автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.04, диссертация на тему:Разработка технологии йогурта функциональной направленности с пониженной аллергенностью белков молока

На правах рукописи

РЯЗАНЦЕВА КСЕНИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ЙОГУРТА ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ НАПРАВЛЕННОСТИ С ПОНИЖЕННОЙ АЛЛЕРГЕННОСТЬЮ БЕЛКОВ

МОЛОКА

Специальность 05.18.04 - технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

^ДПГ 2015

Москва 2015 005561583

005561583

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности» (ФГБНУ «ВНИМИ»)

доктор технических наук, профессор, академик РАН Харитонов Владимир Дмитриевич Антипова Татьяна Алексеевна

доктор биологических наук, доцент Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт детского питания»,

главный научный сотрудник отдела аграрно-пищевых и частных технологий

Серба Елена Михайловна

кандидат технических наук, доцент Федеральное государственное бюджетное научное учреждение

«Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии»,

старший научный сотрудник отдела биотехнологии ферментов, дрожжей, органических кислот и биологически активных добавок

Ведущая организация: Федеральное государственное автономное

образовательное учреждение высшего

профессионального образования «СевероКавказский федеральный университет»

Защита диссертации состоится « /5"» ОкТЯ^рЯ- 2015 г. в часов на заседании диссертационного совета ДМ 0d6.021.01 при Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский институт мясной промышленности им. В.М. Горбатова» по адресу: 109316, г. Москва, ул. Талалихина, 26.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБНУ «ВНИИМП им. В.М. Горбатова» и на сайте www.vniimp.ru.

Автореферат разослан « /в » 6'КГЦ Г Т ¿с. 2015 г.

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат технических наук старший научный сотрудник

У

А.Н.Захаров

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы.

В настоящее время в связи с ухудшением социально-экономических условий, нестабильной экологической обстановкой и несбалансированным питанием возрастает потребность в доступных функциональных продуктах, снижающих риск развития многих заболеваний и оказывающих благоприятное воздействие на здоровье. На сегодняшний день рынок йогуртов является одним из перспективных в области здорового питания. Потребление молока и молочных продуктов в России на душу населения в 2013 году возросло по сравнению с 2012 годом на 3,3 % и составило в среднем около 250 кг при рекомендуемой норме 340 кг. При этом объем производства йогурта в тот же год увеличился на 5,8 % и остается востребованным по настоящее время, несмотря на кризисное состояние традиционных кисломолочных продуктов. Потребление йогурта способствует ряду позитивных эффектов, среди которых отмечаются как иммуномодулирующее, так и гипотензивное действие за счет молочных пептидов, образованных в процессе сквашивания. Тем не менее, примерно для 15 % детей и 4% взрослых в России белки молока являются причиной развития аллергической реакции за счет наличия в их структуре антигенных участков — эпитопов, из-за чего возникает необходимость отказа от молочных продуктов.

Наиболее эффективным способом снижения антигенности молочных белков является их ферментативная конверсия, или гидролиз, который приводит не только к расщеплению антигенных детерминант, но также и к увеличению числа функциональных групп, способных к ионизации, а также воздействию гидрофобных поверхностей, которые определяют биологические эффекты пептидов.

Влияние функциональных свойств белков и их гидролизатов на аллергенность молочных продуктов рассмотрено в работах Боровик Т.Э., Королевой О.В., Круглика В.И., Лусс Л.В., Ревякиной В.А., Харитонова В.Д., ЭггаЬа В., Мопас1 Ь., КиНег В., Р1оссЫ А. Разработкам молочных продуктов с

3

различными функциональными свойствами посвятили свои научные труды такие учёные, как Бельмер C.B., Доронин А.Ф., Семенихина В.Ф., Тамим А.Й, Тихомирова H.A., Шендеров Б.А., Chobert J., Gagnaire V., Makino S., Parvez S.

Разработка йогурта с использованием гидролизованных молочных пептидов позволит получить функциональный продукт с пониженной аллергенностью на молочные белки, потребление которого также будет способствовать профилактике артериальной гипертонии за счет наличия биологически активных пептидов, обладающих гипотензивной активностью. Цель и задачи.

Целью работы являлось создание технологии йогурта функциональной направленности для диетического профилактического питания, основанной на использовании короткоцепочечных молочных пептидов, предназначенного для снижения риска развития аллергических реакций на белки молока.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- провести оптимизацию условий проведения ферментативной конверсии молочных белков с целью получения функционального пищевого ингредиента (ФПИ) с пониженной антигенностью профилактической направленности;

- доказать эффективность потребления ФПИ, в частности наличие биологически активных пептидов после переваривания на модельной системе желудочно-кишечного тракта;

- установить степень влияния ФПИ на остаточную антигенность, структурно-механические характеристики и органолептические показатели йогурта функциональной направленности;

- установить зависимость реологических, органолептических, физико-химических и микробиологических характеристик молочного сгустка от режимов проведения ультрафильтрации;

- провести исследование in vivo по оценке аллергенности разработанного ФПИ и йогурта функциональной направленности на его основе;

— разработать технологию и комплект технической документации на йогурт

функциональной направленности для диетического профилактического

питания и провести его промышленную апробацию.

Научная новизна.

Доказано наличие биоактивных пептидов после переваривания гидролизата сывороточных белков на модельной системе желудочно-кишечного тракта.

Установлена зависимость проницаемости мембранного элемента и кислотообразующей активности заквасочных культур от температуры проведения процесса ультрафильтрации молочно-пептидного сгустка.

Установлены зависимости реологических характеристик, физико-химических и микробиологических показателей йогурта функциональной направленности от режимов проведения ультрафильтрации.

Практическая значимость.

