автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Обоснование технологии фукоидана при комплексной переработке бурых водорослей дальневосточных морей

На правах рукописи

Гурулёва Ольга Николаевна

ОБОСНОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ФУКОИДАНА ПРИ КОМПЛЕКСНОЙ ПЕРЕРАБОТКЕ БУРЫХ ВОДОРОСЛЕЙ ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ МОРЕЙ

05.18.07 — биотехнология пищевых продуктов

(биотехнология гидробионтов); 03.00.04 — биохимия (технические науки)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Владивосток - 2006

Работа выполнена в лаборатории комплексной переработки водорослей Федерального государственного унитарного предприятия «Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр» (ФГУП «ТИНРО-Центр»).

Научный руководитель — кандидат биологических наук, ст. н. сотр.

Аминина Наталья Михайловна

Официальные оппоненты — доктор биологических наук, ст. н. сотр.

Пивненко Татьяна Николаевна

— доктор технических наук, профессор Бойцова Татьяна Марьяновна

Ведущая организация — Дальневосточный государственный тех-

нический рыбохозяйственный университет (Дальрыбвтуз)

Защита состоится 5 декабря 2006 г. в 13.30 часов на заседании диссертационного совета Д 307.012.01 при ФГУП «ТИНРО-Центр» по адресу: 690950, г. Владивосток, ГСП, пер. Шевченко, 4. Факс: (4232) 300-751.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ТИНРО-Центр». Автореферат разослан " ^ " ноября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, /¡г^г

доктор биологических наук (ш [* О.С. Темных

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Бурые водоросли являются источником биологически активных веществ, таких как альпшат, фукоидан, йод, маннит, незаменимые аминокислоты, биогенные макро- и микроэлементы (Кизеветтер, 1976; Аминина, Под-корытова, 1992; Саенко, 1992; Ковековдова и др., 2001; Подкорытова, 2002). Главными компонентами водорослей являются полисахариды, направления использования которых определяются их физико-химическими и лечебно-профилактическими свойствами.

В последние годы внимание ученых привлекли сульфатированные гетеропо-лисахариды — фукоиданы, — построенные главным образом из остатков a-L-фукозы. При участии в молекулярном межклеточном взаимодействии они могут являться блокаторами широкого диапазона биологических процессов. Фукоиданы обладают противоопухолевым, противовирусным, антикоагулянтным, противовоспалительным контрацептивным и иммуномодулирующим действием, а также анти-пролиферативным эффектом. Следовательно, производство лечебно-профилактических продуктов, содержащих фукоидан, позволит значительно расширить арсенал немедикаментозных средств профилактики многих заболеваний.

В настоящее время только фирма "Sigma" производит фукоидан как реактив из бурой водоросли Fucus vesiculosus. Фукоидан является одним из компонентов таких биологически активных добавок (БАД), как «Суполан», «Маринид», «Ламиналь», «Ламэкс», а также полисахаридный комплекс «Фукусовый». Однако производство фукоидана как отдельного компонента, выделенного из водорослей, в виде БАДа в России отсутствует.

В дальневосточных морях сосредоточены огромные запасы бурых водорослей, представленные не одним десятком видов. В литературе встречаются противоречивые данные по химическому составу и содержанию фукоидана в водорослях (Усов и др., 1985; Zvyagintseva et al., 1999; Усов и др., 2001 ; Шевченко и др., 2005). Поэтому выбор сырья для получения этого полисахарида возможен только на основании исследований и систематизации данных по его количеству.

При существующих в России технологиях переработки водорослей основная часть фукоидана, хорошо растворимого в воде и разбавленных кислотах, экстрагируется и теряется в процессе первичной обработки. В связи с этим актуальной явля-

ется разработка технологии фукоидана из водорослей при их комплексной переработке, что позволяет сочетать его производство с получением альгинатсодержащих и йодсодержащих продуктов.

Цели и задачи исследования

Целью работы являются исследование содержания и состава фукоидана в бурых водорослях дальневосточных морей и разработка технологии его получения как составной части комплексной переработки водорослей.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

— провести исследования содержания и состава фукоидана бурых водорослей дальневосточных морей и обосновать выбор сырья для получения полисахарида;

— обосновать выбор экстрагента и условия извлечения фуковдана из бурых водорослей;

— обосновать технологию получения фукоидана из бурых водорослей;

— показать возможность получения фукоидана в одном технологическом цикле при получении альгинатсодержащих и других продуктов;

— провести исследования моносахаридного и фракционного состава конечного продукта «Фукоидан», определить его молекулярную массу;

— оценить биологическую активность полученного «Фукоидана».

Научная новизна. Впервые систематизированы данные по содержанию фукоидана в 26 видах бурых водорослей из разных районов дальневосточных морей, причем 6 видов водорослей исследованы впервые. Показано, что более 10 видов бурых водорослей дальневосточных морей могут быть использованы в качестве сырья для получения фукоидана.

Исследована зависимость количества фукоидана в водорослях от места их произрастания, возраста и части слоевища. Установлено, что максимальное количество фукоидана накапливается на второй год развития водоросли в верхней части слоевища Показано, что его содержание увеличивается с ростом температуры поверхностных вод в месте произрастания водоросли.

Впервые из бурых водорослей Cystoseira crassipes (Turn.) Ag. и Sargassum miyabe Yendo выделены фукоиданы и определен их химический состав.

Установлено влияние технологических параметров на моносахаридный состав и степень сульфатирования фукоидана в процессе экстрагирования.

Обоснованы рациональные параметры кислотного экстрагирования, обеспечивающего максимальное извлечение высокомолекулярного фукоидана из ламинарии японской, обладающего разнообразной биологической активностью.

Научно обоснована возможность получения фукоидана при комплексной переработке водорослей, предусматривающей производство и других биологически активных добавок к пище.

Предложены новые показатели, характеризующие процесс экстрагирования фукоидана, - степень извлечения и эффективность экстрагирования.

Практическая значимость. Усовершенствована технологическая схема переработки бурых водорослей, включающая получение в одном технологическом цикле фукоидана, а также йод- и альгинатсодержащих БАДов. Данная технология позволяет повысить рентабельность производства и расширить перечень продуктов, обладающих биологической активностью, за счет выделения фукоидана из кислотных экстрактов, являющихся отходами производства. Состав БАДов и их технология защищена Патентом РФ № 2233104 «Способ комплексной переработки бурых водорослей с получением йодсодержащих и полисахаридных продуктов».

По результатам медико-биологических испытаний фукоидап рекомендован к использованию в качестве биологически активной добавки к пище.

Разработаны нормативные документы: ТУ 9284-305-00472012-06 - «Фукои-дан. Биологически активная добавка к пище»; ТИ № 36-305-06 по изготовлению биологически активной добавки к пище «Фукоидан».

Реализация результатов исследований. На экспериментальном технологическом производстве ФГУП «ТИНРО-Центр» выпущены опытные партии «Фукоидана» и установлена экономическая эффективность производства.

Апробация работы. Материалы диссертации представлялись на Всероссийской конференции молодых ученых, посвященной 140-летию со дня рождения Н.М. Книповича (Мурманск, 2002 г.); Международной научно-практической конференции «Современные проблемы торговли, расширение ассортимента и контроля качества потребительских товаров и продуктов общественного питания» (Санкт-Петербург, 2002 г.); Всероссийской конференции молодых ученых ТИНРО-Центра «Комплексные исследования и переработка морских и пресноводных гидробионтов» (Владивосток, 2003 г.); Международной конференции «Рациональное природополь-

зование и управление морскими биоресурсами: экосистемньш подход» (Владивосток, 2003 г.); 18th International seaweed symposium (Norway, 2004); 9-й Дальневосточной конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, 2005 г.); The Fourth Asia Pacific Phycological Forum (Bangkok, 2005).

Публикации. Основное содержание диссертационной работы изложено в 16 публикациях, в том числе 3 статьях, 12 материалах конференций, патенте.

Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения и 3 глав, включает 25 таблиц и 28 рисунков, изложена на 142 стр. Содержит 5 приложений, в которых приведены нормативная документация, патент, акты о выпуске опытных партий. Список литературы состоит из 204 источников (в том числе 121 иностранных).

Основные положения, выносимые на защиту:

Содержание фукоидана в бурых водорослях зависит от вида водоросли, ее возраста и условий произрастания.

Концентрация кислоты и гидромодуль, а также продолжительность экстракции влияют на выход фукоидана и его моносахаридный состав. От температуры экстракции зависит содержание фукозы и степень сульфатирования полисахарида.

Разработанные условия экстрагирования фукоидана позволяют получать несколько биологически активных добавок в одном технологическом цикле.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Обоснована актуальность темы, определена цель исследования и намечены пути ее достижения, сформулирована научная новизна, основные положения, выносимые на защиту, и показана практическая ценность работы.

Глава 1. Обзор литературы. Проведен анализ отечественной и иностранной научной и патентной литературы о структуре, биологической активности и способах извлечения и очистки фукоидана. Представленные данные показывают целесообразность использования бурых водорослей дальневосточных морей в качестве источника фукоидана. Обоснована необходимость разработки технологии фукоидана. Сделано заключение о перспективности извлечения фукоидана и других биологически активных веществ в одном технологическом цикле.

Глава 2. Объекты и методы исследований. Разработан общий методологический подход к научному и экспериментальному обеспечению технологии фукоидана и использованию его при изготовлении БАДов (рис. 1).

Рис. 1. Общая схема проведения исследований

В качестве объектов исследований использовали:

— 16 видов водорослей порядка Laminariales, 8 видов порядка Fucales, Desmarestia intermedia порядка Desmarestiales, Chordaria flagelliformis порядка Chordariales. Из них 13 образцов собрано у восточной Камчатки и северных Курильских островов, 7 - у юго-западного побережья о. Сахалин и в зал. Анива, 13 — у южного Приморья и в зал. Петра Великого, 2 — у Южной Кореи (Пусан);

— для определения фукоидана по топографии слоевища бурой водоросли L. bongardiana, разрезанной на 3 равные части;

— фукоиданы, полученные из бурых водорослей по разработанной технологии и по методам других авторов, а также фукоидан фирмы «Sigma»;

— альгинат натрия, полученный при отработке технологических режимов комплексной переработки водорослей;

— крыс линии Sprague-Dawley, массой около 100±5 г, а также сыворотку крови, ткани сердца и печени крыс после их эвтаназии;

— бактерии: Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Enterobacter aerogenes, Streptococcus mutans.

В работе применяли методы химических, спектральных, хроматографических и биологических исследований с использованием современного оборудования.

Содержание фукозы устанавливали спектрофотометрически по реакции фуко-зы с L-цистеином и серной кислотой (Усов и др., 2001). Моносахаридный состав -методом ГЖХ в виде альдононитрилов с мио-инозитом в качестве внутреннего стандарта на Shimadzu GS-9A (Япония), с капиллярной колонкой СВР-5. Содержание сульфатных групп - в виде BaS04 по методу Доджсона (Dodgson, 1961). Молекулярную массу - методом ВЭЭХ на Shimadzu LC-6A (Япония) с использованием колонки Shodex Asahipak GS-620, рефрактометрического детектора RID-6A и УФ-детектора SPD-6AV с длиной волны 280 нм. Колонку калибровали по декстранам с молекулярной массой 10,5, 40,0, 65,3, 473,0 и 2000,0 кДа (Sigma). Фукоидан фракционировали на колонке (3,2x45 см) с сорбентом DEAE-Toyopearl 650, фракции анализировали на присутствие углеводов фенол-сернокислым методом (Химия углеводов, 1967).

Степень извлечения определяли по разнице между содержанием фукондана в исходной водоросли и в водорослевых остатках. Эффективность экстрагирования рассчитывали путем умножения степени экстрагирования на отношение S0427Fuc.

Антибактериальную активность 1 %-ного раствора фукоидана определяли дисковым методом в клеточном инкубаторе Cellstar, интенсивность действия фукоидана оценивали по диаметру зон отсутствия роста микроорганизмов в миллиметрах.

Липидкорригирующую и антиоксидантную активность фукоидана определяли на белых крысах после холестериновой диеты. Биохимические показатели сыворотки крови, включая метаболиты липидного обмена, - на анализаторе FP-901 «Labsistems» (Финляндия) с использованием наборов фирм «Labsistems». Фракционный состав нейтральных липидов - методом тонкослойной хроматографии (Кейтс, 1975). Перекисное окисление липидов - по нарастанию диеновых коньюгатов (Скорняков и др., 1988) и малоновому диальдегиду (Андреева и др., 1988). Определение гепато-протекгориой и иммуномодулирующей активности фукоидана, острой и хронической токсичности проводили в Дальневосточном научном центре физиологии и патологии

дыхания СО РАМН НИИ MKBJI г. Владивостока на белых крысах с сердечнососудистой патологией.

