автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.10, диссертация на тему:Технология получения авермектинового комплекса, продуцируемого культурой Streptomyces avermitilis

Министерство Образования Российской Федерации

Московский Государственный Университет пищевых производств

На правах рукописи УДК: 663.182.62 (043.3)

Давыдова Елена Михайловна

Технология получения авермектинового комплекса, продуцируемого культурой 81гер1отусе8 ауегтШи8

Специальность 05.18.10 - Технология чая, табака, биологически активных веществ и субтропических культур

Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук

Научный руководитель: академик, д.т.н., проф. Каптере В.М.,

к.б.н. Дриняев В.А.

Москва -2001

Авермек 2 2 ,

2 2 Содержание

зарегистриро 2 2

индексом С-С Введение .4 Всестор( 2 2 Глава 1. Обзор литературы

работ, наибо, 1.1 Физико-химические свойства и строение авермектинов............8

под редакцие 2 2 12 Биологические свойства авермектинов.................................12

Авермек 1.3 Характеристика 5й-ер1отусе8 ауегт111И8................................13

компонентов 9 2 1.4 Культивирование 81гер10тусез ауегт111и8..............................15

четыре мине аве| 15 Применение авермектинов................................................18

относительнс 2 2 16 Отечественные препараты на основе аверсектина С.................24

учетом этого 1.7 Экологические аспекты применения авермектинов...................31

серии и ее xi 2 2 18 Методы определения авермектинов.....................................35

Bib, была на 1.9 Способы выделения и очистки авермектинов.........................39

получило н; Глава 3.

препараты Д1 Глава 4 Глава 2. Экспериментальная часть

С использовг 2.1 Объекты и методы исследований

Баймек, Ивер 2.1.1 Объекты исследований................................................51

В нашег 2.1.2 Методы анализов.........................................................52

ш

комплекс, на 2.1.3 Математическая обработка результатов............................61

Се

авермектино! 2.2 Результаты и их обсуждение

От(

На OCHO 2.2.1 Выделение авермектинового комплекса из биомассы

Ин

ветеринарньк 2.2 .1.1 Анализ исходного сырья............................................62

в жидком HOJ Пр 2.2 .1.2 Выбор экстрагента....................................................66

9 2 13 Продолжительность экстракции 71

мицелиальной биомассы культуры 81гер1отусе8 ауегт111115 и получении целевого продукта в сухом очищенном виде.

Основные задачи, поставленные при выполненрш работы

1. Разработка условий извлечения авермектинового комплекса из биомассы.

2. Исследование различных приемов очистки экстракта.

3. Разработка рекомендаций для проведения стадии очистки.

4. Определение контрольных точек производственного процесса.

5. Разработка Критериев для оценки качества препарата.

6. Получение препарата в сухом очищенном виде.

7. Получение исходных данных и разработка опытно-промыщденного регламента на получение аверсектина С в сухом виде.

Научная новизна

1. Установлена закономерность извлечения целевого продукта от качества биомассы по критерию содержания в ней целевого продукта.

2. На основе экспериментальных данных установлены и рекомендованы оптимальные условия извлечения авермектинового комплекса.

3. Впервые дана объективная оценка различным способам очистки авермектинового комплекса с учетом совокупности критериев; технологичности, экономичности и безопасности для окружающей среды.

4. Установлено постоянство компонентного состава авермектинового комплекса независимо от условий экстракции и способов очистки экстрактов.

5. Впервые разработана технологическая схема, позволяющая получать целевой продукт в сухом виде со степенью чистоты не менее 70%.

Прак 17111 ческая зна ч им ост ь

Использование результатов работы позволило:

-разработать инструкцию входного контроля поступающего сырья, на основе которой целесообразно выбирать способ экстракции целевого продукта;

-вести процесс экстракции в условиях максимального извлечения целевого продукта;

-определить контрольные точки на каждой стадии производственного процесса, ответственнью за качество готового продукта; -оптимизировать процесс по критерию минимальных потерь действующего вещества;

-получить исходные данные для разработки опытно-промыщденного регламента на получение аверсектина С в сухом очищенном виде.

Глава 1 Обзор литературы

1.1 Физико-химические свойства и строение авермектинов

в процессе роста культура Su-eptomyces avermitilis синтезирует авермектиновый комплекс из 8 авермектиновых компонентов. Описаны основные авермектины А] А , Ага, В|;„ В:,, и четыре минорных - А | ь, А2ь, Вц, и В2ь- Последние четыре компонента образуются в процессе биосинтеза в незначительных количествах, особенно Ац, и ВАь, содержание которых в ряде случаев не превышает 2-4 % от суммарного количества авермектинов (76).