Разработан технологический процесс получения йогурта функциональной напрвленности с использованием гидролизата молочной сыворотки. Разработан и утвержден комплект ТД (ТУ 9222-538-00419785-14, ТУ ТИ) на йогурт для диетического профилактического питания. Осуществлен выпуск опытной партии продукта на ООО «Южский Молочный Завод».

Получен патент: «Способ получения низкогидролизованной пептидной композиции из белков молочной сыворотки» №2013126576/10 (039456) от 11.06.2013.

Диссертационная работа выполнена соискателем лично, включая анализ литературных источников, постановку проведения исследований, получение и обобщение теоретических и экспериментальных данных, формулирование основных результатов и выводов. Соавторство по ряду этапов отражено в списке публикаций и патенте.

Апробация работы.

Основные положения и результаты работы были обсуждены в рамках 6-ой

Конференции молодых ученых и специалистов институтов Отделения хранения и

переработки сельскохозяйственной продукции Россельхозакадемии

5

«Фундаментальные основы и передовые технологии в пищевой и перерабатывающей промышленности», ГНУ ВНИИКОП Россельхозакадемии, г. Видное, 2012; VII научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Отделения хранения и переработки сельскохозяйственной продукции Россельхозакадемии «Научный вклад молодых ученых в развитие пищевой и перерабатывающей промышленности АПК», г. Москва, 2013; Пленарном заседании VI Всероссийского форума молодых ученых и студентов «Дни студенческой науки», г. Москва, 2014 г.; Всероссийской научно-практической конференции «Пути интенсификации производства и переработки сельскохозяйственной продукции в современных условиях. Переработка сельскохозяйственного сырья и пищевых продуктов», г. Волгоград, 2014; VIII Международной конференции молодых ученых и специалистов «Фундаментальные и прикладные исследования по безопасности и качеству пищевых продуктов», ВНИИТеК, 2014. Получена золотая медаль на Всероссийском смотре-конкурсе лучших инновационных разработок 5-6 июня 2014 года, г. Волгоград «За инновационные разработки технологий высококачественных молочных продуктов».

Публикации.

По теме диссертационной работы опубликовано 14 печатных работ, из которых 3 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 1 патент.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, экспериментальной части, основных результатов и выводов, списка использованной литературы, содержащего 147 отечественных и зарубежных источников и приложений. Работа изложена на 148 страницах, включает 40 таблиц, 19 рисунков и 8 приложений.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность предлагаемой работы, показана необходимость проведения исследований в области диетического профилактического питания на основе традиционных молочных продуктов с

6

целью предупреждения различных заболеваний, изложены научная новизна, практическая значимость, сформулирована цель исследований и поставлены задачи.

В первой главе проведен анализ состояния вопроса непереносимости молочных белков, в том числе при пищевой аллергии. Из зарубежных баз данных установлены основные аллергены молока и молочной сыворотки. Изучены научные труды отечественных и зарубежных авторов о биологических свойствах молочных пептидов и их применении в технологии функционального питания. Рассмотрены особенности получения традиционного кисломолочного продукта -йогурта, в том числе изучены возможности применения баромембранных технологий.

На основании проведенного обзора литературных источников сформулированы основные направления исследования по разработке йогурта функциональной направленности с применением баромембранных технологий при использовании в качестве основного компонента, определяющего функциональные свойства - гидролизованные молочные белки. Определена цель работы и поставлены соответствующие задачи.

Во второй главе изложена организация экспериментов, объекты и методы исследований. Схема проведения исследований представлена на рис. 1.

Основной блок экспериментальных работ выполнен в ФГБНУ «ВНИМИ». Изучение условий процесса ферментативной конверсии сывороточных белков, а также биологических эффектов молочных пептидов in vitro и in vivo проводилось в ФГБУН Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Провести анализ научно-технической и патентной литературы, определить цель и

поставить задачи

Фермент-субстратное соотношение

Температура

Продолжительность ФК

*-

3 3 1 £

*- a s a S.

Л « ¡S с

Исследовать и оптимизировать

процесс ферментативной конверсии (ФК) белков молочной сыворотки

<D

s -

it H

S i¿

Степень гидролиза

Содержание свободных аминокислот

Остаточная антигенность

Идентифицировать биоактивные пептиды in vitro в гидролизате молочной сыворотки

Пептиды с гипотензивным действием

Пептиды с антиоксидантной активностью + -

Оценить степень усвояемости in vitro биоактивных пептидов на модельной системе

желудочно-кишечного тракта »

Разработать функциональный кисломолочный продукт йогурт на основе функционального пищевого ингредиента - гидролизата молочной сыворотки (ФПИ)

£

s

s

м

S

Соотношение заквасочных культур Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus и Streptococcus thermophiles

Продолжительность сквашивания

Массовая доля внесения ФПИ

s s ь &

H

Остаточная антигенность

Органолептические показатели

Физико-химические показатели

Структурно-механические характеристики

Исследовать процесс ультрафильтрации на этапе формирования молочно-пептидного

сгустка

ai -а

2 &

ОС

о СЗ

s ^

Продолжительность сквашивания

Продолжительность концентрирования

Температура концентрирования

Тестирование аллергенности молочных пептидов in vivo

Исследовать показатели качества готового продукта

Разработать и утвердить ТД; выработать опытную партию йогурта

Рисунок 1 - Схема проведения исследований 8

Исследования осуществлялись в рамках Федеральной целевой программы «Разработка новых биотехнологических методов повышения функциональных свойств и контроля качества кисломолочных продуктов» (шифр заявки «2013-1.214-512-0013»), а также в ходе реализации Государственного контракта Министерства образования и науки РФ № 12.527.11.0008 по теме: «Разработка технологии получения гипоаллергенных функциональных молочных продуктов».

