬканофоетидин ШОК

3 - пектофоетидин ГЗХ

Условия гидролиза: концентрация субстрата влажностью 64£ - 625 г/л концентрация фермента - 40 г/л тедаература - 45иС рН - 4,5

ксилоглшанофоетидина ШОХ в интервале 45-55°С. рН-Оптымум действия целловиридина ПЗХ составил 4,0-5,0, для пектофоетидина ГЭХ к ксило-глюканофсетвдина ГПОХ - 4,5-5,5.

Оптимальная концентрация субстрата при гидролизе составила 625 г/л, при влажности дробины 84$, что соответствует 100 г с.в*/л. Оптимальная дозировка ферментных препаратов - 10$ к с.в. дробины. При такой дозировке время гвдролиза - 20-24 часа.

Анализ состава гидролизатов дробины, проведенный с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, показал, что основными продуктами были арабютоза, ксилоза, ксилобиоза, глюкоза и целлоби-оэа, а также неидентифицированные трисахарида. для увеличения выхода РВ при ферментолизе использовали мультиэнзикные композиции /табл.4/»

Как видно из данных табл.4 применение ыультиэнзиыных композиций позволило увеличить глубину гидролиза- с 37,9Й до 47, Сй и 46,8$ -для дробины, предобработаяной 0,6^-ным раствором серной кислота в ■ сочетании с термообработкой и с 36,до 45,и 46, Сй - для дробины, предобработанной в анодной зоне электроактиватора погружной конструкции в сочетании с термообработкой, при следующем соотношении ферментных препаратов целлозиридин ГЗХ:пентофоетидин ГЗХ - 4:1, целловирвдин ГЭЗСгхснлоглюканофоетвдкн ЛЮХ - 4:1, соответственно,

¿энные табл.5 свидетельствуют о высокой эффективноети мульти-энэимной композиции, состоящей из ксилоглюканофо&тц£ина П10Х и целловиридива ГЗХ, взятых в соотношении 1:1, при зтом зысод РВ увеличился с 40,СЙ до 47,Е$ я с.в.

2.4, Кинетика, механизм и закономерности ферментативного гидролиза геккцелжщозы

Из приведенных вьале данных следует, что при ^ерлентолизе пивной дробины с увеличением гешцеялкшаздай актив::ости ферментов увеличивается выход РВ, В связи с этим представлялось целесообразном

Сравнительная эффективность действия мультиэнзимных композиций на предобработанную пивную дробину^

? Содержание РВ в гидролиэатах ,%с.в. > Предобработка пивной дробины

Состав цультиэнзимной композиции! 0,8$-ным раство- !в анодной зоне

!ром серной кисло-!элеятроактивато-!ты в сочетании с погружной [термообработкой 'конструкции в I (сочетании с тер-

? !мообработкой

Гидролиэат после предобработки

Целловиридин ГЗХ-1С$

Целловиридин ГЗХ- Ш + Пектофоетидин ГБХ-2%

Целловиридин ГЗХ- + Пектофоетидин ГЗХ-5%

Целлэвирвдин ГЗХ- 8% + . Ксилоглюканофоетидин П10Х-2%

Целловиридин ГЗХ- ЭЙ + Ксилоглюканофоетидин ПХСК-5®

23,20 37,90

47,00

34,90

46,79

37,90

19,00 36,80

45,20

33,50'

46,00

35,80

X/

Условия гидролиза; концентрация субстрата - 625 г/л, влажностью температура - 45°С, рЙ - 4,5, продолжительность 22 часа.

Таблица 5

Сравнительная эффективность действия мультиэнзимных композиций на дробину, предобработанную паровой декомпрессией х/

Состав мультиэнзимной композиции ¡Содержание ^дгидролизате,

Гвдролизат после предобработки 9,00

Ксилоглюканофоетидин П10Х-1С$ 39,00 Ксилоглюканофоетидин ЩСК- 85ь +

Целловиридин ГЗХ - 44,20 Ксилоглюканобоетидин П1СХ- 5% +

Целловиридин ГЗХ - 5$ 47,50 Ксилоглюканофоетидин ПЮХ- 2% +

Целловиридин ГЗХ - 42,00

^Условия гидролиза аналогичны табл.4.

- le -

более подробно изучить кинетику, механизм и закономерности ферментативного гидролиза гешщеллюлоэы.

1/ш. этого из ферментного препарата ксилоглюканофоетцдин П1СК

бели вццелены и очищены фракции ферментов, осуществляющих гидролиз

гемкцеллюдозы: эндо-1,4-£ -ксиланаза и £-ксилозидаза. Константы

Михаэлиса действия на гемицеллкшоэу дробины эндо-1,4-^ -кошкшазьг

Р о

и ^.-ксилозидазы составили 3x10 , 5x10 г/мл, соответственно.

