автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.12, диссертация на тему:Исследование процесса замораживания спермы рыб осетровых пород и его техническое обеспечение

Стр. 4

Глава

Современное состояние низкотемпературного консервирования биообъектов. Проблемы и пути их реализации.

1.1. Анализ технических средств криоконсервирования биообъектов. 10

1.2. Анализ существующих технологий низкотемпературной обработки спермы рыб.

1.2.1. Структура спермы и ее свойства. 19

1.2.2. Анализ режимов замораживания, криопротекторы. 21

Глава

Расчетно-теоретическое исследование процесса криозамораживания спермы рыб осетровых пород.

2.1. Обоснование режима криозамораживания спермы рыб осетровых пород. 36

2.2. Расчет теплофизических характеристик биообъекта. 39

2.3. Математическая модель процесса замораживания биообъека. 45

2.4. Теплотехнический расчет криозамораживателя. 53

Глава

Реализация программы низкотемпературного консервирования. 3.1. Техническое обеспечение процесса криоконсервации спермы рыб осетровых пород.

3.1.1. Конструкция и технические характеристики криоустройства для замораживания спермы. 63

3.1.2. Тестирование и исследование характеристик криоустройства. 71

3.2. Экспериментальное исследование процесса криозамораживания спермы рыб осетровых пород. 32.1. Методика проведения экспериментов. 79

3.2.2. Результаты проведенных исследований. 86

Глава

Реализация решения математической модели процесса криозамораживания. 4.1.Численный метод решения математической модели в программном пакете MATH CAD 2000. 99

4.2. Сопоставление результатов исследований и математической модели. 119

4.3. Разработка номограммы пользователя криоустройством для замораживания спермы. 121

Выводы

В настоящее время проблема исчезновения редких видов рыб осетровых обозначилась особенно угрожающе. Без специальных мер охраны и искусственного воспроизводства эти реликтовые гидробионты обречены на вымирание. Поэтому задача сохранения и восстановления их поголовья и видового разнообразия является актуальной.

Темп видового вымирания устойчиво возрастает. Если с 1960 по 1975 годы вымерли примерно 1,2 % видов млекопитающих, рыб и птиц, то к концу 80-х годов под угрозой вымирания находилось уже 8%. Сохранение такой тенденции может привести к тому, что к 2050 году исчезнет до 50% видов [1,17, 21,39].

Создание низкотемпературных банков генетического материала, как показывает опыт, представляет собой один из наиболее перспективных способов сохранения биоразнообразия. Развитие этого направления в решении задач видовой репродукции позволит: сохранить генетическую информацию редких, исчезающих и промысловых видов при температуре жидкого азота в течение десятилетий без утраты генетического стандарта; транспортировать генетический материал в районы исчезновения или резкого сокращения численности для восстановления популяции вида, обеспечить возможность селекционно-генетических работ в промысловых хозяйствах, создать достаточно полную генетическую коллекцию разных видов гидробионтов, что позволяет практически неограниченная емкость криохранилищ. К примеру, для сохранения 6,5 тыс видов необходимо всего 12 литров суспензии яйцеклеток и 0,4 литра суспензии спермиев. Это количество вполне вмещает в себя сосуд Дьюара, емкостью 50100 литров, занимая площадь 1 м [39, 84]. Криоконсервированную сперму можно использовать для осеменения яйцеклеток гидробионтов и многолетней аквакультуры, для введения генов от диких представителей данного вида с целью поддержания ее генетической гетерогенности. Криоконсервированная сперма от элитных особей может иметь большое значение в селекционно-генетических работах для усиления признаков, наиболее ценных в хозяйственном отношении (плодовитость, скорость воспроизводства, скорость накопления биомассы, толерантность к заболеваниям и др.).

Большой интерес представляет возможность применения криоконсервиро-ванной спермы для воссоздания исчезнувшего в природе вида с использованием промежуточного этапа межвидовой гибридизации.

Практическое использование замороженной спермы будет в свою очередь стимулировать дальнейшие исследования, необходимые для развития работ по криоконсервации: определение сроков созревания яйцеклеток и сезонная динамика репродуктивной способности (спермин используются для тестирования оплодотворенности яйцеклеток), изучения и развития способов искусственного оплодотворения и осеменения in vitro и т.д.

