автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.01, диссертация на тему:Исследование белкового и ферментативного комплекса бобовых культур Таджикистана

На правах рукописи

Асатуллоев Искандар Анварович

ИССЛЕДОВАНИЕ БЕЛКОВОГО И ФЕРМЕНТАТИВНОГО КОМПЛЕКСА БОБОВЫХ КУЛЬТУР ТАДЖИКИСТАНА

Специальность 05.18.01 - Технология обработки, хранения и переработки злаковых, бобовых культур, крупяных продуктов, плодоовощной продукции и виноградарства

Специальность 03.00.04 - Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

ПИШИ» ШНИНН»

0031В4158

Москва - 2008

Работа выполнена на кафедре «Биохимия и зерноведение» ГОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств»

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор

Карпиленко Геннадий Петрович

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор

Мельников Евгений Михайлович

ГОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств»

доктор биологических наук, профессор Голенков Виктор Федорович

Российский государственный торгово-экономический университет

Ведущая организация:

Российский государственный аграрный университет - МСХА им. К.А. Тимирязева

Защита состоится «28» февраля 2008 г.

/<Г

часов

на заседании диссертационного совета Д 212.148.03 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ГОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» по адресу. 125080, Москва, Волоколамское шоссе, 11, ауд. 229, корпус А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО МГУПП

Автореферат разослан «е^^ января 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета к.т.н. доцент

Белявская И.Г.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.!. Актуальность темы. Нут (Cicer ariettmm) — ценнейшая бобовая культура, известная с древнейших времен. Она широко используется в питании населения различных стран, особенно, странах Азии, в том числе и странах Среднеазиатского региона. Пищевая ценность семян нута обусловлена благоприятным сочетанием в семенах белков, жиров и углеводов, макро- и микроэлементов, витаминов и других биологически активных веществ Зерно в зрелом виде содержит 18-31% белка, 6% жира, 46 - 48% крахмала, 84 - 86% сухих веществ, 19,9% азотистых веществ, 3,8% золы.

В настоящее время рост производства зернобобовых культур в сочетании с улучшением их биохимических показателей и технологических достоинств -одна из сложных и ответственных задач растениеводства В то же время изучение сложных физиологических процессов, протекающих в семени на разных этапах его развития позволят найти подходы к направленному формированию биохимических показателей качества семян Одним из таких важнейших процессов является протеолиз запасных белков при прорастании В нем могут принимать участие как ферменты, содержащиеся в созревших семенах, так и ферменты, синтезирующиеся de novo при прорастании

Семена нута богаты белком, однако их протеолитические ферменты практически не изучены В семенах нута показано наличие белковых ингибиторов протеаз, но все они являются ингибиторами экзогенных протеолитических ферментов. Вопрос о взаимодействии белковых ингибиторов протеаз семян нута с собственными протеолитическим ферментами, а следовательно, и об их роли в регуляции процесса протеолиза запасных белков при прорастании семян нута остается открытым.

1.2. Цель в задачи исследования. Целью работы является изучение белкового и протеолитического комплекса семян нута, выращенного в Таджикистане, а также выяснение возможных механизмов регуляции их активности в покое и при прорастании

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи-

- провести оценку технологических показателей качества семян нута сортов «Таджикский» и «Джалалабадский», выращенных в условиях Таджикистана,

- охарактеризовать белковый комплекс семян нута исследуемых сортов,

- выделить и охарактеризовать нейтральные и щелочные протеазы семян нута;

- изучить взаимодействие протеолитических ферментов семян нута с белковыми ингибиторами протеаз,

- исследовать изменение активности протеаз семян нута и их белковых ингибиторов при прорастании

1.3. Научная новизна. Показано наличие в созревших семенах нута протеолитических ферментов разного типа, действующих в нейтральной и щелочной областях рН Проведена очистка нейтральной тиоловой протеиназы с оптимумом рН действия 7,0. Выделен и охарактеризован ранее не описанный в литературе фермент с оптимумом рН действия 10,0 Показано, что щелочная протеиназа относится к ферментам серинового типа

Установлено, что нейтральные и щелочные протеиназы семян нута активно гидролизуют запасные белки покоящихся семян.

Впервые показано, что белковые ингибиторы в семенах нуга взаимодействуют с эндогенными протеолитическими ферментами участвуют в регуляции их активности в покоящихся и прорастающих семенах.

1.4. Практическая значимость работы. Семена нута имеют многоцелевое использование, и в разных технологических операциях состояние белково-протеиназного комплекса играет весьма существенную роль. Так, нутовая мука используется в хлебопечении и при производстве кондитерских изделий, как компонент, повышающий пищевую ценность и вкусовые качества готового продукта Выявленная способность нейтральных протеиназ семян нута гидролизовать белки пшеницы позволит наметить подходы к управлению процессом протеолиза в условиях тестоведения.

Разработана схема выделения нейтральных и щелочных протеиназ и их белковых ингибиторов из семян нута Получены препараты нейтральной и 4

щелочной протеаз со степенью очистки 1132 и 547 раз соответственно

Полученные данные могут быть использованы в селекции нута для получения семян с заданными особенностями белково-протеиназного комплекса

Показана возможность замены пшеничной муки на нутовую в количестве 10% при выпечке хлеба, при этом происходит увеличение удельного объема формового хлеба, улучшается окраска и структура корок, сохраняются другие органолептические показатели качества.

1.5. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на III Юбилейной международной выставке-конференции «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (Москва, 2005); V Ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика» (Москва, 2005), IV Международной конференции-выставке «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (Москва, 2006).

1.6. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

1.7. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов и библиографии. Работа изложена на 128 страницах текста, содержит 22 таблицы и 25 рисунков Список литературы включает 151 источник.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы обобщены литературные данные о распространении и значении культуры нута, пищевой ценности семян нута Проанализированы особенности белково-протеиназного комплекса бобовых культур, в том числе и семян нута. Рассмотрены вопросы, связанные с ролью белковых ингибиторов протеолитических ферментов в регуляции активности протеаз в покое и прорастании

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Материалы и методы исследования

При проведении исследований были использованы образцы семян нута

('Cicer anetinum) сортов «Таджикский» и «Джалалабадский», урожая 2005 года, выращенных в условиях Таджикистана

В исследуемых образцах ячменя физические, химические, физиологические показатели качества определяли в соответствии с действующими ГОСТами Содержание водорастворимого белка определяли по методу Лоури (Lowry et al, 1951) Активность протеаз определяли модифицированным методом Ансона (Anson, 1938) по начальной скорости реакции Ингибирующую активность определяли по остаточной активности протеаз (Витол, 1986) Для выделения протеаз и их белковых ингибиторов, а также для определения их молекулярной массы использовали метод гель-хроматографии на колонке с TSK-gel Toyoperl HW-55F Проращивание семян нута проводили согласно методике, предложенной АД Шутовым и И А Вайытраубом (1972)

3.2. Характеристика объекта исследования

В таблицах 1 и 2 представлены данные, характеризующие физические и химические показатели качества исследуемых образцов семян нута, которые имеют важное значение для оценки их технологических достоинств

Таблица 1

Физические показатели семян нута

№ Показатели сорт «Таджикский» сорт «Джалалабадский»

1 Натура, г/л 799 794

2 Масса 1000 зерен, г 340 330

3 Крупность мелкосешнкой мелкосемянной

4 Содержание сорной примеси, % 0,5 0,5

5 Содержание зерновой примеси, % отсутствует отсутствует

По физическим показателям исследуемые образцы семян нута могут быть отнесены к I типу в соответствии с ГОСТом 8758 — 76, который распространяется на нут, заготовляемый и поставляемый для продовольственных и кормовых целей

Таблица 2

Химические показатели семян нута

№ Показатели сорт «Таджикской» сорт «Джалалабадский»

1 Массовая доля влаги, % 13,4 13,6

2 Массовая доля крахмала, % 43,8 46,4

вт ч.: Массовая доля амилозы, % Массовая доля амилопекгина, % 45,5 53,5 34,8 65,2

3 Общий белок по Къельдалю (Ы х 6,25), % 27,8 28,4

4 Зольность, % 4,3 3,9

Показатели содержание крахмала, белка и зольность исследуемых образцов зерна находятся на уровне средних показателей для этой культуры Однако фракционный состав крахмала существенно отличается от средних значений для бобовых культур (20 - 30% амилозы и 70 - 80% амилопекгина) Так, содержание амилозы в семенах нута сорта «Таджикский» составляет 45,5%, что превышает средний уровень содержания амилозы в семенах бобовых культур и соответствует уровню содержания амилозы в мозговых сортов гороха.

