автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.18, диссертация на тему:Направленный биосинтез лимонной кислоты при периодической и непрерывной ферментации гриба Aspergillus niger

На правах рукописи УДК 577.15.062:577.158.4

АВЧИЕВА Пенкер Бабаевна

НАПРАВЛЕННЫЙ БИОСИНТЕЗ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ ПРИ ПЕРИОДИЧЕСКОЙ И НЕПРЕРЫВНОЙ ФЕРМЕНТАЦИИ ГРИБА Aspergillus niger

Специальность 05.18.18 «Технология биологически активных веществ»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук

Москва -1998

Работа выполнена в Государственном научно-исследовательском институте биосинтеза белковых веществ (ГосНИИсинтезбелок)

Научный консультант:

доктор технических наук, Академик международной Академии информатизации, профессор, ВИНАРОВ А.Ю.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, И.М. Грачева; доктор технических наук, профессор, В.В.Бирюков; доктор технических наук, Т.В. Тулякова

Ведущее учреждение: Государственный Научно -исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Защита состоится:. МЛ _ 1998 г.

I ЯХу на зас

в часов, в аудитории на заседании специализированного совета 06%. 51. 03 Московского Государственного Университета Пищевых производств по адресу:

125080, Москва, Волоколамское шоссе, 11, МГУПП, ауд. 229. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУПП. Автореферат разослан ».

1998 г

Отзывы на автореферат (в двух экземплярах), заверенные печатью (предприятия или учреждения), просим направлять ученому секретарю совета.

Ученый секретарь диссертационного

совета, к.т.н., доцент П\, . Л.А.Иванова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Одной из основных задач биотехнологии на современном этапе является разработка технологий, призванных ликвидировать нехватку пищевых продуктов, кормовых ресурсов, улучшить охрану окружающей среды, с одной стороны, а с другой - предстоит решение задачи безотходных технологических процессов, то есть без сброса промышленных сточных вод в водоемы. Решение этих вопросов аребует досконального изучения путей и методов регуляции метаболизма микробной клетки, обеспечивающих направленный биосинтез ценных для народного хозяйства метаболитов.

Научные разработки, излагаемые в данной диссертационной работе, содержат новые принципиальные решения и подходы к организации непрерывного процесса производства мицелиальной биомассы гриба А.гндег и лимонной кислоты.

В настоящее время накоплен достаточно большой опыт в области получения и производства лимонной кислоты. Большую роль в развитии и совершенствовании отечественного прозводства сыграли научно-практические разработки сотрудников Санкт-Петербуогского ВНИИ пищевых ароматизаторов, кислот и красителей. В последствии в ИБФМ под руководством Т.В.Финогеновой были начаты и продолжаются по настоящее время исследования по подбору продуцентов лимонной кислоты и источников сырья.

В ГосНИИсинтезбелок под руководством проф. Винарова А.Ю. разработаны и реализуются методы оптимального технологического проектирования модульных установок по получению лимонной кислоты из различных субстратов.

Несмотря на то, что ежегодный объем мирового производства лимонной кислоты достигает 450 тыс. тонн в год, потребность в ней удовлетворяется далеко не полностью. Доля лимонной кислоты на душу населения в нашей стране в настоящее время в 2,8 раза ниже, чем в развитых странах. В связи с чем особую актуальность в настоящее время приобрели разработки, направленные на интенсификацию и повышение производительности данного производства.

Основной энергоемкой и наиболее трудоемкой стадией производства лимонной кислоты является стадия ферментации. Продолжительность этой стадии при периодическом способе производства составляет 7-9 суток, а концентрация лимонной кислоты в среде достигает 10-14%. Основным критерием оценки эффективное™ стадии ферментации является производительность ферментации, определяемая продолжительностью и концентрацией конечного

- г -

продукта в среде. Поэтому проблемы интенсификации производств ва лимонной кислоты, увеличения и снижения себестоимости продукции относятся к первоочередным задачам данного производства.

Исследованиями последних лет показано, что одним из перспективных направлений, обеспечивающих оптимизацию этой стадии, является разработка технологии непрерывного процесса производства лимонной кислоты. Реализация этих задач и максимальное использование всех возможностей производства в целом требует значительно более глубокого изучения физиолого-биохимических закономерностей и особенностей, связанных как с ростом культуры, так и с биосинтезом лимонной кислоты.

Изучению указанных закономерностей при периодическом и непрерывном способах ферментации гриба Aspergillus niger на средах, содержащих различные источники углерода, и разработке непрерывной ферментации продуцента лимонной кислоты посвящено настоящее исследование.

//ель н задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение закономерностей биосинтеза лимонной кислоты при периодической и непрерывной ферментации гриба Aspergillus niger с целью совершенствования и интенсификации технологии получения лимонной кислоты.

В связи с этим,в число основных задач настоящей диссертационной работы входило:

- подбор высокоактивных штаммов гриба A.niger - продуцентов лимонной кислоты;

- изучение биохимических закономерностей биосинтеза и экскреции лимонной кислоты в зависимости от физиологического и морфологического состояния культуры;

- изучение влияния способа очистки мелассных питательных сред на биосинтез лимонной кислоты;

- изучение условий получения посевного материала, обеспечивающих максимальное кислотообразование продуцентом;

- подбор и оптимизация условий, обеспечивающих направленный биосинтез лимонной кислоты при одно-и двухстадийном способах ферментации продуцента;

- разработка технологического режима получения лимонной кислоты при непрерывной ферментации гриба Aspergillus niger.

Научная новизна работы. Детально изучены биохимические закономерности биосинтеза и экскреции лимонной кислоты грибом A.niger при периодической и непрерывной ферментации в зависимости от физиологического и морфологического состояния культуры.

- 3 -

Впервые исследована ультраструктура мицелия гриба в фазе роста и биосинтеза лимонной кислоты при периодической и непрерывной ферментации гриба. Показано, что биосинтез и экскреция лимонной кислоты зависят от фазы роста культуры и проницаемости клеточной мембраны. Максимальное накопление лимонной кислоты в среде имеет место в стационарной фазе, морфологические исследования клеток в этот период показывают нарушение целостности их структуры.

Впервые показана возможность удаления избытка минеральных элементов из мелассных сред, особенно железа, путем сорбционной очистки с применением клиноптилолита. Очистка мелассы с помощью клиноптилолита исключает наличие в среде свободного ферроцианида и облегчает процесс подготовки мелассы к ферментации, так как при этом отсутствуют стадия обработки мелассы гексацианоферроатом калия и стадия нейтрализации свободных цианидов, что обеспечивает экологическую чистоту этого процесса.

Впервые установлена взаимосвязь между начальной величиной рН среды, размером мицелиального клубка и активностью биосинтеза лимонной кислоты грибом. Показано, что чем ниже начальная величина рН, тем мельче и плотнее мицелий и тем выше активность синтеза лимонной кислоты.

Показана возможность организации производства лимонной кислоты путем ферментации гриба в непрерывном двухстадийном режиме. При этом первая стадия характеризуется как стадия роста культуры, а вторая стадия - стадия биосинтеза лимонной кислоты. Показана возможность индукции экскреции лимонной кислоты на второй стадии с применением пермеабилизирующих реагентов (твин-40 и твин-80).

Практическая ценность работы заключается в том, что разработаны технологические способы интенсификации по основным стадиям производства лимонной кислоты, в частности, по стадиям подготовки мелассы к ферментации, получения посевного материала, ферментации, в том числе и при одно- и двухстадийной непрерывной ферментации. Данные разработки позволили интенсифицировать процесс биосинтеза лимонной кислоты и обеспечить экологически безопасную и экономически эффективную технологию получения лимонной кислоты.

Селекционирован и испытан в промышленных условиях высокопродуктивный штамм гриба А.ш§ег Р-718. В результате промышленных испытаний показано, что штамм по морфологическим, биохимическим и технологическим особенностям отвечает требованиям, предъявляемым к продуцентам лимонной кислоты в про-

- Ч -

мышленных условиях. Штамм накапливает в промышленном ферментере объемом 100 м3 до 14,4% лимонной кислоты.

На основании промышленных испытаний выданы рекомендации по подготовке питательных сред к ферментации и по технологии получения посевного материала.

На основе результатов работы разработаны исходные данные для организации промышленного производства лимонной кислоты непрерывным способом. Промышленная реализация технологии осуществляется в условиях Белгородского завода лимонной кислоты и начата на Краснодарском гидролизном заводе. Разработаны и утверждены нормативно-тихническая документация на производство 50%-ного раствора лимонной кислоты, а также разработаны исходные данные по получению водных растворов лимонной кислоты применительно к ряду предприятий в России и за рубежом.

Публикации. По материалам диссертации автором опубликовано 32 работы, в том числе 3 обзора, 11 авторских свидетельств и патентов (в том числе и Европейских).

Апробаиия работы. Основные результаты исследований были доложены и обсуждены: на 4-й международной конференции молодых специалистов в Болгарии (1990 г.); на конференции «Концепция создания экологически чистых регионов» в Волгограде (1991 г.); на международной конференции Interbiotech-92 в Болгарии. Материалы диссертации докладывались на международной школе в Тарту (1993 г.); на конференции-выставке «Достижения Российской биотехнологии» в Берлине (1997 г.); на международной выставке-конференг'-и в Ганновере (1997 г.) и на симпозиуме «Биотехнология-97» в Манаме (1997 г.).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 7 глав, обсуждения результатов, заключения, общих выводов, списка литературы и приложения.

Работа изложена на 280 страницах, содержит 46 таблицы, 35 рисунков, 180 литературных источников, в том числе НО зарубежных авторов.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве основного объекта исследований использовались продуценты лимонной кислоты - мицелиальные грибы A.niger.

Исследования проводили в колбах на качалке, в лабораторных и камеральных ферментерах с рабочим объемом от 1 до 20 литров в опытных условиях - ферментерах объемом 10 м3 и промышленных условиях в ферментерах объемом 100 м3. В качестве

- £ -

сырья для биосинтеза лимонной кислоты в основном использовали мелассу, гидролизаты крахмалосодержащего сырья, а также сахар. Состав среды, компонентов минерального питания, лимонную кислоту определяли в динамике развития гриба.

Для электронно-микроскопических исследований мицелиаль-ных клеток материал фиксировали 5%-ным глутаровым альдегидом и в 1%-ном растворе четырехокиси осмия.

Ультратонкие среды контрастировали по Рейнольсу и исследовали под микроскопом УЕМ-ЮОС.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Получение мутантов А.трег и селекция активных продуцентов лимонной кислоты

Природные штаммы микроорганизмов, как правило, не всегда обладают высокой способностью продуцировать необходимый продукт в таком количестве, чтобы это обеспечивало необходимое количество продукта и невысокую его стоимость. В связи с этим наряду с исследованиями по усилению природной способности микроорганизма продуцировать определенный продукт большое внимание уделяется селекционной работе по повышению продуктивности штамма.

В настоящее время микробиологический способ получения лимонной кислоты хорошо освоен. Исследованиями многих ученых селекционировано и внедрено в производство большое количество штаммов гриба А.ш£ег, полученных путем направленного мутагенеза.

Несмотря на это, воссоздать точную динамику нарастания продуктивности селекционированых штаммов в настоящее время невозможно, так как оценка кислотообразующей способности проводилась с использованием мелассы различного состава и качества. Показатели качества мелассы не постоянны и очень сильно изменились за последние годы.

Поэтому, несмотря на широкое разнообразие продуцентов, в каждом конкретном случае штамм-продуцент подбирается экспериментальным путем.

Нами для исследования активности кислотообразования использованы два штамма гриба А.г^ег: ВСБ-357 и 228.

Динамика биосинтеза биомассы мицелия и лимонной кислоты исследуемыми штаммами представлена на рис. 1, из которого видно, что закономерности роста и биосинтеза лимонной кислоты данными штаммами общие для всех продуцентов лимонной кислоты.

Наибольшее количество лимонной кислоты во все., исследованных вариантах имело место при ферментации гриба А.одег 228. При этом количество биомассы в среде соответственно ниже.

Морфологические исследования указанных штаммов показали существенное различие также в развитии мицелия в процессе культивирования.

Мицелий штамма 357 образовал в среде сильно разветвленные и переплетенные между собой гифы, распределенные во всем объеме жидкости. Согласно исследованиям многих авторов такое морфологическое состояние мицелия приводит к увеличению вязкости культуральной жидкости и значительно затрудняет массообмен, что сопровождается снижением эффективности всего процесса.

продолжительность ферментац.(су*)

Рис.1. Динамика роста и образования лимонной кислоты штаммами грибов А.ш§ег 228 ( 1) и А.т§ег 357 ( 2):

———— лимонная кислота;

— — — — мицелий гриба.

- %

Мицелий же штамма 228 как при культивировании в лабораторных условиях, так и в процессе периодической ферментации в камеральных условиях в основном представлял собой скопление гиф в форме окатышей (клубка), что значительно облегчало отделение мицелия от культуральной жидкости.

