автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.15, диссертация на тему:Разработка тест-систем для идентификации плодово-ягодной продукции методом полимеразной цепной реакции

На правах рукописи

005008333

Мудрикова Ольга Викторовна

РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПЛОДОВО-ЯГОДНОЙ ПРОДУКЦИИ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

Специальность 05.18.15 - Технология и товароведение пищевых продуктов и функционального и специализированного назначения и общественного питания

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

1 9 ЯН В 2012

Кемерово 2012

005008333

Работа выполнена в Федеральном Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» (ФГБОУ ВПО КемТИПП)

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор

Просеков Александр Юрьевич

Официальные оппоненты: доктор технических наук, доцент

Гореликова Галина Анатольевна

доктор химических наук, профессор Верещагин Александр Леонидович

Ведущая организация: Государственное учреждение Ярославской области «Ярославский государственный институт качества сырья и пищевых продуктов»

Защита диссертации состоится 17 февраля 2012 года в 13-00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.089.02 при ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» по адресу: 650056, г. Кемерово, б-р Строителей, 47.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности».

С авторефератом можно ознакомиться на сайтах Высшей аттестационной комиссии Министерства образования и науки Российской Федерации (http://vak.ed.gov.ru/) и ФГБОУ ВПО «КемТИПП» (www.kemtipp.ru).

Автореферат разослан «12» января 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

И.А. Бакин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Хорошо известно, что мякоть фруктов и ягод содержит многочисленные биологически активные соединения, которые очень полезны для здоровья человека, снижают риск возникновения заболеваний. По этой причине их активно используют в качестве ингредиентов для функциональных продуктов питания.

В условиях увеличения объема частного производства и свободной торговли продовольственными товарами, в том числе плодово-ягодным сырьем, полуфабрикатами и готовыми продуктами на основе плодово-ягодного сырья, возрастает возможность расширения их фальсификации по структуре и видовой принадлежности сырьевых составляющих. По экономическим соображениям чаще всего фальсифицируют малоценное плодово-ягодное сырье, реализуя его как продукцию высокого качества.

Государственное нормирование, а также надзор и контроль за качеством и безопасностью пищевых продуктов питания на современном этапе являются важнейшими стратегическими задачами государства и осуществляются путем введения стандартов, санитарных правил, норм и гигиенических нормативов, обязательных для выполнения юридическими и физическими лицами. Процесс вхождения России во Всемирную торговую организацию активизировал разработки стандартов, а также гармонизации национальных стандартов с международной системой стандартов ISO, Codex Alimentarius, стандартами безопасности продовольствия стран Единого Союза.

Используемые в настоящее время методы органолептического и физико-химического анализа не позволяют однозначно определить видовую принадлежность плодово-ягодного сырья в полуфабрикатах. В работах зарубежных исследователей (D.C. Hunter, J. Zhang, L.M. Stevenson, P. Taberlet, L. Gielly, G. Pautou, J. Bouvet, J. Sabate, E. Barrio A. Ortola-Vidal, H. Schnerr, M. Rojmyr), посвященных установлению видовой принадлежности плодово-ягодного сырья показано, что по сравнению с традиционными способами, установление видовой принадлежности плодово-ягодного сырья при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) отличается универсальностью, более глубоким уровнем видовой дифференциации, высокой воспроизводимостью и возможностью количественного анализа.

Учитывая актуальность проблемы обеспечения продовольственного российского рынка качественными продуктами питания, настоящая диссертационная работа посвящена разработке ПЦР-тест-системы для видовой идентификации плодово-ягодной продукции.

Цель работы и задачи исследований. Целью настоящей диссертационной работы является разработка ПЦР-тест-системы для идентификации плодово-ягодной продукции.

Для достижения поставленной цели определены следующие задачи исследования:

- анализ нуклеотидных последовательностей ДНК клубники (лат. Fragaria moschatá), груши (лат. Pyrus), яблока (лат. Malus), черной смородины

(лат. Ribes nigrum), черники (лат. Vaccinium myrtillus), абрикоса (лат. Prunus ar-meniaca), персика (лат. Prunns pérsica );

- конструирование универсальных праймеров для амплификации кластера ITS 1 ; 5.8S рРНК; ITS2 Fragaria moscháta, Руг us, Malus, Ribes nigrum, Vaccinium myrtillus, Prunus armeniaca, Primus pérsica-,

- определение оптимальных параметров проведения ПЦР для идентификации Fragaria moschata, Pyrus, Malus, Ribes nigrum, Vaccinium myrtillus, Prunus armeniaca, Prunus pérsica',

- сравнение специфичности ПЦР идентификации плодово-ягодного сырья и классических физико-химических методов;

- описание ПЦР-тест-системы для идентификации Fragaria moschata, Pyrus, Malus, Ribes nigrum, Vaccinium myrtillus, Prunus armeniaca, Prunus pérsica и расчет затрат на проведение исследования в испытательных лабораториях.

Научная новизна работы. Сконструированы родо- и видоспецифичные праймеры для амплификации кластера ITS1; 5.8S рРНК; ITS2 Fragaria moschata, Pyrus, Malus, Ribes nigrum, Vaccinium myrtillus, Prunus armeniaca, Prunus pérsica. Проведена сравнительная оценка видовой специфичности методом ПЦР с классическими физико-химическими методами на примере продуктов питания на основе плодово-ягодного сырья.

Практическая значимость работы. В результате теоретических и экспериментальных исследований разработана ПЦР-тест-система для идентификации плодово-ягодного сырья в продуктах питания. Отправлены материалы в ФГУП «Всероссийский научно-исследовательский институт метрологической службы» для проведения работ по аттестации «Методики идентификации плодово-ягодного сырья в продуктах питания методом полимеразной цепной реакции». Внесены в международную геномную базу данных два сорта персика, предоставленных для секвенирования Крымским селекционным центром "ГАВРИШ" (Крымск).

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были предметом докладов и обсуждений на международных и межрегиональных научно-технических конференциях, семинарах, конгрессах: III Всероссийской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Пищевые продукты и здоровье человека» (Кемерово, 2010); IX Международной научно-практической конференции "Инновационные технологии в пищевой промышленности" (Минск, 2010); Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Москва, 2010); I Всероссийской интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий» (Казань, 2010); II Международной научно-практической конференции «Прогрессивные технологии и перспективы развития» (Тамбов, 2010); конкурса "Участник молодежного научно-инновационного конкурса" («УМНИК») Федерального Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере на территории Кемеровской области (Кемерово, 2010); XV-ой Международной школе конференции молодых ученых (Пущино, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, в том числе три в журналах, рекомендованных экспертным советом ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из следующих основных разделов: введение, обзор литературы, объекты и методы выполнения работы, результаты исследований и их обсуждение, практическая реализация результатов работы, результаты и выводы, список использованных источников и приложения. Основное содержание работы изложено на 100 страницах, включая 30 таблиц и 19 рисунков. Список литературы включает 175 наименований.