Промышленная апробация технологии ферментативного гидролиза проводилась на ОАО Молочный комбинат «Воронежский».

Объектами исследований в работе являлись: сыворотка молочная подсырная ГОСТ Р 53438-2009; ферментные препараты сериновая эндопротеиназа Alcalase 2.4L, нейтральная протеаза Protamex (Novozymes, Дания); гидролизованный ультрафильтрационный концентрат молочной сыворотки (ФПИ); заквасочные культуры Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus штамм J1 37/7 и Streptococcus thermophilus штамм 6 КБ; кисломолочный продукт йогурт.

Для проведения стендовых испытаний была использована ультрафильтрационная пилотная установка AL 362.00.00.01 и гидродинамический смеситель-диспергатор ГИД 170/70.

Измерения физико-химических показателей образцов сухой и восстановленной подсырной сыворотки и продуктов ее концентрирования, а также опытных образцов йогуртов осуществляли по следующим стандартам: отбор проб и подготовка их к испытанию - ГОСТ 3622-68, определение массовой доли жира - ГОСТ 5867-90, определение массовой доли белка методом Кьельдаля - ГОСТ Р 53951-2010; определение массовой доли сывороточных белков методом Кьельдаля - ГОСТ Р 54756-2011; определение массовой доли лактозы - ГОСТ 51259-99; определение массовой доли влаги и сухого вещества - ГОСТ 3626-73; определение массовой доли углеводов - ГОСТ Р 54667-2011; определение кислотности - ГОСТ Р 54669-2011; определение рН - ГОСТ Р 53359-2009; определение активности щелочной фосфатазы - ГОСТ Р 52996-2008.

Измерения микробиологических показателей опытных образцов йогуртов осуществляли по следующим стандартам: определение количества молочнокислых микроорганизмов и бактерий группы кишечных палочек - ГОСТ Р 53430-2009; выявление и определение количества бактерий вида Escherichia coli - ГОСТ 30726-2001; определение Staphylococcus aureus - ГОСТ 30347-97; определение патогенных микроорганизмов, в том числе сальмонелл - ГОСТ Р 52814-2007, ГОСТ 31659-2012; определение дрожжей и плесневых грибов - ГОСТ 10444.12-88; выявление и определение количества бактерий Listeria monocytogenes - ГОСТ Р 51921 -2002.

Анализ органолептических показателей экспериментальных партий йогуртов проводили в соответствии с ГОСТ Р 53438-2009.

Молекулярно-массовое распределение полученных гидролизатов белков молочной сыворотки оценивали методом гель-проникающей хроматографии, степень гидролиза (СГ) определяли спектрофотометрическим методом согласно методике Spencer J. F. Т., содержание свободных аминокислот (САК) в гидролизатах определяли спектрофотометрическим методом, остаточную антигенность (OA) определяли методом конкурентного непрямого иммуноферментного анализа, анализ пептидного профиля осуществляли методом гель-проникающей хроматографии с последующей обращено-фазовой хроматографией с детекцией методом масс-спектрометрии ионно-циклотронного резонанса; тестирование антиоксидантной емкости in vitro оценивали по отношению к пероксильному радикалу; тестирование гипотензивной активности in vitro основывалось на спектрофлуориметрическом методе тестирования активности АПФ с использованием субстрата с внутренним тушением флуоресценции; определение титров аллергенспецифических IgG антител к ß-ЛГ коровьего молока в сыворотке крови осуществляли методом иммуноферментного анализа; структурно-механические характеристики определяли на ротационном вискозиметре «Реотест-2».

Обработку массивов экспериментальных данных проводили при помощи прикладных сервисных программ Microsoft Office Excel 2010 и Statistiea 8.0.

10

В третьей главе изложены экспериментальные исследования.

Разработка и оптимизация процесса получения функционального пищевого ингредиента — гидролизата молочных белков

Получение гидролизата сывороточных белков молока включало следующие операции: восстановление сухой подсырной сыворотки, ультрафильтрационное концентрирование восстановленной сыворотки, проведение ферментативного гидролиза полученного концентрата молочной сыворотки.

Концентрирование молочной сыворотки проводили при температуре (20±1)°С, давлении на входе и выходе из мембранного модуля 0,51/0,44 МПа. Объемный фактор концентрирования составил 3,8. Содержание белка в концентрате возросло в 3,6 раза по сравнению с исходной сывороткой и составило 3,5 %, в том числе содержание аллергенного р-лактоглобулина составило 6,94 мг/мл.

Для оптимизации условий проведения ферментативной конверсии концентрата молочной сыворотки ферментными препаратами А1са1азе 2.4Ь и РпЛатех с целью получения функционального пищевого ингредиента (ФПИ) с привлекательными органолептическими характеристиками без выраженного горького привкуса, с пониженной антигенностью по р-лактоглобулину (менее 0,1 %), минимальным содержанием свободных аминокислот, степенью гидролиза 520% и комплексом биологически активных пептидов (БАП) прибегали к методике полнофакторного эксперимента (рисунок 2).

По итогам полнофакторного эксперимента установлены следующие оптимальные условия проведения ферментативной конверсии: продолжительность гидролиза 90 мин; доза ферментного препарата А1са1аБе 2.4Ь 0,5% от содержания белка в сырье; доза ферментного препарата Рго1атех 3,5% от содержания белка в сырье; температура процесса (50±1) °С; начальная величина активной кислотности при температуре ферментативной конверсии - (7,00±0,02) ед. рН; проведение гидролиза в условиях нестатичного рН; продолжительность инактивации ферментов и пастеризации - 10 мин; температура инактивации ферментов и пастеризации - (80-84) °С; температура охлаждения ФПИ - (30±2) °С; доохлаждение ФПИ до температуры (4-6) °С.

