автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.04, диссертация на тему:Исследование свойств покоящихся форм микроорганизмов и разработка методики их определения в молочной продукции с длительными сроками годности

На правах рукописи

ГРИНЕВИЧ АЛЕКСАНДРА ИВАНОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ ПОКОЯЩИХСЯ ФОРМ МИКРООРГАНИЗМОВ И РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ ИХ ОПРЕДЕЛЕНИЯ В МОЛОЧНОЙ ПРОДУКЦИИ С ДЛИТЕЛЬНЫМИ СРОКАМИ ГОДНОСТИ

Специальность 05.18.04 - Технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

13 ноя 2014

Москва-2014

005555104

Работа выполнена на кафедре «Технология мясных и молочных продуктов» ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств»

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор Ганина Вера Ивановна

Официальные оппоненты: Стоянова Лидия Григорьевна

доктор биологических наук, ФГБОУ ВГТО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова», биологический факультет, старший научный сотрудник кафедры микробиологии. Рожкова Ирина Влалимпровна

кандидат технических наук, ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности», заведующая Центральной лабораторией микробиологии.

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Российский государственный аграрный

университет - МСХА имени К. А. Тимирязева».

Защита состоится «16» декабря 2014 г в 14 часов 30 минут

на заседании Диссертационного совета ДМ 006.021.01 при Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский институт мясной промышленности им. В.М. Горбатова» по адресу: 109316, Москва, ул. Талалихина, д. 26.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБНУ «ВНИИМП им. В.М. Горбатова».

Автореферат разослан «?.?» О/аиВкл. 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат технических наук, старший научный сотрудник

А.Н.Захаров

Актуальность темы исследования:

В мировой практике большое внимание уделяется вопросам безопасности пищи, что особенно актуально в условиях расширения торговли между разными странами. По информации, прозвучавшей на Международном конгрессе по микробиологии, количество крупномасштабных вспышек от молочной продукции, зараженной в едином источнике, и производимой в разных странах мира, в последние годы интенсивно увеличивается. Учёные полагают, что это вызвано резким изменением свойств уже известных микроорганизмов, и связано с созданием многокомпонентных продуктов и их длительными сроками годности.

В нашей стране и за рубежом отмечают случаи ухудшения показателей качества в поздние сроки годности молочной продукции и даже её забраков-ки при стандартных микробиологических показателях. К сожалению, причины возникновения таких изменений при соблюдении условий хранения продукции часто не ясны.

Некоторые учёные полагают, что одной из причин изменения показателей качества могут быть покоящиеся формы клеток остаточной микрофлоры и микрофлоры вторичного обсеменения продукции. В это состояние микроорганизмы могут переходить при действии различных стрессовых факторов. В ряде исследований отмечаются случаи образования покоящихся форм патогенными микроорганизмами, например энтеропатогенными штаммами E.coli, Yersinia enterocolitica, Shigella dysenteriae. Vibrio cholerae. Доказано, что при потере клетками способности к образованию колоний на питательных средах, клетки могут синтезировать токсины, а также у них сохраняется активность факторов вирулентности.

Стандартные микробиологические подходы оценки качества и безопасности молочной продукции не отражают наличие в продукте покоящихся форм клеток микроорганизмов остаточной микрофлоры и микрофлоры вторичного обсеменения продукции.

Степень разработанности темы: Вопросы качества, микробиологической безопасности и нормирования молочной продукции с длительными сроками годности всегда были в поле зрения научных исследований, как в нашей стране, так и за рубежом: Бирюкова З.А, Галстян А.Г., Голубева JI.B., Дун-ченко Н.И., Ефимочкина Н.Р., Королева Н.С., Лешина B.C., Остроумов JI.A., Петров А.Н., Радаева И.А., Рожкова И.В., Семенихина В.Ф., Свириденко Г.М., Тихомирова H.A., Харитонов В.Д., Храмцов А.Г., Шевелева С.А., Britz Т..J., Lewis M.J.,и др.

Большой вклад в изучение явления образования покоящихся форм и перехода клеток в некультивируемое состояние сделали Ленченко Е.М., Лойко Н.Г., Мулюкин А.Л., Стоянова Л.Г., Эль-Регистан Г.И., Bjergbak L.A., Lowder М.А., Nilsson L., Oliver J.D., Stevenson B.S. и другие.

Однако вопрос наличия и изучения покоящихся форм микроорганизмов в молочной продукции с длительными сроками годности практически не изучен. В связи с этим актуальными являются исследования в области выявления и изучения свойств покоящихся форм микроорганизмов, а также совершенствования методов микробиологического контроля молочной продукции с длительными сроками годности.