3.2.1. Характеристика белкового комплекса семян нута

Содержание белка в семенах нута зависит как от сортовых особенностей, так и от условий произрастания. Проведенные исследования показали, что исследуемые образцы отличаются содержанием общего белка, определяемого методом Къельдаля (сорт «Таджикский» - 43,8%, сорт «Джалалабадский» -46,4%) и водорастворимого белка, определяемого методом Лоури (сорт «Таджикский» - 14,2 мг/мл; сорт «Джалалабадский» - 15,8 мг/мл) Однако названные факторы могут оказывать влияние и на соотношение отдельных белковых фракций

3.2.2. Фракционирование белков семян нута по растворимости

Изучение количественного соотношения и свойств различных фракций белковых веществ зерна представляет наряду с теоретическим интересом и большой практический интерес для технологий, использующий зерно в качестве сырья. Однако, несмотря на многочисленные исследования, многие

вопросы остаются до сих пор до конца невыясненными Это объясняется, с одной стороны, чрезвычайно сложной структурой белковых веществ, и различием в методическом подходе разных исследователей с другой стороны

Таблица 3

Фракционный состав белков семян нута, (% от общего содержания белка)

Образец Белковая фракция

Альбумины Глобулины Глютелины Проламины

сорт «Таджикский» 12,0 68,7 14,2 5,0

сорт «Джалалабадский» 12,6 77,4 7,8 2,2

Приведенные в табл. 3 данные показывают существенные различия в содержании отдельных белковых фракций, различающихся своей растворимостью Белки семян нута сорта «Джалалабадский» отличаются более высоким содержанием глобулиновой фракции (примерно на 12,5%) и более низкими значениями фракций глютелинов и проламинов (на 55% и 56% соответственно) по сравнению белками семян нута сорта «Таджикский» При этом альбуминовая фракция белков исследуемых образцов находится на одинаковом уровне и составляет 12-12, 6%

3.2.3. Фракционирование белков семян нута методом гель- хроматографии на колонке с TSK - gel Toyopeari iíW - 55F

Фракционирование белков семян нута проводили на колонке с TSK - gel Toyopeari HW - 55F Для оценки молекулярной массы полученных белковых фракций колонка была предварительно откалибована стандартными метчиками с известной молекулярной массой На колонку, заполненную гелем Toyopeari HW - 55F, наносили 5 мл водного экстракта, полученного при соотношении размолотое зерно - вода 1 10 Элюцию проводили дистиллированной водой Фракционирование проб осуществляли на коллекторе фракций «ULTRARAC» фирмы LKB (Швеция), при 4°С в холодильной камере «Colora» Объем собираемых фракций - 4 мл. Регистрацию оптической плотности элюата во всех фракциях осуществляли при длине волны 280 нм на спектрофотометре Профиль элюции представлен на рис. 1

Рис. 1. Фракционирование водорастворимых белков семян нута сорта «Джалалабадский» на колонке с TSK - gel Toyopearl HW - 55F

Полученные результаты показывают, что водорастворимые белки семян нута характеризуются большим разнообразием фракций различной молекулярной массы, варьируемой от 700000 до 1000 Дальтон. Выявлены семь основных хроматографических пиков, которые характерны для белков определенной молекулярной массы. Определение молекулярной массы этих белков проводили графическим методом с использованием калибровочной кривой. Белки, выходящие со свободным объемом колонки (I пик), вероятнее всего представляют собой агломераты. Значительную часть анализируемых белков составляют белки с молекулярной массой 200000+15000 Дальтон (I - IV пики). Обнаружены три минорные фракции низкомолекулярных белков и пептидов с молекулярной массой 8500 (V пик); 2000 (VI пик) и 1500-1000 (VII пик) Дальтон, что соответствует в среднем 75+68 и 16+8 аминокислотным остаткам.

3.3. Характеристика протеолитических ферментов семян нута

Изучение протеолитических ферментов семян нута проводили на образцах семян нута сорта «Джалалабадский», урожая 2005 г.

Экспериментально было установлено, что наиболее полное извлечение нейтральных и щелочных протеаз семян нута достигается при концентрации соды 0,03 - 0,05%, а также, что нейтральные и щелочные протеазы извлекаются практически полностью в первые 2 — 3 мин интенсивного

перемешивания. Увеличение длительности экстракции приводит к увеличению в растворе содержания балластных белков.

3,3.1. Определение оптимума рН и температуры протеаз семян нута

Проведенные исследования показали, что в покоящихся семенах нута содержатся протеазы, различающиеся по оптимуму своего действия при гидролизе бычьего сывороточного альбумина (рис. 2).

Одни из них имеют оптимум при рН 7,0 (нейтральные протеазы), другие - при рН 10,0. Кривые рН зависимости имеют четко выраженные оптимумы, и даже небольшое изменение рН приводит к резкому снижению активности. Проведенные исследования показали, что исследуемые нейтральные и щелочные протеазы семян нута имеют одинаковый температурный оптимум 40 °С (рис. 3).

Нейтральные протеазы (фосфатно-цитратный буфер)

щелочные протеазы (глициновый буфер)

Рис. 2. Влияние рН реакциионной смеси на активность протеаз семян нута

Рис. 3. Влияние температуры на активность протеаз семян нута

Для частичного разделения ферментов использовали способ ступенчатого осаждения с изменением рН от 9,0 до 4,0 (рис. 4).

При подкислении до 6,0 осаждались преимущественно нейтральные протеазы, при дальнейшем подкислении до 5,0 - щелочные. При этом удельная активность протеаз, действующих в нейтральной зоне рН, возросла (по сравнению с исходным экстрактом) в 14,8 раз, а щелочных в 3,0 раза Белки семян нута максимально осаждались в интервале 6,0 - 5,0.

9,0 8,0 7,0

Нейтральные протеазы

-

-

Щелочные протеазы

рН

л

шятж мтПай« ш вдмяш»

9.0

8,0 7.0

Белок

рН

Рис. 4. Ступенчатое осаждение протеаз семян нута при подкислении

экстракта

содового

3.4. Очистка протеаз семян нута и характеристика очищенных препаратов

На основании проведенных исследований была разработана схема выделения и очистки протеаз семян нута.

По приведенной на рис 5 схеме, были получены препараты нейтральных и щелочных протеаз, очищенных соответственно в 1132 и 547 раз (табл 4 и 5)

ИЗМЕЛЬЧЕННЫЙ МАТЕРИАЛ

экстракция

0,35% раствором соды

(1)

ЭКСТРАКТ

подкисление до рН 6,0

(2)

ОСАДОК

(нейтральные протеазы)

НАДОСАДОЧНАЯ ЖИДКОСТЬ

подкисление до рН 5,0

(3)

перерастворенш в буфере рН 7,5

ОСАДОК (щелочные протеазы)

перерастворение в буфере рН 7,5

РАСТВОР

НЕЙТРАЛЬНЫХ

ПРОТЕАЗ

(4)

гель-хроматография на на колонке с ТБК—^е! ТоуореаН НЖ- 55Р

РАСТВОР ЩЕЛОЧНЫХ ПРОТЕАЗ

НЕЙТРАЛЬНЫЕ ПРОТЕАЗЫ

гель-хроматография на на колонке с Т8К~%е1 ТоуореаН НЖ- 55F

ЩЕЛОЧНЫЕ ПРОТЕАЗЫ

Рис 5. Схема выделения протеаз из семян нута

Таблица 4

Очистка нейтральных протеаз семян нута

Этап Содержание белка, мг/мл Активность протеаз, ААш Удельная активность, ДАжо / мг белка Степень очистки

1. Экстракция 0,35% N32003 20,6 0,110 0,0053 1

2. Подкисление до рН 6,0 14,8 0,180 0,0120 14,8

3. Гель-хроматография 0,010 0,060 6,0 1132

Таблица 5

Очистка щелочных протеаз семян нута

Этап Содержание белка, мг/мл Активность протеаз, ЛАмя Удельная активность, ААгво ! мг белка Степень очистки

1. Экстракция 0,35% ИагСОз 20,6 0,150 0,0073 1

2. Подкисление до рН 6,0 14,8 0,200 0,0135 1,84

3. Подкисление до рН 5,0 10,0 0,220 0,0220 3,01

4. Гель-хроматография 0,020 0,080 4,0 547

3.4.1. Характеристика нейтральных протеаз нута

Полученный препарат нейтральных протеаз был охарактеризован по ряду показателей- оптимуму рН, влиянию активаторов и ингибиторов, молекулярной массе (табл. 6).