11

а) б) в)

Рисунок 2 - Зависимости степени гидролиза (а), содержания САК (б) и ОА гидролизатов молочной сыворотки (в) от различных соотношений ферментных препаратов А1са1аБе 2.4Ь и Рго1ашех Физико-химические показатели полученного ФПИ в сравнении с исходным УФ-концентратом представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Физико-химические показатели гидролизата молочной сыворотки

Наименование показателя УФ-концентрат ФПИ

Содержание Р-лактоглобулина, мг/мл 6,93 0,015

Массовая доля жира, % 0,3 0,3

Массовая доля сухих веществ, % 10,36 10,46

Массовая доля общего белка, % 3,5 3,5

Массовая доля общего азота, % 0,558 0,558

Массовая доля небелкового азота, % 0,0585 0,31

Массовая доля лактозы, % 4,89 зд

Активная кислотность, ед. рН 6,13 6,34

Остаточная антигенность по (З-лактоглобулину, % 12,57 0,04

Как видно из представленных данных (таблица 2), образец ФПИ и исходный УФ-концентрат характеризовались содержанием белка на уровне 3,5%. При этом остаточная антигенность в ФПИ снизилась больше чем в 300 раз и составила 0,04%.

Идентификация биологически активных пептидов in vitro, полученных в результате ферментативной конверсии, и оценка степени их устойчивости на модельной системе желудочно-кишечного тракта

Для идентификации in vitro в разработанном ФПИ биологически активных пептидов с гипотензивной и антиоксидантной активностями, а также оценки устойчивости полученных пептидов к действию пищеварительных ферментов (пепсин, трипсин+ химотрипсин), ФПИ был подвергнут гидролизу в условиях,

моделирующих процесс переваривания в желудочно-кишечном тракте с последующим анализом пептидного профиля полученного гидролизата (ФПИп) и исходного ФПИ.

Анализ последовательностей идентифицированных пептидов с помощью базы данных ВюРер (www.uwm.edu.pl/biochemia) позволил установить наличие в составе образца ФПИп 530 фрагментов антиоксидантных пептидов, что в 1,65 раза больше, чем в исходном гидролизате сывороточных белков. Сравнительные данные по гипотензивным пептидам и их фрагментам, идентифицированным в ФПИ и ФПИп, представлены в таблице 2. Таблица 2 - Сравнение пептидных профилей ФПИ и ФПИп

Пептиды, идентифицированные в ФПИ Соответствующие пептиды по данным литературы, обладающие гипотензивной активностью 1С50, мкМ Пептиды ФПИп, совпадающие с ФПИ Анализ переваривания ФПИ в ЖКТ т 5Шсо

РРУАРРРЕ, УАРИРЕ, РУАРРРЕ РРУАРРРЕУРОК 18,00 -

ЬУУРРРСР, УУРГРСР^ ЦУУРРРОР1РК5ЬРС!№РР 5,30 ЬУУРРРОР УУРРРОР1РЫ УУРРРСР

ЬУУРРРСР1Р -

игсгтру М1РРЦГС>ТРУ 173,00 ЬТОТРУ -

1РРЬТ<ЗТРУ, МРРЬТСгТР, 1РР1.Т(ЗТР -

УУРРРйР УУРРРОР! 500,00 уурррар -

5КУУРРРОР1 1,70 -

УУУРРРЬ трууурррьс;р 749,00 УУУР1^ -

УУРРР УУРРР УУРРР

УУУРРР УУУРРР УУУРРР

ТРУУУРРР ТРУУУРРР -

УУРРРЬ - -

рАсгтсзз расяс^УУР 25,00 - -

LHLPL.PL ЬНЬРЬРЬ 432,70 - -

БАРЬЯ, ЬОА(35АР1К, ОАОЗАРЬИ ЬОАОБАРЬК 635,00 - -

УАОТ\У VAGTW 534,00 УАОТ\У -

ьшсгк ьшок 17,00 1Л31(5К

УЬОТБУК УЬЭТОУК 946,00 - -

АЬРМН!, АЬРМШЯ АЬРМНЖ 43,00 - -

Два из 6 гипотензивных пептида, и 8 из 20 фрагментов гипотензивных пептидов, представленные в базе данных Вюрер, присутствующие в ФПИ, были обнаружены в ФПИп (таблица 2). 1п зШсо анализ на сервере

PeptideCutter ExPASy последовательностей гипотензивных пептидов и их фрагментов показал, что три пептида, идентифицированные в ФПИп, были получены в результате воздействия на соответствующие пептиды исходного гидролизата ферментов желудочно-кишечного тракта (таблица 3). При этом наиболее выраженным АПФ-ингибирующим действием обладали пентапептид LDIQK и гептапептид ALPMHIR, поскольку они имеют наименьшее значение концентрации полумаксимального ингибирования IC50, равное 17 и 43 мкМ соответственно, а также фрагменты гипотензивных пептидов VYPFPGPIPN, LVYPFPGP (ICso- 5,30), VYPFPGP (ICS0- 7).

Таким образом, по результатам проведенного in vitro исследования было установлено, что биологические эффекты разработанного гидролизата молочной сыворотки сохраняются после переваривания. Доказанное условие стало основанием для разработки йогурта функциональной направленности с использованием гидролизата молочной сыворотки.

Разработка йогурта с использованием функционального пищевого ингредиента

С целью оценки зависимости кислотообразующей активности заквасочных культур Lactobacillus bulgaricus штамм JI 37/7 и Streptococcus thermophilus штамм 6 КБ от их соотношений были исследованы три модельные системы йогурта без использования ФПИ (таблица 3). Модельные системы (МС) представляли собой заквашенную нормализованную смесь без стабилизирующих агентов и сухого молока. В качестве сырья при выработке йогуртов использовалось нормализованное молоко жирностью 1,5% с температурным режимом пастеризации (85±1) °С с выдержкой 15 минут. Сквашивание проводилось при температуре (42±0,5) °С.

