автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Обоснование биотехнологии БАД к пище из печени тихоокеанских лососей

На правах рукописи

ЧЕПКАСОВА Анна Ивановна

ОБОСНОВАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИИ БАД К ПИЩЕ ИЗ ПЕЧЕНИ ТИХООКЕАНСКИХ ЛОСОСЕЙ

Специальность 05.18.07 - биотехнология пищевых продуктов и биологически

активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Владивосток - 2015

Работа выполнена в лаборатории биохимии гидробионтов Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр» (ФГБНУ «ТИНРО-Центр»)

Научный руководитель: Ковалев Николай Николаевич

доктор биологических наук, старший научный сотрудник, профессор кафедры «Пищевая биотехнология» Института пищевых производств ФГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный технический

рыбохозяйственный университет»

Официальные оппоненты: Бойцова Татьяна Марьяновна,

доктор технических наук, профессор, директор научно-образовательного центра ФГБОУ ВПО «Владивостокский государственный университет экономики и сервиса»

Касьянов Сергей Павлович

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории фармакологии, руководитель экспериментально-технологического участка ФГБУН «Институт биологии моря им. A.B. Жирмунского ДВО РАН»

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Калининградский

государственный технический университет», г. Калининград

Защита состоится «27» апреля 2015 г. в 14— на заседании диссертационного совета Д 307.012.01 при ФГБНУ «Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр» (ФГБНУ «ТИНРО-Центр») по адресу: 690091, г. Владивосток, переулок Шевченко, 4. Факс: (423) 2300-751; e-mail: dissovet@tinro-center.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБНУ «ТИНРО-Центр». Объявление о защите и автореферат диссертации размещены на сайте Минобрнауки РФ: www.vak.ed.gov.ru. полный текст диссертации и автореферат на сайте ФГБНУ «ТИНРО-Центр»: https://sites.google.com/site/tinrodisdoc/home/diss_chepkasova.pdf

Автореферат разослан « -2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

РОССИЙСКАЯ Г ОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА 2015

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Тихоокеанские лососи (лососи) являются одним из массовых объектов морского промысла на Дальнем Востоке. Общий вылов лососей за последние годы составлял от 300 до 500 тыс. т (Состояние промысловых ресурсов..., 2012, 2014; Лососи-2014..., 2014). На пищевые цели используется около 70 % массы в зависимости от вида рыб. Отходы промышленной переработки лососей привлекают внимание исследователей как потенциальный источник биологически активных веществ. Неиспользуемыми отходами переработки лососей являются внутренние органы, жабры, костные ткани, некондиционные молоки. На долю внутренностей приходится 11,0-18,0 %, а на долю печени 1,4-3,8 % массы в зависимости от вида рыбы, места вылова и биологического состояния (Бассейновые нормы..., 2007). Расчетное количество отходов внутренностей при глубокой переработке, таким образом, составляет 33,0-90,0 тыс. т, включая порядка 4,2-19,0 тыс. т печени.

В предыдущие годы в ТИНРО-Центре были разработаны технологии получения биологически активных веществ из отходов переработки лососей: выделен и изучен цитохром С из сердец лососей (Пат. № 1297278; Аюшин, Ковалев, 2006), комплекс протеолитических ферментов из пилорических придатков (Пивненко, 1995), ДНК (Касьяненко и др., 1997) и нуклеопротеидный комплекс (Позднякова, 2003) из молок лососей. Разработана технология БАД к пище «Артротин» из хрящевой и костной ткани лососей (Суховерхова, 2006), позиционируемая в качестве источника гексозаминов и хондроитинсульфата. Разработана технология БАД к пище «Гепатокортин» (ТУ 9283-284-00472012-06), которая является источником со-3 полиненасыщенных жирных кислот и витамина Е. Сырьем для изготовления Гепатокортина являются печень и сердца дальневосточных лососевых рыб.

Несмотря на то что печень лососей считается пищевым сырьем (ТУ 9267037-33620410-04), привлечению ее в пищевую промышленность для приготовления продукции, аналогичной продукции из печени трески и минтая, препятствует трудность отделения желчного пузыря, содержимое которого придает

продукции из печени лососей горький привкус (Шульгина и др., 2013), а также ограниченные сроки ее хранения вследствие окислительной порчи липидов.

Исходя из анализа литературы и данных по влиянию на организм сравнительно новых компонентов, получаемых из животного сырья, а именно - пептидов (Ашмарин, 1982, 1986; Хавинсон, Кветная, 2005, Хавинсон, 2009, Хавин-сон и др., 2012), представляется целесообразным расширить перечень биологически активных добавок из печени лососей, которая потенциально является источником биологически активных веществ. Таким образом, разработка технологии получение из печени лососей биологически активных веществ является актуальной.

Цель работы: обоснование технологии получения из печени тихоокеанских лососей гепатопротекторных добавок к пище, содержащих биологически активные компоненты пептидной и липидной природы.