Таблица 6

Характеристика нейтральных протеаз

Частично очищенный Нейтральные

Показатель препарат нейтральных протеазы

протеаз (степень очистки 1100)

(степень очистки 14)

Оптимум рН 7,0 7,0

Влияние цистеина активирует активирует

1,0 мг/мл на 50% на 50 %

2,0 мг/мл на 100 % на 100 %

Влияние п-ХМБ ингибирует ингибирует

0,5 мг/мл на 30% на 100 %

1,0 мг/мл на 65% на 100 %

Влияние ДПФФ не ингибирует не ингибирует

0,54 мМ

Влияние ФМСФ не ингибирует не ингибирует

1,82 мМ

Молекулярная масса - 70000

Нейтральные протеазы могут быть классифицированы как тиоловые ферменты, с молекулярной массой 70000 Да и оптимумом рН действия 7,0

3.4.2. Характеристика щелочных протеаз нута

Полученный препарат щелочных протеаз был охарактеризован по ряду аналогичных показателей (табл. 7).

Таблица 7

Характеристика щелочных протеаз

Частично очищенный Щелочные

Показатель препарат щелочных протеазы

протеаз (степень очистки 547)

(степень очистки 3)

Оптимум рН 10,0 10,0

Влияние цистеина активирует активирует

1,0 мг/мл на 20% на 40%

2,0 мг/мл на 30% на 40%

Влияние п-ХМБ ингибирует ингибирует

0,5 мг/мл на 5% на 10%

1,0 мг/мл на 10 % на 10 %

Влияние ДПФФ ингибирует ингибирует

0,54 мМ на 80 % на 100 %

Влияние ФМСФ ингибирует ингибирует

1,82 мМ на 60% на 100 %

Молекулярная масса, Да - 35000

Щелочные протеазы следует отнести к сериновым ферментам, с молекулярной массой 35000 Да и оптимумом рН действия 10,0 3.5. Белковые ингибиторы протеаз из семян нута Известно, что в семенах бобовых культур, в том числе и в семенах нута, содержится большое количество различных ингибиторов протеаз. Для большинства из них показана способность подавлять активность пищеварительных протеиназ - трипсина, химотрипсина, а также протеиназ микробного происхождения Изучению взаимодействия белковых ингибиторов с эндогенными протеолитическими ферментами посвящено лишь небольшое количество работ. В литературе отсутствуют данные по изучению

взаимодействия белковых ингибиторов из семян нута с собственными протеолитическими ферментами.

3.5.1. Выделение белковых ингибиторов

Выделение фракции белковых ингибиторов проводили из семян нута сорта «Джалалабадский» при экстракции водой в соотношении 1 : 10 и подкислении водного экстракта до рН 5,0 с целью удаления протеаз и дальнейшего подкисления до рН 3,0. Ингибирующую активность оценивали по подавлению активности частично очищенных препаратов протеаз нута и трипсина. Из графиков, представленных на рис. 6, видно, что белковая фракция, выделенная при подкислении в интервале 5,0 - 3,0 обладает ингибирующей активностью к собственным нейтральным и щелочным протеазам, так и к трипсину.

Рис. 6. Влияние ингибиторов, выделенных из семян нута на активность собственных протеаз и трипсин

3.5.2. Гель-хроматография ингибиторов протеаз на колонке с TSK - gel Toyopearl HW — 55F

Метод гель-хроматографии использовали для фракционирования белковых ингибиторов, полученных путем подкисления водного экстракта в интервале pH от 5,0 до 3,0. На колонку, заполненную Toyopearl gel HW-55F, наносили 5 мл образца. Элюцию проводили дистиллированной водой. Объем собираемых фракций 4 мл. В полученных фракциях регистрировали

содержание белка при 280 нм и проверяли на ингибирующую активность по

15

отношению к нейтральным и щелочным протеазам, а также к трипсину. Профиль элюции белков представлен на рис. 7.

Были выявлены шесть основных хроматографических пиков, причем большая часть белка была сосредоточена во фракциях 17 (объем элюции - 68 мл) и 18 (объем элюции - 72 мл).

Однако вся ингибирующая активность по отношению к трипсину была сосредоточена в 23 фракции, а ингибирующая активность по отношению к нейтральным и щелочным протеазам семян нута в 27 фракции. При этом произошло разделение белкового ингибитора трипсина и ингибиторов собственных протеолитических ферментов. Для определения молекулярной массы ингибиторов использовали калибровочный график.

AiSO

авоо

0,700 О.ВОО 0,500 04оо 0,300 0.200 0,100 О.ОХ -01СО

II

п

]

1

ill IV VI

Л л и 1\

О и i

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 35304042 44 46 4850

№ фракций

Рис. 7. Фракционирование ингибиторов из семян нута методом гель-хроматографии на колонке с TSK - gel Toyopearl HW - 55F

Полученные данные свидетельствуют о том, что белковая фракция, проявляющая активность по отношению к трипсину выходит с объемом элюции 92 мл и имеет молекулярную массу 25000 Дальтон, а белковые ингибиторы собственных протеаз семян нута элюируются с объемом 108 мл, их молекулярная масса около 8000 Дальтон.

3.5.3. Схема выделения белковых ингибиторов протеаз из семян нута

На основании проведенных экспериментов была разработана схема выделения белковых ингибиторов из семян нута, которая включает следующие этапы (рис. 8)

В результате выделения и очистки по предложенной схеме, удельная активность нейтральных протеаз нута возросла в 1800 раз, а щелочных протеаз -в 1400 раз.

ИЗМЕЛЬЧЕННЫЙ МАТЕРИАЛ

ОСАДОК (протеазы)

ИНГИБИТОР ТРИПСИНА

| экстракция водой

ВОДНЫЙ ЭКСТРАКТ

подкисление до рН 5,0

НАДОСАДОЧНАЯ ЖИДКОСТЬ (ингибиторы)

| подкисление до рН 3,0

ОСАДОК

I перерастворение 1 в буфере рН 7,5

РАСТВОР ИНГИБИТОРОВ

гель-хроматография на на колонке с Т8К-це1 ТоуореаН Н1У- 55F

ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕАЗ НУТА

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

Рис. 8. Схема выделения белковых ингибиторов протеаз из семян нута

3.6. Действие протеолитических ферментов семян нута на белки нута н пшеницы

Способность протеолитических ферментов семян растений гидролизовать собственные белки, является чрезвычайно важной и позволяет

понять физиологическую роль этих ферментов, их участие в метаболизме семени.

На рис. 9 представлены кривые хода реакции протеолиза белков нута нейтральными протеазами.

В течение первых 60 мин реакции протеолиза содержание водорастворимых белков увеличивается пропорционально количеству внесенного фермента. Аналогичная картина наблюдается при действии щелочных протеаз семян нута. При этом скорость накопления водорастворимых белков под действием щелочных протеаз примерно в 2 раза выше, чем при действии нейтральных протеаз.

Время реакции, мин

-Автолиз

-0,05 мг/мп вносимого фермента -0,15 мг/мл вносимого фермента -0.25 мг/мл вносимого фермента

Рис. 9. Действие нейтральных протеаз на белки семян нута

Полученные данные свидетельствуют о том, что нейтральные и щелочные протеазы, выделенные из покоящихся семян нута, способны гидролизовать собственные (немодифицированные) белки, а эндогенные белковые ингибиторы протеаз выполняют в этом процессе регуляторную функцию. Изучение действия частично очищенного препарата нейтральных протеаз на белки пшеницы проводилось без предварительного удаления ингибиторов из пшеничной муки.

Рис. 10. Действие нейтральных протеаз на белки пшеничной муки

Представленные на рис.10 кривые хода реакции протеолиза белков пшеницы нейтральными протеазами семян нута показывают, что за 60 мин реакции протеолиза количество водорастворимых белков увеличивается пропорционально количеству внесенного фермента.

Полученные данные косвенно свидетельствуют о том, что нейтральные протеазы семян нута не взаимодействуют с белковыми ингибиторами протеаз пшеницы, поскольку активно гидролизуют белки пшеницы без предварительного удаления ингибиторов. Проведенные исследования показали, что нейтральные и щелочные протеазы семян нута способны осуществлять протеолиз собственных белков при удалении ингибиторов протеаз, а нейтральные протеазы семян нута активно гидролизовать белки пшеницы даже в присутствии ингибиторов.

3.7. Изменение активности протеолитических ферментов и их белковых ингибиторов при прорастании семян нута

В отношении участия белковых ингибиторов нет единства взглядов исследователей. Одни считают, что обнаруживаемые в семенах растений белковые ингибиторы протеаз не связаны с регуляцией протеолиза запасных белков, другие напротив считают эту функцию ингибиторов основной.