МЕТОДИКА ВЫПОЛНЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

Теоретические и экспериментальные исследования проведены в соответствии с поставленными задачами на кафедре «Бионанотехнология» Федерального Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности». Общая схема проведения исследований приведена на рис. 1. Весь цикл исследований состоял из нескольких взаимосвязанных этапов.

На первом этапе для формулировки цели и задач собственных исследований проводили анализ доступной отечественной и зарубежной информации по теме диссертационного исследования.

На втором этапе проводили анализ нуклеотидных последовательностей, которые могут послужить универсальной ДНК-мишенью при разработке методики идентификации плодово-ягодного сырья. Проведено исследование на соответствие потенциальных нуклеотидных последовательностей требованиям, предъявляемым к ДНК-мишени.

На третьем этапе исследования с использованием компьютерной программы ClustalW (версия 2.1) проводили сравнительный анализ полных нуклеотидных последовательностей ДНК, кодирующей кластер ITS1; 5.8S рРНК; ITS2 Fragaria moschata, Pyrus, Malus, Ribes nigrum, Vaccinium myrtillus, Prunus armeniaca, Prunus pérsica, представленных в международной базе данных GenBank, с целью выявления консервативных участков нуклеотидных последовательностей для закладки родоспецифичных и видоспецифичных прайме-ров. Результаты этих исследований положены в основу конструирования прай-меров.

Четвертый этап посвящен оптимизации параметров амплификации. Оптимизировали последовательности праймеров с целью повышения температуры отжига и увеличения специфичности получаемого ПЦР-продукта.

На пятом этапе проводили оценку специфичности ПЦР в сравнении с классическими физико-химическими методами. Исследовали специфичность параллельной идентификации Fragaria moschata, Pyrus, Malus, Ribes nigrum, Vaccinium myrtillus, Prunus armeniaca, Prunus pérsica, а так же пищевых продуктов, изготовленных на их основе с использованием физико-химических методов и методики на основе ПЦР.

Рис. 1. Общая схема проведения исследований

Заключительный этап связан с освоением и внедрением разработанной ПЦР-тест-системы в аккредитованной испытательной лаборатории Научно-образовательного центра ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» (аттестат аккредитации испытательной лаборатории № РОСС RU.0001.2irniI08 от 01.06.09 г.), а также расчетом стоимости

разработанной тест-системы.

При проведении исследований использовали общепринятые, стандартные, оригинальные методы исследований, в том числе физико-химические, биохимические, микроскопические и другие. Отбор проб и подготовку их к анализу проводили по ГОСТ 26313-84.

Физико-химические показатели определяли по стандартным методикам: массовую долю сухих веществ определяли по ГОСТ 28562-90, титруемую кислотность определяли по ГОСТ 25555.0-82, минеральные примеси определяли

по ГОСТ 25555.3-82.

Для определения содержания органических кислот использовали систему капиллярного электрофореза «Капель-105». Метод основан на миграции и разделении анионных форм анализируемых компонентов под действием электрического поля вследствие их различной электрофоретической подвижности по МВИ М 04-47-2007 «Определение органических кислот в безалкогольных и алкогольных напитках».

Для проведения экстракции ДНК использовали коммерческий набор реагентов "Сорб-ГМО-А" (ЗАО «Синтол», Москва). Для амплификации использовали «Набор реактивов для проведения ПЦР-РВ» (ЗАО «Синтол», Москва). Собственно реакцию проводили в термоциклере (амплификаторе) «Терцик» (ДНК-технология, Россия) с применением функции активного точного регулирования температуры, по следующей программе: 95°С - 200 сек - 1цикл, 64°С 50 сек; 95°С 20 сек - 35 циклов, 72°С - 120 сек - 1 цикл. Детекцию продуктов реакции амплификации проводили при помощи электрофореза в агарозном геле. Для проверки достоверности получаемых результатов в одну из лунок помещали 1000 п.н. ДНК-маркер («Сибэнзим», Новосибирск).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Анализ нуклеотидных последовательностей ДНК Fragaria tnosckaía, Pyrus, Malus, Ribes nigrum, Vaccinium myrtillus, Prunus armeniaca, Prunus pérsica

Проведен поиск потенциальных нуклеотидных последовательностей, которые могут послужить универсальной ДНК-мишенью при разработке методики идентификации указанных образцов плодово-ягодного сырья. Поиск нуклеотидных последовательностей растительных геномов проводили по базе данных GeneBank.

Для того, чтобы можно было оценить использование ДНК-мишени для построения универсальных праймеров по длине сегмента ДНК после проведения полимеразной цепной реакции, выбранные презентативные нуклеотидные последовательности проанализированы и сведены в табл. 1.

Таблица 1

Сравнение размеров нуклеотидных последовательностей_

Наименование гена и межгенных областей Величина нуклеотидной последовательности, п.н.

груша персик абрикос черника черная смородина яблоко клубника

ПпЬ-йпР 417 447 402 442 - 883 418

72 - - - - - 39

18Б рРНК 1063 1063 1063 - 1063 1063 1063

ГГв!; 5-8в рРНК; Ш2 571 585 596 724 628 436 625

26Б рРНК 294 290 36 - - 487 37

рвЬА-йпН - 269 263 - - 152 292

тРНК-Ьеи (ИиЬ) 564 572 - 86 - 478 -

(рэЬА) ген 942 1062 1062 - - 1062

тРНК-ау (йпО) ген - 735 737 - - - 691

йпв-ШЮ - 394 677 672 - 661 670

тРНК-Ьеи (ЧгпЬ) ген 564 568 578 86 - - «5

«-» - нуклеотидные последовательности отсутствуют в геномной базе данных

Анализ данных, представленных в табл.1, указывает на то, что нуклеотидные последовательности гена тРНК-Leu (trnL), тРНК-Gly (trnG), (psbA), тРНК -Leu (trnL) ген, 18S pPHK и межгенных областей tmL-tmF и psbA-trnH недостаточно изучены. Имеющиеся последовательности свидетельствуют о низкой родовой дифференциации и, как следствие, не возможности их использования в качестве ДНК-мишени. Нуклеотидные последовательности кластера ITS1; 5.8S pPHK; ITS2 обеспечивают значительную родовую и видовую дифференциацию и могут быть рекомендованы к использованию в качестве ДНК-мишени.