Таким образом, проведенные исследования показали преимущества штамма 228 как по изучаемому признаку (то есть по биосинтезу лимонной кислоты), так и по морфологическим признакам мицелия. Поэтому указанные штамм был использован в качестве исходного штамма для селекции активных продуцентов лимонной кислоты.

Получение активных продуцентов наряду с подбором исходного штамма для селекции включало в себя этапы действия мутагенных факторов на исходную культуру и отбор вариантов с необходимыми физиологическими, биохимическими и морфологическими признаками. Для получения мутантов исходную культуру подвергали ступенчатой селекции под воздействием производных Ы-нитрозосоединений, называемых «супермутагенами», в частности, нитрозоэтилмочевины и нитрозонитрометилмочевины.

В ходе исследований существенных различий чувствительности клеток использованной для селекции культуры к нитрозоэтил-мочевинс и нитрозонитрометилмочевине не наблюдали.

На первом этапе исследований, после обработки и рассева конидий на твердой сусло-агаровой среде, были выделены и просмотрены 170 вариантов, среди которых были как морфологически измененные, так и морфологически неизмененные варианты. В результате биохимических исследований было показано, что только 10 процентов из них продуцируют лимонную кислоту больше, чем исходный штамм. Эти культуры и были отобраны для проверки кислотообразующей способности на мелассных питательных средах. Остальные варианты в подавляющем большинстве были отрицательные мутанты с пониженной активностью синтеза лимонной кислоты.

Среди отобранных вариантов были выбраны культуры, которые сохраняли приобретенные свойства при многократных пересевах на твердые и жидкие питательные среды. После рассева 11 вариантов с более или менее измененными морфологическими свойствами была выделена культура Р-710 с довольно высокой активностью биосинтеза лимонной кислоты. Данная культура была отобрана из вариантов обработанного на первом этапе селекции нит-розоэтилмочевиной, а на втором - нитрозонитрометилмочевиной. Культура сохраняла приобретенные свойства при многочисленных пересевах.

Активность биосинтеза лимонной кислоты полученным штаммом показана в таблице 1. Из таблицы видно, что полученный в результате ступенчатой селекции штамм Р-710 синтезирует в лабораторных условиях в среднем на 12% больше лимонной кислоты, чем исходный.

Сравнительное изучение динамики роста и биосинтеза лимонной кислоты исходным и мутантными штаммами показало,что средний выход лимонной кислоты от сахара при ферментации исходного штамма (228) составил 67%, а при ферментации мутантно-го штамма (710) - 84% (рис. 2).

Сч

Ен О. ЕЗ О

К

2 К Ч

(Я

я с; 0}

Я

сб р, Е-> X а} и

X

о X

± г 1 'ч б

продолжительность ферментации, сут.

Рис.2. Динамика роста и биосинтеза лимонной кислоты исходным Алодег 228 (1) и мутантным А.1^ег 710 (2) штаммами.

_ лимонная кислота, ___ мицелий гриба.

Однако полученный штамм Р-710 проявлял высокую биохимическую активность при культивировании на мелассной среде с низкой первоначальной концентрацией сахара - не более 3%.

- 3 -

Увеличение начальной концентрации сахара от 3-% и выше приводило к задержке роста мицелия и соответственно к увеличению длительности, а чаще и к ингибированию цикла накопления лимонной кислоты. Поэтому параллельно с изучением динамики образования лимонной кислоты штаммом Р-710 ю оптимизацией этого процесса проводились исследования по отбору конидий данного штамма, по изучению их биохимической активности и по адаптации к высоким начальным концентрациям сахара в среде.

Таблица 1

Активность биосинтеза лимонной кислоты исходным и мутантным штаммами гриба А.ш§ег

Ля пп Штамм 228 (исх.) Штамм Р-710

Концентрация сахара в среде, г/л Концентрация лимонной кислоты, г/л Выход лимонной кислоты от саха-ра.% Концентрация сахара в среде, г/л Концентрация лимонной кислоты, г/я Выход лимонной кислоты от саха-Р*,%

1 30 18,0 60,0 30 20,1 67,0

2 40 23,8 59,5 40 27,2 68,0

3 50 28,6 57,2 50 34,3 68,6

4 60 34,1 56,8 60 39,0 65,0

5 70 37,5 53,5 70 46,6 66,5

6 80 45,0 56,2 80 54,9 68,6

Исследования проводились в колбах на качалках. Длительность культивирования - 6 суток.

В результате непрерывного многократного отбора конидий и дополнительной обработки их химическими мутагенами в лабораторных условиях был выделен штамм Р-718, который в зависимости от параметров культивирования в лабораторных условиях синтезировал в среднем на 6-12% больше лимонной кислоты, чем штамм Р-710 (табл.2).

Морфологические свойства штамма Р-718 незначительно отличались от свойств штамма Р-710.

Эффективность штаммов оценивали по конечным концентрациям лимонной кислоты и выходу от сахара. Как видно из результатов таблицы, выход лимонной кислоты от сахара у исследуемых штаммов менялся в зависимости от рН среды. Штамм Р-710 накапливал максимальное количество лимонной кислоты при рН среды в интервале 7,0-6,0. При культивировании штамма Р-718 максимальное накопление лимонной кислоты имело место при рН среды 4,5-5,5.

Адаптация штамма к более кислым первоначальным значениям рН имеет огромное промышленное значение, так как при этом значительно снижается риск возникновения посторонней микрофлоры в среде. Кроме того, при быстром закислении среды штамм преимущественно синтезирует лимонную кислоту.

Таблица 2

Активность биосинтеза лимонной кислоты мутантными штаммами гриба

Параметры культивирования Штамм F-710 Штамм F-71S

м IUI pH среды Концентрация сахара в среде, % Концентрация лимонной кисть-ты, г/л Выход лимонной кислоты. Концентрация лимонной кислоты, г/л Выход лимонной кислоты, %

1 7,0 8,0 53,8 67,2 56,8 71,0

2 6,5 8,0 53,9 67,3 57,2 71,5

3 6,0 8,0 52,5 65,6 59,0 73,7

4 5,5 8,0 48,8 61,0 61,8 77,2

5 5,0 8,0 49,2 61,5 60,9 76,1

6 4,5 8,0 46,4 58,0 60,8 76,0

7 4,0 8,0 43,2 54,0 57,4 71,7

8 3,5 8,0 33,2 41,5 48,0 60,0

Исследования проводились в колбах на качалке, на мелассной питательной среде.

Продолжительность культивирования - 6 суток.

По сравнению с исходным штаммом 228, штамм 718 синтезировал в среднем на 17% больше лимонной кислоты. Средняя продуктивность штамма F-718 составляет 0,53 г/л час против 0,41 г/л-час в контрольном варианте (F-710).

Дальнейшие исследования кислотообразующей способнеости штамма проводили в промышленных условиях. При этом режим ферментации, минеральный состав питательной среды, контроль процесса соответствовал принятой на заводе схеме.

Изучение биосинтеза лимонной кислоты грибом F-718 при поверхностном н глубинном способах ферментации

Штамм F-718 был испытан в промышленных условиях Белгородского завода лимонной кислоты. Эффективность биосинтеза лимонной кислоты данным штаммом оценивалась в сравнении со

- Н -

штаммами гриба А.ш§ег-Л-4, внедренным в условиях завода, и штаммом, полученным в лаборатории завода.

Оценку эффективности проводили по принятой на затоде технологической схеме. Сравнительные результаты исследований представлены в табл. 3, из которых видно, что максимальный съем лимонной кислоты достигается при использовании спорового материала штамма Л-4 и штамма Р-718. Съем лимонной кислоты при использовании этих двух штаммов был фактически на одном уровне или немного выше при использовании штамма Р-718. По сравнению с заводским штаммом съем лимонной кислоты при использовании штамма Л-4 возрастал на 25%, а при использовании штамма Р-718 -на 30%.

Таблица 3

Съем лимонной кислоты при поверхностном культивировании различных штаммов

Номер опыта Съем лимонной кислоты с 1 м2 (г/сутки)

Штамм гриба A.niger

Заводской штамм Штамм Л-4 Штамм F-718

/ л III

I 1075 1627 1549 - 1588

2 1506 1581 1666 1676 1796

3 1235 1558 1562 1656 1803

4 1196 1447 1516 1751 1640

5 1022 1310 1408 1228 1434

Средний съем 1206 1504 1540 1577 1652

Продолжительность культивирования - 7 суток. 1, II, III - этапы исследований

Дальнейшие исследования по оценке эффективности штамма проводились в производственных условиях в ферментерах объемом 100 м3 (рабочий объем 80-85 м3). Испытания, также как и в лабораторных условиях, проводились по технологической схеме, принятой на заводе.

Динамика накопления лимонной кислоты исследуемыми штаммами в промышленном ферментере представлена на рис. 3, из которого видно, что в течение 4-5 суток от начала ферментации активность накопления лимонной кислоты всеми исследуемыми штаммами находится почти на одном уровне. Затем, начиная от 5 и до 9 суток, активность биосинтеза лимонной кислоты штаммом F-718 резко возрастает и достигает 14,5% против 10,2 и 11,2 в контрольных вариантах. Такая закономерность резкого увеличения биосинтеза лимонной кислоты штаммом F-718 по истечении 4-5 суток наблюдалась фактически во всех вариантах исследований, в

- <г -

том числе и в лабораторных условиях. Возможно, что это связано с кислотностью ферментационной среды, так как в результате исследований кислотообразующей способности штамма в лабораторных условиях было показано, что с понижением рН среды активность биосинтеза лимонной кислоты возрастает.

Соответственно с увеличением концентрации лимонной кислоты при ферментации гриба Р-718 возрастала и продуктивность процесса (рис.3). Через 8 суток от начала ферментации средняя продуктивность в контрольных вариантах составила 0,53 г/л-час, а в опытных с АшЁвг Р-718 - 0,64 г/л-час.

продолжительность ферментации (сут.)

Рис.3. Динамика накопления лимонной кислоты различными штаммами гриба в производственных условиях:

1-Заводской штамм; 2-А.шёег-Л-4; 3- А.шяег Р-718

Влияние наполнителем конидий на физиологическую активность и сохранность посевпого материала

Эффективность микробиологического производства лимонной кислоты наряду с составом питательной среды и режимом ферментации определяется применяемым штаммом-продуцентом и биохимической активностью посевного материала.

В промышленных условиях для обеспечения лучшей сохранности морфологических и физиологических свойств сухие конидии смешивают с различными наполнителями, применение которых обеспечивает уменьшение влажности конидий и равномерное распределение балластных примесей и конидий в посевном материале.

Обычно в качестве наполнителей используют активированный уголь (реже тальк), который смешивают с конидиями в соотношении 1:1 или 1:2. Несмотря на то, что применение активированного угля в качестве наполнителя конидий обеспечивает снижение расхода спор и. увеличение срока сохранения посевного материала, он инертен по отношению к посевному материалу и не влияет на его физиологическую или биохимическую активность.

Нами для исследований активности посевного материала использованы наполнители конидий, наиболее часто используемые в производстве лимонной кислоты, а также наполнители, полученные в лабораторных условиях института ГосНИИсинтезбелок. В качестве контрольного варианта использованы конидии без наполнителя. Результаты проведенных исследований показали, что активированный уголь и тальк фактически не влияют на биохимическую активность конидий или их всхожесть.

Использование предложенных наполнителей (1 и 2), как показали результаты сравнительных испытаний при поверхностном культивировании производственного штамма гриба и штамма А.ш^ег Р-718 в условиях Белгородского завода лимонной кислоты, способствует значительному повышению биохимической активности посевного материала.

Как видно из представленных в таблице 4 результатов, наиболее существенное влияние на накопление лимонной кислоты было отмечено при использовании конидий производственного штамма гриба. В этом случае съем лимонной кислоты возрастал по сравнению с контрольным вариантом в среднем на 23%.

Опытные наполнители (1 и 2) представляют собой смесь органических соединений, содержащих физиологически активные вещества, в частности, ферменты, витамины, аминокислоты, микроэлементы, оказывающие благоприятное влияние на рост и развитие гриба A.niger.

- н-

Таблица 4

Влияние наполнителя на съем лимонной кислоты при поверхностном культивировании различных штаммов гриба А.ш§ег

Производственный штамм Штамм Р-718

№ экспери- Без наполнителя С наполнителем Без наполнителя С наполнителем

мента Съем лимонной кислоты, ¿/м2 сутки Съем лимонной кислоты, г/м1 сутки

I 1072 1542 1513 1571

2 1506 1591 1160 1683

3 1235 1820 1584 1696

4 1196 1359 1469 1617

5 1022 1156 1803 1584

Среднее 1206 1493 1503 1630

Продолжительность культивирования - 6 суток

Для исследований использован опытный наполнитель 1

Влияние способа подготовки мелассы к ферментации на биосинтез лимонной кислоты

Непостоянство химического состава мелассы, используемой в качестве основного сырья при микробиологическом производстве лимонной кислоты, требует подбора состава питательной среды к штамму микроорганизма. Поэтому даже при использовании одного и того же штамма продуцента и при одних и тех же технологических параметрах процесса ферментации общего рецепта подготовки мелассы к ферментации не существует.