Эндо-1,4-^-хсиланаэа проявляла наибольшую активность при рН 4,5-5,0 и температуре 45-50°С, а ^-исилозвдаза при рН 5,0-5,5 и температуре 55-60°С. Веделеннда фракции ферментов характеризуются сравнительно высокой термостабильностью « Так эндо-1,4-^-ксилаказа при 50°С сохраняла за 24 часа 85$ активности, а р-ксилозвдаза -95^,

Следует ответить, что значительная тестабильность ферментов в сочетании с высоким температурным оптимумом действия выделенных ферментов делает кк перспективными для практического применения.

Ферменты достаточно устойчивы к инактивация при перемешивании. Так^-ксилозщцаза за 24 часа сохраняла до 68%, а зндо-1,4-^-ксила-наза до 72% активности /преыешивание - 300 об/мин, 25°С/.

Различие адсорбционной способности ферментов на нерастворимом субстрате приводит к тому, что в процессе гидролиза эндо-Г, 4-ji -кси-ланаза осуществляет гидролиз находясь практически полностью адсорбированной на субстрате - до 70% и более, основная же часть jb-ксилози-дазы находится в растворе - до Ш-9С(£.

В действии между эндо-1,4-^»-ксиланазой и ji-ксилозкдаэой бил обнаружен синергизм.

£.5, Регенерация ферментов, гкдролизующих некрахмальные полисахариды пивной дробины

Проблема регенерации ферментов, гццролизущих некрахмальные полисахариды имеет два аспекта: регенерация слабоадсорбкругацихся ферментов из раствора - т.е. отделение от низкомолегулярных продуктов

гидролиза; и регенерация прочкоэдсорбирущихся ферментов.

В экспериментах по окончании процесса ферлентолиза 65-7СЙ эн-доглоканазы и гемицеллюлазы, 90-92$^-ксилозидазы находилось в растворе, ЗО-ЗЕй эндоглюканаэы и гемицеллюлазы, 8-1С(£ £-ксилозида-зы было адсорбировано на остатках субстрата, при этом глубина гидролиза предобработанной дробины составила в среднем 47&,

Доя выделения ферментов из гщролизата был применен метод ультрафильтрации. Установлено, что мембрана УАМ-100, из всех иссле-дованкьд типов мембран, обеспечивает хороший эффект разделения -98-99$ - ферментов при концентрировании их в 20 и более раз, при этом скорость процесса ультрафильтрации составила в среднем 11-13

л/Л.

Данные по десорбции прочноадсорбирукицихся ферментов с непро-гидролизованного остатка субстрата показали, ггго эффективным десор-бирупщим агентом оказались I М раствор мочевины и активированная вода с рН 7,0, которые приводили к десорбции более чем половины . прочноадсорбирующихся ферментов - эвдоглюканазы и гемицеллюлазы, что составило в среднем около 19$ при использовании мочевины и при использовании активированной вода от общего количества эндоглюканаэн и гемицеллюлаэк в исходном ферментном препарате.

Использование регенерированные слабо- и прочноадсорбирувдцихся ферментов для гвдролиза свежей порции предобработанной дробины показало, что при равных зндоглшаназцих активностях глубина гидролиза слабоадсорбирующигжся ферментами составила примерно ТОЙ, а прочно-адсорбирующикися - 60-65% от глубины гидролиза под действием исход- у ного ферментного препарата.

Возможность регенерации ферментов, гидролизущих некрахь'альние полисахарида, могло оценить на основании данных эксперимента по гидролизу предобработанной дробины "реконструированным" ферментным препаратом, полученным объединением растворов регенерировангалс прочно-и слабоадсорбкгуюцихся ферментов нульткэнзмлних кошозиций.

Композиционный ферментный препарат - ВД& к с.в.

Предобр&ботанная пивная дробина -100 г с, в./л Гидролиз 22 часа, рН 4,5, 1=45°С Глубина гидролиза 4^? от с.в.

