автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Комплексная технология биологически активной добавки к пище "Тинростим" и препарата холинэстеразы из ганглиев кальмаров

На правах рукописи

МИХЕЕВ Евгений Валерьевич

КОМПЛЕКСНАЯ ТЕХНОЛОГИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ДОБАВКИ К ПИЩЕ «ТИНРОСТИМ» И ПРЕПАРАТА ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ ИЗ Г АНГЛИЕВ КАЛЬМАРОВ

Специальности: 05 Л 8.07 - биотехнология пищевых продуктов

(биотехнология гидробионтов); 03.00.04 - биохимия (технические науки)

~ з ДЕК 2009

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Владивосток - 2009

Работа выполнена в лаборатории биохимии гидробионтов Федерального государственного унитарного предприятия «Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр» (ФГУП «ТИНРО-Центр»).

Научный руководитель доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Ковалев Николай Николаевич

Официальные оппоненты доктор технических наук,

старший научный сотрудник Ярочкин Альберт Павлович кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Корчагин Владимир Павлович

Ведущая организация ФГУП «Государственный

научно-исследовательский институт органической химии и технологии» (ФГУП « ГосНИИ ОХТ»)

Защита диссертации состоится 23 декабря 2009 г. в 13.30 на заседании диссертационного совета Д 307.012.01 при ФГУП «Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр» по адресу: 690091, г. Владивосток, яер. Шевченко, 4, факс: (4232) 300-751.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ТИНРО-Центр»

Автореферат разослан 20 ноября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

О.С. Темных

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Среди головоногих моллюсков особое промысловое значение имеют кальмары, мышечные ткани которых составляют до 52 %. Около 32 % массы приходится на отходы - печень, пищеварительную систему, гонады и ганглии. Известны технологии переработки внутренних органов кальмаров для получения лечебно-профилактических жиров как БАД к пище (Новгородцева и др., 2007), щелочных и кислых фосфатаз из гонад (Касьянеико и др., 1980; Розенгарт и др., 1993), БАД <<Артротин» из хрящевой ткани (Клыч-кова, 2004; Пивненко и др., 2005), БАД «Тинростим» из ганглиев (Эпштейн и др., 1997). Известная технология получения БАД «Тинростим» (ТИ 36-278-05) из ганглиев кальмаров многостадийна, требует больших затрат ацетона, что предъявляет особые требования к организации производства.

Исследования последних лет показали наличие высокой холинэстеразиой активности в нервной ткани у различных видов гидробионтов, в том числе кальмаров (Козловская и др., 1990; Jebali et al., 2006; Podolska, Napierska, 2006). Интерес к холинэстеразам (ХЭ) объясняется той ролью, которую играет фермент нервной ткани в быстропротекающих процессах синаптической передачи. Известно использование ХЭ как биохимического реактива при оценке эффективности инсектицидов и высокотоксичных фосфорорганических соединений, а также лекарственных средств (Садыков и др., 1976; Бресткин и др., 1997).

Несмотря на то что ранее фермент ацетилхолинэстераза (АХЭч) из эритроцитов донорской крови человека как биохимический реактив производился в России на нескольких предприятиях, ферменты из органов и тканей гидробионтов, в частности кальмаров, в промышленных масштабах не производятся. Повышенные требования к контролю безопасности производств и охраны окружающей среды привели к разработке ряда ферментных тест-систем с использованием ХЭ для оценки уровня загрязнений, в том числе промышленными и бытовыми ядами (Стойкова и др., 2000; Beljakova et al., 2001). Основываясь на знании различий в физико-химических свойствах БАВ нервной ткани, представляется актуальным создание комплексной технологии переработки нервной

ткани головоногих моллюсков для получения БАД «Тинростим» и препарата ХЭ из одного источника в одном технологическом процессе.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явились поиск и характеристика сырьевых источников, а также разработка биотехнологических способов получения фермента холинэстеразы и БАД «Тинростим» из нервной ткани гидробионтов в одном технологическом процессе.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

— разработать модифицированный способ получения БАД «Тинростим»;

— обосновать использование зрительных ганглиев головоногих моллюсков как сырья для производства ХЭ;

— определить рациональные параметры экстракции ХЭ из нервной ткани кальмаров;

— обосновать технологию выделения фермента по характеристике конечного продута (термостабильность, субстратная и ингибиторная специфичность);

— обосновать технологию получения БАД «Тинростим» и препарата холинэстеразы в одном технологическом цикле.

Научная новизна работы. Определены рациональные параметры хранения и обработки сырья - нервных ганглиев кальмаров.

Впервые:

— определена биологическая активность различных по молекулярной массе белковых фракций БАД «Тинростим» и обоснована модификация метода его получения;

— установлено влияние детергента (тритона Х-100), целлюлолитических и протеолитических ферментов на экстрактивность ХЭ из мороженых и сублимированных ганглиев кальмаров;

— определены субстратная и ингибиторная специфичности, термостабильность и электрофоретическая характеристика очищенного фермента ХЭ из ганглиев кальмаров;

— из одного вида сырья в одном технологическом процессе выделены и охарактеризованы БАД «Тинростим» и препарат ХЭ;

— научно обоснована технология получения ферментного препарата ХЭ из сублимированных ганглиев кальмаров.

Практическая значимость работы. Выполненные исследовагам послужили основанием для выбора наиболее перспективного источника получения фермента. Разработаны модификация способа получения БАД «Тинростим»; способ заготовки и хранения сырья - сублимированных ганглиев тихоокеанского кальмара; технология получения фермента холнгостеразы, в основу которой положен метод дробного высаливания сульфатом аммония; технологическая схема получения из одного вида сырья в одном технологическом цикле БАД «Тинростим» и препарата ХЭ. Разработана и утверждена нормативная документация на «Препарат фермента пропионил-холинэстеразы» (ТУ № 9289-295-00472012-05). Выпущена опытно-промышленная партия препарата фермента в количестве 10000 ед. Проведена опытно-промышленная проверка препаратов фермента во ФГУП ГосНИИОХТ, которая показала, что они могут быть использованы при разработке аналитических методик определения остаточного количества фосфорорганических соединений и служить основой разработки метода дифференциального определения различных по структуре фосфорорганических соединений в окружающей среде. Защищаемые положения:

— характеристика субстратной и ингибиторной специфичности является показателем пригодности сырья для получения фермента ХЭ;

— модификация технологии БАД «Тинростим» на основе ультрафильтрации позволяет сохранить его биологическую активность;

— способ получения холинэстеразы, включающий дробное фракционирование, позволяет получить термостабильный, высокочувствительный к ФОС фермент с высокой удельной активностью;

— комплексная технология переработки ганглиев кальмаров на основе ограниченного протеолиза, с использованием мембранных технологий обеспечивает получение препарата ХЭ и БАД «Тинростим» в одном технологическом процессе.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на Первой международной научно-технической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы технологии живых систем» (Владивосток, 2005); на XV ежегодной рабочей встрече North Pacific Marine Science Organization (PICES) (Йокогама, Япония, 2006): на научно-практической конференции «Современное состояние водных биоресурсов», посвященной 70-летию С.М. Коновалова (Владивосток, 2008); на Международной научно-практической конференции «Морские прибрежные экосистемы. Водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки» (Владивосток, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 работы.

Структура Ii объем диссертации. Работа состоит из введения, 3 глав, выводов, списка литературы (156 наименований, в том числе 56 иностранных). Изложена на 123 стр., иллюстрирована 26 рисунками и 29 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Обзор литературы

Рассмотрено строение, свойства и биологическая роль цитомединов и ХЭ нервной ткани. Обобщены данные по технологии выделения и свойствам цитомединов различных тканей животных. Дана характеристика ХЭ разных видов гидробионтов. Рассмотрена эффективность методов выделения и очистки ХЭ. Имеющиеся в литературе данные по способам выделения ХЭ ограничены 5070-ми гг. 20-го века. Данных по выделению ХЭ из сырья морского происхождения (головоногих моллюсков) не обнаружено. Данное обстоятельство обусловливает важность и актуальность проблемы выделения, очистки и характеристики ХЭ как биохимического средства.

Глава 2. Материалы и методы Материалы исследования:

— сублимированные и мороженые ганглии головоногих моллюсков, заготовленные в соответствии с ТИ № 36-46-07; строма эритроцитов человека, полученная по методике Т.Д. Абрамович с соавторами (1973);

— источником фермента служили центрифугаты (1000 g) водных гомоге-пагол тканей (соотношение сырье/вода составляло 10 мг/мл для сырых ганглиев и 1 мг/мл для сублимированных ганглиев);

— ферменшые препараты — пилорин из пилорических придатков лососевых рыб (ТУ 9280-1203-00472012-96), протамеке из Bacillus protease (Denmark). ЦеллоЛюкс-А (ООО ПО «Сиббнофарм»);

— в качестве ингибиторов использовали [(CHi)2CH0]2P(0)F - диизопро-пилфторфосфат (ДФФ) (Sigma); C2II50(CH3)P(0)SC;I I4S+(CI I3)C2H5 - О-этил-З-ф-этилмеркаптоэтил) метилтиофосфанат (ГД-42), синтезированный в Институте эле-менторганических соединений РАН; ингибитор протеаз яичного белка (Sigma).

В качестве субстратов ХЭ использовали тиохолиновые эфиры карбоно-вых кислот - ацетил-, пропионил- и бутирилтиохолин иодиды (ICN, США).

Методы исследования. Холинэстеразную активность определяли калориметрическим методом Эллмана (Ellman et al., 1961) на спектрофотометрах Shimadzu UV-260 и Shimacizu UV-3101PC, кинетические параметры ферментативного гидролиза (Vm и Км) — графически по методу Лайнуивера-Берка (Кор-ниш-Боуден, 1979). Антихоли ну сгеразаос действие фосфорорганических соединений (ФОС) оценивали ио величине бимолекулярной константы кд скорости взаимодействия ХЭ с ингибитором (Яковлев, 1965). Эффективность водной экстракции и солюбилизации ХЭ оценивали по увеличению холинэстеразной активности в центрифугате на 1 мг навески. Термостабильность препаратов определяли по степени инактивация фермента при гермостатировании в течение 1 ч при 50 °С. Анализ состава полученных препаратов осуществляли методом гель-электрофореза (Остерман, 1981). Для выявления ХЭ-активности в гелях использовали тиохолиновый метод (Karnovsky, Roots, 1964). Для разделения компонентов экстракта при получении ферментных препаратов, а также БАД «Тинростим» использовали колонки с мембранами волоконного типа с пределом пропускания молек}'л 1, 10 и 100 кДа. Параметры процесса: скорость - 500 мл/ч; давление - 0,1 кПа; температура 5 °С; время - от 3 ч. Определение содержания белка проводили по методу Лоури (Lowry et al., 1951). Общее содержа-

ние липидов в тканях устанавливали гравиметрически методом Фолча (Folch et al., 1957). Массовую долю воды и растворимость БАД «Тинростим» определяли по Государственной фармакопее (1987). Изоэлектрическую точку — по методу Н.С. Дроздова и Н.П. Материнской (1970).

Иммунологическую активность в тестах восстановления фагоцитарного показателя и фагоцитарного числа исследовали в Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии СО РАМН (г. Владивосток).