Традиционным способом подготовки мелассы к ферментации при промышленном производстве лимонной кислоты является обработка гексацианоферроатом калия К4[Ре(СМ)б]*ЗН20 (желтой кровяной солью - ЖКС). Обработка указанным комплексообразо-вателем приводит к осаждению элементов, как отрицательно, так и положительно влияющих на рост и кислотообразование продуцента, и обусловливает присутствие в среде «связанного» ферроциани-да. Поэтому для оптимизации мелассных питательных сред, интенсификации производства лимонной кислоты и решения проблем утилизации отходов производства, необходимы новые более перспективные способы обработки меласс, которые позволят селективно воздействовать на различные компоненты мелассной среды и разработать безотходный технологический процесс.

Проведенные нами исследования показали, что альтернативным вариантом удаления избытка тяжелых металлов, особенно

-

железа, является сорбционная очистка мелассы на цеолитовом фильтре.

Для исследований использован цеолит осадочного происхождения - клиноптилолит. Из известных в настоящее время видов природных цеолитов клиноптилолит занимает особое место из-за его специфической биологической активности, термо- и кислото-стойкости и широкой распространенности. Он обладает комплексом адсорбционных, ионообменных, молекулярно-ситовых, каталитических и других свойств, делающих его универсальным сорбентом для различных биотехнологических процессов.

Исследования по сорбционной очистке мелассы проводились на лабораторной установке, включающей в себя емкость для исходного раствора мелассы, колонку, заполненную цеолитом, и емкость для сбора очищенного раствора мелассы.

Для исследований по очистке мелассы были отобраны несколько образцов мелассы, разведенных до содержания сахара от 3 до 12%, в которых определялось содержание микро- и макроэлементов.

Согласно литературным данным наиболее существенное влияние на биосинтез лимонной кислоты грибом оказывает содержание в среде ионов железа, марганца и кальция. Причем в работах многих исследователей показано, что удаление избытка кальция из среды проблема более сложная, чем удаление первых двух элементов.

На рис. 4 представлены результаты сорбционной и химической очистки мелассной питательной среды, из которых видно, что цеолит лучше задерживал соединения указанных элементов.

В среднем их содержание после пропускания через цеолито-вый фильтр снижалось: железа в 25-30 раз, марганца в 15-20 раз и кальция в 5-10 раз. Во всех вариантах опытов содержание ионов железа при очистке на сорбционном фильтре снижалось до величины менее 5 мг/л, что является оптимальным для роста гриба и ки-слотообразования. При обработке же мелассы гексацианоферроа-том калия этот показатель не снижался менее 8-10 мг/л.

Исследования по влиянию способа обработки мелассы на рост гриба и биосинтез лимонной кислоты показали, что биосинтез лимонной кислоты на очищенных средах значительно выше, чем на исходной. Активность биосинтеза лимонной кислоты на средах после обработки ЖКС и после сорбционной очистки незначительно отличалась (рис. 5).

-f6 -

so-

Чо

30-

. го-

40 ■

TT

ж

6Ш

4500-

350O-

g

ll

_ 1SOO-Ш.

4

Ul

ЖЕЛЕЗО

МАРГАНЕЦ

КАЛЬЦИЙ

Рис. 4. Изменение содержания минеральных элементов в мелассе: I - исходная меласса; 11-меласса после обработки ЖКС; III - меласса после сорбционной очистки.

Дальнейшие исследования сорбционной очистки мелассы проводились в условиях Белгородского завода лимонной кислоты. Исследования проводились в лабораторных условиях завода с использованием мелассы различного состава и качества. В качестве продуцента лимонной кислоты использовали штамм гриба А.^ег (Л4(Л5) - внедренный на заводе.

В процессе подготовки мелассы к ферментации в условиях завода особое внимание уделяется на удаление кальция из среды. Существует мнение, что при концентрации выше 0,4-0,5% кальций снижает выход лимонной кислоты. Поэтому в производственных условиях мелассу в начале обрабатывают щавелевокислым аммонием (ЩКА) с целью удаления избытка кальция, затем желтой кровяной солью (ЖКС).

Исследования проводились в несколько этапов. Варианты экспериментов и результаты представлены в таблице 5 и на рис. 6:..

Рис. 5. Биосинтез лимонной кислоты грибом A.niger в зависимости от способа обработки мелассы:

I - контроль (необработанная меласса);

II - обработка мелассы K4Fe(CN>6] (50 мг/л);

III - сорбционная очистка мелассы.

Таблица 5.

Варианты экспериментов по очистке мелассы в опытно-промышленных условиях

1 -2 Контрольные варианты. Подготовку мелассы к ферментации проводили традиционными способами (путем обработки ЖКС и ЩКА).

3-6 Опытные варианты. Подготовку мелассы к ферментации проводили путем сорбционной очистки на клиноптило-лите. \

I Очистку мелассы проводили по принятой на заводе схеме. Меласса обрабатывалась оптимальным количеством ЩКА, затем ЖКС. После стерилизации, перед ферментацией, мелассу обогащали питательными солями, содержащими источники цинка ^ фосфора и азота.

2 Мелассу обрабатывали только ЩКА (без ЖКС). Перед ферментацией мелассу обогащали питательными солями по варианту 1.

3 Для ферментации использовали мелассный раствор, пропущенный через колонку, заполненную клиноптилолитом. Обогащение мелассы питательными солями не проводилось.

4 Раствор мелассы пропускали через колонку, заполненную клиноптилолитом, затем обрабатывали ЖКС.

5 Раствор мелассы пропускали через колонку, заполненную клиноптилолитом, затем обрабатывали ЩКА, ЖКС и перед ферментацией обогащали солями цинка, фосфора и азота.

6 Раствор мелассы пропускали через клиноптилолитовую колонку, затем обрабатывали ЩКА.

Е* >> с

« 5 ■

<а

Ен

° 2 <4 5

О

к

к §

5 I

ч

I ¿т ж т& у. у]

Рис. 6. Биосинтез лимонной кислоты грибом А.ш^ег при

различных способах подготовки мелассы (1-У I табл.5)

Представленные на рис. 6 данные показывают, что биосинтез лимонной кислоты на средах, обработанных классическим способом (варианты 1 и 2), и на средах после сорбционной очистки (вариант 3) идет фактически на одном уровне. Таким образом, вместо очистки ЖКС и ЩКА может быть использована це-олитовая очистка.

Существенное увеличение биосинтеза лимонной кислоты, как видно из рисунка, достигается при комбинировании обоих способов очистки, то есть при сорбционной обработке мелассы на

клиноптилолите и дополнительной обработке очищенной мелассы классическим способом (вариант 5).

Таким образом, в результате проведенных исследований показана высокая эффективность сорбционной очистки мелассы с помощью клиноптилолита. Замена классического способа очистки мелассы ЖКС и ЩКА на сорбционную очистку приводит к значительному повышению экономической эффективности процесса из-за того, что отпадает необходимость закупки дорогостоящих солей, отпадает необходимость длительной термической обработки мелассы до и после обработки солями, отпадает стадия термического разложения цианидов в мицелиальной массе.

На основании полученных результатов выданы рекомендации по промышленному использованию сорбционной очистки ме-лассных растворов с помощью клиноптилолита.

Влияние минерального состава п Аизнко-хнмичесотгх ¿¡акторов

Среды на биосинтез лнмоннон кислоты грибом; А.п1£ег Р-718

Одним из физиологических путей регуляций синтеза является изменение в среде соотношения исходных концентраций источников углерода и азота. Величина соотношения устанавливается экспериментально и определяется особенностями самого продукта и его продуцента. Наряду с соотношением углерода и азота регулирование ряда других физико-химических факторов среды также обеспечивает изменение метаболизма клетки. Например, регулирование таких факторов, как рН среды, содержание в ней ионов металлов, особенно железа, введение в среду биологически активных веществ обеспечивает минимальное разложение цитрата в клетке за счет снижения активности ферментов, ответственных за его метаболизм.

Биосинтез лимонной кислоты можно рассматривать как процесс, состоящий из двух этапов - синтеза биомассы гриба и лимонной кислоты. На каждом из этапов культура может быть подвержена влиянию различных физико-химических факторов. Эффективное влияние тех или иных факторов, стимулирующих кислотообразо-вание грибом А.г^ег, в значительной мере различаются в зависимости от физиолого-биохимических особенностей самой культуры, а также от технологических параметров процесса культивирования.

При производстве лимонной кислоты в промышленных условиях первостепенное значение приобретает способность культуры-продуцента к максимально полному использованию основного компонента питательной среды - источника углерода.

Несмотря на различия в продуцировании лимонной кислоты, связанные с составом питательной среды и условиями культивиро-

- го-

вания продуцента, общей закономерностью сверхсинтеза является лимитирование среды источниками азота и железа при переходе культуры в стационарную фазу роста.

При дефиците азота в среде задерживается формирование ферментной системы гриба и соответственно задерживается рост мицелиалыюй массы; при его избытке интенсифицируются ферментативные реакции клетки, направленные на рост биомассы и существенно снижается выход лимонной кислоты.

Следовательно, использование регуляции путей метаболизма важно с точки зрения возможностей увеличения выхода продукта на единицу использованного источника углерода, а также увеличения скорости биосинтеза.

Влияние компонентов минерального питания

Из компонентов минерального питания основное влияние на синтез лимонной кислоты оказывают азот, фосфор и железо. Оптимальные концентрации этих элементов зависят от особенностей используемого продуцента, источника углеродного питания и содержания в среде органических и минеральных соединений.

Исследования по влиянию указанных соединений на рост гриба A.niger Р-718 и синтез им лимонной кислоты проводились при его культивировании на мелассной и синтетической сахаросодер-жащей питательной средах.

Для проведения исследований нами была использована меласса с низким содержанием азота - 0,08%, в которую вносили различные концентрации (ЫН4)2804 (рис. 7).

Результаты проведенных исследований показали, что увеличение концентраций азота, фосфора и железа в среде обычно сопровождается увеличением концентрации мицелия, особо ярко выражена зависимость концентрации мицелия от концентрации азота в среде.

Исследования по влиянию различных источников азота на биосинтез лимонной кислоты показали, что для гриба A.niger Р-718 лучшими источниками азота являются (N114)2804 и МН4С1. Концентрация лимонной кислоты в среде при использовании указанных источников азота в среднем на 16% выше, чем при использовании других источников азота. Возможно, что благоприятное воздействие указанных источников азота на синтез лимонной кислоты основано на том, что сульфаты и хлориды аммония, катионы которых поглощаются быстрее, сдвигают реакцию среды в кислую сторону. При подкислении среды, как известно, гриб быстрее переходит к кислотообразованию и синтезирует преимущественно лимонную кислоту.

-2,4-

Результаты исследований по изучению влияния концентрации фосфора на биосинтез лимонной кислоты грибом А.г^ег Р-718 показали, что оптимальные для синтеза лимонной кислоты концентрации фосфора на обеих использованных средах находятся в интервале 120-400 мг/л. При культивировании гриба на синтетической питательной среде наибольший выход лимонной кислоты наблюдается при концентрации 170-350 мг/л, а на мелассной питательной среде - 150-400 мг/л. Дальнейшее увеличение концентрации фосфора и в том и в другом случае не приводило к резкому снижению синтеза лимонной кислоты грибом, а сопровождалось лишь незначительным снижением концентрации кислоты в среде и увеличением концентрации биомассы мицелия.

Исследования по влиянию концентрации железа на активность синтеза лимонной кислоты показали, что присутствие железа в среде обязательно, и увеличение его концентрации от 1 до 5-10 мг/л сопровождается увеличением активности синтеза лимонной кислоты грибом. Дальнейшее увеличение концентрации данного элемента по-разному влияло на синтез лимонной кислоты и зависело от используемой питательной среды.

Рис. 7. Влияние концентрации (N114)2804 на биосинтез лимонной кислоты грибом Р-718:

- мелассная среда;____синтетическая среда

Концентрация сахара - 90 г/л.

<о5 0,25

концентрация 'Ну)

-гг.

При культивировании гриба на синтетической питательной среде явно выраженной зависимости синтеза лимонной кислоты от концентрации железа не наблюдали. При увеличении концентрации железа от 10 до 25 мг/л концентрация лимонной кислоты постепенно снижалась, а концентрация мицелия возрастала. Резкого снижения активности синтеза лимонной кислоты грибом в данном случае не наблюдали и при концентрациях железа в интервале 50-75 мг/л. При указанных значениях железа концентрация лимонной кислоты в среде была выше, чем при низких концентрациях (1-5 мг/л). Полученные данные свидетельствуют о том, что отрицательное влияние железа, возможно, проявляется на фоне избыточного содержания в среде других микро- и макроэлементов, особенно тяжелых металлов.