Задачи исследования:

- исследовать состав белков, аминокислот, липидов, жирных и желчных кислот печени тихоокеанских лососей как сырья для производства БАД;

- исследовать влияние различных способов консервации печени тихоокеанских лососей, используемой для получения БАД, на изменение состава липидов в процессе хранения;

- обосновать рациональные условия экстракции пептидных фракций из печени тихоокеанских лососей (рН, гидромодуль, температура, время);

- обосновать и разработать технологию биологически активных добавок пептидной и липидной природы из печени тихоокеанских лососей и определить их состав;

- провести оценку биологической активности БАД из печени тихоокеанских лососей: исследовать антиоксидантную активность и гепатопротекторные свойства;

- разработать и утвердить нормативную документацию на сушеную печень тихоокеанских лососей как сырье для производства БАД;

- разработать нормативную документацию на БАД к пище из печени тихоокеанских лососей.

Научная новизна работы:

- проведен сравнительный анализ аминокислотного состава, состава ли-пидов, жирных и желчных кислот мороженой и сушеной печени тихоокеанских лососей;

- научно обоснован рациональный способ консервации печени тихоокеанских лососей для последующего использования как сырья для получения биологически активных добавок;

- обоснованы условия экстракции, обеспечивающие полноту извлечения биологически активных пептидных компонентов из печени тихоокеанских лососей;

- обоснована целесообразность использования хитозана для осаждения белков и липидов из экстракта печени тихоокеанских лососей, что обеспечивает получение водорастворимого пептидного препарата и хитозан-липидного комплекса;

- научно обоснована технология биологически активных добавок пептидной и липидной природы из печени тихоокеанских лососей;

- исследован состав биологически активных добавок, полученных из печени тихоокеанских лососей;

- исследована антиоксидантная активность водорастворимого пептидного препарата, полученного из печени тихоокеанских лососей;

- научно обосновано гепатопротекторное действие водорастворимого пептидного препарата и хитозан-липидного комплекса из печени тихоокеанских лососей при проведении биологических экспериментов.

Практическая значимость: разработана технология предварительной обработки сырья для производства БАД, утверждена нормативная документация - «Печень тихоокеанских (дальневосточных) лососевых рыб сушеная», ТУ 9283-336-00472012-2011.

Разработана технология получения двух биологически активных добавок: водорастворимого пептидного комплекса и хитозан-липидного комплекса из печени тихоокеанских лососей, в основу которой положен метод водной экстракции и последующего осаждения хитозаном белков и липидов. Технологические решения получения БАД из печени лососей защищены патентом № 2409291 «Способ получения водорастворимого полипептидного комплекса из печени рыб лососевых пород». Разработан проект нормативной документации на БАД «Водорастворимый пептидный комплекс из печени лососей. Биологически активная добавка к пище».

Проведены биологические испытания гепатопротекторной активности водорастворимого пептидного и хитозан-липидного комплексов.

Положения, выносимые на защиту:

- печень тихоокеанских лососей является перспективным сырьем для получения биологически активных добавок пептидной и липидной природы;

- биотехнология переработки печени тихоокеанских лососей обеспечивает ее комплексное использование с получением пептидного и хитозан-липидного комплексов;

- водорастворимый комплекс, содержащий пептиды, и хитозан-липидный комплекс, включающий в себя фосфолипиды и жирные кислоты, обладают ге-патопротекторным действием.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 4 в изданиях, рекомендованных ВАК, 3 - в материалах конференций, и один патент на изобретение.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, трех глав, выводов, списка цитируемой литературы (208 наименований, в том числе 56 иностранных). Работа изложена на 131 стр., содержит 31 рисунок, 36 таблиц и 5 приложений.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Первая глава «Обзор литературы» состоит из разделов, в которых проводится анализ информации источников отечественной и зарубежной литерату-

ры, освещены вопросы состава и свойств печени наземных и водных организмов. Дана характеристика технохимического состава печени лососей. Приведены данные об источниках, биологической активности, методов выделения и способах применения пептидов из тканей животных. Дана характеристика и описаны свойства гепатопротекторов животного происхождения. Приведена характеристика хитозана как полиэлектролита, обладающего способностью к сорбции белков и липидов.

Во второй главе «Материалы и методы» приведена характеристика объектов и методов исследования.