Органолептическая оценка исследуемых МС показала, что повышение доли штамма Л 37/7 способствует чрезмерному кислотообразованию и появлению постороннего привкуса. Наилучшим соотношением заквасочных культур обладала модельная система с соотношением штаммов JI 37/7 и 6 КБ — 1/3, на

основании чего дальнейшие исследования по разработке йогурта с ФПИ проводились с выбранным соотношением.

Таблица 3 - Модельные системы йогуртов с различным соотношением

заквасочных культур

Модельные системы йогурта /

Наименование сырья соотношение Л 37/7 и 6 КБ

1 2 3

1/4 1/3 1/2

Молоко нормализованное с массовой долей жира 1,5 % 95,0 95,0 95,0

Заквасочная культура Л 37/7 1 1,25 1,66

Заквасочная культура 6 КБ 4 3,75 3,3

Итого 100,0 100,0 100,0

Продолжительность сквашивания, мин 261 244 200

Активная кислотность, ед. рН 4,59 4,57 4,58

Установлена степень влияния ФПИ на остаточную антигенность, структурно-механические характеристики и органолептические показатели йогурта. Анализ остаточной антигенности показал, что при внесении в рецептуру йогурта 30 % ФПИ и более данный показатель снижается более чем в 40 раз по сравнению с контролем и достигает требуемого значения менее 0,1 % (таблица 4). Таблица 4 — Зависимость остаточной антигенности йогуртов от количества внесенного ФПИ

Наименование показателя Количество ФПИ, вносимого в рецептуры йогуртов, %

0 10 20 30 40 50 60

Массовая доля белка, % 2,9 2,97 3,1 3,12 3,18 3,22 3,26

Содержание р-лактоглобулина, мг/мл 0,00427 0,00354 0,00409 0,000088 Менее 0,00001 Менее 0,00001 Менее 0,00001

Остаточная антигенность 0,14 0,12 0,10 0,003 Менее 0,001 Менее 0,001 Менее 0,001

Конечная активная кислотность, ед. рН 4,59 4,60 4,58 4,56 4,58 4,56 4,57

Конечная титруемая кислотность, °Т 86 84 86 88 86 88 88

Продолжительность сквашивания, мин 180 180 180 190 213 240 270

Установлено, что с увеличением доли ФПИ в образцах йогуртов возрастал

период формирования молочно-пептидного сгустка и нарастания кислотности

(рисунок 3). При этом повышение доли ФПИ также способствовало появлению постороннего привкуса и формированию тянущейся консистенции. В процессе сквашивания в опытных образцах 6 и 7 наблюдалось отделение сыворотки, в образце 7 сгусток не образовался и в дальнейшем не исследовался.

Продолжительность процесса, мин п 0% ФПИ ■ 10% ФПИ * 20% ФПИ о зо% ФПИ « 40% ФПИ • 50% ФПИ

Исследуемые образцы доля ФПИ, % Уравнение и величина достоверности аппроксимации

№ 1 0 у = 7Е-08х3 - 2Е-05х- - 0,0072х + 6,1922; R2 = 0,9949

№2 10 у = 7E-08xJ - 2Е-05х2 - 0,006х + 6,1678; R2 = 0,9972

№3 20 у = 7E-08xJ - ЗЕ-05х2 - 0,0048х + 6,153; R2 = 0,9978

№4 30 у = 1 E-07xJ - 4Е-05х2 - 0,0028х + 6,13 81; R2 = 0,999

№5 40 у = lE-07xJ - 5Е-05х' - 0,0008х + 6,1325; R2 = 0,999

№6 50 у = 1 E-07xJ - 6Е-05х" + 0,0008х + 6,1215; R2 = 0,9991

Рисунок 3 — Кислотообразующая активность штаммов заквасочных культур

Анализ структурно-механических и тиксотропных характеристик исследуемых образцов йогурта показал, что наилучшими вязкостными показателями в сравнении с контрольным образцом обладал йогурт с 10% ФПИ, а наихудшими - образец с 40 % ФПИ (рисунок 4).

Органолептическая оценка показала, что опытные образцы йогуртов, содержащие 40% ФПИ и более, имели ярко выраженный специфический вкус и посторонний привкус, неприемлемые с точки зрения дальнейшего использования в профилактическом питании. В то же время данные по антигенности, представленные в таблице 4, позволили продолжить работу над созданием

продукта на основе образца йогурта, содержащего 30 % ФПИ.

16

4500 £ 4000 3500

го

в 3000

ъ

и 2500

н

С 2000

| 1500 ё

й 1000 | 500

и п С 0

0 10 20 30 40 50 Массовая доля ФПИ в опытных образцах йогурта, %

б)

4204.81

3061,515

-2191.203 И Ц И2361'55

У

№ экспериментального образца Уравнение, величина достоверности аппроксимации

1 у = 241,64х Я2 = 0,9853

2 у = 214,82х-°'М1 Я2 = 0,981

3 у= 159,94х'у-да Я2 = 0,9774

4 у = 97,133х'"'зю Я2 = 0,9953

5 у = 48,895х"ил44 Я2 = 0,9973

6 у = 42,652х"и,з№ Я2 = 0,9784

Рисунок 4 - а) структурно-механические характеристики и б) тиксотропные свойства образцов йогуртов с различным содержанием ФПИ Для улучшения органолептических показателей и усиления структурно-механических характеристик без внесения стабилизирующих добавок и сухого молока в разрабатываемой технологии йогурта с ФПИ, а также повышения его функциональности, был применен процесс ультрафильтрации на этапе формирования молочно-пептидного сгустка.