Таким образом, в результате проведенных исследований показано, что максимальное кислотообразование селекционированных грибом A.niger Р-718 наблюдается при концентрациях источника азота 1,5-2,0 г/л, фосфора - 120-400 мг/л и железа - 8-15 мг/л.

Влияние начальной величины рН среды на биосинтез лимонной кислоты и морфологию гриба

Активное развитие гриба А.1^ег и биосинтез им лимонной кислоты на полноценной питательной среде зависит от ее физико-химических свойств, в частности от величины рН.

От величины рН зависит состояние ионогенных групп на поверхности клеток, а если ионы Н+ и ОН- проникают внутрь, то и на внутренних структурах. Под влиянием рН может изменяться активность внутриклеточных ферментов, интенсивность конструктивного и энергетического обмена микроорганизмов.

При микробиологическом синтезе лимонной кислоты рН не является постоянным фактором среды. По мере синтеза и накопления кислоты в среде рН сдвигается в кислую сторону, при этом оптимальная для образования биомассы величина рН не совпадает с величиной, оптимальной для синтеза лимонной кислоты. Установление в среде оптимальной для биосинтеза лимонной кислоты величины рН во многом в данном случае зависит от начальной величины рН. Характер действия начальной рН на синтез лимонной кислоты микроорганизмами практически не изучался.

Проведенные нами исследования показали, что влияние начальной величины рН зависит от состава питательной среды и, в некоторых случаях, например при культивировании на сложных (не стандартных) питательных средах, установление указанных значений величин рН в начале роста культуры нарушает процесс кисло-тообразования. Подобные изменения имеют последствием низкий

-2.3 -

выход лимонной кислоты и непродуктивное расходование источника углерода.

С целью изучения влияния различных значений рН в начале ферментации на активность биосинтеза лимонной кислоты и оптимизации условий культивирования гриба А.шдег в наиболее благоприятном для биосинтеза лимонной кислоты диапазоне рН нами были проведены исследования по изучению динамики образования биомассы, лимонной кислоты и изменения рН среды. Исследования проводились при оптимальных для данной культуры условиях культивирования на питательной среде с начальной величиной рН 7,0. Результаты этих исследований показали, что активный рост гриба A.niger сопровождается интенсивным подкислением среды, конечная величина рН устанавливается через 72-84 часа от начала ферментации. Наиболее интенсивное снижение происходит в течение первых двух суток, за этот период рН снижается с 7,0 до 3,5, в последующие двое суток рН меняется незначительно (с 3,5 до 2,0) и далее до конца процесса поддерживается на этом уровне.

Дальнейшие исследования, которые посвящены изучению влияния начальной величины рН среды на рост гриба А.г^ег и его кислотообразование, показали существенное влияние этого фактора на синтез лимонной кислоты. Причем, влияние рН существенно зависело от сырьевого и минерального состава питательной среды.

При ферментации гриба на синтетической питательной среде, содержащей в качестве источника углерода сахар, наибольшая активность синтеза лимонной кислоты во всех вариантах опытов отмечалась при начальной величине рН 2,5 (рис. 8).

При культивировании гриба на мелассной питательной среде максимальное накопление лимонной кислоты в среде наблюдалось при начальной величине рН в интервале 4,5-5,5, а при рН от 2,5 до 3,5 довольно существенно задерживался рост гриба и синтез лимонной кислоты. Концентрация лимонной кислоты через 48 часов от начала ферментации при рН равной 2,5 почти в 3 раза ниже, чем при рН - 4,5.

Влияние рН среды на морфологию грнба. Зависимость биосинтеза лпмоипон кислоты от морфологии

Исследования по изучению влияния рН на морфологию гриба и синтез лимонной кислоты проводились на различных питательных средах, в частности, на синтетической питательной среде, содержащей в качестве источника углерода сахар, и на мелассной пи1ательной среде.

-гч

продолжительность ферментации (сут*)

Рис. 8. Влияние начальной величины рН на биосинтез лимонной кислоты при ферментации гриба на синтетической са-харосодержащей среде.

□ - рН-2,5; ф - рН-3,0; Д -рН-4,0;

■ - рН-4,5; О - рН-5,5; ▲ . рН-7,0.

.____биомасса гриба.

Полученные результаты показали четкую взаимосвязь между биосинтезом лимонной кислоты и морфологией гриба, в частности, размером клубка мицелия.

Начальная величина рН оказывала значительное влияние на размер мицелиального клубка и его структуру. Однако на различных питательных средах влияние рН на данные показатели было не одинаково. Размер и плотность мицелиального клубка менялись в зависимости от рН среды и длительности ферментации. Во всех вариантах эксперимента было отмечено, что чем ниже начальная величина рН, тем мельче и плотнее мицелий и тем выше активность синтеза лимонной кислоты грибом (таблица 6). Такая закономерность имела место с начала и до конца ферментации и особенно ярко выражена в течение первых 48 часов от начала ферментации.

Таблица 6

Влияние начальной величины рН на морфологию гриба А.г^ег и синтез лимонной кислоты при ферментации на синтетической питательной срсде

м Hit Начальная величина рН среды Продолжительность ферментации, час.

48 часов 120 часов 168 часов

Коиц-ия лили кислоты, г/л Морфол. состояа иг мицелия Размер миц. клубка, мм Конц-ия лили кислоты, г/л Морфол. состояние мицелия Размер миц. . ¡шубка, мм Копц-ия лим. кислоты, г/л Морфол. состояние мицелия • Размер миц. клубка, мм

1 2,5 50 Мицелий круглый в виде клубка 1.5 97 Мицелий круглый и виде клубка 3.0 111 Мицелий круглый в виде клубка 3.0

2 3,0 47 То же 1.7 93 То же 3.5 107 То же 3.5

3 3,5 45 - « - 2.0 93 - « - 4.0 107 - «- 4.0

4 4,0 32 - « - 3.0 93 - « - 4.2 93 Мицелий имеет рыхлую округлую форму*

5 4,5 32 - « - 3.2 87 - « - 5.0 87 То же

6 5,0 36 - « - 3.5 84 - « - 6.0 84 - « -

7 5,5 40 - « - 3.5 82 - « - 6.0 82 - « -

8 6,0 28 - « - 3.7 87 - « - 6.0 87 - « -

9 6,5 45 - « - 3.7 87 - « - 6.0 87 - « -

¡0 7,0 32 - « - 4.0 87 - « - 6.0 87 - « -

1. Концентрация сахара -12%. 1 ' 2. Минеральный состав среды: (N11 4):$04-0,5 г/л; КН2Р04-0.03 гЬ; М^О 4*7Н20-0,25г/л1. ' Размер мииглпальпо.'о кчубка не определили из-за рыхлой структуры мицелия.

- 3,6-

Увеличение размера клубка мицелия от 1,5 до 3,2 мм в этот период приводило к резкому снижению концентрации лимонной кислоты в среде и увеличению концентрации биомассы мицелия.

Видимо, такое неоднозначное влияние начальной величины рН на морфологию мицелия и биосинтез лимонной кислоты связано с тем, что оптимальные для роста и синтеза лимонной кислоты величины рН в данном случае не совпадают. Более низкие значения рН (2,5-3,5) неблагоприятны для роста мицелия. Однако, несмотря на медленный рост и сравнительно мелкий крупообразный мицелий, синтез лимонной кислоты не подавлялся, а существенно интенсифицировался. Видимо, постоянное отрицательное воздействие неблагоприятной величины рН вызывает приспособление гриба к данному фактору. Возможно, что и минеральный состав питательной среды, в том числе и избыточное содержание источника углерода, играет стабилизирующую роль в данном случае, обеспечивая жизнедеятельность клеток и устойчивость процесса синтеза лимонной кислоты.

В условиях недостатка минеральных компонентов и сахара в среде под воздействием кислых значений рН мицелий приобретал бесформенную структуру с явно зыраженными признаками лизиса.

В ходе дальнейших исследований было показано, что мелкие морфологические формы с плотной структурой, которые образовывались в средах с начальной величиной рН 2,5-3,5, имеют очевидные преимущества перед мицелием, имеющим более крупные размеры и рыхлую структуру. Более мелкий и плотный мицелий сохранял жизнеспособность и активность синтеза лимонной кислоты в течение более длительного периода времени. При подпитке среды сахаром такие морфологические формы активно синтезировали лимонную кислоту до 14-15 суток, тогда как синтез лимонной кислоты грибом при начальной величине рН 6,5 продолжался не более 7-9 суток. Дальнейшее внесение сахара в среду не приводило к его конверсии в лимонную кислоту. Процент разлагающейся биомассы мицелия в среде к этому периоду достигал 70-80%.

Совершенно иная биохимическая и морфологическая картины имеют место при культивировании гриба при различных значениях рН на мелассной питательной среде. Через 120 часов от начала ферментации мицелий во всех вариантах имел округлую морфологическую форму, однако размер мицелиального клубка можно было оценить только визуально, так как он имел рыхлую структуру, а при рН 6,5-7,0 мицелий имел хлопьевидную форму. Эти данные свидетельствуют о наличии в мелассной питательной среде большого количества ингибиторов роста гриба, влияние которых может проявляться в зависимости от рН среды. При неоптималь-

ных для роста значениях рН эффект ингибирования более ярко выражен, чем при оптимальных значениях.

Как уже отмечалось, закономерности биосинтеза лимонной кислоты грибом А.ш^ег Р-718 общие для всех таксономических групп микроорганизмов. Сверхсинтез лимонной кислоты и накопление ее в среде наблюдается после замедления роста продуцента, что, как правило, является следствием исчерпания минерального источника азотного питания. С целью более глубоких исследований физиологических, биохимических и морфологических особенностей клеток в период образования биомассы и синтеза лимонной кислоты, а также тех изменений, которые происходят в клетках в этот период, одновременно с концентрацией биомассы и лимонной кислоты в культуральной жидкости в течение всего процесса ферментации определяли внутриклеточную концентрацию лимонной кислоты, содержание сырого протеина (белка) в биомассе и культуральной жидкости, а также содержание липидов в клетках.

Результаты этих исследований показали, что синтез лимонной кислоты протекает одновременно с ростом культуры. Как показано на рис. 9, в фазе роста культуры концентрация лимонной кислоты внутри клетки выше, чем в культуральной жидкости. После замедления роста и перехода в стационарную фазу, когда концентрация лимонной кислоты внутри и вне клетки достигает приблизительно одного уровня, начинается экскреция ее в среду, что сопровождается резким снижением внутриклеточной концентрации лимонной кислоты.

Помимо изменения внутри- и внеклеточной концентрации лимош ой кислоты в процессе ферментации меняется также содержание белка в мицелиальных клетках. После перехода культуры в стационарную фазу с увеличением лимонной кислоты в среде содержание сырого протеина в клетках постепенно снижалось, а в культуральной жидкости, наоборот, возрастало (таблица 7). Затем, с увеличением активности продуцирования лимонной кислоты, его содержание в культуральной жидкости постепенно снижалось. Возможно, что после исчерпания в среде минерального азота гриб ассимилирует азот из органических соединений, то есть из аминокислот, и , видимо, из-за того, что в среде нет дефицита в органическом азоте наряду с синтезом и накоплением лимонной кислоты гриб продолжает расти до конца ферментации.

- Ъд~

Рис. 9. Динамика образования биомассы, лимонной

кислоты и утилизации азога при периодической ферментации гриба:

О - внеклеточная и # - внутриклеточная концентрация лимонной кислоты;

А - биомасса гриба; X - азот.

-2,9-

Таблица 7

Изменение химического состава мицелия гриба в зависимости от продолжительности ферментации

Показатели

л» Продолжи Концепт Концент- Концепт

тельность рация, рация Сырой протеин рация

«Л фермеитац биомассы лимонной в био- в культу- липидовв

ии, час г/л кислоты, массе, ральной биомассе,

г/л % жидкости, %

г/л

1 24 7,0 - 14,5 2,0 2,6

2 48 16,0 7,0 14,0 3,0 1,95

3 72 17,7 23,0 12,0 4,7 0,7

4 96 20,4 53 11,1 3,96 1,75

5 120 20,9 72 10,0 3,0 1,43

6 144 22,7 84 9,0 2,7 1,36

7 168 22,2 100 8,5 . 1,9 0,46

Концентрация сахара -110 г/л.

Как видно из результатов, представленных в таблице 7, содержание липидов в мицелиальных клетках также, как и содержание сырого протеина, снижалось с увеличением продолжительности культивирования. Максимальное содержание их в клетках отмечалось в течение 24-48 часов от начала ферментации, то есть в фазе роста культуры. При переходе культуры к интенсивному продуцированию лимонной кислоты содержание липидов в биомассе снижалось, однако установить какой-либо закономерности в данном случае не удалось.