Объектами исследования являлись:

- печень лососей: горбуши (Oncorhynchus gorbuscha)-, кеты (О. ketä)-, нерки (О. пегка)-, симы (О. masou) без отделения желчного пузыря, заготовленные в период 2006-2010 гг. в различных районах Дальневосточного промыслового бассейна, желчные пузыри кеты (О. keta)\

- хитозан из панциря камчатского краба (Paralithodes camtschaticus) и уг-лохвостой креветки (Pandalus goniurus), полученные согласно ТУ 9289-00349857769-2003;

В работе использовали стандартные и общепринятые химические, биохимические, микробиологические и математические методы исследований. Проводили определение:

- технохимических показателей, кислотного и перекисного числа по ГОСТу 7636-85 «Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Методы анализа»;

- содержания экстрактивного белка по методу Лоури (Lowry et al., 1951);

- общего количества белка по методу Кьельдаля (Лазаревский, 1955) на приборе "Kjeltec 2300" (Foss, Швеция);

- состава аминокислот на скоростном аминокислотном анализаторе L-8800 («Hitachi», Япония);

- содержания липидов по Фолчу (Folch et al., 1957). Анализ фосфолипидов по методу В.Е. Васьковского и Е.Ю. Костецкого (Vaskovsky et al., 1975). Состав

жирных кислот липидов анализировали на хроматографе с пламенно-ионизационным детектором "Shimadsu-14B" (Япония);

- гликогена «прямым методом» (Практикум по биохимии, 1989);

- концентрации металлов на атомно-адсорбционном спектрофотометре «Shimadzu» АА-6800. Подготовка проб и минерализация - по ГОСТу 26929-94;

- антиоксидантной активности по методу антиокислительной активности карнозина (Пат. SU 1807353);

- молекулярной массы белков электрофорезом в полиакриламидном геле на оборудовании фирмы Pharmacia (Швеция) (Остерман, 1981), использовали белковые маркеры фирмы Sigma (США);

- содержания витаминов А и Е методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (Рыбин, Саяпина, 1999);

- активности ферментов аланин- и аспартатаминотрансфераз и содержания общего билирубина в сыворотке крови, концентрации глюкозы в плазме венозной крови стандартными методами (Колб, Камышников, 1982);

- желчных кислот: на газовом хроматографе GC-14B "Shimadzu" (Япония) с пламенно-ионизационным детектором и на газовом хроматографе СР-3800 (Varian, США) с масс-селективным детектором 1200L Quadrupole MS (Varian, США). Идентифицировали вещества с помощью электронной библиотеки стандартных масс-спектров;

- фракционного состава пептидов методом гель-хроматографии (Остерман, 1981);

- ультрафильтрацию на аппарате Millipore (50-650 RPM) (Франция) с плоскими мембранными модулями Pellicon (1 и 10 кДа);

- кинематической вязкости хитозана (Бондалетова, Сутягин, 2003);

- ионного эквивалента и удельной поверхности по ТУ 9283-174-00472012-03;

- гепсидина методом масс-спектрометрии на приборе фирмы "Ciphergen Biosystems" (США) (Kemna et al., 2007).

Биологические испытания печени сушеной (ПС), хитозан-липидного комплекса (XJIK) и водорастворимого пептидного комплекса (ВПК) проводили

в лаборатории иммунологии Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова СО РАМН (ДВО РАН), г. Владивосток.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета программы «STATISTICA 8» и «Microsoft Excel». Для оценки значимости различий использовали t-критерий Стьюдента. Уровень доверительной вероятности (р) был задан равным 95 %.

В третьей главе «Результаты и обсуждения» представлен технохимиче-ский состав печени лососей (табл. 1 ).

Таблица 1. Технохимические показатели печени лососевых рыб мороженой,

% от общей массы, среднее ±ст

Вид лосося Вода Минеральные вещества Белок Жир

Горбуша (Камчатка) 72,2±1,3 1,6±0,2 21,6±0,8 4,7±0,5

Горбуша (о. Сахалин) 69,7±1,4 1,8±0,2 22,8±0,9 3,8±0,5

Кета (Камчатка) 72,1±0,8 1,8±0,3 23,1±1,3 5,2±1,2

Сима (Приморский край) 76,2±1,8 2,4±0,2 18,6±0,8 2,2±0,3

Установлено, что печень рыб рода тихоокеанские лососи (ОпсогЬупсЬиз) в осенний период имеет высокое содержание белка (до 23,1 ± 1,3 %) и низкое -жира (до 5,2 ± 1,2 %). В жире печени кеты содержится большое количество фосфолипидов (ФЛ) (50,4 %) и полиненасыщенных жирных кислот (39,1 %), а также свободных жирных кислот (СЖК) (16,8 %). Содержание гликогена в печени кеты - 10,2 мг/г ткани, а в печени горбуши - 12,3 мг/г ткани. Показано наличие в печени витаминов А и Е, содержание которых зависит от сезона и района промысла.

Высокий уровень кислотного числа (КЧ) является естественной особенностью печени лососей, которую можно объяснить очень высокой активностью липаз, присутствующих в ней (КлпПбоп е1 а1., 2011), которая сохраняется при холодильном хранении сырья (табл. 2).