Общее содержание азотистых веществ определяли по методу Кьельдаля на анализаторе «Kjeltec auto» 10 SO (Tecator, Япония). Содержание альгиновой кислоты, золы, вязкость альгинатных растворов и их относительную молекулярную массу -по ГОСТу 26185-84, а также проводили микробиологический контроль продукции.

Полученные экспериментальные данные обрабатывали с использованием пакета прикладных программ «Microsoft Excel»-XP, Statistica-6,0. Глава 3. Результаты исследований

Исследование содержания фукоидана в бурых водорослях

Содержание фукоидана в ламинариевых водорослях варьирует от 0,6 до 6,5 % (рис. 2), в фукусовых - от 1,5 до 7,9 % (рис. 3). Среди водорослей двух порядков отдельные представители отличаются высоким содержанием фукоидана: например, из порядка ламинариевых - Undaria pinnatifida (6,5 %), Laminaria japónica (4,5 %), Laminaria bongardiana (4,2 %); из порядка фукусовых - Sargassum fulvellum (7,9 %), Fucus evanescens (6,9 %), Cystoseira crassipes (5,0 %). Наибольшее количество фукоидана (15,4 %) присутствует в бурой водоросли С. flagelliformis - представителе порядка Chordariales.

A. fistulosa С. costata A. cribrosum A. turnere A. angustata L. yezoensis L. cichorioides A. bifidus L. dentigera K. crassifolia L. gurjanovae Th. intermedium L. bongardiana L. japónica U. pinnatifida

>:S'-Víjór-lv-iti^ '

3 4 5 6

Содержание фукоидана. "ó

Рис. 2. Содержание фукоидана (% от сухого вещества) в водорослях порядка Laminariales

фукоидана (% от сухого вещества) в водорослях порядка Рисакв

Рис. 3. Содержание

о

2 3 4 5 6 7 8

Установлено, что количество фукоидана зависит от гидротермических условий произрастания водорослей. Его содержание увеличивается с ростом температуры поверхностных вод. Например, в бурой водоросли С. сгсязгреБ (цистозира толстоногая) с западного побережья о. Сахалин содержание фукоидана в 2 раза выше, чем в водоросли из бухты Краковка, которая подвержена влиянию холодного Приморского течения, а в цистозире из зал. Петра Великого отмечено наибольшее количество фукоидана - 7,7 % (рис. 4). Поэтому водоросли, произрастающие в закрытых бухтах или районах, подверженных влиянию теплых течений, целесообразно использовать для комплексной переработки, включая получение фукоидана.

Распределение фукоидана по слоевищу водорослей имеет неоднородный характер и зависит от возраста водоросли (рис. 5). На примере Ь. Ъоп^агсИапа установлено, что максимальное количество фукоидана накапливается на второй год развития в верхней части слоевища, поэтому для получения фукоидана рекоменду-

1эо т 134 |з> 1эа 1« 1« ш

Рис. 4. Содержание фукоидана (% от сухого вещества) в С. сга$51рез в зависимости от места произрастания:

- холодное течение, аждаЛ1" - теплое течение

ется использовать не только центральные части слоевища, но и верхние, которые являются отходами при заготовке водорослей.

Рис. 5. Динамика накопления фукоидана (% от сухого вещества) в зависимости от части слоевища Ь. Ъоп^агсИапа

X год 2 года 3 года

Часть слоевища О верх. Ш сред. Ш ниж.

ГЖХ-анализ ламинариевых и фукусовых водорослей показал, что фукоза является основным моносахаридом, за исключением L. gurjanovae, где главный моносахарид — глюкоза (16 %), по количеству которого можно судить о присутствии в водоросли ламинарана (табл. 1). В остальных водорослях содержание ламинарана не превышает 0,4 % - у ламинариевых и 2,6 % - у фукусовых. Для извлечения фукоидана, содержащего наименьшее количество примеси ламинарана, рекомендована L. japónica. Помимо фукозы в фукоидане также могут присутствовать ксилоза, ман-ноза, галактоза. Как показал анализ, количество данных моносахаридов не превышает 1 %, за исключением галактозы в К. crassifolia (табл. 1). По моносахаридному составу можно оценить «идеальный» состав фукоидана — это наибольшее количество фукозы к сумме других моносахаридов (Xyl+ Man+Gal). Так, источником фукоидана с содержанием фукозы 50,0-67,0 % могут служить исследованные фукусовые и ламинариевые водоросли за исключением L. gurjanovae, A. fistulosa, L. yezoensis.

Таблица 1

Моносахаридный состав бурых водорослей дальневосточных морей,

Вид водоросли Моносахаридный состав Fue/ (Xyl+ Man+Gal)

Fue Xyl Man Glc Gal

L. bongardiana 1,61 0,50 0,63 0,30 0,48 50,0: 50,0

L. gurjanovae 0,55 0,14 0,47 16,00 0,63 30,7: 69,3

К. crassifolia 3,20 0,25 1,22 0,39 1,38 52,9:47,1

A. bifídus 1,70 0,40 0,66 0,29 0,66 50,0:50,0

L. yezoensis 1,83 0,56 U1 0,25 0,73 42,3:57,7

L. japónica 1,91 0,25 0.60 0,05 0,68 55,5 : 44,5

A. fistulosa 0,52 0,10 0,38 0,25 0,46 35,6:64,4

C. crassipes 2,26 0,36 0,70 1,76 0,99 52,4 : 47,6

F. evanescens 4,55 0,26 0,98 2.58 1,00 67,0:33,0

В результате проведенных исследований установлено, что по содержанию и составу фукоидана сырьем для его получения могут служить бурые водоросли -L. japónica, L. bortgardiana, К. crassifolia, A. bifidus, С. crassipes, F. evanescens. Разработка технологии фукоидана из ламинарии японской За основу разработки технологии были выбраны условия экстракции, при которых возможна переработка водорослей с получением двух и более продуктов.

Для удаления сопутствующих фукоидану низкомолекулярных веществ была испытана стадия предобработки воздушно-сухой водоросли раствором этилового спирта в условиях, аналогичных режиму экстракции йодно-маннитных комплексов. Установлено, что в результате такой обработки в продукте снижается количество азотсодержащих веществ и маннита, за счет чего улучшаются качественные характеристики полисахарида: повышается степень его извлечения, количество сульфатных групп и фукозы увеличивается в 2 раза (рис. 6), поэтому в дальнейших исследованиях использовали водоросли после обработки спиртом.

70 60 50 40 30 ■ 20 -10 0

Сульфатные Азотсодержа группы Щие вещества

Рис. 6. Влияние спиртовой предобработки водоросли на выход и химический состав фукоидана (% от сухого вещества)

Ш Исходная водоросль □ Водоросль после спиртовой обработки

Для изучения влияния экстрагента на выход фукоидана и его качественные характеристики при температуре 20±5 °С исследован интервал концентраций соляной кислоты от 0 до 1,5 % при разном гидромодуле (ГМ) и времени экстрагирования. Установлено, что при использовании воды в экстракте содержится около 20,5 % примесей азотсодержащих веществ, в то время как при использовании кислоты в 2 раза меньше. Максимальный выход конечного продукта — «Фукоидана» — наблюдается при использовании 1,0 % (ГМ 1 : 5 ) и 1,5 %-ных растворов кислоты при обработке водоросли от 8 до 16 ч (рис. 7).

Дня установления рационального времени экстрагирования при 20+5 °С определена степень извлечения фукоидана в течение 24 ч (рис. 8), которую оценивали

по содержанию фукозы в экстракте. Установлено, что наибольшее количество фу-коидана экстрагируется в течение 16+1,5 ч от начала экстрагирования.

20

Ш12 10

4ч 6 ч

— 0,5% HCl, 1:5

— 1 % HCl, 1:5

— 1,5% HCl, 1:5

12 ч 16 ч 20 ч

— 0,5% HCl, 1:10 ■■»•■1% HCl, 1:10

Рис. 7. Влияние продолжительности кислотного экстрагирования на выход конечного продукта (% от сухого вещества) при температуре 20±5 °С

Рис. 8. Динамика экстрагирования фукоидана (%), экстрагент - 1 %-ная HCl, ГМ 1 : 5, температура 20±5 °С

2 4 6 8 10 14 16 18 24 Время,ч

При варьировании ГМ и концентрации кислоты установлено, что экстрагирование в течение 16 ч при температуре 20±5 °С способствует увеличению содержания сульфатных групп в полисахариде в 1,5-2,0 раза, фукозы - в 2-3 раза (рис. 9). Причем при использовании 1 %-ной НС1 (ГМ 1 : 5) получен фукоидан с наибольшим содержанием сульфатных групп и фукозы (рис. 9).

.. ГМ 1;5

&

4 10

О 5

О

ГМ 1:5

ГМ 1:10

S -

0,5 % HCl

0,5 %HCI

1 %НС1

3]-2 часа; щ - 16 часов Рис. 9. Влияние ГМ и концентрации кислоты на содержание сульфатных групп (а) и фукозы (б) в фукоидане при температуре экстракции 20±5 °С

При нагревании экстракта до 50 °С в течение 2 ч степень извлечения фукои-дана увеличивается и достигает своего наибольшего значения (рис. 10), сравнимого со степенью извлечения полисахарида, полученного при температуре 20+5 °С в течение 16 ч (табл. 2). Однако в результате нагревания количество сульфатных групп в фукоидане снижается в 1,5 раза, а содержание маннита увеличивается в 2 раза. По литературным данным, биологическая активность фукоидана зависит от степени сульфатирования (Гаврилова и др, 1997; Усов и др. 1998; Нагоип-ВоиЬесУа Й а1., 2000), поэтому сделано заключение о неприемлемости нагревания в кислой среде. Оценка эффективности экстрагирования фукоидана (степень экстрагирования, умноженная на отношение БОЛТис), а также количество сульфатных групп показати, что рациональной является экстракция при температуре 20±5 °С в течение 16 ч.

76 # 74 | 72 I 70

щ

I 68 1 66 -

I 64 ф

о 62 60

HCl, ГМ 1:5

Рис. 10. Влияние температуры экстракции на степень извлечения фукоидана (время экстракции 2 ч)

— 1 % HCl, ГМ 1:10

Ч-1-1-1

20±5 30±5 40±5 50±5 60±5 70±5 80±5 Температура

Таблица 2

Влияние температуры экстракции на эффективность экстрагирования и химический

Условия экстракции Степень извлечения Эффективность эк страгирования Сульф. группы Фукоза Азотсодержащие в-ва Маннит

16 ч, 20±5 *С 74,2±0,5 104,1 21,6±0,2 15,4±0,2 7,4±0,4 4,4±0,3

2 ч, 50±5 °С 74,0±0,6 81,4 14,7+0,3 13,9+0,1 8,8±0,3 9,9+0,4

Примечание: экстрагент 1 %-иая HCl, ГМ 1: 5.

На степень извлечения фукоидана также влияет кратность экстрагирования. Установлено, что при повторной обработке водоросли 1 %-ной кислотой от 2 до 10 ч при температуре 20±5 °С выход фукоидана увеличивается и достигает своего максимального значения через 6 ч, поэтому на следующем этапе разработки технологии фукоидана была рекомендована стадия повторного экстрагирования в течение 6 ч при температуре 20+5 °С. Как показал анализ, в результате однократного экстрагирования в течение 16 ч из водоросли извлекается около 74 % фукоидана, повторное экстрагирование в течение 6 ч способствует максимальному извлечению высо-

косульфатированного фукоидана, количество которого составляет около 83 % от его исходного содержания в водоросли (табл. 3).

Таблица 3

Влияние кратности экстрагирования на степень извлечения и химический состав

фукоидана, % от сухого вещества, среднее ± а

Условия экстракции Т,°С Степень извлечения Сульф. группы Фуко за Азотсодержащие в-ва Маннит

1-а экстракция (16 ч) 20±5 74,2+0,5 21,6±0.2 15,4±0,2 7,4±0,4 4,4±0,3

2-я экстракция (6 ч) 20+5 6,8±0,3 17,8±0,1 12,4±0,3 6,0±0,1 2,5±0,2

Двукратная экстракция (16+6 ч) 20±5 82,7±0,4 31,0±0,3 15,6±0,1 7,б±0,2 2,0±0,3

2-я экстракция (2 ч) 50±5 81,1±0,5 19.1±0, 2 17,3±0,1 10,0±0,1 2,4±0,2

2-я экстракция (6 ч) 50+5 72,4±0,3 15,4±0,3 17,7±0,2 11,5±0,1 2,3±0,3

Повышение температуры при повторном экстрагировании не только не способствует увеличению степени извлечения фукоидана, но и приводит к отщеплению сульфатных групп в 1,5-2,0 раза по сравнению с фукоиданом, полученным при температуре 20+5 °С (табл. 3).

Влияние условий экстрагирования на структурные особенности фукоидана оценивали по его моносахаридному составу. В составе полисахарида помимо фуко-зы обнаружены ксилоза, манноза, галактоза и маннит, основное количество которого удаляется при спиртовой обработке. В полученном продукте отсутствуют примеси ламинарана, содержание которого оценивали по глюкозе. Установлено, что изменение условий экстрагирования влияет на количество всех моносахаридов. Так, содержание фу козы варьирует от 2,2 до 17,7 %, ксилозы - от 0,3 до 7,0 %, количество галактозы и маннозы изменяется от 0,4 до 5,5 %. Сравнительный анализ моноса-харидного состава выделенного фукоидана с таковым у исходной водоросли позволяет полагать, что изменений в структуре полисахарида при его двукратной экстракции I %-ной соляной кислотой в течение 16 и 6 ч при температуре 20±5 °С не происходит.

На основании проведенных исследований установлен рациональный режим экстрагирования фукоидана из бурых водорослей, позволяющий получать максимальный выход полисахарида с наибольшим содержанием сульфатированной фуко-зы: предварительная спиртовая обработка водоросли, двукратное экстрагирование 1 %-ной НС1 при ГМ 1 : 5 в течение 16 и 6 ч при температуре 20±5 °С.

Проведены исследования по влиянию нейтрализации, фильтрования и сушки на качество конечного продукта. Для нейтрализации экстракта испытаны карбонат и гидрокарбонат натрия, гидроксид натрия и калия. Установлено, что использование щелочей приводит к бурному протеканию процесса, поэтому нейтрализовать экстракт рекомендовано с помощью карбоната или гидрокарбоната натрия. Испытано различное оборудование для фильтрования экстракта и показано, что очистку можно осуществлять на ротационном фильтре, центрифуге любого типа или с помощью ультрафильтрации. После исследования процесса сушки очищенного экстракта до остаточной влажности не более 10 %, рекомендовано использование сушилок любого типа (сублимационных, распылительных, конвекционных) при температуре процесса не выше 60 °С.

Для оценки эффективности разработанной технологии фукоидана из ламинарии японской выделены полисахариды по методикам, описанным в литературе, условия которых наиболее близки к нашим. Анализ показал, что фукоиданы, полученные разными методами, имеют близкий состав (табл. 4). Однако количество сульфатных групп и фукозы у фукоидана, выделенного по разработанной технологии, выше, чем у других полисахаридов. Целесообразность использования разработанной нами технологии также подтверждают высокая степень извлечения фукоидана (82,7 %) и эффективность его экстрагирования (173,7 %), которая значительно выше, чем при использовании других технологических решений.

Таблица 4

Химический состав полисахаридов, выделенных по методикам,

описанным в литературе, и по схеме автора, % от сухого вещества, среднее + ст

Условия экстракции Степень извлечения Эффективность экстрагирования Сульф. группы Фукоза Маннит Азотсодержащие в-ва

1 % HCl, 1:5,16 ч, 25"С; повторно 1 % HCl, 1 :S, 6 ч, 25 'С 82,7±0,4 173,7 З1,0±0,3 15,«±0,1 2,0±0,3 7,6±0Д

Трижды: 0,4 % HCl, 1:10, 1 ч, 65 "С * 71,5±0,3 143,0 22,1 ±0,4 10,9±0,2 3,4±0,4 8,9+0,3

Трижды (2 % СаС12, 1:17, 16 ч, 25 "С; повторно 6 ч, 50°С) ** 64,3+0,5 141,5 30,1+0,1 13,5±0,1 1,1+0,1 9,3+0,4

* Park et al., 2002. ** Усов и др., 1994.

Получение фукоидана из фукусовых водорослей

Рациональный режим выделения фукоидана из ламинарии японской был применен при использовании в качестве сырья фукусовых водорослей - С. crassipes

и К е\'апе$сет. Анализ полученных данных показал, что полисахариды из фукусовых водорослей имеют иной качественный и количественный состав по сравнению с таковым из ламинарии японской (табл. 5). Фукоиданьг из цистозиры и фукуса отличаются более высоким содержанием фукозы и меньшим количеством сульфатных групп, также в них обнаружено в 2,0-2,5 раза меньше азотсодержащих веществ.

Таблица 5

Химический состав полисахаридов из фукусовых водорослей, __% на сухое вещество, среднее ± о__

Вид водоросли Сульф. группы Фу коза Азотсодержащие в-ва Маннит Xyl/Man/Gal/ Glu Fuc/ (Xyl+Man+Gal)

L. japonica 31,0±0,3 14,6±0,1 7,6±0,2 2,0+0,3 1.9/1,1/1,3/0 77,2:22,8

С. crassipes 20,б±0,1 16,4±0,1 3,0±0,3 1,9+0,2 0/1.0/3,7/3,9 77,7:22,3

F. evanescens 25,3±0,1 19,1 ±0,2 3,9±0,2 2,4 ±0,1 0/0,8/1,1/3,2 91.0:9,0

Анализ моносахаридного состава показал, что в продуктах из фукусовых водорослей содержатся небольшие примеси ламинарана (3,2-3,9 %), а в составе фу-коидана отсутствует ксилоза (табл. 5). Таким образом, из фукусовых водорослей может быть получен фукоидан с преобладающим содержанием фукозы по отношению к остальным моносахарам (77,7 и 91,0 % соответственно для цистозиры и фукуса), что сравнимо с полисахаридом из ламинарии японской (77,2 %).

Показана возможность получения фукоидапа из саргассовых водорослей S. fulvellum и S. miyabei. Установлено, что полученные полисахариды имеют химический состав, отличный от состава фукоиданов из других исследованных нами водорослей, и состоят из фукозы и ксилозы в отношении 1,0 : 1,1. Из литературы известно (Park et ai., 2002), что фукоидан из S. fulvellum рекомендован для нормализации липидного обмена при холестериновой диете, поэтому саргассовые водоросли представляют интерес как источники фукозасодержащих полисахаридов.

По разработанной технологии на экспериментальном технологическом производстве ТИНРО-Центра выпущены опытные партии конечного продукта «Фукоидан», химический состав которых приведен в табл. 6. В процессе хранения «Фукоидан» в герметичной упаковке соответствовал требованиям СанПиН 2.3.2.1078. Содержание КМАФАнМ изначально и при хранении в течение 24 мес при температуре 20±5 °С находилось в пределах нормы, патогенные микроорганизмы не выявлены.

Таблица 6

Химический состав «Фукоидана», % на сухое вещество, среднее ± а

Выход Фукоидан Сульфатные группы Азотсодержащие вещества Минеральные вещества Маннит

17,3±5,0 39,2±0,5 30,3±0,2 4,8±0Л 20,1+0,2 5,6±0,1

Исследование фракционного состава «Фукоидана»

Установлено, что полученный «Фукоидан» представляет собой гетерогенный набор макромолекул с разным содержанием фукозы и сульфатных групп и состоит из 5 фракций (табл. 7). Используя метод разделения фукоидапа с помощью ионно-обменной хроматографии на БЕАЕ-Тоуореаг1 650 М, выделена фракция фукансульфата, состоящая преимущественно из остатков высокосульфатированной фукозы. Согласно литературным данным, именно с наличием фукансульфата в фукоида-не связывают его способность к антикоагулянтной активности (М^Ыпо й а1., 1989). Для выделения фукансульфата в качестве элюента обосновано использование 1,0 М, в меньшей степени 0,5 М, раствора хлорида натрия в 0,01 N соляной кислоте.

Таблица 7

Характеристика фракций «Фукоидана», полученных при ионно-обменной

хроматографии в градиенте концентраций NaCl, %

Показатель н2о 0,01 N НС1 0,5 М NaCl 0,01 N НС1 1,0 М NaCl 0,01 NIIC1 2,0 М NaCl 0,01 N НС1

Фукоза 9,34 26,55 30,66 46,51 23,92

Сульфатные группы 8,07 28,31 36,81 44,83 29,06

ВЭЭХ-анализ показал, что «Фукоидан» состоит из двух фракций — высоко-и низкомолекулярной (рис. 11). Помимо самого полисахарида в состав препарата входят высокомолекулярные белковые примеси и низкомолекулярные вещества, которые представляют собой неразделенную смесь олиго- и моносахаридов, маннита, растворимых минеральных веществ и аминокислот. Молекулярная масса первой фракции составляет 2280 кДа, далее выходит полидисперсный пик полисахарида, который содержит фукоидан с молекулярной массой 10-100 кДа. Исследование показало, что фукоидан фирмы Sigma имеет аналогичное молекулярно-массовое распределение и количественный состав (табл. 8), за исключением фракции с молекулярной массой 10-100 кДа, которая, согласно литературе, рекомендуется для использования в качестве антикоагулянта (Grauffel et al., 1989; Nishino et al., 1991). Результаты исследования показали, что данная фракция может быть выделена из нашего продукта с помощью ультрафильтрации.

Таблица 8

Содержание основных фракций «Фукоидана», %_

Препарат Фракция я2000 кДа Фракция 10-100 кДа 11изкомолеку лярные вещества

«Фукоида н» 42 19 39

Фукоидан (Sigma) 66 - 34

Рис. 11. Хроматограм-ма разделения «Фукоидана» методом ВЭЭХ: 1 — высокомолекулярные белковые примеси; 2 — высокомолекулярная фракция фукоидана; 3 — среднемолекулярная фракция фукоидана; 4 — низкомолекулярные примеси

Оценка биологической активности «Фукоидана»

В результате исследований установлено, что 1 %-пый раствор «Фукоидана» обладает антибактериальной активностью в отношении Bacillus cereus, Bacillus sub-tilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Enterobacter aerogenes, Streptococcus mutans; наиболее высокий антибактериальный эффект был выявлен в отношении Staphylococcus aureus, который проявлялся уже на первые сутки.

При определении острой и хронической токсичности при пероральном введении «Фукоидана» в дозе 2000 мг/кг не отмечено гибели животных, а также морфологических изменений тканей внутренних органов. Дальнейшее увеличение вводимой дозы невозможно из-за технических трудностей. Острая токсичность (ЛД50) для «Фукоидана» не установлена, рекомендуемая доза ежедневного потребления для человека составила 2 г в день.

При развитии холестериновой нагрузки у крыс было выявлено позитивное воздействие «Фукоидана» на основные показатели липидного обмена в сыворотке крови, тканях сердца и печени. Под действием «Фукоидана» нормализовались показатели, характеризующие процессы ПОЛ: так, содержание гидроперекисей и малонового диальдгида в печени уменьшилось в полтора раза, а показатели диеновой коиьюгации нормализовались до значений контрольной группы.

Курсовой прием «Фукоидапа» при экспериментальной сердечно-сосудистой патологии способствует нормализации обменных процессов в печени, значительному понижению уровня глюкозы и мочевой кислоты в крови, что указывает на нормализацию общих обменных процессов в организме животных под действием препарата. «Фукоидан» стимулирует фагоцитарные реакции, увеличивая уровень количественных и качественных параметров неспецифической резистентности, позволяет снизить уровень кислородного взрыва, вместе с тем повышая функциональный резерв окислительного метаболизма.

Таким образом, на основании медико-биологических исследований установлена безопасность употребления препарата «Фукоидан», который был рекомендован к использованию в качестве биологически активной добавки к пище как вспомогательное средство в профилактике и лечении заболеваний сердечно-сосудистой системы, заболеваний, связанных с нарушением липидного обмена, а также в качестве антиоксидан-та, иммуномодулятора и профилактического антибактериального препарата.

Обоснование комплексной технологии переработки бурых водорослей Экстракт, полученный после предварительной обработки водорослей спиртом, использовали для изготовления йодсодержащих пищевых добавок.

После экстракции «Фукоидана» была исследована возможность получения из водорослевых остатков альгинатсодержащих продуктов, таких как «Альгилоза» и «Ламиналь». На примере альгината было установлено, что по вязкости водных растворов и относительной молекулярной массе полисахарид, полученный после экстракции «Фукоидана», не уступает альгинату, выделенному по традиционной технологии (табл. 9).

Таблица 9

Влияние извлечения фукоидана из водорослей на выход и физико-химические

свойства альгината натрия, среднее ± ст

Сырье Выход альгината натрия, % Содержание, % к сухому веществу Вязкость 0,2 %-ного водного раствора, Ы- 10"3Пас

Альгиновая кислота Минеральные вещества

Ламинария японская сушеная 24,8±03 73,0±0,2 22,9+0,2 7,5±0,2

Водоросли после извлечения фукоидана 21,4±0,5 73,4±0,2 22,7±0,3 7,6±0,1

Таким образом, «Фукоидан», полученный по разработанной технологии, включен в технологическую схему комплексной переработки бурых водорослей

(рис. 12, 13), где в одном технологическом цикле получают продукты, обладающие лечебно-профилактическими свойствами: йодсодержащие добавки, фукоидан, аль-гинатсодержащие продукты. Новизна технологии подтверждена Патентом РФ № 2233104.

Расчет себестоимости фукоидана произведен в ценах 2006 г. для линии по производству альгинатов или «Ламиналя» производительностью 10 кг воздушно-сухой водоросли в сутки, без учета стоимости водорослей. Целесообразность внедрения линии по получению фукоидана подтверждается расчетом себестоимости готового продукта - 4 тыс. руб за кг, при этом общая стоимость производимой продукции составит 2 млн руб в год, с учетом прибыли в 33 %, а срок окупаемости капитальных затрат - 1 мес.

Отгонка спирта

Отстаивание и разделение

Йодсодержащие комплексы

Сушеные бурые водоросли

Измельчение

Водно-спиртовый

экстракт *

Водно-спиртовая экстракция

Фильтрование

Водорослевый

остаток + ~

Кислотное экстрагирование

экстракт

Нейтрализация

«Фукоидан»

Фильтрование Водорослевый остаток

Промывка

Щелочная

экстракция +

Альгинатсодер-жащие БАДы

Рис. 12. Технологическая схема комплексной переработки бурых водорослей

водорослевые потери; 4,4

отходы;25,1 1 V - минерал ьт,« р„с. 13. ВЫХОД бнОЛОГИЧе-

комплекс; 30,3

" ски активных веществ (%) при

ЧИЙЙ^; I комплексной переработке водо-

рослей

алыинагг ^ "" липидный

ватрия, 21,4 1 'фукоидан; комплекс;

17^ 1.5

ВЫВОДЫ

1. Научно обоснована технология фукоидана из бурых водорослей как составная часть комплексной переработки водорослей, которая позволяет в одном технологическом цикле получать фукоидан, йод- и альгинатсодержащие добавки.

2. Проведен скрининг фукоидана в 26 видах бурых водорослей дальневосточных морей. Показано, что его содержание в ламинариевых водорослях варьирует от 0,6 до 6,5 %, в фукусовых - от 1,5 до 7,9 %. Высоким содержанием фукоидана из порядка ламинариевых отличаются U. pinnatifida, L. japónica, L. bongardiana; из порядка фукусовых - 5. fulvellum, F. evanescens, С. crassipes, а также представитель порядка хордариевых - С. fíagelliformis.

3. Установлена зависимость количества фукоидана в водорослях от места их произрастания, возраста и части слоевища. Показано, что его содержание увеличивается с ростом температуры поверхностных вод в месте произрастания водоросли. Максимальное количество фукоидана накапливается на второй год развития водоросли в верхней части слоевища.

4. Установлена зависимость выхода фукоидана и его химического состава от концентрации кислоты, гидромодуля, температуры и продолжительности экстракции. В качестве рационального обоснован режим: спиртовая обработка водорослей, двукратное экстрагирование 1 %-ной НС1, ГМ 1 : 5 при температуре 20+5 °С.

5. Показано влияние условий экстракции на количество моносахаридов и сульфатных групп фукоидана. Количество фукозы варьирует от 2,2 до 17,7 %, ксилозы -от 0,3 до 7,0 %, галактозы и маннозы - от 0,4 до 5,5 %. Доказано, что при использовании рационального режима экстракции изменений в структуре полисахарида, по сравнению с таковым у исходной водоросли, не происходит, а содержание фукозы достигает 72,2-91,0 % от суммы всех моносахаридов. Установлено, что натре-

вание экстракта в кислой среде приводит к отщеплению сульфатных групп, в то время как использование рационального режима способствует их сохранению.

6. Разработанная технология позволяет получать фукоидан не только из ламинариевых, но и из фукусовых водорослей. Полисахариды из фукусовых водорослей имеют иной качественный и количественный состав по сравнению с таковым из ламинарии японской. Из С. crassipes и F. evanescens может быть получен фукоидан с преобладающим содержанием фукозы в полисахариде, из саргассовых водорослей S. fulvellum и S. miyabei — полисахариды, состоящие из фукозы и ксилозы в отношении 1,0 :1,1.

7. Разработанная технология позволяет в одном технологическом цикле получать фукоидан, йод- и альгинатсодержащие биологически активные продукты. Установлено, что по вязкости водных растворов и относительной молекулярной массе альгинат, полученный из водорослевых остатков после экстракции фукоида-на, не уступает альгинату, выделенному по традиционной схеме. Комплексная технология защищена Патентом РФ, ее эффективность подтверждается экономическими расчетами.

8. Установлено, что препарат «Фукоидан» представляет собой смесь гетерогенных макромолекул с различным содержанием фукозы и сульфатных групп, молекулярной массой 2000 и 10-100 кДа. Показана возможность получения фукан-сульфата, преимущественно состоящего из остатков фукозы и серной кислоты, а также фукоиданов с заданной степенью сульфатирования с помощью ионно-обменной хроматографии.

9. Установлено, что препарат «Фукоидан» обладает высокой антибактериальной активностью по отношению к S. aureus, снижает содержание в крови холестерина, триглицеридов при гиперлипидемии, а также продуктов пероксидации ли-пидов. По результатам медико-биологических исследований «Фукоидан» рекомендован к использованию в качестве биологически активной добавки к пище.

Основное содержание диссертации опубликовано в работах:

Материалы конференций

1. Гурулева О.Н., Вишневская Т.И., Суховерхов С.В. Исследование йодсодержащего экстракта из Laminaria japónica Aresh. // Материалы Всерос. Интернет-конф. мол. ученых «21-й век - перспективы развития рыбохоз. науки». - Владивосток: ТШ1РО-Центр, 2002. — С. 136-142.

2. Гурулева Q.H., Медведева К.С. Исследование распределения L-фукозы по слоевищу бурой водоросли Laminaria hongardiana // Материалы 2-й Всерос. интернет-конф. мол.

ученых «Актуальные проблемы изучения и использования водных биоресурсов». - Владивосток: ТИНРО-Центр, 2004. - С. 192-196.

3. Гурулева О.Н., Галкина А.Н., Вишневская Т.И. Перспективы использования бурых водорослей Японского моря // Материалы первой Междунар. науч.-практ. конф. мол. ученых «Комплексные исследования биологических ресурсов южных морей и рек». - Астрахань, 2004. - С. 61-63.

4. Aminina N.M., Yoon H.D., Novgorodccva Т.Р., Talabaeva S.V., Curuleva O.N., Vish-nevskaya T.I. Hypolipemic activity of brown seaweeds polymer and extracts // 18th International seaweed symposium. - Norway, 2004. - P. 47.

5. Yoon H.D., Park H.Y., Aminina N.M., Curuleva O.N. Hypocholesterolemic effects of polysaccharides of brown algae in rato// 18th International seaweed symposium.-Norway, 2004.-P. 50.

6. Гурулева O.H., Медведева K.C., Аминина H.M. Распределение фукоидана по слоевищу Laminaria bongardiana Р. et. R в зависимости от возраста водоросли и места сбора // Материалы 2-й Междунар. науч.-практ. конф. «Морские прибрежные экосистемы: водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки». - Архангельск, 2005. — С. 287-291.

7. Гурулева О.Н., Вишневская Т.Н., Аминина Н.М. Комплексная технология получения БАД из бурых водорослей // Материалы 2-й Междунар. научно-практ. конф. «Актуальные проблемы технологии живых систем». - Владивосток, 2005. - С. 99-106.

8. Гурулева О.Н., Аминина II.M. Определение фукоидана в бурых водорослях Дальнего Востока // Материалы 4-й Всерос. науч.-практ. конф. «Химия и технолога» растительных веществ». - Сыктывкар, 2006. - С. 58-59.

9. Гурулева О.Н., Амишша Н.М. Сравнительная характеристика фукоиданов из фукусовых и ламинариевых водорослей Дальнего Востока // Материалы 4-й Всерос. науч.-практ. конф. «Химия и технология растительных веществ». — Сыктывкар, 2006. — С. 56-57.

10. Аминина Н.М., Новгородцева Т.П., Гурулева O.II. и др. Биологическая активность бурых водорослей дальневосточного побережья // Материалы 4-й Вссрос. науч.-практ. конф. «Химия и технология растительных веществ». — Сыктывкар, 2006. - С. 223-224.

11. Гурулева О.Н., Галкина А.Н., Вишневская Т.И., Аминина НЛ1. Сравнительная оценка бурых водорослей порядков Laminariales и Fucales дальневосточного побережья // Материалы регион, науч.-практ. конф. «Проблемы бизнеса и технологий в Дальневосточном регионе». — Находка, 2006. - С. 21-23.

12. Гурулева О.Н., Вишневская Т.И., Аминина Н.М., Подкорытова А.В. Комплексная технология йодсодержащих и полисахаридных продуктов из бурых водорослей ДВ морей // Материалы 4-й Междунар. науч. конф. «Инновации в науке и образовании - 2006». — Калининград, 2006. - Т. 1. - С. 343-346.

Статьи

1. Вишневская Т.Н., Аминина Н.М., Гурулева O.II. Разработка технологии йодсодержащих продуктов из Laminaria japónica // Изв. ТИНРО. - 2001. - Т. 129. - С. 163-170.

2. Гурулева О.Н., Аминина Н.М., Вишневская Т.И. Способ получения фукоидана из бурой водоросли Laminaria japónica Aresch. // Изв. ТИНРО. - 2005. — Т. 143. - С. 327-331.

3. Гурулева O.II., Аминина Н.М., Парк Х.Й. Сравнительная характеристика бурых водорослей SargassumjidveUum и Sargassum miyabei // Изв. ТИНРО. - 2006. - Т. 147. — С. 265-269. Патенты

Патент РФ № 2233104 Способ комплексной переработки бурых водорослей с получением йодсодержащих и полисахаридных продуктов / Аминина Н.М., Вишневская Т.И., Гурулева О.Н., Подкорытова А.В. Опубл. 27.07.04.

Подписано в печать 30.10.2006 г. Формат 60x90/16. Уч.-изд.л. 1. Тираж 100. Заказ Ж 22. Типография ТИНРО-Центра

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Бурые водоросли: распределение, запасы

1.2 Химический состав, структура и содержание фукоидана в ^ ^ водорослях

1.3 Физико-химические свойства и биологическая активность фукоидана

1.4 Методы выделения и очистки фукоидана

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Методический подход к организации исследований

2.2 Объекты исследований

2.3 Методы исследований

2.3.1 Методы выделения фукоидана

2.3.2 Фракционирование фукоидана методом ионообменной ^ хроматографии

2.3.3 Определение молекулярной массы фукоидана

2.2.4 Спектрофотометрическое определение фукозы

2.2.5 Определение моносахаридного состава фукоидана

2.2.6 Определение содержания сульфатных групп в фукоидане

2.2.7 Расчет процента извлечения фукоидана из водорослей

2.2.8 Определение антибактериальной активности фукоидана

2.2.9 Определение липидкорригирующей активности фукоидана

2.3.10 Определение антиоксидантной активности фукоидана

2.2.11 Другие методы анализа

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 49 3.1. Исследование химического состава бурых водорослей

3.1.1 Исследование содержания фукоидана в бурых водорослях

3.1.2 Исследование содержания фукоидана в бурых водорослях в зависимости от места произрастания

3.1.3 Исследование распределения фукоидана по слоевищу в ^ зависимости от возраста водоросли и места сбора

3.1.4 Исследование моносахаридного состава промысловых и ^ потенциально промысловых бурых водорослей

3.2 Разработка технологии фукоидана

3.2.1 Разработка технологии фукоидана из ламинарии японской

Влияние предобработки водорослей на извлечение фукоидана

Влияние экстрагента на извлечение фукоидана 67 Влияние концентрации кислоты и продолжительности ^ экстрагирования на извлечение фукоидана

Влияние температуры и кратности экстрагирования на ^ извлечение фукоидана

Влияние реагента при нейтрализации на извлечение фукоидана

3.2.1.1 Влияние условий экстрагирования на моносахаридный ^ состав фукоидана

3.2.1.2 Сравнительный анализ фукоиданов, выделенных разными методами

3.2.1.3 Исследование фракционного состава фукоидана gi

Исследование фракционного состава фукоидана методом ионно- g ^ обменной хроматографии

Исследование молекулярно-массового распределения фукоидана

3.2.2 Получение фукоидана из фукусовых водорослей

3.2.3 Технологические режимы получения «Фукоидана» из бурых ^ водорослей

3.3 Обоснование комплексной технологии переработки бурых ^ водорослей

3.4 Технико-экономические показатели промышленного производства ^ «Фукоидана»

3.5Оценка биологической активности «Фукоидана»

3.5.1 Антибактериальная активность

3.5.2 Липидкорригирующая и антиоксидантная активность

3.5.3 Гепатопротекторная и иммуномодулирующая активность 107 ВЫВОДЫ 110 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 112 ПРИЛОЖЕНИЯ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AJIT - аланин-аминотрансфераза

ACT - аспартат-аминотрансфераза

БАВ - биологически активные вещества

БАД - биологически активная добавка

ВЭЭХ - высокоэффективная эксклюзионная хроматография

ГЖХ - газожидкостная хроматография

ГПЛ - гидроперекиси липидов

ДК - диеновые коньюгаты

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

ЛПВП - липопротеиды высокой плотности

ЛПНП - липопротеиды низкой плотности

ЛПОНП - липопротеиды очень низкой плотности кДа - кило Дальтоны

МДА - малоновый диальдигид

OJI - общие липиды

СЖК - свободные жирные кислоты

ТГ - триглицериды

ХС - холестерин

ЭЖК - эсенциальные жирные кислоты

ЭХС - эфиры холестерина

Fuc - фукоза

Gal - галактоза

Glu - глюкоза

Man - манноза

S042" - сульфатные группы

Ху1 - ксилоза

Актуальность темы.

В настоящее время на основании исследований отдельных групп населения выявлены ранее мало известные факторы питания, способствующие улучшению здоровья населения и снижению риска многих заболеваний. Было определено, что биологически активные добавки к пище, как дополнительные источники макро- и микронутриентов, приобретают все большую значимость (Корзун, 2002; Пилат и др., 2002; Абрамова, 2002; Корзун 2003; 2005). Среди большого разнообразия этой продукции, присутствующей на российском рынке, в последнее время постоянно увеличивается ассортимент БАД, содержащих бурые морские водоросли, которые богаты самыми разнообразными биологически активными веществами (Гаппаров и др., 2002; Тутельян, 2003; Шендеров, 2003; Зилова, 2005).

Полисахариды водорослей - одни из наиболее популярных биологически активных веществ, обладающих многофункциональностью воздействия на организм человека. Механизм их действия недостаточно изучен, но все они в большей или меньшей степени влияют на обмен липидов, глюкозы, минеральных элементов, обладают антиоксидантной активностью, иммуномодулирующем эффектом.

В настоящее время внимание ученых привлекли сульфатированные гетерополисахариды бурых водорослей - фукоиданы. При участии в молекулярном межклеточном взаимодействии они могут являться блокаторами широкого диапазона биологических процессов. Фукоиданы обладают противоопухолевым, противовирусным, антикоагулянтным, противовоспалительным, контрацептивным и иммуномодулирующем действием, а также антипролиферативным эффектом. Следовательно, производство лечебно-профилактических продуктов, содержащих фукоидан, может значительно расширить арсенал немедикаментозных средств профилактики многих заболеваний.

Фукоидан находит широкое применение в пище, напитках, приправах, косметике и медикаментах, за счет его биологической активности (Пат. ЕР 1327448; Запорожец и др, 1991; Пат. JP 2002265370). Так, было разработано антибактериальное ранозаживляющее средство «Фумагол», где в качестве активного агента был использован фукоидан из бурой водоросли Fucus vesiculosus (Пат. РФ 2003110694). Полисахарид из Laminaria saccharina также используют в качестве противовоспалительного и иммуномодулирующего агента в линии Balance испанской профессиональной косметики Belnatur (производитель — компания BCN Cosmetics). Одним из компонентов антицеллюлитного крема «Сплат» и средства для полости рта «Морская звезда» также является фукоидан

В настоящее время только фирма "Sigma" производит фукоидан. как. реактив из бурой водоросли Fucus vesiculosus. Фукоидан является одним из компонентов некоторых БАД (биологически-активных добавок), таких как «Суполан», «Маринид», «Ламиналь», «Ламэкс», а также БАД «Фукусовый», которые являются полисахаридными комплексами. Однако производство фукоидана как отдельного компонента, выделенного из водорослей, в виде БАД в России отсутствует.

В Дальневосточных морях сосредоточены огромные запасы бурых водорослей, представленные не одним десятком видов. В литературе встречаются противоречивые данные по химическому составу и содержанию фукоидана в водорослях (Усов и др., 1985; Zvyagintseva et.al., 1999; Усов и др., 2001; Шевченко и др., 2005). Поэтому выбор сырья для получения этого полисахарида возможен только на основании исследований и систематизации данных по его количеству.

При существующих в России технологиях переработки водорослей основная часть фукоидана, хорошо растворимого в воде и разбавленных кислотах, экстрагируется и теряется в процессе первичной обработки. В связи с этим актуальной является разработка технологии фукоидана из водорослей при их комплексной переработке, что позволяет сочетать его производство с получением альгинатсодержащих и йодсодержащих продуктов.

Цели и задачи исследования

Целью работы является исследование содержания и состава фукоидана в бурых водорослях ДВ морей и разработка технологии его получения как составной части комплексной переработки водорослей.

В соответствии с поставленной целью определены следующие задачи: провести исследования содержания и состава фукоидана бурых водорослей дальневосточных морей и обосновать выбор сырья для получения полисахарида; обосновать выбор экстрагента и условия извлечения фукоидана из бурых водорослей; обосновать технологию получения фукоидана из бурых водорослей; показать возможность получения фукоидана в одном технологическом цикле при получении альгинатсодержащих и других продуктов; провести исследования моносахаридного и фракционного состава фукоидана, определить его молекулярную массу; оценить биологическую активность полученного «Фукоидана».

Научная новизна работы.

Впервые систематизированы данные по содержанию фукоидана в 26 видах бурых водорослей из разных районов дальневосточных морей, причем 6 видов водорослей исследованы впервые. Показано, что более 10 видов бурых водорослей ДВ морей могут быть использованы в качестве сырья для получения фукоидана.

Исследована зависимость количества фукоидана в водорослях от места их произрастания, возраста и части слоевища. Установлено, что максимальное количество фукоидана накапливается на второй год развития водоросли в верхней части слоевища. Показано, что его содержание увеличивается с ростом температуры поверхностных вод в месте произрастания водоросли.

Впервые из бурых водорослей Cystoseira crassipes (Turn.) Ag. и Sargassum miyabe Yendo выделены фукоиданы и определен их химический состав.

Установлено влияние технологических параметров на моносахаридный состав и степень сульфатирования фукоидана в процессе экстрагирования.

Обоснованы рациональные параметры кислотного экстрагирования, обеспечивающего максимальное извлечение высокомолекулярного фукоидана из ламинарии японской, обладающего разнообразной биологической активностью.

Научно обоснована возможность получения фукоидана при комплексной переработке водорослей, предусматривающей производство и других биологически активных добавок к пище.

Предложены новые показатели, характеризующие процесс экстрагирования фукоидана, - степень извлечения и эффективность экстрагирования.

Практическая значимость работы.

Усовершенствована технологическая схема переработки бурых водорослей, включающая получение в одном технологическом цикле фукоидана, а также йод- и альгинатсодержащих БАД. Данная технология позволяет повысить рентабельность производства, а также расширить перечень продуктов, обладающих биологической активностью, за счет выделения фукоидана из кислотных экстрактов, являющихся отходами производства. Состав БАДов и их технология защищена Патентом РФ № 2233104 «Способ комплексной переработки бурых водорослей с получением йодсодержащих и полисахаридных продуктов».

По результатам медико-биологических испытаний фукоидан рекомендован к использованию в качестве биологически активной добавки к пище.

Разработаны нормативные документы: ТУ 9284-305-00472012-06 -«Фукоидан. Биологически активная добавка к пище»; ТИ № 36-305-06 по изготовлению биологически активной добавки к пище «Фукоидан».

Реализация результатов исследования.

На экспериментальном технологическом производстве ФГУП «ТИНРО-Центра» выпущены опытные партии БАД «Фукоидан» и установлена экономическая эффективность производства.

Апробация работы:

Материалы диссертации представлялись на Всероссийской конференции молодых ученых, посвященной 140-летию со дня рождения Н.М. Книповича (Мурманск, 2002 г.); Международной научно-практической конференции «Современные проблемы торговли, расширение ассортимента и контроля качества потребительских товаров и продуктов общественного питания» (Санкт-Петербург, 2002 г.); Всероссийской конференции молодых ученых ТИНРО-Центра «Комплексные исследования и переработка морских и пресноводных гидробионтов» (Владивосток, 2003 г.); Международной конференции «Рациональное природопользование и управление морскими биоресурсами: экосистемный подход» (Владивосток, 2003 г.); XVIIIth International seaweed symposium (Norway, 2004 г.); IX Дальневосточной конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, 2005 г.); The Fourth Asia Pacific Phycological Forum (Bangkok, 2005 г.).

Публикации.

Основное содержание диссертационной работы изложено в 16 публикациях, в том числе 3 статьях, 12 материалах конференций, патенте.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения и 3 глав, включает 25 таблиц и 28 рисунков, изложена на 142 стр. Содержит 5 приложений, в которых приведены нормативная документация, патент, акты о выпуске опытных партий. Список литературы состоит из 204 источников (в том числе 121 иностранных).

110 вывода

1. Научно обоснована технология фукоидана из бурых водорослей, как составная часть комплексной переработки водорослей, которая позволяет в одном технологическом цикле получать фукоидан, йодсодержащие и альгинагсодержащие добавки.

2. Проведен скрининг фукоидана в 26 видах бурых водорослей ДВ морей. Показано, что его содержание в ламинариевых водорослях варьирует от 0,6 до 6,5 %, в фукусовых от 1,5 до 7,9 %. Высоким содержанием фукоидана из порядка ламинариевых отличаются - U. pinnatifida, L. japonica, L. bongardiana; из порядка фукусовых - S. fulvellum, F. evanescens, С. crassipes.

3. Установлена зависимость количества фукоидана в водорослях от места их произрастания, возраста и части слоевища. Показано, что его содержание увеличивается с ростом температуры поверхностных вод в месте произрастания водоросли. Максимальное количество фукоидана накапливается на второй год развития водоросли в верхней части слоевища.

4. Установлена зависимость выхода фукоидана и его химического состава от концентрации кислоты, гидромодуля, температуры и продолжительности экстракции. В качестве рационального обоснован режим: спиртовая обработка водорослей, двукратное экстрагирование 1 % НС1, ЖК 1:5 при температуре, , 20±5 °С.

5. Показано влияние условий экстракции на количество моносахаридов и сульфатных групп фукоидана. Количество фукозы варьирует от 2,2 до 17,7 %, ксилозы - от 0,3 до 7 %, галактозы и маннозы от 0,4 до 5,5 %. Доказано, что при использовании рационального режима экстракции изменений в структуре полисахарида, по сравнению с таковым у исходной водоросли, не происходит, а содержание фукозы достигает 72,2-91 % от суммы всех моносахаридов. Установлено, что нагревание экстракта в кислой среде приводит к отщеплению сульфатных групп, в то время как использование рационального режима способствует их сохранению.

6. Разработанная технология позволяет получать фукоидан не только из ламинариевых, но и из фукусовых водорослей. Полисахариды из фукусовых водорослей имеют иной качественный и количественный состав, по сравнению с таковым из ламинарии японской. Из С. crassipes и F. evanescens может быть получен фукоидан с преобладающем содержанием фукозы в полисахариде, из саргассовых водорослей S. fulvellum и S. miyabei - полисахариды, состоящие из фукозы и ксилозы в отношении 1:1,1.

7. Разработанная технология позволяет в одном технологическом цикле получать фукоидан, йодсодержащие и альгинатсодержащие биологически-активных продукты. Установлено, что по вязкости водных растворов и относительной молекулярной массе альгинат, полученный из водорослевых остатков после экстракции фукоидана, не уступает альгинату, выделенному по традиционной схеме. Комплексная технология защищена Патентом РФ, ее эффективность подтверждается экономическими расчетами.

8. Установлено, что «Фукоидан» представляет собой смесь гетерогенных макромолекул с различным содержанием фукозы и сульфатных групп, молекулярной массой 2000 кДа и 10-100 кДа. Показана возможность получения фукансульфата, преимущественно состоящего из остатков фукозы и серной кислоты, а также фукоиданов с заданной степенью сульфатирования с помощью ионно-обменной хроматографии.

9. Установлено, что «Фукоидан» обладает высокой антибактериальной активностью по отношению к S. aureus, снижает содержание в крови холестерина, триглицеридов при гиперлипидемии, а также продуктов пероксидации липидов. По результатам медико-биологических исследований «Фукоидан» рекомендован к использованию в качестве биологически активной добавки к пище.

1. Абрамова Л.С. Комплексное использование нерыбных объектов промысла// Мат. Первой Международн. научно-практ. конфер. «Морские прибрежные экосистемы: водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки». Москва-Голицино. - 2002. - С. 29-33.

2. Аминина Н.М., Клочкова Н.Г. Перспективы развития водорослевого производства на побережье Камчатки и северных Курил// Мат. Междунар. науч.-практ. конф. «Прибрежное рыболовство 21 век». - Южно-Сахалинск. -2001.-С. 151-152.

3. Андреева Л.И., Кожемякин Л.А., Кишкун А.А. Модификация метода определения перекисей липидов в тесте с тиобарбитуровой кислотой// Лаб. дело. 1988.-№11.- С. 41-43.

4. Балконская Л.А. Потенциальные районы промысла ламинарии японской {Laminaria japonica) у южного Сахалина // Мат. Междунар. науч.-практ. конф. «Прибрежное рыболовство 21 век». - Южно-Сахалинск, -2001.-С. 6-7.

5. Барашков Г.К. Сравнительная биохимия водорослей. М.: - Изд-во «Пищ. Промышленность». - 1972. - С. 96-97.

6. Березовская И.В. Классификация химических веществ по параметрам острой токсичности при парентеральных способах введения// Хим.-фармацевтический журнал. 2003. - Т. 37. - № 3. - С. 32-34.

7. Болдырев В.З., Солодовников С.А. Состояние сырьевой базы объектов прибрежного рыболовства дальневосточного бассейна России// Мат. Междунар. науч.-практ. конф. «Прибрежное рыболовство -21 век». — Южно-Сахалинск.-2001.-С. 10-11.

8. Буршнейн А.И. Методы исследования пищевых продуктов. Киев, 1963,- 643 с.

9. Вишневская Т.Н., Аминина Н.М., Гурулева О.Н. Разработка технологии йодсодержащих продуктов из Laminaria japonicall Изв. ТИНРО.2001.-С. 163-170.

10. Грачев Ю.П. Математические методы планирования экспериментов. -М.: Пищ. пром-ть. 1979. - 197 с.

11. Гусарова И.С., Суховеева М.В., Моргутова И.А. Аннотированный список водорослей-макрофитов северного Приморья// Изв. ТИНРО. 2000. -Т. 127.-С. 626-641.

12. Дарбре А. Аналитические методы. В кн.: Практическая химия белка. Пер с англ./ Под ред. Дарбре. - М.: Мир. - 1989. - С. 243-333.

13. Денисова Е.В., Артяева И.В. К проблеме условий экстрагирования высокомолекулярных полисахаридов// Мат. Краевой научно-практ. конфер. студентов, молодых ученых и специалистов «Молодежь и наука III тысячелетия». 2001. - С. 143-144.

14. Евсеева Н.В. Ресурсы промысловых водорослей Южных Курил// Мат. Междунар. науч.-практ. конф. «Прибрежное рыболовство 21 век». - Южно-Сахалинск.-2001. - С. 37-38.

15. Езепчук Ю.В. Патогенность как функция биомолекул. -М.: Медицина. 1985.-240 с.

16. Запорожец Т.С., Лоенко Ю.Н., Беседнова Н.Н., Артюков А.А.

17. Заявка на Пат. РФ 2003123744 А Способ комплексной переработки бурых водорослей с получение препаратов для медицины и косметологии/ Шевченко Н.М, Имбс Т.И, Урванцева А.М, Кусайкин М.И, Корниенко В.Г, Звягинцева Т.Н., Елякова Л.А./ Бюл. № 3,27.01.05

18. Кейтс М. Техника липидологии. М.: Мир. - 1975. - 322с.

19. Кенуй М.Г. Быстрые статистические вычисления. Упрощенные методы оценивания и проверки. Справочник. -М.: Статистика. 1979. - 70 с.

20. Кизеветтер И.В., Суховеева М.В., Шмелькова Л.П. Промысловые морские водоросли и травы дальневосточных морей. М.: Лег. и пищ. пром-сть. - 1981. - 113 с.

21. Клочкова Н.Г., Березовская В.А. Водоросли камчатского шельфа. Распространение, биология, химический состав. Владивосток; П-Камчатский: Даль-наука. - 1997. - 155 с.

22. Клочкова Н.Г., Королева Т.Н. Видовой состав морских водорослей-макрофитов острова Парамушир (Северные Курилы)// Альгология. 2003. -Т. 13. -№ 1. - С. 83-94.

23. Ковалева Е.А., Вишневская Т.Н., Подкорытова А.В. Разработка технологии вкусовой быстрорастворимой приправы из Laminaria japonica// Известия ТИНРО. 1999. - Т. 125. - С. 462-467.

24. Корзун В.Н., Чумак А.А. Пути предупреждения щитовидной железы у лиц, подверженных действию радиации и проживающих на территориях, эндемичных по зобу// Международн. журнал рациональной медицины. -2003.-№ 5.-С. 180-187.

25. Королева Т.Н. Развитие бурой водоросли L. bongardiana P.et.R. в прикамчатских водах: Автореф. дис. канд. биол. наук: 03.00.32/ КамчатНИРО. П-Камчатский. - 2004. - 28 с.

26. Королева Т.Н., Вялых А.Э. Алярия: перспективные для промышленного использования камчатские ламинариевые водоросли// Рыбное хозяйство. 2002. - № 6. - С. 45-47.

27. Кочетков Н.Г., Бочков А.Ф., Дмитриев Б.А., Усов А.И., Чижов О.С., Шибаев В.Н. Химия углеводов. -М.: Химия. 1967. - С. 477-490.

28. Некрасова В.Б., Полянская Е.Т. Экстракт «Ламинария»// Пищ. и перераб. Промышленность. 1987. - № 9. - С. 35-36.

29. Облучинская Е.Д. Технологии лекарственных и лечебно-профилактических средств из бурых водорослей. -Апатиты: Изд. Кольского научного центра РАН. 2005. - 164 с.

30. Облучинская Е.Д., Афиногенова А.Г. Изучение сорбционной активности биомассы бурых водорослей Баренцева моря// Материалы XX юбилейной конференции молодых ученых. 2002. - С. 117-123.

31. Пат. РФ 2019186 С1 Способ ингибиции ВИЧ-инфекции/ Быковский А.Ф, Миллер Г.Г, Подкидышева JI.H, Титова И.В. и др./ Опубл. 15.09.94

32. Пат. РФ 2028153 С1 Способ получения биологически активных веществ из ламинарии/ Макарова Р.Н, Самокиш И.И, Компанцев В.А, Кайшева Н.Ш, Василенко Ю.К, Мащенко Н.П. и др./ БИ. 1995. № 4.

33. Пат. РФ 2247574 С2 Средство, обладающее антикоагулянтным и иммунотропным действием/ Шевченко Н.М, Звягинцева Т.Н., Исаков В.В, Кузнецова Т.А. и др./ БИ. 2005. № 7.

34. Пат. ЕР 1327448 Homeostasis-maintaining agents/ Takeshi S, Fumitsugu H, Ikunoshin K, Etsuko M, Eiji N, Haruo O, Hiroaki S./ Опубл. 16.07.03

35. Пат. JP 2002265370 New fucoidan derived from sea mustard sporophyll and immunostimulator/ Suetsuna Kunio/ Опубл. 18.09.02

36. Пат. WO 115654 A2 Применение сульфатов полисахарида для терапии тромбозов кровеносных сосудов/ Colliec-Jouault S, Durand Р, Fischer А-М, Jozefonvicz J., Letourneur D, Millet J./ Опубл. 08.03.01

37. Пилат Т.Л., Иванов A.A. Биологически активные добавки к пище (теория, производство, применение). -М.: Авваллон. 2002, - 710 с.

38. Подкорытова А.В. Влияние предварительной обработки морской капусты на выход и качество альгината// Рыбное хозяйство. 1985. - № 1. -С. 73-75.

39. Подкорытова А.В. Зависимость эффективности экстрагирования альгината натрия из ламинарии японской от условий обработки// Рыбное хозяйство. 1987. - № 2. - С. 64-67.

40. Подкорытова А.В., Аминина Н.М. Сезонная динамика химического состава Laminaria japonica, культивируемой у берегов Приморья// Растительные ресурсы. 1992. - Т. 28. - вып. 3., - С. 137-140.

41. Подкорытова А.В., Шмелькова Л.П. Пищевая и техническая ценность морской капусты // Изв. ТИНРО. 1983. - Т. 108. - С. 111-116.

42. Прогноз общих допустимых уловов по Тихоокеанскому бассейну на 2005 г (Краткая версия). Владивосток: ФГУП ТИНРО-Центр. - 2005. - 267 с.

43. Промысловые и перспективные для использования водоросли и беспозвоночные Баренцева и Белого морей. Апатиты: Изд-во КНЦ РАН. -1998.-С. 306-307.

44. Репина О.И. Фукоиды белого моря: химический состав и перспективы использования// Мат. II Международ, научно-практ. конфер. «Морские прибрежные экосистемы: водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки». Архангельск. - 2005 а. - С. 219-223.

45. Репина О.И. Обоснование и разработка технологии биологически активных веществ из фукусовых водорослей Белого моря: Автореф. дис. кандидата технолог, наук: 05.18.04/ ВНИРО. Москва. - 2005 б. - 24 с.

46. Розкин М.Я., Левина М.Н., Каменева Н.С., Усов А.И., Ефимов B.C. Изучение механизма антиоксидантной активности фукоиданов// Фармокол. и токсикол. 1989. - Т. 52. -№ 3. - С. 48-51.

47. Рудаков О.Б., Полянский К.К. Современная жидкостная хроматография углеводов// Молочная промышленность. 1999. - № 4, - С. 25-27.

48. Семенов А.В., Мазуров А.В., Преображенская М.Е., Ушакова Н.А., Михайлов В.И., Берман А.Е., Усов А.И., Нифантьев Н.Э., Бовин В.Н.

49. Сульфатированные полисахариды как ингибиторы рецепторной активности Р-селектина и Р-селектинозависимого воспаления// Вопросы медицинской химии. 1998. - Т. 44. - Вып. 2. - С. 135-144.

50. Скорняков В.И., Кожемякин JI.A., Смирнов В.В., Полякова М.А., Чулкевич Г.Ф., Лобаева И.А. Продукты перекисного окисления липидов в спинномозговой жидкости у больных с черепно-мозговой травмой// Лабораторное дело. 1988. - № 8. - С. 14-16.

51. Состояние промысловых ресурсов. Прогноз общих допустимых уловов по тихоокеанскому бассейну (Краткая версия). Владивосток: ФГУП ТИНРО-Центр. - 2003. - 252 с.

52. Стыскин Е.Л., Ициксон Л.Б., Брауде Е.В. Практическая высокоэффективная хроматография. М.: Химия. - 1986. - 288 с.

53. Суховеева М.В Видовой состав и распределение макрофитов в районах размножения сельди у северо-западного побережья Охотского моря// Известия ТИНРО. 1976, - Т. 100. - С. 144-149.

54. Суховеева М.В., Подкорытова А.В. Промысловые водоросли и травы Дальневосточных морей: биология, распространение, запасы, технологии переработки. -Владивосток: ТИНРО-Центр. 2006. - 243 с.

55. Трофимова Т.Н., Козлов Г.Т. Камчатские ламинариевые водоросли, перспективные для промышленного использования. Род Алярия// Тез. докл. Международн. науч.-практ. конф. «Прибрежное рыболовство 21 век». -Южно-Сахалинск-2001.-С. 118-119.

56. Тутельян В.А. Концепция оптимального питания// Мат. VII Всероссийского конгресса «Здоровое питание населения Росии». Москва. -Т. 2. - С. 524-525.

57. Урбах В.М. Математическая статистика для медиков и биологов. М.: Медгиз. - 1962. - 75 с.

58. Усов А.И., Кирьянов А.В. Выделение фракций фукоидана из бурой водоросли L.cichorioides Miyabell Биоорганическая химия. 1994. - Т. 20. -№ 12.-С. 1342-1348.

59. Усов А.И., Кошелева Е.А., Яковлев А.И. Полисахаридный состав некоторых бурых водорослей Японского моря// Биоорганическая химия. -1985. Т. 11. - № 6. - С. 830-836.

60. Усов А.И., Смирнова Г.П., Билан М.И., Шашков А.С. Бурая водоросль Laminaria sacharina (L.) Lam. как источник фукоидана// Биоорганическая химия. 1998. - Т. 24. - № 6. - С. 437-445.

61. Усов А.И., Смирнова Г.П., Клочкова Н.Г. Полисахаридный состав некоторых бурых водорослей Камчатки// Биоорганическия химия. 2001. - Т. 27.-№6.-С. 444-448.

62. Усов А.И., Чижов А.О. Углеводный состав бурой водоросли Chorda fillum// Биоорганическая химия. 1989. - Т. 15. - № 2. - С. 208-216.

63. Шендеров Б.А. Современное состояние и перспективы развития концепции функционального питания в России// Мат. VII Всероссийского конгресса «Здоровое питание населения России». Москва. - Т. 2. - С. 547-575.

64. Шунтов В.П. Биология дальневосточных морей России. Том 1. -Владивосток: ТИНРО-Центр. -2001. С. 72-98.

65. Щипунов Ю.А., Муханева О.Г., Звягинцева Т.Н., Попивнич И.Б., Шевченко Н.М. Исследования реологических свойств водных растворов фукоиданов// Высокомолекулярные соединения. 2000. - Т. 42. - С. 93-101.

66. Abdel-Fattah A.F., Edrees М. Carbohydrates of the brown seaweed Padina pavonia// Phytochemistry. 1977. -V. 16. - P. 939-941

67. Abdel-Fattah A.F., Hussein M.M.-E. Studies on the isolation and some characteristics of the acid-extractable water sulphated heteropolysaccharide" material from Sargassum linifoliumll J. Biochem. 1975. - V. 8. - P. 36-40.

68. Abdel-Fattah A.F., Hussein M.M.-E., Salem H.M. Sargassan: a sulphted heteropolysaccaride from Sargassum linifoliumll Phytochemistry. 1973. - V. 12. -P. 1995-1998

69. Ahuja K.K. Fertilization studies in the Hamster: The role of cell-surface carbohydrates// Exp. Cell. Res. 1982. - V. 140. - P. 353-362.

70. Alves A-P., Mulloy В., Diniz A.J., Mourao P.A.S. Sulfated Polysaccharides from the egg jelly layer are species-specific inducers of acrosomal reaction in sperms of sea urchins// J. Biol. Chem. 1997. - V. 272. - P. 22113-22123.

71. Anggadiredja J., Andyani R., Hayati M. Antioxidant activity of Sargassum polycystum (Phaephyta) and Laurencia obtuse (Rhodophyta) from Seribu Islands// J. Apply. Phycol. 1997. - V. 9. - P. 477-479.

72. Anno K., Terahata H., Hayashi Y., Seno N. Isolation and purification of Fucoidan from brown seaweed Pelvetia wrightiill Agric. and Biol. Chem. 1966. -V. 30. -№ 5. - P. 495-500

73. Beress A., Wassermann O., Tahhan S. A new procedure for the isolation of anti-HIV compounds (polysaccharides and polyphenols) from the marine alga. Fucus vesiculosus!! J. Nat. Prod. 1996. - V. 59. - P. 478-488.

74. Bernardi G., Springer G.F. Properties of highly purified fucan// J. Biol. Chem. 1962. - V. 237. - P. 75-80.

75. Bilan M.I, Grachev A.A, Ustuzhanina N.E., Shashkov A.S, Nifantiev N.E, Usov A.I. Structure of a fucoidan from the brown seaweed Fucus evanescens C.Ag.ll Carbohydrate Research. 2002. - V. 337. - P. 719-730.

76. Bilan M.I, Grachev A.A, Ustuzhanina N.E., Shashkov A.S, Nifantiev N.E, Usov A.I. A highly regular fraction of a Fucoidan from the brown seaweed Fucus distichus L.H Carbohydrate Research. 2004. - V. 339. - P. 511-517.

77. Black W.A. P. The seasonal variation in the combined L-fucose content on the common British Laminariaceae and Fucaceae// J. Sci. Food Agric. 1954. - V. 5.-P. 445-451.

78. Black W.A.P, Devar E.T., Woodward F.N. Manufacture of algal chemicals. Laboratory-scale isolation of Fucoidan from brown marine algae // J. Sci. Food. Arg. 1952. -V. 3. - P. 122-130.

79. Bolwell G.P., Callow J.A., Callow M.W., Evans L.V. Fertilization in brown algae. II. Evidence for lectin-sensitive complementary receptors involved in gamete recognition in Fucus serratusll J. Cell Sci. 1979. - V. 36. - P. 19-30.

80. Callow M.E., Evans L.V. Localization of sulfated polysaccharides by X-ray microanalysis in Laminaria sacharina/I Planta. 1976. -V. 131. - P. 155-157

81. Carlberg G.E., Percival E.E., Rhaman M.A. Carbohydrates of the seaweed Desmarestia ligulata, Desmarestia firmall Phytochemistry. 1978. - V. 17.-P. 1289-1292.

82. Chargaff E., Bancroft F.W., Stanley-Brown M. Studies on the chemistry of blood coagulation. II. On the inhibition of blood clotting by substances of high molecular//J. Biol. Chem.- 1936.-V. 115.-P. 155.

83. Chevolot L., Colliec-Jouault S., Foucault A., Ratiskol J., Sinquin C. Preliminary report on fractionations of fucans by ion-exchange displacement centrifugal partition chromatography// J. Chromatogr. 1998. - V. 706. - P. 43-54.

84. Chevolot L., Foucault A., Chaubet F., Kervaree N., Sinquin C., Fisher A-M., Boisson-Vidal C. Further data on the structure of brown seaweed fucan: Relationships with anticoagulant activity// Carbohydr. Res. 1999. - V. 319. - P. 154-165.

85. Chevolot L., Mulloy В., Ratiskol J., Foucault A., Colliec-Jouault S. Adisaccharide repeat unit is the major structure in fucoidans from two species of brown algae // Carbohydr. Res. 2001. - V. 330. - P 529 - 535.

86. Chizhov A.O., Dell A., Morris H.R., Haslam S.M., McDowell R.A., Shashkov A.S., Nifant'ev N.E., Khatuntseva E.A., Usov A.I. A study of a fucoidan from the brown seaweed Chorda filum// Carbohydr. Res. 1999. - V. 320.-P. 108-119.

87. Church F.C., Meade J.B. Treanor R.E., Whinna H.C. Antitrombin activity of Fucoidan: the interaction of Fucoidan with heparin cofactor II , a Antitrombin Ш and trombin// J. Biol. Chem. -1989. V. 264. - № 6. - P. 3618-3623.

88. Cimino P., Bifulco G., CasapuIIo A., Bruno I., Gomez-Paloma L., Riccio R. Isolation and NMR characterization of rosacelose, a novel sulfated polysaccharide from the sponge Mixylla rosacea!I Carbohydrate Research. 2001. -V.334.-P. 39-47.

89. Colliec S., Boisson-Vidal C., Jozefonvicz J.A. Low molecular weight Fucoidan fraction from brown seaweed Pelvetia canaliculatall Phytochemistry.1994.-V. 35.-P. 697-700.

90. Conchie J., Percival E.G.V. Fucoidan. The hydrolysis of methylated fucoidin prepared from Fucus vesiculosus// J. Chem. Soc. 1950. - P. 826-832.

91. Dillon Т., Kristensen K., O'hEocha C. Seed mucilage of Ascophyllum nodosum// Proc. Roy. Irish Acad., Sect. B. 1953. - V. 55 B. - 189 p.

92. Dodgson K.S. Determination of inorganic sulphate in studies on the enzymic and non-enzymic hydrolysis of carbohydrate and other sulphate esters// Biochem. J.-1961.-V. 78.-P. 312-319.

93. Doner W. L., Whistler R.L. Fucoidan, in "Industrial Gums. Polysaccharides and their derivatives", Second edition/ Ed. R.L. Whistler, Academic Press, New York, San Francisco, London. 1973. - P. 115-121.

94. Duarte M.E.R., Cardoso M.A., Noseda M.D., Cerezo A.S. Structural studies on fucoidans from brown seaweed Sargassum stenophyllum// Carbohydrate Research. 2001. - V. 333. - P. 281-293.

95. Durig J., Bruhn Т., Zurborn K-H., Gutensohn K., Bruhn H. D., Beress L. Anticoagulant fucoidan fractions from Fucus vesiculosus induce platelet activation in vitro// Thromb. Res. 1997. - V. 85. - P. 479-490.

96. Ellouali M., Boisson -Vidal C., Jozefonvicz J. Antiproliferative effect and interaction of fucans with cells// Colloids Surf B: Biointerfaces. 1994. - V. 2. -P. 305-314.

97. Ferrao A.V., Mason R.M. The effect of heparin on cell proliferation and type-I collagen synthesis by adult human dermal fibroblasts// Biochem. Biophys. Acta. 1993. - V. 1180. - P. 225-230.

98. Finch P., Percival E.E., Slaiding I.R., Weigel H. Carbohydrates of the Antarctic brown seaweed Ascoseira mirabilisllPhytochemistry. -1986. V. 25. - P. 443.

99. Fujihara M., Iizima N., Yamomoto I., Nagumo T. Purification and chemical and physical characterization of an Antitumor polysaccharide from the brown seaweed Sargassum fulvellum!I Carbohydrate Research. 1984. - V. 125. -P. 97-106.

100. Fujii Т., Kuda Т., Saheki K., Okuzumi M. Fermentation of water soluble polysaccharides of brown algae by human intestinal bacteria in vitro// Nippon Suisan Gakkaishi. 1992. - V. 58.-№ 1,-P. 147-152.

101. Fujikawa Т., Anno Т., Wada M. Sulphated polysaccharide of the thallus of brown seaweed Undaria pinnatifidall Nippon Nogeikagaku Kaishi. 1975. - V. 44.-P. 667.

102. Grauffel V., Kloareg В., Mabeau S., Durand P., Jozevonvicz J. Newnatural polysaccharides with potent antithrombic activity: fucans from brown algae// Biomaterials. 1989. - V. 10. - P. 363-368.

103. Haroun-Bouhedjal F., EHouali M., Sinquin C., Boisson-Vidal C. Relationship between Sulfate Groups and Biological Activities of Fucans// Thrombosis Research. 2000. - V. 100. - P. 453-459.

104. Haug A. Composition and properties of alginates.- Norwegian Inst, of Seaweed Rept. 1964. - № 30. - 123 p.

105. Haug A., Jensen A. Seasonal variation in chemical composition of Laminaria digitata from different parts of the Norwegian coast// Proc. Int. Seaweed Symp. 1956. -V. 2.-P. 10-15.

106. Honya M., Kinoshita Т., Ishikawa M., Mori H., Nisizawa K. Monthly determination of alginate, M/G ratio, mannitol and minerals in cultivated Laminaria japonicall Bull. Jap. Soc. Sci. Fish. 1993. - V. 59. - P. 295-299.