Подобные биохимические изменения культуры в период интенсивного накопления лимонной кислоты в среде, возможно, связаны с увеличением проницаемости мицелия под воздействием кислых значений рН и ассимиляцией органического азота грибом в процессе синтеза лимонной кислоты.

Электронно-микроскопические исследования структуры клеток гриба в процессе ферментации

Морфологические особенности клеток гриба, как и многих других микроорганизмов, в значительной степени зависят от условий культивирования. Наряду с фазой роста и минеральным составом питательной среды существенное влияние на данный показатель физиологического состояния культуры оказывает рН среды.

Проведенные нами электронно-микроскопические исследования были направлены на изучение ультраструктуры клеток гриба в

-го -

процессе ферментации. Исследования проводились в фазе роста культуры через 72 часа - в начале экскреции лимонной кислоты, и далее до конца процесса. В результате этих исследований отмечены значительные различия ультраструктуры в фазе роста, активного продуцирования лимонной кислоты и стационарной фазе - когда концентрация лимонной кислоты в среде остается на одном уровне.

Как видно из фотографий 1-4, представленных на рис. 10, в фазе роста (фото 1) цитоплазма заполняет всю полость клетки и характеризуется высокой электронной плотностью. Почти все клетки (более 90%) на данной стадии развития культуры имеют целостную, не поврежденную структуру.

С началом экскреции лимонной кислоты (через 72 часа) значительно уплотняется вакуоль, занимая почти весь центр клетки. Цитоплазма в данный период сильно разрыхляется, а клеточные структуры деградируют. Структура клеточной стенки менее четкая, чем в фазе роста культуры, а местами наблюдается частичный лизис клеточной стенки (фото 2). По-видимому, в данном случае можно говорить о начале стадии лизиса культуры, о чем свидетельствуют также и данные по изменению химического состава биомассы мицелия.

Дальнейшие исследования ультраструктуры клеток показали, что, начиная с четвертых суток от начала ферментации, под воздействием кислых значений рН происходит интенсивное нарушение целостности структуры клеток, при этом более 80% клеток в среде с нарушенной проницаемостью, о чем свидетельствует структура цитоплазмы и клеточной стенки (фото 3, 4). В среде также много пустых и полупустых клеток, количество которых возрастает с увеличением продолжительности культивирования.

К седьмым суткам ферментации в среде более 50% пустых и нефункционирующих клеток (фото 4). Такие морфологические изменения коррелируют с интенсивностью синтеза лимонной кислоты грибом.

Таким образом, исследования ультраструктуры клеток на разных стадиях развития гриба позволили установить ряд общих закономерностей, характеризующих особенности культуры в фазах роста и продуцирования лимонной кислоты.

Переход культуры на продуцирование лимонной кислоты сопровождается снижением физиологической активности и ужшбшг-нием проницаемости клеток, в результате чего образовавшаяся в клетках лимонная кислота выходит в окружающую среду в результате простой физической диффузии. Полное нарушение проницаемости клеток при длительном их пребывании в среде и воздействии неблагоприятных значений рН приводит к гибели клеток.

- з/-

ФОТО I

ФОТО 2

ФОТО 3

Рис. 10. Электронно-микроскопические исследования

ультраструктуры клеток гриба по фазам роста.

- ъг-

На основании полученных данных, с целью интенсификации процесса получения лимонной кислоты и снижения продолжительности культивирования нами была предпринята попытка незначительного увеличения проницаемости клеток под воздействием соединений, влияющих на проницаемость клеток микроорганизмов.

Влияние ПАВ на биохимическую активность гриба и экскрецию лимонной кислоты

Существует множество способов изменения проницаемости клеток: изменение ионной силы и солевого состава среды, обработка литическими ферментами, растворителями и поверхностно активными веществами (ПАВ). Из литературных источников известно, что ПАВ в зависимости от концентрации могут оказывать также и стимулирующее действие на синтез органических кислот, в том числе и лимонной кислоты.

В настоящее время известно, что неионогенные ПАВ обладают более щадящим действием на ферментные белки мембраны, поэтому для исследований, направленных на изучение влияние ПАВ на морфологию и структуру клеток гриба и на экскрецию лимонной кислоты использовали твин-40, твин-80 и тритон Х-100.

В ходе исследований существенных различий указанных ПАВ на-биосинтез лимонной кислоты и морфологию гриба не наблюдали. Поэтому для исследований, изложенных в данной работе, использовали более доступный ПАВ - твин-40.

В результате этих исследований показано, что внесение твин-40 в среду в количестве от 10 до 50 мг/л фактически не влияет на процесс кислотообразования грибом. Дальнейшее увеличение его концентрации сопровождается увеличением концентрации лимонной кислоты. Наибольшее количество лимонной кислоты образуется при концентрациях 100-150 мг/л, затем концентрация лимонной кислоты в среде снижается.

Динамика синтеза и экскреции лимонной кислоты в контрольном варианте и при введении твин-40 (150 мг/л) в среду представлены на рис. 11, из которого видно, что через 24 часа после введения твин-40 в среду (3 суток от начала ферментации) происходит увеличение концентрации лимонной кислоты в среде и снижение внутриклеточной концентрации. В этот период разница в концентрации лимонной кислоты в контрольном и опытном вариантах составляет 17 г/л. С увеличением продолжительности ферментации разница в концентрации лимонной кислоты в контрольном и опытном вариантах снижалась, а на 6-е сутки фактически не отмечалась.

Сравнительные электронно-микроскопические исследования ультраструктуры клеток в контрольный и опытный периоды показали существенное влияние твин-40 на ультраструктуру клеток гриба. В частност^через 24 часа после введения твина (72 часа от начала ферментации) клетки имели структуру с явно выраженными признаками деградации клеточных структур, особенно клеточной стенки.

В контрольном варианте подобные морфологические изменения отмечались через 5 суток от начала ферментации. В опытах с твином на 5-е сутки структура клетки аналогична культуре на 7-е сутки ферментации в контрольном вариантах.

Таким образом, исследования по влиянию твин-40 на синтез лимонной кислоты показали, что использование оптимальных концентраций твина приводит к увеличению активности синтеза лимонной кислоты грибом и к существенному снижению продолжи-

Рис. 11. Влияние оптимальных концентраций твина на биосинтез и экскрецию лимонной кислоты при периодической ферментации гриба:

О - контроль; А-опыт с твином (150 мг/л) ____внутриклеточное содержание лимонной кислоты

Полученные с помощью биохимических и электронно-микроскопических исследований данные были использованы при оптимизации режима непрерывного культивирования гриба А.ш£ег Р-718.

Получение лимонной кислоты при непрерывной Ферментации гриба А.тгег Р-718

При периодическом культивировании микроорганизмов -продуцентов лимонной кислоты - культура для поддержания жизнеспособности вынуждена постоянно адаптироваться к изменяющимся условиям окружающей среды. Это затрудняет создание оптимальных условий для получения культуры с высокой физиологической активностью на стадии роста, что в конечном итоге определяет эффективность синтеза лимонной кислоты."

Создание индивидуальных условий легче всего достигается в управляемом непрерывном процессе культивирования.

Ферментацию в непрерывном режиме осуществляли на оптимальной для синтеза лимонной кислоты грибом Р-718 минеральной питательной среде.

Исследования по эффективности биосинтеза лимонной кислоты при непрерывной ферментации гриба проводились при различных физико-химических параметрах процесса, основным из которых является скорость разбавления среды (Д) - фактор, обеспечивающий равновесную концентрацию целевого продукта в среде.

Зависимость биосинтеза биомассы мицелия и лимонной кислоты от скорости разбавления среды при одностадийной непрерывной ферментации гриба на мелассной питательной среде показана на рис. 12. Из представленных на рисунке результатов видно, что перевод процесса на непрерывный режим при скоростях разбавления среда в интервале от 0,01 до 0,02 час-1 не приводит к снижению концентрации лимонной кислоты в среде. Дальнейшее увеличение скорости разбавления среды сопровождается снижением концентрации и лимонной кислоты, и биомассы гриба, а концентрация остаточного сахара в срсдс существенно возрастает.

Из компонентов питательной среды наиболее существенное влияние на биосинтез лимонной кислоты оказывают концентрации источников азота и углерода.

Исследования по влиянию концентрации азота на биосинтез лимонной кислоты грибом при непрерывной ферментации показали, что оптимальная для биосинтеза лимонной кислоты концентрация (№14)2804 в непрерывно подаваемом питательном растворе составляет 1 г/л. При дальнейшем увеличении концентрации азота

происходит резкое снижение концентрации лимонной кислоты, а рост гриба значительно активизируется.

а н о ч о к к

15 О Ж

ж о 2 Я

ч

(Я

33

а,

Е-> Ж

О Я"

ж

80 70-1 60 5040 30] НО

ю-

0,01 0^015 0,02. 0,03 0,04 0,05 0,06 0,01

>А

■2,5"

■ г,о

■1,5

■10

сг ж

скорость разбавления среды (час )

Рис. 12. Влияние скорости разбавления среды на биосинтез лимонной кислоты при одностадийной непрерывной ферментации гриба:

1. Лимонная кислота.

2, Концентрация остаточного сахара.

При непрерывной ферментации оптимальные концентрации сахара также зависят от скорости разбавления среды. При Д=0,02 час1 оптимальные концентрации сахара, при которых наблюдается максимальный выход лимонной кислоты, а концентрация остаточного сахара в среде не высокая - составляют 8-9% . Более высокие концентрации сахара при таком режиме не полностью утилизируются грибом, что приводит к увеличению концентрации остаточного сахара в среде.

Дальнейшие исследования по оценке эффективности биосинтеза лимонной кислоты, которые проводились при оптимальных параметрах ферментации в непрерывном режиме, показали, что стабильное накопление лимонной кислоты в среде продолжается в течение 10-14 суток, затем происходит постепенное снижение концентрации лимонной кислоты и биомассы мицелия, а концентрация остаточного сахара в среде возрастает. Снижение концентрации лимонной кислоты и мицелия в данном случае, возможно объ-

-д£ -

ясняется постепенным снижением скорости роста культуры в условиях лимитирования среды источниками азота, фосфора и других минеральных компонентов.

Таким образом, в результате проведенных исследований показано, что, несмотря на взаимосвязь условий культивирования и образования лимонной кислоты, оптимальные условия роста гриба отличаются от оптимальных условий биосинтеза лимонной кислоты. Создание оптимальных условий и для роста гриба и для биосинтеза им лимонной кислоты в одной технологической стадии фактически невозможно, поскольку максимальное использование всех возможностей данного процесса возможно только при достижении установившегося стабильного режима для каждой стадии отдельно. Создание таких условий легче всего достигается при двухстадийном непрерывном культивировании. При этом условия культивирования на первой стадии подбираются так, чтобы они были оптимальны для роста гриба, а на второй - для биосинтеза лимонной кислоты.

Биосинтез лимонной кислоты при двух стадийной непрерывной ферментации гриба

Исследования по биосинтезу лимонной кислоты при двух-стадийной непрерывной ферментации гриба проводились в двух параллельно соединенных ферментерах. Засев первого ферментера осуществляли так же, как и при одностадийной непрерывной ферментации. Перевод процесса на непрерывный режим осуществляли через 36-48 часов от начала ферментации после того, как гриб накапливал максимальное количество биомассы и начинался интенсивный синтез лимонной кислоты.

После перевода процесса на непрерывный режим на первую стадию ферментации непрерывно подавали питательную среду, содержащую все необходимые для роста гриба компоненты углеродного минерального питания. Концентрации компонентов минерального питания при этом подбирались таким образом, чтобы они преимущественно исчерпались на первой стадии ферментации -стадии роста гриба. Концентрацию источника азота подбирали из расчета, чтобы при переходе суспензии на вторую стадию, концентрация ее в среде не превышала 100 мг/л.

При двухстадийной непрерывной ферментации, так же как и при одностадийной, интенсивность образования лимонной кислоты зависит от скорости разбавления среды (табл. 8). Как видно из представленных в таблице данных, при скоростях разбавления среды до 0,05 час-' концентрация лимонной кислоты в среде довольно высокая - 82-84 г/л. Средний выход лимонной кислоты от сахара в указанном диапазоне скоростей разбавления среды составляет 91,8%.

Максимальная продуктивность процесса, как видно из рис.13, достигается при скоростях разбавления среды в интервале от 0,06-0,07 част1. Однако, как видно из рисунка, с увеличением Д от 0,06 до 0,07 час1 концентрация остаточного сахара в среде возрастает в два раза, а концентрация лимонной кислоты снижается в среднем на 20%. Поэтому процесс целесообразней вести при Д=0,05-0,06 час-'. Средняя продуктивность в указанном интервале составляет 2,1 г/л*час, а концентрация остаточного сахара - 0,04%. Процесс ки-слотообразования при двухстадийной ферментации гриба протекал в более стабильном по сравнению с одностадийной ферментацией режиме. Концентрация лимонной кислоты и мицелия гриба держалась почти на одном уровне в течение 22 суток ферментации.