Статистическую обработку результатов эксперимента проводили с помощью пакета программ Statistica 6,0 и «Microsoft Excel», определяя стандартное отклонение (5) и доверительный интервал (р).

Глава 3. Результаты и обсуждение 3.1. Характеристика сырья — ганглиев головоногих моллюсков Для нервных ганглиев кальмаров характерно высокое содержание воды и низкое — жира (табл. 1).

Таблица 1

Химический состав не рвных ганглиев кальмаров, %

Вода Жир Белок Минеральные вещества

83,1±1,7 3,60+0,07 11,8±0.9 1,1±0,1

С целью возможного расширения сырьевой базы получения ХЭ и БАД «Тинростим» впервые, с использованием набора тиохолиновых субстратов, проведено исследование ХЭ-активности зрительных ганглиев двух видов каракатиц (Sepiola birostrata, Rossia pacifica), осьминога (Octopus dofleini) и кальмаров (Ommastrephes bartramii, Todarodes pacificus, Watasenia sclntillans, Sepioteuthis lessoniand), а также стромы эритроцитов крови человека в качестве модели (табл. 2).

Основным критерием выбора сырья для выделения фермента являются величина его удельной активности и кинетические параметры гидролиза субстратов, характеризующие принадлежность фермента к тому или иному классу.

Самой низкой активностью среди головоногих моллюсков характеризовался фермент оптических ганглиев осьминога О, dofleini Наиболее высокая

активность фермента кальмаров отмечена в зрительных ганглиях О. ЬаПгати, наименьшая — у IV. зсШШат.

Таблица 2

Удельная активность ХЭ ганглиев различных видов головоногих моллюсков, мкМ АТХ/м г ткани _

Источник фермента Удельная активность

Осюрич сЬАеШ (осьминог ДофлеЛна) 0,1S±0,006

$ср1о!а ЫгомгаШ (селиола двурогая) 0.25±0,03

Лом/а расфсч (россия тихоокеанская) 0,43±0,004

Отта\{гсп/1с.\ Ьагихтш ( кальмар Бартрама) 1.2±0,03

ТоЛапкк? расЩст (кальмар тихоокеанский) 0,7=0,03

\Vatusenia хстШкта (кальмар светлячок) 0,40±0,02

ИгрШсШШ кштшт (кальмар клрахатицевидкый) 0,6±0,01

Строка эритроцитов сублимированная 0,8±0,01

ХЭ изученных видов каракатиц характеризовались более низкой активностью по сравнению с ХЭ эритроцитов. Сопоставимой по активности по сравнению с ферментом стромы эритроцитов была холинэстераза Т. раа/гст. Удельная активность ХЭ О. ЬаПгати была в 1,5 раза выше, чем у ХЭ стромы эритроцитов.

Исходя из высоких величин удельной активности в качестве потенциальных источников получения препарата ХЭ и БАД «Тинростим» более подробно были изучены ХЭ двух видов кальмаров — тихоокеанского и Бартрама. Для них были определены основные параметры гидролиза тиосубстратов и величины бимолекулярной константы ингибирования кц (табл. 3).

Таблица 3

Кинетические параметры холинэстеразного гидролиза под действием ХЭ из оптических

Активность, кп'Ю5, М'мин 1

мкМ/мг ткани ГД-42 ДФФ

Тихоокеанский кальмар

0,70±0,03 430,0±0,1 69,&=0,1

Кальмар Бартрама

1.20±0,03 З2оо,а±о,1 230,0±0.1

Строма сублимированная (АХЭч)

0,S0±0.01 600,0±0,1 3,3±0,1

Проведенный ингибиторный анализ фермента стромы эритроцитов человека показал разную чувствительность АХЭ к гидрофобным (ДФФ) и катион-ным (ГД-42) ФОС: разница в чувствительности к ингибиторам составляла 180 раз (табл. 3), что согласуется с ранее полученными данными (Розенгарт и др.,

2000). Установлено, что наибольшей чувствительностью к рассмотренным ингибиторам обладает ХЭ кальмара Бартрама. ХЭ тихоокеанского кальмара по чувствительности к рассмотренным ингибиторам была сопоставима с реперным ферментом (АХЭч). Полу ченные характеристики чувствительности ХЭ ганглиев тихоокеанского кальмара к ингибиторам согласуются с данными, известными ранее (Ковалев и др., 1987).

Таким образом, проведенные исследования с использованием набора тио-холиновых субстратов, показали высокую чувствительность ХЭ исследованных видов кальмаров к ФОС различного химического строения. Высокая активность п чувствительность к ФОС фермента ганглиев кальмаров позволяет характеризовать это сырье как перспективное для получения препаратов ХЭ.

3.2. Модификация метода получения БАД «Тинростим» С целью проверки предположения о связи биологической активности и молекулярной массы различных белковых фракций БАД «Тинростим» методом улътрафильтрацик было проведено разделение экстракта ганглиев кальмара на фракции с молекулярной массой от 1 до 10, от 10 до 100 и свыше 100 кДа с целью определения иммунологической активности каждой из них табл. 4.

Таблица 4

Иммунологическая активность различных по молекулярной массе фракций

Образец Выход, г ФП, % ФЧ

Стандартный 100.0 58 1.6

Фракция более 100 кДа 26.6 50 1,2

Фракция 10-100 кДа 21,8 50 1.2

Фракция 1-10 к Да 36,6 58 1.3

Примечание. ФП - фагоцитарный показатель; ФЧ - фагоцитарное число, р < 0.01.

Установлено, что на фракции с молекулярной массой менее 100 кДа приходилось 58 % суммарного выхода препарата. Это послужило основанием для модификации метода пол) чения БАД «Тинростим» с использованием мембран с пределом пропускания пор 1 и 100 кДа (рис. 1).

Для концентрирования и выделения БАД «Тинростим» из экстракта применяют стадию осаждения ацетоном в количестве 250 л ацетона на 10 кг исходного сырья.

11

Сырье

(ганглии кальмара мороженые 10 кг)

Измельчение

Экстрагирование (3 %-ная уксусная кислота)

„ Экстракт (50 л)

Осаждение ацетоном (250 л)

1,0%

Ультрафильтрация 100 кДя; 1 кДа (концентрат 5 л>

^ Сушка Экстрагирование

Центрифугирование *

Сублимирование

Упаковывание, -маркирование,, хранение

Осаждение 'ацетоном (25 л)

0.82 %

Рис. 1. Схема модификации способа получения БАД «Тинростнм»

Введение в технологию метода ультрафильтрации позволяет за счет концентрирования экстракта сократить в 10 раз количество используемого ацетона. По модифицированному методу получения выход конечного продукта составил 0,82 % массы сырья, что на 18 % ниже по сравнению со стандартным методом.

БАД «Тинростим», полученная с использованием ультрафнльтрации, по физико-химическим и иммунологическим показателям практически не отличалась от препарата, полу ченного стандартным способом (табл. 5).

Таблица 5

Фшнко-химические и иммунологические показатели БАД «Тинростим»,

Метод получения рН Изоэл. точка, рн Растворимость, мг/мл Массовая доля воды, % Мах. поглощен., Л, им ФП, % ФЧ

Стандартный 6.8 4,35 15 2,0 267 73,3 5.27

УФ 6.8 4,35 15 1,5 267 76,0 6.28

3.3. Технологические характеристики ганглиев кальмаров как сырья для полумания препарата ХЭ

3.3.1. Определение рациональных сроков хранения сырья Согласно полученным данным, в процессе морозильного хранения сырья при минус ] 8 °С в течение 9 мес происходило к снижению на 22 % активности ХЭ мороженых ганглиев (табл. 6).

Таблица 6

Изменение активности ХЭ е ганглиях тихоокеанского кальмара в процессе хранения сырья,

_ %

Время хранения, мес

Ганглии 0 1 2 4 6 9 12

Мороженые (-18 "С) 100 98 94 91 89 78 67

Сублимированные (5 "О 100 94 83 79 77 71 43

Хранение в течение б мес сублимированного сырья приводило к аналогичной потере активности.

Таким образом, исходя из полученных нами данных можно рекомендовать для мороженых ганглиев срок хранения 9 мес, а для сублимированных 6 мес. При определении сроков хранения исходили из расчета материального потока при работе с сырьем, ферментативная активность которого составляет менее 75 % от исходной, когда требуется вовлечение в технологический процесс на 30 % больше сырья по сравнению с сырьем меньшего срока хранения.

3.3.2. Обоснование рациональных параметров экстракции ХЭ Определение рациональных параметров водной экстракции ХЭ показало (рис, 2), что рациональным соотношением сырье : вода для сырья различных

способов обработки

5 8l

t 6-1 ,-i 5 J н 4 j

И

•<0 4-

щ н ж

щ

1 гага (гая

ь. Нн j;;:

Я яя т i _ш !:' ;

Я .: ' j.

ш Я 1 ill !

1 : : f; Г ? "i

O мороженые El сублимированные

является 3:1.

Рис. 2. Активность ХЭ в экстракте при различных гидромодулях, t - 20 ± 2 С, рН - 6,8 (р < 0. 05)

2:1

4:1

Гидромодуль

5:1

Установлено, что рациональными температурами экстракции ХЭ как для сублимированного, так и для мороженого сырья являются 18-25 "С.

Проведенные исследования зависимости процесса экстракции от времени показа™, что при указанных выше параметрах время экстракции ХЭ из мороженых ганглиев двух видов кальмара составляло 6 ч, из сублимированных ганглиев тихоокеанского кальмара — 12 ч и из сублимированных ганглиев кальмара Бартрама — 15 ч. Дальнейшая экстракция не приводила к увеличению активности ХЭ в экстракте (рис. 3).

< о ^-,--,-;-----,

О 5 10 15 20

Время (час)

Рис. 3. Зависимость экстрактивности ХЭ из мороженых и сублимированных ганглиев кальмаров от времени экстракции: 1 - мороженые. 2 - сублимированные ганглии тихоокеанского кальмара; 3 - мороженые, 4 - сублимированные ганглин кальмара Бартрама; гидромодуль 3:1,1- 20±2 °С, рН - 6,8 (р < 0,05)

3.4. Методы солюбилизации и очистки фермента

3.4.1. Определение параметров обезжириватш сырья органическими растворителями Известно, что ХЭ существуют в виде растворимой и мсмбраносвязанной форм, причем до 50 % фермента связано с мембраной, следовательно, эффективное извлечение фермента невозможно без ее разрушения.

На примере сублимированных ганглиев тихоокеанского кальмара было проведено исследование влияния спиртов и их смеси с гексаном на реакционную способность и увеличение активности ХЭ в экстракте. Установлено, что обработка сублимированных ганглиев смесью органических растворителей (бутанол : гексан 1,5 : 1,0) приводит к удалению из ткани 32 % липидов (табл. 7). При этом

обработка смесью бутанол : гексан позволяет перевести в раствор 67 % активности фермента.

Таблица 7

Влияние обработки смесью бутанол : гексан на содержание лштдов в сублимированных

Сырье Содержание липи-дов в ткани,%

Ганглии сублимированные 2,67

Ганглии сублимированные, обработанные смесью растворителей (бутанол : гексан 1,5 : 1,0) 1.78

Обработка мороженых ганглиев кальмара смесью органических растворителей не давала положительных результатов из-за образования стойкой эмульсии.