Сравнение двух способов обработки печени - замораживания и сушки -показало следующее: при хранении при высокой положительной температуре

(20 °С) в сухой печени продолжаются активный гидролиз и окисление липидов, о чем свидетельствует увеличение КЧ и перекисного числа (ПЧ) (табл. 3). Хранение сушеной печени при небольшой положительной температуре (4 °С) обеспечивает существенное снижение активности гидролитических и окислительных процессов (табл. 3).

Таблица 2. Изменение кислотного числа мороженой печени лососей _в зависимости от срока хранения, мг КОН/г, среднее ± о_

Вид лосося Срок хранения при температуре минус 18 °С мес.

1 2 4 6 12 24

Горбуша (Камчатка) 2,5±0,1 3,8±0,1 5,9±0,2 9,3±0,4 22,5±1,0 47,6±2,0

Горбуша (Сахалин) 3,1±0,1 4,0±0,1 6,6±0,2 13,0±0,5 28,3±1,3 54,2±2,5

Кета 2,7±0,1 3,9±0,1 6,9±0,2 12,8±0,5 25,6±1,2 52,0±2,2

Таблица 3. Изменение перекисного и кислотного чисел сухой печени кеты _в зависимости от срока хранения, среднее ± а_

Перекисное число, Кислотное число,

Срок хранения, мес. моль активного кислорода/кг мг КОН/г

Температура 20 °С

0 4,0±0,2 1,0±0,1

1 6,0±0,2 4,0±0,2

3 12,0±0,4 30,0±1,2

6 30,0±1,2 60,0±2,5

Температура 4 °С

0 4,0±0,2 1,5±0,1

1 5,0±0,2 2,2±0,1

3 7,5±0,3 2,8±0,1

6 10,0±0,4 3,5±0,1

8 12,0±0,4 4,0±0,2

12 12,8±0,5 5,3±0,2

Поэтому в дальнейших экспериментах использовали мороженую печень не более 2 мес. и сухую печень не более 12 мес. хранения.

Исследование состава аминокислот печени лососей. Основную долю небелковых азотистых веществ печени лососей составляют свободные аминокислоты, содержание которых варьирует от 0,01 до 2,50 мг на 1 г сухой массы

(табл. 4). Суммарное содержание свободных аминокислот в печени кеты ниже, чем в печени горбуши. Отмечено высокое содержание таурина - 0,52 мг/г в печени кеты и 2,50 мг/г в печени горбуши.

Установлено, что количество связанных аминокислот в печени лососей значительно выше, чем в печени наземных животных (табл. 5), а по сумме незаменимых аминокислот мороженая и сушеная печень различались незначительно.

Результаты исследований показывают, что печень лососей является более ценным источником аминокислот, чем печень наземных животных.

Состав липидов и жирных кислот печени лососей. Проведенные исследования показали, что мороженая печень горбуши содержит 3,6 ± 0,2 % липидов, а кеты - 4,7 ± 0,2 %. Сухая печень горбуши содержит 11,0 ± 0,6 % липидов, кеты - 14,7 ± 0,7 % липидов.

Таблица 4. Содержание свободных аминокислот в печени кеты и горбуши, мг/г (на сухой вес)

Аминокислота Кета Горбуша

p-Ser 0,61 0,03

Tau 0,52 2,50

Asp 0,36 0,32

Thr 0,38 0,42

Ser 0,38 0,37

Glu 0,88 1,75

Sar - 0,01

Gly 0,57 0,69

Ala 0,71 1,00

Cit 0,69 0,02

Val 0,43 0,43

Cys 0,08 0,08

Met 0,22 0,21

Cystin 0,05 0,04

Ile 0,32 0,24

Leu 0,62 0,48

Туг 0,21 0,26

Phe 0,28 0,24

b-Ala 0,11 0,08

Trp 0,03 0,04

Orn 0,09 0,25

Lys 0,34 0,60

His 0,04 0,12

Ans 0,08 0,31

Car 0,01 0,06

Arg 0,04 0,04

Pro 0,04 3,46

Всего 8,29 14,15

Примечание, р < 0,05. Таблица 5. Связанные аминокислоты печени лососей,

Показатель Кета, печень мороженая Горбуша, печень Печень говяжья*

Мороженая Сушеная

Сумма незаменимых 114,4 298,3 259,9 68,1

Сумма заменимых 217,2 470,6 401,9 100,9

* Из книги «Химический состав пищевых продуктов» (1987).

Исследование состава липидов мороженой и сушеной печени показало, что в процессе хранения (табл. 6) происходит гидролиз ФЛ и триглицеридов, а также накопление СЖК.

Таблица 6. Состав липидов печени кеты, % от суммы общих липидов

Класс липидов Печень мороженая 1 мес. хранения (темп.-18 °С) Печень сушеная из мороженой 1 мес. хранения (темп. 4 °С) Печень сушеная из мороженой 6 мес. хранения (темп. 4 °С)

Фосфолипиды 50,4 66,9 32,2

Стерины 17,8 15,6 17,0

Свободные жирные кислоты 16,8 11,4 32,1

Триглицериды 9,9 2,3 <0,1

Эфиры стеринов 5,1 3,8 18,7

Примечание, р < 0,05.

При исследовании состава ЖК мороженой и сухой печени кеты и горбуши выявлены межвидовые различия в содержании насыщенных и ненасыщенных ЖК (табл. 7). Главными ЖК липидов сушеной печени горбуши и кеты являются пальмитиновая (16:0), стеариновая (18:0), олеиновая (18:1п-9), эйкоза-пентаеновая (20:5п-3) и докозагексаеновая (22:6п-3) кислоты.

Таблица 7. Состав жирных кислот липидов печени горбуши и кеты, _% от общей суммы ЖК_

Показатель Печень горбуши мороженая 1 мес. хранения (темп. -18 °С) Печень кеты

Мороженая 1 мес. хранения (темп.-18 °С) Сушеная из мороженой 1 мес. хранения (темп. -4 °С)

Сумма насыщенных ЖК 56,8 34,7 37,3

Сумма мононенасыщенных ЖК 25,6 26,2 29,5

Сумма полиненасыщенных ЖК 17,6 39,1 33,2

Примечание, р < 0,05.

Антиоксидантная активность печени лососей (АОА). Величины АОА печени лососей были сравнительно невелики и составляли всего 54-76 % по сравнению с АОА карнозина. Наибольшей активностью характеризуется пе-

чень нерки (0,76 мг/мг ткани), наименьшей - печень горбуши (0,54 мг/мг ткани). АОА печени кеты составила 0,63 мг/мг ткани.

Желчные кислоты печени лососей. При анализе желчных кислот, выделенных из желчных пузырей кеты, идентифицированы холевая и дезоксихоле-вая кислоты, а также этиловый эфир холевой кислоты, как известно, оказывающие положительное биологическое действие (рис. 1).

Рис. 1. Хроматография метилированного экстракта желчных пузырей кеты на газовом хроматографе СР-3800 (участок выхода производных желчных кислот). Пики 1, 2 и 3 идентифицированы соответственно как метиловые эфиры холевой и дезоксихолевой кислоты и этиловый эфир холевой кислоты

Разработка технологии получения сушеной печени. Хранение мороженой печени при температуре -18 °С в течение двух месяцев приводит к снижению содержания ПНЖК в 2,5 раза, с 39,1 до 15,5 %. Высушивание обеспечивает содержание ПНЖК в сухой печени не менее 15 % при хранении в течение года.

На основании проведенных исследований разработана технологическая схема получения сушеной печени, представленная на рис. 2. Выход готового продукта составил 15-20 % в зависимости от типа сушильного аппарата.

Рис. 2. Технологическая схема получения сушеной печени лососей

Печень тихоокеанских лососей сушеная полностью соответствует требованиям безопасности по содержанию токсичных элементов, пестицидов и микробиологическим показателям. Сушеная печень, показавшая стабильность при хранении (КЧ и ПЧ) и по содержанию ПНЖК, предпочтительнее как сырье по сравнению с мороженой печенью при производстве БАД. На основании этого разработана документация на «Печень тихоокеанских (дальневосточных) лососевых рыб сушеную» (ТУ 9283-336-00472012-2011), предназначенную для использования в качестве сырья при производстве биологически активных добавок к пище со сроком хранения 12 мес.

Технология выделения водорастворимых компонентов печени лососевых и получения хитоэан-липидных комплексов. Исследование процесса экстракции белково-пептидного материала проводили на мороженой и сушеной

печени. Исследовано влияние различных рН среды на экстракцию белков и пептидов из печени лососей: дистиллированная вода рН = 5,0; щелочная (рН = 8,0) и сильнокислая (рН = 3,0) среды. Экстракцию проводили в интервале температур от 15 до 25 °С, зависимости полноты экстракции (по выходу белково-пептидного материала в раствор) от температуры не обнаружено.

Судя по полученным результатам рациональными условиями экстракции для сушеной печени горбуши являются соотношение печень : экстрагент = 1 : 30 в слабокислой рН = 5,0 среде (рис. 3).

Рис. 3. Зависимость полноты экстракции белкового-пептидного материала от времени при различных гидромодулях экстракции печени горбуши: сушеной, рН = 5,0; мороженой, рН = 8,0

Для мороженой печени горбуши рациональными условиями экстракции являются рН = 8, соотношение фарша и экстрагента 1 : 5 (рис. 3). При этих условиях в течение 2-4 ч происходит максимальная экстракция белков и пептидов: из мороженой печени лососей - 47,5 %; из сушеной печени - 35,4 %.

Следующим этапом работы было проведение фракционирования экстракта на пептидную и липид-белковую фракции. Предварительно установлено, что использование хитозана различного происхождения, получаемого по ТУ 9289003-49857769-2003, одинаково успешно влияет на эффективность сорбции липидов и незначительно влияет на сорбцию высокомолекулярных пептидов.

На основании проведенных исследований разработана технологическая схема получения из сушеной и мороженой печени лососей водорастворимого пептидного (ВПК) и хитозан-липидного комплексов (ХЛК) (рис. 4).

Рис. 4. Технологическая схема получения БАД из печени лососей

Выход ВПК составляет от 4,1 до 4,6 % в зависимости от вида сырья (мороженая или сушеная печень) и типа используемого сушильного аппарата. Содержание пептидов в ВПК - 40-43 %. Выход ХЛК составляет от 85 до 90 %.

Характеристика водорастворимого пептидного комплекса (ВПК) из печени лососей. Определение молекулярно-массового распределения белково-

пептидного материала в ВПК показало наличие 12 пептидных фракций. Расчет общего содержания пептидов по площади пиков показал, что во фракциях 3-5 с молекулярной массой (ММ) 1-10 кДа их количество составляет более 60 % (рис. 5).

Рис. 5. Молекулярно-массовое распределение пептидов в ВПК из печени лососей

ВПК из печени горбуши имеет высокое содержание таурина - 29,6 мг/г (табл. 8). Суммарное количество таких аминокислот, как триптофан, фенилала-нин, тирозин, цистеин, метионин, гистидин, и дипептидов карнозина и анзерина, обладающих антиоксидантными свойствами, в ВПК из печени горбуши составляет 9,0 мг/г, а в ВПК из печени кеты - 10,1 мг/г. В пептидной фракции ВПК отмечено высокое содержание незаменимых аминокислот (табл. 9).

ВПК из мороженой печени горбуши содержит в 1,3 раза больше белковых аминокислот, чем ВПК из сушеной печени. Предположительно это связано с особенностями экстракции и сорбции полипептидов из мороженой и сушеной печени лососей.

Антиоксидангная активность ВПК из мороженной и сушеной печени горбуши в 6,5 и 4,9 раза выше активности карнозина. АОА выделенной из ВПК фракции пептидов с ММ 1-10 кДа в 6,3 раза выше активности карнозина.

Таблица 8. Содержание сво- Фракция 1-10 кДа исследована с помо-

бодных аминокислот в ВПК щью маСс-спе1сгрометрии, обнаружены три из печени лососей, мг/г

молекулярных иона с массой 2841,54, 2913,54 и 3025,63 Да, которые, по литературным данным, соответствуют молекулярной массе известных изоформ гепсидинов, обладающих антимикробным и антигрибковым действиями.

Характеристика липидов ХЛК из печени лососей. Содержание липидов в ХЛК из сушеной печени кеты и горбуши составляет соответственно 10,8 и 11,0 % от сухого веса. В ХЛК из мороженой печени горбуши содержание липидов - 16,5 %, а в ХЛК из сушеной печени - 11,0 % от сухого веса. Проведено исследование классов липидов в ХЛК, полученных из мороженой и сушеной печени кеты различного срока хранения с использованием хитозанов, выделенных из различных источников. Показано, что содержание основных классов липидов в ХЛК коррелирует с их содержанием в печени кеты (табл. 10). Отмечается снижение относительного содержания триглицеридов в ВПК по сравнению с их содержанием в печени.

Таблица 9. Аминокислотный состав пептидов в ВПК из сушеной и мороженой _печени лососей, мг аминокислоты / г_

Показатель Печень кеты Печень горбуши

Мороженая Мороженая Сушеная

Сумма незаменимых 287,3 169,3 117,6

Сумма заменимых 385,2 303,2 249,1

Соединение Кета Горбуша

p-Ser 5,26 4,4

Tau 5,79 29,6

Asp 3,02 5,0

Thr 2,71 2,0

Ser 2,60 1.7

Glu 8,15 5,5

a-AAA 0,26 0,1

Gly 4,68 6,4

Ala 5,28 16,33

Cit 0,08 —

Val 5,21 5,9

Cys 6,86 0,03

Met 0,56 0,01

Cystin 0,24 0,35

Ile 1,56 3,55

Leu 3,43 9,5

Туг 0,26 4,1

Phe 1,27 1,6

b-Ala 0,56 0,6

b-Aiba 0,77 0,15

g-ABA 0,77 0,15

Trp 0,25 0,3

HyLys 0,22 0,03

Orn 0,81 2,6

Lys 2,62 8,1

His 0,27 0,74

Ans 0,61 1,8

Car 0,06 0,4

Arg 0,23 2,4

Pro 2,87 18,6

Всего 67,3 132,06

Примечание, р < 0,05.