Таблица 8

Влияние скорости разбавления среды на активность образования лимонной кислоты при двухстадийной непрерывной ферментации гриба А.ш§ег Р-718

М ЯП Скорость разбавления среди, час1 Общая скорость разбал-леяия среди, час' Концентра цця биомассы граба, г/л Концентрация лимонной кислоты, г/я Выход лимонной кислоты, % от сахара

1 0,02 0,01 25,0 84 88,4

2 0,03 0,015 24,4 84 88,4

3 0,04 0,02 23,7 82 86,3

4 0,05 0,025 23,0 81 90,0

5 0,06 0,03 21,7 79 85,2

6 0,07 0,035 20,0 67 70,5

7 0,08 0,040 18,3 52 54,7

Исследования проводились на мелассной питательной среде. Общая концентрация сахара - 95 г/л. Рабочий объем ферментеров - Юл.

При ведении процесса в две стадии, как видно из рис.14 достигается возможность ведения процесса при больших концентрациях сахара в среде по сравнению с одностадийной ферментацией, сахара в среде. При одностадийной ферментации увеличение концентрации сахара выше 90 г/л сопровождалось увеличением концентрации остаточного сахара в среде. При двухстадийной ферментации возможно ведение процесса при концентрациях сахара 110-120 г/л, что обеспечивает накопление высоких концентраций лимонной кислоты в среде.

2.5-1

о

(в <

С*

го

<5

о

в

£

о

Р-. С!

0,5

г

г,о

и 5"

■0,5

—О'

-Н-

св р<

сб X св о

о с* о ж

о

(в Ен о о

св р.

н ж 0)

ЕХ

ж

о м

0,01 О,0/£Г ¿>,02. о.огй о.огв 0,0Ъ$ О.0Ч

скорость разбавления среды (час- )

Рис. 13. Продуктивность синтеза лимонной кислоты при двух стадийной непрерывной ферментации гриба. 1 - Продуктивность (расчитана с учетом объема двух ферментеров. 2- Концентрация остат. сахара.

90 100 (мг/л)

30 40 50 СО 70 I концентрация твин -

Рис. 14. Влияние концентраций твин-40 на активность кисло-тообразования гриба.

Д=0,06 час-1. Концентрация сахара - 90г/л. Средняя концентрация лимонной кислоты в контроле -72 г/л.

Стабильность синтеза лимонной кислоты при двухстадийной ферментации достигается, по всей вероятности, возможностью управления стадией роста гриба. Изменение состава питательной среды, внесение в среду стимуляторов роста гриба или изменение параметров культивирования на данной стадии позволяет получать мицелий гриба, обладающий высокой физиологической и биохимической акгивностью, не нарушая режим кислотообразования на второй стадии. Возможна также и корректировка режима и интенсификация биосинтеза лимонной кислоты на второй стадии ферментации - стадии образования лимонной кислоты. Исследования по интенсификации лимонной кислоты на этой стадии показали высокую эффективность способов, влияющих на морфологическую характеристику культуры.

Исследования по влиянию твин-40 на биосинтез лимонной кислоты при одностадийной непрерывной ферментации гриба не привели к увеличению активности кислотообразования. Напротив, концентрации твина выше 70 мг/л ингибировали процесс кислотообразования.

Дальнейшие исследования по влиянию твина на активность кислотообразования грибом при непрерывной ферментации проводились при двухстадийной ферментации. При этом различные концентрации твин-40 подавались на первую и на вторую стадии ферментации гриба. Результаты этих исследований, показали, что более заметный эффект кислотообразования достигается при добавлении твина непосредственно на стадию биосинтеза лимонной кислоты. Как видно из результатов, представленных на рис.14, добавление твина в ферментационную среду на второй стадии в концентрациях от 10 до 20 мг не оказывает влияния на активность биосинтеза лимонной кислоты.

•Максимальное увеличение концентрации лимонной кислоты достигается при концентрациях твина 30-50 мг/л, затем происходит снижение концентрации мицелия и лимонной кислоты. Как показали морфологические исследования мицелиальных клеток, с увеличением концентрации твина возрастало количество полупустых и пустых клеток в среде, не способных, по всей вероятности, к ки-слотообразованшо, что и приводило к снижению концентрации лимонной кислоты.

Увеличение активности образования лимонной кислоты под воздействием более низких по сравнению с периодическим процессом концентраций твина в данном случае, видимо, связано с тем, что клетки гриба в результате длительного воздействия кислых значений рН имеют достаточно рыхлую структуру с увеличенной проницаемостью клеточной стенки.

- -

Незначительное воздействие на проницаемость клетки, не сопровождающееся нарушением проницаемости вообще, при таких условиях стимулирует биосинтез лимонной кислоты. Воздействие больших концентраций твина на проницаемость клеток в сочетании с кислыми значениями рН приводят к разрушению клеток и нарушению способности образования лимонной кислоты.

Добавление оптимальных концентраций твина на вторую стадию ферментации наряду с интенсификацией биосинтеза лимонной кислоты позволяет вести процесс при больших по сравнению с контрольным вариантом скоростях разбавления среды.

При двухстадийной ферментации гриба на мелассной питательной среде без добавления твина в среду максимальное накопление лимонной кислоты имеет место при скоростях разбавления среды в пределах от 0,02 до 0,05 час1. Средний выход лимонной кислоты в данном интервале составляет 86,6±1%. При добавлении твина на вторую стадию ферментации концентрация лимонной кислоты держится на довольно высоком уровне при скорости разбавления среды до 0,06 час-1, а средний выход лимонной кислоты в интервале значений Д от 0,02 до 0,05 час1 составляет 89,4±1% (табл.9).

При ферментации гриба на синтетической сахаросодержащей среде добавление оптимальных значений твина позволяет вести процесс при скоростях разбавления среды до 0,06-0,07 час1.

Ведение процесса при больших по сравнению с контрольными вариантами значениях скоростей разбавления среды способствует значительному увеличению продуктивности процесса. Как показывают результаты, представленные на рис. 15, в контрольных вариантах максимальная продуктивность процесса имеет место при Д= 0,05 и выше, а в опытных - при Д=0,06 час-1 и выше. С увеличением скорости разбавления среды в обоих вариантах возрастает концентрация остаточного сахара в среде. Результаты проведенных исследований показали, что в контрольном варианте возможно ведение ферментации при Д=0,05, при этом продуктивность процесса составляет 1,9 г/л»час, а концентрация остаточного сахара в среде -0,045%. В опытных вариантах целесообразней ведение процесса при Д=0,06-0,05 час-'. Дальнейшее увеличение скорости разбавления среды и в том и в другом вариантах приводит лишь к незначительному увеличению продуктивности процесса, а содержание остаточного сахара в среде значительно возрастает.

Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что при непрерывной ферментации гриба влияние твина-40 на рост гриба и биосинтез лимонной кислоты зависит от условий ферментации и морфологического состояния культуры. При двухстадийной ферментации добавление твина-40 на стадию роста гриба так же, как и при одностадийной непрерывной ферментации не

Таблица 3.

Влияние оптимальных концентраций твин-40 на биосинтез лимонной кислоты при

двухстадийной ферментации в зависимости от скорости разбавления Среды_

Контроль 1 Опыт с добавлением твин-40

м Скорость Мелассная питательная Сахаросодержащая среда Мелассная питательная Сахаросодержащая среда

па разбавления среда среда

среды, Концентрация Выход от Концентрация Выход от Концентрация Выход от Концентрация Выход от

час1 лимонной сахара, % лимоннои сахара, % лимоннои сахара, % лимоннои сахара, %

кислоты, г/л кислоты, г/л кислоты, г/л кислоты, г/л

0,02 85 89,4 87 91,5 86 90,5 87 91,5

2 0,03 83 87,3 85 89,4 87 91,5 90 94,7

3 0,04 79 83,1 81 85,2 85 89,5 90 94,7

4 0,05 76 80,0 77 81,0 85 89,5 87 91,5

5 0,06 71 74,7 .73 76,8 82 86,3 85 89,4

6 0,07 64 61,Ъ 66 69,5 73 76,8 81 85,2

7 0,08 55 57,9 58 61,0 67 70,5 65 78,9

8 0,1 45 47,3 53 55,8 54 56,8 64 72,6

Концентрация сахара - 95 г/л. Концентрация твина-40 - 50 мг/л. Рабочий объем ферментеров- 3 литра.

приводило к заметному увеличению концентрации лимонной кислоты в среде. Больший эффект стимуляции биосинтеза лимонной кислоты достигался при добавлении твина на вторую стадию ферментации. При этом продуктивность процесса возрастала с 1,9 г/л«час (в контрольном варианте при Д=0,05 час-1) до 2,5 г/л»час (при Д=0,07 час1), концентрация остаточного сахара в среде не превышала 0,5%.

о се

Сг <

Сн

Z.S

1.0

iS-

ьР Е-1 О

О

§ 4о

о

Ol, С!

0,5

ifi

о, 8

■0,6

0,4

о, г

„ » ж—I-1-1-1-1-1-1 * ,

0,ог 0,03 О,Of 0,050,060,07 0,08О,OS 0,i _т

скорость разбавления среды (час ]

ей Рч ей X ей о

о

Сч

о ж Р1 о

Е-| ей Е-> О

о

tfi К

Я" <й а,

Е*

ж

(К

И"

ж о к

Рис. 15. Продуктивность процесса при добавлении оптимальных концентраций твина на стадию биосинтеза лимонной кислоты: Мелассная питательная среда:

1 - контроль; 2 - опыт с твином. -------остаточный сахар.

Продуктивность рассчитана с учетом суммарного объема первого и второго ферментеров.

Изучение морфологической характеристики гриба при непрерывной ферментации показало, что мицелий гриба при различных режимах культивирования, в том числе при различных скоростях

разбавления среды, имеет явно выраженные различия но размерам и морфологии.

При одностадийной ферментации с увеличением скорости разбавления среды отмечалось уменьшение размеров мицелиаль-ных клеток. Мицелий имел плотную структуру, аналогичную структуре в фазе роста гриба при периодическом способе ферментации. Со снижением скорости разбавления среды размер ми-целиальных клеток увеличивался, клетки имели более рыхлую структуру. Подобные морфологические изменения, по всей вероятности, связаны с длительностью пребывания культуры в среде под воздействием кислых значений рН.

При двухстадийной ферментации величина скорости разбавления среды оказывала не столь существенное влияние на размер и морфологию клеток. Возможно, это связано с тем, что при двухста-дийном культивировании первая стадия характеризуется как стадия роста гриба, и минеральный состав и физико-химические параметры среды в данном случае более благоприятны для роста, чем при одностадийном культивировании.

Как показали сравнительные исследования ультраструктуры мицелия, добавление оптимальных концентраций твина на вторую стадию приводит к изменению проницаемости клеток, но клетки за время пребывания в среде не разрушаются, а накапливают более высокое, чем в контрольном варианте, количество лимонной кислоты. Ультраструктура клеток в данном случае в какой-то мере соответствует структуре клеток 4-5-суточной культуры при периодическом способе ферментации

Сравнительные данные по эффективности биосинтеза лимонной кислоты грибом А.ш§ег Р-718 при различных способах ферментации представлены в таблице 10.

Таким образом, селекционированный штамм гриба А.ш'§ег Р-718 обладает высокой активностью биосинтеза лимонной кислоты при периодическом и непрерывном режимах ферментации, устойчив к более кислым значениям рН среды и высоким концентрациям сахара в период роста.

Разделение стадий роста гриба и биосинтеза им лимонной кислоты, а также оптимизация параметров на каждой из стадий позволило ведение процесса в непрерывном режиме с высокой продуктивностью. При оптимальном режиме двухстадийной ферментации продуктивность биосинтеза лимонной кислоты селекционированным штаммом возрастает в 5 раз по сравнению с периодическим и в 1,8 раза по сравнению с одностадийным непрерывным режимом ферментации.

- нч-

Таблица 10

Эффективность биосинтеза лимонной кислоты грибом А.г^ег Р-718 при различных способах ферментации

ЛСз пп Режим ферментации Продуктивность, г/л »час Концентр, остаточного сахара, %

I Периодический 0,47 0,25

2 Пери одический при добавлении оптимальных концентраций твина-40 0,51 0,22

3 Непрерывный одностадийный 1,35 0,25

4 Непрерывный одностадийный при добавлении твина-40 1,3 0,25

5 Двухстадийный непрерывный 2,2 0,4

6 Двухстадийный непрерывный при добавлении твина на первую стадию 2,2 0,4

7 Двухстадийный непрерывный при добавлении твина на вторую стадию 2,4 0,4

Ферментация во всех случаях проводилась на мелассной питательной среде.