Работы, проведенные на кафедре «Биохимия и зерноведения» показали наличие в семенах растений различных форм белковых ингибиторов,

19

способных подавлять активность эндогенных протеолитических ферментов, относящихся к разным типам. Эти данные указывают на участие ингибиторов в регуляции активности протеаз в метаболизме семени (Попов, Шаненко, 1980, Типисева, 1984, Витол,1986; Колесное,1987)

Опыты по изучению изменения протеолитической и ингибирующей активности проводили на семядолях прорастающих семян нута с 1-х по 9-е сутки проращивания Протеазы выделяли путем ступенчатого осаждения при подкислении содового экстракта

Ингибиторы протеаз выделяли из водного экстракта после осаждения протеаз при подкислении в интервале рН 5,0 - 3,0. Полученные данные представлены в табл 8

Из данных табл 8 следует, что при прорастании активность нейтральных и щелочных протеаз изменяется неодинаково

Нейтральные протеазы увеличивают свою активность, причем наибольший прирост активности наблюдается на стадии набухания семян нута (1,5 суток проращивания) — 44,7 % и на стадии появления проростка длиной от 1 до 5 мм (3 суток прорастания) - 75,6 %

Для щелочных протеаз картина изменения активности при прорастании -противоположная. На стадии набухания и на ранних стадиях прорастания активность щелочных протеаз уменьшается незначительно. На 9-е сутки прорастания при длине проростка 8 - 10 мм активность щелочных протеаз падает и составляет 49,7% от исходной активности покоящихся семян нута

Взаимосвязь автолитических процессов и активности ингибиторов при прорастании для бобовых культур была показана только для чины, сои, и фасоли (Бенкен и др., 1977, Типисева, 1984, Витол,1986)

Ингибирующую активность определяли по остаточной активности протеаз При этом протеазы выделяли из покоящихся семян нута, а их белковые ингибиторы из семян на разных стадиях прорастания

Данные, представленные в табл 8 демонстрируют, что при прорастании семян нута активность ингибиторов нейтральных и щелочных протеаз резко падает, причем темпы падения активности ингибиторов щелочных протеаз 20

Таблица 8

Изменение активности протеаз и их белковых ингибиторов при прорастании семян нута

Время прорастания, сутки Физиологическая стадия Средняя масса семени, г Активность протеаз Активность ингибиторов, %

нейтральных щелочных нейтральных протеаз щелочных протеаз

ААгзо на одно семя %от исходной ДА 280 на одно семя % от исходной

0 Покой 0,34 0,324 100 0,441 100 100 100

1,5 Набухание 0,32 0,469 144,7 0,437 99,0 89 65

3,0 Проявление проростка (длина 1-5 мм) 0,28 0,714 220,3 0,428 97,0 30 40

7,0 Развитие проростка (длина 5-8 мм) 0,26 0,846 261,1 0,423 95,9 0 0

9,0 Развитие проростка (длина 8- 10мм) 0,18 0,972 300 0,222 50,3 0 0

значительно превышают темпы снижения активности ингибиторов нейтральных протеаз

Исходя из изложенного, можно заключить, что вероятно процесс деградации запасных белков семян нута, осуществляемый нейтральными и щелочными протеазами, при прорастании семян связан как с повышением протеолитической активности (нейтральные протеазы), которое, скорее всего, обусловлено синтезом ферментов, действующих в нейтральной зоне рН de novo, так и с разрушением белковых ингибиторов, что способствует высвобождению активных протеолитических ферментов, содержащихся в созревших семенах нута

3.8. Влияние нутовой муки на качество хлеба

Анализ литературных данных по состоянию вопроса о производстве и применению белков растительного происхождения позволяет выделить нут как наиболее перспективную зернобобовую культуру, массовая доля белков в котором составляет 30 — 32%, а аминокислотный скор идентичен сое. Нут, как отмечалось выше, традиционная культура для Среднеазиатского региона, она имеет хорошие перспективы возделывания и в России (посевные площади составляют 50 тыс га и имеет тенденцию к дальнейшему росту). При этом себестоимость 1 тонны зерна нута в 2 — 3 раза ниже за счет неприхотливости при возделывании (Аникеева Н.В , 2004, Балашов В В др , 2002).

С целью изучения возможности замены части пшеничной муки на нутовую (10, 15, 20, 25% от массы пшеничной муки), проводили оценку выхода и качества клейковины, а также оценивали качественные и органолептические показатели хлеба Оценку качества исходного сырья проводили стандартными методами, принятыми в хлебопечении. Полученные данные свидетельствуют о том, что добавление нутовой муки более 10% от массы пшеничной муки приводит к уменьшению массовой доли клейковины и ее ослаблению

На следующем этапе проводили выпечку хлеба с заменой части

пшеничной муки на нутовую (10, 15, 20, 25% от массы пшеничной муки)

Контрольным вариантом служила проба муки без добавления нута Брожение

теста проводили при температуре 28 - 30°С в воздушном термостате, 22

продолжительность брожения теста - 150 минут с двумя обминками через каждые 60 минут после начала брожения. После брожения тесто взвешивали. Куску массой 400 г придавали овальную форму и сразу же после формования помещали в предварительно смазанную форму. Форму помещали для расстойки в термостат, в котором поддерживали температуру 35°С и относительную влажность воздуха 75 - 80 %. Окончание расстойки определяли органолептически. Выпечку хлеба проводили в лабораторной условиях в электропечи при температуре 220-230 °С с увлажнением пекарной камеры в течение 25 мин. Качество хлеба оценивали через 16 часов хранения по следующим показателям: пористость, удельный объем, органолептическая оценка. Как видно из представленных на рис. 11 фотографиях, образец 2,

1 2 3 4 5

Рис. 11. Образцы хлеба с добавлением путовой муки

1 - контроль; 2 - 10% нутовой муки; 3 - 15% нутовой муки; 4 муки; 5 — 25% нутовой муки

- 20% нутовой

с добавлением нутовой муки в количестве 10 % от массы пшеничной муки, по объему, правильности формы, цвету корки не уступает контрольному варианту, а даже превосходит его Суммарная оценка качества хлеба исследуемых образцов была проведена с использованием балльной оценки по методике, разработанной кафедрой технологии хлебопекарного производства МТИШТ (в настоящее время МГУ 1111) Она комплексно отражает (в баллах) наиболее важные показатели качества пшеничного хлеба, определяемые органолептическими и объективными методами анализа. На основании проведенных исследований, можно сделать вывод о том, что наиболее оптимальной является замена пшеничной муки на нутовую в количестве 10% к массе муки (82 балла против 80 баллов в контроле)

Выводы

1 Проведено сравнительное изучение белкового комплекса семян нута сортов «Таджикский» и «Джалалабадский», выращенного в условиях Таждикистана, урожая 2005г

2 Показано, что в созревших семенах нута содержатся протеолитические ферменты, различающиеся оптимумом рН действия, нейтральные (рН 7,0) и щелочные (рН 10,0)

3 Разработана схема выделения и очистки нейтральной и щелочной протеаз с применением гель-хроматографии на колонке с колонке с TSK - gel Toyopearl HW - 55F

4 Проведена очистка нейтральной протеазы с увеличением удельной активности в 1130 раз Установлено, что нейтральная протеаза является тиоловым ферментом с молекулярной массой 70000 Дальтон.

5 Проведена очистка щелочной протеазы с увеличением удельной активности в 540 раз Установлено, что щелочной протеаза является сериновой протеазой с молекулярной массой 35000 Дальтон.

6. Разработана схема выделения белковых ингибиторов протеаз из семян нута, специфичных по отношению к собственным протеолитическим ферментам и к трипсину.

7. Показана способность нейтральной и щелочной протеаз семян нута гидролизовать собственные белки.

8. Установлено, что белковые ингибиторы протеаз участвуют в регуляции активности протеаз нута в покое и при прорастании. Устойчивость белкового комплекса семян нута в покое обусловлена тем, что активность протеаз подавляется белковыми ингибиторами. При прорастании семян наблюдается разрушение ингибиторов и высвобождение активных протеолитических ферментов, осуществляющих активный протеолиз белков.