Все авермектины являются амфотерными соединениями, обладающими выраженными липофильными свойствами (94).

Авермектины хорощо растворяются в ацетоне, хлорсодержащих углеводородах, алифатических и ароматических спиртах, этилен и пропилен-гликолях, низкомолекулярных полиэтиленгликолях (полиэтиленгликоле 200 и 400). Слабо растворяются в гексане, петролейном эфире и практически не растворяются в воде (75).

Все авермектины обладают характерным поглощением в УФ-области спектра с максимумами поглощения при 237, 243 и 252 (плечо) нм. Спектр авермектинов представлен на рис. 1 (112).

Спектральные и физико-химические характеристики отдельньгх авермектинов представлены в табл. 1.

В химическом отнощении авермектины близки к макролидным антибиотикам: в их состав входит 16-ти членный лактон и дисахарид, состоящий из двух остатков олеандрозы (2,6 - дидезокси -3-0 -метил - L -арабиногексозы).

Рис.1 УФ-спектр раствора препарата аверсектина С в этаноле (10 мкг/мл)

спектральные и физико-

Суммарная формула

Оптическое вращение

(СНС 1 д)

Молекулярная масса (определенная путем масс- спектрометрии)

Ультрафиолетовый а б -сорцион-ный спектр X макс, (мкм)

А-1 а А-1Ь А"2а

C49H74OJ4 С4 8-Л72Л14

+ 68,5°±2'

(С=0,77)

-f 48,8°±2С

(С=1,64)

886 872 904

гз ?

(28,700; 4,458)

243

(3;275; 4,495)

252

(20,290; 4,307)

237 (28л00; 4,459) ,

243

(31,740; 4,501)

252

(20л425; 4.310)

Таблица Л,

лские свойства отдельных соединений С-076. А-2Ь В-1 а В-1Ь В-2а В-2Ь

Л - 4 6 л 72*14 С'47л70014 С 46л 74015 С47Н72015 + 55,7°±2° + 38,342°

(С=1,06) (С = 0,87)

890 872 858 890 876 .

237 237

(29,120; (27л580;

4,464) 4,486)

243 243

(31,850; (30,590;

4,503) 4,486)

252 252

(2СЛ10; (20л060;

4.431) 4,302)

Для установления структуры авермектинов были использованы химические и физические методы, включая масс-спектроскопию и спектроскопию ядерно-магнитного резонанса, а также рентгеновскую кристаллографию. В результате проведенных исследований было установлено, что отдельные авермектиновые компоненты отличаются между собой алкильными заместителями у 5-го и 25-го углеродных атомов, а также наличием или отсутствием двойной связи между 22-23-м углеродными атомами (69, 121). Структурная формула авермектинов приведена на рис.2.

Структурная формула авермектинового комплекса

М.в. 858-904

О' I

[ О'ч,- СНз лл,23 СИА

; "а R26

СНз

м ОН

г

О-

СНо

0R5

Авермектины R5

Ala СНз

Alb СНз

Bia Н

Bih Н

A2a СНз

Агь СНз

Н

Вгь Н

R26

С2Н5

СНз

С2Н5

СНЗ

С2Н5

СНз

С2Н5

СНз

С22~Х-С23

-СН-СН-

-СН=СН-

-сн=сн-

-СН=СН-

-СН2-СНОН

-СН2-СНОН

-СН2-СНОН

-СН2-СНОН

Из приведенных данных следует, что авермектины группы А отличаются от авермектинов группы В наличием у 5-го углеродного атома СНз-группы. Авермектины, обозначаемые рубрикой 1 имеют двойную связь между углеродными атомами С22 = С2з, тогда как у авермектинов обозначаемых рубрикой 2 эта связь отсутствует: в положении С22 появляется еще один атом водорода, а в положении С23 - оксигруппа. Символы (а) и (Ь) обозначают наличие у С23 5-бутильной (а) или изопропильной (Ь) группировки. Все индивидуальные авермектины обладают высокой противопаразитической активностью, но наиболее активным является авермектин В 1а(81).-

12 Биологические свойства авермектинов

Авермектины - новый класс биотоксинов, обладающих инсектицидной, акарицидной и нематоцидной активностью. Авермектины высокоактивны против насекомых, клещей и других членистоногих, а также нематод, но не действуют на цестод, трематод (64, 134). Авермектины не обладают выраженной активностью против бактерий, грибов и простейщих.

Действие авермектинов на различные группы членистоногих существенно отличается от такового у фосфорорганических соединений и пиретроидов, так как в последнем случае погибает практически вся фауна членистоногих, попадающая в зону действия этих препаратов, в том числе энтомофагов (63).