ВЫВОДЫ '

1. В результате многократного отбора и обработки мицелия гриба химическими мутагенами получен мутантный штамм гриба А.ш§ег Р-718, отличающийся от исходного штамма высокой активностью образования лимонной кислоты при периодической и непрерывной ферментации. По сравнению с исходным штаммом, полученный штамм синтезирует в среднем на 17% больше лимонной кислоты.

Испытания штамма в промышленных условиях показали, что ш гамм не утрачивает стабильности свойств и накапливает в промышленных ферментерах до 14,5% лимонной кислоты, против 10,2 и 11,2% в контрольных вариантах.

-Подобран и оптимизирован состав биологически активного наполнителя конидий, способст вующего повышению биохимической активности посевного материала.

Испытания наполнителя конидий в промышленных условиях обеспечило сокращение цикла прорастания и увеличение съема ли-

- <УГ-

монной кислоты (по сравнению с конт рольным наполнителем) на 8,3%.

2. Показана высокая эффективность сорбционной очистки мелассы от нежелательных примесей с помощью клиноптилолита. Применение данного способа очистки способствует более полному удалению избытка железа из среды и сокращению числа технологических операций на стадии приготовления сырья.

3. Обнаружено существенное влияние начальной величины рН среды на активность биосинтеза лимонной кислоты при периодической ферментации гриба.

Установлено, что оптимальные для биосинтеза лимонной кислоты значения рН зависят от состава и качества сырья. При ферментации гриба на синтетической питательной среде оптимальная для биосинтеза лимонной кислоты начальная величина рН составляет 2,5; на мелассной питательной среде - оптимальные для синтеза лимонной кислоты величины рН лежат в пределах 4,5-5,5.

4. Установлена взаимосвязь начальной величины рН среды с размером мицелиального клубка и активностью биосинтеза лимонной кислоты. Показано, что чем ниже начальная величина рН тем мельче и плотнее мицелий и тем выше активность синтеза лимонной кислоты грибом.

5. Исследования ультраструктуры мицелия на разных стадиях развития гриба позволили выявить ряд общих закономерностей, характеризующих особенности культуры в фазах роста и продуцирования лимонной кислоты:

Установлено, что переход культуры на продуцирование лимонной кислоты сопровождается разрыхлением цитоплазмы и частичным лизисом клеточной стенки на начальном этапе (через 72 часа от начала ферментации) и существенным нарушением целостности структуры, а также увеличением проницаемости клеток в период интенсивного накопления лимонной кислоты (120 часов). Снижение и прекращение накопления лимонной кислоты грибом (144-168 часов) сопровождается появлением в среде более 50% полупустых и пустых нефункционирующих клеток.

6. Показана возможность управления процессом экскреции лимонной кислоты и сокращения продолжительности ферментации путем добавления в питательную среду соединений, влияющих на проницаемость клеток микроорганизмов, в частности, твина-40.

Электронно-микроскопические исследования морфологии и структуры гриба в присутствии гпина в среде показали, что ультраструктура мицелиальных клеток 5-ти суточной культуры, выращиваемой при добавлении оптимальных концентраций твина, аналогична ультраструктуре 7-ми суточной культуры без добавления твина.

7. Установлено, что несмотря на взаимосвязь условий культивирования и образования лимонной кислоты, оптималные условия для роста гриба и биосинтеза лимонной кислоты не совпадают. Максимальная эффективность по данным показателям достигается при двухстадийном непрерывном ведении процесса при установлении стабильного режима для каждой стадии отдельно. Оптимизация параметров каждой стадии позволило вести процесс в непрерывном стабильном режиме с продуктивностью 2,4 г/л.час против 0,51 г/л.час при периодической и 1,35 г/л.час при непрерывной одностадийной ферментации.

Разработанные технологические режимы приняты к внедрению на Белгородском заводе лимонной кислоты. Проведенные исследования легли в основу исходных данных для организации непрерывного способа производства лимонной кислоты и ее водных растворов в России и за рубежом.

Основные положения диссертации отражены в следующих публикациях

1. Авчиева П.Б., Винаров А.Ю. Биосинтез лимонной кислоты му-тантным штаммом C.lipolvtica 917. - Биотехнология, 1992, № 3, с. 65-68. '

2. Авчиева П.Б., Винаров А.Ю. Закономерности биосинтеза лимонной кислоты микроорганизмами при непрерывной ферментации. - Процессы и аппараты химико-фармакологических производств. 1992, вып.3, с. 1-26.

3. Авчиева П.Б., Винаров А.Ю. Биосинтез лимонной кислоты из глюкозы при непрерывной ферментации. Экскреция лимонной кислоты. - Биотехноло1 ия, 1992, №1, с. 46-49.

4. Авчиева П.Б., Винаров А.Ю. Получение мутантов дрожжей C.lipolytica-активных продуцентов лимоннои кислоты. - Микробиология, 1993, в. 2, т. 62, с/243-248.

5.Авчиева П.Б., Винаров А.Ю. Непрерывный способ производства лимонной кислоты из н-парафинов. - Тезисы докладов всесоюзной конференции "Концепция создания экологически чистых регионов' , Волгоград, 28-31 мая 1991, с.52.

6. Avchieva Р.В., Vinarov A.J.

Contonuous fermentation for the production of citric acid. - Proceeding of the confcrence "Interbiotech-91 , Bratislava, July 22-23, 1997. p.27.

7. Авчиева П.Б., Винаров А.Ю. Биосинтез лимонной кислоты при непрерывной ферментации A.niger. - Прикладная биохимия и микробиология, 1993, в. 4, т. 29, с. 567-5758. Авчиева П.Б., Винаров А.Ю., Козлова И.А. Сорбционная очистка среды при биосинтезе лимонной кислоты. - Биотехнология, 1993, №11-12, с.42-45.

9. Авчиева П.Б., Винаров А.Ю. Побочные продукты производства лимонной кислоты - компоненты комбикормов. - Комбикормовая промышленность, 1994, № 1, с. 33-34.

10. Авчиева П.Б., Винаров А.Ю. Углеводно-минеральный концентрат. - Комбикормовая промышленность,

1994, №1, с. 32.

11. Авчиева П.Б., Винаров А.Ю. Новый биопрепарат. - Комбикормовая промышленность, 1994, № 1, с. 32.

12. Авчиева П.Б., Винаров А.Ю. Кормовые продукты с помощью биотехнологии. - Комбикормовая промышленность, 1994, № I, с.

13. Авчиева П.Б., Винаров А.Ю. Способ получения посевного материала в производстве лимонной кислоты. - Заявка на патент № 941)17790, 1994. Решение о выдаче 1995 г.

14. Авчиева П.Б. Способ получения лимонной кислоты и ее солей. -Заявка на патент №95116057, 1995. Решение о выдаче 1996 г.

15. Авчиева П.Б. Штамм гриба A.niger F-718 - продуцент лимонной кислоты. - Заявка на патент № 95 П 6989, 1995. Решение о выдаче 1996 г.

16. Авчиева П.Б., Винаров А.Ю. , Козлова И.А. Питательная среда для получения лимонной кислоты. Патент России 2007459, 1995.

17. Авчиева П.Б.. Винаров А.Ю., Понамарева Т.А. Способ подготовки мелассы к ферментации при производстве лимонной кислоты Заявка па патент 931)39026, 1995. Решение о выдаче 1996 г.

18. Авчиева П.Б., Винаров А.Ю. Непрерывный способ получения лимонной кислоты, Патент России 200/689, 1996.

19. Авчиева П.Б., Винаров А.Ю. Способ получения лимонной кислоты в непрерывном режиме. Заявка на патент № 94012671, 1996. Решение о выдаче 1996 г.

20. Авчиева П.Б. Производство лимонной кислоты путем непрерывной ферментации гриба A.niger. - МГЦНТИ, 1996, № 1-96, 2 с.

21. Авчиева П.Б. Подготовка среды к ферментации в производстве лимонной кислоты. - МГЦНТИ, 1996, №2-96, 2 с.

22. Авчиева П.Б. Производство лимонной кислоты на основе продуктов переработки зерна. - МГЦНТИ, 1996, № 3-96, 3 с.

23. Авчиева П.Б., Минченко Т.В. Способ гидролиза протопентина с помощью лимонной кислоты. Заявка на патент

№ 9?fOfûSO, 1996.

Решение о выдаче 1997 г.

24. Авчиева П.Б. Производство лимонной кислоты. - Тезисы докладов конференции-выставки "Достояния Российской Биотехнологии", Берлин, 1996, с. 43-44.

25. Авчиева П.Б. Continuous method of cittric acid production. - Заявка на патент Малайзии № . 1997г.

26. Авчиева П.Б. Food citric acid and a method of its production. - Заявка на патент Малайзии № .1997г.

27. Авчиева П.Б. Пишевая лимонная кислота и способы ее получения. Заявка на патент России.

28. Авчиева П.Б. Установка для сорбционной очистки мелассных растворов. - МГЦНТИ, 1997, №3-97Гс. 1-4.

29. Авчиева П.Б. Технология применения нового физиологически активного наполнителя при производстве лимонной кислоты. -МГЦНТИ, 1997,№ 1-97, сЛ-3.

30. Авчиева П.Б. Сорбционный способ очистки среды при биосинтезе лимонной кислоты. - МГЦНТИ, 1997, № 2-97, с. 1 -3.

31. Авчиева П.Б. Влияние способа подготовки мелассы к ферментации на синтез лимонной кислоты и качество мицелия гриба Ал^ег. - Биологическая технология, 1997, вып. 2, с. 1-35.

32. Авчиева П.Б. Отбор активных продуцентов лимонной кислоты. - Биологическая технология, 1997, вып. 2, с. 1- 40.

Лицензия ЛР № 040211 от 7.04.97 г.

Подписано в печать 2.02.98 г. Формат 60 х 84 1/16. Бумага газетная. Гарнитура Тайме. Печать офсетная. Усл. печ. л 2,79. Уч.-печ. л. 3,00. Тираж 100 экз. Заказ 2036. Отпечатано с готового оригинала-макета

в типографии Издательства МАИ 125871, Москва, Волоколамское шоссе, 4.

f

Ii il

j ; 7"";

Ä...... 9¿¡

ii V

//. ,/V J" / ' ^ 0 <V МИНИСТЕРСТВО ЭКОНОМИКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ БИОСИНТЕЗА БЕЛКОВЫХ ВЕЩЕСТВ (ГосНИИсинтезбелок)

АВЧИЕВА Пенкер Бабаевна

УДК 577.15.062:577.158.4

НАПРАВЛЕННЫЙ БИОСИНТЕЗ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ ПРИ ПЕРИОДИЧЕСКОЙ И НЕПРЕРЫВНОЙ ФЕРМЕНТАЦИИ ГРИБА Aspergillus niger

Специальность 05.18.18 «Технология биологически активных

веществ»

Диссертация

на соискание ученой степени доктора технических наук

Научный консультант

доктор технических наук, профессор Александр Юрьевич ВИНАРОВ

Москва - 1997

- г, -

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР......................................Щ-бЗ

1.1. Микробиологический синтез лимонной кислоты. Сырье и продуценты. Селекция высокопродуктивных штаммов гриба А.ш§ег. Требования, предъявляемые к ним......................................................................................

1.2. Механизм и основы направленного микробиологического синтеза лимонной кислоты....................................... $0~3В

1.3. Динамика биосинтеза лимонной кислоты грибом А.ш§ег и ассимиляция источника углерода и компонентов минерального питания................................32

1.4. Основные технологические этапы получения лимонной _ кислоты................................................................................ ¿/¿"-^

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.........................................

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ......... Ь'Ч -

2.1. Продуценты лимонной кислоты и методы их культивирования................................................................................ 6 У - Л

2.2. Селекция гриба А.ш§ег......................................................5? - 5 $

2.3. Получение конидий для поверхностной ферментации.... 62 " 6

2.4. Методы контроля роста и биосинтеза лимонной

кислоты, определения компонентов минерального у питания в среде................................................................... ^ " о /

Глава 3. СЕЛЕКЦИЯ ГРИБА А.МСЕИ И ОТБОР

АКТИВНЫХ ПРОДУЦЕНТОВ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ..................................................................

3.1. Получение мутантов А.г^ег и селекция активных

продуцентов лимонной кислоты...................................... 6*3 ~

3.2. Изучение способности биосинтеза лимонной кислоты грибом A.niger F-718 при поверхностном и глубинном способах ферментации....................................................... Ёб^б^

3.3. Влияние наполнителей конидий на физиологическую активность посевного материала.......................................&&'

Глава 4. ПОДГОТОВКА МЕЛАССЫ К

ФЕРМЕНТАЦИИ.......................................................& " Н6

4.1. Влияние способа подготовки мелассы к ферментации на

биосинтез лимонной кислоты.............................................99 -//6

Глава 5. ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ НАПРАВЛЕННОГО БИОСИНТЕЗА ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ ГРИБОМ A.NIGER...................................................." í6á

5.1. Влияние состава и физико-химических факторов среды

на биосинтез лимонной кислоты при периодической ^^ ферментации гриба.............................................................."