3.4.2. Очистка ХЭ методом фракционирования сульфатом аммония

Последовательность технологических стадий очистки ХЭ га ганглиев кальмаров включала: измельчение сублимированных ганглиев кальмаров; обработку смесью органических растворителей (бутанол : гексан 1,5 : 1,0) в течение 30-40 мин при температуре 17±2 °С (соотношение смеси растворителей и сырья составляло 10 : 1); отделение обезжиренного сырья; экстракцию ХЭ при соотношении сырье : вода, равном 3:1; время экстракции 12-15 ч при температуре 20±2 °С (табл. 8).

Показано, что образование осадка при втором высаливании для экстрактов из ганглиев кальмаров наступает при 75 %-ном насыщении раствора солью. Контроль активности показывает, что двойное осаждение сопровождается для ХЭ кальмаров потерей 55-60 % активности по сравнению с исходной тканью. В то же время 4-кратное высаливание АХЭч при общем насыщении 65 % приводит к потере 76 % активности фермента. ХЭ из оптических ганглиев кальмаров выделяются практически с равным выходом и удельной активностью, что превышает показатели для АХЭч практически в 2 раза.

Полученные методом дробного фракционирования ХЭ из различных источников были охарактеризованы по параметрам активности, термостабильности и чувствительности к ФОС (табл. 9). АХЭч характеризовалась активностью

3,6 мкМ АТХ/мнн/на 1 мг белка, что в 29 раз ниже активности ХЭ, выделенной из сублимированных ганглиев тихоокеанского кальмара.

Таблица 8

Основные характеристики процесса фракционирования ХЭ из различных источников

Показатель Кальмар тихоокеанский Кальмар Бартрама АХЭч

Исходная активность в

сублимированном сырье, % 100 100 100

Водная экстракция, % 67 65 40

1-е высаливание 366 366 114

((ШиьЯО„1 г/л (65 %) (65 %) (20 %)

Контроль активности, % 50 42 30

2-е высаливание 216 216 262

((МЪЪЯОД г/л (75 ВД (75 %) (30 %)

3-е высаливание 85

(Ш^ОД г/л - _ (50 %)

4-е высаливание 266

((Ш4)2$04). г/л - - (65 %)

Контроль активности, % 45 40 J 24

Обессоливанне Диализ

Контроль активности, % 33,5 30,0 18.2

Примечание. В скобках указан показатель общего насыщения раствора сульфатом аммония.

Таблица 9

Характеристика препаратов ХЭ, выделенных из сублимированных ганглиев кальмаров и стромы эритроцитов крови человека методом фракционирования сульфатом аммония __(субстрат АТХ)___

Термостабиль- Удельная активность, мкМ /мин/яг белка ка 10', Ммин"1 Молекуляр-

ность (1 ч, 50 °С). % ГД-42 j ДФФ i ная масса. _... кДа

Тихоокеанский кальмар

_ 25 106,0±0,05 130,0*0,1 I 0,6±0,1 117;215

Кальмар Бартрама

> 3?. _ 93.0±0,05 47,0±0,1 1 8,5±0,1 220

Строма эритроцитов крови человека (АХЭч)

15 3,60±0,01 58.0±0,1 ! 0,02±0,Ю 220

По чувствительности к исследованным ингибиторам ХЭ кальмаров сравнимы с АХЭч (по ГД-42) либо превосходят реперный фермент в 30-425 раз.

Исследование термостабильности показало, что ХЭ из эритроцитов стромы человека при термостатировании в течение 1 ч при 50 °С теряет 15 % исходной активности (табл. 9). Наиболее близка к этому значению ХЭ из ганглиев тихоокеанского кальмара, для которой потеря активности составляла 25 %. По этому показателю ХЭ кальмара Бартрама соответствует предъявляемых! тре-

бованиям. На основании проведенного исследования сделано заключение о возможности получения термостабильной, высокоактивной и чувствительной к ФОС ХЭ из сублимированных ганглиев тихоокеанского кальмара методом дробного фракционирования.

Окраска по Карновскому выявила холинэстеразную активность в препарате из ганглиев тихоокеанского кальмара во фракциях с молекулярной массой 117 и 215 кДа. В препарате из эритроцитов крови человека ХЭ активностью обладала фракция с молекулярной массой 220 кДа (табл. 9).

3.4.3. Солюбипизация ХЭ нервной ткани кальмаров тритоном Х-100

Исследования по выделению фермента нз различных источников показали, что большинство ХЭ не переходит в раствор без разрушения ткани солюби-лтирующими агентами. Экстракция 1 %-ным раствором тритона Х-100 ХЭ из сублимированных, обработанных смесью органических растворителей ганглиев тихоокеанского кальмара позволила перевести в раствор 71 % общей активности в сырье.

Основываясь на описанных выше параметрах процессов, была получена опытно-промышленная партия фермента ХЭ из сублимированных ганглиев тихоокеанского кальмара путем обработки смесью органических растворителей (бутанол : гексан 1,5 : 1,0), с последующей обработкой тритоном Х-100 (1 % от массы сырья) и очисткой ультрафильтрацией.

Балластные белки из экстракта отделяли центрифугированием при 3500 об/мин. С целью увеличения ионной силы раствора, что способствует десорбции детергента с молекулы ХЭ, к центрифугату добавляли 0,1 М Ъ1аС1 в соотношении 4 : 1 (Григорьева и др., 1987). Ультрафильтрацию проводили на колонках с мембранами волоконного типа с пределом пропускания молекул 100 кДа. Параметры процесса: скорость - 500 мл/ч; давление - 0,1 кПа; температура 5 °С; время - 3 ч.

Полученный препарат был охарактеризован по величине удельной активности, термостабильности и чувствительности к ФОС (табл. 10). Удельная активность препарата ХЭ составляла 11,6 Е/мг белка. Выход препарата — 18 % от

активности в сырье (сублимированные ганглии). По чувствительности к ФОС полученная ХЭ превосходила реперный фермент в 3,2 раза по ГД-42 и в 60,0 раза по ДФФ.

Таблица 10

Характеристика препарата ХЭ. выделенного из сублимированных ганглиев тихоокеанского кальмара, обработанных смесыо органических растворителей и тритоном Х-100

(субстрат АТХ)

Термостабиль- иость (1 ч, 50 "С). % Удельная активность, мМ /мин/мг белка Выход. % Кц'Ю', М-мшГ1 Молекулярная масса, кДа

ГД-42 ДФФ 223

44 11,60±0,03 18 | 190,0±0,1 1,2±0.1

Специфическая окраска препарата ХЭ по Карновскому показала, что хо-линэстеразной активностью обладает белковая фракция с молекулярной массой 223 кДа (табл. 10).

Таким образом, дву стадийная обработка сырья позволила получить из сублимированных ганглиев тихоокеанского кальмара препарат ХЭ с высокой чувствительностью к ФОС. Однако снижение активности в тесте на термостабильность составляло 44 % (табл. 10), что не соответствует требованиям, предъявляемым к ферментным препаратам как аналитическим реактивам.

3.4.4. Исследования влияния ферментов на прог/есс выделения ХЭ из ганглиев кальмаров

В ходе работы впервые проведено исследование влияния коммерческого препарата целлолюкс А на выход ХЭ из ганглиев кальмаров в раствор.

Установлено, что в концентрации 0,5 % от массы сырья целлолюкс повышает окетракгивность ХЭ из мороженых и сублимированных ганглиев тихоокеанского кальмара на 10 % в течение 5-8-часовой реакции.

Обработка мороженых ганглиев тихоокеанского кальмара протамексом в концентрации 1 % (с акшвностыо 240 Пе/г) приводит к повышению на 18 % выхода ХЭ в раствор в течение 2 ч обработки. Более длительная обработка протамексом приводит к уменьшению активности ХЭ в экстракте.

Действие фермента протамекс на сублимированные ганглии тихоокеанского кальмара отличается от действия на мороженые ганглии (рис. 4). Макси-

мальное влияние на увеличение активности ХЭ в экстракте оказывал протамекс в концентрации 0,5 % к массе сырья: увеличение выхода ХЭ в раствор по сравнению с водной экстракцией составляло 48,5 % в течение первых пяти часов. Более длительная экстракция также приводила к понижению активности ХЭ в растворе. По-видимому, как и в случае мороженых ганглиев, в данном случае происходит ферментативная деструкция ХЭ под действием протамекса.

1 3 5 7 9

Время (час)

Рис. 4. Влияние протеолигаческих препаратов на экстрактивность ХЭ из сублимированных ганглиев кальмаров: 1 - тихоокеанский кальмар + протамекс 0,5 %; 2 - тихоокеанский кальмар + пилорин 0,5 %;. 3 - кальмар Бартрама + протамекс 0,5 %; 4 - кальмар Бартрама + пилорин 0,5 %; t - 20 °С, рН - 6,8, субстрат АТХ

Известно, что в ряде случаев протеолитические ферменты гидробионтов проявляют большую специфичность действия по отношению к морскому сырью. Проведенное исследование показало, что максимальное влияние на выход ХЭ в раствор из сублимированных ганглиев тихоокеанского кальмара оказывал 0,5 %-ный пилорин. В случае кальмара Бартрама обработка сублимированных ганглиев 0,5 %-ным пилорином приводила к повышению выхода ХЭ в раствор на 24,5 % по сравнению с тем же без фермента (рис. 4).

У становленные параметры экстракции ХЭ (с использованием пилорина и протамекса), обеспечивающие существенное увеличение выхода фермента из сублимированных ганглиев кальмаров двух видов, были использованы при наработке опытно-промышленных партий препарата.

Для наработки опытно-промышленной партии ХЭ последовательно выполнен ряд технологических стадий. Обработку сублимированных ганглиев

кальмаров ферментными препаратами протеолитического действия (0,5 % от сырья, протамекс — 240 Е/г, пилорин — 204 Е/г) проводили при гидромодуле 3:1. По окончании экстракции (время экстракции 5-8 ч) с целью прекращения про-теолиза в раствор добавляли ингибитор протеаз (ингибитор трипсина из яичного белка индейки) в количестве 0,25 % от массы сублимированных ганглиев. Очистку от протеолитических ферментов и низкомолекулярных белков проводили методом ультрафильтрации на мембранах волоконного типа с пределом пропускания молекул 100 кДа. Параметры процесса: скорость - 500 мл/ч; давление - 0,1 кПа; температура 5 °С; время - 3 ч.

Активность ХЭ, полученных с использованием пилорина, составляла 2125 мкМ мип/мг белка, с использованием протамекса — 30,6—33,1 мкМ АТХ/мин/мг белка (табл. 11).