Экологические проблемы Каспийского бассейна, связанные с интенсивным антропогенным прессом и реальной угрозой для ихтиофауны Каспийского моря, включая такие ценные виды рыб, как осетровые, а также для исторически сложившихся уникальных сообществ живых организмов, требуют принятия незамедлительных мер.

Эти проблемы актуальны в настоящее время не только для Астраханской области, но и для регионов, расположенных по побережью Каспия: Казахстана, Азербайджана, Дагестана, Калмыкии, Ирана и др. Ввиду резкого сокращения численности популяции осетровых на правительственном уровне предполагаются меры по приостановлению добычи и переработки этих ценных видов рыб. Одна из них - Постановление правительства РФ от 27.12.2000 г. №1010 "О квотах на вылов (добычу) водных биоресурсов внутренних морских вод Российской Федерации".

В настоящее время на базе Астраханского государственного технического университета разработан и внедряется проект 2.4.16 "Организация Нижневолжского регионального криобанка генофонда гидробионтов Волго-Каспийского бассейна" федеральной целевой программы "Юг России" [100]. Целью этого проекта является:

- сохранение генетического многообразия редких и исчезающих видов ихтиофауны нижней Волги и Каспийского моря;

- возможность корректировки технологий воспроизведения рыб, в том числе осетровых.

В рамках этого проекта ведутся научно-исследовательские работы по отработке методики технологии замораживания, описанию теплотехнических процессов и разработке математической модели процесса криообработки спермы рыб осетровых пород, подбора криозащитных сред, апробации оборудования. Эти мероприятия дают реальную возможность решения проблемы восстановления водных биоресурсов Каспия во всем их видовом и генетическом многообразии в сочетании с урегулированными нормами эксплуатации и снижения антропогенного пресса.

Впервые идея низкотемпературной консервации в хранении половых и соматических клеток редких и исчезающих видов животных и растений с последующим их воспроизводством, была выдвинута профессором Б. Н. Веприн-цевым (1928-1990) в 1975 году и доложена на XIV Конгрессе Международного союза охраны природы (IUCN).

В работах Ротт и Вепринцева [17, 18] приведены данные об успешной криоконсервации зародышей и личинок. Во многих случаях из криоконсерви-рованных генетических материалов получены полноценные животные, для части из них показана возможность получения полноценного потомства, не обнаруживающего явных признаков генетических нарушений.

В тоже время практически не удается сохранить жизнеспособность замороженных яйцеклеток и спермы. Главная особенность, выявляющаяся в таких работах - высокая видоспецифичность клеток по отношению к разным криопротекторам, режимам замораживания - оттаивания, составу культуральной среды. Механизмы такой видоспецифичности остаются пока необъяснимыми, а ученые многих стран пытаются распознать и решить эту актуальную проблему.

Анализ литературных данных [1, 17, 18, 21, 23, 39, 50, 53, 71, 78, 119] показал, что методики криоконсервации спермы всех видов рыб весьма сходны. Получаемая от самцов сперма разбавляется криозащитной средой, предотвращающей активизацию сперматозоидов. Она имеет определенную кислотность, является источником питания, а также содержит тот или иной криопротектор, предохраняющий клетки от повреждений при низкотемпературном замораживании. Применяемые скорости охлаждения не слишком отличаются, независимо от того в каком виде замораживается сперма в гранулах или контейнерах.

Тем не менее, даже при тщательном соблюдении разных методик криоконсервации, их воспроизведение не всегда удается. Многие российские и зарубежные исследователи считают [29, 35, 39, 46, 58, 71, 119, 120], что возникшие различия в результатах обусловлены биологической неоднородностью материала, который в свою очередь зависит от целого комплекса факторов: индивидуальных различий в пригодности к криоконсервированию различных самцов, времени сезона для взятия половых продуктов, кормности водоемов, ряда экологических факторов, видоспецифичности, криоустойчивости.

Все это требует проведения специальных исследований для каждого вида рыб с учетом, по возможности, большого количества факторов, влияющих на криоустойчивость спермы.

Актуальность темы по сохранению видов путем создания криобанков с заморожеными элитными биообъектами очевидна. Ученые России, дальнего и ближнего зарубежья работают по разным направлениям этой проблемы. Постоянно проводятся встречи и симпозиумы, посвященные проблемам криоконсервации. Большой вклад в решение этих задач внесли такие ученые как Ананьев В.И. (МИК), Цветкова Л.И.(ВНИИПРХ), Пушкарь Н.С., Копейка Е.Ф. (Институт проблем криобиологии и криомедицины Национальной Академии Наук Украины), Петропавлов Н.Н, Андреев А.А., Гахова Э.Н.(ИБК РАН), Меричка

П.(Председатель Комиссии криобиология и криомедицина Международного института холода), Витвицкая Л.А., Тихомиров A.M., Земков Г.В.(АГТУ) и многие другие.