Цель и задачи исследования: Целью настоящей работы являлось научное обоснование причин порчи молочной продукции в поздние сроки годности на основании изучения условий реактивации и свойств покоящихся форм микроорганизмов, а также разработки методики их определения для повышения качества и обеспечения микробиологической безопасности готовой продукции.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

- обосновать рациональные условия реактивации покоящихся форм клеток в молочной продукции с длительными сроками годности;

- выделить покоящиеся формы клеток микроорганизмов из молочной продукции с длительными сроками годности и изучить их морфологические, биохимические свойства;

- изучить действие покоящихся форм клеток микроорганизмов на тест-культуры санитарно-показательных и условно-патогенных микроорганизмов и представителей заквасочной микрофлоры;

- изучить влияние штаммов покоящихся форм клеток микроорганизмов на показатели качества молочной продукции, вырабатываемой при использовании высоких режимов тепловой обработки, включая продукты для детского питания;

- разработать методику по определению покоящихся форм клеток микроорганизмов в молочной продукции с длительными сроками годности. Научная новизна работы: Обоснованы рациональные условия реактивации покоящихся форм клеток микроорганизмов, присутствующих в молочной продукции с длительными сроками годности.

Покоящиеся формы микроорганизмов впервые выделены из стерилизованного и ультрапастеризованного молока, молочно-растительной продукции, проведены исследования их биохимических и морфологических свойств. Показано, что выделенные штаммы покоящихся форм клеток микроорганизмов имели палочковидную или кокковую формы; были как грамот-рицательными, так и грамположительными; обладали протеолитической и липолитической активностью.

Выявлено, что выделенные штаммы покоящихся форм клеток могут стимулировать развитие санитарно-показательных и условно-патогенных микроорганизмов, возбудителей порчи молочной продукции с длительными сроками годности, а также способны подавлять развитие представителей полезной заквасочной микрофлоры.

Установлено, что режим тепловой обработки молочного и молочно-раститсльного сырья, использусмыи для определения степени летальности микроорганизмов остаточной и вторичного обсеменения микрофлоры, а

5

именно температура (120 ± 1) °С в течение 15 мин. не приводит к гибели выделенных штаммов покоящихся форм клеток микроорганизмов. Теоретическая и практическая значимость Выдвинута и подтверждена гипотеза о возможности присутствия покоящихся форм клеток микроорганизмов в стерилизованном и ультрапастеризованном молоке, стерилизованной молочно-растительной продукции, которые могут приводить к возникновению её порчи на поздних сроках хранения. Расширены представления о свойствах покоящихся форм микроорганизмов.

Определены параметры методики количественного учета покоящихся форм микроорганизмов в молочной продукции с длительными сроками годности: стрессовое воздействие при температуре (70 ± 1) °С в течение 5 мин. и минус (18 ± 1) °С в течение 120 мин. на пробу контролируемого продукта с последующим высевом на питательную среду определенного состава и культивированием посевов при температуре 30 "С и 37 °С в течение 7 дней.

Разработана и утверждена «Методика определения покоящихся форм микроорганизмов в остаточной микрофлоре полных консервов», включая молочную продукцию с длительными сроками годности.

Проведена апробация разработанной методики при контроле молочной продукции с длительными сроками годности в условиях «Испытательного центра пищевой продукции и продовольственного сырья ВНИИКОП» (Аттестат аккредитации РОСС 1Ш.0001.21ПН85 от 29.07.2011). Результаты проверки методики показали возможность её реализации при контроле молочной продукции для выявления причин порчи и прогнозирования сроков годности.

Результаты исследований внедрены в учебный процесс: использованы в курсах лекций по дисциплине «Технология молока и молочных продуктов» и «Микробиология продуктов детского питания» для студентов специальности 260303.65 и направления 260200.68.

Методология и методы исследовании Методология настоящего научного исследования базировалась на изучении работ отечественных и зарубежных

б

ученых, посвященных явлению анабиотического покоя клеток микроорганизмов в различных условиях.

Экспериментальные исследования проводили в соответствии со стандартными микробиологическими, физико-химическими и органолептически-ми методами, а также оригинальными методами, которые использовали при выявлении покоящихся форм микроорганизмов. Математическую и графическую обработку данных проводили с помощью программы Microsoft Office Excel.

Достоверность результатов работы подтверждается 3-5 кратной повторно-стыо проведенных опытов и воспроизводимостью экспериментальных данных, полученных с использованием современных стандартных и оригинальных методов исследования и их математической обработкой. Апробация работы Основные положения исследовательской работы опубликованы в научных журналах и сборниках следующих международных научно-технических конференций: X Международная научная конференция студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения»; V международная научно-техническая конференция «Безопасность и качество продуктов питания»; Международная научно-практическая конференция «Новые подходы, принципы и механизмы повышения эффективности производства и переработки сельскохозяйственной продукции». Результаты работы доложены на 6-ой научной конференции молодых ученых и специалистов НИИ Отделения хранения и переработки сельскохозяйственной продукции «Фундаментальные основы и передовые технологии в пищевой и перерабатывающей промышленности» 16 октября 2012 года и IV международной научно-практической конференции «Детское и специальное питание» 23 апреля 2014 года.

