автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Биотехнология стартовых культур на основе молочнокислых бактерий, синтезирующих полисахариды

На правах рукописи

РОЖКОВА ТАТЬЯНА ВЯЧЕСЛАВОВНА

БИОТЕХНОЛОГИЯ СТАРТОВЫХ КУЛЬТУР НА ОСНОВЕ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ, СИНТЕЗИРУЮЩИХ ПОЛИСАХАРИДЫ

Специальность 05.18.07 - Биотехнология пищевых продуктов

(перерабатывающие отрасли АПК)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва-2006

Работа выполнена на кафедре «Технология молока и молочных продуктов» ГОУ ВПО Московского государственного университета прикладной биотехнологии (МГУПБ)

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор технических наук, профессор Ганина В.И.

доктор технических наук, профессор Токаев Э.С.

доктор биологических наук, профессор Синеокий С.П.

Ведущая организация:

ГНУ ВНИМИ (ГНУ ВНИИ молочной промышленности)

Защита состоится « 6 » . 2006 г. в /У. (7/Р. часов на заседании

Диссертационного совета Д 212.1/9.01 при ГОУ ВПО Московском государственном университете прикладной биотехнологии по адресу: 109316, г. Москва, ул. Талалихина, д.ЗЗ, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО МГУПБ.

Автореферат разослан 2006 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат технических наук, проф.

Забашта А. Г.

JUJ7

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Современные требования к пищевым продуктам, предъявляемые медиками-диетологами, обусловленные развитием общества, энергозатратами людей, состоянием здоровья населения, стимулируют производителей выпускать как традиционные, так и новые продукты с более длительным сроком хранения. Выработка качественных и безопасных молочных продуктов, стабильно сохраняющих показатели при хранении, одна из важнейших задач в производстве продуктов питания. Существуют и постоянно совершенствуются технологические приемы, направленные на получение кисломолочных продуктов с заданными характеристиками. Важнейшую роль в производстве ферментированных молочных продуктов играют стартовые культуры (закваски).

Научные основы биотехнологии молочных продуктов изложены в трудах: Банниковой JI.A., Гавриловой Н.Б., Ганиной В.И., Евдокимова И.А., Забодапо-вой Л.А., Королевой Н.С., Рогова И.А., Семенихиной В.Ф., Хорольского В.В., Храмдава А.Г., Daly С., Degeest В., Hassan А„ De Vuyst L. и др.

Интенсивное расширение ассортимента молочных продуктов, произошедшее в конце XX и в начале XXI века, привело к широкому использованию в технологии пищевых добавок. Для улучшения реологических характеристик и увеличения срока годности кисломолочных продуктов применяют полисахариды различного происхождения: натуральные полимеры, полученные из морских водорослей (агар, альгинаты и каррагинаны) и из растений (крахмал, га-лактоманнаны и пектины); модифицированные (кукурузный, картофельный крахмалы и др.). Однако, как показала практика, применение пищевых добавок для улучшения консистенции, имеет ряд недостатков Во-первых, каждый из полисахаридов обладает комплексом функциональных свойств, которые варьируют в зависимости от состава, pH используемой коллоидной системы и других параметров. Во-вторых, иногда только применение композиции полисахаридов позволяет получить требуемый результат. До последнего времени не решены все аспекты биобеэо-пасности, возникающие при использовании в продуктах питания пищевых добавок.

За рубежом в последние года акцентируется внимание на новые стартовые молочнокислые культуры, синтезирующие экзополисахариды (ЭПС), которые могут быть не только натуральным альтернативным источником пищевым добавкам, улучшающим реологические показатели кисломолочных продуктов, но также выступать в роли факторов, способствующих адгезии полезных микроорганизмов на стенках кишечника Особый интерес к ЭПС-сингезирующим культурам обусловлен тем, что на Международном уровне молочнокислым бактериям, которые используются in situ, присвоен статус безопасности - GRAS, что подтверждает возможности применения этих микроорганизмов в производстве безопасных продуктов питания. В этой связи, актуальным и целесообразным является получение стартовых культур на основе природных отечественных штаммов молочнокислых бактерий, синтезирующих ЭПС, внесение которых на соответствующей стадии технологического процесса будет способствовать наибольшему сохранению полезных природных свойств получаемой продукции, ее конкурентоспособности при заданных показателях качества и безопасности. | р НАЦИ1л1Л..чЬНЛ>. !

I БИБЛИОТЕКА . I

ijJza&f-i

Цель и задачи исследования

Целью диссертационной работы являлась разработка биотехнологии новых отечественных стартовых молочнокислых культур, обладающих свойством синтезировать экзополисахариды, путем селекции молочнокислых бактерий с дальнейшим скринингом культур по биотехнологическим параметрам и способности к максимальному синтезу экзополисахаридов.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

❖ Исследовать отечественные штаммы молочнокислых бактерий разных таксонов на способность к синтезу экзополисахаридов;

❖ Изучить влияние внешних факторов на способность штаммов бактерий к синтезу ЭПС (температура культивирования и состав питательных сред);

❖ Охарактеризовать плазмидный профиль и изучить стабильность сохранения свойства синтеза ЭПС у селекционированных культур;

❖ Определить количество, фракционный и мономерный состав, молекулярную массу, соотношение моносахаридных единиц синтезируемых штаммом молочнокислых бактерий;

❖ Научно обосновать параметры биотехнологии стартовой культуры, обладающей свойством синтезировать экзополисахариды; исследовать ее основные производственно-ценные свойства в процессе хранения в лиофили-зированной форме;

❖ Провести комплексную оценку показателей качества ЭПС-стартовой культуры, выработанной в производственных условиях, и проверить ее в производстве сметаны.

Научная новизна

Проведена диагностика и селекция отечественных штаммов молочнокислых бактерий, позволившая выявить среди них синтезирующие экзополисахариды. Получены новые данные о влиянии внешних условий на метаболистиче-скую активность ЭПС-культур в условиях стационарного и полунепрерывного глубинного культивирования.

Селекционирован природный импортозамещающий штамм-продуцент ЭПС - ЬасЮсосс^ 1ас^з яиЬяр. 1асШ 1ХМ-Е2 со стабильными свойствами, который принят на патентное депонирование за № ВКПМ В-8558 во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенети-ки и селекции промышленных микроорганизмов.

Определены фракционный и мономерный состав, молекулярная масса и соотношение моносахаридов в экзополисахариде, синтезируемом штаммом Ьааососсич 1асЦБ виЬяр. 1аспз 1ХМ-Е2.

Научно обоснованы параметры биотехнологии, обусловливающие получение биомассы ЭПС-стартовой культуры, характеризующейся высоким выходом экзополисахаридов, количеством клеток и технологичностью.

Практическая ценность

Освоены количественный и качественный методы по определению и выделению экзополисахаридов у культур молочнокислых бактерий Выявлены

штаммы молочнокислых бактерий, обладающие комплексом биотехнологических свойств, и синтезирующие экзополисахариды. Показано, что штаммы молочнокислых бактерий разных таксонов, способные к синтезу экзополисахари-дов, отличаются составом и размером обнаруженных плазмид.

Разработана и проверена в лабораторных и промышленных условиях биотехнология ЭПС-стартовой культуры.

Проведена выработка сметаны на ОАО «Волоколамском молочном заводе» с применением биомассы полученной ЭПС-культуры молочнокислых бактерий. Показано, что опытный готовый продукт обладал лучшими органолеп-тическими и реологическими показателями по сравнению с контрольным, полученным с традиционно используемыми заквасками.

Разработан проект технической документации на биомассу стартовой культуры молочнокислых бактерий, синтезирующих экзополисахариды.

На штамм бактерий Lactococcus lactis subspecies lactis ВКПМ B-8558, используемый в производстве молочных продуктов, и способ получения стартовой культуры штамма Lactococcus lactis subspecies lactis ВКПМ B-8558 подана заявка патент, зарегистрированная за № 2005125605.

Результаты работы внедрены в учебный процесс: используются при выполнении лабораторных, курсовых и дипломных работ на основе вновь разработанных методических указаний к выполнению лабораторных и научно-исследовательских работ для магистров техники и технологий направления 260100 - Технология продуктов питания и студентов по специальностям: 260303, 260301, 260302, 260505, 240902, 240901 по дисциплине «Стартовые культуры в технологии продуктов питания и кормов».

Работа выполнялась в рамках НИР №2-6-02 «Биотрансформация мясного сырья. Подбор и изучение штаммов бактерий. Технологии переработки био-трансформированного сырья».

По выполняемой теме в 2003 году выигран внутривузовский грант на конкурсе среди молодых ученых и получен диплом за разработку в области биологии «Биотехнология стартовой культуры с ЭПС-активностью для молочных продуктов» на Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи НТТМ-2005, Москва (29 июня - Зиюля, 2005г.).

Апробация работы

Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на 2-ой Международной научной конференции «Живые системы и биологическая безопасность населения» (21 октября, 2003г.); 3-ей Международной научной конференции «Живые системы и биологическая безопасность населения» (26 ноября, 2004г.); конференции, посвященной 60-ти летию кафедры «Технология молока и молочных продуктов» и 75-ти летию МГУПБ (31 января, 2005г); Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи НТТМ-2005, Москва (29 июня - Зиюля, 2005г.); 4-ой Международной научной конференции «Живые системы и биологическая безопасность населения» (30 ноября, 2005г.) и др.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 19 работ.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, аналитического обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, приложений. Основной текст работы изложен на 114 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 45 рисунков. Библиография представлена 200 источниками, в том числе 108 зарубежных авторов, количество приложений 13.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Аналитический обзор

В аналитическом обзоре представлены и обобщены данные по классификации, происхождению и свойствам полисахаридов. Проведен анализ имеющихся данных о потенциале молочнокислых бактерий в качестве продуцентов экзополисахаридов. Систематизирован материал по современным представлениям ученых зарубежных стран о роли ЭПС-штаммов в производстве безопасных кисломолочных продуктов.

На основании анализа и обобщения информации аналитического обзора литературы сформулированы цель и задачи диссертационной работы.

2. Экспериментальная масть Материалы и методы исследования

Объектами исследований служили: отечественные молочнокислые бактерии разных таксонов (26 штаммов Streptococcus thermophilus; 6 штаммов Lactobacillus acidophilus; 4 штамма Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus; 3 штамма Lactococcus lactis subsp. lactis; 1 штамм Lactococcus lactis subsp. cremo-ris: 1 штамм Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetilactis); ЭПС, продуцируемые штаммом Lactococcus lactis subsp. lactis LLN-E2; стартовая культура Lactococcus lactis subsp. lactis LLN-E2 (в сухом виде, свежеприготовленная и в процессе хранения); сметана с массовой долей жира 10% и 20% свежеприготовленная и в процессе хранения.

При проведении исследований использовали: микробиологические; биохимические; генетические; реологические; хроматографические методы; методы математической статистики. Эксперименты проводили в 3-7 кратной по-вторности.

Схема проведения исследований представлена на рис. 1.

Результаты исследований и их обсуждение Исследование способности к синтезу ЭПС у штаммов молочнокислых бактерий

У отечественных 41 штамма молочнокислых бактерий, находящихся в коллекционном хранении, после восстановления были изучены технологические свойства и способность к синтезу ЭПС.