Таблица 10. Состав липидов ХЛК из печени кеты, _% от общего содержания липидов_

Комплекс Комплекс Комплекс Комплекс с хитозаном креветки

Класс липидов с хитоза-ном краба с хитозаном креветки с хитозаном краба

Мороженая печень Сушеная печень

1 мес. хранения 6 мес. хранения

Фосфолипиды 53,6 54,7 44,4 40,3

Стерины 16,9 16,5 21,8 21,7

Свободные жирные 21,0 20,0 24,6 25,4

кислоты

Триглицериды <0,1 1,5 <0,1 <0,1

Эфиры стеринов 8,5 7,3 9,2 12,6

Примечание, р < 0,05.

В хитозан-липидных комплексах из печени кеты содержится 20-21 % свободных жирных кислот (СЖК). При хранении сухой печени в течение 6 мес. происходит гидролиз ФЛ и их концентрация несколько снижается (на 17-26 %), а относительное содержание СЖК увеличивается. Не выявлено различий в составе классов липидов ХЛК из печени кеты в зависимости от источника получения хитозана. Фосфолипиды ХЛК из печени горбуши: фосфатидилхолин -более 50 % суммы; фосфатидилэтаноламин - 19 %; фосфатидилинозитол - 5 %; фосфатидилсерин - 2 %.

Основными ЖК липидов ХЛК мороженой печени горбуши и кеты являются пальмитиновая (16:0), стеариновая (18:0), олеиновая (18:1п-9), эйкозапен-таеновая (20:5п-3) и докозапентаеновая (22:6п-3) кислоты. ХЛК из печени кеты и горбуши имеют практически равное количество полиненасыщенных ЖК (18,1 и 17,9 %) (табл. 11).

Таблица 11. Состав жирных кислот ХЛК из мороженой печени кеты и горбуши,

% от суммы ЖК

Показатель Печень кеты Печень горбуши

Сумма насыщенных ЖК 39,7 32,1

Сумма мононенасыщенных ЖК 16,2 23,4

Сумма полиненасыщенных ЖК 18,1 17,9

Проведено исследование содержания связанных аминокислот ХЛК из мороженой и сушеной печени горбуши (табл. 12), выявленные различия могут являться следствием того, что содержание связанных аминокислот в мороженой печени в 1,2 раза выше, чем в сушеной печени горбуши. Установлено, что сорбционная емкость хитозана из панциря краба по отношению к связанным аминокислотам на 20 % выше сорбционной емкости хитозана из панциря креветки.

Таблица 12. Связанные аминокислоты в ХЛК из печени лососей, мг аминокислоты / г

Показатель Печень горбуши, хитозан -краб Печень кеты мороженая

Сушеная печень Мороженая печень Хитозан из панциря краба Хитозан из панциря креветки

Сумма незаменимых аминокислот 230,7 221,7 206,4 167,3

Сумма заменимых аминокислот 353,1 399,9 319,6 258,9

Примечание, р < 0,05.

Медико-биологические испытания. Препараты ПС, ВПК и ХЛК исследованы в качестве гепатопротекторов на модели токсического гепатита, индуцированного тетрахлорметаном. О гепатопротекторной активности исследуемых препаратов печени лососей судили по восстановлению уровня маркерных ферментов крови - аланинаминотрасферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT) и изменению уровня билирубина (Колб, Камышников, 1982). Показано, что ПС не оказывает влияния на уровень АЛТ, снижает уровень ACT на 30 % и уровень билирубина до нормы. ХЛК нормализует уровни АЛТ и билирубина и оказывает положительное влияние на уровень ACT, снижая его на 15 %. ВПК нормализует уровень АЛТ и снижает уровень ACT и билирубина (рис. 7).

Расчет экономической эффективности производства БАД к пище на основе ВПК. Экономические расчеты показали, что при выходе ВПК 4 % от массы исходного сырья себестоимость продукта составит 7032,00 руб. за 1 кг. Окончательный расчет показывает, что при рентабельности 20 % стоимость

препарата составляет 9603,3 руб. за 1 кг. Стоимость месячного курса БАД на основе ВПК из печени лососей ниже стоимости аналогичного курса фармпрепаратов в 3,0-17,8 раза, а курса БАД - в 1,1-16,0 раза.

% Аланинаминотрансфераза 200

150 -100 50 0

% Аспартатаминотрасфераза 250

200 150 100 50 0

Гепатит ПС

ХЛК

%

200 150 100 -50 -0

ВПК

Гепатит ПС

ХЛК

ВПК

Билирубин

Гепатит ПС

ХЛК

ВПК

Рис. 6. Сравнительный анализ эффективности гепатопротекторной активности препаратов из печени лососей. 100 % - норма.

ВЫВОДЫ

1. Разработана технология БАД из печени тихоокеанских лососей, основными стадиями которой являются: водная экстракция и осаждение хитоза-ном, позволяющая получать продукты, содержащие биологически активные вещества гепатопротекторного действия.