9. Показана возможность замены пшеничной муки на нутовую в количестве 10% при выпечке хлеба, при этом происходит увеличение удельного объема формового хлеба, улучшается окраска и структура корок, сохраняются другие органолептические показатели качества.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Асатуллоев, И А. Зернобобовые культуры и их значение [Текст] / И. А Асатуллоев // сб докладов III Юбилейной международной выставки -конференции «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации», Ч П - М : ИК МГУПП, 2005.-С 29-32

2 Асатуллоев, И.А. Характеристика нута как основной бобовой культуры Таджикистана [Текст] / И А Асатуллоев, Г П Карпиленко //сб докладов V ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика» - М, 2005 - С 362 - 366

3 Асатуллоев, И А Белки семян бобовых культур [Текст] / И А Асатуллоев, Г П Карпиленко // сб. докладов IV международной конференции-выставки «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации», Ч II - М ИК МГУПП, 2006 - С 19-20

4 Асатуллоев, И.А Белково-протеиназный комплекс семян нута [Текст] / И.А. Асатуллоев, Г.П Карпиленко, И С. Витол // Хлебопродукты.- 2007 -№7.-С 50-51

5 Асатуллоев, И А Белковые ингибиторы протеаз из семян нута [Текст] / И А Асатуллоев, Г.П Карпиленко, И С Витол // Хлебопродукты - 2008 -№ 1 - С 58-59

Подписано в печать 22.01 08 Формат 30x42 1/8 Бумага типографская № 1 Печать офсетная. Печ л. 1,2. Тираж 120 экз Заказ 8 125080, Москва, Волоколамское ш., 11 ИКМГУПП

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. История; распространение и значение нута.

1.1.1. Нут - общая характеристика.

1.1.2. Пищевая ценность семян нута.

1.2. Белковые вещества семян бобовых культур.

1.3. Протеолитические ферменты.

1.3.1. Классификация и общая характеристика протеолитических ферментов.

1.3.2. Протеолитические ферменты семян растений.

1.3.3. Протеолитические ферменты семян бобовых культур.

1.4. Белковые ингибиторы протеолитических ферментов, их роль в регуляции активности протеаз.

1.4.1. Белковые ингибиторы пищеварительных протеаз в семенах нута различных сортов.

2. Экспериментальная часть.

2.1. Материалы и методы исследований.

2.1.1. Характеристика объекта исследования и методы исследования физических и химических показателей качества семян нута.

2.1.2. Проращивание семян нута.".

2.1.3. Определение водорастворимого белка по методу Лоури.5 Г

2.1.4. Определение фракционного состава белков.

2.1.5. Определение активности протеаз по методу Ансона.

2.1.6. Определение ингибирующей активности белковых ингибиторов протеаз.

2.1.7. Определение амилозы и амилопектина.

2.1.8. Фракционирование белков методом гель-хроматографии.

2.1.9. Методы оценки свойств сырья для приготовления хлеба.

2.1.10. Методы приготовления теста и хлеба. Бальная оценка качества хлеба.

2.2. Характеристика белкового комплекса семян нута.

2.2.1. Фракционирование белков семян нута по растворимости.

2.2.2. Фракционирование белков семян нута методом гельхроматографии на колонке с TSK - gel Toyopearl HW - 55F.

2.3. Характеристика протеолитических ферментов семян нута.

2.3.1. Выбор условий извлечения протеаз семян нута.

2.3.2. Определение оптимума рН протеаз семян нута.

2.3.3. Выбор условий осаждения протеаз семян нута.

2.3.4. Влияние температуры на активность протеаз семян нута.

2.3.5. Влияние активаторов и ингибиторов на активность протеаз семян нута.

2.41 Очистка протеаз семян нута и характеристика очищенных препаратов.

2.4.1. Осаждение протеаз при подкислении.79'

2.4.2. Гель-хроматография протеаз на колонке с ТБК - gel Тоуореаг

2.4.3. Схема выделения и очистки протеаз семян нута.

2.4.4. Характеристика нейтральной протеазы нута.

2.4.5. Характеристика щелочной протеазы нута.

2.5. Белковые ингибиторы протеаз из семян нута.

2.5.1. Выделение белковых ингибиторов.

2.5.2. Гель-хроматография протеаз на колонке с ТБК - gel Тоуореаг1 Н\\г-55Р.

2.5.3. Схема выделения белковых ингибиторов протеаз из семян нута.

2.6. Действие протеолитических ферментов семян нута на белки нута и пшеницы.

2.6.1. Действие протеолитических ферментов семян нута на белки нута.

2.6.2. Действие протеолитических ферментов семян нута на белки пшеницы.

2.7. Изменение активности протеолитических ферментов и их белковых ингибиторов при прорастании семян нута.

2.8. Влияние нутовой муки на качество хлеба.

Выводы.

Актуальность темы

Нут (Cicer arietinum) - ценнейшая бобовая культура, известная с древнейших времен. Она широко используется в питании населения различных стран, особенно, странах Азии, в том числе и странах Среднеазиатского региона. Пищевая ценность семян нута обусловлена благоприятным сочетанием в семенах белков, жиров и углеводов, макро- и микроэлементов, витаминов и других биологически активных веществ. Зерно в зрелом виде содержит 18-31% белка, 6% жира, 46 - 48% крахмала, 84 — 86% сухих веществ, 19,9% азотистых веществ, 3,8% золы.

В настоящее время рост производства зернобобовых культур в сочетании с улучшением их биохимических показателей и технологических достоинств - одна из. сложных и ответственных задач растениеводства. Изучение сложных физиологических процессов, протекающих в семени на разных этапах его развития позволят найти подходы к направленному формированию биохимических показателей качества семян. Одним из таких важнейших процессов, протекающих в семени является протеолиз запасных белков при прорастании. В нем могут принимать участие как ферменты, содержащиеся в созревших семенах, так и ферменты, синтезирующиеся de novo при прорастании.

Семена нута богаты белком, однако их протеолитические ферменты практически не изучены. В семенах нута показано наличие белковых ингибиторов протеаз, но все они являются ингибиторами экзогенных 4 протеолитических ферментов. Вопрос о взаимодействии белковых ингибиторов протеаз семян нута с собственными протеолитическим ферментами, а, следовательно, и об их роли в регуляции процесса протеолиза запасных белков при прорастании семян нута остается открытым.

Цель и задачи исследования

Целью работы является изучение белкового и протеолитического комплекса семян нута, выращенного в Таджикистане, а также выяснение возможных механизмов регуляции их активности в покое и при прорастании.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи: охарактеризовать белковый комплекс семян нута сортов «Таджикский» и «Джалалабадский», выращенных в условиях Таджикистана;

- выделить и охарактеризовать нейтральные и щелочные протеазы семян нута;

- изучить взаимодействие протеолитических ферментов семян нута с белковыми ингибиторами протеаз;

- исследовать изменение активности протеаз семян нута и их белковых ингибиторов при прорастании.

Научная новизна

Впервые показано наличие в созревших семенах нута протеолитических ферментов разного типа, действующих в нейтральной и щелочной областях рН. Проведена очистка нейтральной протеазы с оптимумом рН действия 7,0, показано, что она является ферментом тиолового типа. Выделен и охарактеризован ранее не описанный в литературе фермент с оптимумом рН действия 10,0. Показано, что щелочная протеаза относится к ферментам серинового типа.

Установлено, что нейтральная и щелочная протеазы семян нута активно гидролизуют запасные белки покоящихся семян.

Впервые показано, что белковые ингибиторы в семенах нута взаимодействуют с эндогенными протеолитическими ферментами и участвуют в регуляции их активности в покоящихся и прорастающих семенах.

Практическая значимость работы

Семена нута имеют многоцелевое использование, и в разных технологических операциях состояние белково-протеиназного комплекса играет весьма существенную роль. Так, нутовая мука используется в хлебопечении и при производстве кондитерских изделий, как компонент, повышающий пищевую ценность и вкусовые качества готового продукта. Выявлена способность нейтральных протеаз семян нута гидролизовать белки пшеницы, что позволит наметить подходы к управлению процессом протеолиза в условиях тестоведения.

Разработана схема выделения нейтральных и щелочных протеаз и их белковых ингибиторов из семян нута. Получены препараты нейтральной и щелочной протеаз со степенью очистки 1132 и 547 раз соответственно.

Полученные данные могут быть использованы в селекции нута для получения семян с заданными особенностями белково-протеиназного комплекса.

Показана возможность замены пшеничной муки на нутовую в количестве 10% при выпечке хлеба, при этом происходит увеличение удельного объема формового хлеба, улучшается окраска и структура корок, сохраняются другие органолептические показатели качества.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на III Юбилейной международной выставке-конференции «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (Москва, 2005); V Ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика» (Москва, 2005); IV Международной конференции-выставке «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (Москва, 2006).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы.

1. Обзор литературы

1.1. История, распространение и значение нута

Выводы

1. Проведено сравнительное изучение белкового комплекса семян нута сортов «Таджикский» и «Джалалабадский», выращенных в условиях Таджикистана, урожая 2005г.