Таблица 11

Характеристики препаратов ХЭ, выделенных из сублимированных ганглиев кальмаров _обработкой сырья протеолитическнми ферментами (субстрат АТХ)_

Термостабиль- Удельная актив- КцТО7, Ммин 1 1 1 „

ность (1 ч, 50 °С). % ность, мМ АТХ/мин/ мг белка ГД-42 ДФФ Выход, % масса, кДа

Тихоокеанский кальмар + 0,5 %-ный пилорин

37 24,70±0.02 1200.0±0,1 1,2±0.1 21 227

Тихоокеанский кальмар + 0.5 %-ный протамекс

46 30,60±0,01 690.0=0,1 1,3±0,1 25 221

Кальмар Бартрама + 0,5 %-ный пилорин

45 21,0±0.01 2900.0±0,1 8.5±0,1 17 . 227

Кальма р Бартрама + 0,5 %-ный протамекс

66 33,10±0,01 2100,0±0,1 15±0,1 27 226

По влиянию на величину выхода ХЭ два протеолитических препарата были равноэффективны независимо от вида сырья.

Использование ферментов различной специфичности приводило к изменению субстратных характеристик ХЭ, выделенных из одного вида сырья, а также оказывало влияние на величину кп взаимодействия фермента с ФОС. Так, ХЭ тихоокеанского кальмара, полученная с использованием пилорина, оказалась более чувствительной к ингибитору ГД-42 по сравнению с ХЭ, полученной с использованием протамекса. Чувствительность к ДФФ ХЭ кальмара Бар-

трама, полученной с использованием протамекса, была в 1,8 раза выше таковой для ХЭ, полученной обработкой пилорином. В целом следует отметить, что ХЭ кальмара Бартрама оказалась наиболее чувствительной к исследованным ФОС по сравнению с реперным ферментом. Параметру термостабильности соответствовал только препарат ХЭ, полученный из ганглиев тихоокеанского кальмара.

Для препаратов ХЭ из ганглиев тихоокеанского кальмара после окрашивания гелей по Карновскому показано наличие ХЭ-активности фракции массой 221 и 227 кДа, в препаратах ХЭ из ганглиев кальмара Бартрама — 226-227 кДа (табл. 11).

3.5. Комплексная технология получения фермента холинэстеразы и БАД «Тинростим»

Теоретической предпосылкой технологической части работы явилась возможность раздельного экстрагирования компонентов нервной ткани: ХЭ -водой, а БАД «Тинростим» - раствором уксусной кислоты (ТИ 36-278-05). В комплексной технологии получения учитывали параметры способа получения препарата ХЭ методом ограниченного протеолиза с последующей ультрафильтрацией (п. 3.4.4) и модификацию метода получения БАД «Тинростим» (п. 3.2).

Технологическая схема выделения включала ряд стгдий: измельчение, обработку сырья пилорином, экстракцию, отделение осадка и ультрафильтра-иию на мембранах с пределом пропускания молекул 1 и 100 кДа (рис. 5).

Фильтрат, раствор с веществами менее 100 кДа, смешивали с осадком и направляли на получение БАД «Тинростим». Экстракцию пептидов проводили в 3 %-ном растворе уксусной кислоты в течение 48 ч при температуре 10 °С. Балластные белки удаляли центрифугированием. Супернатант концентрировали на ультрафильтрационной колонке с пределом пропускания пор 1 кДа. Полученный концентрат направляли на получение БАД «Тинростим» согласно ТИ 36-278-05.

Рис. 5. Схема совместного получения препарата ХЭ и БАД «Тлнростим»

Раствор с веществами более 100 кДа (концентрат, содержащий ХЭ) концентрировали до минимального объема, центрифугировали при 9000 об/мин, проводили контроль активности фермента, разливали во флаконы и направляли на сублимационную сушку (-1... +1 °С, досушивание при 20 °С).

Препарат ХЭ, полученный комплексным методом, был характеризован по параметрам удельной активности, чувствительности к ФОС и термостабильности. Метод ограниченного протеолиза позволяет получить термостабильный препарат фермента с удельной активностью 24,7 Е/'мг белка и высокой чувствительностью к ФОС (табл. 11).

Выход БАД «Тинростим» составил 0,3 % от количества использованного сырья (табл. 12), в то время как выход препарата, получаемого традиционным способом (осаждением ацетоном), составляет 1,0 % (Боровская и др., 2006).

Таблица 12

... -. Метод получения Внешний вид Цвет рн Изозл. точка, РН Растворимость, мг/мл Массовая доля воды, % Мах поглощен., X, нм Выход. %

Комплексный Аморфный порошок Светло-кремовый 6,8 4,35 15 1,2 267+3 0.3

Стандартный Аморфный порошок Светло-кремовый 6,8 4,35 15 1,7 267+3 1,0

Органолептические и физико-химические показатели БАД «Тинростим», полученной комплексным методом, не отличаются от показателей препарата, полученного стандартным способом (табл. 12).

Расчет экономической эффективности разработанной технологии получения препарата ХЭ из ганглиев кальмаров показал, что сгоимость 1 ед. фермента составляет 5,23 руб.

В одном производственном цикле (3 кг сырья) при выходе конечного продукта 5 % возможно получение 15000 ед. фермента общей стоимостью %1-ОСО вЦШ^- ПРИ рентабельности 20 %.

Выводы

1. Разработана комплексная технология переработки оптических ганглиев кальмаров, позволяющая производить в одном технологическом цикле из одного источника два вида биологически активных препаратов (препарат ХЭ и БАД «Тинростим»), основанная на ограниченном протеолизе сырья с последующим разделением биологически активных компонентов методом ультрафильтрации. Комплексная технология позволяет получать препарат ХЭ с удельной активностью 24,7 Е/мг белка, а также БАД «Тинростим» по физико-химическим и органолептическим показателям не отличающийся от препарата, полученного классическим методом.

2. Разработана модификация способа получения БАД «Тинростим» из мороженых ганглиев кальмаров с использованием метода ультрафильтрации, которая дает возможность снизить количество используемого ацетона в 10 раз и получать БАД «Тинростим» с высокой иммунологической активностью.

3. На основании данных по определению удельной активности ХЭ ганглиев у 7 видов головоногих моллюсков обоснован выбор источников получения препарата ХЭ. Впервые определены параметры гидролиза тиохолиновых субстратов под действием ХЭ нервных ганглиев осьминога Octopus dofleitii; каракатиц Sepiota birostrata, Rossia pacifica; кальмаров Ommastrephes bartramii, Wa-tasenia scintillans, Sepioteuthis lessoniana.

4. На примере ганглиев тихоокеанского кальмара установлены рациональные сроки хранения сырья различных способов обработки, которые составили 9 мес для мороженого сырья при минус 18 °С и 6 мес для сублимированных ганглиев при 5 °С.

5. Определены рациональные параметры экстракции фермента из мороженых и сублимированных ганглиев кальмаров: температура экстракции 18—25 °С; соотношение сырье : вода 3:1; время экстракции для мороженых ганглиев 6 ч, для сублимированных — 12-15 ч в зависимости от вида кальмара.

6. Показано, что обработка сублимированных ганглиев смесью органических растворителей (бутанол : гексан) позволяет перевести в экстракт 67 % общей активности ХЭ в сырье.

7. Показано влияние целлюлолитического и протеолитических ферментов на экстрактивность ХЭ из сублимированных ганглиев кальмаров. Обработка ганглиев пилорином и иротамексом в концентрации 0,5 % от массы сырья дает возможность перевести в раствор 68 % общей активности в случае тихоокеанского кальмара и 63 % в случае кальмара Бартрама.

8. Разработана технологическая схема получения препаратов ХЭ из сублимированных ганглиев дальневосточных видов кальмаров методом фракционирования сульфатом аммония с удельной активностью 106,0 Е/мг белка из ганглиев тихоокеанского кальмара и 93,1 Е/мг белка из ганглиев кальмара Бар-

трама. Определена молекулярная масса холинэстераз, которая составляла 211225 кДа в зависимости от вида кальмара.

9. Разработана и утверждена нормативная документация, ТУ № 9289295-00472012-05, на «Препарат фермента пропионилхолинэстеразы». Рассчитаны экономические показатели производства препарата ХЭ из ганглиев кальмара.

Список работ, опубликованный по теме диссертации

Статьи, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах

Боровская Г.А.. Михеев Е.В., Эпштейн Л.М. и др. Метод ультрафильтрации в технологии получения тинростима // Изв. ТИНРО. — 2006. — Т. 146. — С. 294-299.

Михеев Е.В., Ковалев H.H. Роль видовых различий холинэстераз нервной ткани тихоокеанских головоногих моллюсков // Изе. ТИНРО. — 2007. — Т. 151.—С. 460-465.

Михеев Е.В., Ковалев H.H. Обоснование биотехнологии производства ферментного препарата из зрительных ганглиев кальмаров // Материалы научной конференции «Современное состояние водных биоресурсов», посвященной 70-летию С.М. Коновалова. - Владивосток : ТИНРОЦенгр, 2008. — С. 904907.

Михеев Е.В., Ковалев H.H. Комплексный метод получения фермента хо-линэстеразы и БАД «Тинростим» // Изв. ТИНРО. — 2009. — Т. 159. — С. 326338.

Подписано в печать 11.11.2009 г. Формат 60x84/16. 1 уч.-изд. л. Тираж 100 экз. Заказ №31, Отпечатано в типография издательского центра ФГУП «ТИНРО-Центр» г. Владивосток, >л. Западная, 10.

Введение.

1. Обзор литературы

1.1. Строение и свойства цитомединов

1.2. Характеристика Б АД «Тинростим».

1.3. Биологическая роль, строение и свойства холинэстераз.

1.4. Холинэстеразы гидробионтов

1.5. Методы выделения и очистки холинэстераз

1.5.1. Солюбилизация ХЭ с помощью детергентов

1.5.2. Солюбилизация с помощью ферментов

1.5.3. Солюбилизация органическими растворителями

2. Материалы и методы

3. Результаты и обсуждение

3.1. Характеристика сырья ганглиев головоногих моллюсков.

3.2. Модификация метода получения Б АД «Тинростим».

3.3. Технологические характеристики ганглиев кальмаров как сырья для получения препарата ХЭ

3.3.1. Определение рациональных сроков хранения сырья.

3.3.2. Определение рациональных параметров экстракции ХЭ

3.4. Методы солюбилизации и очистки фермента.

3.4.1. Определение параметров обезжиривания сырья органическими растворителями

3.4.2. Очистка ХЭ методом фракционирования сульфатом аммония

3.4.2.1. Характеристика процесса получения препаратов ХЭ из сублимированных ганглиев кальмаров методом фракционирования сульфатом аммония

3.4.2.2. Характеристика препаратов ХЭ кальмаров, полученных методом фракционирования сульфатом аммония.

3.4.3. Солюбилизация ХЭ нервной ткани кальмаров тритоном Х

3.4.3.1. Определение параметров обработки сырья детергентом тритон

3.4.3.1. Определение параметров обработки сырья детергентом тритон

3.4.3.2. Характеристика препарата ХЭ полученного с использованием тритона Х

3.4.4. Исследования влияния ферментов на процесс выделения ХЭ ганглиев кальмаров.

3.4.5. Характеристика препаратов ХЭ, полученных с использованием ферментов.

3.5. Комплексная технология получения фермента холинэстеразы и БАД «Тинростим»

3.5.1. Характеристика процесса

3.5.2. Характеристика препаратов ХЭ и БАД «Тинростим», полученных комплексным методом

3.6. Обсуждение.