Рис. 1. Схема проведения исследований

Аббревиатуры МКБ - молочнокислые бактерии, ЭПС - экзополисахариды, БГКГ1 - бактерии группы кишечных палочек,

Показатели I - Титруемая кислотность, 2 - Активная кислотность, 3 - Активность сквашивания; 4 - Органолегггические показатели, 5 - Энергия кислотообразования, 6 - Влагоудержи-ваюшая способность; 7 - ¡}-галактоэидазная активность, 8 - Количество клеток МКБ; 9 -Микроскопия; 10- Наличие способности к синтезу ЭПС; 11 - Количество ЭПС; 12 - Вязкость, 13 - Микроструктура, 14 - Фракционный состав ЭПС, 15 - Молекулярная масса; 16 -Мономерный состав, 17 - Соотношение Сахаров в ЭПС; 18 - Массовая доля жира, 19 - Массовая доля белка, 20 - Массовая доля влаги, 21 - Фосфата ¡а, 22 - БГКП, 23 - Патогенные микроорганизмы, в том числе сальмонеллы, 24 - Staphylococcus aureus, 25 - Дрожжи и плесени

В результате проведенных исследований было выявлено, что 7 штаммов ухудшили исходные технологические свойства и поэтому отнесены к нетехнологичным. Наилучшие показатели по органолепггическим и технологическим свойствам (образование плотных, вязких сгустков с чистым кисломолочным вкусом и запахом; количество клеток в 1см3 - КУ+109КОЕ; активные кислото-образователи; низкий показатель синерезиса) имели штаммы: Streptococcus thermophilus СТ 138; СТ 95; СТ ВГР; Lactobacillus acidophilus АКА-5; АБ-259; Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Б-ЛГ; Lactococcus lactis subsp. lactis L18-AK; L36c; LLN-E2; Lactococcus lactis subsp. cremoris cr 152.

Для выявления штаммов, способных к синтезу ЭПС, на начальном этапе исследований применяли качественный метод, в соответствии с которым красный цвет колоний, образованных на селективной питательной среде, свидетельствовал об отсутствии у штаммов способности к синтезу ЭПС, а белый и розовый - о наличии.

Способность к синтезу ЭПС была выявлена у 32% штаммов из 34 проверенных культур молочнокислых бактерий разных таксонов (рис. 2).

1 - штаммы, синтезирующие ЭПС; 2 - штаммы, несинтезирующие ЭПС Рис. 2. Характеристика штаммов по способности к синтезу экзополисахаридов

В результате исследований проведена селекция штаммов по способности к синтезу ЭПС и обладающих комплексом производственно-ценных свойств.

Известно, что условия культивирования могут влиять на синтез продуктов метаболизма микроорганизмов, поэтому в стационарных условиях культивирования исследовали влияние на синтез ЭПС штаммами молочнокислых бактерий двух параметров: температуры и состава питательной среды. Выявили, что количество штаммов термофильного стрептококка, синтезирующих экзопо-лисахариды, при их развитии в обезжиренном молоке увеличивалось как при снижении температуры культивирования с 37+1 до 32+1 °С (26%), так и при увеличении температуры до 42±1 °С (32%). Следовательно, вполне обоснованным является предположение, что наличие экзополисахаридной капсулы выполняет защитную функцию для термофильных культур. Выявлено, что молочнокислые палочки прекращали синтез ЭПС при отклонении температуры от оптимальной, вероятно, координируя промежуточные продукты метаболистиче-ского пути на синтез других сложных молекул при неблагоприятных факторах. Все изученные штаммы лактококков сохраняли способность к синтезу ЭПС при изменении температуры в равной степени, поэтому, установив увеличение ко-

личества синтезируемых ими ЭПС, можно говорить о проявлении протекторной характеристики ЭПС-капсулы у клетки бактерии.

Для подтверждения гипотезы о снижении защитных функций в более благоприятных условиях исследовали способность молочнокислых бактерий к синтезу ЭПС при их культивировании в гидролизованном молоке. Выявлена та же тенденция увеличения количества штаммов Streptococcus thermophilus -продуцентов ЭПС при уменьшении или увеличении температуры. По сравнению с культивированием в обезжиренном молоке при 32+1 °С количество штаммов, синтезирующих экзополисахариды, в гидролизованном молоке уменьшалось на 9%; 37±1 °С - на 15% и 42±1 °С - на 15%, что указывало на снижение количества ЭПС-продуктивных штаммов термофильного стрептококка при более благоприятных условиях их ферментации (рис. 3). При развитии молочнокислых палочек в гидролизованном молоке также наблюдали снижение количества штаммов-продуцентов ЭПС, по сравнению с культивированием в обезжиренном молоке. Лактококки утрачивали свойство синтезировать ЭПС в гидролизованном молоке при варьировании температуры, кроме штамма Lactococcus lactis subsp. lactis LLN-E2, который сохранял способность к синтезу экзополисахаридов в различных условиях.

37±1°С

42±1°С

Температура кулыивирования

Рис. 3. Влияние температуры культивирования на способность штаммов термофильного стрептококка к синтезу ЭПС

МО - молоко обезжиренное; ГМ- молоко гидролизованное

На следующем этапе изучали способность к синтезу ЭПС в жидкой сывороточной среде (СС) и на плотной питательной среде MRS у ранее изученных культур, обладающих комплексом технологических свойств: Streptococcus thermophilus СТ 138; СТ 95; СТ ВГР; Lactobacillus acidophilus АКА-5; АБ-259; Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus Б-ЛГ; Lactococcus lactis subsp. lactis L18-AK; L36c; LLN-E2; Lactococcus lactis subsp. cremoris cr 152.

Анализ полученных данных позволил сделать заключение о том, что в сывороточной среде штаммы молочнокислых бактерий синтезируют ЭПС, так же как и в обезжиренном молоке, за исключением штамма ацидофильной палочки АБ-259, который синтезировал ЭПС только в сывороточной среде при

температуре культивирования ниже рациональной. Было замечено, что при культивировании в жидких питательных средах (обезжиренное молоко, сывороточная среда) ЭПС-способность штаммов молочнокислых бактерий проявляется при снижении рациональной температуры развития, а при культивировании на плотной питательной среде (MRS) - при повышении.

Таким образом, изменение состава питательной среды и температур культивирования влияло на способность штаммов синтезировать ЭПС. В результате был селекционирован штамм Lactococcus lactis subsp. lactis LLN-E2, синтезирующий ЭПС при различных температурах и использовании питательных сред, отличающихся составом.

Важной характеристикой технологичности штаммов является их способность к стабильному сохранению плазмидного профиля и производственно-ценных свойств, включая синтез ЭПС, при искусственно создаваемых условиях шока.

Для изучения выбрали мезофильный штамм L. lactis LLN-E2 и термофильный штамм Streptococcus thermophiius CT 138, синтезирующие ЭПС. Плазмидные профили штаммов молочнокислых бактерий до шока (Streptococcus thermophiius CT 138 - СТк и L. lactis LLN-E2 -- Лк) сравнивали с плазмид-ными профилями после шока (СТ1 и Л1, Л2, ЛЗ, соответственно), что представлено на члектрофореграмме (рис. 4).

12 345 6 78 9 10 11 12

Рис. 4. Плазмидный профиль молочнокислых бактерий до и после шока 1 - Е.соИ Я.Д 2 - ЕсоИ Я-64, 3 - Е.соИ Яр-1, 4 - Е.соП Я-64, 5 - СТк, 6 - Лк, 7-СТ1, 8 -Л1, 9 - Л2, 10-ЛЗ, 11 - Лк, 12 - Е.соИ ИР4

Во внехромосомной ДНК штамма термофильного стрептококка, как контрольного до шока - СТк, так и после шока - СТ1 обнаружен плазмидный реп-ликон размером близким к 3 т.п.н На электрофореграмме видно, что у изученной мезофильной культуры - контрольной и после воздействия факторов шока

штазмидный профиль не изменился: визуализированы две плазмиды, идентичные по размеру.

У полученных после шока штаммов молочнокислых бактерий исследовали способность к синтезу ЭПС и производственно-ценные свойства. Все варианты синтезировали экзополисахариды и обладали производственно-ценными свойствами, как и исходные (контрольные) штаммы, то есть стабильно сохраняли свойства.

В настоящее время ДНК-фингерпринт позволяет получить достаточно точную генетическую характеристику культуры, а при промышленном ее использовании осуществлять мониторинг ее исходных свойств и защиту авторских прав. При проведении исследований использовали технологию ДНК-фингерпринта с проведением дальнейшего анализа наборов продуктов амплификации. Результаты ПЦР-фингерпринта технологичных штаммов молочнокислых бактерий с праймерами Крш1-Крш2 представлены на рисунке 5.

123456781 19 10 И 1

Рис. 5. ПЦР-фингерпринт исследуемых штаммов молочнокислых бактерий (TAP-PCR). I - lkb DNA Ladder (маркер); 2 - Str. thermophilus СТ95; 3 - Str. thermophilus СТВГР; 4-L. cremoris cr 152; 5-L lactis L18-AK; 6 - Str. thermophilus CT138; 7 - L lactis LLN-E2; 8 - L lactis L36c; 9-L acidophilus АБ-259; 10 - L acidophilus AKA-5; 11 ~L bulgaricus Б-ЛГ

Полученные результаты ПЦР-фингерпринта могут быть использованы как молекулярно-биологическая характеристика изученных штаммов молочнокислых бактерий при их мониторинге в биотехнологическом цикле промышленного получения биомассы и при производстве молочных продуктов.

Научное обоснование параметров биотехнологии биомассы ЭПС-культур молочнокислых бактерий

В зарубежной литературе имеются сведения о том, что штаммы молочнокислых бактерий могут синтезировать разное количество экзополисахаридов. В этой связи важно установить количество, синтезируемых ЭПС, и определить

условия максимальной биоконверсии Сахаров питательной среды для получения большего количества ЭПС конкретными штаммами.

В исследованиях использовали выбранные ЭПС-штаммы молочнокислых бактерий стабильно проявляющие комплекс свойств при различных условиях: Str. thermophilus СТ138, Lactobacillus acidophilus АБ-259 и L. lactis LLN-E2.

Установлено, что при температуре культивирования 24±1°С в сывороточной среде (СС) и обезжиренном молоке (МО) штамм L. lactis LLN-E2 синтезировал наибольшее количество ЭПС, в сравнении с другими изучаемыми штаммами, синтезирующими ЭПС (рис. 6).

Интересным представлялось охарактеризовать состав ЭПС, синтезированного штаммом Lactococcus lactis subspecies lactis LLN-E2. Известно, что количество фракций, их молекулярная масса, состав ЭПС и соотношение моносахаридов, синтезируемых одним и тем же штаммом, зависят от условий культивирования. Поэтому с целью дальнейшего использования изучаемого штамма в производстве кисломолочных продуктов было целесообразным определить фракции, молекулярную массу этих фракций, полисахаридный состав и соотношение Сахаров у выделенных ЭПС при культивировании штамма Lactococcus lactis subspecies lactis LLN-E2.

Sir thermophilus L acidophilus АБ- L lactis LLN-E2 L lactis LI.N E2 CTI38 (32°0 259 (ЗГС) (24°C1 (30°C)

Штамм

Рис. 6. Количество ЭПС, синтезируемых изученными штаммами молочнокислых бактерий

В результате проведенной гель-фильтрации образцов ЭПС происходило разделение на два пика F1 и F2 (рис. 7), которые показали, что по фракционному составу изученный ЭПС гетерогенен и имеет две фракции. Установлено, что, молекулярная масса первой фракции ЭПС составляла 1,7х105, второй фракции - 2,9x104. Выявлено, что ЭПС состоит из глюкозы и галактозы в соотношении 1:1.