Для оценки степени влияния ФПИ на кислотообразующую активность заквасочных культур в процессе УФ-концентрирования экспериментального образца с ФПИ (ЭО 1) параллельно был исследован экспериментальный образец без ФПИ (ЭО 2). В качестве контролен для экспериментальных образцов были исследованы образцы с аналогичными рецептурами, но не подвергнутые концентрированию (таблица 5).

Наименование компонентов Содержание компонентов, г на 100 г

Исследуемые образцы йогуртов

ЭО 1 КО 1 Э0 2 КО 2

Молоко нормализованное с массовой долей жира 1,5 % 65,0 65,0 95,0 95,0

Гидролизат молочной сыворотки (ФПИ) 30,0 30,0 0,0 0,0

Закваска 5,0 5,0 5,0 5,0

Итого 100,0 100,0 100,0 100,0

УФ-концентрирование да нет да нет

Графическая иллюстрация зависимостей кислотообразующей активности заквасочных культур от наличия ФПИ представлена на рисунке 4.

Продолжительность процесса, мин Продолжшельностьпроцесса.мин

• Удельная скорость фильтрации * Активная кислотность • Удельная скорость фильтрации »Активная кислотность

а) экспериментальный образец 1 б) экспериментальный образец 2

Рисунок 4 — Влияние внесения ФПИ в процессе УФ-концентрирования на

кислотообразующую активность заквасочных культур

Установлено, что активная кислотность в процессе концентрирования

нарастала быстрее на 11 минут в ЭО 2 и достигла требуемого значения (4,58±0,05)

ед. рН за 46 минут. При этом объемный фактор концентрирования (Фк)

исследуемого образца составил 1,83 и был меньше, чем при концентрировании

ЭО 1 (Фк = 2,54), что говорит о более высокой производительности установки. По

окончании процесса фильтрации полученные концентраты были охлаждены до

температуры (4±2) °С и выдержаны 2 часа для формирования структуры.

В результате исследований были подобраны режимы для сквашивания и

последующего УФ-концентрирования молочно-пептидного сгустка:

продолжительность сквашивания при (42±0,5) °С до достижения активной

18

кислотности (4,9±0,02) ед. рН - 3 часа, температура УФ-концентрирования (40±0,5) °С, продолжительность концентрирования до достижения активной кислотности (4,58±0,02) ед. рН - 1 час, объемный фактор концентрирования - 2,54.

Массовая доля белка в ЭО 1 увеличилась в 1,45 раза по сравнению с соответствующим контролем и составила 5,28 %, при этом величина остаточной антигенности осталась низкой - 0,09 %. Массовая доля белка в ЭО 2 также возросла по сравнению с соответствующим контролем, при этом также возросла остаточная антигенность. В то же время количество молочнокислых микроорганизмов в экспериментальных образцах возросло на порядок и составило 2,5-109 КОЕ/г. Результаты структурно-механических характеристик и тиксотропных свойств экспериментального образца йогурта с ФПИ в процессе хранения представлены на рисунке 5.

Исследование вязкостных характеристик ЭО 1 проводилось на 1 и 2 сутки, далее в период с 5 по 14 сутки с интервалом в 3 дня. В процессе хранения йогурта показатели вязкости незначительно снижались, на 11 и 14 сутки отмечено снижение вязкостных характеристик на 33 %. Также установлено, что с восьмых суток хранения повышалась степень тиксотропности, тем не менее, сопоставляя данные по структурно-механическим характеристикам йогурта можно заключить, что на 11 и 14 дни хранения исследуемый экспериментальный образец имел более низкие показатели вязкости (рисунок 5 а) по сравнению с начальным периодом, из-за чего степень тиксотропности имела также низкие значения.

Таким образом, на основании проведенного анализа структурно-механических и тиксотропных характеристик можно заключить, что экспериментальный образец йогурта с ФПИ, прошедший УФ-концентрирование, сохранял стабильную консистенцию в течение 8 суток.

Продолжительность хранения, сут Уравнение, величина достоверности аппроксимации

1 у= 14К68х-°-Ь1<' R2 = 0,9984

2 у- 167,18хи-ьу' R2 = 0,9906

5 у= 155,61х"и-УЛ R2 = 0,9899

8 у= 143,65Х""'',8& R2 = 0,9883

11 у=112,12х-°>у R2 = 0,9961

14 у= Ш^бх-"'3"; R2 = 0,9971

Рисунок 5 - Изменения структурно-механических характеристик (а) и тиксотропных свойств (б) экспериментального образца с ФПИ в процессе

хранения

Тестирование аллергенности молочных пептидов йогурта in vivo

Для проведения in vivo экспериментов по оценке аллергенности разрабатываемого функционального пищевого ингредиента - гидролизата сывороточных белков и йогурта функциональной направленности были использованы норвежские коричневые крысы (Brown Norway rats).

В эксперименте участвовало 5 групп по 10 самцов крыс с начальной массой 400±12 г (таблица 6). Ежедневно каждой группе вводилось внутрижелудочно заданное количество исследуемого продукта.