Актуальность работы. Вопросам переработки головоногих моллюсков на пищевые цели посвящено много работ (Леванидов, Захарова, 1968; Кизеветтер, 1973; Купина и др., 2001; Швидкая, Блинов, 2008). Среди головоногих моллюсков особое промысловое значение имеют кальмары. Мышечные ткани кальмаров составляют до 52 % и около 32 % массы кальмара приходится на отходы - печень, пищеварительную систему, гонады и ганглии. Известны технологии переработки внутренних органов кальмаров для получения лечебно-профилактических жиров как БАД к пище (Новгородцева и др., 2007), щелочных и кислых фосфатаз из гонад (Касьяненко и др., 1980; Розенгарт и др., 1993), БАД «Артротин» из хрящевой ткани (Клычкова, 2004; Пат. РФ № 2250047), БАД «Тинростим» из ганглиев (Эпштейн и др., 1997). Зрительные ганглии кальмара составляют около 3 % массы тела животного. Процесс их ручной заготовки трудоемок и затратен. Известная технология получения БАД «Тинростим» (ТИ 36-278-05) из ганглиев кальмаров многостадийна, требует больших затрат ацетона, что предъявляет особые требования к организации производства. Использование современных технологических приемов и аппаратов позволяет существенно уменьшить количество используемых органических растворителей.

Исследование ферментов как биологических катализаторов представляет собой одно из наиболее перспективных направлений современной биотехнологии и биохимии. В течение многих лет разрабатываются различные аспекты взаимосвязи структуры и активности, а также направления их практического применения в биотехнологии продуктов питания и БАД (Пивненко и др., 1997; Неклюдов и др., 2000; Калиниченко и др., 2008). Однако проблема выделения и очистки ферментов не теряет своей актуальности, так как развитие современных биотехнологических приемов позволяет упростить и удешевить многоступенчатую и высокозатратную процедуру выделения ферментов. Все это предъявляет, определенные требования к разработке технологических приемов» выделения ферментов, масштабированию процессов, изучению специфических свойств ферментов.

Исследования последних лет убедительно показали наличие высокой холи-нэстеразной активности в нервной ткани у различных видов гидробионтов (Козловская и др., 1990; Jebali et al., 2006; Podolska, Napierska, 2006). Интерес к холинэстеразам (ХЭ) объясняется той ролью, которую играет фермент нервной ткани в быстропротекающих процессах синаптической передачи. Известно использование ХЭ как биохимического реактива при оценке эффективности инсектицидов «и высокотоксичных фосфорорганических соединений (ФОС), а также лекарственных средств (Садыков и др., 1976; Бресткин и др., 1997).

Ранее фермент ацетилхолинэстераза из эритроцитов донорской крови человека (АХЭч) как биохимический реактив производился в России на нескольких предприятиях Министерства здравоохранения. Ферменты из органов и тканей гид-робионтов в промышленных масштабах не производятся, не являются исключением и ХЭ. Повышенные требования к контролю безопасности производств и охраны окружающей среды привели к разработке ряда ферментных тест-систем с использованием ХЭ для оценки уровня загрязнений, в том числе промышленными и бытовыми ядами (Стойкова и др., 2000; Порус и др., 2008; Beljakova et al., 2001).

Основываясь на знании различий физико-химических свойств БАВ нервной ткани, представляло интерес создание комплексной технологии переработки нервной ткани головоногих моллюсков для получения БАД «Тинростим» и препарата ХЭ из одного источника в одном технологическом процессе.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явились поиск и характеристика сырьевых источников и разработка биотехнологических способов получения фермента холинэстеразы и БАД «Тинростим» из нервной ткани гидро-бионтов в одном технологическом процессе.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить, следующие задачи: обосновать использование зрительных ганглиев головоногих моллюсков как сырья'для производства ХЭ; определить рациональные параметры экстракции ХЭ из нервной* ткани кальмаров; обосновать технологию выделения фермента по характеристике конечного продута (термостабильность, субстратная и ингибиторная специфичность); обосновать технологию получения БАД «Тинростим» и препарата холинэстеразы в одном технологическом цикле.

Научная новизна работы. Определены оптимальные параметры хранения и обработки сырья - нервных ганглиев кальмаров. Впервые:

- определена биологическая активность различных по молекулярной массе белковых фракций БАД «Тинростим» и обоснована модификация метода его получения;

- установлено влияние детергента (тритона Х-100), целлюлолитических и протеолитических ферментов на экстрактивность ХЭ из мороженых и сублимированных ганглиев кальмаров;

- определены субстратная и ингибиторная специфичности, термостабильность и электрофоретическая характеристика очищенного фермента ХЭ из ганглиев кальмара;

- из одного вида сырья в одном технологическом процессе выделены и охарактеризованы БАД «Тинростим» и препарат ХЭ;

- разработана и утверждена технология получения ферментного препарата ХЭ из сублимированных ганглиев кальмаров.

Практическая значимость работы. Выполненные исследования послужили основанием для выбора наиболее перспективного источника получения фермента. Обоснован способ заготовки и хранения сырья - сублимированных ганглиев кальмаров. Разработаны способ получения фермента холинэстеразы, в основу которого положен метод дробного высаливания сульфатом аммония; принципиальная схема получения из одного вида сырья в одном технологическом процессе БАД «Тинростим» и препарата ХЭ. Разработана и утверждена нормативная документация на «Препарат фермента пропионилхолинэстеразы» (ТУ № 9289-295-00472012-05). Выпущена опытно-промышленная партия препарата фермента. Проведены промышленные испытания препарата фермента в оценке содержания токсических веществ в окружающей среде.

Защищаемые положения:

- характеристика субстратной и ингибиторной специфичности является показателем пригодности сырья для получения фермента ХЭ;

- модификация технологии БАД «Тинростим» на основе .ультрафильтрации позволяет сохранить ее биологическую активность;

- способ получения холинэстеразы, включающий дробное фракционирование сульфатом аммония позволяет получить термостабильный, высокочувствительный к ФОС фермент с высокой удельной активностью;

- комплексная технология переработки ганглиев кальмаров на основе мембранных технологий обеспечивает получение препарата ХЭ и БАД «Тинростим» в одном технологическом процессе.

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на Первой международной научно-технической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы технологии живых систем» (Владивосток, 2005); на XV ежегодной рабочей встрече North Pacific Marine Science Organization (PICES) (Йокогама, Япония, 2006); на научно-практической конференции «Современное состояние водных биоресурсов», посвященной 70-летию С.М. Коновалова (Владивосток, 2008); Международной научно-практической конференции «Морские прибрежные экосистемы. Водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки» (Владивосток, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, 3 глав, выводов, списка литературы (156 наименований, в том числе 56 иностранных). Изложена на 123 стр., иллюстрирована 26 рисунками и 29 таблицами.

105 ВЫВОДЫ

1. Разработана комплексная технология переработки оптических ганглиев кальмаров, позволяющая производить в одном технологическом цикле из одного источника два вида биологически активных препаратов (препарат ХЭ и БАД «Тинростим»), основанная на ограниченном протеолизе сырья с последующим разделением биологически активных компонентов методом ультрафильтрации. Комплексная технология позволяет получать препарат ХЭ с удельной активностью 24,7 Е/мг белка, а также БАД «Тинростим», по физико-химическим и органолептическим показателям не отличающийся от препарата, полученного классическим методом.

2. Разработана модификация способа получения БАД «Тинростим» из мороженых ганглиев кальмаров с использованием метода ультрафильтрации, позволяющая снизить количество используемого ацетона в 10 раз и получать БАД «Тинростим» с высокой иммунологической активностью.

3. На основании данных по определению удельной активности ХЭ ганглиев у 7 видов головоногих моллюсков обоснован выбор источников получения препарата ХЭ. Впервые определены параметры гидролиза тиохолиновых субстратов под действием ХЭ нервных ганглиев осьминога Octopus dofleini; каракатиц Sepiola biros-trata, Rossia pacifica; кальмаров Ommastrephes bartramii, Watasenia scintillans, Sepiotenthis lessoniana.

4. На примере ганглиев тихоокеанского кальмара установлены рациональные сроки хранения сырья различных способов обработки, которые составили 9 мес для мороженого сырья при -18 °С и 6 мес для сублимированных ганглиев при 5 °С.

5. Определены рациональные параметры экстракции фермента из мороженых и сублимированных ганглиев кальмаров: температура экстракции 18-25 °С; соотношение сырье : вода 3:1; время экстракции для мороженых ганглиев 6 ч, для сублимированных ганглиев 12-15 ч в зависимости от вида кальмара.

6. Показано, что обработка сублимированных ганглиев смесью органических растворителей (бутанол : гексан) позволяет перевести в экстракт 67 % общей активности ХЭ в сырье.

7. Показано влияние целлюлолитического и протеолитических ферментов на экстрактивность ХЭ из сублимированных ганглиев кальмаров. Обработка ганглиев пилорином и протамексом в концентрации 0,5 % массы сырья позволяет перевести в раствор 68 % общей активности в случае тихоокеанского кальмара и 63 % в случае кальмара Бартрама.

8. Разработана технологическая схема получения препаратов ХЭ из сублимированных ганглиев дальневосточных видов кальмаров методом фракционирования сульфатом аммония с удельной активностью 106,0 Е/мг белка из ганглиев тихоокеанского кальмара и 93,1 Е/мг белка из ганглиев кальмара Бартрама. Определена молекулярная масса холинэстераз, которая составляла 211-225 кДа в зависимости от вида кальмара.

9. Разработана и утверждена нормативная документация, ТУ № 9289-29500472012-05, на «Препарат фермента пропионилхолинэстеразы». Рассчитаны экономические показатели производства препарата ХЭ из ганглиев кальмара.

3.7. Заключение

Таким образом, в ходе исследований различными способами были получены препараты фермента холинэстеразы из дальневосточных видов кальмаров и эритроцитов крови человека, которые различались по активности, термостабильности и чувствительности к ФОС. Наибольшей удельной активностью характеризовался препарат из ганглиев тихоокеанского кальмара, полученный методом фракционирования сульфатом аммония. Также этот препарат оказался наиболее термостабилен. Высокой чувствительностью к ГД-42 отличался препарат, полученный из ганглиев кальмара Бартрама, обработанных пилорином. Наибольшую чувствительность к ДФФ показал препарат из кальмара Бартрама, полученный с использованием протамекса.

Метод ограниченного протеолиза с использованием пилорина позволил получить термостабильный препарат ХЭ с высокой чувствительностью к ФОС. Данный метод взят за основу для разработки технологии получения БАД «Тинростим» и ХЭ в одном технологическом цикле. В результате получен тинростим, по органо-лептическим и физико-химическим показателям не отличающийся от препарата, полученного классическим методом (ТИ 36-278-05). При этом выход тинростима составил 0,3 % массы сырья, в то время как выход препарата, получаемого традиционным способом (осаждением ацетона), составляет 1,0 %, а выход тинростима методом ультрафильтрации - 0,82 % массы использованного сырья. По-видимому, это связано с тем, что для получения тинростима стандартным способом и методом ультрафйльтрации в качестве сырья использовались мороженые ганглии кальмара, а в случае комплексной технологии были использованы сублимированные ганглии кальмара.