В результате проведенных исследований путем скрининга из коллекции микроорганизмов МГУПБ селекционирован для дальнейшей работы высокоак-

тивный природный штамм-продуцент ЭПС - Lactococcus lactis subspecies lactis LLN-E2, с которым проводили постоянную поддерживающую работу с целью контроля его функциональных характеристик. Данная культура принята на патентное депонирование во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов и зарегистрирована за номером В-8558 в ФГУП ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Элоируемый объем, мл

Рис. 7. Гелъ-хроматограмма ЭПС, синтезируемых штаммом Lactococcus lactis subspecies lactis LLN-E2

Для использования в производстве кисломолочных продуктов необходимо было обосновать параметры биотехнологии биомассы ЭПС-штамма.

При разработке биотехнологии стартовой ЭПС-культуры важным представлялось определить, при каких условиях и, в какой период роста наиболее активно происходит образование экзополисахаридов и одновременно накопление живых клеток, необходимое для создания стартовой культуры.

В этой связи изучали динамику развития ЭПС-штамма Lactococcus lactis subsp. lactis LLN-E2 при различных условиях культивирования, которую контролировали по изменению титруемой и активной кислотности, количеству клеток (в обезжиренном молоке - МО - контрольная среда; сывороточной среде -СС) (рис. 8).

По полученным экспериментальным данным проведен регрессионный анализ. Выявлено, что полиномиальная модель третьего и четвертого порядка наиболее адекватно описывает результаты проведенных экспериментов. Проанализировав полученные данные, можно сказать, что сывороточную среду можно рекомендовать для накопления биомассы изучаемого штамма.

С научной и практической точки зрения представляло интерес провести управляемое культивирование ЭПС-синтезирующего штамма, которое осуществляли в сывороточной среде в условиях полунепрерывного глубинного культивирования на аппарате АК-203.

Рис. 8. Динамит развития штамма Ь. 1асШ ШЯ-Е2 в стационарных условиях при температуре культивирования 24±1 °С

В аппарате культивирования АК-203 поддерживали постоянный уровень активной кислотности (6,210,2) единиц рН. В условиях полунепрерывного глубинного культивирования наблюдали большее количество клеток, по сравнению со стационарными условиями в одинаковые моменты времени (рис. 9.).

Анализ полученных данных показал, что штамм ЬаЛососсив Ьсйб зиЬвр. 1асйя лучше развивается в условиях полунепрерывного глубинного

культивирования.

О 3 5 7 9 10 11 12 13 14 Время культивирования, ч

"•-Стационарное культивирование _-»-Полунепрерывное культивирование _

Рис. 9. Динамит развития штамма ЬасШсоссш 1асШ хиЬяр. 1асИх ШЫ-Е2 в условиях полунепрерывного и стационарного культивирования

Для установления момента наибольшего количества ЭПС в среде была проведена серия экспериментов. Полученные результаты позволили выявить, что в условиях полунепрерывного глубинного культивирования при температу-

ре ферментации 24±1°С в сывороточной среде в момент окончания лог фазы (через (12±0,5)ч) определяли наибольшее количество ЭПС и живых клеток. Зависимость количества клеток и ЭПС от времени и температуры культивирования представлены в виде поверхностных диаграмм (рис. 10 и И).

На диаграмме (рис. 11) виден максимум количества ЭПС, синтезируемых штаммом Ьас1ососсия кс^ БиЬвр. 1асП5 ЬЬЫ-Е2, который отмечали при его развитии в сывороточной среде и температуре ниже рациональной.

Время культивирования, ч

Рис. 10. Динамика количества клеток в условиях полунепрерывного культивирования в зависимости от температуры

Г-------' Г~ --"тО.12

Рис. II. Изменение количества ЭПС в условиях полунепрерывного культивирования в зависимости от температуры

В результате проведения экспериментов были установлены рациональные параметры биотехнологии стартовой ЭПС-культуры, характеризующейся высоким выходом экзополисахаридов и количеством клеток: необходимо проводить полунепрерывное глубинное культивирование в сывороточной среде при температуре ферментации 24+1 °С в течение (12±0,5)ч при постоянном значении рН равном (6,2±0,2).

На следующем этапе проводили ферментацию при установленных параметрах биотехнологии с целью получения данной стартовой культуры в лиофи-лизированном виде. Полученную и затем восстановленную из сухого состояния ЭПС-культуру исследовали по органолегтгическим, технологическим, физико-химическим, микробиологическим показателям и ЭПС-активности.

Результаты исследований свидетельствовали о том, что стартовая культура содержала 8,46±0,12 \% количества клеток в 1 см3 молока, количество ЭПС -0,0897±0,0078 г/100 г, тогда как количество ЭПС, синтезируемых импортной ЭПС-стартовой культурой (термофильная йогуртаая культура ГО ОУБ УР-Ь8П - Уо-Пех), поставляемой на российский рынок составляло 0,028610,0037 г/100 г образца. Полученная отечественная стартовая ЭПС-культура обладала требуемыми для заквасок показателями качества и безопасности, поэтому она может применяться как импортозамещающая, и является перспективной для использования в производстве кисломолочных продуктов.

В производственных условиях на предприятии ГНУ ВНИМИ проведены выработки стартовой культуры, синтезирующей экзополисахариды, по разработанной биотехнологии. Результаты производственной проверки биотехнологии стартовой культуры, синтезирующей экзополисахариды, подтвердили установленные ранее параметры при ее получении в жидкой и сухой формах с заданными показателями качества и безопасности, что отражено в акте производственной проверки.

Важным для стартовых культур является установление их способности к сохранению показателей качества в течение длительного времени хранения. Для этого исследовали показатели полученной ЭПС-культуры в течение 6 месяцев хранения при температуре минус 20±1°С. Сравнение полученных результатов со свойствами свежеполученной стартовой культуры показало, что количество клеток, активность свертывания молока, способность к синтезу ЭПС, ор-ганолептические показатели образуемых сгустков в молоке после хранения в течение 6 месяцев практически не изменялись. Показано, что выработанная по разработанной биотехнологии стартовая культура соответствовала требованиям, предъявляемым к стартовым культурам, применяемым в производстве молочных продуктов в течение всего срока хранения.

На основании результатов проведенных исследований научно обоснованы рациональные параметры биотехнологии, разработана схема биотехнологического процесса (рис. 12) и проект технической документации на биомассу стартовых культур молочнокислых бактерий, синтезирующих ЭПС.

Рис. 12. Биотехнология ЭПС-стартовой культуры

Изучение показателей качества продуктов, полученных с использованием разработанной ЭПС-стартовой культуры Один из самых востребованных на российском рынке национальный кисломолочный продукт - сметана. В последние годы на отечественном рынке появилось широкое разнообразие видов сметаны, некоторые из них значительно отличаются по качеству от традиционной сметаны. Такие обстоятельства обусловили введение нового ГОСТа Р 52092-2003 «Сметана. Технические условия», в котором предусмотрено, что термином «сметана» может называться кисломолочный продукт, выработанный только из натуральных сливок и сквашенный чистыми молочнокислыми культурами Независимо от введения нового ГОСТа остаются постоянными требования потребителей к консистенции сметаны: это должна быть густая однородная масса без отделения сыворотки. Таким образом, для производителя важным является решение проблемы получения сметаны с требуемыми реологическими показателями по ГОСТ Р 520922003 без использования стабилизаторов консистенции. Поэтому представлялось интересным проверить, как будет протекать технологический процесс и каковы будут показатели качества и безопасности сметаны, выработанной с применением новой ЭПС-стартовой культурой.

Для исследования выбрали классическую сметану с массовой долей жира 20%. Учитывая тенденцию выработки продуктов с пониженной массовой долей жира, вырабатывали сметану с массовой долей жира 10%.

Сметану вырабатывали резервуарным способом, как в лабораторных, так и производственных условиях на ОАО «Волоколамский молочный завод» Московской области. При проверке для получения контрольных образцов использовали серийно выпускаемые и применяемые на предприятиях закваски для сметаны КД (образец 1) и МТс (образец 4), а опытных образцов - новую ЭПС-культуру и КД (образец 2); новую ЭПС-культуру и МТс (образец 5); новую ЭПС-культуру (образец 3).

У опытных образцов, по сравнению с контрольными, наблюдалось более высокое количество клеток молочнокислых бактерий. Органолепггическая оценка продукта после созревания оценивалась дегустационной комиссией, что подтверждено протоколами дегустации. Наиболее четко разница была отмечена между образцами нежирной сметаны. Наилучшими органолептическими показателями обладал 3 образец, получаемый с использованием новой ЭПС-стартовой культуры на основе штамма ЬасЮсоссив 1асП$ яиЬхр 1ас11я Ш^-Е2. Опытный образец №3 характеризовался более выраженным аромаггообразова-нием и густой консистенцией по сравнению с другими образцами. Образцы № 2 и №5 также отличались от контрольных (образцы №1 и №4) более густой консистенцией Конечные значения титруемой и активной кислотности для образцов сметаны с массовой долей жира 10% и 20% соответствовали требованиям ГОСТ Р 52092-2003.

Наилучшим значением активности сквашивания обладали 2, 3 и 5 образцы сметаны, что позволяло сократить сроки выработки сметаны и являлось позитивным фактором для производства. Синерезис для всех образцов свежеприготовленной сметаны и в процессе хранения имел очень малые значения - отделения сыворотки практически не наблюдалось.Полученные образцы сметаны оценивали по вязкости с помощью ротационного вискозиметра «Реотест-2». Снимали показания и пересчитывали на эффективную вязкость, которую оценивали при единичном градиенте скорости сдвига.

Реологические показатели у опытных образцов (2, 3 и 5) сметаны намного выше, чем у контрольных (1 и 4), как в начале, так и в конце периода хранения. Оценка консистенции продукта как одного из основных показателей его качества показала, что включение ЭПС-стартовой культуры в производство сметаны, обеспечивает получение вязкого сгустка, вязкость которого в процессе хранения продукта при температуре (4±2)°С увеличивается.

В проведенных исследованиях наблюдали практически идентичный характер консистенции двух контрольных образцов по отношению к опытным, при выработке сметаны с массовой долей жира 10% и 20%. В сметане с массовой долей жира 20% показатели вязкости опытных образцов были выше, чем в сметане с массовой долей жира 10%.

Для уточнения полученных данных провели изучение микроструктуры выработанной сметаны. На рис. 13 (а, б и в) в качестве примера приведены микроструктуры нежирной сметаны (образец №1,2 и 3).

Микроструктурное исследование нежирной сметаны на гистологических препаратах показало формирование молочными белками агрегационных комплексов, наиболее крупных в контрольном образце Xsl. При использовании разработанной ЭПС-культуры (образец №3) наблюдали более мелкие агрегаци-онные комплексы при одновременном более равномерном их распределении в

массе продукта. Микрофлора контрольной стартовой культуры в большей степени была ассоциирована с поверхностью белковых агрегатов, в то время как микрофлора ЭПС-культуры характеризовалась преимущественно диффузным распространением бактерий в массе молочного белка.