Авермектины проявляют активность при попадании в организм вредителей как контактным путем, так и через кищечник. причем в микроколичествах (52).

Механизм противопаразитарного действия авермектинов заключается в том, что они изменяют величину хлорных токов через мембраны нервньгх и

мышечных клеток беспозгзоночных животных. В настояшее время основной мишенью для авермектинов считают глютамат-чувствительные хлорные каналы, не отрицая участия и ГАМК-рецепторов. Из1\юнение хлорных токов нарушает проведение нервных импульсов и ведет к параличу и гибели паразитов. Этот механизм уникален, поскольку соответствующие структуры у млекопитающих животных находятся в центральной нервной системе и защищены гемато-энцефалическим барьером (22, 23, 24, 68, 78, 79, 93).

Таким образом, по механизму действия авермектины являются нейротоксинами биогенного происхождения (4).

Благодаря уникальности структуры авермектина и способа его действия развитие перекрестной резистентности весьма маловероятно.

13 Характеристика 81гер1отусе8 ауегтШИ8

Продуцент авермектинов 8й'ер1отусез ауегт111И8 - относится к классу Actrnomycetes, порядку Ас! 1потусе1а1ез, се.мейству Ас11потусе1асеае.

Типичная культура 8й"ер1отусез ауегт111И8, описанная в работе (99), обладает следующими морфологическими и культуральными свойствами: спорофоры образуют спирали в виде боковых ветвей воздушного мицелия: спирали компактные, но делаются более открытыми по мере старения культурьк споры цепочками не более чем в 15 спор, обычно имеют сферическую или овальную форму (при увеличении в 970 раз): спорообразование наблюдается при выращивании культуры в агаре с овсяной мукой, с глицерином-аспарагином. - с солями, крахмалом и с яичным альбумином; поверхность спор гладкая (71).

Культура 81гер1отусе8 ауегга1!1и8 на агаризованной среде образует субстратный и воздушный мицелий. Благодаря субстратному мицелию колонии прочно врастают в среду и потребляют питательные вещества (10).

Субстратный мицелий обычно темно-каштанового цвета. Воздушный мицелий формируется на поверхности колонии, как правило, серовато-коричневого цвета. Колонии характеризуются бугристым профилем и складчатой поверхностью. Колонии Streptomyces ауегт1гИ15 имеют землистый запах (21).

Во Всероссийской коллекции микроорганизмов имеется типовой штамм 8церЮтусез ауегтЦШз ВК1М Ас 1301. Изучение его биотехнологических особенностей показало, что штамм обладает невысокой продуктивностью в отношении авермектинов и значительной гетерогенностью (20). От родительского штамма ВКМ Ас 1301 был получен методом ступенчатого отбора мутант S^eptomyces avermitilis ВНИИСХМ 50, которьпй обладает лучшими биотехнологическими свойствами (21). В результате тормозного короткоимпульсного облучения культуры 8церШтусез ауегтЦ1И5 ВНИИСХМ 50 и последующего ступенчатого отбора активных вариантов получены два штамма: 8!гер1отусе5 ауегт1!!И5 ВНИИСХМ 51 и 8treptolTlyces а\'егт111и5 ВНИ14СХМ 52. По продуктивности штаммы превышают исходную культуру более чем в 2,5 раза (18,41). Методом естественного отбора получен мутант от 51 штамм 8Ц'ер1отусе8 ауегт111И5 ВНИРЮХМ - 54, который является основным продуцентом в настоящее время (40,43).

Культура данного штамма имеет сиороносцы в виде правильных спиралей. На 2% глюкозокартофельном агаре на 14-21 день роста при температуре +28'С образуется колония со светло-серым воздушным мицелием. Край колоний неровный. Поверхность колоний бороздчатая. В популяции встречаются аспорогенные колонии белого цвета - до 1%. На минеральном агаре образуются мелкие плоские колонии серовато-коричневого цвета, цвет субстратного мицелия - кремовый. Спороношение умеренное. Пигментообразование отсутствует. Вегетативное размножение штамма-иродуцента осуществляется в аэробных условиях на средах, содержащих в определенных количественных соотношениях в посевных

средах: зеленую патоку, соевую муку, глюкозу, лактозу, фосфат калия; в ферментационных средах; глюкозу, БВК, соевую муку, кукурузный экстракт и фосфат калия.

Указанный штамм-продуцент отличается от других известных штаммов прежде всего способностью синтезировать авермектины как по количеству, так и по компонентному составу. Наличие фагов у ЗцерШтусез ауегт111И5 не обнаружено (43).