• I---1

Непрогидролизованный остаток Раствор, содержащей слабоад-

субстрата с прочноадсорбиро- сорбированные ферменты - 65%

ванными на нем ферментами - эндоглюканазы от ее исходного

35% эндоглюканазы от ее ис- количества, и продукты гидро-

ходного количества лиза ^

Регенерация прочноадсорбиро- Регенерация слабоадсорбирую-

ванных ферментов - обработка цихся ферментов - ультрафилы

активированной водой с рН 7,0 рация на ацетилцбллюлозных

в течение 1-часа при перене- мембранах УАЫ-Т " шивании, 20 |

Регенерированные прочноад- Регенерированные слабоадсорби-

сорСированные фешенты - 27, К рованные ферменты - андо-

эвдогиканазы от ее исходного глюканаэы от^ее исходаого ко-

количества, 77,5% от коли- личества, 98% от количества

чества прочноадсррбированных слабоадсорбированных ферментов

ферментов

1

"Реконструированный" ферментный препарат, регенерированный из раствора и с остатка субстрата-.91,1% эндоглюканазы от ее исходного количества

Предобработанная пивная дробина

Повторный гидролиз 22 часа, рН 4,5; ^ 45°С Глубина гидролиза около 45% от с.в. -94% от глубины гидролиза, осуществляемого исходным ферментным препаратом

Рис.2

Схема ферментолиза дробины регенерированнши ферментами

пивная дробина

га

л,

ферментный препарат

\

ОО

23

ОЭ

Ж

е-

V

ГТГЪ^Г]

} 21\ 20

СО

18 Оп 15 Ю]

З9

Рис. ЗБиотехнологоте екая схема утилизации пивной дробины 1-бункер для дробины, 2-весы, З-еукость ддя хранения компонентов буферных растворов, 4-еукость для приготовления Суферного-раст^орэ, 5,6,10,19,22,25,ЗГ.ЗЗ-насосн, 7-е«кость для приготовления раствора фермента, 8-реевторная установка для предобработки, 9-фериек-тшшзер, П-сепаратор, 12-17-фильтрационнэя установка тонкой очистки, 18-сборник, 20-у л ьт рефильграци энная установка, 2Г-сбор(ш концентрата, 23-сборнкк дедаеата, 24-ек»-кость для .приготовления питательной среды, 26-пробирки чистой культуры, 27-нолба, 28-вно-иулятор, 29-4ертертатор, ЭО-элентроактаьвтор, 32-емкость, 34-сепаратор

2.6. Технологический процесс утилизации пивной дробины

В результате проведенных исследований разработана технология утилизации пивной дробшш на основе применения биотехнологических процессов, которая сводится к получению ферментолизатов пивной дробины и белковое кортовому продукту /рис.3/.

Полеченный кормовой продукт соответствует требованиям ИСК СССР и содержит 44-50^ сырого протеина; 37-42$ истинного белка; 5,1-5,255 фосфора - 2,0-5,0 липидов; 2,5-3,9$ нуклеиновых кислот.

ВЫВОДЫ

1. Разработана принципиально новая биотехнологическая схема утилизации пивной дробины, включающая получение ферментолиэатов для микробиологического синтеза и процесс получения белкового кордового продукта из пивной дробины с содержанием сырого протеина 44-5СЙ, истинного белна 37-42$, фосфора 5,1-5,9$.

2. Разработаны способы предобработки пивной дробины, направленные на увеличение реакционной способности субстрата при ферлентолизе.

2.1. Предобработка 0,б$-ным раствором серной кислоты в сочетании с термообработкой /121°С, 30 минут/.

2.2. Предобработка суспензии дробины в анодной зоне электроактиватора погружной конструкции в сочетании с термообработкой /121°С,30мин./.

2.3. Предобработка паровой декомпрессией /0,5 Ш1а, 70 минут/. *

3. Разработан процесс ферментативного гидролиза пивной дробины.

3.1. Разработан экспресс-метод определения ксилаиазной активности по окрашенному субстрату.

3.2. Изучена роль компонентного состава и активности ферментов, необходимых для гидролиза пивной дробины.

3.3. Показано, что наиболее важными для эффективного ферментативного гидролиза пивной дробины являются высокая ксиланазная,^-ксилозидаз-ная, эндоглюканазная и целлобиазная активности.

3.4. Разработан способ гидролиза предобработаншк образцов пивной дробина с использованием мультиензимных композиций, состоящих из целловиридина ГЗХ. и пектофоетвдина ГЗХ, взятых в соотношении 4:1, целловиридина ГЗХ и ксилоглюканофоетидина ШОК - в соотношении 4:1, ксилоглюканофоетидина ШОХ и целловиридина ГЗХ - в соотношении 1:1, при этом концентрация субстрата составляла ICO г с.в,/л, концентрация ыультиэнзимной композиции - 1СЙ к с.в., температура 45-50°С, рН 4,5-5,0, продолжительность-22 часа. Выход РВ составил 45,2-47,5&с.в;