Целью диссертационной работы является реализация программы технического и научного обеспечения технологического процесса криозаморажива-ния спермы рыб осетровых пород.

Задачи диссертационной работы.

- Теоретическое исследование процесса переноса теплоты при криозаморажи-вании биообъекта, построение его математической модели, соответствующей принятому режиму обработки с программным обеспечением.

- Разработка и исполнение криоустройства для низкотемпературной обработки биообъекта.

- Проведение экспериментальных исследований процесса замораживания биообъекта с использованием криоустройства с целью выявления оптимальных параметров процесса и оценки их влияния на качество получаемого продукта.

- Проверка адекватности математической модели проведенным экспериментам.

- Разработка номограммы для пользователя криоустройством.

Научная новизна диссертационной работы:

- разработано программное обеспечение в Math CAD 2000 на основе математической модели процесса криозамораживания с учетом переменных тепло-физических характеристик замораживаемого биообъекта, которое позволяет в любой момент времени и в любой точке биообъекта определять изменение температуры в различных по составу биообъектах в зависимости от температуры охлаждающего азота при различных значениях скорости замораживания;

- рассчитано, сконструировано и выполнено криозамораживающее устройство, обеспечивающее необходимые режимы замораживания для спермы различных видов рыб; 9

- определены значения оптимальной концентрации криопротекторов растительного и животного происхождения; ингибитора в сочетании с различными режимами криозамораживания, позволяющие повысить качество получаемого при криообработке продукта.

Основные положения и результаты диссертации доложены на: научно -технических конференциях (г. Астрахань, АГТУ 1999,2000,2001г.г.); Международной научной конференции "Экология и здоровье населения. Актуальные проблемы биологии и медицины" (г. Астрахань, АГМА, 2000 г.); 1-ом международном симпозиуме "Генетический криобанк для аквакультуры редких и исчезающих видов рыб и других гидробионтов" (г. Пущино, Моск. обл., ИБП РАН 2000 г.); II Международной научно - практической конференции "Аквакульту-ра осетровых рыб: достижения и перспективы развития" (г. Астрахань, НПЦ "Биос" 2001г.).

Диссертация состоит из введения, четырех глав и приложений. Работа изложена на 103 страницах машинописного текста, в том числе приложений на 16 страницах, содержит 36 рисунков, 3 фотографии, 14 таблиц, список литературы из 124 наименований.

124 Выводы

1. Опыты по криоконсервации спермы показали, что имеется принципиальная возможность получения жизнеспособного посадочного материала после криообработки, жизнестойкость которого зависит от качества исходных половых продуктов, от правильно выбранной технологии режима замораживания для каждого вида рыб.

2. Установлено, что факторами, влияющими на качество продукта, полученного в результате криообработки, являются: качество нативной спермы, подвергающейся криообработке, скорость процесса криозамораживания, состав спермы, состав протектирующей среды.

3. Разработанная математическая модель процесса замораживания биообъекта достаточно адекватно описывает процесс криозамораживания и позволяет обеспечивать необходимую скорость замораживания в зависимости от состава биообъекта и от температуры паров азота на его поверхности.

4. Разработанная конструкция и изготовленное криоустройство для замораживания биообъектов апробировано в работах по криоконсервированиию спермы рыб осетровых пород и показало высокую надежность и эффективность его использования.

5. Содержание влаги в составе биообъекта влияет на его теплофизические характеристики, что сказывается на результатах технологического процесса и качестве продукта, получаемого в результате криообработки.

6. По результатам оценки зависимости качества получаемой спермы от их размерно-возрастных характеристик следует, что необходима предварительная оценка качества отбираемой для криоконсервирования спермы, поскольку, чем качественнее исходный продукт, тем больше гарантии получения полноценного выхода в результате произведенного процесса криообработки.

125

7. Влияние эпина не оказало значительно- качественного влияния на процесс криообработки спермы и его использование требует дальнейшего углубленного исследования.