2. Показано, что в созревших семенах нута содержатся протеолитические ферменты, различающиеся оптимумом рН действия: нейтральные (рН 7,0) и щелочные (рН 10,0).

3. Разработана схема выделения и очистки нейтральной и щелочной протеаз с применением гель-хроматографии на колонке с колонке с Т8К -§е1 Тоуореаг1 Н^^ - 55Б.

4. Проведена очистка нейтральной протеазы с увеличением удельной активности в 1130 раз. Установлено, что нейтральная протеаза является тиоловым ферментом с молекулярной массой 70000 Дальтон.

5. Проведена очистка щелочной протеазы с увеличением удельной активности в 540 раз. Установлено, что щелочная протеаза является сериновой протеазой с молекулярной массой 35000 Дальтон.

6. Разработана схема выделения белковых ингибиторов протеаз из семян нута, специфичных по отношению к собственным протеолитическим ферментам и к трипсину.

7. Показана способность нейтральной и щелочной протеаз семян нута гидролизовать собственные белки.

8. Установлено, что белковые ингибиторы протеаз участвуют в регуляции активности протеаз в покое и при прорастании. Устойчивость белкового комплекса семян нута в покое обусловлена тем, что активность протеаз подавляется белковыми ингибиторами. При прорастании семян наблюдается разрушение ингибиторов и высвобождение активных протеолитических ферментов, осуществляющих активный протеолиз белков.

9. Показана возможность замены пшеничной муки на нутовую в количестве 10% при выпечке хлеба, при этом происходит увеличение удельного объема формового хлеба, улучшается окраска и структура корок, сохраняются другие органолептические показатели качества.

1. Абдрахманова A.M. Использование нетрадиционных наполнителей в производстве средне- и низкокалорийных майонезов / В кн.: Совершенствование технологий и переработки с.-х. продукции в современных условиях. -Волгоград, 1999, с. 161 - 163.

2. Абрамова Е.П., Черникова М.П. Содержание ингибиторов- протеаз в семенах некоторых бобовых // Вопросы питания, 1964, т. 23, с. 13-18.

3. Аникеева Н.В. Биологическая ценность белков нута / В сб. «Качинские чтения». — Волгоград: Царица, 2003, с. 12 13.

4. Аникеева Н.В. Научные основы новых технологий белковых препаратов и диетических продуктов с использованием нута. Автореф. дисс. на соискание уч. ст. докт. техн. наук. Воронеж, 2004, — 48 с.

5. Антонов К.В. Химия протеолиза. М.: Наука, 1983, - 386 с.

6. Балашов В.В1., Балашов A.B., Патрин М.Т. Нут зерно здоровья. -Волгоград: Изд. «Перемена», 2002, - 88 с.

7. Белозерский^ М:А. Свойства, и физиологическая роль протеиназ и их ингибиторов в семенах некоторых высших растений. Автореф. дисс. на-соискание уч. ст. докт. биол. наук. М.: 1983, - 44 с.

8. Бенкен И.И. Изменчивость содержания ингибиторов трипсина в семенах фасоли / В'кн.: Селекция, семеноводство и приемы возделывания фасоли. -Орел, 1975, с. 137- 143.

9. Бенкен И.И., Буданова В.И. Ингибиторы трипсина в семенах фасоли / В кн.: Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции, 1976, т. 56, № 3, с. 67-73.

10. Ю.Бенкен И.И., Волузнева Т. А., Мирошниченко И.И. Активность ингибиторов трипсина и содержание белка в семенах чечевицы и чины / Бюл. ВИР, 1977, № 73, с. 29 34.

11. Бенкен И.И., Демина Р.Б. Комендантова Т.А. Белок и белковые ингибиторы протеиназ1 в семенах различных сортов нута (Cicer arietinum1.) II Труды по прикладной ботанике, генетике, селекции, 1981, т. 70, № 3, с. 3 9.

12. Бенкен И.И., Кузнецова Е.А. Активность протеолитических ферментов и ингибиторов протеиназ в прорастающих семенах чины / В кн.: Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции, 1981, т. 70, № 3, с. 11-19.

13. Бенкен И.И., Макашев Р.Х. Некоторые показатели питательной ценности кормового гороха. JL: Бюл. ВИР, 1977, вып. 73, с. 7 - 11.

14. Бенкен И.Иг, Мосолов В:В., Федуркина Н.В. Влияние ингибитора протеиназ из фасоли на фитопатогенные грибы // Микробиология и фитопатология, 1976, т. 10 № 3, с. 198-201.

15. Бенкен И.И1. Волузнева Т. А., Мирошниченко И.И. Активность ингибиторов трипсина и содержание белка в семенах чечевицы и чины. -Л.: Бюл. ВИР, 1977, вып. 73, с. 29 34.

16. Буткевич B.C. Регрессивный метаморфоз белковых веществ в высших растениях и участием в нем протеолитического фермента // Изв. Московского сельскохозяйственного института, 1904,т. 10, с. 1.

17. Витол И.С. Протеолитические ферменты семян фасоли. Дисс. на соискание уч. степ. канд. биол. наук. М., 1986, - 188 с.

18. Вишнякова М.А. Яньков И.И., Булынцев C.B. Горох, фасоль, бобы. — СПб.: Диамант, 2001, 224 с.

19. ГОСТ 8758 76. Нут. Технические условия. - М.: Изд-во стандартов, 2003, с. 16-19.

20. Детерман Г. Гель-хроматография. М.: Мир, 1970, - 602 с.

21. Дюкянджиев С.Б., Саянова О.В., Вайнтрауб И.А., Шутов А.Д. Распад запасных белков и протеолитическая активность в прорастающих семенахфасоли // Изв.- АН Молд. ССР, серия биол. и хим. наук, 1980, № 2, с. 48 -53.

22. КарпиленкоГ.П., Попов М.П. Свойства кислой протеиназы-ячменя // Прикладная биохимия и микробиология, 1975, т. 11, №5, с 757 758.

23. Княгиничев М.И., Гросман В.Ю. Биохимия нута / В кн.: Биохимия культурных растений. JL, 1938, т. 2, - 248 с.

24. Колеснов А.Ю. Протеолитические ферменты ячменя. Дисс. на соискание уч. ст. канд. биол. наук. М., 1987. - 186 с.

25. Коренев Г.В., Подгорный П.И., Щербак С.Н. Растениеводство с основами селекции и семеноводства: -М.: Агропромиздат, 1990, 575 с.

26. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. М.: Высшая школа, 1980,-272 с.

27. Коэн Ф. Регуляция ферментативной активности. М.: Мир,1986; -144 с.

28. ЗБ.Кретович B.JI. Биохимия растений. М.: Высшая школа, 1986, - 502 с.

29. Локшина JI.A. Реакции ограниченного протеолиза и их регуляторноезначение / В кн.: Успехи биологической химии. — М.: Наука, 1977, т. 18, с. 162-184.

30. Локшина JI.A. Регуляторная роль протеолитических ферментов // Молекулярная биология, 1979, т. 13, № 6, с. 1205 1229.

31. Милов В.М. Количественный и качественный состав белка и его изменения в семенах гороха и нута. Дис. на соискание уч. ст. канд. биол. наук. JL, 1953.-23 с.

32. Мирошниченко И.И., Павлова A.M. Нут. М.: Сельхозгиз, 1953, - 112 с.

33. Мосолов В.В. Белковые ингибиторы как регуляторы, процессов протеолиза / В"кн.: 36-е Баховские чтения. М.: Наука, 1983, - 40 с.

34. Мосолов В.В. Природные ингибиторы протеолитических ферментов / В кн.: Успехи биологической химии. М.: Наука, 1982, т. 22, с. 100 - 118:

35. Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. М.: Наука, 1971, - 414 с.

36. Плешков В.Н. Биохимия сельскохозяйственных растений. М.: Колос, 1980,-495 с.

37. Попов М.П., Карпиленко Г.П. Исследование кислых протеаз ячменя и ячменного солода // Прикладная биохимия и микробиология, 1974, т. 10, №2, с: 301 -303.

38. Попов М.П.", Карпиленко Г.П., Глинская,E.H. Исследование продуктов протеолиза альбумина и белков эндосперма ячменя кислой протеиназой ячменя // Прикладная биохимия и микробиология, 1976, т. 12, № 3, с. 438 -441.

39. Пучкова Л.И. Лабораторный практикум по технологии хлебопекарного производства. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1982, - 232 с.

40. Саранчук И.С., Арсений A.A. Изменение химического состава зерна нута в. зависимости от агротехнических приемов / В кн.: Интенсификация производства техш и корм.» культур. Кишинев, 1990,- с. 35 - 40.

41. Сельскохозяйственная биотехнология / под ред. акад. РАСХН B.C. Шевелухи, М.: Изд. МСХА, 1995, - 310 с.

42. Сеферова И.В. Анализ географического распространения i разновидностей культурного нута Cicer arietinum L. II Научн.-техн. бюл. ВНИИ растениеводства, 1994, № 233, с. 95 - 99.

43. Сеферова И.В. Типы семян культурного нута (Cicer arietinum L.) и их географическое распространение // Научн.-техн. бюл. ВНИИ растениеводства, 1992, № 223, с. 43 46.

44. Сеферова И.В. Эколого-географическая дифференциация нута Cicer arietinum L. 11 Научн.-техн. бюл. ВНИИ растениеводства, 1993, № 230, с. 34-35.

45. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир, 1995, - 310 с.

46. Степанов В.М. Протеолитические ферменты структура, функциональные особенности, эволюция. / В кн.: Химия протеоли-тических ферментов. - Углич, 1979, с. 5 - 11.

47. Столяров О.В., Федоров В. А., Демченко Н.И. Нут (Cicer arietinum L.). — Воронеж: Изд. ВГУ, 2004, 256 с.

48. Тер-Мовсесян А.Ж. Нейтральные протеазы зерна ржи и их белковые ингибиторы. Автореф. дис. на соискание уч. степ. канд. биол. наук. — М., 1981,-24 с.

49. Тимман К.В. Вступительная глава / В кн.: Физиология и биохимия покоя и прорастания семян. -М.: Колос, 1982, с. 13 16.

50. Типисева И.А. Протеолитические ферменты семян сои. Автореф. дис. на • соискание уч. степ. канд. биол. наук. М., 1984, - 21 с.

51. Федотов В.А. Зернобобовые культуры /под ред. Г.В. Коренева. -Воронеж: Центр.-Ченозем. кн. изд., 1986, с. 142 169.

52. Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов. М.: Мир, 1980, -432 с.

53. Фомина О.Н. Левин A.M. Нарсеев A.B. Зерно. Контроль качества и безопасности по международным стандартам, (под ред. В:М. Кантере). -М.: Протектор, 2001,-368 с.

54. Химия и биохимия бобовых растений / под ред. М.Н. Запрометова. М.: Агропромиздат, 1986, - 336 с.

55. Шаненко Е.Ф. Нейтральные протеазы зерна пшеницы и их белковые ингибиторы. Автореф. дис. на соискание уч. степ. канд. биол. наук. М., 1980, - 24 с.

56. Шаненко Е.Ф., Попов М.П. Кретович В.Л. Нейтральные протеазы зерна пшеницы / Прикладная биохимия и микробиология, 1985, т.21, № 2, с. 173- 175.

57. Шпаар Д., Элмер Ф., Постников А., Тарануко Г. Зернобобовые культуры. Минск: ФАУинформ, 2000, - 264 с.

58. Шульц Г., Ширмер Р. Принципы структурной'организации белков М.: Мир, 1982,-354 с.74:Шутов А.Д. Протеолиз запасных белков в прорастающих семенах бобовых. Автореф. дис. на соискание уч. степ, доктора^биол. наук. — М., 1983,-34 с.

59. Шутов А.Д., Белтей Н.К., Вайнтрауб И.А. Цистеиновая протеиназа из прорастающих семян пшеницы: частичная очистка и гидролиз клейковины // Биохимия, 1984, т. 49, № 7, с. 1171 1177.

60. Шутов А.Д., Бульмага В:П., Поло Р.Э. Протеиназа А прорастающих семян вики и ее роль в мобилизации запасных белков / В кн.: Биохимия нуклеиновых кислот и метаболизм белка. Минск, 1981, с. 73 - 74.

61. Шутов А.Д., Вайнтрауб И.А. О разложении белков семян сои и вики при прорастании / В кн.: Растительные белки. Кишинев: Штиица, 1972, с. 38 -42.

62. Шутов А.Д., Вайнтрауб И.А. Протеолиз запасных белков при прорастании семян / В кн.: Биохимические- и физиологические исследования семян. Иркутск, 1979, с. 136 - 146.

63. Шутов А.Д., До Нгок Лань, Вайнтрауб И.А. Очистка и частичная характеристика протеазы В из прорастающих семян вики // Биохимия, 1982, т. 47, №5, с. 814-821.

64. Шутов А.Д., Королева Т.Н., Вайнтрауб И.А. Об участии протеаз покоящихся семян вики в распаде запасных белков при прорастании // Физиология растений, 1978, т. 25, № 4, с. 735 742.

65. Шутов А.Д., Поло Р.Э. Об участии фенилаланин-п-нитроанилидазы в распаде запасных белков вики // Биохимия, 1983, т. 48, № 5, с. 870 874.

66. Янцен С.П. Результаты испытания нута в лесостепной зоне Алтайского края / Научно.техн. бюл. СО ВАСХНИЛ, 1987, № 6, с. 38 42.

67. Abu-Shakra S., Mirza S., Tannous R. Chemical composition and amino acid content of chickpea seeds at different stages of development // J.jf Sci/ os Food and Agriculture, 1970, v. 21, p. 91 93.

68. Adams S. A., Novelle L., Liebernberg W. Biochemical properties, and ultrastucture of protein bodies isolated from selected1 cereals // Sereal Chemistry, 1976; v. 53, № 1, с. 1 1-2.

69. Ainouz I.L., Benevides N. В., Freitas A.L.P. Proteolytic activities in seeds of Vigna unguiculata (L.) Walp. // Biol. Plant., 1981, v. 23, № 2, p. 133 140.

70. Amen R.D. A model of seed dormancy // Botanical Review, 1968, v. 34, № 1, p. 1-31.

71. Anson M.L'. The estimation of pepsin, trypsin, papain and catepsin with hemoglobin // J!. Gen. Physiol., 1938, v. 22, p. 79 82.

72. Aschton F. M. Mobilization of storage proteins of seeds // Ann. Rev. Plant. Physiol., 1976, v. 27, p. 95 117.

73. Baker B.E., Papaconstantinou J.A., Cross С/КУ, Khan N.A. Protein and lipid constitution of some Pacistani puises // J. Sci. Food Agric., 1961, v. 12, № 3, p. 205-207.

74. Belew M., Porath J., Sundberg L. The tripsin and chymotripsin inhibitors in chick peas (Cicer arietinum L.\ purification and properties of inhibitors // Eur. J. Biochem., 1975, v. 60, № 1, p. 247 258.

75. Bennett R.E. The study and evaluation of proteins from chickpea, (Cicer arietinum L.) and horse bean (Vicia faba L.) flours // Dissertatijn Abstracts International, B.37. S.3331.

76. Belitz H. D. Lymen F., Weder J.K.P. Comparative studies on the inhibitors action of some legume seeds, potato tubers and bran against human and bovine proteases // Zeitschrift fur Lebensmittel Untersuchung' und Forschung, 1982, B. 174, S. 442-446.

77. Bhatty R. S. Albumin* proteins of eight edible grain- legume species: Electrophoretic patterns and amino acid composition // J. of Agr. and Food Chemistry, 1982, v. 30, p. 620 622.

78. Bond H.Mi, Bowles D.I. Characterization of soybeans endopeptidase activity using exogenous and endogenous substrates // Plant. Physiol., 1983, v. 72, № 2, pi 345-350.

79. Boulter D. The ultrastructure and composition of legume cotyledon protein bodies I I Abh. Akadem. Wiss. DDR Abt. Math., Naturwiss., Techn., 1981, H: 5, S. 95-101.

80. Chandra S., Arora S. -K. An estimation of protein, ascorbic acid and.mineral matter content in some indigenous and exotic varieties of gram (Cicer arietinum L.) II Current Sci., 1968, v. 37, № 8, p. 237 238.

81. Chrispeels M.I., Baumgartner B., Harris H. Regulations of reserve protein metabolism in the cotyledons of mung bean seedlings // Proc. Nat. Acad. Sci., 1976, v. 73, № 8, p. 3168 3172.

82. Chrispeels M.I:, Bollini R., Harris H. Biosynthesis, accumulation and catabolism of reserve proteins in legume seeds // Ber. Bot. Ges., 1980, Bd.92, H: 2-3, S. 535-551.

83. Chrispeels M.I., Boulter D. Control of storage protein,metabolism in the cotyledons of germinating mung beans: role of endopeptidase // Plant. Physiol., 1975, v. 55, № 6, p. 1031 1037.