Таким образом, проведенные исследования показали, что комплексный метод получения ХЭ и БАД «Тинростим» позволяет получать препарат фермента холинэстеразы с высокой чувствительностью к ФОС, а также БАД «Тинростим», по органолептическим и физико-химическим показателям соответствующий препарату, полученному стандартным способом.

1. А.с. 1259185 SU. Способ хроматографического разделения пептидов / В.П. Демушкин, Т.А. Малыгина, В.М. Зотов и др. 23.09.86. Бюл. № 35.

2. Абрамович Т.Д., Борзунина A.M., Голуб T.JI. О каталитических свойствах ацетилхолинэстеразы из эритроцитов человека // Биохимия. 1973. - Т. 38, № 6. -С.1137-1143.

3. Богатков С.В., Фролова Т.Т., Грачева И.М. и др. Оптимизация гидролиза белков щелочной протеиназой Bacillus subtilis // Прикл. биохим. и микробиол. -1982.-Т. 18, вып. 5.-С. 71-75

4. Боровская Г.А., Михеев Е.В., Эпштейн JI.M. и др. Метод ультрафильтрации в технологии получения тинростима // Изв. ТИНРО. — 2006. Т. 146. - С. 294— 299.

5. Боровская Г.А., Эпштейн JI.M. Физико-химические свойства тинростима и его применение в медицине // Изв. ТИНРО. 1999. - Т. 125. - С. 176-184.

6. Бресткин А.П., Брик И.Л., Волкова Р.И. и др. Влияние ионной силы органических растворителей на взаимодействие холинэстераз с субстратами и фосфо-рорганическими ингибиторами // Биохимия. 1970 - Т. 35, № 2. - С. 382-393.

7. Бресткин А.П., Вяземская М.М., Майзель Е.Б. Влияние тритона Х-100 на свойства ацетилхолинэстеразы из эритроцитов крови человека // Биохимия. 1978. -Т. 43, № 1.-С. 94-99.

8. Бресткин А.П., Ковалев Н.Н., Розенгарт Е.В. Субстратно-ингибиторная специфичность холинэстераз нервной ткани командорского кальмара // Нейрохи-мия. 1986. - Т. 5, № 3. - С. 264-270.

9. Бресткин А.П., Кузнецова Л.П., Моралев С.Н. и др. Холнпэстеразы наземных животных и гидробионтов : монография. Владивосток : ТИНРО-Центр, 1997.-466 с.

10. Бресткин А.П., Майзель Е.Б., Розенгарт Е.В. Влияние некоторых органических растворителей на реакционную способность холинэстеразы // Биохимия. -1969.-Т. 34, вып. 5.-С. 1062-1067.

11. Бресткин А.П., Певзнер Д.Л. О свойствах ацетилхолинэстеразы мозга и эритроцитов быка // Биохимия. 1971. - Т. 36, № 1. - С. 81-86.

12. Бресткин А.П., Певзнер Д.Л. Октаноловый способ получения и каталитические свойства ацетилхолинэстеразы из эритроцитов крови теплокровных животных //Биохимия.-1966.-Т. 31, № 6. С. 1174-1180

13. Бресткин А.П., Розенгарт Е.В., Эпштейн Л.М. О свойствах холинэстеразы из хвостатого ядра мозга тюленя Phoca hispida ladogensis // Журн. эволюц. биохим. физиол. 1971. - Т. 7, № 5. - С. 474-476.

14. Бузолева Л.С., Костюшко А.В., Кондрашова Н.М. Оценка клинико-иммунологической эффективности иммуномодуляторов природного происхождения при экспериментальной пневмонии у мышей // Тихоокеанский медицинский журнал. 2009. - № 3. - С. 64-67.

15. Гажа А.К. Иммуноакгивный пептид из оптических ганглиев моллюсков : дис. канд. биол. наук. Владивосток, 1994. -140 с.

16. Гафуров К.М. Дезоксирибонуклеазы : монография. Владивосток : Даль-наука, 1999.-230 с.

17. Говоруха А.Г., Малыгина Т.А., Сыропятов Б.Я. Сравнительное исследование свойств цитомединов гидробионтов // Технология гидробионтов : сб. науч. тр. Владивосток : ТИНРО, 1987. - С. 71-77.

18. Государственная Фармакопея СССР. 1987. XI изд., вып.1, 2.

19. Григорьева Г.М. Холинэстеразы зрительного ганглия кальмара Illex illece-brosus, каракатицы Sepia officinalis и эледоны Eledona sp. // Сравнительная физиология и нейрохимия / под ред. Е.М. Крепса. Л. : Наука, 1976. - С. 3-13.

20. Григорьева Г.М. Холинэстеразы зрительного ганглия кальмаров Ommastrephes sloani pacificus // Систематика и экология головоногих моллюсков. Л. : ЗИН АН СССР, 1983.-С. 137-139.

21. Григорьева Г.М., Конычева Н. Кинетические свойства холинэстераз зрительного ганглия кальмаров // Физиология и биохимия морских и пресноводных животных / под ред. Е.М. Крепса. Л.: Наука, 1979. - С. 194-204.

22. Григорьева Г.М., Краснова Т.И., Хованских А.Е. и др. Выделение и каталитические свойства растворимой и мембранной холинэстеразы мозга капустной мухи Delia brassicae // Биохимия. 1987. - Т. 52, № 7. - С. 1192-1200.

23. Давидович В.В. Получение и характеристика БАД «Моллюскам» из мантии и щупалец кальмаров // Материалы 2-го Международного симпозиума «Пищевые биотехнологии: проблемы и перспективы в XXI веке». 2004. — С. 17—20.

24. Давидович В.В., Позднякова Ю:М. Состав и свойства ферментативных гидролизатов из двустворчатых моллюсков // Сб. тез. докл. Конф. молодых ученых ТИНРО. Владивосток: ТИНРО-Центр, 1999. - С. 202.

25. Дворецкая С. Новое в лечении детей, часто болеющих респираторно-вирусными инфекциями // Врач. 1996. - № 11. — С. 14-15.

26. Дроздов Н.С., Материнская Н.П. Практикум по биохимии. М. : Высш. шк., 1970. -255 с.

27. Кабачник М.И. Фосфорорганические физиологически активные вещества // Вести. АН СССР. 1964. - № 40. - С. 60-68.

28. Калиниченко Т.П., Ярочкин А.П., Тимчишина Г.Н., Кузнецов Ю.Н. Возможность ферментирования сырья при производстве майонеза из молок минтая // Изв. ТИНРО. 2008. - Т. 155. - С. 355-360. .

29. Карташева Н.В., Пашоков А.Н., Розенгарт В.И. Очистка ацетилхолинэстеразы мозга // Вопр. мед. химии. — 1967. —Т. 13, №1.,— С. 104—105.

30. Касьяненко Ю.И., Федорец Ю.А., Эпштейн Л.М. и др. Фосфагаза ткани зрительных ганглиев и гонад командорского кальмара // Исслед. по технол. новых, объектов промысла : сб. науч. тр- — Владивосток: ТШРО, 1980. С. 3-11.

31. Кизеветтер И.В. Биохимия сыр.»я воднох о происхождения : монография. -М.: Пищ. пром-сть, 1973. 416 с.

32. Клычкова Г.Ю. Разработка технологии комплексного препарата из хрящевой ткани кальмара, лосося и осетра // Материалы Всероссийской Интернет-конференции молодых ученых. Владивосток : ТИНРО-центр, 2004. - С. 164-170.

33. Ковалев Н.Н., Розенгарт Е.В., Хованский А.Е. Различия в свойствах холинэстеразы командорского кальмара из разных районов обитания // Вопр. эволюц. физиол. : Десятое совещ. по эволюц. физиол. : тез. сообщ. JI. : Наука, 1986. - С. 126.

34. Ковалев Н.Н., Розенгарт Е.В., Хованский А.Е. и др. Ингибиторная специфичность холинэстеразы командорского и тихоокеанского кальмаров // Технология гидробионтов : сб. науч. тр. Владивосток : ТИНРО, 1987. - С. 46-54.

35. Козловская В.И., Мензикова О.В., Чуйко Г.М., Майер Ф.Л. Холинэстеразы водных животных // Физиология, биохимия и токсикология пресноводных животных. Л., 1990. - С. 42-66.

36. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики : монография. М. : Мир, 1979. - 280 с.

37. Костылев Э.Ф., Рябошапко А.П. Биохимия сырья водного происхождения : монография. М.: Лег. пром-сть, 1982. - 142 с.

38. Кузник Б.И., Пинелис И.С., Хавинсон В.Х. Применение пептидных биорегуляторов в стоматологии : монография. СПб.: Эскулап, 1999. - 142 с.

39. Купина Н.М., Герасимова Н.А., Поваляева Н.Т. Биохимический способ удаления кожи с мантии кальмара // ХИПС. 2001. -№ 1. - С. 25-28.

40. Леванидов И.П., Захарова В.П. Химический состав промысловых моллюсков и иглокожих Сахалинского района // Изв. ТИНРО. 1968. - Т. 65. - С. 221230.

41. Мецлер Д. Биохимия. Т. 2: Химические реакции в живой клетке : монография.-М.: Мир, 1980.-580 с.

42. Моралев C.H., Базюкин А.Б. Факторный анализ чувствительности холинэстераз к необратимым ингибиторам // Журн. эволюц. биохим. и физиол. — j 997 j-33.-С. 296-301.

43. Моралев С.Н., Розенгарт Е.В. Современные представления о структуре и каталитических свойствах холинэстераз позвоночных и беспозвоночные // Журн эволюц. биохим. физиол. 1999. - Т. 35, № 1. - С. 1-14.

44. Моралев С.Н., Розенгарт Е.В. «Субстратное ингибирование» — один из аспектов субстратной специфичности холинэстераз позвоночных и беспозвоночных // Журн. эволюц. биохим. и физиол. 2001. - Т. 37, № 5. - С. 358-372.

45. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Выделение, очистка и идентификация имму-номодулирующего полипептида, содержащегося в тимусе телят и человека // Биохимия. 1981. - Т. 46, вып. 9. - С. 1652-1659.

46. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Пептидные биорегуляторы (25-летыий опыт экспериментального и клинического изучения) : монография. СПб. : Наука, 1996 - 74 с.

47. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Роль клеточных медиаторов (цитомединов) в регуляции генетической активности // Изв. АН СССР. Сер. биол. — 1985. — Вып. 4 -С. 581-587.

48. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., Малинин В.В. Пептидные тимомиметики монография. СПб.: Наука, 2000. - 158 с.

49. Мусил Я., Новакова О., Кунц К. Современная биохимия в cxeivrax : монография. -М. : Мир, 1984. -214 с.

50. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Бердутина А.В. Получение и очистка белковых гидролизатов // Прикл. биохим. и микробиол. 2000. - Т. 36, Jsfo 4. q 371379.

51. Неклюдов А.Д., Федорова Н.В., Илюхина В.П., Лисица Е.П. Ферментативный профиль автолизирующих дрожжей рода Saccharomyces // Прикл. биохим. и микробиол. 1993. - Т. 29, вып. 5. - С. 734-743.

52. Несис К.Н. Вертикальное распределение пелагических моллюсков // Журн. общ. биол. 1977. - Т. 38, вып. 4. - С. 547-558.

53. Несис К.Н. Краткий определитель головоногих моллюсков Мирового океана. -М. : Лег. и пищ. пром-сть, 1982. 360 с.

54. Несис К.Н. Океанические головоногие моллюски : монография. М. : Наука, 1985.-286 с.

55. Новгородцева Т.П., Караман Ю.К., Виткина Т.И., Касьянов С.П. Сравнительная характеристика биологической активности жиров из гепатопанкреаса камчатского краба и печени командорского кальмара // Вестн. ДВО РАН. 2007. -№ 6. - С.105-110.

56. Остерман JI.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование : монография. М.: Наука, 1981. - 286 с.

57. Пат. РФ № 2250047 Пищевой общеукрепляющий профилактический продукт из хрящевой ткани гидробионтов и способ его получения / Т.Н. Пивненко, Г.Ю. Клычкова, Н.Н. Ковалев и др. Бюл. изобретений. 2005. - № 11.

58. Певзнер Д.Л. Выделение, частичная очистка и некоторые свойства ацетилхолинэстеразы из эритроцитов крупного рогатого скота // Биохимия. 1965. - Т. 30, вып. 5. - С. 980-985.

59. Певзнер Д.Л. Частичная очистка и свойства ацетилхолинэстеразы эритроцитов // Первый Всесоюзный биохимический съезд. Л., 1964. - Т. 2. - С. 109.

60. Певзнер Д.Л., Григорьева Г.М., Розенгарт Е.В., Яковлев В.А. Выделение и очистка холинэстераз из крови млекопитающих // Тез. докл. Всесоюз. совещ. по произв. очищ. ферм, препаратов. Рига, 1963. - С. 22.

61. Пивненко Т.Н. Трипсиноподобные протеазы дальневосточных лососей : дис. .канд. биол. наук. Киев : Ин-т биохимии им. Палладина, 1986. - 176 с.

62. Пивненко Т.Н., Эпштейн Л.М., Позднякова Ю.М., Давидович В.В. Получение и характеристика белковых гидролизатов с использованием ферментных препаратов различной специфичности // Изв. ТИНРО. — 1997. Т. 120. - С. 23-31.

63. Позднякова Ю.М., Давидович В.В. Влияние специфичности ферментных препаратов на нуклеотидный состав гидролизатов молок различных видов рыб // Сб. тез. докл. конф. молодых ученых ТИНРО. Владивосток : ТИНРО-Центр, 1999.-С. 216.

64. Позднякова Ю.М., Давидович В.В. Исследование субстратной специфичности панкреатических сериновых протеаз различного происхождения // Тез. докл. конф. молодых ученых ТИНРО. Владивосток : ТИНРО-Центр, 1997.

65. Порус М.В., Дубачева Г.В., Сиголаева Л.В. и др. Определение активностей холинэстераз в смеси с использованием двухэлектродной сенсорной системы // Сенсор, системы. 2008. - Т. 22, № 1. - С. 86-93.

66. Практическая химия белка : монография / под ред. А. Драбре. М. : Мир,1989.

67. Розенгарт Е.В. Реакционная способность холинэстераз командорского кальмара Berryteuthis magister. Субстраты и фосфорорганические ингибиторы // Журн. эволюц. биохим. физиол. 1996. - Т. 32, № 5. - С. 576-582.

68. Розенгарт Е.В. Сравнительный анализ чувствительности протеаз (химот-рипсин, трипсин) и холинэстераз разного происхождения к некоторым фосфорор-ганическим ингибиторам // Журн. эволюц. биохим. физиол. 2009. — Т. 45, № 3. -С.277-283.

69. Розенгарт Е.В. Субстратно-ингибиторный анализ холинэстеразы гемолимфы тихоокеанского брюхоногого моллюска Neptunea eulimata // Журн. эволюц. биохим. физиол. 2001. - Т. 37, № 5. - С. 401-405.

70. Розенгарт Е.В., Басова Н.Е. Сравнительная энзимология холинэстераз лежит в основе биохимического метода таксономии кальмаров И Журн. эволюц. биохим. и физиол. 2005. - Т. 41, № 6. - С. 490-499.

71. Розенгарт Е.В., Басова Н.Е., Хованских А.Е., Эпштейн Л.М. Различные аспекты субстратной специфичности холинэстеразы зрительных ганглиев тихоокеанского кальмара Todarodes pacificus // Журн. эволюц. биохим. и физиол. 1996. -Т. 32, №4.-С. 384-391.

72. Розенгарт Е.В., Державин Д.К., Ковалев Н.Н. и др. Видовые различия в субстратной специфичности холинэстераз дальневосточных кальмаров семейства Gonatidae // ДАН. 1995. - Т. 342, № 5. - С. 703-704.

73. Розенгарт Е.В., Касьяненко Ю.И., Хованских А.Е., Эпштейн Л.М. Кислая фосфатаза кальмаров и других гидробионтов бассейна Тихого океана II Журн. эволюц. биохим. и физиол. 1993. - Т. 29, № 2. - С. 127-133.

74. Розенгарт Е.В., Ковалев Н.Н., Басова Н.Е., Эпштейн Л.М. Ингибиторная специфичность холинэстераз зрительных ганглиев кальмаров семейства Gonatidae // ДАН. 2000. - Т. 370, № 5. - С. 693-695.

75. Розенгарт Е.В., Хованских А.Е., Эпштейн JI.M. Исследование гомогенности холинэстераз нервной ткани кальмаров методом субстратно-ингибиторногэ анализа // Журн. эволюц. биохим. и физиол. 1994. - Т. 30, № 1. - С. 15-21.

76. Савиных В.Ф., Шевцов Г.А. Кальмары северной части Тихого океана: состояние запасов и перспективы промысла // Сб. ВИНИТИ. М. : Мировой океан, 2001.-Вып. 2.-С. 181-184.

77. Садыков А.С., Розенгарт Е.В., Абдувахабов А.А., Асланов Х.А. Холинэстеразы. Активный центр и механизм действия : монография. Ташкент : ФАН, 1976.-204 с.

78. СанПиН 2.3.2.560-96: Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов // Санитарные правила и нормы. -М., 1997.-С. 209.

79. Скоупс Р. Методы очистки белков : монография. М. : Мир, 1985. — 358 с.

80. Соколов О.Ю., Зотова В.В., Кузнецов С.М. и др. Экстракорпоральная им-мунокоррекция в терапии некоторых заболеваний // Человек и лекарство : тез. докл. 3-го рос. нац. конгр. -М., 1996. С. 209.

81. Стойкова Е.Е., Белякова С.В., Будников Г.К., Евтюгин Г.А. Ферментные тест-системы для определения остаточных количеств фосфорорганических пестицидов в растительном материале // Всерос. конф. "Химический анализ веществ и материалов". М., 2000. - С. 128.

82. Суховерхова Г.Ю., Пивненко Т.Н. Исследование специфичности ферментов к гидролизу хрящевой ткани гидробионтов // Материалы научно-практической конференции «Пищевая и морская биотехнология: проблемы и перспективы». -Калининград, 2006. С. 115-116.

83. ТИ № 36-46-07 по изготовлению ганглиев кальмара мороженых — сырья для производства БАД.

84. ТИ № 36-278-05 по изготовлению гидролизата ганглиев кальмара «Тинростим».

85. ТУ 6-16-1743-72. Препарат фермента ацетилхолинэстеразы из, эритроцитов крови человека, лиофилизированный.

86. ТУ 9280-1203-00472012-96. Пилорин марки А.

87. ТУ 9291-008-13684916-05. Препарат ферментный ЦеллоЛюкс-А для спиртовой и пивоваренной промышленности.

88. Турпаев Т.М., Абашкина Л.И., Бресткин А.П. и др. Холинэстераза зрительных ганглиев кальмара Ommastrephes sloanipacificus // Физиология и биохимия беспозвоночных.- Л.: Наука, 1968.-С. 121-130.

89. Швидкая З.П., Блинов Ю.Г. Химические и биотехнологические аспекты теплового консервирования гидробионтов дальневосточных морей : монография. -Владивосток: Дальнаука, 2008. 270 с.

90. Шевцова С.П., Бресткин А.П., Несис К.Н., Розенгарт Е.В. Об идентичности свойств холинэстераз зрительных ганглиев кальмара Бартрама из южной Атлантики и Большого Австралийского залива // Океанология. 1977. - Т. 17, вып. 6. -С. 1102-1105.

91. Эпштейн Л.М. Получение и свойства холинэстеразы : дис. . канд. биол. наук.-Л., 1974.

92. Эпштейн Л.М., Боровская Г.А., Левачев М.М. и др. Эффективность перо-рального применения нового иммунокорректора природного происхождения // Вопр. питан. 1997. -№ 1. - С. 10-13.

93. Эпштейн Л.М., Шевцов Г.А., Ковалев Н.Н., Розенгарт Е.В. Субстратная специфичность холинэстераз зрительных ганглиев кальмаров как показатель ценности сырья // Технология гидробионтов : сб. науч. тр. — Владивосток : ТИНРО, 1987.-С. 37-45

94. Яковлев В.А. Кинетика ферментативного катализа : монография. М.: Наука, 1965.-248 с.

95. Яковлев Г.М., Морозова В.Г., Хавинсон В.Х. Современные представления о цитомединах // Цитомедины. Функция в организме. Использование в клинической практике. Томск, 1986. - С. 9-11.

96. Яковлев Г.М., Новиков B.C., Хавинсон В.Х. Резистентность, стресс-регуляция : монография. Л.: Наука, 1990. - 238 с.

97. Aprison M.H., Jackson R.L. Solubilization of cholinesterase from rabbit caudate nuclei by surface active agents // Fed. Proc. 1961. - Vol. 20. - P. 341.

98. Ardle В., Thompson R.H.S., Wabster G.R. The action of lisolecithin and snake venom of whole cell preparations of brain, muscle and liver // J. Neurochem. 1960. -Vol. 5, № 2. - P. 135-144.

99. Barak D., Ordentlich A. et al. Allosteric modulation of acetylcholinesterase activity by peripheral ligands involves a conformational transition of the anionic subsite // Biochemistry. 1995. - Vol. 34. - P. 15444-15452.

100. Beljakova S.V., Stoikova E.E., Evtugyn G.A., Latypova V.Z. Enzymatic test kit for the rapid and sensitive detection of insecticides in the corn // Environ. Radioecol. Appl. Ecol. 2001. - Vol. 7, № 2. - P. 35-42.

101. Bergmann F., Rimon S., Segal R. Effect of pH on the activity of eel esterase towards different substrates // Biochem. J. 1958. - Vol. 68, № 3.

102. Bernheim F., Bernheim M.L. Action of drags on the cholinesterase of the brain. // J. Pharmacol. 1936. - Vol. 57. - P. 427-436.

103. Bourne Y., Taylor P., Marchot P. Acetylcholinesterase inhibition by fasciculin crystal structure of the complex // Cell. 1995. - Vol. 83. - P. 503-512.

104. Bullock K. Resistance of Acetylcholine esterase in dry preparations to certain organic solvents // Biochem. J. 1951. - Vol. 49, № 1.