5.1.1. Влияние компонентов минерального питания............../105.1.2. Влияние начальной величины рН среды на биосинтез

лимонной кислоты и морфологию гриба........................ ^

5.2. Физико-биохимические закономерности биосинтеза и экскреции лимонной кислоты............................................ i1/в -

5.2.1. Электронно-микроскопические исследования структуры клеток гриба в процессе ферментации......................6

5.2.2. Влияние ПАВ на биохимическую активность гриба и экскрецию лимонной кислоты........................................ /SS-

Глава 6. ПОЛУЧЕНИЕ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ ПРИ

НЕПРЕРЫВНОЙ ФЕРМЕНТАЦИИ ГРИБА у „

А • Т- TIO /б?"

A.niger F-718.................................................................'

6.1. Зависимость роста гриба и биосинтеза лимонной

кислоты от скорости разбавления среды.......................... 1У-3

ч

6.2. Биосинтез лимонной кислоты при двухстадийной непрерывной ферментации гриба.....................................

6.3. Морфологическая характеристика культуры гриба в процессе непрерывной ферментации................................

Глава 7. ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ БИОТЕХНОЛОГИИ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ И ЗАДАЧИ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ПРОИЗВОДСТВА.... ^

7.1. Обсуждение свойств и критерии выбора потребителей биомассы мицелия гриба A.niger......................................^ ~ ^^

7.2. Оценка мицелия как корма для сельскохозяйственных животных............................................................................- &

7.3. Амилолитичесая активность мицелия. Использование мицелия для ферментативного гидролиза

крахмалсодержащего сырья.............................................. 6 "

1 А. Биосинтез лимонной кислоты на гидролизованных

средах зерновых продуктов.............................................. Zs/sf-

7.5. Получение водных растворов лимонной кислоты.

Испытания в производстве консервных продуктов....... ¿¿^ ~ ^

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ..........................................Ш

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ......................................................................¿ь*-л&3

ВЫВОДЫ.................................................................................¿36--Ш

ЛИТЕРАТУРА ........................................................................

ПРИЛОЖЕНИЯ......................................................................

- Акт промышленной проверки и внедрения штамма грибаA.nigerF-718...............................................................

- Рекомендации по получению посевного материала и ферментации гриба A.niger в производстве

лимонной кислоты в условиях Белгородского .,, завода лимонной кислоты...................................................... "

- -

- Титульный лист ТУ "Биомасса мицелия гриба".................. ¿¿Ч

- Акт испытаний мицелия в кормлении норок....................... Лб-Г-Мб

- Титульный лист "Кислота лимонная пищевая водный раствор ............................

......................................... ¿6?

- Методика определения лимонной кислоты в биомассе микроорганизмов..................................................

- 6 -ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Одной из основных задач биотехнологии на современном этапе является разработка технологий, призванных ликвидировать нехватку пищевых продуктов, кормовых ресурсов, улучшить охрану окружающей среды, с одной стороны, а с другой - предстоит решение задачи безотходных технологических процессов, то есть без сброса промышленных сточных вод в водоемы. Решение этих вопросов требует досконального изучения путей и методов регуляции метаболизма микробной клетки, обеспечивающих направленный биосинтез ценных для народного хозяйства метаболитов.

Научные разработки, излагаемые в данной диссертационной работе, содержат новые принципиальные решения и подходы к организации непрерывного процесса производства лимонной кислоты и мицелиальной биомассы гриба А.г%ег.

Среди метаболитов, продуцируемых микроорганизмами, широкое применение в народном хозяйстве находят пищевые кислоты, в частности лимонная кислота. Благодаря своим вкусовым и физико-химическим свойствам она широко применяется в пищевой, медицинской, фармацев-

ч/ и Тч _

тическои, косметической промышленности. В пищевои промышленности лимонная кислота в основном применяется в процессе производства кондитерских изделий, в производстве алкогольных и безалкогольных напитков, ею обрабатывают мясо, рыбу, фрукты для стабилизации аромата и цвета. Введение этой кислоты с продуктами питания в организм стимулирует секреторные функции поджелудочной железы, усиливая выделение поджелудочного сока и повышая усвояемость пищи. Для человека приемлема суточная доза лимонной кислоты 50-120 мг/кг.

- f -

Продукты, содержащие лимонную кислоту, человек использует в питании с древнейших времен. Целенаправленное получение и использование данной кислоты для придания продуктам кислого вкуса началось в XYIII веке после открытия шведским химиком В.К.Шееле лимонной кислоты в плодах цитрусовых.

Интерес ученых к лимонной кислоте, как к продукту микробного метаболизма, возник после того, как в 1905 г. немецкий ботаник К.Вемер открыл способность двух видов грибов - Citromyces pfefferianis и Citromy-ces glaber образовывать лимонную кислоту как результат аэробного брожения. Позднее было установлено, что лимонную кислоту на сахарных средах могут образовывать также грибы Strigmatocystis nigra и Aspergillus niger. Дальнейшими исследованиями было показано, что продуктивность образования лимонной кислоты у A.niger выше, чем у остальных исследованных грибов.

С тех пор исследованиям по образованию лимонной кислоты указанным грибом в зависимости от условий культивирования, от источника углерода, минерального состава питательной среды и т.д. посвящены научные труды ученых многих стран мира.

После изучения и освоения микробиологического способа производства этой кислоты объемы промышленного производства данным способом неуклонно возрастают. На сегодняшний день самым крупным производителем лимонной кислоты являются США, в частности фирмы «Ch.$dZ^\«Miles Laboratories, 1пс», которые вырабатывают ее как внутри страны, так и на своих предприятиях во многих других странах.

В России в настоящее время лимонную кислоту вырабатывают в основном на Белгородском заводе лимонной кислоты. Большую роль в развитии и совершенствовании отечественного производства сыграли на-

учные и практические разработки сотрудников Санкт-Петербургского ВНИИ пищевых ароматизаторов, кислот и красителей.

В последствии в ИБФМ под руководством Т.В.Финогеновой были начаты и продолжаются по настоящее время исследования по подбору других продуцентов лимонной кислоты и источников сырья.

В ГосНИИсинтезбелок под руководством проф. Винарова А.Ю. разработаны и реализуются методы оптимального технологического проектирования модульных установок по получению лимонной кислоты из различных субстратов.

Таким образом на сегодняшний день накоплен достаточно большой опыт в области получения и производства лимонной кислоты. Однако в промышленных условиях ее в основном производят путем периодической глубинной ферментации гриба Aspergillus niger на сахаро- и крахмалосо-держащих средах.

В Италии и Японии производят небольшое количество лимонной кислоты путем периодической ферментации дрожжей на средах, содержащих в качестве источника углерода н-парафины.

Несмотря на то, что ежегодный объем мирового производства лимонной кислоты на основе указанных выше источников углерода достигает 450 тыс. тонн в год, потребность в ней удовлетворяется далеко не полностью. Доля лимонной кислоты на душу населения в нашей стране в настоящее время в 2,8 раза ниже, чем в ведущих капиталистических странах. В связи с чем особую актуальность в настоящее время приобрели разработки, направленные на интенсификацию и повышение производительности данного производства. К проблемам данного производства относятся также высокие затраты сырья, энергии, топлива и воды, что приводит к увеличению себестоимости продукта. Снижение удельного расхода этих показателей может быть достигнуто путем использования высокопродук-

тивных штаммов - продуцентов лимонной кислоты, применения стимуляторов кислотообразования, совершенствования технологии и аппаратурного оформления технологического процесса.

Основной энергоемкой и наиболее трудоемкой стадией производства лимонной кислоты является стадия ферментации. Продолжительность этой стадии при периодическом способе производства составляет 79 суток, а концентрация лимонной кислоты в среде достигает 10-14%.

Основным критерием оценки эффективности стадии ферментации является производительность процесса, что определяется продолжительностью ферментации и концентрацией конечного продукта в среде. Поэтому проблемы интенсификации производства лимонной кислоты, увеличения и снижения себестоимости продукции относятся к первоочередным задачам данного производства.

Исследованиями последних лет показано, что оптимизация стадии ферментации, в том числе и сокращение ее продолжительности, позволяет значительно повысить эффективность всего процесса производства лимонной кислоты. Одним из перспективных направлений, обеспечивающих оптимизацию этой стадии, является разработка технологии непрерывного процесса производства лимонной кислоты. Реализация этих задач и максимальное использование всех возможностей производства в целом требует значительно более глубокого изучения физиолого-биохимических закономерностей и особенностей, связанных как с ростом культуры, так и с биосинтезом лимонной кислоты.

Изучению указанных закономерностей при периодическом и непрерывном способах ферментации гриба Aspergillus niger на средах, содержащих различные источники углерода, и разработке непрерывной ферментации продуцента лимонной кислоты и посвящено настоящее исследование.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение закономерностей биосинтеза лимонной кислоты при периодической и непрерывной ферментации гриба Aspergillus niger, а также оптимизация условий биосинтеза биомассы и лимонной кислоты.

В связи с этим в число основных задач настоящей диссертационной работы входило:

- подбор высокоактивных штаммов гриба A.niger - продуцентов лимонной кислоты;

- изучение влияния способа очистки мелассных питательных сред на биосинтез лимонной кислоты;

- изучение условий получения посевного материала, обеспечивающих максимальное кислотообразование продуцентом;

- изучение биохимических закономерностей биосинтеза и экскреции лимонной кислоты в зависимости от физиологического и морфологического состояния культуры;

- подбор и оптимизация условий, обеспечивающих направленный биосинтез лимонной кислоты при непрерывном способе ферментации продуцента;

- разработка технологического режима производства лимонной кислоты при непрерывной ферментации гриба Aspergillus niger.

Научная новизна работы. Детально изучены биохимические закономерности биосинтеза и экскреции лимонной кислоты грибом A.niger при периодической и непрерывной ферментации в зависимости от физиологического и морфологического состояния культуры.

Впервые исследована ультраструктура мицелия гриба в фазе роста и биосинтеза лимонной кислоты при периодической и непрерывной ферментации гриба. Показано, что биосинтез и экскреция лимонной кислоты зависят от фазы роста культуры и проницаемости клеточной мембраны.

- а -

Максимальное накопление лимонной кислоты в среде имеет место в стационарной фазе; морфологические исследования клеток в этот период показывают нарушение целостности их структуры.

Показано, что условия получения и активность посевного материала существенно влияют на активность биосинтеза лимонной кислоты грибом. Наибольшая активность образования лимонной кислоты отмечается при использовании посевного материала, полученного путем подращивания мицелия гриба на среде, содержащей 2% редуцирующих веществ и оптимальные концентрации цинка, кобальта и молибдена.

Впервые показана возможность удаления избытка минеральных элементов из мелассных сред, особенно железа, путем сорбционной очистки с применением клиноптилолита. Очистка мелассы с помощью кли-ноптилолита исключает наличие в среде свободного ферроцианида и облегчает процесс подготовки мелассы к ферментации, так как при этом отсутствуют стадия обработки мелассы гексацианоферроатом калия и стадия нейтрализации свободных цианидов, что обеспечивает экологическую чистоту этого процесса.

Впервые установлена взаимосвязь между начальной величиной рН среды, размером мицелиального клубка и активностью биосинтеза лимонной кислоты грибом. Показано, что чем ниже начальная величина рН, тем мельче и плотнее мицелий и тем выше активность синтеза лимонной кислоты.

Показана возможность организации производства лимонной кислоты путем ферментации гриба в непрерывном двухстадийном режиме. При этом первая стадия характеризуется как стадия роста культуры, а вторая -стадия биосинтеза лимонной кислоты. Показана возможность индукции экскреции лимонной кислоты на второй стадии с применением пермеаби-лизирующих реагентов, (твин-40 и твин-80).

-

Практическая ценность работы заключается в том, что разработаны технологические способы интенсификации по основным стадиям производства лимонной кислоты, в частности, по стадиям подготовки мелассы к ферментации, получения посевного материала, ферментации, в том числе при одно- и двухстадийной непрерывной ферментации. Данные разработки позволили интенсифицировать процесс биосинтеза лимонной кислоты, а также обеспечить экологически безопасную и экономически эффективную технологию получения лимонной кислоты.

Селекционирован и испытан в промышленных условиях высокопродуктивный штамм гриба A.niger Р-718. В результате промышленных испытаний показано, что штамм по морфологическим, биохимическим и технологическим особенностям удовлетворяет требованиям, предъявляемым к продуцентам лимонной кислоты в промышленных условиях. Штамм накапливает в промышленном ферментере объемо/ч 100 м3 до 14,4% лимонной кислоты.

На основании промышленных испытаний выданы рекомендации по подготовке питательных сред к ферментации и по технологии получения посевного материала.

На основе результатов работы разработаны исходные данные для организации промышленного производства лимонной кислоты непрерывным способом. Промышленная реализация технологии осуществляется в условиях Белгородского завода лимонной кисл