Публикации: Г1о материалам диссертационной работы опубликовано 11 печатных работ, в том числе 5 статей в журналах, рекомендованных перечнем

П Л V

Структура и объем работы Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, выводов, списка литературы, включающей 206 источников (в том числе 117 на иностранных языках). Работа изложена на 146 страницах текста, содержит 24 таблицы, 31 рисунок и 9 приложений.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1 - Обзор литературы

Проведен анализ научных трудов отечественных и зарубежных ученых по теме диссертации. Рассмотрены тенденции развития рынка производства молочной продукции с длительными сроками годности. Проведен анализ литературы, касающейся методов контроля стерилизованной продукции; возникновения пороков и причины их появления; изменения свойств микроорганизмов, в частности явления перехода в покоящееся состояние. Показана биологическая опасность, связанная с появлением новых свойств у микроорганизмов, попадающих в пищевые продукты. На основании анализа обзора научно-технической литературы были сформулированы цель и задачи исследования.

Глава 2 - Организация работы, объекты и методы исследования

Схема постановки экспериментальных исследований представлена на рис.1.

Основная экспериментальная часть работы выполнена на кафедре «Технология мясных и молочных продуктов» (до июля 2013 г. - «Технология молока и молочных продуктов») ФГБОУ ВПО МГУПП. Ряд исследований осуществлялся на базе ГНУ ВНИИКОП Россельхозакадемии и ФГБУ «Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского» РАН.

В качестве объектов исследования были использованы:

- средние пробы, составленные из образцов молочной продукции с длительными сроками годности: стерилизованное и ультрапастеризованное молоко; стерилизованные сывороточные напитки; стерилизованные продукты для детского питания на основе молочного и растительного сырья;

- штаммы покоящихся форм клеток микроорганизмов, выделенные из молочной продукции с длительными сроками годности;

з

- модельные образцы молочной продукции, зараженные выделенными штаммами покоящихся форм микроорганизмов, сразу после тепловой обработки и в процессе хранения.

Рис. 1 — Схема проведения исследований

Показатели, определяемые при проведении исследований:! — кислотность титруемая; 2 - промышленная стерильность; 3 - микроскопирование

(стандартное); 4 - микроскопирование с люминесцентным красителем Live/Dead; 5 - определение количества клеток; 6 - состав питательной среды; 7 - определение углеводного метаболизма; 8 - определение липолитических свойств; 9 - определение протеолитических свойств; 10 - определение массовой доли жира; 11 - определение массовой доли белка; 12 - жирно-кислотный состав продукта; 13 -массовая доля углеводов; 14 -антагонистическая активность по отношению к E.coli и S. aureus; 15 - массовая доля СОМО; 16 - органолептическая оценка; 17 - температура; 18- время; 19-действие на представителей заквасочной микрофлоры.

При проведении исследований использовали штаммы из коллекции МГУПП: Streptococcus thermophilic СТ-95 (ВКПМ В-7985), Lactobacillus acidophilus АСТ-44 (ВКПМ В-9647), Lactococcus lactis subsp. lactis 220, а также культуры Escherichia coli B-125 и Staphylococcus aureus 209-P из коллекции ГИСК им. JT.A. Тарасевича, тест-культуру Bacillus macerans из коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИКОП.

Идентификацию выделенных штаммов микроорганизмов и исследование биохимических свойств проводили микробиологическими методами и с использованием набора для идентификации api 50 СН, и api Staph, фирмы Bi-omerieux и программного обеспечения apiweb, а также секвенированием 16s рРНК по Сэнгеру

Выработки опытной партии молочной продукции с длительными сроками годности, зараженной исследуемыми штаммами, осуществляли в стерилизаторе СТ 02.00.000 ПКФ «Промсервис» технологического стенда ГНУ ВНИИКОП.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ АНАЛИЗ Глава 3 - Экспериментальное обоснование рациональных условий реактивации покоящихся форм клеток микроорганизмов из молочной и мо-лочно-растительной продукции с длительными сроками годности

Предполагали, что количество покоящихся форм клеток микроорганизмов в исследуемых продуктах значительно меньше, чем в объектах окружа-

10

ющей среды, что обусловлено высокой температурной обработкой в технологическом цикле. Кроме того, свойства исследуемой молочной продукции не позволяют проводить типовую операцию реактивации - отмывку клеток от аутоиндукторов анабиоза. В связи с отмеченными особенностями, определение условий реактивирования клеток проводили путём выбора рациональной комбинации воздействия

Отсутствие температурного воздействия

% <

Факторы воздействия

9 ю 11 1г

Воздействие температуры (70*1) °С.'

456789 10 И и .Фактооы-Еозяейстаин______________

Воздействие температуры минус (18±1) °С

■ а

Л

I;

5 6 7 8 9 10 11 12 Факторы воздействия

Рис. 2 - Реактивация покоящихся форм микроорганизмов из образцов: а - стерилизованного молока; Ь - ультрапастеризованного молока

различных температур, состава питательной среды и времени культивирования. В ходе исследований использовали: стандартные агаризо-ванные питательные среды, применяемые для количественного учета КМАФАнМ; эти же среды с добавлением 0,1 % пировиноградной кислоты; среды с ограниченным количеством питательных веществ и среды, применяемые для реактивации покоящихся форм микроорганизмов из объектов окружающей среды. Другим фактором являлось температурное воздействие: ^ — отсутствие температурного воздействия; действие температуры - ^ - (70 ± 1) °С в течение 5 минут; действие низкой температуры - Х2 - минус (18 ± 1) °С в течение 120 минут. Результаты совместного действия двух факторов на реактивацию покоящихся форм микроорганизмов из образцов молочной продукции с длительными сроками годности представлены на рисунках 2-3.