105. Bullock Т.Н., Grunfest H., Nachmansohn D., Rothenberg M.A. Generality of the role of acetylcholine in nerve and muscle condition // J. Neurophysiol. — 1947. Vol. 10, № l.-P. 11-21.

106. Carlsen J.B., Svenmark A. Multiple forms of soluble butyrylcholinesterase in human brain // Biocem. Biophis. Acta. 1970. - Vol. 207. - P. 477-484.

107. Chan S.L., Shirachi D.Y., Hargava H.N. et al. Purification and properties of multiple forms of brain acetylcholinesterase // J. Neurochem. 1972. - Vol. 19, № 12. -P.2747-2758.

108. Choen J.R., Warringa M.G.P.Y. Methods to estimate the turnover number of preparations of red cell cholinesterase // Biochem. Biophys. Acta. 1953. - Vol. 11, № l.-P. 52-58.

109. Cygler M., Schrag J.D., Sussman J.L., et al. Relationship between sequence conservation and three-dimentional structure in a large family of esterases, lipase and related proteins // Protein Science. 1993. - Vol. 2. - P. 366-382.

110. Ecobichon D.J., Israel Y. Characterization of the esterases from electric tissue of Electrophorus by starch-gel electrophoresis II Can. J. Biochem. 1967. - Vol. 45, № 7. -P. 1099-1105.

111. Ellman G.L., Courtney K.D., Andres V.Jr., Featherstone R.M. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity // Biochem. Pharmacol. 1961. - Vol 7, № 1. - P. 88-95.

112. Folch J., Les M., Sloane-Stanly G.H. Method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues // J. Biol. Chem. 1957. - Vol. 226, № 1. - p. 497-509.

113. Fournier D., Mutero A., Pralavorio M., Bride J.M. Drosophila acetylcholinesterase: mechanism of resistance to organophosphates II Chem. Biol. Interact. — 1993. -Vol. 87.-P. 233-238.

114. Gibney G., Camp S., Dionne M. Mutagenesis of essential functional residues in acetylcholinesterase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - Vol. 87. - P. 7546-7550.

115. Glauert A.M. Electron microscopy of lipids and membranes // J. Roy. Microscop. Soc. 1968. - Vol. 88, № 1. - P. 49-70.

116. Gnatt A., Loewenstein Y., Yaron A. et al. Site-directed mutagenesis of active site residues reveals plasticity of human butyrylcholinesterase in substract and inhibitor interactions // J. Neurochem. 1994. - Vol. 62. - P. 749-755.

117. Haas R., Braudt P.T., Knigt J., Rosenbery T.L. Identification of amino components in a glicolipid membrane-binding domain at the C-terminus of human erythrocyte acetylcholinesterase//Biochemistry. 1986. - Vol. 25, № 11. -P. 3098-3105.

118. Ho I.K., EHman G.L. Triton solubilized acetylcholinesterase of brain // J. Neurochem. 1969.-Vol. 16, № 11.-P. 1505-1513.

119. Hsiao Y.M., Lai J.Y., Liao H.Y., Feng H.T. Purification and characterization of acetylcholinesterase from oriental fruit fly (Bactrocera dorsalis (Hendel)) (Diptera:

120. Tephritidae) // J. of Agricultural and Food Chemistry. 2004. - Vol. 52, Iss 17. - P. 5340-5346.

121. Hussein A.S., Grigg M.E., Selkirk M.E. Nippostrongylus brasiliensis: Characterisation of a somatic amphiphilic acetylcholinesterase with properties distinct from the secreted enzymes //Experimental Parasitology. 1999. - Vol. 91, Iss 2. - P. 144-150.

122. Jackson P., Whittaker N. Some characteristics of acetylcholinesterase extracted from human erythrocytes by three different detergents // Enzymologia. 1972. - Vol. 43. -P. 359-372.

123. Jackson R.L. Aprison M.H. Mammalian brain acetylcholinesterase. Effects of surface active agents // J. Neurochem. 1966. - Vol. 13. - P. 1367-1371.

124. Jackson R.L., Aprison M.H. Mammalian brain acetylcholinesterase: purification and properties //J. Neurochem. 1966. - Vol. 13. - P. 1356-1365.

125. Jebali J., Bani M., Guerbej H. et al. Effects of malathion and cadmium on acetylcholinesterase activity and metallothionein levels in the fish Seriola dumerilli // Fish. Physiol. Biochem. 2006. - Vol. 32. - P. 93-98.

126. Karnovsky M., Roots L.A. "Direct-colouring" thiocholine method for choli-nesterases // Histochem. Cytochem. 1964. - Vol. 12. - P. 219-226.1.uzinger W. The number of catalytic sites in acetylcholinesterase // Biochem. J. 1971.-Vol. 123, №2.-P. 134-141.

127. MacPhee-Quigley K., Taylor P., Taylor S. Primary structure of the catalytic subunits form two molecular form of acetylcholinesterase // Biol. Chem. 1985. - Vol. 260.-P. 12185-12189.

128. Marcos M.R., SanchezYague J., HernandezHernandez A., Llanillo M. Amphiphilic and hydrophilic forms of acetylcholinesterase from sheep platelets // Bio-chimicaetBiophysica Acta-Biomembranes.- 1998.-Vol. 1415, Iss l.-P. 163-173.

129. Massoulie J., Sussman J.L., Doctor B.P. Recommendation for nomenclature in cholinesterases // Multidisciplinary approaches to Cholinesterase Fanction : Plenum Press, 1992.-P. 285-288.

130. Miller D.M. Total solubilization of erythrocyte membranes by nonione detergents // Biochem. Biophis. Acta. 1970. - Vol. 207. - P. 716-722.

131. Nachmansohn D. Chemical and molecular basis of nerve activity. NY; L.: Academic Press, 1959. - 235 p.

132. Neuman E. The reaction of acetylcholine receptor and esterase and bioelectric signal generation //J. Physiol. Chem. 1981. - Vol. 362, № 10. - P. 1907-1911.

133. NietoCeron S., MoralNaranjo M.T., MunozDelgado E. et al. Molecular properties of acetylcholinesterase in mouse spleen // Neurochemistry International. 2004. -Vol. 45, Iss l.-P. 129-139.

134. Ollis D.L., Cheah E., Cygler M., et al. The alfa/beta hydrolase fold // Protein Engineering. 1992. - Vol. 5. - P. 197-211.

135. Ord M.B., Thomson R.H.S. Pseudo-cholinesterase activity in the central nervous system // Biochem. J. 1950. - Vol. 46. - P. 346.

136. Ord M.G., Thompson R.H.S. Pseudo-cholinesterases activity in the central nervous system //Biochem. J. 1952. - Vol. 51. - P. 245-251.

137. Ord M.G., Thompson R.H.S. The preparation of soluble cholinesterases from mammalian heart and brain // Biochem. J. 1951. - Vol. 49, № 1. - P. 191-199.

138. Palmer T. The Cholinesterases // J. of Biological Chemestry. 1991. - Vol. 266, №7.-P. 4025-4028.

139. Podolska M., Napierska D. Acetylcholinesterase activity in host (herring Clupea harengus) and parasites (Anisakis simplex larvae) from the southern Baltic// J. of Marine Science. 2006. - Vol. 63. - P. 161-168.

140. Radic Z., Gibney G., Kawanoto S. et al. Expression of recombinant acetylcholinesterase in a baculovirus system: kinetic properties of glutamate 199 mutants // Biochemistry. 1992. - Vol. 31. - P. 9760-9767.

141. Ripoll D.R., Faerman C.H., Axelsen P. H. et al. An electrostatic mechanism for substrate down the aromatic gorge of acetylcholinesterase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - Vol. 90. -P. 5128-5132.

142. Rosenfeld С., Kousba A., Sultatos L.G. Interactions of rat brain acetylcholinesterase with the detergent Triton X-100 and the organophosphate paraoxon // Toxico-logical Sciences.-2001.-Vol. 63, Iss 2.-P. 208-213.

143. Shafferman A., Velan В., Ordentlich A. et al. Substrate inhibition of acetylcholinesterase: residues affecting signal transduction from the surface to the catalytic center // EMBO J. 1992. - Vol. 11. - P. 3561-3568.

144. Sussman J.L., Harel M., Frolow F. et al. Atomic structure of acetylcholinesterase fron Torpedo californica: A prototypic acetylcholine-binding protein // Science. 1991. - Vol. 253.-P. 872-879.

145. Tan R.C., Truong T.N., McCammon J.A., Sussman J.L. Acetylcholinesterase: electrostatic steering increases the rate of ligand binding // Biochemistry. 1993. - Vol. 32.-P. 410-413.

146. Toschi G.A. A biochemical study of brain microsomes //Exp. Cell. Rec. 1959. -Vol. 16, №2.-P. 232-255.

147. Vellom D.C., Radic Z., Li Y. et al. Amino acid residue controlling acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase specificity // Biochemistry. 1993. - Vol. 32. - P. 12-17.

148. Wilson I.B., Harrison M.A., Ginsburg S. Carbamyl derivatives of acetylcholi-nesteiase // J. Biol. Chem. 1961. - Vol. 236, № 5. - P. 1498-1500.

149. Zoran A., Matjaz Z., Milan S. Inhibition of erythrocyte acetylcholinesterase by n-butanol at high concentration // Arch. Biochem. and Biophys. 2005. - Vol. 437, № 1. -P. 78-84.

150. ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО РЫБОЛОВСТВУ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УНИТАРНОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ «ТИХООКЕАНСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ РЫБОХОЗЯЙСТВЕННЫЙ ЦЕНТР» ( ФГУП «ТИНРО-Центр»)1. ОКП 92 8902етрунин 05 г

151. Группа Н 28 (ОКС 67.120.30)1. ЩОКДАЮbHbijf директор . -Центр» Л.Н. Бочаров 5 //.2005 г

152. ПРЕПАРАТ ФЕРМЕНТА ПРОПИОНИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ

153. Технические условия ТУ 9289-295-00472012-05 (впервые)

154. Дата введения в действие 30,12.2005 г1. РАЗРАБОТАНОЧ

155. Научный сотрудник Г. А. Боровска

156. Младшийнаучныйалрудник ^^ ЕВ.Михеев1. Владивосток 2005

157. ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО РЫБОЛОВСТВУ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УНИТАРНОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ «ТИХООКЕАНСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ РЫБОХОЗЯЙСТВЕННЫЙ ЦЕНТР» ( ФГУП «ТИНРО-Центр»)1. ОКП 92 8902лектор ЮХТ» 'етрунин 05 г

158. Группа Н 28 (ОКС 67.120.30)1. ЕРЖДАЮъшлй директор . ►-Центр» Л.Н. Бочаров £/£2005 г

159. ПРЕПАРАТ ФЕРМЕНТА ПРОПИОНИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ

160. Технические условия ТУ 9289-295-00472012-05 (впервые)

161. Дата введения в действие 30.12.2005 г1. РАЗРАБОТАНОЧ

162. Научный сотрудник -^Pfcj^ Г. А. Боровска: Младший научный сотрудник ЕВ. Михеев1. Владивосток 2005

163. Результаты тестов приведены в таблице. ,»

164. Начальник лаборатории промышленной индикации1. Л.Ф. Морозова