Анализ всех нуклеотидных последовательностей свидетельствует о том, что кластер ITS1; 5.8S pPHK; ITS2 содержит наибольшее количество нуклеотидных остатков - гуанина и цитозина. При технологической тепловой обработке данная ДНК-мишень будет сохраняться в продукте в неизменном виде. Таким образом, кластер ITS1; 5.8S pPHK; ITS2 является единственной ДНК-мишенью, которая соответствует всем предъявляемым требованиям.

С целью конструирования родо- видоспецифичных праймеров проведен сравнительный анализ семи полных нуклеотидных последовательностей кластера ITS1; 5.8S pPHK; ITS2 Fragaria moschata, Руг us, Malus, Ribes nigrum, Vaccinium myrtillus, Prunus armeniaca, Prunus pérsica (табл. 2).

Таблица 2

Номер последовательности кластера ITSl; 5.8 S pPHK; ITS2 Название организма

DQ00627 Персик {Prunus pérsica)

EF211085 Абрикос (Prunus armeniaca)

FJ356165 Клубника (Fragaria moschata)

HQ836652 Яблоко (Malus)

EU 150086.1 Груша {Pyrus)

AJ297579.1 Черная смородина {Ribes nigrum)

GU361894 Черника (Vaccinium myrtillus)

IlUV/JIC 1Ща1СЛОпи1с/ ciucuxti^^ uuyvunv!,.^...----—r-,----------------A

ITSl; 5.8S pPHK; ITS2, имеющихся в современных банках данных, выбраны наиболее консервативные участки в пределах отдельных родов, подходящие для создания нуклеотидных праймеров. Для повышения специфичности нук-леотидные последовательности в регионах, соответствующих позициям праймеров, детально проанализированы с целью выявления нуклеотидных замен.

Для проверки последовательностей, полученных при анализе геномной базы данных, проведено секвенирование исследуемых образцов, предоставленных Крымским селекционным центром "ГАВРИШ" (Крымск) (совместно с Государственным научным учреждением «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии»). ДНК выделяли по стандартной методике с помощью набора ДНК-ЭкстранЗ (ЗАО «Син-тол», Москва). Амплификацию проводили по программе: 95°С-3 мин - 1 цикл, 95°С-30 с - 30 циклов, 72°С - 7 мин - 1 цикл. Обнаружены нуклеотидные замены в последовательности Prunus pérsica vor.Maria Bianca и Prunus pérsica var.Redhaven. В последовательности GAACGAGAGAGCGCATCGTCCC, представленной в геномной базе данных - нет вставки GTC.

Выбранные нами нуклеотидные последовательности использованы для сравнительного филогенетического анализа, результаты которого отражены на рис. 2

Lita

rt-ííor-W

Рис. 2. Филогенетическое дерево, основанное на анализе структур фрагментов кластера ITS!; 5.8S pPHK; ITS2, отражающее родственные связи исследуемых образцов, а именно видов:

1 - Prunus pérsica;

2 - Prunus armeniaca;

3 - Pyrus; 4 - Malus;

5 - Fragaria moschata;

6 - Ribes nigrum

Таким образом, мы получили три кластера. В первый вошли Prunus pérsica и Prunus armeniaca (DQ00627, EF211085), во второй - Malus и Pyrus (HQ836652, EU150086.1), в третий - Fragaria moschata, Ribes nigrum и Vaccinium myrtillus (FJ356165, AJ297579.1, GU361894). Следовательно, необходимо разработать как родо- как и видоспецифичные праймеры для идентификации Fragaria moschata, Pyrus, Malus, Ribes nigrum, Vaccinium myrtillus, Prunus armeniaca, Prunus pérsica в продуктах питания.

Конструирование универсальных праймеров для амплификации кластера ITS1; 5.8S рРНК; ITS2 Fragaria moschata, Pyrus, Malus, Ribes nigrum, Vaccinium myrtillus, Prunus armeniaca, Prunus pérsica

По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей кластера ITS 1; 5.8S рРНК; ITS2 разработаны следующие праймеры Pap527-549F: ATG СТС СТТ GTC ССС ТТТ АТС С Pap527-549R: CGT TGA AAG CCG AGC CGG AG

Расчетная величина амплифицируемого фрагмента нуклеотидной последовательности составляет для Pyrus - 507 п.н.; Ribes nigrum - 610 п.н.; Malus -529 п.н.; Fragaria moschata - 562 п.н.; Prunus armeniaca - 527 п.н. Vaccinium myrtillus и Prunus pérsica не реагируют с данной парой праймеров.

На рис. 3 видно, что в дорожке геля №1 наблюдается фрагмент размера 507 п.н., соответствующий Pyrus; в №2 - 610 п.н., соответствующий Ribes nigrum-, в №3 - 529 п.н., соответствующий Malus; в №4 - 562 п.н., соответствующий Fragaria moschata-, в №5 отсутствуют продукты амплификации; в №6 - 527 п.н., соответствующий Prunus armeniaca; в №7, как и ожидалось - нет продукта амплификации. Экспериментальные данные показывают, что при работе с данной парой праймеров, нельзя идентифицировать Malus и Prunus armeniaca при совместном прис)'тствии.

600 п.н.-500 п.н.-

3 4 4 * 1 Рис. 3, Электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента кластера ITS1; 5.8S рРНК; ITS2 с использованием синтезированных родоспенифичных праймеров Pap527-549F и Pap527-549R: М - маркер молекулярного веса; 1 - Pyrus-, 2 - Ribes nigrum-, 3 - Malus-, 4 - Fragaria moschata-, 5 - Prunus pérsica-, 6 - Prunus armeniaca-, 7 - Vaccinium myrtillus

Обоснованная специфичность данной пары родоспецичных праймеров подтверждена экспериментально на образцах фруктов и ягод, из которых приготовлены фруктово-ягодные смеси, содержащие от 0,01 до 100% исследуемых

1

ни

«|м ■ • ШШ *

Шш щШЬмШШ'яЯшшю ill ».

t . Ш

щ ш

■

" .' ,.• • •• ..... ' , •

видов фруктов и ягод, которые разделены на несколько опытных групп в зависимости от способа обработки.

Рис. 4. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента кластера ITS 1 ; 5.8S рРНК; ITS2 яблока с использованием пары родоспецифичных праймеров Pap527-549F и Pap527-549R: M - маркер молекулярного веса;

1 - смесь Malus (0,01%) и Prunus pérsica',

2 - смесь Malus (90,0%) и Prunus pérsica;

3 - смесь Malus (90,0%) и Prunus pérsica после термической обработки при 90°С в течение 30 минут, включая процедуру автоклави-рования (120°С, 2 атм.)