Таким образом, в опытных образцах наблюдали большую симбиотиче-скую взаимосвязь белковых комплексов, клеток бактерий и жировых частиц, что обусловливало образование более равномерной системы и предотвращение расслоения. Вследствие этого ЭПС-стартовые культуры могут улучшать структурные показатели сметаны и других кисломолочных продуктов. В этой связи при осуществлении технологического процесса в целях получения продукта с заданными реологическими показателями можно рекомендовать использовать природное свойство штаммов молочнокислых бактерий - синтезировать экзо-полисахариды.

В процессе хранения опытных партий сметаны при температуре (4±2)°С исследовали- количество жизнеспособных клеток молочнокислых бактерий, титруемую кислотность, активную кислотность, органолептические показатели и структурно-механические свойства.

Количество молочнокислых микроорганизмов в процессе хранения составляло не менее 107 КОЕ/г, что соответствует требованиям ГОСТ Р 520922003. Значения титруемой и активной кислотности на конец срока хранения составляли 71-74Т и 4,21-4,37, соответственно, что допускается ГОСТом.

Результаты комплексных микробиологических, физико-химических, реологических и органолептических исследований свидетельствовали о том, что показатели качества и безопасности исследуемых партий сметаны, оставались на уровне ре!ламентируемых ГОСТом на сметану и позволяют увеличить срок годности традиционно полученной сметаны до 21 суток. Обобщая результаты исследований можно констатировать, что сметана, полученная с применением разработанной ЭПС-стартовой культуры обладала высокими микробиологическими, органолептическими и структурно-механическими свойствами, что подтверждается актами. Следовательно, разработанная биотехнология ЭПС-стартовой культуры, позволит обеспечить предприятия молочной промышленности отечественной закваской, способствующей выпуску высококачественной, безопасной продукции. Результаты проведенных проверок новой ЭПС-стартовой культуры свидетельствуют о целесообразности и перспективности ее широкого использования в производстве молочных продуктов.

Выводы

1 Научно обоснованы параметры и разработана биотехнология биомассы ЭПС-стартовой культуры Lactococcus lactis subspecies lactis LLN-E2, включающая проведение полунепрерывного глубинного культивирования в сывороточной среде определенного состава при температуре ферментации 24±1 °С в течение 12±0,5ч при поддержании значения рН на уровне (6,2±0,2).

2. Селекционировано 11 отечественных штаммов молочнокислых культур, обладающих технологическими свойствами и способностью к синтезу

ЭПС. Выявлен высокопродуктивный природный ЭПС-штамм Lactococcus lactis subspecies lactis LLN-E2, который принят на патентное депонирование за № ВКГТМ В-8558 во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенетики и селекции промышленных микроорганизмов.

3 Установлено, что снижение температуры оптимального развития на 5 "С и использование питательных сред, менее богатых питательными веществами, приводило к увеличению ЭПС-активности изученных штаммов молочнокислых бактерий.

4 Получены с помощью технологии ДНК-фингерпринта индивидуальные генетические характеристики селекционированных ЭПС-штаммов молочнокислых бактерий разных таксонов, позволяющие осуществить мониторинг за культурами в биотехнологических циклах.

5. Охарактеризован фракционный состав экзополисахарида, синтезируемого селекционированным штаммом Lactococcus lactis subspecies lactis LLN-E2 и показано, что ЭПС гетерогенен и имеет две фракции с молекулярной массой 1,7х105 и 2,9x1с)4. Экзополисахариды, выделяемые штаммом Lactococcus lactis subspecies lactis LLN-E2 состояли из глюкозы и галактозы в соотношении 1:1.

6. Определены показатели лиофилизированной ЭПС-сгартовой культуры, полученной по разработанной биотехнологии, проверка которой свидетельствовала о ее возможной реализации в промышленных условиях.

7. Выявлено, что консистенция сметаны, выработанной с применением ЭПС-стартовой культуры, обладала большей стабильностью за счет образования микроструктуры, в которой экзополисахариды симбиотически и равномерно связывают свободную воду с белковыми и жировыми комплексами в продукте.

8. Показано, что применение новой ЭПС-стартовой культуры в производстве позволяет увеличить срок годности сметаны до 21 суток при температуре хранения (4+2) °С при сохранении комплекса нормируемых показателей.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Панина, В.И. Изучение свойств культур молочнокислых бактерий после хранения при низких температурах на различных питательных средах / В.И. Танина, Е.В. Иванова, Т.В. Рожкова, И.В. Борина, Ю.А. Рыбаков, С.Г. Ботина// Низкотемпературные и пищевые технологии в XXI веке: материалы II Международной научно-технической конференции. - Санкт-Петербург. - ноябрь. - 2003. -С. 329-331

2. Панина, В.И. Влияние внешнего фактора на продуцирование экзополисаха-ридов культурами термофильного стрептококка / В.И. Ганина, Т.В. Рожкова // Наукоемкие и конкурентоспособные технологии продуктов питания со специальными свойствами: материалы научно-практической конференции. - Углич. -11-12 сентября. - 2003. - С. 76-78

3. Рожкова, Т.В. Изучение способности молочнокислых бактерий к продуцированию экзополисахаридов / Т.В. Рожкова, В.И. Ганина И Живые системы и

биологическая безопасность населения: материалы 2-ой Международной научной конференции. -М. -21 октября. -2003. -С. 186-188

4. Ганина, В.И. Участие молочнокислых бактерий с экзополисахаридной способностью в механизме формирования показателей качества и безопасности молочных продуктов / В.И. Ганина, Т.В. Рожкова, М.А. Гобузова // Пища. Экология. Человек: материалы 5-ой Международной научно-технической конференции. - М. - 22-23 октября. - 2003. - С. 62-63

5. Ганина, В.И. Перспективы использования пробиотических культур Lactobacillus acidophilus, образующих экзополисахаридную капсулу / В.И. Ганина, Т.В. Рожкова Н Пробиотики, Пребиотики, Синбиотики и Функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы: материалы Международной конференции. - М. - 2-4 июня. - 2004. - С. 43-44

6. Рожкова, Т.В. Совершенствование условий культивирования молочнокислых бактерий с целью получения продуктов микробного синтеза - экзополиса-харидов / Т.В. Рожкова // Повышение энергоэффективности техники и технологий в перерабатывающих отраслях АПК: материалы конференции, посвященной Липилкину А.Н. - М. - 2004. - С. 230-233

7. Ганина, В.И. Использование потенциала молочнокислых бактерий для улучшения качества кисломолочных продуктов / В.И. Ганина, Т.В. Рожкова // Качество и безопасность сельскохозяйственного сырья и пищевых продуктов: материалы научно-практической конференции. - Углич. - 8-9сентября. - 2004. -С. 78-81

8. Рожкова Т В. Включение ЭПС-капсулы молочнокислых бактерий в процесс борьбы с бактериафагами / Т.В. Рожкова, В.И. Ганина, Ю.С. Быстрова // Живые системы и биологическая безопасность населения- 3-я Международная научная конференция. - М. - 25-26 ноября. - 2004. - С. 217-219

9. Ганина, В.И. Новые функциональные характеристики молочнокислых бактерий / В.И. Ганина, Т.В. Рожкова, Л.А. Борисова, Ю.А. Рыбаков // Чтения, посвященные 60-ти летию кафедры «Технология молока и молочных продуктов» и 75-ти летию МГУПБ. - М. - 31 января. - 2005. - С. 81 - 83

10. Рожкова, Т.В. Биотехнологические аспекты получения фагорезистентных штаммов / ТВ. Рожкова, И.Р. Волкова, В.И. Ганина, Л.А. Борисова// Биотехнология-состояние и перспективы развития: материалы 3-го Международного конгресса . - М. - 14-18 марта. - 2005. - С. 146-147

11. Ганина, В.И. Биотехнология стартовой культуры с ЭПС-активностью для молочных продуктов / В.И. Ганина, Т.В. Рожкова, Н.Н. Свистун // Сборник материалов Всероссийской выставки научно-технического творчества молодежи НТТМ-2005. - М. - 2005. - С. 110-112

12. Ганина, В.И. Аналитический обзор зарубежных исследований в области молочнокислых бактерий, синтезирующих экзополисахариды / В.И. Ганина, Т.В. Рожкова // Известия Вузов. Пищевая технология. - 2005. - №5-6. - С. 65-66

13. Ганина, В.И. Сравнительное изучение плазмидного профиля у штаммов молочнокислых бактерий с различной способностью к продуцированию экзопо-лисахаридов / В.И. Ганина, Т.В Рожкова, М.А. Тренина, Ю.А Рыбаков // Известия Вузов. Пищевая технология. - 2005. - №4. - С. 37-39

14. Ганина, В.И. Микроструктура сметаны выработанной на основе ЭПС-стартерной культуры / В.И. Ганина, С.И. Хвыля, Т.В. Рожкова // Молочная промышленность. - 2005. - № 7. - С. 36-37

15. Ганина, В.И. Перспективы применения ЭПС-стартерных культур молочнокислых бактерий / В.И. Ганина, Т.В. Рожкова, С.И. Хвыля // Молочная река. -2005.- №3.- С. 19

16. Ганина, В.И. Интегрированный подход к созданию отечественных стартовых культур прямого внесения / В.И. Ганина, Н.В. Ананьева, Т.В. Рожкова // Молочная промышленность. - 2005. - № 11. - С. 23-24

17. Рожкова, Т.В. Пути улучшения качества сметаны / Т.В. Рожкова, В.И. Ганина, Н.Н. Свистун // Живые системы и биологическая безопасность населения: материалы 4-ой международной научной конференции. - 30 ноября. - 2005. -С. 152-154

18. Заявка 028765 Российская Федерация. Штамм бактерий Lactococcus lactis subspecies lactis ВКПМ B-8558, используемый в производстве молочных продуктов, и способ получения стартерной культуры штамма Lactococcus lactis subspecies lactis ВКПМ B-8558 / Ганина В.И., Рожкова Т.В. - № 2005125605; заявл. 12.08.2005.-20 с.

19. Ганина, В.И. Стартовые культуры в технологии продуктов питания и кормов / В.И. Ганина, Т.В. Рожкова // Методические указания к выполнению лабораторных и научно-исследовательских работ для магистров техники и технологий направления 260100 - Технология продуктов питания и студентов по специальностям: 260303, 260301, 260302, 260505, 240902, 240901. - М: МГУПБ. -2005.-31с.

Подписано в печать 17.01.2006.Формат 60x84 1/16. Печать лазерная

Тираж 100 экз. Заказ 1/18

ООО «Полисувенир»

109316, Москва, ул. Талалихина, 33.

Тел. 677-03-86

»#

ВВЕДЕНИЕ.

1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР.

1.1. Общая характеристика полисахаридов.

1.2. Свойства полисахаридов.

1.3. Новые возможные аспекты применения молочнокислых бактерий.

1.3.1. Молочнокислые бактерии - продуценты биологически активных веществ.

1.3.2. Экзополисахариды молочнокислых бактерий и факторы, влияющие на их синтез.

1.4. Современные представления о роли ЭПС-штаммов в кисломолочных продуктах.

1.5. Обоснование перспективности выбранного направления, формулирование цели и задач работы.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Объекты исследований.

2.2. Методы исследований.

2.2.1. Микробиологические методы.

2.2.2. Биохимические методы.

2.2.3. Генетические методы.

2.2.4. Методы определения структурно-механических свойств.

2.2.5. Хроматографические методы.

2.2.6. Математические методы.

3. ИССЛЕДОВАНИЕ СПОСОБНОСТИ ШТАММОВ

МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ СИНТЕЗИРОВАТЬ ЭПС.

3.1. Активизация коллекционных штаммов молочнокислых бактерий и изучение технологических свойств восстановленных штаммов.

3.2. Исследование способности отечественных культур молочнокислых бактерий к синтезу ЭПС.

3.3. Изучение влияния внешних факторов на способность бактерий синтезировать ЭПС.

3.4. Определение плазмидного профиля и изучение стабильности сохранения синтеза ЭПС у подобранных культур.

3.5. Получение индивидуальной генетической характеристики отобранных штаммов.

4. НАУЧНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПАРАМЕТРОВ БИОТЕХНОЛОГИИ БИОМАССЫ ЭПС-КУЛЬТУР МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ.

4.1. Определение количества ЭПС, синтезируемых молочнокислыми бактериями, при разных условиях культивирования.

4.2. Характеристика ЭПС, синтезируемых штаммом Ь. Ысйб ЬЫМ-Е2.

4.3. Изучение влияния температуры культивирования и состава питательных сред на показатели качества стартовой культуры в условиях стационарного культивирования.

4.4. Изучение влияния температуры культивирования на показатели качества стартовой культуры в условиях полунепрерывного культивирования.

4.5. Получение сухой биомассы ЭПС-штамма.

4.6. Исследование производственно-ценных свойств полученной в условиях полунепрерывного культивирования лиофилизированной ЭПС-стартовой культуры.

4.7. Исследование свойств разработанной стартовой культуры в процессе хранения.

5. ИЗУЧЕНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ КАЧЕСТВА ПРОДУКТОВ, ПОЛУЧЕННЫХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАЗРАБОТАННОЙ

ЭПС-СТАРТОВОЙ КУЛЬТУРЫ.

5.1. Применение ЭПС-стартовой культуры в технологии сметаны.

5.2. Изучение микробиологических показателей сметаны, выработанной с ЭПС-стартовой культурой.

5.3. Изучение органолептических и физико-химических показателей сметаны.

5.4. Изучение структурно-механических свойств сметаны.

5.5. Исследование показателей сметаны в процессе хранения.

ВЫВОДЫ.

Современные требования к пищевым продуктам, предъявляемые медиками-диетологами, обусловленные развитием общества, энергозатратами людей, состоянием здоровья населения, стимулируют производителей выпускать как традиционные, так и новые продукты с более длительным сроком хранения. Выработка качественных и безопасных молочных продуктов, стабильно сохраняющих показатели при хранении, одна из важнейших задач в производстве продуктов питания. Существуют и постоянно совершенствуются технологические приемы, направленные на получение кисломолочных продуктов с заданными характеристиками. Важнейшую роль в производстве ферментированных молочных продуктов играют стартовые культуры (закваски).

Научные основы биотехнологии молочных продуктов изложены в трудах: Банниковой Л.А., Гавриловой Н.Б., Ганиной В.И., Евдокимова И.А., Забодаловой JI.A., Королевой Н.С., Рогова И.А., Семенихиной В.Ф., Хорольского В.В., Храмцова А.Г., Degeest В., Hassan А., De Vuyst L. и др.

Интенсивное расширение ассортимента молочных продуктов, произошедшее в конце XX и в начале XXI века, привело к широкому использованию в технологии пищевых добавок. Для улучшения реологических характеристик и увеличения срока годности кисломолочных продуктов применяют полисахариды различного происхождения: натуральные полимеры, полученные из морских водорослей (агар, альгинаты и каррагинаны) и из растений (крахмал, галактоманнаны и пектины); модифицированные (кукурузный, картофельный крахмалы и др.) [90, 178]. Однако, как показала практика, применение пищевых добавок для улучшения консистенции, имеет ряд недостатков. Во-первых, каждый из полисахаридов обладает комплексом функциональных свойств, которые варьируют в зависимости от состава, pH используемой коллоидной системы и других параметров [14, 21, 41]. Во-вторых, иногда только применение композиции полисахаридов позволяет получить требуемый результат. До последнего времени не решены все аспекты биобезопасности, возникающие при использовании в продуктах питания пищевых добавок.

За рубежом в последние годы акцентируется внимание на новые стартовые молочнокислые культуры, синтезирующие экзополисахариды (ЭПС), которые могут быть не только натуральным альтернативным источником пищевым добавкам, улучшающим реологические показатели кисломолочных продуктов, но также выступать в роли факторов, способствующих адгезии полезных микроорганизмов на стенках кишечника. Особый интерес к ЭПС-синтезирующим культурам обусловлен тем, что на Международном уровне молочнокислым бактериям, которые используются in situ, присвоен статус безопасности - GRAS, что подтверждает возможности применения этих микроорганизмов в производстве безопасных продуктов питания [54, 105, 118, 151, 183]. В этой связи, актуальным и целесообразным является получение стартовых культур на основе природных отечественных штаммов молочнокислых бактерий, синтезирующих ЭПС, внесение которых на соответствующей стадии технологического процесса будет способствовать наибольшему сохранению полезных природных свойств получаемой продукции, ее конкурентоспособности при заданных показателях качества и безопасности.

Целью диссертационной работы являлась разработка биотехнологии новых отечественных стартовых молочнокислых культур, обладающих свойством синтезировать экзополисахариды, путем селекции молочнокислых бактерий с дальнейшим скринингом культур по биотехнологическим параметрам и способности к максимальному синтезу экзополисахаридов.

Научная новизна работы заключается в том, что проведена диагностика и селекция отечественных штаммов молочнокислых бактерий, позволившая выявить среди них синтезирующие экзополисахариды; получены новые данные о влиянии внешних условий на метаболистическую активность ЭПС-культур в условиях стационарного и полунепрерывного глубинного культивирования; селекционирован природный импортозамещающий штамм-продуцент ЭПС - Lactococcus lactis subsp. lactis LLN-E2 со стабильными свойствами, который принят на патентное депонирование за № ВКПМ В-8558 во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенетики и селекции промышленных микроорганизмов; определены фракционный и мономерный состав, молекулярная масса и соотношение моносахаридов в экзополисахариде, синтезируемом штаммом Lactococcus lactis subsp. lactis LLN-E2; научно обоснованы параметры биотехнологии, обусловливающие получение биомассы ЭПС-стартовой культуры, характеризующейся высоким выходом экзополисахаридов, количеством клеток и технологичностью.

Практическая ценность результатов состоит в том, что освоены количественный и качественный методы по определению и выделению ЭПС у культур молочнокислых бактерий. Выявлены штаммы молочнокислых бактерий, обладающие комплексом биотехнологических свойств, и способные синтезировать экзополисахариды. Показано, что штаммы молочнокислых бактерий разных таксонов, способные к синтезу ЭПС, отличаются составом и размером обнаруженных плазмид. Разработана и проверена в лабораторных и промышленных условиях биотехнология ЭПС-стартовой культуры. Проведена выработка сметаны на ОАО «Волоколамском молочном заводе» с применением биомассы полученной ЭПС-культуры молочнокислых бактерий. Показано, что опытный готовый продукт обладал лучшими органолептическими и реологическими показателями по сравнению с контрольным продуктом, полученным с традиционно используемыми заквасками. Разработан проект технической документации на биомассу стартовой культуры молочнокислых бактерий, синтезирующих ЭПС.

На штамм бактерий Lactococcus lactis subspecies lactis ВКПМ В-8558, используемый в производстве молочных продуктов, и способ получения стартовой культуры штамма Lactococcus lactis subspecies lactis ВКПМ В-8558 подана заявка на патент, зарегистрированная за № 2005125605.

Результаты работы внедрены в учебный процесс: используются при выполнении лабораторных, курсовых и дипломных работ на основе вновь разработанных методических указаний к выполнению лабораторных и научно-исследовательских работ для магистров техники и технологий направления 260100 - Технология продуктов питания и студентов по специальностям: 260303, 260301, 260302, 260505, 240902, 240901 по дисциплине «Стартовые культуры в технологии продуктов питания и кормов». Работа выполнялась в рамках НИР №2-6-02 «Биотрансформация мясного сырья. Подбор и изучение штаммов бактерий. Технологии переработки биотрансформированного сырья».

По выполняемой теме в 2003 году выигран внутривузовский грант на конкурсе среди молодых ученых и получен диплом за разработку в области биологии «Биотехнология стартовой культуры с ЭПС-активностью для молочных продуктов» на Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи НТТМ-2005, Москва.

Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на 2-ой Международной научной конференции «Живые системы и биологическая безопасность населения» (21 октября, 2003г.); 3-ей Международной научной конференции «Живые системы и биологическая безопасность населения» (26 ноября, 2004г.); конференции, посвященной 60-ти летию кафедры «Технология молока и молочных продуктов» и 75-ти летию МГУПБ (31 января, 2005г); Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи НТТМ-2005, Москва (29 июня - 3 июля, 2005г.); 4-ой Международной научной конференции «Живые системы и биологическая безопасность населения» (30 ноября, 2005г.) и др.

По материалам диссертации опубликовано 19 работ.

Диссертационная работа состоит из введения, аналитического обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, приложений. Основной текст работы изложен на 114 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 45 рисунков. Библиография представлена 200 источниками, в том числе 108 зарубежных авторов, количество приложений 13.

выводы

Научно обоснованы параметры и разработана биотехнология биомассы ЭПС-стартовой культуры Lactococcus lactis subspecies lactis LLN-E2, включающая проведение полунепрерывного глубинного культивирования в сывороточной среде определенного состава при температуре ферментации 24±1°С в течение 12±0,5ч при поддержании значения рН на уровне (6,2±0,2).

Селекционировано 11 отечественных штаммов молочнокислых культур, обладающих технологическими свойствами и способностью к синтезу ЭПС. Выявлен высокопродуктивный природный ЭПС-штамм Lactococcus lactis subspecies lactis LLN-E2, который принят на патентное депонирование за № ВКПМ В-8558 во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Установлено, что снижение температуры оптимального развития на 5°С и использование питательных сред, менее богатых питательными веществами, приводило к увеличению ЭПС-активности изученных штаммов молочнокислых бактерий.

Получены с помощью технологии ДНК-фингерпринта индивидуальные генетические характеристики селекционированных ЭПС-штаммов молочнокислых бактерий разных таксонов, позволяющие осуществить мониторинг за культурами в биотехнологических циклах. Охарактеризован фракционный состав экзополисахарида, синтезируемого селекционированным штаммом Lactococcus lactis subspecies lactis LLN-E2 и показано, что ЭПС гетерогенен и имеет две фракции с молекулярной массой 1,7x105 и 2,9x104. Экзополисахариды, выделяемые штаммом Lactococcus lactis subspecies lactis LLN-E2 состояли из глюкозы и галактозы в соотношении 1:1.

Определены показатели лиофилизированной ЭПС-стартовой культуры, полученной по разработанной биотехнологии, проверка которой свидетельствовала о ее возможной реализации в промышленных условиях.

Выявлено, что консистенция сметаны, выработанной с применением ЭПС-стартовой культуры, обладала большей стабильностью за счет образования микроструктуры, в которой экзо полисахариды симбиотически и равномерно связывают свободную воду с белковыми и жировыми комплексами в продукте.

Показано, что применение новой ЭПС-стартовой культуры в производстве позволяет увеличить срок годности сметаны до 21 суток при температуре хранения (4±2)°С при сохранении комплекса нормируемых показателей.