84. Csoma C., Polgar L. Proteinase from germinating bean cotyledons // Biochem. J., 1984, v. 222, № 3, p. 769 777.

85. Dudman W. F. Growth and extracellular polysaccharide production by Rhizobium meliloti in defined medium // J. Bacterid., 1964, v. 88, № 3, p. 640 645.

86. Enari T.-M., Mikola J. Endopeptidases of germinating barley / EBC Congress Proc., 1967, p. 9- 16.

87. Frattali Y., Steiner R.F. Soybean inhibitors. I. Separation and. some properties of three inhibitors from commercial crude soybean trypsin inhibitor // Biochemistry, 1968, v. 7, p. 521'.

88. Gallardo F., Araya H., PakN., Tagle M.A. Toxic factors in Chilean legumes. II. Trypsin inhibitor activity // Archivos Latin de Nutricion, 1974, v. 24, p. 183- 189.

89. Gennis L.S., Cantor C.R. Double-headed protease inhibitors from Black eyed' Peas. L Purification» of two new inhibitors and endogenous protease by affinity chromatography // J. Biol. Chem., 1976, v. 251, p. 734 740.

90. Gennis L.S., Cantor C.R. Double-headed protease inhibitors from Black eyed Peas. II. Structural studies be optical absorption'and circular dichroism // J. Biol. Chem., 1976, v. 251, p. 741- 746.

91. Guardiola L, Suteliffe I. F. Control of protein hydrolysis in the cotyledons of germinating pea seeds (P. sativum) // Ann. Bot., 1971, v. 35, № 142, p. 791 -807.

92. Jaya T.V., Krishnamurthy K.S., Venkataraman L.V. Effect of germination and cooking on the protein efficiency ratio of some legumes // Nutritions Reports International, 1975, v. 12, p. 175 183.

93. Jodha N.S., Subba Rao K. V. Chickpea: world importance and distribution // Indian "J. Biochem. and biophys;v1997, v. 34}№ 1, p. 1 24.

94. Kakade M. L., Simons N., Liener I. An evaluation of natural and synthetic substrates for measuring the the antitryptic activity of soybean samples // Cereal Chem;., 1969, V. 46, p. 518.

95. Khan M. A., Jacobsen I., Eggum B.U. Nutritive value of improved varieties of legumes //J. of Sei. of Food and Agr., 1979, v. 30 p. 395 400.llö.Laskowski M., Kato I. Protein inhibitor of proteinases // Ann. Rev. Biochem., 1980, v. 49, p. 593 626.

96. Liener I. E. A Review: Legume-toxins in-relation to protein digestibility //-J.-of Food Sei., 1976, v. 41, p. 1076 1081.

97. Liener I. E. Protein inhibitors and lectins // Biochemistry of Nutrition, 1979, v. 27, p. 97 122.

98. Lichtenfeld C., Mantenfell L., Müntz K., Scholz G. Protein degradation'in germinating legume seeds // Abh. Akadem. Wiss. DDR Abt. Math:, Naturwiss., Techn., 1981, H. 4, S. 133 152.

99. Lowry O.H., Rosebrougt N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent. // J. Biol. Chem., 1951, v. 193, p. 265.

100. Maesen L. J. G., Cicer L. A monograph of the genus, with special>reference-to the chick pea; its ecology and cultivation. Wageningen. 172, p. 287 292.

101. Mathur K. S., Sharma R.D., Ran N. Chromatographic amino acid patterns of various protein fractions of Bengal gram (Cicer arietinum L.) II Indian J. of Medical Research, 1968, v. 58, p. 863.

102. Matile P. Alerone vacboleos lysosomes // Z. Pflanzen-physiol., 1968, B.58, S. 365-368.

103. Mitsuhashi W., Koshiba T., Minamikawa T. Separation and characterization of two proteinases in germinating Vigna mungo seeds // Plant. Physiol., 1986, v. 80, № 3, p. 628 634.

104. Morris G. F. I., Turman D.A., Boulter D. The extraction and chemical composition of alerone grains (protein bodies) isolated from seeds of Vicia faba II Phytochemistry, 1970, v. 9, p. 1709 1714.

105. Mossor G., Skupin J., Romanovska B. Plant inhibitors of proteolytic enzymes / Die-nahryng-food, 1984, v. 28, № 1, p. 92 113.

106. Pak N., Barja I. Composition, content of toxic substances, protein quality and protein value of greenpeas, chickpea and lentils grown in Chile // Ciencia Investigación Agraria, 1974, v. 1, p. 105 — 111.

107. Pushpamma P., Geervani P. Utilization of chickpea. Wallingford: C.A.B. International, 1981, p. 357 - 368.

108. Pusztai A., Duncan I. Changes in proteolytic enzyme activities and transformation of nitrogenous components in the germinating seeds of kidney bean II Planta, 1971, v. 96, № 4, p. 317 325.

109. Rajalakshmi R., Vanaja K. Chemical'and biological evaluation of the effects of fermentation on the nutritive of value of foods prepared from rice and gram // British J. of Nutrition, 1967, v. 11, p. 268 372.

110. Raskis I.I., Anderson R.E. Isolation of four soybean trypsin inhibitors by DEAE-cellulose chromatography//Biochem. Biophys. Res. Communs., 1964, v. 15, p. 230-235.

111. Richardson M. The proteinase inhibitors of enzemes // Food. Chem., 1981, v. 6, №3, p. 235-253.

112. Saxena M.G., Singh K.B: The chickpea. Wallingford: C.A.B. International, 1987,- 409 p.

113. Sing U., Jambunathan R., Subramanyam N., Kherderkar M. S. Studies on the antinutritional factors of desi and kabuli chickpeas cultivars / Presented at the 13th Annual Meeting of the Nutrition Society of India, 1980, p. 56 59.

114. Sing U., Raju S. M., Jambunathan R. Studies on desi and kabuli chickpeas {Cicer arietinum L.) cultivars. II. Seed protein fractions and amino acid composition // J. of Food Sci. and Technology, 1981, v. 18, h. 86 88.

115. Taisuke I., Masayuke K., Kazue M. Partical purification and proerties of proteases from defatted soybean flour // J. Nitr. Sci. Vitaminology, 1979, v. 25, №4, p. 333-342.

116. Tan-Wilson A.L., Cosgriff S.E., Duggan M.C., Obach R.S:, Wilson K.A. Bauman-Birk inhibitor complements of soybean strains // J. Agric. And Food. Chemi, 1985, v. 33, № 3, p. 389 393.

117. Vaintraub I.A., Bulmaga V.P. Soybean seed 2S-globulins are not trypsin inhibitors // Die Nahrung Food, 1985, v. 29, № 8, p. 711 - 714.

118. Vavreinova S., Turkova I. SH-proteinase from bean Phaseolus vulgaris var. Perlicka II Biochem. Et biophys. Acta, 1975, v. 403, № 2, p. 506 513.

119. Warsy A.S., Norton G., Stein M. Protease inhibitors from broad bean. Isolation and purification // Phytochemistiy, 1974, v. 13, № 11, p. 2481 -2486.

120. Whiltaker I.R., Sgarbieri V.C. Purification and composition of trypsin-chymotrypsin inhibitors of Phaseolus vulgaris L. var. Rosinha G2 II J. Food Biolchem., 1981, v. 5, № 3, p. 197 213.

121. Williams P.S., Singh U. Nutritional quality and the evaluation of quality in breeding programmes. Wallingford: C.A.B. International, 1981, p. 329 -342.

122. Willson K.A., Chen I.C. Amino acid sequence of mung bean trypsin inhibitors and its modified forms appearing during germination //Plant. Physiol., 1983, v. 71, № 2, p. 341 349.

123. Willson K.A., Laskowski M. Isolation of three isoinhibitors of trypsin from garden bean, Phaseolus vulgaris, having either lysine or arginine at the reactive site // J. Biol. Chem., 1973, v. 248, № 3, p. 756 762.

124. Willson K.A., Tan-Willson A.L. Proteinases involved in degradation of trypsin inhibitors in germinating mung beans // Acta biochimica polonica, 1983, v. 30, №30, p. 139-148.

125. Yamamoto M., Ikenaka T. Studies on soybean trypsin inhibitors. I. Purification and characterization of the two soybean trypsin inhibitors // J. Biochem., 1967, v. 62, p. 141 149.

126. УТВЕРЖДАЮ» ^Генеральный директорграната № 3 г. Москвы Маркса Л.Н.2007 г.и чиый !0Т1. АКТпроизводственных (предварительных) испытаний