На рис. 4 видно, что фрагменты ДНК искомого размера (529 п.н.) наблюдаются во всех дорожках агарозного геля, куда нанесены пробы ДНК Malus, не зависимо от концентрации, состава смеси и термической обработки.

В связи с этим разработана пара праймеров для идентификации Prunus pérsica в продуктах питания:

Pp289F: GAA CG A GAG AGC GCG TCG ТС Pp289R: GCC GAG GAC TTG GTA TTT ATT CCA А

Величина амплифицирующего участка составляет 289 л.н. Температура отжига составляет 65,0°С для For-праймера и 64,0°С для Rev-праймера. Также разработана пара праймеров для идентификации Prunus armeniaca, поскольку при работе Pap527-549F и Pap527-549R пары праймеров величины амплифици-руемых фрагментов для Prunus armeniaca и Malus аналогичны.

Pa319F: AGT ТСА TAC ССТ ТСС GGG CGT РаЗ 19R: GCA TTT TAT GCC ААС CGC GCG АСА A Величина амплифицирующего участка составляет 319 п.н. Температура отжига составляет 63,0°С для For-праймера и 67,0°С для Rev-праймера. Все праймеры были проверены на специфичность.

Обоснованная специфичность данных пар видоспецифичных праймеров была подтверждена экспериментально на самостоятельно полученных препаратах ДНК Prunus armeniaca и Prunus pérsica.

На рис. 5 видно, что при использовании пар видоспецифичных праймеров Pp289F-Pp289R и Pa319F-Pa319R в дорожке, куда была нанесена проба ДНК Prunus pérsica, размер продукта амплификации составляет 289 п.н.; в дорожке, куда была нанесена проба ДНК Prunus armeniaca, размер продукта амплификации составляет 319 п.н. Следовательно, пара праймеров Pp289F-Pp289R и Pa319F-Pa319R позволяет проводить идентификацию Prunus pérsica и Prunus armeniaca при совместном присутствии в объекте исследования.

300 П.Н.-200 п.н,-

Рис. 5, Электрофореграмма про-ов амплификации фрагмента тера ITS 1; 5,8S рРНК; ITS2 с щьзованием пар видоспецифичных :меров Pp289F-Pp289R и Pa319F-9R: М - маркер молекулярного веса; runus pérsica; 2 - Prunus armeniaca

Проведено выравнивание нуклеотидных последовательностей кластера ITS 1 ; 5,8S рРНК; ITS2 Ribes nigrum и Vaccinium myrtillus, несмотря на таксоно-метрические отличия, нуклеотидные последовательности кластера ITS1; 5,8S рРНК; ITS2 для них идентичны. Таким образом, разработана пара праймеров для определения Vaccinium myrtillus и Ribes nigrum'.

Pch503F: GCC TAG С AG AAC G AC CCG T Pch503R: CCG TGC GCG GTC GGC СТА A

По расчетным данным длина амплифицируемого участка кластера ITS 1 ; 5,8S рРНК; ITS2 для ДНК Ribes nigrum составляет 482 п.н., для ДНК Vaccinium myrtillus - 503 п.н.

Полученные экспериментальные данные позволяют утверждать, что сконструированная и исследованная нами система праймеров для выявления кластера ITS 1 ; 5,8S рРНК; ITS2, может быть использована для идентификации Fragaria moschata, Pyrus, Malus, Ribes nigrum, Vaccinium myrtillus, Prunus armeniaca, Prunus pérsica.

Определение оптимальных параметров проведения ПЦР для идентификации Fragaria moschata, Pyrus, Malus, Ribes nigrum, Vaccinium myrtillus, Prunus armeniaca, Prunus pérsica

Известно, что эффективность проведения полимеразной цепной реакции зависит от температуры отжига праймеров, их количества и концентрации ионов Mg +. При выборе условий ПЦР проводили в реакционном буфере содержащем фиксированную концентрацию ионов Mg2+.

Таким образом подбор условий ПЦР свелся к варьированию таких параметров, как температура отжига праймеров, температура денатурации, продолжительность денатурации и количество циклов амплификации.

В процессе оценки параметров учитывали наличие или отсутствие фоновой амплификации, наличие дополнительных продуктов амплификации. Результаты представлены в табл. 3-5. Эффективность амплификации при разных температурах отжига изучали отдельно для каждой пары праймеров.

Таблица 3

Влияние параметров проведения амплификации при использовании

Наименование образцов исследования Температура отжига праймеров, °С Температура денатурации, °С

62 63 64 65 93 94 95

Prunns pérsica + + - - - +

Malus - + + - - - +

Pyrus - + + - - - +

Ribes nigrum - - + + - - +

Fragaria moschata - - + - - +

Полученные экспериментальные данные указывают, что при использовании праймеров Pap527-549F-Pap527-549R амплификацию следует проводить по следующей схеме: 95°С - 200 с - 1цикл, 64°С 50 с; 95°С 20 с - 35 циклов, 72°С -120 с -1 цикл.

Таблица 4

Влияние параметров проведения амплификации при использовании пар

видоспецифичных праймеров Pp289F-Pp289R и РаЗ 19F-Pa319R

Наименование образцов исследования Температура отжига праймеров, °С Температура денатурации, °С

63 64 65 66 67 93 94 95

Prunus pérsica - - + + - - - +

Prunus armeniaca - + + + - - + +

Полученные экспериментальные данные указывают, что при использовании пар видоспецифичных праймеров Pp289F-Pp289R и РаЭ19Р-РаЗт амплификацию следует проводить по следующей схеме: 95°С - 200 с - 1цикл, 65-66°С 50 с; 95°С 20 с - 35 циклов, 72°С -120 с -1 цикл.

Таблица 5

Влияние параметров проведения амплификации при использовании

праймеров Pch503F - Pch503R

Наименование образцов исследования Температура отжига праймеров, °С

61 62 63 64 65 66

Ribes nigrum - - + + - -

Vaccinium myrtiilus - - - + + -

Наименование образцов исследования Температура денатурации, °С

93 94 95

Ribes nigrum - - +

Vaccinium myrtiilus - - +

Полученные экспериментальные данные указывают, что при использовании праймеров РсЬ503Р - Pch503R амплификацию следует проводить по следующей схеме: 95°С - 200 с - 1цикл, 64°С 50 с; 95°С 30 с - 35 циклов, 72°С - 120 с -1 цикл.