1. Бакунина, О. Загустители и структурообразователи / О. Бакунина, Д. Марташов // Пищевая промышленность. 1999. - № 11. - С. 30-32

2. Бармичев, Д.В. Стабилизация консистенции сметанных продуктов / Д.В. Бармичев // Переработка молока 2005. - № 1 (63). - С. 32

3. Баснакьян, Л.А. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами / Л.А. Баснакьян // М. 1992. - 150 с.

4. Бетева, Е.А. Пектин, его модификации и применение в пищевой промышленности / Е.А. Бетева, A.A. Кочеткова, М.В. Гернет // 1992 выпуск 4-1.-32 с.

5. Валовая, М.А. Микротехника. Правила, приемы, искусство, эксперимент / М.А. Валовая, Д.Н. Кавтарадзе // М. Изд-во МГУ. - 1993

6. Ван-Дейк, К. Крахмало-паточная промышленность Европы / К. Ван-Дейк // Пищевые ингредиенты. Сырье и добавки. 1999. - №2. - С. 18-20

7. Волкова, О.В., Елецкий Ю.К. Основы гистологии с гистологической техникой / О.В. Волкова, Ю.К. Елецкий // М. Медицина. - 1982

8. Волкова, О.В. Гистология, цитология и эмбриология: Атлас / О.В. Волкова, Ю.К. Елецкий, Т.К. Дубовая // М. Медицина. - 1996

9. Гаврилов, В.В. Разделение системы обезжиренное молоко полисахарид центробежным способом / В.В.Гаврилов, С.И. Батин // Энергосберегающие технологии переработки сельскохозяйственного сырья: межд. научн. - практ. конференция. — Минск. - 1996

10. Галстян, А.Г. Активность воды в молочных продуктах / А.Г. Галстян,

11. A.Н. Петров, В.В. Павлов // Переработка молока. 2002. - июль. - № 7(33)

12. Ганина, В.И. Явление бактериофагии в молочной промышленности /

13. B.И. Ганина, В.Ф. Семенихина // М. МГУПБ. - 1999. - 16 с.

14. Гвоздяк, Р.И. Микробный полисахарид ксантан / Р.И. Гвоздяк, М.С. Матышевская // Киев: Наукова думка. - 1989. - 212 с.

15. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак // Пер. с англ. М.: Мир. - 2002. - 589 с.

16. Голубев, В.Н. Функциональные свойства пектинов и крахмала / В.Н. Голубев, С.Ю. Беглов // Пищевые ингредиенты. Сырье и добавки. 2000. -№1.- С. 14-18

17. Горбатов, А.В. Реология мясных и молочных продуктов / А.В. Горбатов // М.: Пищевая промышленность. 1979. - 384 с.

18. Горбатова, К.К. Биохимия молока и молочных продуктов / К.К. Горбатова // СПб.: ГИОРД. 2001. - 320 с.

19. ГОСТ Р 52092-2003 «Сметана. Технические условия».

20. Грешнов, А.Г. Пищевые добавки фирмы The Nutra Sweet Kelco Company (Великобритания) / А.Г. Грешнов, A.Jl. Взоров, В.А. Никитков // Пищевая промышленность. 1997. -№11.- С. 68-71

21. Дацева, Т.А. Экзополисахариды молочнокислых бактерий / Т.А. Дацева, Н.А. Коваленко // СГУ.: Ставрополь. Internet. - 3 с.

22. Danisco Cultor. Применение функциональных систем в йогуртах и других кисломолочных продуктах Рекламный материал. 8 с.

23. Донченко, JI.B. Безопасность пищевой продукции / JI.B. Донченко, В.Д. Надыкта // М.: Пищепромиздат. 2001. - 528 с.

24. Европейский рынок гидроколлоидов / По материалам журнала «International Food Ingredients» // Пищевые ингредиенты. Сырье и добавки. -2000.-№1.-С. 12-13

25. Ежов, В.Н. Использование грибной пектин эстеразы для получения яблочного пектина / В.Н. Ежов, Е.Г. Сонина // Виноград и вино России. -2000. №3. - С.46-48

26. Блинов, Н.П. Химия микробных полисахаридов / Н.П. Блинов // М.: Высшая школа. 1984. - 286 с.

27. Жданов, Ю.А. Практикум по химии углеводов / Ю.А. Жданов, Г.Н. Дорофеенко, Г.А. Корольченко, Г.В. Богданова // Изд. 2-е, переработ, и допол. Под редак. Ю.А.Жданова. М.: «Высшая школа» . — 1973. — 204 с.

28. Жушман, А.И. Новое в производстве модифицированных крахмалов для пищевой промышленности / А.И. Жушман // Пищевая промышленность. -1990.- №1. 41 с.

29. Жушман, А.И. Фосфатный эфир крахмала эффективный стабилизатор пищевых продуктов / А.И. Жушман, Е.К. Коптелова // Продуктовая индустрия Юга России: матер, конф. - 2000. - С. 43-45.

30. Иванова, Е.А. Заменители жира для низкокалорийных продуктов питания (зарубежный опыт) / Е.А. Иванова // Сборник научных материалов. -М.: АгроНИИТЭИПП. 1999. - 92 с.

31. Ивашев-Мусатов, О.С. Теория вероятностей и математическая статистика / О.С. Ивашев-Мусатов // Наука. Главная редакция физико-математической литературы. М. - 1979. - 256 с.

32. Ивченко, Г.И. Математическая статистика / Г.И. Ивченко, Ю.И. Медведев // Учеб. пособие для студентов высш. техн. учеб. заведений. 2 изд., доп. М.: Высш. Школа. - 1992. - 304 с.

33. Иерусалимский, Н.Д. Теория и практика непрерывного культивирования микроорганизмов / Н.Д. Иерусалимский // Микробиология. 1961 - Т.30, вып. 5. - С. 818-824

34. Инструкция по микробиологическому контролю производства на предприятиях молочной промышленности / Москва. 1988. - 122 с.

35. Кислов, И.М. Крахмалы «Эмсланд-Штерке» ГмбХ гарантия отличного качества вашего продукта / И.М. Кислов // Пищевая промышленность. - 2001. - № 4 - С.32

36. Колесников, А.Ю. Пектины и их применение в молочной промышленности / А.Ю. Колесников // Пищевая и перерабатывающая промышленность. 1996. - №4. - С.13-23

37. Колесников, А.Ю. Пектины и их применение в молочной промышленности / А.Ю. Колесников // Пищевая и перерабатывающая промышленность. 1996. - №4. - 37 с.

38. Кочетков, Химия углеводов / Кочетков, Бочков, Дмитриев // Издательство «Химия». Москва. - 1967. - 672 с.

39. Кочеткова, A.A. Пищевые гидроколлоиды: теоретические заметки / A.A. Кочеткова // Пищевые ингредиенты. Сырье и добавки. 2000. - №1. -С.10-11

40. Красникова, JI.B. Непрерывное культивирование молочнокислых бактерий с целью накопления биомассы и продуктов метаболизма / JI.B. Красникова, Е.И. Кострова // Обзорная информация ЦНИИТЭИ мясомолпром. М. - 1979. - 14 с.

41. Краснова, Н.С. Продукты с пектином для детей / Н.С. Краснова // Пищевая промышленность. 1997. - №6. - С. 11

42. Крусь, Г.Н. Методы исследования молока и молочных продуктов / Г.Н. Крусь, A.M. Шалыгина, З.В. Волокитина // М.: Колос. 2000. - 368 с.

43. Макарова, Л.Б. Поверхностные явления и дисперсные системы / Л.Б. Макарова // Учебное пособие. М.: МГУПБ. - 2001. - 140 с.

44. Маниатис, Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук // М.:Мир. 1984. - 479 с.

45. Меркулов, Г.А. Курс патолого-гистологической техники / Г.А. Меркулов // Л.: Медицина. 1969

46. Михалкина, Г.С. Пектиновые вещества амаранта высокоэффективные коагулянты сывороточных белков/ Г.С. Михалкина, H.A. Соснина // Хранение и переработка сельскохозяйственного сырья. - 1999. - №5. - С.32-34

47. National Starch ведущий мировой поставщик специальных крахмалов // Пищевая промышленность. - 1998. - № 9 - С. 34-35

48. Нейланд, О.Я. Органическая химия / О.Я. Нейланд // Учеб. для хим. вузов. М: Высш. шк. - 1990. - 751 с.

49. Нетрусов, А.И. Практикум по микробиологии / А.И. Нетрусов, М.А. Егорова, Л.М. Захарчук // Учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений. Под ред. Нетрусова А.И. М.: Издательский центр «Академия» . - 2005. - 608 с.

50. Нечаев,А.П. Пищевая химия/А.П. Нечаев // С-Пб., Гиорд. 2001.-592 с.

51. Новик, Г.И. Характеристика полисахаридов, секретируемых Bifidobacterium adolescentis 94 БИМ / Г.И. Новик, Н.И. Астапович, Й. Кюблер, А. Гамьян // Микробиология. 2002. - Том 71. - № 2. - С. 205-210

52. Олехнович, A.A. Изучение формирования гелевой структуры в системах вода-полисахарид / A.A. Олехнович, А.П. Ощенко, И.М. Лоскутова // Вестник РАСХН. №3. - 2000. - С. 76-80

53. Пат. СА2388203, Канада, Микроб, микробиальный ЭПС и использование / Bulla Lee, Candas Mehmet // Опубл. 03.05.2001.

54. Пат. US 2004197877, Синтез экзополисахаридов / Lubitz, Werner // Опубл. 07.10.2004.

55. Пат. US2004077056, США, Синтез ЭПС неприсоединенных к поверхности бактериальной клетки / Y. Motohide, R.W. Armentrout, M. Mikolajczak and T.J. Pollock // Опубл. 22.04.2004.

56. Пат. 6743607, Синтез сложных полисахаридов / Apicella // Опубл.0106.2004.

57. Пат. 6183802, Молочные продукты и методы их приготовления / Silva // Опубл. 06.02.2001.

58. Пат. 6855324, Метод для выделения экзополисахаридов / Nore // Опубл.1502.2005.

59. Пат. AU5639601, Австралия, Опероны Streptococcus thermophilus участвующие в синтезе ЭПС. / J. Mengaud, F. Rallu, R. Pierre, I. Besancon-Yoshpe and C. Fremaux // Опубл. 30.10.2001.

60. Пат. W09962316, Всемирная организация по охране интеллектуальной собственности (ВОИС), Молочнокислые бактерии, продуцирующие ЭПС / Е. Germond Jacques, G. Lamothe and F. Stingele // Опубл. 09.12.1999.

61. Пат. US5834043, США, Штаммы подобные Lactobacillus sake, синтез и использование их ЭПС / A.M. Ledeboer, R. Vreeker, G.W. Robijn and Van den Berg D.J.C.//Опубл. 10.11.1998.

62. Пат. NZ280974, Новая Зеландия, ДНК молочнокислых бактерий кодирующая ферменты, включенные в синтез ЭПС и их использование / В. Mollet and F. Stingele // Опубл. 26.08.1998.

63. Пат. FR2632968, Франция, Процесс отбора ЭПС продуцирующих бактериальных клонов и производство полученных клонов / F. Gancel, G. Novel, D. Carcano, A. Loones and P. Ramos // Опубл. 22.12.1989.