Номер группы Продукт Массовая доля общего белка, % Масса вводимого продукта на 1 крысу (400 г), г

1 Питьевая вода - 0,5

2 Молочная основа 2,92 0,7

3 Гидролизат сывороточных белков (ФПИ) 3,5 0,5

4 Йогурт с ФПИ, не подвергнутый УФ-концентрированию 3,64 0,5

5 Йогурт с ФПИ, подвергнутый УФ-концентрированию 5,28 0,4

Средние значения титра 1§С2а антител в образцах крови животных, специфичных к р-лактоглобулину (Р-ЛГ), представлены в таблице 7. Таблица 7 - Результаты тестирования показателей аллергенности исследуемых

продуктов

Номер группы Среднее значение титра ^С2а

1 55,4758

2 150,3069

3 84,7048

4 58,0951

5 64,4697

Установлено, что в опытной группе животных 2, которым вводили молочную основу, по сравнению с контрольной группой 1 значение титра 1§С2а было выше почти в 3 раза и составило 150,3069. В опытной группе 3, животным которой вводили гидролизат молочной сыворотки, значение титра 1§С2а также оказалось выше, чем в контрольной группе, и составило 84,7048. Значение титров 1§02а в группах 4 и 5, животным которых вводили образцы йогуртов до и после концентрирования, незначительно превышали значение титра в контрольной группе 1и составляли 58,0951 и 64,4697 соответственно. При этом отмечается, что значение титра 1§С2а в группах крыс 4 и 5 ниже, чем в группе 3, животным которой вводили гидролизат, что предположительно обусловлено тем, что в процессе сквашивания йогурта происходит частичное расщепление белка и, как следствие, снижение антигенности.

Таким образом, результаты проведенного исследования in vivo по оценке аллергенности ФПИ и йогурта с ФПИ, подвергнутого УФ-концентрированию, подтвердили, что исследуемые продукты обладают пониженной антигенностью. Основные результаты работы и выводы

1. Оптимизированы условия процесса ферментативной конверсии ультрафильтрационного концентрата сывороточных белков для получения ФПИ со сниженной антигенностью: продолжительность гидролиза 90 мин, температура процесса 50 °С, доза ферментного препарата Alcalase 2.4L 0,5 % от содержания белка в сырье, доза ферментного препарата Protamex 3,5 % от содержания белка в сырье, начальная величина активной кислотности при температуре ферментативной конверсии -(7,00±0,02) ед. рН.

2. Доказана эффективность потребления ФПИ наличием биологических эффектов в опытах in vitro, показано наличие пептидов, обладающих гипотензивным действием и антиоксидантной активностью. Установлено, что биологические эффекты сохраняются в условиях, моделирующих процесс переваривания в желудочно-кишечном тракте.

3. Установлена степень влияния ФПИ на остаточную антигенность, структурно-механические характеристики и органолептические показатели йогурта. Показано, что при внесении 30 % ФПИ в рецептуру йогурта достигается требуемая остаточная антигенность менее 0,003%; отсутствие горечи во вкусе, приемлемые реологические характеристики.

4. Установлено, что при УФ-концентрировании молочно-пептидного сгустка с повышением температуры до (40±0,5) °С улучшается производительность процесса, достигается необходимая величина активной кислотности - (4,58±0,02) ед. рН, на порядок повышается содержание молочнокислых микроорганизмов. При внесении ФПИ улучшаются органолептические и реологические показатели продукта.

5. Проведено исследование in vivo по оценке аллергенности разработанного ФПИ и функционального кисломолочного продукта йогурта на его основе в сравнении с питьевой водой, молочной основой и йогуртом, не подвергнутом

22

концентрированию. Показано снижение антигенности йогурта, как не подвергнутого (титр = 58,0951), так и подвергнутого УФ-

концентрированию (титр ^С2а = 64,4697) в сравнении с молочной основой (титр ДОга = 150,3069) и ФПИ (титр 1ёС2а = 84,7048).

6. Разработаны режимы получения йогурта функциональной направленности с использованием ФПИ: продолжительность сквашивания при (42±0,5) °С 3 часа, температура УФ-концентрирования (40±0,5)°С, продолжительность концентрирования 1 час, объемный фактор концентрирования - 2,54. Разработан и утвержден комплект ТД (ТУ, ТИ ТУ 9222-538-00419785-14 «Йогурт для диетического и профилактического питания»). Проведено промышленное внедрение на ООО «Южский Молочный Завод». По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Харитонов, В.Д. К вопросу о перспективных направлениях борьбы с аллергией [Текст] / В.Д. Харитонов, В.Г. Будрик, Е.Ю. Агаркова, С.Г. Ботина, К.А. Березкина, А.Г. Кручинин, А.Н. Пономарев, Е.И. Мельникова // Техника и технология пищевых производств. - Кемерово: - 2012. - № 4. - С. 3-6.

2. Березкина, К.А. Аспекты методов воздействия на белковые компоненты вторичного молочного сырья для создания функциональных молочных продуктов [Текст] / К.А. Березкина, Е.Ю. Агаркова, В.Г. Будрик, А.Г. Кручинин // Научное обеспечение молочной промышленности. Сб. научн. трудов. ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии. - М.: Интеллект-Центр. - 2012. - С. 13-19.

3. Березкина, К.А. Анализ условий проведения ферментативного гидролиза молочных белков [Текст] / К.А. Березкина, Е.Ю. Агаркова, А.Г. Кручинин, В.Г. Будрик // Сб. мат. юбилейной X научн.-практич. конф. с междунар. участием «Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты», конференции молодых ученых «Инновационные технологии продуктов здорового питания». - М.: МГУПП. - 2012. - С. 81-83.

4. Королева, О.В. Функциональные свойства кисломолочных продуктов с гидролизатами сывороточных белков [Текст] / О.В. Королева, Е.Ю. Агаркова, С.Г. Ботина, И.В. Николаев, Н.В. Пономарева, Е.И. Мельникова, В.Д. Харитонов,

23

A.Ю. Просеков, А.Г. Кручинин, М.В. Крохмаль, К.А. Березкина, И.В. Рожкова, Е.А. Юрова, Н.А. Жижин // Молочная промышленность. 2013. -№11. -С.52-55.