Сравнение специфичности ПЦР-идентификации плодово-ягодного сырья и физико-химических методов

Проведено исследование по идентификации плодово-ягодного сырья в образцах повидла из абрикоса. Результаты опыта по параллельной идентификации плодово-ягодного состава повидла физико-химическими методами и с помощью ПЦР-метода исследования показаны в табл. 6.

Таблица 6

Результаты параллельной идентификации плодово-ягодного состава повидла

физико-химическими методами и методики на основе ПЦР

№ п/п Метод анализа Показатель Норма Эксперимент Заключение по составу повидла

1 ГОСТ 28562-90 Рефрактометрия Массовая доля растворимых сухих веществ,% 61 65 Соответствует ГОСТ Р 51934, нет данных по составу продукта

2 ГОСТ 25555.382 Флотация Массовая доля минеральных примесей, % 0,05 0,04 Соответствует ГОСТ Р 51934, нет данных по составу продукта

3 МВИМ 04-472007 Капиллярный электрофорез ^яблочной к-ть/ Х;1ИМ0НК0Й к-ты 23,18 0,48 Нельзя сделать заключение о составе продукта

4 ПЦР-тест-система Длина ПЦР ампликонов, п.н. 319 п.н. 319 п.н. Содержит абрикос

Повидло из абрикоса должно соответствовать ГОСТ Р 51934-2002 «Повидло. Технические условия» и может содержать в своем составе до 40% яблочного сока. Исследования, проведенные согласно действующей документации (рефрактометрия и флотация) подтверждают, что данный продукт соответствует требованиям. Сделать заключение о составе продукта по экспериментальным данным нельзя.

Нами предпринята попытка идентифицировать состав повидла по профилю органических кислот. Для этого были приготовлены контрольные образцы абрикосового повидла в лабораторных условиях. В контрольном образце «повидло из абрикоса» отношение яблочной и лимонной кислот составляет 23,18, в исследуемом образце повидла - Хя6лочной к.ты/ Хлимонной к.ты = 0,48. Однако сделать однозначное заключение о содержании абрикоса в абрикосом повидле в данном случае нельзя, поскольку возможно, что в качестве регулятора кислотности была использована органическая кислота (например, лимонная кислота), что соответствует ГОСТ Р 51934-2002, п.4.3.1.

Из представленных данных видно, что использование классических физико-химических методов при идентификации плодово-ягодного сырья не дает однозначных результатов о составе продукта.

Суммируя вышесказанное, можно заключить, что результаты идентификации Fragaria moschata, Pyrus, Malus, Ribes nigrum, Vaccinium myrtillus, Prunus armeniaca, Prunus pérsica, полученные с использованием полимеразной цепной реакции, превосходят результаты классических физико-химических методов идентификации плодово-ягодного сырья в продуктах питания, поскольку позволяют сократить время и расходы на проведение одного исследования.

ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕАЛИЗАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

Тест-система представлена в виде готовых пробирок с реакционной смесью и необходимыми положительными и отрицательными контрольными образцами, в которые требуется только внести образец ДНК. Такая форма снижает вероятность ошибок оператора и риск контаминации реактивов при приготовлении смеси, повышает воспроизводимость результатов, а также уменьшает время и трудоемкость анализа. Тест-система для идентификации плодово-ягодного сырья в продуктах питания позволяет провести исследования по следующей схеме, представленной на рис. 6.

Рис. 6. Этапы идентификации плодово-ягодного сырья

Отличительными особенностями набора тест-систем является наличие родо- и видоспецифичных праймеров, специально подобранных для кластера

ITS1; 5,8S рРНК; ITS2 Fragaria moschata, Pyrus, Malus, Ribes nigrum, Vaccinium myrtillus, Prunus armeniaca, Prunus pérsica.

ВЫВОДЫ

1. Проведен анализ нуклеотидных последовательностей ДНК Fragaria moschata, Pyrus, Malus, Ribes nigrum, Vaccinium myrtillus, Prunus armeniaca, Prunus pérsica, произведен выбор презентативной ДНК-мишени на основе данных о размерах нуклеотидных последовательностей и соответствии требованиям, предъявляемым к ДНК-мишени. Установлено, что нуклеотидные последовательности кластера ITS1; 5.8S рРНК; ITS2 обеспечивают значительную родовую дифференциацию и обладают наибольшей термоустойчивостью и, следовательно, могут быть рекомендованы к использованию в качестве ДНК-мишени.

2. Сконструированы и синтезированы родо- и видоспецифичные прайме-ры для амплификации кластера 1TS1; 5.8S рРНК; ITS2 Fragaria moschata, Pyrus, Malus, Ribes nigrum, Vaccinium myrtillus, Prunus armeniaca, Prunus pérsica.

3. Определены оптимальные параметры проведения ПЦР для идентификации Fragaria moschata, Pyrus, Malus, Ribes nigrum, Vaccinium myrtillus, Prunus armeniaca, Prunus pérsica.

При идентификации Prunus pérsica, Malus, Pyrus, Ribes nigrum, Fragaria moschata амплификацию следует проводить по следующей схеме: 95°С - 200 с -1цикл, 64°С 50 с; 95°С 20 с - 35 циклов, 72°С - 120 с - 1 цикл. При идентификации Prunus pérsica, Prunus armeniaca - 95°C - 200 с - 1цикл, 65-66°C 50 с; 95°C 20 с - 35 циклов, 72°С - 120 с - 1 цикл. При идентификации Ribes nigrum, Vaccinium myrtillus - 95°C - 200 с - 1цикл, 64°C 50 с; 95°C 30 с - 35 циклов, 72°С -120 с -1 цикл.

4. Проведена сравнительная оценка специфичности ПЦР с физико-химическими методами исследования. Идентификации плодово-ягодного сырья в продуктах питания с использованием полимеразной цепной реакции позволяет сократить время и расходы на проведение одного исследования.

5. Разработана тест-система для идентификации плодово-ягодного сырья в продуктах питания, что позволит совершенствовать контроль за качеством продуктов питания на основе растительного, сырья.

Работа выполнена в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы», ГК№ 14.740.11.1219.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНО В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ

В журналах, рекомендованных экспертным советом ВАК РФ:

1. Остроумов, JI.A. Метод выделения растительной ДНК из растений и продуктов питания на их основе / Л.А. Остроумов, А.Ю. Просеков, А.Н. Архи-

пов, O.B. Мудрикова // Известия Самарского научного центра РАН, 2010.-

Т.12.-№4(3).-С. 722-724.

2. Архипов, А.Н. Сравнительный анализ геномов организмов, используемых в производстве пищевых добавок / А.Н. Архипов, О.В. Мудрикова, H.A. Масунов // Техника и технология пищевых производств - 2010,- № 4.- С. 77-81.

3. Просеков, А.Ю. Методы ДНК-технологии для идентификации растительного сырья в молочных продуктах/ А.Ю. Просеков, О.В. Мудрикова, A.B. Булавина, А.Н. Архипов // Молочная промышленность,- 2011.- № 12.- С. 62-63.

Статьи в других журналах и сборниках материалов конференций:

1. Мудрикова, О.В. ПЦР-тест-системы для видовой идентификации и количественной оценки плодово-ягодного сырья в полуфабрикатах и готовой продукции // Пищевые продукты и здоровье человека: материалы III Всероссийской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых.- Кемерово, 2010.- С.42.

2. Мудрикова, О.В. Молекулярно-генетическая родовая идентификация рода Malus / O.B. Мудрикова, А.Ю. Просеков // Интеллект и наука: материалы X Международной научно-практической конференции (г. Железногорск, 28-29 апреля 2010 г.).- Красноярск: ИПК СФУ.- 2010,- С. 238.

3. Просеков, А.Ю. Разработка методики определения качества плодово-ягодного сырья / А.Ю. Просеков, О.В. Мудрикова // Инновационные технологии в пищевой промышленности: материалы IX Международной научно-практической конференции (7-8 октября 2010г., г. Минск).- Минск: РУП "Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по продовольствию".- 2010.- С.289-290.

4. Мудрикова, О.В. Филогенетический анализ для экспертизы качества продуктов питания на основе сравнительного анализа геномов / О.В. Мудрикова, С.А. Сухих, К.В. Беспоместных // Биотехнология растительного сырья, качество и безопасность пищевых продуктов: материалы Всероссийской научно-практической конференции.- Иркутск: ИрГТУ, 2010.- С 204-205.

5. Мудрикова, О.В. Использование ДНК-фингерпринтинга для генетической идентификации сырья пищевой промышленности / О.В. Мудрикова, А.Ю. Просеков // Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: материалы I Международной научно-практической конференции (17-19 ноября) / под общей ред. В.В. Уйба,- М.: Парк-медиа.-2010.- С.113.

6. Мудрикова, О.В. Исследование эволюции растительного сырья для пищевой промышленности с использованием повторяющихся последовательностей / О.В. Мудрикова, А.Ю. Просеков // Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий: материалы I Всероссийской Интернет-конференции (17-22

ноября). Казань, 2010,- С.112.

7. Архипов, H.A. Компьютерный поиск мишеней для ПЦР в пищевои промышленности / А.Н. Архипов, О.В. Мудрикова, H.A. Масунов // Прогрессивные технологии и перспективы развития: материалы II Международной научно-практической конференции. Тамбов: ООО «ТР-Принт», 2010.- С.143-144.

8. Архипов, H.A. Внедрение ПЦР в пищевой промышленности: проблемы и перспективы / H.A. Архипов, О.В. Мудрикова // Наука в современной мире: материалы III Международной научно-практической конференции (30 октября) / под ред. Г.Ф.Гребенщикова.- М.: Издательство «Перо», 2010.- С. 10-13.

9. Мудрикова, О.В. ПЦР-маркеры для видовой дифференциации персика и абрикоса / О.В. Мудрикова, А.Ю. Просеков, Ю.В. Мудрикова // Биология -Наука XXI века: материалы XV Международной школы-конференции молодых ученых.- Пущино: Пущинский научный центр РАН, 2011.- С. 282-283.

Отчеты по НИР

1. Разработка методов выявления фальсификации и идентификации продукции на растительной основе / О.В. Мудрикова // Научно-технический отчет по государственному контракту №14.740.11.1219 в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (1-ый этап, ИК110707120514).- Кемерово, 2011,- 72 с.

2. Разработка методов выявления фальсификации и идентификации продукции на растительной основе / О.В. Мудрикова // Научно-технический отчет по государственному контракту №14.740.11.1219 в рамках федеральной целевой про1раммы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (2-ой этап, ИК01040412191).- Кемерово, 2011.- 65 с.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ПЦР - полимеразная цепная реакция ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота РНК - рибонуклеиновая кислота п.н. - пар нуклеотидов п.а. - продукт амплификации

Подписано в печать 29.12.11. Формат 60x86/16. Тираж 80 экз. Объем 1,1 п.л. Заказ №157. Отпечатано в редакционно-издательском центре КемТИПП. 650010, г. Кемерово, ул. Красноармейская, 52

61 12-5/1425

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности»

(ФГБОУ ВПО КемТИПП)

• ' ■ ■ ■ '

МУДРИКОВА ОЛЬГА ВИКТОРОВНА

Разработка тест-систем для идентификации плодово-ягодной продукции методом полимеразной цепной реакции

Специальность 05.18.15 - Технология и товароведение пищевых продуктов и функционального и специализированного назначения и общественного питания

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата технических наук

Научный руководитель:

доктор технических наук, профессор А.Ю. Просеков

Кемерово 2012

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ......................................................... 4

ВВЕДЕНИЕ............................................................................. 5

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................ 8

1.1 Основные положения об идентификации и фальсификации пищевого сырья и готовой продукции................................. 8

1.2 Физико-химические методы оценки видовой принадлежности плодово-ягодного сырья....................................................... 12

1.3 Принцип полимеразной цепной реакции............................... 16

1.4 Структура генома растений.............................................. 21

1.5 Применение методов ДНК-диагностики для видовой идентификации плодово-ягодного сырья.......................................... 28

1.6 Заключение по обзору литературы и задачи исследований........ 37

2 МЕТОДИКА ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ................................. 39

2.1 Организация экспериментальных работ................................ 39

2.2 Объекты исследований..................................................... 41

2.3 Основные методы исследований......................................... 43

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ АНАЛИЗ.................. 54

3.1 Анализ нуклеотидных последовательностей ДНК Fragaria moschata, Pyrus, Malus, Ribes nigrum, Vaccinium myrtillus, Prunus armeniaca, Prunus pérsica.................................................. 54

3.2 Конструирование универсальных праймеров для амплификации кластера ITS1; 5.8S рРНК; ITS2 Fragaria moschata, Pyrus, Malus, Ribes nigrum, Vaccinium myrtillus, Prunus armeniaca,

Prunus pérsica................................................................ 66

3.3 Определение оптимальных параметров проведения ПЦР для идентификации Fragaria moschata, Pyrus, Malus, Ribes nigrum,