8. В работах по влиянию ингибирования на качество реконсервированной спермы, определена его оптимальная концентрация, которая составила 0,005 мг/мл в сочетании с криопрортекторами натурального происхождения.

9. Выбор режима криозамораживания с протекторами растительного и животного происхождения показал, что результаты быстрого замораживания, оказались неудовлетворительными.

10.Лучший показатель при криообработке отмечался при следующем режиме криозамораживания: криопротектор - рыбий жир + глицерин, в соотношении 1:1; разведение - сперма + протектор -1:1; доза ингибитора - 0,005 мг/мл; при скорости замораживания на этапах I, И- 5 °С /мин, на этапе III - 20 °С /мин.

11.Номограмма пользователя криоустройством определяет использование криоустройства, обеспечивает точность контроля за процессом при проведении криоконсервационных работ.

1. Актуальные проблемы криобиологии. Ю.А. Иткин, Р. Клен, Г.С. Лобын-цева и др.; Под общ. ред Н.С. Пушкаря, A.M. Белоуса-Киев: Наукова думка, 1981. 600с.

2. Алмаши, Элемер и др. Быстрое замораживание пищевых продуктов, М: Легкая и пищевая пр-ть, 1981. 407с.

3. Андреев А.А. Петропавлов Н.Н. Замораживание растворов антифризных веществ // Биофизика живой клетки. Пущино, 1994, № 6. С.65-68.

4. Аппарат для глубокого охлаждения биообъектов с программным управлением (Комаров Б.А., Горбовицкий Е.В., Белова И.А., Златников В.П. // Медицинская техника, 1971. №3, С.51-53.

5. Белоус, A.M. и др. Криоконсервация репродуктивных клеток /A.M. Белоус и др. Киев Наук, думка, 1986. 207с.

6. Богданов С.Н., Куприянов А.В. Задачник по термодинамическим расчетам в пищевой и холодильной промышленности:Учеб. пособие для высш. техн. учеб. завед.. М.: Легкая и пищевая пр-ть, 1983. 144с.

7. Богданов С.Н., Иванов О.П., Куприянова А.В. Холодильная техника. Свойства веществ. Справочник, 1976. 168с.

8. Боушев Т. Определение температуро- и теплопроводности методами регулярного режима.// Холодильная техника, 1951, №3. С.58-60

9. Бошняк Л.Л. Измерение при теплотехнических исследованиях. Л., Машиностроение, 1974. 448с.

10. Бражников A.M. Исследование и разработка основ аналитической теории процессов термической обработки мясопродуктов. Автореферат дис. к.т.н. М., 1973. 23с.

11. Бражников A.M. Исследование и разработка основ аналитической теории процессов термической обработки мясопродуктов. // Холодильная техника, 1976, №11. С.7-8.

12. Бронштейн В.Л. К механизму взаимодействия растущих кристаллов льдас биологическими структурами при замораживании Докл. АН СССР, 1978, № 3. С.722-725.

13. Бронштейн B.JL, Розанов Л.Ф. Начальное переохлаждение как фактор повреждения при замораживании клеточных суспензий // Криобиология и криомедицина, 1977, №3. С.26-29.

14. Бурмакин А.Г. Справочник по производству замороженных продуктов М., Пищевая промышленность, 1970. 464с.

15. Бурцев И.А., Серебрякова Е.В. Первый опыт замораживания спермы осетровых рыб. Труды молодых ученых. ВНИРО, 1969, т.1. С.94-100

16. Варгафтик Н.Б. Справочник по теплофизическим свойствам газов и жидкостей. М., Наука, 1972. 717с.

17. Вепринцев Б.Н., Ротт Н.Н. Консервация генетических ресурсов // Природа, М., 1978, №11. С. 10-21.

18. Вепринцев Б.Н., Ротт Н.Н. Стратегия сохранения животного и растительного мира земли // Консервация генетических ресурсов. Пущино, 1991. С. 47-62

19. Витвицкая J1.B. Эффективность использования биологически активных веществ в искусственном воспроизводстве русского осетра.// Вестник АГТУ, №2 Астрахань, 1996. С.71-74.

20. Вопросы криоконсервации биологических объектов. П/р Н.С. Пушкаря.-Киев, Наукова Думка, 1985. 207с.

21. Воскресенский К.Д. Сборник расчетов и задач по теплопередаче М.: Гос-торгиздат, 1959. 335с.2326