3.5. йщелены эцдо-1,4-р-ксиланазная и ^-ксилозвдазная фракции кси-ланаэного комплекса ксилоглюканофоетидина П10Х, изучены их кинетические свойства и механизм действия. Показано, что при совместном присутствии эндо-1,4-^-ксиланазной и ^-ксилозидазной фракций в процессе ферментолиза гемицеллюлозы проявляется синергизм,

3.6. Разработана комплексная схема регенерации ферментов, включающая регенерацию слабоадсорбирувмцихся ферментов из ферыентолизата методом ультрафильтрации на ацетилцелшлозных мембранах ИМ И десорбция прочноадсорбирующихся ферментов с поверхности не прогидролизо ванного остатка субстрата с применением в качестве десорбирущего агента I М раствор мочевины или активированной воды с рН 7,0. Установлено, что комплексная схема регенерации ферментов позволяет регенерировать до 9И ферментов /по эндоглюканаэе/ от их исходного содержания при гидролизе.

3.7. Доказана возможность многократного использования концентратов, содержался ферменты, для гидролиза сырья.

4. Разработан способ получения белкового кормового продукта из пие-лой дробины.

4.1, Установлена целесообразность использования пивной дробины как технологического сырья для получения продуктов микробиологического синтеза.

4.2. Отобран штамм дроишей Candida tiopica&s 431, обладающий высо-

кой скоростью роста к активно синтезирующий белок при глубинном культивировании на питательной среде, содержащей в качестве основного компонента ферментолизат, полученный из дробины и определены оптимальные условия культивирования - рН 4,7-5,5, температура 37°С, продолжительность 9-10 часов, Разработана рациональная среда для культивирования, содержащая в качестве основных компонентов ферыен-толизат -.98,8% и диаммоний фосфат - 0,2Si.

5. Ожидаемый экономический эффект от внедрения белкового кормового продукта составит 37,99 тыс.рублей в расчете на типовой телятник в 400 голов за один откормочный период.

Основные положения диссертации изложены в следующих работах:

1. Толстова С.Б», Калунянц К.А., Садова А.И., Лисш F.M. Еиотранс-формация пивной дробины в шсокобелковистый корд, - В сб.: Тезисы докладов- Всесоюзной научной конференции "Пути совершенствования технологических процессов и оборудования для производства, хранения и транспортировки продуктов питания", M., I9Q4, с.100, "Для служебного пользования".

2. Толстова C.B., Калунянц К.А,, Садова А.И., Лисюх Г.М. Гидролиз пивной дробины целлюлолитическими препаратами. - Ферментная и спиртовая промышленность, Si 7, 1984, с.16-17.

3. Толстова C.B., Калунянц К.А., Садова А,И., Шелоп Н.М. Математические метода оптимизации гидролиза пивной дробшш и использование гидролиз&та. - Ферментная и спиртовая промышленность, (S I, 1985, с.30-32.

4. Толстова C.B. Цути использования отходов при производстэе пива.-В сб.; Материалы межреспубликанской научно-технической конференции молодых учешгх до состоянию и перспективам мало- и безотходной технологии и использованию вторичных материальных ресурсов, Тбилиси, 1985, с.125-126.

5. Толстова C.B., Трсфилов Э,М., Сидоренко Б.Н. Регенерация ферментов, гидролизующих некрахмальные полисахариды. - В сб.: Тезисы докладов У Всесоюзного симпозиума по инженерной энзимологии "Получение и применение биокатализаторов в народном хозяйстве и медицине", Кобулети, 1985, т.2, с.281.

6. Калунянц К.А., Садова А.И., Толстова C.B. Гидролиз целлюлозосо-держащих отходов пищевой промышленности и сельского хозяйства биокаталиэаторами. - В сб.: Тезисы докладов II Всесоюзной конференции "Биосинтез целлюлозы", Казань, 1985, с.80-81.

7. A.c. П43777/СССР/. Способ получения посевной культуры дрожжей. Авг.изобр. Толстова C.B., Калунянц H.A., Садова АД., Ездахов Н.В.-Заявл. б.07.93, » 3610103/13,- Опубл. в Б.И., 1985, F 9 .

8. A.c. I163826 /СССР/. Способ получения белкового корда из отходов пивоваренного производства. Авт.кзобр. Толстова C.B., Калунянц H.A., Садова A.B., Дисюк P.M. - Заявл. 6;07.83, № 3616438/15; Опубл. в Б.И., 1935, S* 84.

9. Толстова C.B., Калунянц К.А., Садова А.К. Использование отходов пищевой промышленности для получения этанола. - Экспресс информация. Серия 7. йдаодельческая, спиртовая, ликеро-водочная и пи-' во-безалкогольная промышленность. - М., ЩЛШШПщепроы, выпуск

4, 1985

J