Vaccinium myrtillus, Prunus armeniaca, Prunus pérsica............... 74

3.3.1 Выделение ДНК...................................................... 74

3.3.2 Выбор параметров и оптимизация процессов амплификации..............................................................................................................................................77

3.3.3 Выбор условий для проведения электрофореза в агароз-ном геле..................................................................................................................................80

3.3.4 Влияние технологической обработки образцов на эффективность ПЦР идентификации плодово-ягодного сырья..........81

3.3.5 Сравнение специфичности ПЦР-идентификации плодово-ягодного сырья и физико-химических методов................................83

4 ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕАЛИЗАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ.... 90

4.1 Методика изготовления ПЦР тест-системы и ее описание..................90

4.2 Расчет затрат на проведение исследования с помощью ПЦР-

тест-системы....................................................................................................................................92

ВЫВОДЫ..............................................................................................................................................................99

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ..................................................101

ПРИЛОЖЕНИЕ..............................................................................................................................................119

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

вэжх Высокоэффективная жидкостная хроматография

ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота

ЕС Европейский союз

ИФА Иммуноферментный анализ

КЭ Капиллярный электрофорез

МВИ Методика выполнения испытаний

м Моль/л

мМ Миллимоль/л

нг Нанограмм

ПААГ Полиакриламидный гель

ПЦР Полимеразная цепная реакция

пг Пикограмм

пмоль Пикомоль

ПДРФ Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

ПКО Положительный контрольный образец

п.н. Пар нулеотидов

п.а. Продукт амплификации

РНК Рибонуклеииновая кислота

Т.П.О. Тысячи пар олигонуклеотидов

ТЕ-буфер Трис-ЭДТА буфер

Трис-НС1 Трис-(оксиметил)-аминометан гидрохлорид

Taq Ткегтт адиаИсш

ЭДТА Этилендиаминтетрацетат натрия

ВВЕДЕНИЕ

Хорошо известно, что мякоть фруктов и ягод содержит многочисленные биологически активные соединения, которые очень полезны для здоровья человека, снижают риск возникновения заболеваний. По этой причине их активно используют в качестве ингредиентов для функциональных продуктов питания.

В условиях увеличения объема частного производства и свободной торговли продовольственными товарами, в том числе плодово-ягодным сырьем, полуфабрикатами и готовыми продуктами на основе плодово-ягодного сырья, возрастает возможность расширения их фальсификации по структуре и видовой принадлежности сырьевых составляющих. По экономическим соображениям чаще всего фальсифицируют малоценное плодово-ягодное сырье, реализуя его как продукцию высокого качества.

Государственное нормирование, а также надзор и контроль за качеством и безопасностью пищевых продуктов питания на современном этапе являются важнейшими стратегическими задачами государства и осуществляются путем введения стандартов, санитарных правил, норм и гигиенических нормативов, обязательных для выполнения юридическими и физическими лицами. Процесс вхождения России во Всемирную торговую организацию активизировал разработки стандартов, а также гармонизации национальных стандартов с международной системой стандартов ISO, Codex Ali-mentarius, стандартами безопасности продовольствия стран Единого Союза.

Маркировка пищевых продуктов в странах Евросоюза регулируется директивой ЕС 2000/13/ЕС, а ответственность производителей регулируется постановлением ЕС 178/2002. Тем не менее, иногда встречается случайные или незаконные замены. Замена сырья - это не только попытка обмануть потребителя, это очень опасно, особенно для здоровья и жизни людей, страда-

ющих аллергическими реакциями на некоторые компоненты продуктов питания.

Используемые в настоящее время методы органолептического и физико-химического анализа не позволяют однозначно определить видовую принадлежность плодово-ягодного сырья в полуфабрикатах. В работах зарубежных исследователей (D.C. Hunter, J. Zhang, L.M. Stevenson, P. Taberlet, L. Gielly, G. Pautou, J. Bouvet, J. Sabate, E. Barrio A. Ortola-Vidal, H. Schnerr, M. Rojmyr), посвященных установлению видовой принадлежности плодово-ягодного сырья, показано, что по сравнению с традиционными способами, установление видовой принадлежности плодово-ягодного сырья при помощи ИТ TP отличается универсальностью, более глубоким уровнем видовой дифференциации, высокой воспроизводимостью и возможностью количественного анализа.

Учитывая актуальность проблемы обеспечения продовольственного российского рынка качественными продуктами питания, настоящая диссертационная работа посвящена разработке ПЦР-тест-системы для видовой идентификации плодово-ягодного сырья в продуктах питания.

В диссертации теоретически обоснован и на практике подтвержден выбор ДНК-мишени для родовой и видовой идентификации персика, абрикоса, яблока, груши, черники, клубники и черной смородины, сконструированы олигонуклеотидные праймеры для дифференциальной амплификации специфических последовательностей ДНК. На основе сконструированных олиго-нуклеотидных последовательностей разработана тест-система, обладающая 100% специфичностью с пределом аналитической чувствительности 0,1% примеси других растительных компонентов в исследуемом продукте или 10 пг растительной ДНК в пробе ПЦР.

Создан внутренний контрольный образец с оптимальной концентрацией 1 пг в ПЦР-пробе, который добавляется на этапе выделения ДНК и полностью исключает ошибки исследователя при постановке реакции. Разработаны положительные контрольные образцы ДНК для рассматриваемых фрук-

тов и ягод, являющиеся индикатором работы амплификационной смеси и маркером длины ПЦР-продуктов.

Проведены сравнительные межлабораторные исследования, подтверждающие чувствительность и достоверность разработанной ПЦР-тест-системы. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе - 3 в журналах, рекомендованных ВАК РФ «Молочная промышленность», «Техника и технология пищевых производств», «Известия Самарского научного центра РАН».

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы представлены основные положении об идентификации и фальсификации пищевого сырья и продуктов питания, проанализированы физико-химические методы анализа, используемые в настоящее время в Российской Федерации для идентификации плодово-ягодного сырья на предмет идентификации плодово-ягодного сырья в молочных продуктах питания. Представлены основы метода полимеразной цепной реакции и особенности генома растений. Проанализированы особенности и перспективы применения методов ДНК-диагностики для видовой идентификации и количественной оценки плодово-ягодного сырья в молочных продуктах питания, предлагаемые зарубежными исследователями. На основании приведенных литературных данных сформулирована цель и задачи собственных исследований.

1.1 Основные положения об идентификации и фальсификации пищевого сырья и готовой продукции

В соответствии со статьей 14 Закона Российской Федерации «О качестве и безопасности пищевых продуктов» (от 01.12.99г.), в целях определения приоритетных направлений государственной политики в области обеспечения качества и безопасности пищевых продуктов, охраны здоровья населения, а также в целях разработки мер по предотвращению поступления на потребительский рынок некачественных и опасных пищевых продуктов органами государственного надзора и контроля проводится мониторинг качества и безопасности пищевых продуктов [56, 57, 58].