64. Пат. EP0750043, Европейская патентная организация, ЭПС-продуцирующие молочнокислые бактерии / В. Mollet, F. Stingele // Опубл. 27.12.1996.

65. Пат. 5700787, США, Капсулярный полисахарид иммуномодулятор / Tzianabos // Опубл. 23.12.1997.

66. Позняковский, В.М. Гигиенические основы питания, безопасность и экспертиза продовольственных товаров / В.М. Позняковский // Учебник. 2-ое изд., испр. и доп. Новосибирск: Изд-во Новосиб ун-та. - 1999. - 448 с.

67. Рогов, М.С. Сахар и крахмалопродукты 2000 / М.С. Рогов, К.В. Васильев // Пищевая промышленность. - 2001. - № 2. - С. 36 -37

68. Рогов, И.А. Современные технологии пищевых продуктов с полисахаридами: Обзорная информация / И.А. Рогов, Н.В. Нефедова // М.: АгроНИИТЭИПП. 1996. - 32 с.

69. Рогов, И.А. Пищевая биотехнология / И.А. Рогов, JI.B. Антипова, Г.П. Шуваева // В 4 кн. Кн. 1. Основы пищевой биотехнологии. М.: Колос. -2004. - 440 с.

70. Ромейс, Б. Микроскопическая техника / Б. Ромейс // М. — И.-JI. 1953

71. Рыбальский, Биотехнология полисахаридов / Рыбальский, Комарова // М. 1990. - ВНИИПИ. - 86 с.

72. СанПиН 2.3.2.1078 2001 Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов.

73. Сарафонова, JI.A. Руководство по применению пищевых добавок / JI.A. Сарафонова // 2000. 142 с.

74. Сборник инструкций по селекции молочнокислых бактерий и бифидобактерий и подбору заквасок для кисломолочных продуктов/М. 1986

75. Семенова, М.Г. Роль взаимодействий между биополимерами в образовании и стабилизации пищевых коллоидов / М.Г. Семенова, A.C. Антипова, JI.E. Белякова // Хранение и переработка сельхозсырья. №6. -2000.- С. 55-56

76. Скрипицын, В.Г. Российские модифицированные крахмалы от ЗАО «Рада М»/В.Г. Скрипицын //Пищевая промышленность. - 2001. -№ 1.-С. 55

77. Скурихин, И.М. Все о пище с точки зрения химика / И.М. Скурихин // Справ, издание. С. 46 М.: Высш. шк. - 1991. - 288 с.

78. Степаненко, П.П. Микробиология молока и молочных продуктов / П.П. Степаненко // Учебник для ВУЗов. Сергиев Посад: ООО «Все для Вас -Подмосковье» . — 1999.-415 с.

79. Тамим, А.Й. Йогурт и другие кисломолочные продукты: научные основы и технологии. / А.Й. Тамим, Р.К. Робинсон. // Пер. с англ. под науч. ред. JI.A. Забодаловой. СПб: Профессия. - 2003. - 664 с.

80. Хвыля, С.И. Научно-методические рекомендации по микроструктурному анализу мяса и мясных продуктов / С.И. Хвыля // М.: РАСХН. 2002. - 40 с.

81. Хем, А. Гистология / А. Хем, Д. Кормак // М. Изд. «Наука» . - 1983

82. Хэндрикс, П. Размышления на тему соусов применение специальных крахмалов с целью улучшения качества / П. Хэндрикс // Масложировая промышленность. - 2000. - № 4. - С.26-27

83. Шевченко, А.Г. Влияние стабилизирующих систем на структурообразование молочных десертов / А.Г. Шевченко, Н.И. Дунченко, Е.Н. Леонова, Э.С. Токаев // Молочная промышленность. 1997. - №8. -С.20-21

84. Шендеров, Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание / Б.А. Шендеров // Том 3: Пробиотики и функциональное питание. -М.: Издательство «ГРАНТЪ» . 2001. - 288 с.

85. Шлегель, Г. Общая микробиология / Г. Шлегель // Пер. с нем. М.: Мир.- 1987.-567 с.

86. Abraham, A.G. Polysaccharides production by kefir grains during whey fermentation / A.G. Abraham and P.S. Rimada // Journal of Dairy Research. 68. -2001.-P. 653-661

87. Adapa, S. Physical properties of low-fat sour cream containing exopolysaccharide producing lactic acid / S. Adapa. A. Schmidt // Journal of Food Science. - 1998. - Vol.63. - № 5. - P. 901-903

88. Akalin, A.S. Viability and activity of bifidibacteria in yoghurt containing fructooligosaccharide during refrigerated storage / A.S. Akalin, S. Fenderya // International Journal of Food Science and Technology. 2004 - №39. - P. 613-621

89. Andaloussi, A.S. Isolation and characterization of exocellular polysaccharides produced by Bifidobacterium longum / A.S. Andaloussi, T.R. Marczak, R. Bonaly // Appl. Microbiol. Biotechnol. 43. - 1995. - P. 995-1000

90. Anderson, A.D. Rheological characterization of skim milk stabilized with carrageenan at high temperatures / A.D. Anderson, C.R. Daubert and B.E. Farkas // Journal of Food Science. Vol.67. - No.2.- 2002.- P. 649-652

91. Beal, C. Combined effects of culture conditions and storage time on acidification and viscosity of stirred yogurt / C. Beal, E. Skokanova // Journal of Dairy Science. 1999. - Vol.82. - №4. - p. 673-681

92. Bourriot, S. Phase separation, rheology and structure of micellar casein-galactomannan mixtures / S. Bourriot, C. Carnier, J.L. Doublier // International Dairy Journal. No.9. - 1999.- P. 353-357

93. Briczinski, E.P. Production of an exopolysaccharide-containing whey protein concentrate by fermentation of whey / E.P. Briczinski, R.F. Roberts // Journal of Dairy Sci.- 2002.- Dec; 85(12).- P. 3189-3197

94. Broadbent, J.R. Use of exopolysaccharide-producing cultures to improve the functionality of low fat cheese / J.R. Broadbent, D.J. McMahon, C.J. Oberg, D.L. Welker // International Dairy Journal. 11. - 2001. - P. 433-439

95. Bury, D. Whey protein concentrate as a nutrient supplement for lactic acid bacteria / D. Bury, P. Jelen and K. Kimure // International Dairy Journal. Vol. 8. - No.2. - 1998.- P. 149-151

96. Cruz, I.B. Dynamic mechanical thermal analysis of aqueous sugar solutions containing fructose, glucose, sucrose, maltose and lactose / I.B. Cruz // International Journal of Food Science and Technology. 36. - 2001. - P. 539-550

97. Cusick, S.M. Use of a single, triplicate arbitrary primed-PCR procedure for molecular fingerprinting of lactic acid bacteria / S.M. Cusick, D.J. O'Sullivan // Applied and Environmental Microbiology. 2000.- V.66(5).- P. 2227-2231

98. Daly, C. The biotechnology of lactic acid bacteria with emphasis on applications in food safety and human health / C. Daly, R. Davis // Agricultural and Food Science in Finland. Vol 7. - №2. - 1998. - P. 251-265

99. Daly, C. Technological and health benefits of dairy starter cultures / C. Daly, G.F. Fitzgerald, // International Dairy Journal. 1998. - № 8. - P. 195-205

100. Deborah, J. Walter. An experimental design to study colonic fibre fermentation in the rat: the duration of feeding / J. Walter Deborah // British journal of nutrition.- 1986.- 55.- P. 465-479

101. Deborah, J. Walter. Fermentation of wheat bran and gum Arabic in rats fed on an elemental diet / J. Walter Deborah // British journal of nutrition. 1988. -60. - P. 225-232

102. Degeest, B. Exopolysaccharide (EPS) biosynthesis by Lactobacillus sakei 0-1: production kinetics, enzyme activities and EPS yields / B. Degeest, B. Janssens and L.DeVuyst//Journal of Applied Microbiology. 91.- 2001.- P. 470-477

103. Degeest, Microbial physiology, fermentation kinetics, and process engineering of heteropolysaccharide production by lactic acid bacteria / Degeest, В., Vaningelgem F., L. De Vuyst // International Dairy Journal. 11 - 2001. - P. 747-757

104. Dellmann, H.-D. Textbook of veterinary histology. Philadelphia / Dellmann H.-D. Lea & Fabiger. 1993

105. L. De Vuyst Exopolysaccharide-producing Streptococcus thermophilus strains as functional starter cultures in the production of fermented milks / L. De Vuyst, etc // International Dairy Journal. No. 13. - 2003. - P. 707-717

106. Dols, M. Kinetic modeling of oligosaccharide synthesis catalyzed by Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299 dextransucrase / M. Dols, etc // Biotechnology and bioengineering. Vol. 63.-No.3 - May 5 - 1999 - P. 309-314

107. Duboc, P. Applications of exopolysaccharides in the dairy industry / P. Duboc and B. Mollet // International Dairy Journal. 11. - 2001. - P. 759-768

108. Dubois, M. Colorimetric method for determination of sugars and related substances / M. Dubois // Anal. Chem. 28. - 1956. - P. 350-356

109. Duenas-Chasco, T. Structural analysis of the exopolysaccharides produced by Lactobacillus ssp. G-77 / T. Dueñas-Chasco, M.A. Rodriguez -Carvajal // Carbohydrate Research. 307.- 1998.- P. 125-133

110. Entrez PubMed Электронная версия.

111. Euston, S.R. Kinetics of droplet aggregation in heated whey protein-stabilized emulsions: effect of polysaccharides / S.R. Euston, S.R. Finnigan, R.L. Hirst//Food Hydrocolloids. 16.- 2002.- P. 499-505

112. Fiszman, S.M. Effect of addition of gelatin on micro structure of acidic milk gels and yoghurt and on their rheological properties / S.M. Fiszman, M.A. Lluch and A. Salvador // International Dairy Journal. No.9. - 1999. - P. 895-901

113. Garcia-Garibay, M. Polymer production by Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus / M. Garcia-Garibay and V.M.E. Marshall // Journal of Applied Bacteriology. 70.- 1991.- P. 325-328

114. Garrote, G.L. Chemical and microbiological characterization of kefir grains / G.L. Garrote, A.G. Abraham and G.L. De Antoni // Journal of Dairy Research. -68.- 2001.- P. 639-652

115. Gancel, F. Exopolysaccharide production by Streptococcus salivarius ssp. thermophilus cultures. 1. Conditions of production / F. Ganceland, G. Novel // Vol.77. No.3. - 1994.- P. 685-688

116. Gancel, F. Exopolysaccharide production by Streptococcus salivarius ssp. thermophilus cultures. 2. Distinct modes of polymer production and degradation among clonal variants / F. Gancel, G. Novel // Vol.77. No.3. - 1994.- P. 689-695

117. Germond, Jacques-Edouard Heterologous expression and characterization of the exopolysaccharide from Streptococcus thermophilus Sfi39 / Jacques-Edouard

118. Germond, Michele Delley, Nicola D'Amico and Sebastien J.F.Vincent // Eur. J. Biochem.- 268.- 2001.- P. 5149-5156

119. Hartley, D.L. The role of lactic acid bacteria in yogurt fermentation / D.L. Hartley, G. Denariaz // Int. J. Immunotherapy. 1993. - 9(1). - P. 3-17