2. Установлено, что печень тихоокеанских лососей характеризуется содержанием белков до 24 % и низким содержанием липидов - 3^4 %. Аминокислотный состав белков на 30-35 % представлен незаменимыми аминокислотами, при этом содержание таурина до 30 мг/г, а карнозина и ансерина в сумме составляет 2,2 мг/г. В липидах содержится до 70 % фосфолипидов, содержание

триглицеридов составляет около 10 %. В липидной фракции идентифицированы желчные кислоты: холиевая, дезоксихолиевая - и этиловый эфир холиевой кислоты.

3. Установлено преимущество способа консервации печени тихоокеанских лососей - сушки по сравнению с замораживанием, что позволяет хранить исходный материал для получения БАД в течение 12 мес.

4. Обоснованы рациональные режимы экстракции белково-пептидного материала из сушеной печени лососей: гидромодуль 1 : 30; рН = 5; время экстракции 4 ч; температура 15-25 °С.

5. Разработана технология переработки печени тихоокеанских лососей, основанная на экстракции и фракционировании хитозаном, позволяющая получать водорастворимую фракцию, состоящую из пептидов и аминокислот, и хи-тозан-липидный комплекс.

6. Установлено, что после высушивания в водорастворимой пептидной фракции содержится 40 % пептидов, из них около 60 % пептидов с молекулярной массой 1-10 кДа; хитозан-липидный комплекс содержит 20 % липидов, из них до 60 % фосфолипидов и более 15 % ненасыщенных жирных кислот.

7. Показано, что пептидный комплекс обладает высокой антиоксидант-ной активностью (в 5-6 раз выше активности карнозина). На модели токсического гепатита показано, что водорастворимый пептидный и хитозан-липидный комплексы обладают гепатопротекторными свойствами, нормализуя уровни маркерных ферментов и билирубина крови мышей.

8. Разработана и утверждена техническая документация на «Печень тихоокеанских (дальневосточных) лососевых рыб сушеную» (ТУ 9283-33600472012-2011), предназначенную для использования в качестве сырья при производстве БАД.

9. Разработан проект технической документации на «Водорастворимый пептидный комплекс» из печени лососей. Оригинальность технического решения подтверждена патентом РФ № 2409291 «Способ получения водорастворимого полипептидного комплекса из печени рыб лососевых пород».

Список публикаций по теме диссертации

Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК:

1. Чепкасова А.И., Аюшин Н.Б., Юрьева М.И., Загородная Г.И., Ковалев H.H. Технохимическая характеристика печени лососевых рыб и перспективы ее использования // Изв. ТИНРО. — 2009 — Т. 159. — С. 325-336.

2. Чепкасова А.И., Аюшин Н.Б., Юрьева М.И., Запорожец Т.С., Макарен-кова И.Д., Ковалев H.H. О комплексной переработке печени дальневосточных лососей // Изв. ТИНРО. — 2011. — Т. 167. — С. 240-251.

3. Чепкасова А.И., Аюшин Н.Б., Юрьева М.И., Позднякова Ю.М., Ковалев H.H. Перспективы использования печени лососевых для получения биологически активных компонентов // Изв. ТИНРО. — 2012. — Т. 169. — С. 230237.

4. Чепкасова А.И., Аюшин Н.Б., Якуш Е.В. Состав и свойства водорастворимого препарата из печени лососей // Изв. ТИНРО. — 2014. — Т. 178. — С. 253-260.

В других изданиях:

5. Чепкасова А.И., Аюшин Н.Б., Юрьева М.И. Комплексная технология переработки печени дальневосточных лососей // Сб. мат. междунар. конф. «Современное состояние водных биоресурсов», посвященной 70-летию С.М. Коновалова. — Владивосток : ТИНРО-Центр, 2008. — С. 842-844.

6. Чепкасова А.И. Практические аспекты биотехнологии печени лососевых // Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов : Мат. III Междунар. конф. с элементами школы для молодых ученых, аспирантов и студентов. - Петрозаводск, 2010. — С. 190-191.

7. Чепкасова А.И., Аюшин Н.Б., Позднякова Ю.М., Ковалев Н.Н Обоснование технологии переработки печени лососевых // Мат. всерос. конф. молодых ученых и специалистов, посвященной 125-летию со дня рождения И.И. Меся-цева. - Мурманск, 2010. — С. 179-181.

8. Чепкасова А.И., Аюшин Н.Б., Ковалев H.H. Способ получения водорастворимого полипептидного комплекса из печени рыб лососевых пород : Патент на изобретение № 2409291. 17.08.09.

15--ЗЗД9

ЧЕПКАСОВА Анна Ивановна

ОБОСНОВАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИИ БАД К ПИЩЕ ИЗ ПЕЧЕНИ ТИХООКЕАНСКИХ ЛОСОСЕЙ

Автореферат диссертации

Подписано в печать 25.02.2015 г Формат 60*84/16. 1 уч -изд. л. Тираж 100 экз. Заказ № 3. Отпечатано в типографии издательского центра ФГБНУ «ТИНРО-Центр» г. Владивосток, ул. Западная, 10

2014271244