Отсутствие температурного воздействия

100 1 *

ге о: & в ■ а

£ эГ шь

§ §20 б с 0 1 2 3 45 67 89 10 11 12 Факторы воздействия

Воздействие температуры (70+1) "С

I*.

3" Е8

Ш О. 5 О

I

1.1

4 5 6 7 8 9 10 II 12 Факторы воздействия

Воздействие температуры минус (18±1) "С

6

I»

« 3

||

с

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 факторы воздействия

Статистическая обработка данных при доверительной вероятности 0,85 выявила отличия в чувствительности к реактивирующим факторам.

Анализ данных показывает, что воздействие температур (70 ± 1) °С в течение 5 минут и минус (18 ± 1) °С в течение 120 минут способствуют прорастанию покоящихся форм клеток микроорганизмов, в то время как отсутствие температурного стрес-

Рис. 3 - Реактивация покоящихся форм микроорганизмов из образцов: а - стерилизованного сывороточного напитка; Ь — стерилизованной молочно-

растительной продукции для детского питания

Таким образом, был сделан вывод о том, что для реактивации покоящихся форм клеток микроорганизмов из образцов молочной продукции с длительными сроками годности их необходимо подвергать температурному

са практически не вызывает рост клеток.

Полученные данные демонстрируют, что покоящиеся формы клеток микроорганизмов в большей степени выявлены во всех образцах молочной продукции с длительными сроками годности при использовании питательных сред - сухой питательный агар (реактивирующий фактор 3) и мя-со-иептонный агар (фактор 6).

стрессу с последующим высевом на питательную среду и дальнейшим культивированием при температуре 30 °С и 37 °С в течение 7 суток.

В результате проведенных исследований были выделены штаммы, реактивированные после различных воздействий, из молочной продукции с длительными сроками годности. Впервые установлено, что в стерилизованной молочной продукции могут присутствовать покоящиеся формы клеток микроорганизмов.

Глава 4 - Изучение свойств реактивированных штаммов покоящихся форм клеток микроорганизмов, перешедших в вегетативное состояние

1.1 Изучение морфологических и биохимических свойств выделенных штаммов. Идентификация микроорганизмов

Морфологические свойства выделенных штаммов приведены в таблице 1

Микроскопические исследования продемонстрировали, что реактивированные штаммы представлены разными морфологическими формами. Характерно, что для некоторых групп молочных продуктов свойственны определенные типы микроорганизмов: стерилизованное молоко — грамположитель-ные кокки; ультрапастеризованное молоко - грамотрицательные кокки; стерилизованные сывороточный напиток и молочно-растительный продукт — грамположительные палочки. Оптимальная температура роста для всех культур 37 °С, это позволяет заключить, что выделенные штаммы являются термофильными микроорганизмами.

Таблица 1 - Свойства реактивированных покоящихся форм клеток микроорганизмов

Шифр Источник Реактивирующее Пределы темпера- Описание

выделения воздействие турного роста,° С морфологии, окраска по Граму

1М1 Молоко стерили- минус (18 ± 1) °С, в тече- Min. - 20 °С Грамположи-

зованное ние 120 минут. Культиви- Мах. - 50 °С тельные кок-

рование на СПА Оптимум - 37 °С ки

1Т Молоко стерили- (70 ± 1) °С, в течение 5 Min.-30 °С Грамположи-

зованное минут. Культивирование Мах. -42 °С тельные

на МПА Оптимум - 37 °С Кокки

2К1 Ультрапастеризо- без температурного воз- Min. - 30 °С Грамотрица-

ванное молоко действия. Культивирова- Мах.-42 °С тельные

ние на МПА Оптимум - 37 °С Кокки

2М Ультрапастеризо- минус (18 ± 1) °С, в тече- Min. - 30 "С Грамотрица-

ванное молоко ние 120 минут. Культиви- Мах.-42 °С тельные

рование на МПА Оптимум - 37 °С Кокки

ЗТ Стерилизованный (70 ± 1) °С, в течение 5 Min. — 20 °С Грамположи-

сывороточный минут. Культивирование Мах. -50 "С тельные па-

напиток на СПА Оптимум - 37 °С лочки

ЗТ1 Стерилизованный (70 ± 1) °С, в течение 5 Min.-20 °С Грамположи-

сывороточный минут. Культивирование Мах. - 50 "С тельные

напиток на МПА Оптимум -37 °С палочки

ЗТ2 Стерилизованный (70 ± 1) °С, в течение 5 Min. - 20 °С Грамположи-

сывороточный минут. Культивирование Мах. - 50 °С тельные

напиток на МПА Оптимум - 37 °С палочки

4M Стерилизованный минус (18 ± 1) °С, в тече- Min. - 15 °С Грамположи-

молочно- ние 120 минут. Культиви- Мах.-50°С тельные па-

растительный рование на СПА Оптимум - 37 °С лочки

продукт для дет-

ского питания

4Т1 Стерилизованный (70 ± 1) °С, в течение 5 Min.-20 °С Грамположи-

молочно- минут. Культивирование Мах. - 50 °С тельные па-

растительный на СПА Оптимум - 37 °С лочки

продукт для дет-

ского питания

В результате реактивации покоящихся форм клеток микроорганизмов из молочной продукции с длительными сроками годности выделено 9 штаммов. Установлено, что среди выделенных штаммов 4 имели форму кокков и 5 — палочек. Выявлено, что 7 штаммов были грамположительными и 2 штамма -грамотрицательными.

4.2 Определение липолитических и протеолитических свойств выделенных штаммов

Задачей данного этапа исследования являлось изучение способности выделенных штаммов к синтезу протеолитических и липолитических ферментов, потенциально способных вызывать порчу молочной продукции с длительными сроками годности.

Протеолитические свойства определяли по зонам просветления, образованным изучаемыми штаммами на водно-молочном агаре, липолитические свойства - по росту на среде с говяжьим жиром. Полученные данные представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Протеолитические и липолитические свойства выделенных

штаммов покоящихся форм клеток микроорганизмов

Наименование выделенного штамма Количество протеолитических клеток, КОЕ/см3 Количество липолитических клеток, КОЕ/см3

ЗТ - 8,3± 0,3- 10'

ЗТ1 3,б± 0,2- 10' -

ЗТ2 2,0± 0,1-10' 2,0±0,1- 10'

4Т1 - 5,3± 0,4- 10'

4М 1,0± 0,2- 10® 1,3±0,1- Ю6

2М - -

2К1 2,4± 0,6- 10' 1,5± 0,3- 10"

1М1 - 1,9±0,7- 10'

1Т 2,0±0,1- 10' -

Таким образом, все штаммы, за исключением 2М, обладают способностью к синтезу протеолитических или липолитических ферментов. Отмечено, что штаммы ЗТ2, 2К1 и 4М способны синтезировать как протеолитические, так и липолитические ферменты. Полученные данные указывают на возможность порчи продукта за счет протеолиза белковой фазы и/или липолиза жировой фазы продукта в случае наличия покоящихся форм клеток микроорганизмов и их перехода в вегетативное состояние.

4.3 Изучение взаимодействия выделенных штаммов с полезной и посторонней микрофлорой молочной продукции

Для более полной характеристики выделенных штаммов покоящихся форм клеток микроорганизмов, перешедших в вегетативное состояние, было изучено их действие на представителей полезной микрофлоры кишечника и

15

используемой в заквасках для получения кисломолочных продуктов детского питания, а также с посторонней микрофлорой кишечника, которая одновременно может быть возбудителем пороков молочной продукции. Данные

Рис. 4 - Взаимодействие реактивированных штаммов покоящихся форм кле-клеток микроорганизмов с E.coli

Рис. 5 - Взаимодействие реактивированных штаммов покоящихся форм клеток микроорганизмов со S. aureus

Рис. 6 - Взаимодействие реактивированных штаммов покоящихся форм клеток микроорганизмов с полезной микрофлорой молочной продукции -пробиотической культурой L. acidophilus В результате проведенных исследований выявлено угнетение роста про-биотических и молочнокислых бактерий при совместном развитии с изученными штаммами.

Наиболее выраженное угнетение исследуемые штаммы оказывали на Lactobacillus acidophilus и Lactococcus lactis, в меньшей степени на — Strepto-

представлены на рисунках 4-6.

Действие реактивированных штаммов на С. сой В- 12 5

Действие реактивированных штаммов на Lactobacillus acidophilus (ACT - 44)

coccus thermophilus. Реактивированные штаммы не ингибировали рост условно-патогенных и санитарно-показательных микроорганизмов.

Анализ данных позволяет сделать заключение о возможном вреде исследуемых форм микроорганизмов для здоровья человека и отрицательном влиянии на показатели качества молочной продукции.

Глава 5 - Изучение влияния штаммов покоящихся форм микроорганизмов на показатели качества молочной продукции, вырабатываемой при использовании высоких режимов тепловой обработки

5.1Получение покоящихся форм выделенных культур С целью исследования динамики отмирания клеток и образования покоящихся форм, реактивированные штаммы были заложены на хранение при температуре (4 ± 2) °С на плотных питательных средах. Результаты инкубирования культур на плотных агаризованных средах в течение 12 месяцев представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Динамика отмирания клеток и образования покоящихся форм после 1 года инкубации

Наименование штамма Количество клеток на постстаццонарноп стадии развития, % Количество рефрактерных клеток, % Количество мертвых клеток, %

1Т 3 7 90

1М1 28,2 19,3 52,5

2К1 0 0 100

2М 5,7 0 94,3

ЗТ 8,5 45,2 46,3

ЗТ1 6,2 40,6 53,2

ЗТ2 35,5 24,5 40

4Т1 23,4 38,7 37,9

4М 12 48,7 39,3

Анализ данных показывает, что применённые условия образования покоящихся форм (инкубация в течение 12 месяцев при низкой температуре (4 ± 2) =С на плотной питательной среде) оказывали разное действие на исследуемые штаммы: штаммы 1Т, 2К1 и 2М характеризовались высоким про-

17

центом мертвых клеток, соответственно 90 %, 100 % и 94,3 % и небольшим процентом или отсутствием рефрактерных (покоящихся) форм — 7 %, 0 % и 0 %; остальные штаммы показывали разный процент образования покоящихся форм: от 7 % - штаммом 1Т до 48,7 % - штаммом 4М.

Таким образом, для последующего исследования влияния тепловой обработки на покоящиеся формы клеток микроорганизмов является нецелесообразным использование штаммов 1Т, 2К1 и 2М, в связи с небольшим количеством образовавшихся покоящихся форм. Для дальнейших исследований был отобран штамм 4М, образовывавший наибольшее количество рефрактерных клеток — 48,7 %.

5.2Изучение устойчивости покоящихся форм клеток штамма 4М к действию различных температурных режимов

Для оценки устойчивости покоящихся форм клеток штамма 4М к воздействию температуры были выбраны две группы температурных режимов.

В первую группу входили режимы, которые, согласно исследованиям ученых, используются при определении термоустойчивости покоящихся форм клеток микроорганизмов (табл. 4); во вторую группу входили типовые режимы, используемые в технологии молочной продукции (табл. 5).

Таблица 4 - Влияние температурных режимов на покоящиеся формы клеток штамма 4М

Количество клеток до температурного воздействия Количество клеток после температурного воздействия при температуре п времени выдержки, КОЕ/см3

60 °С 80 °С 100 "С

20 мнн 40 мин 15 мин 30 мип 10 мип 15 мни

4,1 • 10' 6,5±0,1 11/ 3,5±0,4 107 4,0±0,2-10' 4,9±0,НО' 5,5±0,3-10(' б,2±0,3-106

Таблица 5 - Влияние температурных режимов на покоящиеся формы клеток штамма 4М

Количество клеток до температурного воздействия Количество клеток после температурного воздействия, при температуре и времени выдержки, КОЕ/см5

(65 ± 2) °С (76± 2)°С (87 ± 2) °С

15 сек 20 сек 20 сек 15 мин.

4,1 • 107 3,8±0,1-10' 3,3±0,4-10' 2,7±0,2-10' 1,2±0,2-Ю'

Таким образом, установлено, что покоящиеся клетки способны выдерживать тепловую обработку как при более низких режимах, так и при высоких температурах.

5.3 Изучение показателей качества молочного и молочно-растителыюго сырья, инфицированного выделенными штаммами

Инфицирование молочного и молочно-растительного сырья являлось первым этапом изучения влияния режимов тепловой обработки на выделенные покоящиеся формы микроорганизмов.

В состав первой группы были отобраны штаммы ЗТ, ЗТ1 и ЗТ2. Выбор был обоснован единым источником происхождения культур (сывороточный молочно-растительный напиток), принадлежностью к одной морфологической группе - грамположительные палочки, способностью вызывать пороки и порчу продукта и подавлением роста представителей полезной микрофлоры заквасок и желудочно-кишечного тракта человека. Вторая группа представлена штаммами 1М1 и 1Т- грамположительными кокками, выделенными из стерилизованного молока; третья - 2К1 и 2М, грамотрицательными кокками, выделенными из ультрапастеризованного молока, четвертая - 4М и 4Т1, грамположительные палочки, выделенные из молочно-растительного продукта, пятая группа представлена покоящимися формами клеток штамма 4М, полученными при хранении в течение года при низких температурах.

Для инфицирования использовали продукты разного состава; получен-„ _____„„„ ,, ~аст1!тель..огО СЫ"ЬЯ. В

качестве молочного сырья было использовано пастеризованное молоко с массовой долей жира 3,2 %.

Режимы стерилизации были выбраны в соответствии с исследуемыми группами молочных и молочно-растительных продуктов: режим одноступенчатой стерилизации в упаковке - 15-15-20/120 (15 минут нагрев с 60 °С до 120 °С, 15 минут выдержка при температуре 120 °С, 20 минут - снижение температуры до 55 °С) и режим 15-5-20/120 (15 минут нагрев с 60 °С до 120 °С, 5 минут выдержка при температуре 120 °С, 20 минут - снижение температуры до 55 °С). Кривые прогреваемости модельных образцов представлены на рисунке 7.

Рис. 7 - Кривые прогреваемости модельных образцов молочной продукции, зараженной исследуемыми штаммами

В модельных образцах из молочного сырья массовая доля жира составляла 3,2%, а из молочно-растительного сырья - 0,05 %. Такая разница в содержании жира сказывалась на подъеме температуры в емкости с продуктом: чем выше м.д.ж., тем медленнее происходило увеличение температуры. В связи с этим коэффициенты летальности для молочно-растительного сырья имели большие значения, чем для молочного сырья при одинаковых режимах тепловой обработки. Полученные образцы продукции контролировали по показателям качества и были заложены на хранение.

Хранение модельных образцов продукции осуществляли б соответствия с МУК 4.2.1847-04 «Санитарно-эпидемиологическая оценка обоснования сро-

ков годности и условий хранения пищевых продуктов» при температуре (4 ± 2) °С и (20 ± 2) °С. 5.4 Оценка показателей безопасности и качества инфицированной молочной и молочно-растительной продукции при хранении

Результаты изучения микробиологических показателей модельных образцов продукции, инфицированных штаммами 1-4 групп микроорганизмов, в течение всего периода хранения свидетельствовали, что образцы отвечали требованиям промышленной стерильности.

Таким образом, выявлено, что вегетативные клетки, реактивированные из покоящихся форм клеток, в том числе представленные спорообразующи-ми микроорганизмами, не способны пережить стандартные режимы стерилизации и ультрапастеризации.

Анализ продукции, инфицированной 5 группой микроорганизмов - покоящимися клетками штамма 4М, сразу после прогрева и охлаждения модельных образцов до 20 °С, проводили по методике определения КМАФАнМ и по методике, разработанной по результатам выполненных в данной работе исследований. Полученные результаты представлены в таблице 6.

Таблица 6 - Влияние температурного режима одноступенчатой стерилизации в упаковке на продукцию, зараженную покоящимися формами клеток штамма 4М

Исследуемый продукт Количество клеток, КОЕ/см3

Метод определения промышленной стерильности Метод определения покоящихся форм

(70 ± 5) "С в течение 5 минут Минус (18 ±1) "С в течение 120 минут

Молоко 8 12 87

Растительный продукт 4 6 22

Молочно-растительная смесь 10 18 130

Представленные данные свидетельствуют о том, что клетки, находящиеся в состоянии покоя, способны выживать при использовании режимов стери-

21

лизации молочного и молочно-растительного сырья. Количество клеток, выросших с применением стандартной методики, соответствует нормированному показателю (не более 10 КОЕ/см3), в то время как данные, полученные с применением разработанной методики, позволяют выявлять большее количества клеток. Так, в стерилизованном молоке их было в 11 раз больше, а в мо-лочно-растительном продукте - в 13 раз.

Оценку физико-химических показателей качества выработанных стерилизованного молока и молочно-растительного продукта проводили в соответствии со стандартными методиками в начале и в конце срока хранения.

В модельных образцах стерилизованного молока отмечали снижение массовой доли жира на 0,7 % и белка на 0,2 %. В модельных образцах стерилизованного молочно-растительного продукта отмечали снижение массовой доли белка на 0,5 %. Это по-видимому связано с гидролизом жира и белка под действием липаз и протеаз, синтезируемых покоящимися клетками, которые способны переходить в вегетативное состояние и вызывать пороки и порчу на последних сроках хранения продукции.

Результаты оценки органолептических показателей выработанных контрольных и модельных образцов продукции представлены на рис. 8.

Органолептические показатели модельных образцов стерилизованного молока Органолептические показатели модельных образцов молочно-растительного продукта

внешний вид внешний вид уч.

консистенция ^ , ^ : ■ • ^цвет ш консистенция ^Г Щ "" N цвет ш

вкус.........запах

■ 0 сутки 6 месяцев ■0 сутки ?-6ме<кцев

Рис. 8 - Профилограмма изменения органолептических показателей при хранении: а - стерилизованного молока; б - молочно-растительного продукта

цию, оказывают отрицательное влияние на органолептические показатели готовой продукции в конце срока годности. Через шесть месяцев хранения во

22

всех модельных образцах отмечали горечь, в стерилизованном молоке дополнительно чувствовали прогорклость.

На основе результатов проведенных исследований была разработана «Методика определения покоящихся форм микроорганизмов в остаточной микрофлоре полных консервов», утвержденная в установленном порядке в ГНУ ВНИИКОП РАСХН, позволяющая контролировать покоящиеся формы клеток микроорганизмов в случае отсутствия роста в посевах при использовании стандартных методов определения промышленной стерильности.

ОСНОВНЫЕ ЗАКЛЮЧЕНИЯ ПО РАБОТЕ:

1. Теоретически и экспериментально обоснованы рациональные условия реактивации покоящихся форм клеток микроорганизмов из молочной продукции с длительными сроками годности: стрессовое воздействие температуры (70 ± 1) °С в течение 5 минут и минус (18 ± 1) °С в течение 120 минут на пробу контролируемого продукта с последующим высевом на питательную среду определенного состава и культивирования при температуре 30 °С и 37 °С в течение 7 дней.

2. Выявлено, что в молочной продукции с длительными сроками годности могут содержаться покоящиеся формы клеток микроорганизмов, вызывающие пороки и порчу на поздних сроках хранения.

3. Выделены штаммы покоящихся форм клеток микроорганизмов и изучены их морфологические и биохимические свойства. Установлено, что они имели как палочковидную, так и кокковую формы и были как грамотрица-тельными, так и грамположительными.

4. Штаммы покоящихся форм клеток микроорганизмов, выделенные впервые из молочной продукции с длительными сроками годности, синтезируют протеазы и липазы.

5. Показано, что выделенные покоящиеся клетки микроорганизмов не ингибируют рост санитарно-показательного тест - штамма E.coli В-125 и условно-патогенного S. aureus 209-Р, но могут подавлять развитие представителей полезной микрофлоры заквасок и кишечника человека, что косвенно указывает на их отрицательное влияние на качество продукции и неблагоприятное действие на организм человека.

6. Разработана и утверждена «Методика определения покоящихся форм микроорганизмов в остаточной микрофлоре полных консервов», включая молочные продукты с длительными сроками годности.

7. Проведена апробация разработанной методики при контроле молочной продукции с длительными сроками годности, результаты которой показали возможность ее реализации в условиях микробиологической лаборатории.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в изданиях, рекомендованных перечнем ВАК РФ

1. Ганина, В.И. Микробиологическая безопасность молочных и молочно-растительных консервов [Текст]/ В.И. Ганина, А.И. Гриневич, P.A. Волкова// Молочная промышленность. - 2012. - №8. - С.58-59

2. Лойко, Н.Г. Пробиотические продукты: новые приемы повышения качества [Текст]/ Н.Г. Лойко, Б.А. Кареткин, H.A. Симон, Е.Ф. Шаненко, Т.В. Пичугина, В.И. Ганина, А.И. Гриневич// Молочная промышленность. - 2013. - №10. - С. 57-58

3. Лойко, Н.Г. Изменение диссоциативного спектра популяций молочнокислых бактерий при воздействии антибиотиков [Текст]/ Н.Г. Лойко, М.А. Краснова, Т.В. Пичугина, А.И. Гриневич, В.И. Ганина, А.Н. Козлова, Ю.А. Николаева, В.Ф. Гальченко, Г.И. Эль-Регистан// Микробиология. - 2014. - т. 83,№3. - С. 284-294

4. Гриневич, А.И. Характеристика остаточной микрофлоры молочно-растительных консервов [Текст]/ А.И. Грипевич, В.И. Ганина, C.B. Карпычев// Вестник Кемеровского государственного университета. -2014. - т. 1.,№2 (58). - С. 7-10

5. Гриневич, A.II. Молочные и молочно-растительные консервы: действие штаммов покоящихся форм микроорганизмов консервов на полезную и постороннюю микрофлору кишечника человека [Текст]/ А.И. Гриневнч, В.И. Галина// Молочная промышленность. -2014,-№9.-С. 46-47

Публикации в сборниках научных трудов

6. Гриневич, А.И. Аспекты обеспечения безопасности консервированных молочных продуктов [Текст]/А.И. Гриневич, В.И. Ганина// Живые системы и биологическая безопасность населения: материалы X Международной научной конференции студентов и молодых ученых,—М..МГУПП, 2012. - С. 51-52

7. Гпиненич. А.И Исследование термоустойчивых возбудите пей попчи стерилизованных молочно-растительных консервов [Тексг]/ А.И. Гриневич// Фундаментальные основы и

передовые технологии в пищевой и перерабатывающей промышленности: Сборник научных трудов 6-ой конференции молодых ученых и специалистов институтов Отделения хранения и переработки сельскохозяйственной продукции Россельхозакадемии (г. Видное, ГНУ ВНИИКОП Россельхозакадемии, 16 октября 2012 г.), г. Видное, Изд-во РГАУ-МСХА, С. 79-82

8. Грнневич, А.И. Исследование современных причин порчи молочных консервов [Текст]/ А.И. Грнневич, В.И. Ганина// Приоритетные направления развития науки и технологий - Инновационные технологии: Тезисы докладов XIII Всероссийской научно-технической конференции г. Тула, ФГБОУ ВПО ТулГУ, 2013. С. 90-92

9. Гриневич, А.И. Исследование остаточной микрофлоры молочно-растительных консервов - причины порчи продукта [Текст]/ А.II. Грнневнч// Научный вклад молодых ученых в развитие пищевой и перерабатывающей промышленности АПК: Сборник научных трудов VII конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских институтов Отделения хранения и переработки сельскохозяйственной продукции Россельхозакадемии (г. Москва, ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии, 8-9 октября 2013 г.), г. Москва, Изд-во Интеллект-Центр, С. 94-97

10. Грнневич, А.И. Современные риски, связанные с потреблением продуктов питания [Текст]/ А.Н. Грнневнч, В.И. Ганина// Безопасность и качество продуктов питания. Наука и образование: Сборник научных трудов V международной научно-технической конференции (ФГБОУ ВПО МГУПП, г. Москва, 12-14 марта 2014 г.), М.: Издательско-полиграфический центр МГУПП, С.121-124

11. Грнневич, А.И. Новый подход в обеспечении безопасности молочных продуктов длительного срока хранения [Текст]/ А.И. Грнневнч, В.И. Ганина// Новые подходы, принципы и механизмы повышения эффективности производства и переработки сельскохозяйственной продукции: Материалы Международной научно-практической конференции (г. Волгоград, ГНУ НИИММП, 5-6 июня 2014 г.), Волгоград: Волгоградское научное издательство, С. 182-186

Отпечатано в типографии ООО "Франтера" Подписано к печати 27.10.2014г. Формат 60x84/16. Бумага "Офсетная №1" 80г/м2. Печать трафаретная. Усл.печ.л. 1,56. Тираж 100. Заказ 697.

WWW.FRANTERA.COM