120. Hassan, A.N. Capsule formation by nonropy starter cultures affects the viscoelastic properties of yogurt during structure formation / A.N. Hassan, M. Corredig, J.F. Frank // J. Dairy Sci. Vol 85. - No 4. - 2002. - P. 716-720

121. Hassan, A.N. Modification of microstructure and texture of rennet curd by using a capsule-forming non-ropy lactic culture / A.N. Hassan, J.F. Frank // Journal of Dairy Research. 64.- 1997.- P. 115-121

122. Islam, A.M. Areview of recent developments on the regulatory, structural and functional aspects of gum arabic / A.M. Islam, G.O. Phillips, M.J. Snowden, P.A. Williams // Food Hydrocolloids. Vol. 11. - No. 4. - 1997. - P. 493-505

123. Jolly, L. Lactobacillus helveticus glycosyltransferases: from genes to carbohydrate synthesis / L. Jolly, J. Newell, I. Porcelli, S.J. Vicent and F. Stingele // Glycobiology.- May. No.l2(5).- 2002.- P. 319-327

124. Karen, P. Expression of ropy and mucoid phenotypes in Lactococcus lactis. // P. Dierksen Karen, E. Sandine William and E. Trempy Janine // Journal of Dairy Science. 80.- 1997.- P. 1528-1536

125. Kim, Y.R. Cryoprotection of protein by highly concentrated branched oligosaccharides/Y.R. Kim, J.H. Auh, P. Cornillon, J.Yoon, S.H.Yoo and K.H. Park //International Journal of Food Science and Technology 38 - 2003.-P. 553-563

126. Kitazawa, H. Augmentation of macrophage functions by an extracellular phosphopolysaccharide from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus / H. Kitazawa, etc//Food Microbiology.-2000.- 17.-№ 1.-P. 109-118

127. Knoshaug, E.P. Growth associated exopolysaccharide expression in Lactococcus lactis subspecies cremoris ropy 352 / E.P. Knoshaug, J.A. Ahlgrent and J.E. Trempy // Journal of Dairy Science. Vol.83.- No.4 - 2000. - P. 633-640

128. Ko, E.J. Bifidobacterium bifidum exhibits a lipopolysaccharide-like mitogenic activity for murine B lymphocytes /E.J. Ko, J.S.Gon, B.J. Lee, S.H. Choi and P.H. Kim//Journal of Dairy Science.-Vol.82.-No.9- 1999.-P. 1869-1876

129. Lamoureux, L. Production of oligosaccharides in yogurt containing bifidobacteria and yogurt cultures / L. Lamoureux, D. Roy and S.F. Gauthier // Journal of Dairy Science.- Vol.85. No.5.- 2002.- P. 1058-1069

130. Laure, J. Exploiting exopolysaccharides from lactic acid bacteria / J. Laure, etc // Antonie van Leeuwenhoek. 82. - 2002. - P. 367-374

131. Laws, A.P. The relevance of exopolysaccharides to the rheological properties in milk fermented with ropy strains of lactic acid bacteria / A.P. Laws, V.M. Marshall // International Dairy Journal. 11. - 2001. - P. 709-721

132. Levander, F. Enhanced exopolysaccharide production by metabolic engineering of Streptococcus thermophilus / F. Levander, etc // Applied and Environmental Microbiology. 2002. - Vol. 68. - № 2. - P. 784-790

133. Liu, J.R. Characterization of polysaccharide and volatile compounds produced by kefir grains grown in soymilk / J.R. Liu, M.J. Chen and C.W. Lin // Journal of Food Science.- Vol.67. No.l.- 2002.- P. 104-108

134. Marshall, V.M. Analysis and production of two exopolysaccharides from Lactococcus lactis subsp. cremoris / V.M Marshall, E.N. Cowie, R.S. Moreton // Journal of Dairy Research.- 1995.- 62.-P. 621-628

135. Marshall, V.M. Starter cultures employed in the manufacture of biofermented milks / V.M. Marshall, A.Y. Tamime // International Journal of Dairy Technology.- Vol 50. -№1. 1997. - P. 35-41

136. McLean Ross, A.H. A study of the effects of dietary gum arabic in the rat / A.H. McLean Ross//British journal of nutrition.- 1984.- 51.-P. 47-56

137. McLean Ross, A.H. A study of the effects of dietary gum arabic in humans / A.H. McLean Ross // The American journal of clinical nutrition. 1983. -March. - P. 368 - 375

138. Monsan, P. Homopolysaccharides from lactic acid bacteria / P. Monsan, S. Bozonnet, C. Albenne, G. Joucla, R.M. Willemot, M. Remaud-Simeon // International Dairy Journal. 11. - 2001. - P. 675-685

139. Moreira, M. Technological properties of milks fermented with thermophilic lactic acid bacteria at suboptimal temperature / M. Moreira, A. Abraham and G. De Antoni // Journal of Dairy Science. Vol.83. - No.3. - 2000. - P. 395-400

140. Nordic Industrial Fund. Safe use of lactic acid bacteria in food / Center for innovation and commercial development. March. - 2001. - 6 p.

141. Overdahl, B.J. Relationship between bile tolerance and the presence of a ruthenium red staining layer on strains of Lactobacillus acidophilus / B.J. Overdahl,

142. E.A.Zottola//Vol.74. No.4.- 1991.- P. 1196-1200

143. Ozer, B.H. Rheology and microstructure of Labneh (concentrated yogurt) / B.H. Ozer, R.A. Stenning, A.S. Grandison and R.K. Robinson // Journal of Dairy Science.- Vol.82. No.4.- 1999.- P. 682-689

144. Perry, D.B. Effect of exopolysaccharide-producing cultures on moisture retention in low fat mozzarella cheese / D.B. Perry, D.J. Mcmahon and C.J. Oberg // Journal of Dairy Science. Vol.80. - No.5. - 1997. - P. 799-805

145. Perry, D.B. Manufacture of low fat mozzarella cheese using exopolysaccharide-producing starter cultures / D.B. Perry, D.J. Mcmahon and C.J. Oberg//Journal of Dairy Science. Vol.81. - No.2.- 1998.- P. 563-566

146. Petersen, B.L. Influence of capsular and ropy exopolysaccharide-producing Streptococcus thermophilus on Mozzarella cheese and cheese whey / B.L.

147. Petersen, R.I. Dave, D.J. Mcmahon, C.J. Oberg and J.R. Broadbent // Journal of

148. Dairy Science. Vol.83. - No.9.- 2000.- P. 1952-1956

149. Pham, P.L. Production of exopolysaccharide by Lactobacillus rhamnosus R and analysis of its enzymatic degradation during prolonged fermentation / P.L.

150. Pham, I. Dupont // Journal of Applied and Environmental Microbiology. June. -2000.- P. 2302-2310

151. Puvanenthiran, A. Structure and visco-elastic properties of set yoghurt with altered casein to whey protein rations / A. Puvanenthiran, R.P.W. Williams and M.A. Augustin // International Dairy Journal. 12. - 2002. - P. 383-391

152. Ramos, A. Relationship between glycolysis and exopolysaccharides biosynthesis in Lactococcus lactis / A. Ramos, I.G. Boels, M. de Vos Willem, H. Santos // Applied and Environmental Microbiology-2001.-Vol.67 №1- P. 33-41

153. Rasic, J.L. Assimilation of cholesterol by some cultures of lactic acid bacteria and bifidobacteria / J.L. Rasic, I.F. Vujicic, M. Skrinjar, M. Vulic // Biotechnology Letters. Vol 14. -№1. - 1992. - P. 39-44

154. Ricciardi, A. Exopolysaccharides from lactic acid bacteria: structure, production and technological applications / A. Ricciardi, F. Clementi // Ital. Journal Food Sci. 2000. - Vol. 12. - № 1. - P. 23-45

155. Ruas-Modiedo, P. Role of exopolysaccharides produced by Lactococcus lactis subsp. cremoris on the viscosity of fermented milks / P. Ruas-Modiedo, etc// International Dairy Journal 12.-2002.-P. 689-695

156. Sherine, A.I. Abou Dawood Survival of nonencapsulated and encapsulated Bifidobacterium bifidum in probiotic Kareish cheese / Abou Dawood Sherine A.I. // Egyptian Journal of Dairy Science. 30. - 2002. - P. 43-52

157. Shin, H.S. Growth and viability of commercial Bifidobacterium spp. in skim milk containing oligosaccharides and inulin / H.S. Shin, J.H. Lee, J.J. Pestka and Z. Ustunol // Journal of Food Science. Vol.65. - No.5. - 2000. - P. 884-887

158. Stinsele, F. Identification and characterization of the eps (exopolysaccharide) gene cluster from Streptococcus thermophilus Sfi6 / F. Stinsele, etc//Journal of Bacteriology -Mar.-Vol.l78.-No.6.-1996 P. 1680-1690

159. Sutherland, I.W. Biofilm exopolysaccharides: a strong and sticky framework / I.W. Sutherland//Microbiology. 147.- 2001.- P. 3-9

160. Sutherland, I.W. Microbial polysaccharides from Gram-negative bacteria / I.W. Sutherland // International Dairy Journal. No. 11. - 2001. - P. 663-674

161. Tavan, E. Antimutagenic activities of various lactic acid bacteria against food mutagens: heterocyclic amins / E. Tavan, C. Cayuela, J.M. Antoine and P. Cassand // Journal of Dairy Research. 69. - 2002. - P. 335-341

162. Temmerman, R. Identification of lactic acid bacteria: culture-dependent and culture-independent methods / R. Temmerman, G. Huys and J. Swings // Trends in Food Science & Technology. No.15. - 2004. - P 348-359

163. Torino, M.I. Heterofermentative pattern and exopolysaccharide production by Lactobacillus helveticus ATCC 15807 in response to environmental pH / M.I. Torino, etc//Journal of Applied Microbiology. 91.- 2001.- P. 846-852

164. Torriani, S. Use of PCR-based methods for rapid differentiation of L. bulgaricus and L. delb. subspecies lactis / S. Torriani, G. Zapparoli, F. Dellaglio // Appl. Environ. Microbiol.-1999.-Oct. -65(10) .- P. 4351-4356.-№ 9.-P. 631-638

165. Trowell, H. Physiological role of dietary fiber: a ten-year review / H. Trowell, D. Burkitt // Medical aspects of nutrition

166. Tsangalis, D. Metabolism of oligosaccharides and aldehydes and production of organic acids in soymilk by probiotic bifidobacteria/D. Tsangalis etc//Int. Journal of Food Science and Technology .-2004 №39- P. 541-554

167. Welman, A.D. Exopolysaccharides from lactic acid bacteria: perspectives and challenges / A.D. Welman and L.S. Maddox // TRENDS in Biotechnology. -Vol.21. No. 6,- June 2003

168. Welman, A.D. Screening and selection of exopolysaccharide-producing strains of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus / A.D. Welman, I.S. Maddox and R.H. Archer // Journal of Applied Microbiology .-Vol.95.-2003.- P. 1200-1206

169. Willem, M. de Vos. Making more of milk sugar by engineering lactic acid bacteria / M.de Vos Willem, Hols Pascal, Richard van Kranenburg, Evert Luesink // Int. Dairy Journal. No.8. - 1998. - P.227-233198.www.starko.com. Электронная версия.

170. Wyatt, G.M. A change in human faecal flora in response to inclusion of gum arabic in the diet / G.M. Wyatt // British journal of nutrition. 1986. - 55. -P. 261-266