107. Honya M., H. Mori., Anzai M., Araki Y., Nisizawa К. Monthly changes in the content of fucans, their constituent sugars and sulphate in cultured Laminaria japonica//Hydrobiologia. 1999.-V. 398/399.-P. 411-416.

108. Hou X., Yav X, Chai C. Iodine-dount biological macromolecules// J. of Radioanalitical and Nuclear Chemistry. 2000. - V. 245. - P. 461-167.

109. Kitamura K., Matsuo M., Yasui T. Fucoidan from brown seaweed Laminaria angustata var. longissima/l Agric. Biol. Chem. 1991. - V. 55. - № 5. . -P. 615-616.

110. Kuda Т., Yokoyama M., Fujii T. Fermentable dietary fiber in dried products of brown algae and their effects on fecal microflora and levels of plasma lipid in rats// Fish. Sci. 1998. - V. 64. - № 4. - P. 582-588.

111. Mabeau S., Kloareg В., Joseleau J.P. Fractionation and analysis of fucans from brown algae// Phytochemistry. 1990. - V. 29. - P. 2441-2445.

112. Mahony M.C., Clark G.F., Oehninger S., Acosta A.A., Hodgen G.D. Fucoidin binding activity and its localization on human soermatozoa// Contraception. 1993. - V. 48. - P. 277-289.

113. Main A.J., Percival E. Carbohydrates of the brown seaweeds Himanthalia lorea, Bifurcaria bifurcate and Padina pavona. Part I. Extraction and fractionation// Carbohydrate Research. 1973. - V.26. - P. 133-146.

114. Marais M.-F., Joseleau J.P. A Fucoidan fraction from Ascophyllum nodosum// Carbohydrate Research. 2001. - V. 336. - P.155-159.

115. Maruyama H., Nakajima J., Yamamoto I. A study on the anticoagulant and fibrinolytic activities of a crude fucoidan from the edible brown seaweed Laminaria religiosa// Kitasato Arch. Exp. Med. 1987. - V. 60. - P. 105-121.

116. Mauray S., Sternberg C., Theveniaux J., Millet J., Sfnquin C., Tapon-Bretaudiere J., Fischer F.M. Venous antithrombotic and anticoagulant activities of a Fucoidan fraction// Thromb. Haemostasis. 1995. - V. 74. - P. 1280-1285.

117. McCaffrey T. A., Falcone D. J., Borth W., Brayton C. F., Weksler B.B. Fucoidan is a non-anticoagulant inhibitor of intimal hyperplasia// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. - V. 184. - P. 773-781.

118. McLellan D.S., Jurd K.M. Anticoagulants from marine algae// Blood Coagul. Fibrinolysis. 1992. -V. 3. - P. 69-75.

119. McNeely W.H., Pettitt D.J. In "Industrial Gums"/ Eds. R.L, Whistler, BeMiller J.N. Academic Press, New York. 1973. - P. 49-81.

120. Medcalf D.G., Larsen B. Fucose-containing polysaccharides in the brown algae Ascophyllum nodosum and Fucus vesiculosusII Carbohydrate Research. -1977.-V. 59.-P. 531-357.

121. Mian A.J., Percival E. Carbohydrates of the brown seaweed Himanthalia.lorea, Bifurcaria bifurcate, Padina pavonia. Part I. Extraction and fractionation // Carbohydrate Research. 1973. - V. 26. - P. 133-146

122. Mori H., Nisizawa K. Sugar constituents of sulfated polysaccharides from the fronds of Sargassum riggoldianumll Bull. Jap. Soc. Scientific Fish. 1982. -V. 48.-P. 981-986.

123. Nagaoka M., Shibata H., Kimura-Takagi I., Hashimoto S., Kimura K., Makino Т., Aijama R., Ueyama S., Yokokura T. Structural study of fiicoidan from Cladosiphon okamuranus Tokida II Glycoconjugate J. -1999. V. 16. - P. 19-26.

124. Nagumo Т., Nishino T.S. Fucan sulfates and their anticoagulant activities/ Polysaccharides in Medicinal Applications/ Dumitriu (Ed), Marcel Dakker, New1. York.- 1996.-P. 545-574.

125. Nishide E. Extraction of fucose-containing polysaccharide from the brown alga Kjellmaniella crassifoliall Bull. Jap. Soc. Scientific Fish. 1981. - V. 47. - P. 1233.

126. Nishide E., Anzai H., Uchida N., Nishizawa K. Sugar constituents of fucose-containing polysaccharides from various Japanese brown algae// Hydrobiologia.- 1990.- V. 204/205.-P. 573-579.

127. Nishino Т., Aizu Y., Nagumo T. The relationship between the molecular weigh and the anticoagulant activity of tow types of fucan sulfates from the brown seaweed Ecklonia kurome II Agric. Biol. Chem. 1991c. - V. 55. - № 3. - P. 791-796.

128. Nishino T, Aizu Y, Nagumo T. The influence of sulfate content and molecular weight of a fucan sulfate from the brown seaweed Ecklonia kurome II Thromb. Res. 1991 d. - V. 64. - P. 723-731.

129. Nishino Т., Kiyohara H., Yamada H., Nagumo T. An anticoagulant Fucoidan from brown Ecklonia Kuromell Phytochemistry. 1991a. - V. 30. - P. 535-539.

130. Nishino Т., Nagumo T. Sugar constituents and blood-anticoagulant activities of fucose-containing sulfated polysaccharides in nine brown seaweed species//Nippon Nogeikagaku Kaishi. 1987. -V. 61. -№ 3. - P. 361-363.

131. Nishino Т., Nagumo Т., Kiyohara H., Yamada H. Structural characterization of new anticoagulant fucan sulfate from the brown seaweed Ecklonia kurome J I Carbohydrate Research. 1991b. - V. 211. - P. 77-90.

132. O'Colla P.S., Lewin R.A. "Physiology and biochemistry of algae". Academic Press, New York. 1962. - 120 p.

133. Oehninger S., Patankar M., Seppala M., Clark G.F. Involvement of selectin-like carbohydrate binding specificity in human gamete interaction// Anthologies. 1998. - V. 30. - N 4. - P. 269-274.

134. Painter T.J. Algal polysaccharides// The Polysaccharides V. 2/ Ed. Aspinall N.Y.: Acad. Press. 1983.-P. 195-285.

135. Park H.Y., Yoon H.D., Oh E.G. Effects of Fucoidan from weed Sargassum fulvellum on lipid concentration of serum and liver in rats fed high fat diet// BulletinofNFRDI.-2002.-V. 61.-P. 117-124.

136. Patankar M.S., Oehninger S., Barnett Т., Williams R.L., Clark G.F. A revised structure for Fucoidan may explain some of its biological activities// J. Biol. Chem. 1993. - V. 268. - P. 21770-21776.

137. Percival E. Glucuronoxylofucan, a cell-wall component of Ascophyllum nodosum!I Carbohydrate Res. 1968. - V. 7. - P. 272-283.

138. Percival E., McDowell R.H. Chemistry and enzymology of Marine algal polysaccharides. Academic Press, London. - 1967. - P. 157-164.

139. Percival E.G.V., Ross A.G. Fucoidin. Part I. The isolation and purification of fucoidan from brown seaweeds// J. Chem. Soc. 1950. - V. 717-720.

140. Percival E.E., Venegas M.F., Weigel J.H. Carbohydrates of the brown seaweed Lessonia nigrescensll Phytochemistry. 1983. - V. 22. - P. 1429-1435.

141. Pereira M. S., Mulloy В., Moura P.A.S. Structure and anticoagulant activity of sulphated fucans: comparison between the regular, repetitive and linear fucans fromII J. Biol. Chem. 1999. - V. 274. - Iss. 2. - P. 7656-7667.

142. Ribeiro A.C., Vieira R.P., Mourao P.A.S., Mulloy B. A sulphated a-L-fucan from sea cucumber// Carbohydrate Research. 1994. - V. 255. - P. 225-240.

143. Rompp Encyclopedia Natural Products/ Ed. Prof. Dr. Wolfgang Steglich, Thieme, New York. 2000. - P. 254.

144. Rupe Bires P., Ahrazem O., Leal J.A. Potential antioxidant capacity of sulfated polysaccharides from marine brown seaweed Fucus vesiculosus// J. of Agricultural and chemistry. 2002. - V. 50. - № 4. - P. 840-845.

145. Sakai Т., Komura H., Kato I. A marine strain of flavobacteriaceae utilizes brown seaweed fucoidan// Mar. Biotechnol. 2002. - V. 4. - P. 399-405.

146. Schaeffer D.J., Krylov V.S. Anti-HIV activity of extracts and compounds from alga and cyanobacteria// Ecotoxicology Environ. Safety. 2000. - V. 45. - № 3.-P. 208-227.

147. Schweiger R.G. Methanolysis of fucoidan. The presence of sugars other than L-fucose// J. Org. Chem. 1962. - V. 27. - P.4267-4270.

148. Shibata H., Kimura T.I., Nagaoka M., Hashimoto S., Sawada H., Ueyama S., Yokokura T. Inhibitory effect of Cladosiphon fucoidan on the adhesion of Helicobacter pylori to human gastric cells// J. Nutr. Sci. Vitaminol. -1999.-V. 45.-P. 325-336.

149. Shibata H., Nagaoka M., Takeuchi Y., Takagi I., Hashimoto S., Ueyama S., Yokokura T. Anti-ulcer effect of fucoidan from brown seaweed, Cladosiphon okamuranus Tokida in rats// Jpn. Pharmacol. Ther. 1998. - V. 26. - P. 1211-1215.

150. Zhuang C., Iton H., Mizuno Т., Ito H. Antitumor active fucoidan from the brown seaweed, Umitoranoo (Sargassum thunbergii)// Biosci. Biotech. Biochem. -1995.-V. 59.-P. 563-567.

151. Soeda S., Fujii N., Shimeno H., Nagumatsu A. Oversulafated fucoidan and heparin suppress endotoxin induction of plasminogen activator inhibitor-1 in cultured human endothelial cells: their possible mechanism of action// Biochem.

152. Et. Biophys. Acta. 1995. - V. 1269. - P. 85-90.

153. Soeda S., Sakaguchi S., Shimeno H., Nagamatsu A. Fibrinolytic and anticoacoagulant activities of highly sulfated fucoidans// Biochem. Pharmacol. -1992.-V. 43.-P. 1853-1858.

154. Tako M., Nakada Т., Hongou F. Chemical characterization of fucoidan from commercially cultured Nemacystus decipiens (Itomozuku)// Biosci. Biotechnol. Biohem. 1999. - V. 63. - P. 1813-1815.

155. Usui Т., Asari K., Mizuno T. Isolation of highly purified fucoidan from- -Eisenia bicyclis and its anticoagulant and antitumor activities// Agric. Biol.Chem. -1980.-V. 44 (8).-P. 1965-1966.

156. Whyte J.N.C., Southcott B.A. An extraction procedure for plants: extracts from the red alga Rhodomela larixll Phytochemistry. -1970. V. 9. - № 5. - P. 1159-1161.

157. Xue C.H., Fang Y., Lin H., Chen L., Li Z.J., Deng DS., Lu C.H. Chemical characters and antioxidative properties of sulfated polysaccharides from Laminaria japonica!I J. of Applied Phycology. 2001. - V. 13. - P. 67-70.

158. Xue C.H., Yu G.L., Hirata Т., Terao J., Lin H. Antioxidative activities of several marine polysaccharides evaluated in a phosphatidylcholine-liposomal suspension and organic solvents//Bioci. Biotech. Biochem. -1998. -V. 62. P. 206-209.

159. Zeitlin L, Whaley KJ, Hegarty ТА, Moench TR, Cone RA. Tests of vaginal microbicides in the mouse genital herpes model// Contraception. 1997. -V. 56(5).-P. 329-335.

160. Zhuang С., Itoh H., Mizuno Т., Ito H. Antitumor active fucoidan from the brown seaweed, Umitoranoo {Sargassum thunbergii)// Biosci. Biotech. Biochem. -1995. V. 59. - № 4. - P. 563-567.

161. Zvyagintseva T.N., Shevchenko N.M., Popivnich I.B., Isakov V.V., Scobum A.S, Sundukova E.V., Elyakova L.E. A new procedure for the separation of water-soluble polysaccharides brawn seaweed// Carbohydrate Research. 1999. - V. 322. - P. 32-39.