Согласно Информационному письму от 18 апреля 2006 г. N 01-06/13167 Министерства экономического развития и торговли Российской Федерации, Федеральной таможенной службы, в котором содержатся «Методические рекомендации о назначении экспертиз должностными лицами таможенных ор-

ганов и проведении экспертиз Центральным экспертно-криминалистическим таможенным управлением, экспертно-криминалистическими службами - региональными филиалами ЦЭКТУ, иными экспертными организациями и экспертами», в классификации проводимых экспертиз идентификационная экспертиза занимает первое место [53, 54].

В соответствии с целями идентификационной экспертизы товара идентификацию подразделяют на потребительскую, товарно-партионную, ассортиментную (видовую), качественную, сортовую, специальную и осуществляют при помощи органолептических, измерительных и тестовых методов [42,48,68].

Параллельно с идентификационной экспертизой проводится экспертиза на его подлинность, целью которой является установление соответствия данного изделия ряду специфических показателей, отличающий данный продукт от других. Получение отрицательного результата при установлении подлинности товара свидетельствует о его подделке. Подделка, выполненная с корыстной целью, именуется фальсификацией и является причиной ухудшения тех или иных потребительских свойств продукта [4, 42, 67].

При фальсификации продовольственных товаров подделке подлинности обычно подвергаются одна или несколько характеристик товара. Исходя из этого, различают ассортиментную (видовую), качественную, количественную, стоимостную, информационную и комплексную виды фальсификации, каждая из представленных фальсификаций имеет свои характерные способы подделки подлинности товаров [48].

В настоящее время наиболее распространенной и, в то же время, наиболее сложной для выявления является ассортиментная фальсификация, осуществляющаяся путем полной подмены истинного продукта его заменителями другого сорта, вида или наименования с сохранением сходства одного или нескольких признаков [68].

Отрицательное влияние фальсификаций продовольственных товаров нельзя недооценивать, так как помимо экономических потерь, оно вызывает

1 о

целый спектр отрицательных физиологических и моральных последствии, как на отдельного потребителя, так и на общество в целом. Результатами таких последствий являются утрата здоровья, снижение продолжительности жизни и увеличение смертности от болезней и пищевых отравлений, ухудшение структуры питания за счет повышения удельного веса низкокачественных и малоценных продуктов [3, 7, 92].

Таким образом, разработка эффективных способов идентификации и обнаружения фальсификаций плодово-ягодного сырья в продуктах имеет первоочередное значение в списке мероприятий, направленных на достижение безопасности и качества реализуемой пищевой продукции [49, 60, 107].

Переработанная плодовая продукция представляет собой изделия, содержащие целые плод или их части, имеющие наиболее питательные для организма человека вещества, полученные путем применения физических, химических, биохимических и комбинированных способов консервирования. В зависимости от способов консервирования переработанные плоды подразделяются на следующие виды: сушеные, пастеризованные, стерилизованные, замороженные, маринады, компоты, соленые, квашеные [2].

Наиболее сложным в экспертизе является определение фальсификации переработанных плодов. При этом могут быть следующие виды их фальсификации:

1. Ассортиментная фальсификация переработанных плодов может проводиться следующими приемами: подмена одного сорта тех или иных переработанных плодов другими; подмена одного вида переработанных плодов. Наиболее распространенная ассортиментная фальсификация переработанных плодов осуществляется за счет подмены высококачественной продукции низкосортными изделиями. Может происходить также подмена одного вида плода другими. Так, вместо земляники садовой предлагают клубнику, а вместо персиков — абрикосы.

2. Качественная фальсификация переработанных плодов овощей может происходить за счет добавления воды; использования некачественного сы-

рья (гнилого, давленого, битого, с признаками плесени, червивого, прокисшего и т.п.); нарушения рецептурного состава; введения консервантов и антибиотиков.

Для увеличения массы высушенные плоды и овощи помещают на склад с повышенной влажностью, выдерживают определенное время, и в зависимости от вида плодов и их размеров вес может увеличиться приблизительно на 5—10%. Отличить такую фальсификацию практически очень легко: плоды будут выглядеть более сырыми, срок хранения продукции без консервантов и антибиотиков резко уменьшается, а с применением антибиотиков увеличивается значительно.

Для увеличения сроков хранения переработанных плодов в последние годы вначале за рубежом, а теперь и в нашей стране широко практикуется применение консервантов и антибиотиков как при получении сырья, так и при переработке плодов. Однако при этом не указывают, какие же были применены консерванты, антибиотики и в каких количествах [83, 84].

В замороженные плоды и ягоды также могут добавляться антибиотики. И если мы употребляем такие переработанные плоды и овощи с антибиотиками, то они полностью поступают в наш организм вместе с данной продукцией.

В сырье при производстве сушеных плодов и ягод, полученных в Средней Азии, в больших количествах вводят сернистый газ, который вступает во взаимодействие с сахарами, и образуются бисульфитные производные Сахаров. В результате сахара не разлагаются, и плоды и ягоды имеют не светло-коричневый цвет, а цвет натуральных плодов и ягод. В таких плодах и ягодах в больших количествах присутствуют соединения сернистой кислоты, которые могут провоцировать формирование раковых клеток.

3. Количественная фальсификация переработанных плодов (недовес) — это обман потребителя за счет значительных отклонений параметров товара (массы), превышающих предельно допустимые нормы отклонений. Выявить

такую фальсификацию достаточно просто, измерив предварительно массу квашеных продуктов поверенными мерительными мерами веса.

4. Информационная фальсификация переработанных плодов и овощей — это обман потребителя с помощью неточной или искаженной информации об этих изделиях [28].

Этот вид фальсификации осуществляется путем искажения информации в товарно-сопроводительных документа о маркировке переработанной плодовой продукции. В подобной фальсификации информации о переработанных плодах довольно часто искажаются следующие данные: наименование товара; страна происхождения товара; фирма, производитель товара; количество товара; состав продукта.

В документах в нарушение Закона «О защите прав потребителей» не указываются какие введены консерванты, антибиотики, продлевающие их гарантийный срок хранения.

К информационной фальсификации относится также: подделка сертификата качества, таможенных документов, штрихового кода и др. Выявляется такая фальсификация проведением специальной экспертизы [68, 113].

1.2. Физико-химические методы оценки видовой принадлежности

плодово-ягодного сырья