Культура хорошо хранится до 1 года в сублимационно-воздушном состоянии и под вазелиновым маслом. Для хранения могут быть использованы:

-минеральный агар (Гаузе-1) - срок хранения до 3-х месяцев при +4"С;

-овсяный агар - срок хранения до 3-х месяцев при +4"С (43).

1.4 Культивирование 81гер1отусе8 ауегтШИ8

Питательные среды, для культивирования ЗцерЮтусез ауегт1!1Н5, содержат источники углерода и азота, асси-\н-1лируемые микроорганизмами и небольшие количества неорганических солей. Они обычно присутствуют в виде комплекснььх соединений источников углерода и азота, применяемых в качестве источника питания, но их можно добавлять к среде отдельно. Наиболее высокий выход авермектинов наблюдался при ферментации в средах, содержащих спиртовую барду, пептонизированное молоко, дрожжевой автолизат, а в качестве основных источников углерода - глюкозу, маннозу, декстрин - 600, кукурузный крахмал. {Менее пригодны глицерин, меласса, лактоза, инозит, раффиноза, ксилоза, глюкозамин (28). Используют также такие субстраты как пептон, овсяную муку, соевое молоко, томатную пасту (104).

Из тестированных витаминов, добавляемых к комплексной среде, содержащей дрожжевой автолизат, барду и крахмал, только биотин (2 мкг/мл) стимулировал биосинтез авермектинов. Из тестированных аминокислот явное стимулирующее действие оказал 0,Ь - триптофан (0,5 мг/мл) и слабое 0,Ь - метионин (2,5 мг/мл). Лучщим источником углерода, по сравнению с лактозой, сахарозой и декстрином, оказалась глюкоза (4,5%). а лучщим источником азота - пептонизированное .\юлоко (2,4%), Обязательный компонент среды ~ дрожжевой автолизат (0,25%) как источник витаминов. Добавление к среде такого детергента как полиэтиленгликоль • Р-2000 (2,5 мл/л) вело к заметной стимуляции образования авермектинов (28).

Было установлено, что соотнощение источников углерода и азота (С/Ы) в среде влияет не только на общую продуктивность культур, но и на относительное содержание отдельньгх авермектинов (20,55,95). Оптимальная для антибиотикообразования величина С/Ы составляла 20-23 (20). В свою очередь, повыщение концентрации азотсодержащих субстратов в среде, ведущее к уменьшению С/М, вызывало снижение общей продуктивности культур и относительного содержания авермектинов группы "В"(28). При достаточной для накопления максимальной биомассы концентрации источника азота в среде наличие источника углерода в культуральной жидкости обеспечивает, после исчерпания азота, интенсификацию образования антибиотика и липидов (95).

Обогащение культуры углеродом может быть осуществлено или увеличением концентрации источника углерода в исходной среде (20, 95. 100), или внесением источника углерода по ходу ферментации (87,95). Следует отметить, что степень конверсии источников углерода, в частности глюкозы, в авермектины является все же достаточно низкой, в сравнении с этим показателем у продуцентов других макролидных антибиотиков. Низкое значение экономического коэффициента для авермектинов объясняется, с

ОДНСИ стороны, тем, что авермектины не экскретируются из клетки, а с другой, активным функционированием конкурирующего за общие предшественники пути синтеза липидов (28).

Ферментацию культуры Streptomyces avermitilis для получения опти.мальных результатов наиболее целесообразно проводить при t=27-28'AC. рН питательной среды, пригодной для получения авермектинов, можно применять в пределах 5,0-9,0, предпочтительно 6,0 - 7,5 (38). Ферментацию продолжают в течение 120-170 ч.

Условия выращивания культуры Streptomyces avermitilis штамма ВНИИСХМ - 54 представлены в работе (43). Культура хорошо усваивает источники азота в окисленной и восстановленной формах, глюкозу, арабинозу, фруктозу, лактозу, крахмал и т.д. Гидролизует казеин. Максимум накопления авермектинов - 148-168 ч, при рН 6,8-7,4, оптимум температуры - (28±1)"С, в аэробных условиях.

Изучение путей биосинтеза авермектиновой молекулы показало, что лактонная часть авермектинов образуется из одной молекулы 2-метилбутирата (авермектины группы «А») или изобутирата (авермектины группы «В»), семи молекул ацетата и пяти молекул пропионата (76), т.е. из тех же низших жирных кислот, которые являются предшественниками в биосинтезе жирных кислот в клетках актиномицетов (89, 100, 103, 125).

Превращение В-компонентов в А-компоненты катализируется

ферментом авермектин-В-метилтрансферазой, который передает метил S -аденозилметионин (SAM) на гидроксильную группу, углерода в 5 положении (128).

В биосинтезе авермектинов участвуют аминокислоты, такие как ва