5. Березкина, К.А. Исследование и разработка модели биоконверсии молочных белков при получении гипоаллергенных функциональных продуктов [Текст] / К.А. Березкина // Научный вклад молодых ученых в развитие пищевой и перерабатывающей промышленности АПК: Сборник научных трудов 7-ой конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских институтов Отделения хранения и переработки сельскохозяйственной продукции Россельхозакадемии, 8-9 октября 2013 г. ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии, Россельхозакадемия, - Москва: Интеллект-Центр, 2013. - С. 45-48.

6. Березкина, К.А. Исследование процесса ферментативного гидролиза белков молока с целью создания гипоаллергенных молочных продуктов [Текст] / К.А. Березкина, Е.Ю. Агаркова // Липатовские чтения. Сборник научных трудов кафедры технологических машин и оборудования - М.: Изд-во РЭУ им. Г.В. Плеханова, 2014. - С. - 16-20.

7. Харитонов, В.Д. Рациональный дизайн биокаталитической конверсии молочных белков для создания продуктов со сниженной аллергенностью [Текст] / В.Д. Харитонов, В.Г. Будрик, Е.Ю. Агаркова, А.Г. Кручинин, К.А. Березкина,

B.О. Попов, О.В. Королева, И.В. Николаев, Н.В. Пономарева, Е.И. Мельникова, А.Ю. Просеков // материалы Международной научн.-практич. конф. «Биотехнология и качество жизни» 18-20 Марта 2014 г. М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2014. - С. - 334-335.

8. Березкина, К.А. Исследование процесса ферментативного катализа белков молочного сырья для создания функциональных молочных продуктов [Текст] / К.А. Березкина, Е.Ю. Агаркова, О.В. Королева, И.В. Николаев // Перспективные ферментные препараты и биотехнологические процессы в технологиях продуктов питания и кормов. Сб. научн. трудов. -М.: ВНИИПБТ, 2014. - С. 153-158.

9. Березкина, К.А. Биокаталитический подход к созданию функциональных молокосодержащих продуктов с пониженным содержанием аллергенных белков молока [Текст] / К.А. Березкина, Е.Ю. Агаркова, Н.С. Пряничникова // Пути

24

интенсификации и переработки сельскохозяйственной продукции в современных условиях. Переработка сельскохозяйственного сырья и пищевых продуктов: матер. Всероссийской науч.-практ. конф., г. Волгоград, 3-5 июня 2014 г. / под ред. академика РАН И.Ф. Горлова; д-ра биол. наук, профессора В.Н. Храмовой; ВолгГТУ,-Волгоград, 2014.-С. 144-146.

10. Березкина, К.А. Направленный ферментолиз белков молочной сыворотки [Текст] / К.А. Березкина, Е.Ю. Агаркова, В.Г. Будрик, В.Д. Харитонов, О.В. Королева, И.В. Николаев, АЛО. Просеков, Р.П. Коржов // Переработка молока. -2014. -№7.-С. 20-22.

11. Агаркова, Е.Ю. Разработка продуктов для диетического профилактического питания с пониженной антигенностью [Текст] / Е.Ю. Агаркова, К.А. Березкина, А.Г. Кручинин, В.Г. Будрик, В.Д. Харитонов, О.В. Королева, И.В. Николаев // Актуальные вопросы переработки мясного и молочного сырья. Сб. научн. трудов 2013 / РУП «Институт мясо-молочной промышленности». - Минск, 2014. - Вып. 8. - С. 74-78.

12. Агаркова Е.Ю. Проектирование протеолиза молочных белков для создания продуктов со сниженной аллергенностью [Текст] / Е.Ю. Агаркова, К.А. Березкина, А.Г. Кручинин, И.В. Николаев // Пищевые инновации и биотехнологии: Мат. межд. Научн. конф. Под общей ред. Просекова А.Ю.: ФГБОУ ВПО «Кемеровкий технологический институт пищевой промышленности». -Кемерово, 2014,- т. 1. - С. 21-23.

13. Рязанцева, К.А. Технология получения йогурта питьевого с использованием гидролизата молочных белков [Текст] / К.А. Рязанцева, Е.Ю. Агаркова, В.Г. Будрик // Фундаментальные и прикладные исследования по безопасности и качеству пищевых продуктов: Сб. науч. трудов VIII конференции молодых ученых и специалистов. - Видное, 2014. - С. 226-230.

14. Кручинин, А.Г. Творожный продукт для питания лютей с проявлением аллергии на молочные белки [Текст] / А.Г. Кручинин, Е.Ю. Агаркова, К.А. Рязанцева, О.В. Королева, Т.В. Федорова, В.Д. Харитонов, C.B. Карпычев, И.В.

Малахов // Техника и технология пищевых производств. - 2014. - № 4. - С. 126131.

15. Пат. 2531164 Российская Федерация, МПК А23Х Способ получения низкогидролизованной пептидной композиции из белков молочной сыворотки [Текст] / Королева О.В., Николаев И.В., Федорова Т.В., Агаркова Е.Ю., Ботина С.Г., Березкина К.А., Кручинин А.Г., Харитонов В.Д., Пономарева Н.В., Мельникова Е.И.; заявитель и патентообладатель Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности (1Ш). - №2013126576; заявл. 11.06.2013; опубл. 20.10.2014, Бюл. №29.-15 с.

Список сокращений, приведенных в работе

АПФ - ангиотензин I превращающий фермент; ЖКТ - желудочно-кишечный тракт; ОА - остаточная антигенность; САК - содержание свободных аминокислот; СГ - степень гидролиза; ФПИ - функциональный пищевой ингредиент; ФПИп - функциональный пищевой ингредиент, подвергнутый перевариванию на модельной системе желудочно-кишечного тракта.

Подписано в печать:

14.08.2015

Заказ № 10892 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru