автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.04, диссертация на тему:Разработка технологии синбиотического лиофилизированного бактериального препарата для производства мясных продуктов

московский ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ПРИКЛАДНОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ

На правахрукописи

ЕРШОВ ДМИТРИЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ СИНБИОТИЧЕСКОГО ЛИОФИЛИЗИРОВАННОГО БАКТЕРИАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА МЯСНЫХ ПРОДУКТОВ

Специальность 05.18.04. - Технология мясных, молочных, рыбных

продуктов и холодильных производств

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва-2004

Работа выполнена на кафедре «Технология мяса и мясопродуктов» Московского государственного университета прикладной биотехнологии.

Научный руководитель:

академик РАСХН, доктор технических наук, профессор Рогов И. А.

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор технических наук,

профессор

Ганина В. И.;

доктор технических наук, профессор Криштафович В. И.

ООО Мясоперерабатывающий завод «КампоМос».

Зяттдтта диссертации состоится 2004 г.

в />< часов на заседании диссертационного совета К 212.149.01 при Московском государственном университете прикладной биотехнологии по адресу: 109316, Москва, ул. Талалихина, 33, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУПБ.

Автореферат разослан <иУ>> г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат технических наук

Апраксина С. К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность работы. Микробиологические процессы нашли широкое распространение в различных областях народного хозяйства. Сегодня в биотехнологии видят одно из средств для преодоления продовольственных, сырьевых, энергетических и экологических проблем.

Это дополняется все возрастающими возможностями молекулярной биологии и клеточной инженерии, которые позволяют целенаправленно создавать высокопродуктивные штаммы микроорганизмов.

Производство ряда мясных продуктов, вследствие технологических особенностей, отличается длительностью и большой трудоемкостью. Поэтому в настоящее время большое значение уделяется созданию и внедрению в производство препаратов и технологий, существенно ускоряющих технологический цикл.

Исследованиями ряда ученых, в частности Рогова И. А., Билетовой Н. В., Хорольского В. В., Ганиной В. И., Крыловой В. В., Niinivaara F. P., Wegner К., Schiffner E., Hagedorn W. доказана перспективность применения стартовых культур, представляющих собой специально подобранные штаммы молочнокислых микроорганизмов и дрожжей, с целью сокращения технологического процесса и одновременного получения готового продукта со стабильными качественными показателями. В этой связи почти во всех странах мира при изготовлении сырокопченых и сыровяленых колбас применяют бактериальные препараты - жизнеспособные микроорганизмы в виде отдельных или смешанных культур.

Одним из перспективных направлений разработки новых биопрепаратов является создание пробиотиков на основе микроорганизмов с заданными свойствами, оказывающих благоприятное действие на физиологические функции и биохимические реакции организма-хозяина. Применение микроорганизмов, обладающих пробиотической активностью, целесообразно в комплексе с пребиотиками - ингредиентами пищи, которые способствуют избирательной стимуляции роста и метаболической активности групп бактерий, обитающих в кишечном тракте. Смесь пробиотиков и пребиотиков объединяют в группу синбиотиков, повышающих выживаемость бактериальных добавок в кишечнике.

В настоящее время наибольшее распространение получили бактериальные препараты, выпускаемые в сухом виде, и расфасованные в соответствующие упаковочные материалы. Комбинированные многослойные материалы, такие как целлофан-фольга-полиэтилен, целлофан-полиэтилен-фольга-полиэтилен или саран-целлофан-полиэтилен-фольга-полипропилен обладают лучшими эксплуатационными и высокими барьерными свойствами.

Наиболее распространенным в микробиологической промышленности видом сушки является лиофилизация. Преимущества лиофилизации перед другими способами обезвоживания объясняются удалением влаги при низких температурах, что практически исключает термоинактивацию продукта; лиофилизированный материал может быть с легкостью регидратирован, вследствие его пористости.

Учитывая условия шсоперераба^|й№Ц|1т^Н|в№1(№1Щ^<ю^Разным и

БИБЛИОТЕКА СИ 01

наиболее перспективным является выпуск препаратов в лиофилизированном виде. Это позволяет сохранить стабильные диагностические свойства культур в течение длительного периода времени. Кроме того, такая форма препаратов в наибольшей степени отвечает требованиям предприятий, так как обеспечивает удобство при использовании, хранении и транспортировке.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является разработка технологии синбиотического лиофилизированного бактериального препарата для производства мясных продуктов.

В соответствии с поставленной целью в ходе работы решались следующие задачи:

- изучить фенотипические и молекулярно-генетические характеристики бактериальных культур с целью их идентификации в соответствии с Международным стандартом;

- изучить плазмидный профиль для отбора штаммов со стабильными промышленно-ценными свойствами;

- провести ПЦР - диагностику, позволяющую в условиях промышленного производства контролировать чистоту используемой культуры и ее идентичность депонированной или запатентованной культуре;

- исследовать процесс замораживания клеточной суспензии;

- изучить влияние концентрации протекторных сред различного состава на устойчивость клеток микроорганизмов во время лиофилизации и последующего хранения;

- подобрать концентрацию различных добавок, входящих в состав препарата, обеспечивающих выраженный эффект стимуляции роста микроорганизмов, и определить рациональные параметры вакуум-сублимационной сушки бактериальных клеток;

- обосновать сроки хранения сухого бактериального препарата в зависимости от внешних условий;

провести комплексное исследование физико-химических, биохимических, микробиологических и органолептических показателей колбас, выработанных с использованием разработанного препарата микроорганизмов;

- разработать проект НД на бактериальный препарат.

Объекты исследований. Объектами исследований в данной работе являлись:

- различные штаммы молочнокислых микроорганизмов В-1617 и В-1618, предварительно отнесенных к Lactobacillus plantarum, дополняющие друг друга по спектру биологической активности и проявляющие пробиотические свойства; штамм денитрифицирующих бактерий В-1619, предварительно идентифицированный как Micrococcus caseolyticus из коллекции микроорганизмов кафедры «Технология мяса и мясопродуктов» Московского государственного университета прикладной биотехнологии;

- разработанный лиофилизированный бактериальный препарат, на основе композиции изучаемых штаммов и наполнителя - глюкозы в качестве пребиотика;

- сырые ферментированные колбасы, изготовленные с использованием

разработанного бактериального препарата.

Методы исследований. В работе применяли следующие методы исследований: фенотипические признаки баккультур определяли стандартными общепринятыми методами.

ДНК выделяли методом Мармура с модификациями, включающими обработку ДНК проназой (Serva) после воздействия РНКазой А и центрифугирование очищенных препаратов. Определение содержания гуанин-цитозиновых пар (GC - пар) в ДНК проводили методом оптической реассоциации (с помощью кривых термической денатурации) на спектрофотометре «Pue Unicum SP 1800» при скорости нагрева 0,5°С/мин и последующим расчетом по De Ley. Состав плазмид в штаммах микроорганизмов определяли методом электрофореза в агарозном геле.

ПЦР - диагностику осуществляли в многоканальном амплификаторе ДНК - «Терцик».

Определение выхода готового продукта - по методике, предложенной ВНИИМПом; определение массовой доли влаги - по ГОСТ 9793-74; белка - по ГОСТ 25179-90; жира - по ГОСТ 26183-84; хлористого натрия - по ГОСТ 995773; золы - методом прокаливания; величины рН - потенциометрическим методом; определение микробиологических показателей - по ГОСТ 9958-81; остаточной влажности в лиофилизированной бактериальной массе - методом высушивания при 105 °С до постоянной массы; оценка органолептических показателей - по ГОСТ 9959-91; структурно-механические показатели - на универсальной испытательной машине «INSTRON»; учет микроорганизмов — по ГОСТ 10444.15 - 94; активность свертывания молока - по методике ВНИМИ; предел кислотообразоваяия - методом титрования.

Повторность экспериментов 3-5 кратная.

Научная новизна.

Определены молекулярно-генетические характеристики: содержание GC-пар и внутриродовое сходство в полинуклеотидных последовательностях ДНК в исследуемых штаммах молочнокислых и денитрифицирующего микроорганизмов.

Установлено, что в клетках изученных штаммов кроме хромосомной ДНК, имеются также и внехромосомные ДНК (плазмиды), которые не утрачиваются при культивировании клеток в неблагоприятных условиях, что свидетельствует о постоянстве промышленных свойств штаммов.

Проведена идентификация и классификация микроорганизмов по комплексу фенотипических и молекулярно - генетических признаков с учетом Международного стандарта. Осуществлено депонирование

идентифицированных штаммов во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ГосНИИ «Генетики и селекции промышленных микроорганизмов».

Установлены закономерности влияния различных температур и скорости замораживания налиофилизацию культур Lactobacillus plantarum и Macrococcus caseolyticus.

з

Научно обоснован состав протекторных сред и изучена зависимость выживаемости микроорганизмов при лиофилизации от фазы роста и возраста культур.

Определена рациональная концентрация пищевых солей щелочных металлов, вносимых в состав бактериального препарата в качестве стимулятора роста клеток микроорганизмов, и обоснованы сроки хранения препарата в зависимости от внешних условий.

Практическая значимость. Изменен таксономический статус штаммов микроорганизмов в соответствии с Международной классификацией: Micrococcus caseolyticus реклассифицирован как Macrococcus caseolyticus. Для Lactobacillus plantaram таксономический статус продтвержден. Получены свидетельства об изменении таксономического статуса микроорганизмов и оформлены новые паспорта с внесенными изменениями.

Проведена ПЦР - диагностика, позволяющая в производственных условиях идентифицировать культуры микроорганизмов.

Предложено применение лиофилизированного препарата микроорганизмов в технологии сырых ферментированных колбас без предварительного восстановления.

На основании обобщения результатов экспериментальных исследований разработан проект НД на лиофилизированный бактериальный препарат для производства мясопродуктов. В соответствии с разработанной НД выработана опытная партия бактериального препарата. В производственных условиях ООО «Рус-Агро-Люкс» апробирована технология сыровяленой колбасы с применением разработанного препарата. Изучен процесс лиофилизации биомассы микроорганизмов, который внедрен в учебный процесс для студентов, обучающихся по специальности 270900 - «Технология мяса и мясопродуктов».

Апробация работы. Результаты научной работы доложены на научно-технической конференции «Технологические аспекты комплексной переработки с/х сырья при производстве экологически безопасных пищевых продуктов общего и специального назначения» (Углич, 2002); Международной научной конференции «Живые системы и биологическая "безопасность населения» (Москва, 2002); 1-ом Международном конгрессе «Биотехнология -состояние и перспективы развития» (Москва, 2002); научно-технической конференции "Современные технологии переработки животноводческого сырья в обеспечении здорового питания: наука, образование и производство" (Воронеж, 2003); научно-технической конференции "Технологии живых систем" (Москва, 2003); пятой международной научно-технической конференции "Пища. Экология. Человек" (Москва, 2003).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, семи глав, выводов, списка литературы, приложений. Материал изложен на 137 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц и 24 рисунка. Библиография представлена 142 источниками, в том числе 57 -зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Во введении обоснована актуальность работы, обозначены цель и задачи исследования.

Глава 1. «Современное состояние вопроса». В обзоре литературы проведен анализ отечественных и зарубежных научно-технических и патентных источников информации, касающихся применения стартовых бактериальных культур в мясной промышленности.

Показана динамика изменения микрофлоры сырых колбас в процессе их созревания под влиянием внешних условий. Приведены сведения о влиянии микрофлоры на качественные характеристики готовых колбасных изделий и. перспективы направленного использования препаратов микроорганизмов в технологии сыровяленых и сырокопченых колбас. Рассмотрено состояние современного производства бактериальных заквасок, применяемых в колбасном производстве.

Рассмотрены преимущества применения лиофилизации при создании сухих бактериальных препаратов, основные способы повышения устойчивости микробных клеток и пути увеличения эффективности процесса лиофильного консервирования.

Глава 2. «Схема проведения эксперимента и методы исследования». Дана характеристика объектов исследований, представлена схема проведения эксперимента, определяемые показатели и методы исследований (рис. 1).

Глава 3. «Фенотипические и молекулярно-генетические характеристики микроорганизмов». Приведены полученные данные о морфологических и физиолого-биохимических свойствах изученных штаммов молочнокислых и денитрифицирующего микроорганизмов.

Изучены следующие физиолого-биохимические признаки: ферментативная активность, отношение бактерий к различным источникам углерода и азота, отношение к кислороду, кислотам и щелочам, отношение к различным факторам внешней среды (температуре, концентрации соли, желчи и др.), отношение бактерий к антибиотикам, антагонистическая активность.

Сопоставляя полученные результаты с данными, указанными в «Определителе бактерий» Берджи, установили, что все исследуемые штаммы относятся к тем же видам и подвидам, которые были установлены ранее.

При идентификации бактерий большую разрешающую способность имеют хемотаксономические дескрипторы, отражающие особенности первичной структуры ДНК бактерий.

У исследуемых штаммов В-1617, В-1618 и В-6758 (АТСС 8014, референтный штамм) предварительно отнесенных к Lactobacillus plantarum, определяли нуклеотидный состав ДНК, который характеризуется содержанием GC-nap, и уровень гомологии ДНК методом ДНК-ДНК гибридизации между изученными и типовыми штаммами.

Все исследуемые штаммы имели нуклеотидный состав в пределах 45-46 мол.% GC и характеризовались высоким уровнем гомологии ДНК, превышающим 80%, что позволило отнести их к штаммам одного вида. Согласно «Определителю бактерий» Берджи, известные представители вида L.

plantarum характеризуются содержанием GC-пар в ДНК в пределах 44-46 мол.% и высоким уровнем гомологии.

Таким образом, все исследуемые коллекционные про биотические штаммы могут быть отнесены к Lactobacillus plantarum.

Штамм В-1619 был предварительно идентифицирован как Micrococcus caseolyticus. Согласно «Определителю бактерий» Берджи, этот вид был реклассифицирован в Staphylococcus caseolyticus, так как известные виды Micrococcus имеют нуклеотидный состав от 66 до 73 мол. % GC, а для "Staphylococcus caseolyticus" это содержание составляет 38-39 мол.%. В исследуемом коллекционном штамме содержание GC-пар составило 37,5 мол.%. Таким образом, этот штамм может быть идентифицирован как Staphylococcus caseolyticus, непатогенный (согласно ежегодному альманаху Международной таксономической организации, март 2001г.).

Staphylococcus caseolyticus был реклассифицирован в Macrococcus caseolyticus (Kloos et al. 1998г.). Таким образом окончательно коллекционный штамм В-1619 был идентифицирован как Macrococcus caseolyticus.

Получение готовых продуктов с заданным комплексом свойств во многом определяется составом и свойствами применяемых микроорганизмов.

Кроме хромосомы у большинства видов бактерий существуют другие, способные к автономной репликации структуры - плазмиды. Это двуцепочечные кольцевые ДНК размером от 5 до 0,1 % размера хромосомы, несущие гены, не обязательные для клетки-хозяина, или гены, необходимые лишь в определенной среде.

Некоторые бактериальные плазмиды способны передаваться из одной клетки в другую. Таким образом, клетки в определенных условиях могут, как приобретать, так и утрачивать плазмиды, хотя некоторые из них стабильно сохраняются. Клетки, приобретающие или теряющие плазмиды, как правило, могут изменять свои исходные признаки.

Изученные и идентифицированные штаммы были исследованы на наличие в них плазмид. Результаты исследований представлены на рис. 2.

Эталонным маркером молекулярного веса плазмид служила ДНК фага X, обработанная рестриктазой HindlH (23130,9416,6557, 4361 2322, 2027,564 пар нуклеотид (далее п.н.)).

Гель после электрофореза ДНК был сфотографирован на системе Biotest D фирмы Биоком (чувствительность менее 5 нг ДНК).

Анализируя плазмидный профиль штаммов Lactobacillus plantarum обнаружено, что все штаммы содержат плазмиды в разном количестве и различных молекулярных весов, причем штаммы В-1617 В-6758 имеют сходный плазмидный профиль и содержат по две плазмиды. Штамм В-1618 имеет отличный индивидуальный плазмидный профиль.

Далее, аналогично Lactobacillus plantarum, проведена работа по анализу наличия (отсутствия) плазмид в штамме Macrococcus caseolyticus В-1619 (рис.3). Проведенный анализ показал, что Macrococcus caseolyticus В-1619 содержит одну плазмиду размером 2,0 т.п.н.

Таким образом, различие в плазмидных профилях изучаемых штаммов позволяет предполагать, что информация, ответственная за промышленно-

Рис 1 Схема проведения исследований:

Исследуемые показатели: 1- энергия кислотообразования; 2 - предел кислотообразования; 3

- редукция нитратов; 4 - учет количества микроорганизмов; 5 - определение образования аммиака из аргинина; 6 - устойчивость к поваренной соли; 7 - определите антагонистической активности; 8 - определение сбраживания углеводов; 9 - определение роста при различных температурах; 10 -определение образования каталазы; И - отношение микроорганизмов к кислороду; 12 -определение образования индола; 13 - определение образования сероводорода; 14 - определение способности к разжижению желатины; 15 - окраска бактерий по методу Грамма; 16 - определение чувствительности к антибиотикам; 17 - определение выхода готовой продукции; 18 - определение массовой доли влаги; 19 - белка; 20 - жира; 21 - золы; 22 - хлористого натрия; 23 - величина рН; 24

- микробиологические показатели; 25 - остаточная влажность сухой бактериальной массы; 26 -органолептические свойства; 27 - структурпо-механические свойства; 28 - культивирование микроорганизмов в ферментере «АК-203».

ценные свойства микроорганизмов, закодирована как на хромосомной ДНК, так и на внехромосомной (плазмидной) ДНК.

Рис 2. Плазмидный профиль штаммов Lactobacillus plantarutn B-1617, В-1618 и типового В-6758 (АТСС 8014):

1 - В-1617 присутствует 2 плазмиды с размерами 6,5 и 2,4 т.п н;

2 - В-1618 присутствует 1 плазмида с размерами 7 т.п.н;

3 - В-6758 присутствует 2 плазмиды с размерами 6,5 и 1,5 т.п.н;

4 - Маркер молекулярного веса к (Hindlll);

Однако, говорить точно, что данный штамм, используемый в промышленности, идентичен той культуре, которая была депонирована или же запатентована, разрешена к использованию в пищевой промышленности и будет проявлять нужные в технологическом процессе свойства позволяет проведение ПЦР-диагностики. ПЦР-диагностика дает возможность обезопасить производство и оградить автора данной культуры от незаконного ее использования.

Рис. 3. Плазмидный профиль штамма Macrococcus caseolyticus B-

1619:

1 - Маркер молекулярного весаХ.(Нн1(Ш1);

2- Macrococcus caseolyticus В-1619, в котором обнаружена одна плазмида размером 2,0 т.п.н.

Для проведения ПЦР-диагностики были использованы праймеры рибосомальных последовательностей (RS-PCR: gaa-gtc-gta-aca-agg (PI), caa-ggc-atc-cac-cgt (P2)); короткие праймеры рибосомальных последовательностей (RS/AG-PCR: gaa-gtc-gta-ac (РЗ), aag-gca-tcc-ac (P4)); а так же модифицированные праймеры рибосомальных последовательностей (TAP-PCR: cag-cag-ccg-ccg-taa-tac (Kpml), cag-cag-ccg-cgg-taa-ttc (Kpm2)).

Результаты ПЦР-фингерпринта с праймерами Р1 и Р2 представлены на рис.4. Отмеченные фрагменты, идущие на электрофорезе, на уровне 250 и 300 пар нуклеотид, характерны для представителей штаммов вида Lactobacillus plantarum.

Остальные фрагменты можно считать штаммоспецифичными. Аналогичные результаты получены для ПЦР - фингерпринт штаммов Lactobacillus plantarum с праймерами РЗ, Р4, Kpml и Крт2.

TAP-PCR

н

Рис. 4. ПЦР-фингерпринт штаммов Lactobacillus plantarum с праймерами Р1 и Р2:

1. Маркер GeneRuler I kb DNA Ladder: 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000,2500,2000,1500,1000,750,500,250 п.н.

2. Штамм Lactobacillus plantarum B-1617

3. Штамм Lactobacillus plantarum В-1618

4. Типовая культура штамм Lactobacillus plantarum В- 6758 (АТСС 8014)

5. Маркер GeneRuler I kb DNA Ladder: 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000,2500,2000,1500,1000,750,500,250 п.н.

Исследуемая культура: Macrococcus caseolyticus B-1619.

Рис 5. ПЦР-фингерпринт штамма Macrococcus caseolyticus B-1619 с праймерами P1 P2 (TAP-PCR), РЗ Р4 (RS-PCR), Kpml Kpm2 (RS/AG-PCR)

1. TAP-PCR с праймерами P1 и Р2

2. RS-PCR с праймерами РЗ и Р4

3. RS/AG-PCR с праймерами Kpml и Крт2

4. Маркер Lambda DNA/Hind III, обработанная рестриктазой Hind HI (23130, 9416,6557,4361,2322,2027,564 п.н.)

Результат ПЦР-фингерпринта (рис. 5) может быть использован как характеристика промышленного штамма Macrococcus caseolyticus B-1619.

Глава 4. «Установление закономерностей влияния различных параметров замораживания на лиофилизацию культур микроорганизмов».

Глава посвящена изучению влияния замораживания на устойчивость изученных штаммов микроорганизмов при лиофилизации. Каждый этап лиофилизации является критическим, так как оказывается губительным для

TAP-PCR, RS-PCR, RS/AG-PCR

1

г з

клеток и ведет к потере большого числа жизнеспособных бактерий и их активности, которые определяют качество готового сухого биопрепарата.

Первым этапом разработки было изучение влияния конечной температуры предварительного замораживания бактериальной суспензии на выживаемость микроорганизмов в процессе лиофилизации. У микробных клеток, как объектов сушки, наблюдается прямая зависимость между количеством влаги, удаляемой фазовым переходом «лед-пар», то есть долей вымороженной влаги при данной температуре и гибелью микроорганизмов во время лиофилизации и последующего хранения.

В данной работе исследовались температуры замораживания от минус 10°С до минус 30°С. В этом интервале температур количество вымороженной влаги в биомассе молочнокислых бактерий составляет от 86 до 95,7%, что обеспечивает достижение необходимой остаточной влажности сухой бактериальной массы после лиофилизации и должно способствовать сохранению большого числа жизнеспособных клеток. Перед замораживанием бактерии культивировали глубинным периодическим способом при 37 °С в колбах вместимостью 250 см3 со 100 см3 питательной среды MRS. Продолжительность выращивания 20 - 22 ч. Различные штаммы культивировали и исследовали раздельно. После культивирования суспензию микроорганизмов отделяли от остатков питательной среды центрифугированием с частотой вращения ротора 3000 МИН"' в течение 15 мин. Эти режимы обеспечивают минимальные потери клеток при удалении надосадочной жидкости при сохранении способности к ресуспендированию. Клетки микроорганизмов ресуспендировали в 6 % растворе сухого обезжиренного молока, которое на данном этапе использовалось в качестве защитной среды. Соотношение бактериальной массы и вносимой протекторной среды 1:2.

Образцы с культурой на данном этапе замораживали в течение 36 часов и лиофилизировали на установке «ЛС -1000».

Проведенные исследования показали, что конечная температура предварительного замораживания существенно влияет на выживаемость исследуемых культур в процессе лиофилизации. Снижение температуры до минус 30 °С способствует сохранению 46,7 и 36,4% клеток L. plantarum 31 и L. plantarum 32 соответственно и 27,7% клеток М. caseolyticus 38. Повышение устойчивости микробных клеток при понижении конечной температуры предварительного замораживания происходит в результате увеличения доли вымороженной влаги в суспензии микроорганизмов, которая удаляется во время сублимации льда при понижении давления. Это в свою очередь приводит к уменьшению остаточной влажности сухих препаратов. Полученные результаты представлены в табл. 1

Тем не менее, варьирование только конечными температурами замораживания не достаточно для сохранения высокого числа жизнеспособных бактериальных клеток. Среди факторов, влияющих на выживаемость микроорганизмов в процессе лиофилизации, наиболее важную роль играет состав среды, используемой для приготовления суспензий микроорганизмов.

С целью обоснования выбора защитной среды при лиофилизации микроорганизмов было изучено влияние комбинированных сред различного состава на выживаемость бактериальных клеток. Результаты исследований представлены в табл. 2.

Таблица 1

Выживаемость кл ето к L. plantarum 31, L. plantarum 32 и М. са8ео1уИси 38

при разных температурах замораживания

Штамм Температура заморажива ния, "С Количество живых клеток, хЮ7в 1 см3. Выживае мость % Остаточная влажность, %

до лиофилиза ции после лиофилиза ции

М. caseolyticus 38 минус 10 55,5 ±0,70 5,7 ±0,09 10,3 15,0 ±1,6

минус 20 9,4 ±0,58 16,9 8,3 ± 1,3

минус 30 15,4 ±0,73 27,7 6,1 ±0,7

Lb. plantarum 31 минус 10 118,5 ±0,85 29,9 ±0,24 25,3 12,8 ±0,5

минус 20 49,4 ±0,62 41,9 8,0 ±0,2

минус 30 55,3 ±0,17 46,7 6,2 ± 0,8

Lb. plantarum 32 минус 10 27,2 ±0,58 4,3 ± 0,52 15,8 11,5 ±1,5

минус 20 9,3 ± 0,07 34,2 9,0 ±1,3

минус 30 9,9 ±0,15 36,4 6,5 ±0,6

В состав протекторных сред вводили в различных концентрациях сухое обезжиренное молоко, лактозу и глютаминат натрия.

Таблица 2

Выживаемость клеток микроорганизмов в процессе лиофилизации

_при различном соотношении компонентов защитной среды_

Соотношение компонентов

Выживаемость, %

молоко лактоза глютаминат Lactobacillus Lactobacillus Macrococcus •

натрия plantarum 31 Plantarum 32 caseolyticus 38

2 1 2,5 41,8 38,0 53,6

2 2,5 5 48,2 44,3 67,4

2 5 1 64,5 58,3 67,1

6 2,5 5 50,9 46,2 74,0

6 5 1 37,3 35,8 73,1

6 1 2,5 69,1 66,1 59,8

10 5 1 42,7 63,2 77,7

10 1 2,5 44,5 38,6 65,9

10 2,5 5 25,4 18,6 73,0

Сухое обезжиренное молоко вносили в концентрациях от 2 до 10%. Высокое содержание лактозы и глютамината натрия, являющихся по природе высоко гидрофильными веществами, в составе протекторных сред приводит к удлинению процесса сушки, создает повышенную остаточную влажность и

понижает растворимость сухого препарата. Поэтому в состав протекторной среды эти вещества вносили в количестве 1 - 5%.

Было исследовано 9 вариантов защитной среды и в результате изменения процентного соотношения входящих в их состав всех трех компонентов, достигнут уровень выживаемости исследуемых культур 64,5 - 69,1 % для L. plantaгum 31; 63,2 - 66,1% для L. plantaгum 32 и 74,0 - 77,7% для М. caseolyticus 38; при этом обращают на себя внимание среды с соотношением сухого обезжиренного молока, лактозы и глютамината натрия 6:1: 2,5% и 10 : 5 : 1% при которых потери живых клеток наименьшие.

Помимо соотношения компонентов большое значение так же имеет концентрация протекторной среды. Для установления влияния этого фактора на устойчивость микроорганизмов при диофилизации исследовались соотношения бактериальной массы и протекторной среды 1 : 1, 1 : 2 и 1 :3. В качестве протектора для М. caseolyticus 38 использовалась среда с соотношением сухого обезжиренного молока, лактозы и глютамината натрия 10 : 5 : 1%, а для лиофилизации бактерий L. plantaгum с соотношением 6:1: 2,5%. Результаты исследований представлены на рис. 6.

В результате проведенных исследований установлено, что устойчивость микроорганизмов возрастает с увеличением концентрации микробных клеток в суспензионной защитной среде, и при соотношении клеток и протекторной среды 1 :1 количество жизнеспособных клеток после лиофилизации составляло 81,7% М. caseolyticus 38 и до 76,7 и 73,0 % для L. plantaгum 31 и L. plantaгum 32 соответственно.

Скорость охлаждения клеток микроорганизмов является одним из важных факторов, определяющих механизм термодинамического равновесия паров в клетках, который может осуществляться двумя путями: дегидратацией клетки или внутриклеточным замораживанием.

Результаты проведенных исследований позволили установить, что скорость замораживания не оказывает существенного влияния на выживаемость и стабильность свойств изучаемых штаммов микроорганизмов. Чувствительность бактерий к скорости предварительного замораживания, вероятно, в значительной степени нивелируется защитной средой, которая существенно снижает степень выраженности видовых, групповых и типовых различий в устойчивости бактерий. Результаты исследований представлены в табл. 3.

Характер формируемых кристаллов льда при различных скоростях замораживания не оказывает значительного влияния на общую продолжительность сушки, то есть внутреннее сопротивление переносу массы при быстром замораживании и формировании мелких кристаллов льда не является лимитирующим фактором. В свою очередь кристаллы, формируемые при медленном замораживании, располагаются в массе продукта таким образом, что образования каких-либо существенных тепловых мостиков к зоне сублимации не происходит.

При сублимационном высушивании микроорганизмов очень часто возникает необходимость сохранить перед сушкой препараты, предварительно замороженные в холодильных аппаратах, в течение нескольких часов, а иногда

и несколько дней. При этом допустимая продолжительность хранения может варьировать в зависимости от вида микроорганизма и состава суспензионной среды.

Т 90

II 12 13

Соотношение бактериальной массы и протекторной среды

■ штамм Macrococcus caseolyticus 38

■ штамм Lactobacillus plantarum 31 0 штамм Lactobacillus plantarum 32

Рис. 6. Зависимость выживаемости микроорганизмов от их концентрации в защитной среде

Проведенные исследования показали, что при понижении давления в камере во время сублимации влаги в образцах, которые замораживались в течение 12 часов и в меньшей степени в образцах, замораживаемых 24 часов, наблюдалось вспенивание препаратов.

Происходило это, вероятно, вследствие не полной кристаллизации «свободной» влаги системы. Аморфная фаза сохраняла свою подвижность и при последующем вакууммировании происходило энергичное испарение не вымороженной влаги и удаление газов из зоны сублимации. Таблетки препарата с самого начала сушки деформировались в результате изменений, происходящих в их капиллярно-пористой структуре. В сухих препаратах при этом отмечалась значительная усадка и плохая растворимость.

В образцах, подвергнутых предварительному замораживанию в течение 36 и 48 часов, лиофилизированные культуры представляли собой плотную мелкопористую структуру биомассы, оформленную в виде таблетки, что обеспечило высокую устойчивость микроорганизмов при лиофилизации (табл.4).

Глава 5. «Исследование влияния фазы роста клеток на их устойчивость и активность после лиофилизации. В сохранении жизнеспособности микроорганизмов после сублимационной сушки большую роль играют фракции подвижной и прочносвязанной воды. При переходе из одной фазы роста в другую клетки микроорганизмов претерпевают

определенные структурно-морфологические перестройки, связанные прежде всего с обводненностью либо дегидратированностью тех или иных их компонентов.

Изучение разных фаз роста периодических культур молочнокислых микроорганизмов Lactobacillus plantarum 31 и Lactobacillus plantarum 32 и денитрифицирующего микроорганизма Macrococcus caseolyticus 38 позволило избежать существенных повреждений клеточных структур при их лиофилизации.

Бактерии выращивали в аппарате для культивирования микроорганизмов «АК-203» периодического действия. В ферментере объемом 3 дм3 был реализован глубинный динамический процесс культивирования с перемешиванием при помощи лопастно-дисковой мешалки.

Температура культивирования поддерживалась на уровне 30 ± 2 °С, рН = 6,5 ± 1, скорость вращения лопастной мешалки п = 70 мин'1. Культивирование проводили на среде MRS без дополнительной аэрации. Объем вносимого инокулята составлял 5 %. В качестве инокулята использовались закваски микроорганизмов третьей генерации, полученные из предварительно активированных музейных культур, хранящихся в лиофилизированном виде в герметично запаянных под вакуумом ампулах при соответствующих условиях.

В результате культивирования у исследуемых культур определена продолжительность фаз роста. Характер роста штаммов был традиционным. Клетки проходили в своем развитии все фазы. Начало фазы экспоненциального роста приходилось на 1,5 - 3 ч для лактобацилл и 3,5 - 4 ч для Macrococcus caseolyticus 38. В стационарную фазу клетки Lactobacillus plantarum 31 переходили, начиная с 6 - 7,5 ч культивирования, клетки Lactobacillus plantarum 32 начиная с 7,5 - 9 ч и клетки Macrococcus caseolyticus 38 после 9 ч культивирования. Ксероустойчивость культуры Lactobacillus plantarum 31 в период с 7,5 ч и до окончания культивирования не изменялась и составляла 80 - 84 %. Иная картина характерна для другого штамма - Lactobacillus plantarum 32. Высокий уровень сохранения жизнеспособных клеток отмечен в бактериальной суспензии лишь в период с 6 до 9 ч культивирования и по мере старения культуры, начиная с 10,5 - часового возраста, выживаемость ее постепенно снижалась (рис. 7).

После исследования активности высушенных культур было установлено, что максимальная устойчивость клеток при лиофилизации коррелирует с их наибольшей активностью и способностью проявлять пробиотические свойства.

Глава_6.._«Разработка_технологии_синбиотического

лиофилизированного бактериального препарата». По потребности в питательных веществах молочнокислые бактерии относятся к наиболее сложным микроорганизмам. В состав питательных субстратов зачастую вводятся вещества, которые не являются необходимыми факторами питания микроорганизмов, а оказывают ярко выраженный эффект стимуляции роста и развития микробной популяции.

В качестве таких веществ чаще всего используют щелочные соли пищевых металлов. Как правило, в состав этих солей входят катионы железа, окиси железа, магния, кальция, цинка, но ионы этих металлов не так

эффективны в качестве стимуляторов роста, как ионы марганца. Среди солей марганца следует отметить хлорид-, сульфат-, цитрат-, глицерофосфат-, глюконат марганца и другие водорастворимые соли. Эти вещества вносят в мясное сырье в количестве от 0,01 до 1500 частей на каждый миллион частей мясного сырья по весу, для обеспечения требуемой концентрации катионов металла в сырье.

В качестве объектов исследования выбраны пищевые соли: хлорид кальция и сульфат марганца моногидрат, наиболее часто применяемые для стимуляции роста молочнокислых микроорганизмов.

Эффект стимуляции роста фиксировали по снижению величины рН субстрата. Для культивирования микроорганизмов использовали мясопептонный бульон с глюкозой.

Исследуемые культуры микроорганизмов Lactobacillus plantarum 31, 32 и Macrococcus caseolyticus 38 вносили в равных соотношениях и культивировали при оптимальной температуре. Количество вносимых хлорида кальция и сульфата марганца составляло 0,001 % от массы питательной среды, в качестве контроля использовали МПБ с глюкозой без добавок солей металлов. Результаты исследований представлены в табл. 5.

Величина рН питательного субстрата при добавлении 0,001 % соли сульфата магранца моногидрата достигала значения 5,03 и ниже, менее чем за 12 часов. Среда, являющаяся контролем, достигала этого значения лишь после 16 часов культивирования. В результате проведенных исследований установлено, что катионы марганца в составе - моногидрата оказывают

более выраженный эффект стимуляции роста исследуемых микроорганизмов по сравнению с хлоридом кальция.

Далее было изучено влияние концентраций - моногидрата: 0,002

%, 0,005 % и 0,01 % к массе субстрата на способность ускорять рост микроорганизмов. Результаты представлены в табл. 6.

Добавление к питательному субстрату 0,005 % МиБО^-моногидрата способствует снижению величины рН до 5,00 после 8 часов культивирования. Увеличение концентрации соли до 0,01 % не приводит к существенному увеличению эффекта ускорения роста бактерий, то есть увеличение концентрации сульфата марганца в составе субстрата до 0,01 % является не целесообразным.

При сублимационной сушке материала помимо глубины и скорости замораживания на качество конечного продукта влияют также такие факторы, как рабочий вакуум, интенсивность энергоподвода, высота высушиваемого слоя и некоторые другие.

То есть корректное проведение этапа предварительного замораживания, еще не гарантирует получение конечного препарата с требуемыми характеристиками, так как непосредственно в процессе сублимации влаги в препарате могут наблюдаться явления, названные «коллапсом» материала.

«Коллапс» в препарате в основном инициируется нарушением теплового баланса в материале между теплом, подводимым извне, и теплом, расходуемым на сублимацию.

Таблица 3

Влияние скорости замораживания на устойчивость ми] {роорганизмов к л иофилизации

Штамм Скорость заморажи вания Количество живых клеток, х 107 в 1 см3 Выживае мость, % Интенсивность кислотообразо вания, чСТ) Предел кислотообразо вания, *Т Редукция нитратов

до лиофилизации после лиофилизации

Macrococcus caseolyticus 38 Медленная 53,3 ± 1,30 43,9 ± 1,27 82,4 48 (24* Т) 91 ± 4 +

Быстрая 42,5 ± 0,83 79,7 48 (22* Т) 94 ±9 +

Lactobacillus plantarum 31 Медленная 90,8 ± 0,86 67,6 ± 0,69 74,4 36 (85* Т) 175 ±3 Не определяли

Быстрая 69,8 ± 1,46 76,9 36 (92* Т) 194 ± 10

Lactobacillus plantarum 32 Медленная 26,5 ±1,58 19,1 ± 1,12 72,1 36 (70* Т) 136 ±6 Не определяли

Быстрая 19,3 ±0,94 72,8 36 (75* Т) 146 ±2

Таблица 4

Влиян ие продолжительн ости замораживания на устойчивость микроорганизмов к лиофилизации

Штамм Длительность замораживания, ч Выживае мость, % Интенсивность кислотообразования, ч(*Т) Предел кислотообразования, *Т Редукция нитратов Остаточная влажность, %

Macrococcus caseolyticus 38 12 56,2 60 (20* Т) 75 ± 5,3 + 9,8 ± 2,0

24 65,8 60 (25* Т) 82 ± 2,0 + 8,4 ± 1,6

36 81,6 48 (33 *Т) 95 ± 12,4 + 8,5 ± 0,4

48 82,0 48 (24 *Т) 94 ± 10,1 + 10,2 ± 0,6

Lactobacillus plantarum 31 12 48,4 48 (85* Т) 155 ±7,8 Не определяли 7,5 ± 1,2

24 57,4 36 (80* Т) 164 ±4,0 8,9 ±1,4

36 75,3 36 (90 *Т) 210 ±7,0 9,7 ±0,7

48 73,6 36 (85 *Т) 210 ± 10,4 9,1 ±0,3

Lactobacillus plantarum 32 12 31,1 48 (60* Т) 98 ± 5,6 Не определяли 9,3 ± 0,3

24 61,5 48(60* Т) 120 ±7,2 12,7 ± 0,6

36 73,7 36 (75 *Т) 165 ± 3,0 8,6 ± 1,7 9,2 ±1,0

48 74,3 48 (70 *Т) 158 ±8,6

Рис 7. Зависимость выживаемости микроорганизмов от фазы роста

Для разработки режимов лиофилизации бактериальную массу предварительно замораживали во флаконах объемом 20 см3. Для сублимации использовали сушилку лиофильную «ЛС-1000», включающую конденсатор с

температурой конденсирующей поверхности не более минус 40°С, камеру с 6 полками, термостатируемыми до температуры 40 °С, и термодатчики регистрирующие температуру продукта в двух точках. Рабочее давление в вакуумной камере сушилки 6,67 Па (5х102 мм рт ст), которое регистрируется стрелочным индикатором.

Таблица 5

Влияние солей различных металлов в составе питательной среды на рост _ микроорганизмов _

Питательная среда Период ферментации, ч

0 2 4 6 8 10 12

Контроль (без добавок) 6,23 6,06 5,86 5,79 5,35 5,20 5,12

МПБ+СаС]2 6Д0 5,98 5,81 5,59 5,10 5,06 5,01

МПБ+МпБС^-моногидрат 6,21 5,96 5,56 5,25 4,97 — —

На рис. 8 представлена термограмма высушивания микроорганизмов после предварительного замораживания до минус 30 *С.

Таблица 6

Влияние концентрации сульфата марганца в составе питательной среды

на рост микроорганизмов

Питательная среда Период ферментации, ч

0 2 4 8 10

МПБ+0,002% МпБОгМоногвдрат 6,10 5,90 5,47 5,10 5,02

МПБ+0,005% МпБОгМОНОГидрат 6,10 5,82 5,42 5,00 —

МПБ+0,01% Мп504-моногидрат 6,08 5,85 5,40 4,96 —

Переход на досушивание, предпринятый на 2-й час процесса обезвоживания, привел к вспениванию нижнего слоя продукта, которое произошло скорее всего в результате увеличения температуры продукта выше некоторого порогового значения, и в материале при сублимации происходило таяние аморфной фазы криоконцентрата. Он становился подвижным и закупоривал каналы отвода паров, что привело к деформации продукта, вспениванию, последующему «проседанию» и карамелизации. Это в свою очередь привело к потере биологической активности микроорганизмов. Полученные после сублимационного высушивания препарата сухие образцы в 90 % случаев были признаны не кондиционными.

Подобным образом были обработаны термограммы всех неудачных сушек, в ходе которых материал перегревался выше пороговой температуры и портился. На основании полученных результатов был экспериментально отработан рациональный режим лиофильного обезвоживания, представленный на рис. 9.

На сохранность микроорганизмов в лиофилизированном состоянии влияет несколько факторов. Из них особое внимание необходимо обратить на температуру хранения высушенного препарата, наличие в нем остаточной влаги и атмосферу хранения, состав протекторной среды и упаковочного материала.

Используя подход к изучению гибели популяций микроорганизмов в тепловом поле, основанный на теории мишеней и уравнении Аррениуса,

18

касающегося скорости химических реакций, с некоторыми допущениями получаем уравнение для определения числа жизнеспособных клеток микроорганизмов, хранящихся в лиофилизированном виде:

LgN = LgN0-kT

где: No - начальная концентрация клеток, КОЕ/мл;

N - концентрация клеток в любой момент времени Т - время хранения, ч; к - специфическая скорость отмирания, ч"1.

Для того, чтобы с точностью разработать модель стабильности исследуемых микроорганизмов во время долгосрочного хранения, специфическая скорость отмирания для Lactobacillus plantarum 32 в сублимированном виде в присутствии сухого обезжиренного молока (6 %), лактозы (1 %) и глютамината натрия (2,5 %) была определена в соответствии с формулой (1) для трех высоких температур 30, 45 и 60 "С. Результаты представлены в табл. 7.

Таблица 7

Специфическая скорость отмирания клеток Lactobacillus plantarum 32 _в зависимости от температуры_

Температура хранения, "С Специфическая скорость отмирания, ч"'

30 0,013

45 0,056

60 0,259

Определение величины специфической скорости отмирания (деградации) для каждой температуры позволяет нарисовать график зависимости величины lg к от величины 1/Т. Из этого графика можно определить величину к для любой другой температуры хранения лиофилизированных микроорганизмов. Затем по представленному выше уравнению определяется концентрация клеток в любой момент времени при хранении в данных температурных условиях.

Для доказательства возможности применения данного метода при определении количества жизнеспособных клеток лиофилизированных микроорганизмов, хранимых при различных температурных режимах, определяли уровень выживаемости клеток Lactobacillus plantarum 32 после 20 суток хранения при температурах 20,0 и минус 20°С вычисленный с помощью разработанного экспресс-метода и определенный экспериментально.

Результаты исследований представлены в табл. 8. После 20 сут хранения рассчитанный уровень выживаемости практически полностью соответствует экспериментально полученному значению. Максимальное расхождение, составляющее 1,55 %, наблюдалось при хранении микроорганизмов при температуре минус 20°С.

Аналогичные данные получены для клеток микроорганизмов Lactobacillus plantarum 31 и Macrococcus caseolyticus 38.

Полученные результаты говорят о корректности применения данного метода для определения количества жизнеспособных микроорганизмов, хранящихся в лиофилизированном виде при определенных температурных условиях.

Температура терыодатчиков, С

п т § =

•3 Р

О 00 ЕВ •

8 Н

£•3

? 3

ё-з

»1

*

ч

а 8

|В = г

■о в

§ I

в

3 *

2 о " X

X о в

г> ч

в

X X

Ш1

"8 "8 *

.. 3 Й

I

3

ю

тг

г

Температура нагревательных элементов, С

Температура термодатчиков, С

"в в

•о

о

2 »

а

■о е в л

г

в в о х х

Е к

X

ш

н н н

ООП

£ г £

3 я а

■а -о тз

» Р »

н ч н

V:

•а та -о м ее » в н н

П о п

4 тз и

•а г г "! о о в ь

V № Ч -I

Л Л

X К

Температура нагревательных элементов, С

На основании экспресс-метода было установлено, что при хранении исследуемых микроорганизмов в лиофилизированном виде при темпетатуре не выше минус 10°С существенного снижения титра жезнеспособных бактериальных клеток не происходит в течение 2 лет.

Таблица 8

Уровень выживаемости лиофилизированных клеток _Lactobacillus plantarum 32 _

Температура хранения, •с Уровень выживаемости, %

рассчитанный экспериментальный

20 2,6 2,3 ± 0,5

0 49,8 48,94 ±0,7

минус 20 96,4 94,9 ±0,2

На основании проведенных исследований разработана технологическая схема производства лиофилизированного синбиотического бактериального препарата, представленная на рис. 10.

Рис. 10. Технологическая схема производства лиофилизированного синбиотического бактериального препарата

Глава 7. «Комплексное исследование колбас, выработанных с использованием разработанного препарата микроорганизмов». Для оценки биотехнологического воздействия, оказываемого применением бактериального препарата, на процесс созревания сырых ферментированных колбас в условиях ООО «Pyc-AIpo-Люкс» была выработана опытная партия сыровяленой колбасы «Октябрьская» по ТУ 49 РФ 374 - 80 с внесением бактериального препарата и без него. Бактериальный препарат вносили в количестве 50 г на 100 кг мясного сырья.

Были проведены исследования качественных характеристик контрольного и опытного образцов колбас на протяжении всего технологического процесса.

Динамика снижения показателя рН (рис. 11) в опытном образце отображает активный рост доминирующих штаммов бактериального препарата и более низкие значения были характерны на протяжении всего процесса созревания колбас по сравнению с контрольным образцом.

Рис. 11. Изменение величины рН в процессе созревания колбас

Увеличение кислотности в процессе созревания колбас обусловлено, главным образом, образованием молочной кислоты в результате жизнедеятельности молочнокислой микрофлоры. Динамика развития молочнокислых микроорганизмов показана на рис. 12.

Максимальное их содержание отмечалось на 20 - 25 сутки созревания и достигало величины (75-73) х 106 КОЕ/г фарша в опытном образце.

Снижение рН среды, сопровождающееся снижением активности воды в процессе сушки колбас а также влияние эффекта «вытеснения» приводит к подавлению жизнедеятельности санитарно-показательной микрофлоры, в результате чего общая обсемененность образцов в процессе созревания уменьшалась (рис. 13).

Бактерии группы Е. coli и Proteus vulgaris не обнаруживались в контрольном образце на 25 сутки, а в опытном образце уже на 15 сутки

созревания, что обусловлено высокой антибиотической активностью вносимых штаммов.

Рис 12. Изменение молочнокислой микрофлоры в процессе созревания колбас

Анализ химического состава готового продукта показал, что массовая доля влаги и поваренной соли не превышают величину, допустимую нормативной документацией - 30% и 5% соответственно как для опытного, так и для контрольного образцов (табл. 9).

Рис 13. Динамика общей обсемененности образцов в процессе созревания колбас.

Введение в рецептуру колбасных изделий бактериального препарата позволяет получить продукт с желаемыми органолептическими показателями. Оценка органолептических показателей качества проводилась по девятибалльной шкале. Результаты представлены в табл. 10.

Таблица 9

Химические показатели контрольного и опытного образцов _ ферментированных колбас_

Показатели Готовый продукт

контроль опыт

Массовая доля: влаги, % 29,80 ±1,80 28,50 ± 1,60

белка, % 20,19 ±0,40 21,56 ±0,35

жира,% 33,5 ±0,80 35,02 ±0,70

золы, % 10,87 ±0,05 9,77 ±0,06

поваренной соли, % 5,64 ±0,64 5,15 ±0,57

Изменения структурно-механических характеристик контрольных и опытных образцов колбас по значениям напряжения среза и приведенной работы резания, которые инструментально определяли в центральных и периферийных слоях батонов приведены в табл. 11.

Таблица 10

Органолептические показатели готовых колбасных изделий

Образец Органолептические показатели

товарный вид цвет на разрезе запах вкус консистенция сочность

Контроль 7,0 6,5 7,0 7,1 7,4 7,1

Опыт 8,6 8,7 8,6 8,6 8,8 8,8

Разница в значениях напряжения среза и приведенной работы резания для центральных и периферийных слоев контрольных образцов на 30 сутки составляет 3,14х 10"4 Па и вб^Дж/м2, а для опытных 0,27x10"* Па и 14,84 Дж/м2

соответственно.

Таблица 11

_Структурно-механические характеристики колбасных изделий_

Слой Контрольный образец Опытный образец

напряжение среза, х 104 Па приведенная работа резания, Дж/м2 напряжение среза, х 10чПа приведенная работа резания, Дж/м2

Центральный 1,81±0,09 88,63±2,11 1,75±0,05 88,43±1,91

Периферийный 4,95±0,12 175,10±3,27 2,02±0,11 98,27±2,27

Различия структурно-механических показателей контрольных и опытных образцов колбас объясняется, по-видимому, уменьшением неравномерности распределения влаги по слоям и протеолитической активностью штаммов микроорганизмов в составе вносимого препарата, что улучшает структурно-механические свойства формируемой конденсационно-кристаллизационной структуры сыровяленой колбасы.

ВЫВОДЫ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ПРОВЕДЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

1. Проведена идентификация изучаемых микроорганизмов в соответствии с Международным стандартом; изучен плазмидный профиль штаммов и установлено наличие одной плазмиды в штаммах В-1618 и В-1619; и две плазмиды разного молекулярного веса в штамме В-1617; установлена консервативность генофонда клеток при культивировании в неблагоприятных условиях; проведена ПЦР - диагностика, позволяющая контролировать чистоту используемых штаммов и их идентичность коллекционным культурам.

2. Установлено, что замораживание бактериальных суспензий в течение 36 часов при температуре минус 30°С обеспечивает наибольшую криорезистентность и устойчивость пробиотических свойств изучаемых микроорганизмов. Скорость предварительного замораживания не оказывала существенного влияния на выживаемость микроорганизмов.

3. Определен состав протекторных сред, установлено рациональное соотношение «бактериальная масса : протекторная среда», которое составило 1 : 1, и определены закономерности влияния фазы роста периодических культур на стабильность микроорганизмов и их пробиотических свойств при лиофилизации.

4. Отработаны режимы вакуум-сублимационного обезвоживания биомассы, позволяющие предотвратить развитие «коллапса», сопровождающегося снижением активности исследуемых культур, обоснованы сроки хранения синбиотического бактериального препарата, в течение которого сохраняется высокий титр жизнеспособных клеток. Установлена концентрация пищевой соли марганца, вносимого в бакпрепарат, оказывающая выраженный эффект стимуляции роста популяций микробных клеток.

5. На основании полученных результатов исследований разработана технология синбиотического лиофилизированного бактериального препарата для производства мясных продуктов.

6. Проведено комплексное исследование колбасных изделий, изготовленных с использованием микробного препарата; разработан проект НД на синбиотический лиофилизированный бактериальный препарат, в соответствии с которым выработана его опытная партия и подтверждена возможность реализации разработанной технологии в производственных условиях.

ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ПРОВЕДЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ОПУБЛИКОВАНЫ СЛЕДУЮЩИЕ РАБОТЫ.

1. Рогов И. А., Хорольский В. В., Ершов Д. В. Новые аспекты в производстве лиофилизированной бактериальной закваски// Технологические аспекты комплексной переработки сельскохозяйственного сырья при производстве экологически безопасных пищевых продуктов общего и специального назначения: Материалы научно-практической конференции. -Углич, 2002.-С. 438-440.

2. Рогов И. А., Хорольский В. В., Гудима М. Ю., Ершов Д. В. Производство лиофилизированной закваски бактериальных культур//

Биотехнология - состояние и перспективы развития: 1-й Международный конгресс. - Москва, 2002. - С. 351 - 352.

3. Рогов И. А., Хорольский В. В., Габараев А. Н., Ершов Д. В. Создание отечественных бактериальных препаратов для колбасного производства// Биотехнологические процессы переработки сельскохозяйственного сырья: Сборник докладов ВНИИМПа. - М.: ВНИИМП, 2002. - С. 43 - 45.

4. Машенцева Н. Г., Ершов Д. В., Бучинская А. Г. Живая клетка - основа биотехнологии// Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы международной научной конференции. - М.: МГУПБ, 2002. - С. 45 -46.

5. Ершов Д. В., Машенцева Н. Г., Бучинская А. Г. Способы повышения выживаемости бактериальных культур при лиофилизации// Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы международной научной конференции. - М.: МГУПБ, 2002. - С. 53 - 54.

6. Хорольский В. В. Ферментация и лиофилизация микроорганизмов для создания безопасных технологий биотрансформации мясного сырья и производства мясопродуктов: Лабораторный практикум для студентов спец. 270900 - Технология мяса и мясных продуктов // В. В. Хорольский, Л. Ф. Митасева, А. Н. Габараев, С. К. Апраксина, Л. Г. Черкасова, Н. Г. Машенцева, Д. В. Ершов; под общей редакцией В. В. Хорольского. - М.: МГУПБ, 2002. -75 с.

7. Рогов И. А., Хорольский В. В., Ершов Д. В. Метод сохранения свойств микроорганизмов, используемых в мясной промышленности// Современные технологии переработки животноводческого сырья в обеспечении здорового питания: наука, образование и производство: Материалы научно-практической конференции. - Воронеж: ТММП, 2003. - С. 121 - 122.

8. Рогов И. А,, Хорольский В. В., Машенцева Н. Г., Ершов Д. В. Применение метода сохранения диагностических свойств микроорганизмов для их использования в биотехнологии мясопродуктов// Технологии живых систем: Материалы научно-технической конференции. - М.: МГУПБ, 2003. - С. 91 - 93.

9. Рогов И. А., Хорольский В. В., Ершов Д. В. Способы повышения криорезистентности клеток при создании лиофилизированных бактериальных культур// Пища. Экология. Человек: Материалы пятой международной научно-технической конференции. - М.: МГУПБ, 2003. - С. 212 - 213.

10. Хорольский В. В, Ершов Д. В. Создание синбистического препарата для производства мясопродуктов// Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы: Материалы международной конференции. - Москва, 2004. - С. 120 -121.

11. Хорольский В. В., Ершов Д. В. Разработка синбиотического препарата для проведения процессов ферментации мясного сырья// Микробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК; под общей редакцией В. А. Полякова. - М.: ПИЩЕПРОМИЗДАТ, 2004. - С. 124 - 129.

Подписано в печать 12.11.2004. Формат 60x84 1-16. Усл. печ. л. 1,75. Уч.-изд. л. 1,6 Заказ 10/83. Тираж 80 экз.

ПБОЮЛ "Митрофанов Р.В.". 109316. Москва, ул. Талалихина, 33

»235 15

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ВОПРОСА.

1.1 Трансформация микрофлоры при производстве различных мясопродуктов.

1.2 Роль микроорганизмов в образовании различных качественных характеристик продукта.

1.3 Современное производство бактериальных культур для промышленных целей.

1.4 Обоснование выбора метода сублимационного консервирования.

1.5 Пути повышения эффективности процесса лиофилизации бактериальных культур.

1.6 Механизмы криоповреждения микроорганизмов и их защита

1.7 «Пробиотики», «пребиотики», синбиотики». Производство продуктов пробиотического действия.

ГЛАВА 2. СХЕМА ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1 Методика постановки эксперимента. Характеристика объектов исследования.

2.2 Методы исследований.

ГЛАВА 3. ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ.

3.1 Морфологические, культуральные и физиолого-биохимические свойства исследуемых культур.

3.2 Молекулярно-генетическая характеристика микроорганизмов

3.3 Изучение плазмидного профиля штаммов микроорганизмов

3.4 ПЦР - диагностика промышленно-ценных штаммов.

ГЛАВА 4. УСТАНОВЛЕНИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ

ВЛИЯНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ПАРАМЕТРОВ ЗАМОРАЖИВАНИЯ

НА ЛИОФИЛИЗАЦИЮ КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ.

4.1 Изучение влияния температуры замораживания.

4.2 Подбор эффективной защитной среды и ее соотношения с бактериальной массой.

4.3 Изучение влияния скорости замораживания на выживаемость и активность бактериальных клеток.

4.4 Исследование влияния продолжительности предварительного замораживания на выживаемость и активность клеток после лиофилизации.

ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ФАЗЫ РОСТА КЛЕТОК НА ИХ УСТОЙЧИВОСТЬ И АКТИВНОСТЬ ПОСЛЕ

ЛИОФИЛИЗАЦИИ.

ГЛАВА 6. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ СИНБИОТИЧЕСКОГО ЛИОФИЛИЗИРОВАННОГО БАКТЕРИАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА.

6.1 Подбор концентрации солей различных металлов, стимулирующих рост микроорганизмов.

6.2 Отработка режимных параметров вакуум-сублимационной сушки микробных клеток.

6.3 Обоснование срока хранения препарата.

ГЛАВА 7. КОМПЛЕКСНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КОЛБАС, ВЫРАБОТАННЫХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАЗРАБОТАННОГО

СИНБИОТИЧЕСКОГО БАКТЕРИАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА.

Выводы по результатам проведенных исследований.

Микробиологические процессы нашли широкое распространение в различных областях народного хозяйства. Современные успехи фундаментальных и прикладных наук позволяют на базе биотехнологии создать высокопроизводительные, основанные на промышленных методах, управляемые процессы микробиологического производства ряда пищевых продуктов, органических веществ, медицинских препаратов. В биотехнологии видят одно из средств для преодоления продовольственных, сырьевых, энергетических и экологических проблем.

Все это дополняется все возрастающими возможностями молекулярной биологии и клеточной инженерии, которые позволяют целенаправленно создавать высокопродуктивные штаммы микроорганизмов.

Несомненно, главным направлением в развитии пищевой биотехнологии является комплексная интенсификация производственных процессов, в том числе в технологии получения и переработки мяса и мясопродуктов.

Особое место в производстве мясных продуктов занимает технология сырокопченых и сыровяленых колбас, которая, вследствие технологических особенностей, отличается длительностью и большой трудоемкостью. Поэтому в настоящее время большое значение уделяется созданию и внедрению в производство препаратов и технологий, существенно ускоряющих процесс созревания сырых колбас.

Исследованиями ряда ученых доказана перспективность применения стартовых культур, представляющих собой специально подобранные штаммы молочнокислых микроорганизмов и дрожжей, с целью сокращения технологического процесса и одновременного получения готового продукта со стабильными качественными показателями. В этой связи почти во всех странах мира при изготовлении сырокопченых и сыровяленых колбас применяют бактериальные препараты - жизнеспособные микроорганизмы в виде отдельных или смешанных культур.

Внесение определенных штаммов микроорганизмов в фарш сырых колбас улучшает процесс созревания, способствует образованию характерного цвета, плотной консистенции, своеобразного вкуса и аромата, а также обеспечивает длительную сохранность готового продукта. Кроме того, без внесения стартовых культур процесс ферментации протекает за счет микрофлоры, содержащейся в самом мясе. При таком способе ферментации в продукте может наблюдаться рост гнилостной микрофлоры и даже патогенных бактерий. Наиболее радикальный способ торможения развития санитарно-показательной микрофлоры на раннем этапе созревания сырых колбас - целенаправленное введение стартовых культур. Таким образом, широкое применение бактериальных заквасок существенно улучшает как органолептические, так и микробиологические показатели готовой продукции.

Кроме того, применение бактериальных культур в мясной промышленности приводит к повышению эффективности производства, стабилизации производственного процесса, достижению высокого качества готовых продуктов при большей статистической надежности производства, автоматизации за счет управления биохимическими процессами в ходе производства, сокращению его продолжительности и экономии сырья путем уменьшения технологически обусловленных потерь.

Эти уникальные свойства и обусловили использование бактерий в качестве стартовых культур. Однако жидкая бактериальная закваска имеет не продолжительный срок хранения, что может ограничивать ее использование. Поэтому, учитывая условия мясоперерабатывающих предприятий, целесообразно применять подобранные штаммы микроорганизмов в виде лиофилизированного бактериального препарата расфасованного в соответствующие упаковочные материалы. Это позволяет сохранить стабильные свойства культур в течение длительного периода времени без значительной потери продуктивности. Такая форма препарата в наибольшей степени отвечает требованиям предприятий, так как обеспечивает удобство при использовании, хранении и транспортировке.

ВЫВОДЫ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ПРОВЕДЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

1. Проведена идентификация изучаемых микроорганизмов в соответствии с Международным стандартом; изучен плазмидный профиль штаммов и установлено наличие одной плазмиды в штаммах В-1618 и В-1619; и две плазмиды разного молекулярного веса в штамме В-1617; установлена консервативность генофонда клеток при культивировании в неблагоприятных условиях; проведена ПЦР - диагностика, позволяющая контролировать чистоту используемых штаммов и их идентичность коллекционным культурам.

2. Установлено, что замораживание бактериальных суспензий в течение 36 часов при температуре минус 30°С обеспечивает наибольшую криорезистентность и устойчивость пробиотических свойств изучаемых микроорганизмов. Скорость предварительного замораживания не оказывала существенного влияния на выживаемость микроорганизмов.

3. Определен состав протекторных сред, установлено рациональное соотношение «бактериальная масса : протекторная среда», которое составило 1 : 1, и определены закономерности влияния фазы роста периодических культур на стабильность микроорганизмов и их пробиотических свойств при лиофилизации.

4. Отработаны режимы вакуум-сублимационного обезвоживания биомассы, позволяющие предотвратить развитие «коллапса», сопровождающегося снижением активности исследуемых культур, обоснованы сроки хранения синбиотического бактериального препарата, в течение которого сохраняется высокий титр жизнеспособных клеток. Установлена концентрация пищевой соли марганца, вносимого в бакпрепарат, оказывающая выраженный эффект стимуляции роста популяций микробных клеток.

5. На основании полученных результатов исследований разработана технология синбиотического лиофилизированного бактериального препарата для производства мясных продуктов.

6. Проведено комплексное исследование колбасных изделий, изготовленных с использованием микробного препарата; разработан проект НД на синбиотический лиофилизированный бактериальный препарат, в соответствии с которым выработана его опытная партия и подтверждена возможность реализации разработанной технологии в производственных условиях.

1. Актуальные проблемы криобиологии./ Под ред. Н. С. Пушкаря, А. М. Белоуса. Киев: Наук, думка, 1981. - 606 с.

2. Алмаши Э., Эрдели Л., Шарой Т. Быстрое замораживание пищевых продуктов: пер. с венгер. М.: Легкая и пищевая пром - сть, 1981. - 408 с.

3. Антибиотически активные молочнокислые бактерии в производстве продуктов гарантированного качества / Карликанова С. Н., Кимова Э. Т., Виноградская С. Е. и др. М.: ЦНИИТЭИмясомолпром, 1983. - 50 с.

4. Антипов А. В., Камовников Б. П., Яушева Э. Ф. Интенсификация сублимационной сушки жидких и пастообразных продуктов на противнях. -Мясная индустрия СССР, 1982, №4, с. 30 31.

5. Антонов С. Ф., Сигаев Г. И., Никонов Б. А., Кобатов А. И. Особенности сублимационной сушки лекарственных и диагностических препаратов в ампулах // Биотехнология, 1998, № 5, с. 48 69.

6. Аппараты для культивирования микроорганизмов АК-203, АК-210 // Техническое описание и инструкция по эксплуатации. Пущино. - 2001. - 88 с.

7. Аркадьева 3. А., Безбородов А. М., Блохина И. М. и др. Промышленная микробиология: Учеб. пособие для вузов по спец. «Микробиология» и «Биология» /Под ред. Егорова Н. С. М.: Высш. шк., 1989.-688 с.

8. Артемьева С. А. и др. Микробиологический контроль мяса животных, птиц, яиц и продуктов их переработки: Справочник / С. А. Артемьева, Т. Н. Артемьева, А. И. Дмитриев, В. В. Дорутина. М.: Колос, 2002. - 288 с.

9. Аткинсон Б. Биохимические реакторы: Перевод с английского. — М.: Пищевая пром сть, 1979. - 280 с.

10. Бартнев Г. М., Зеленев Ю. В. Курс физики полимеров Л.: Химия. - 1976.-С.-87.

11. Бекер М. Е. Введение в биотехнологию. Пер. с латышского. — М.: Пищевая промышленность, 1978. 232 с.

12. Бекер М. Е. К вопросу о модели биомембран в связи с проблемой анабиоза. В кн.: Микробиологический синтез аминокислот. Рига : Зинатне, 1977, с. 49-53.

13. Бекер М. Е., Аузан С. И., Аузиня Л. П. и др. Нарушение барьерной функции мембран микроорганизмов при обезвоживании и дегидратации. — В кн.: Биомембраны: структура, функции, медицинские аспекты. Рига : Зинатне, 1981, с. 196 209.

14. Бекер М. Е., Лиепиныш Г. К., Райпулис Е. П. Биотехнология. — М.: Агропромиздат, 1990.-334 с.

15. Белова В. Ю., Вагин В. В., Зимина Л. В., Кузнецова Т. Н., Нецепляев С. В., Шейнкерман А. Н. Применение препаратов, предотвращающих плесневение продукта при производстве сырокопченых колбас. Обзорная информация. М.: АгроНИИТЭИММП. 1990. 28с.

16. Белоус А. М., Бондаренко В. А. Структурные изменения биологических мембран при охлаждении. Киев : Наук, думка, 1982. — 256 с.

17. Белоус А. М., Цветков Ц. Д. Научные основы технологии сублимационного консервирования. Киев : Наук, думка, 1985. - 208 с.

18. Белоус А. М., Шраго М. И., Пушкарь Н. С. Криоконсерванты. -Киев: Наук, думка, 1979. 200 с.

19. Белуков С.В., Иванов В.Ю. // Биотехнология. 1997. - № 2. - С. 4952.

20. Биотехнология: Учебное пособие для вузов. В 8 кн./ Под ред. Н. С. Егорова, В. Д. Самуилова. Кн. 2. Современные методы создания промышленных штаммов микроорганизмов / В. Г. Дебабов, В. А. Лившиц. — М.: Высш. шк., 1988. 208 с.

21. Бифидобактерии и их использование в молочной промышленности / Красникова Л. В., Салахова И. В., Шарбайко В. И. И др. М.: АгроНИИТЭИММП, 1994.-48 с.

22. Брода П. Плазмиды: Пер. с англ. М.: Мир, 1982. - 224 с.

23. Вараксин Н. А., Аборнева И. В., Рябичева Т. Г., Шалаев Е. Ю., Нечаева Е А., Киц И. В., Жилина Н. В. Изучение условий гидролиза желатина с целью разработки защитных сред для лиофилизации биопрепаратов // Биотехнология, 2000, № 2, с. 14-23.

24. Варфоломеев С. Д., Калюжный С. В. Биотехнология: кинетические основы микробиологических производств: Учеб. пособие для вузов. М.: Высш. шк., 1990.-296 с.

25. Владимиров Ю. А., Арчаков А. И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972. - 252 с.

26. Габараев А. Н. Разработка технологии сыровяленых колбас с использованием грибов рода Penicillium. Автореферат дисс. к. т. н. — М. 1986. -18 с.

27. Ганина В. И. Пробиотики. Назначение, свойства и основы биотехнологии: Монография. М.: МГУПБ, 2001. 169 с.

28. Долинский А. А., Иваницкий Г. К. Оптимизация процессов распылительной сушки. Киев: Наук, думка, 1984. - 240 с.

29. Думин М. В., Потапова К. В., Ярмонов А. Н. Оптимизация процесса производства сырокопченых колбас // Мясная индустрия, 2002, №3.

30. Журавская Н. К., Алехина JI. Т., Отряшенкова JI. М. Исследование и контроль качества мяса и мясопродуктов. М.: Агропромиздат, 1985. - 296 с.

31. Иванова В.Ю., Белуков С.В. // Биотехнология. 1996. - № 8. - С. 5052.

32. Ивашов В. И., Рощупкин В. И., Апраксина С. К. Новое в науке о мясе. Обзорная информация. М.: АгроНИИТЭИММП. 1992. 20 с.

33. Каганович Ю. Я., Злобинский А. Г. Промышленные установки для сушки в кипящем слое. JL: Химия, 1970. - 176 с.

34. Кадетов В. В., Курдяков Т. А., Терентьев А. Н., Качкина В. Г., Бородина Т. И., Саямов С. Р. Технология лиофильной консервации чумных фагов // Биотехнология, 1998, № 3, с. 63 67.

35. Камовников Б. П. и др. Вакуум-сублимационная сушка пищевых продуктов (Основы теории, расчет и оптимизация)/ Б. П. Камовников, JL С. Малков, В. А. Воскобойников. М.: Агропромиздат, 1985. - 288 с.

36. Кантере В. М. Теоретические основы технологии микробиологических производств: Учебники и учебные пособия для студентов высш. учеб. заведений. М.: Агропромиздат, 1990. - 271 с.

37. Карпов А. М., Улумиев А. А. Сушка продуктов микробиологического синтеза. М.: Легкая и пищевая пром — сть, 1982. — 216 с.

38. Клыков С. П., Падерин Ю. П., СадиковМ. М., Чупрунов В. П., Дербышев В. В., Гусев В. В. Влияние скорости роста культур на выживаемость сальмонелл // Биотехнология, 1996, № 1, с. 35 40.

39. Клыков С. П., Подерин Ю. П., Садиков М. М. и др // Биотехнология. 1996. - № 1. - С. 35 — 39.

40. Кобатов И. А., Никонов Б. А., Антонов С. Ф. Оптимизация процесса сублимационного высушивания вирус-вакцины против гепатита утят с использованием метода измерения электрического сопротивления высушиваемой системы // Биотехнология, 1996, № 2, с. 26-33.

41. Косой В. Д., Малышев А. Д., Дорохов В. П. Изменение структуры и консистенции сырокопченых колбас при их выработке // Мясная индустрия, 2001, №9.

42. Костенко Ю. Г., Текутьева Д. А., Жаринов А. И., Соколова Н. А. Новые виды сырокопченых изделий // Мясная индустрия, 2000, № 2.

43. Криобиология и биотехнология / Под ред. А. А. Цуцаевой. Киев : Наук, думка, 1987. - 216 с.

44. Лабинская А. С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. 3-е изд. перераб. и доп. М.: Медицина, 1972. 480 с.

45. Лясковская Ю. Н., Крылова Н. Н., Воловинская В. П., Пиульская В. И., Кельман Б. Я. Применение химических консервантов, антиокислителей, стабилизаторов и ионообменных смол в мясной промышленности. М.: Пищевая пром-сть, 1967. - 184с.

46. Маниатис Т., Фриш Е., Самбрук Дж. Молекулярное клонирование. -М.: Мир, 1984.-480 с.

47. Матвеев В. Е. Научные основы микробиологической технологии (кинетика развития и инактивации микробных популяций, асептика, масштабирование). М.: Агропромиздат. 1985. - 224 с.

48. Методы молекулярной генетики и генной инженерии / Мазин А. В., Кузнеделов К. Д., Краев А. С. И др. Новосибирск: Наука. Сиб. отделение, 1990.-248 с.

49. Минаев М. Ю., Костенко Ю. Г. Использование нитрита натрия и перспективы применения денитрифицирующих микроорганизмов при производстве мясных продуктов// Все о мясе, 2000, №1, с. 16-17.

50. Митин В. В., Газзаева А. Д., Славущев С. В. Интенсификация технологических процессов и оборудования в мясной промышленности. Обзорная информация. М.: АгроНИИТЭИММП. 1993. 44 с.

51. Молекулярная биология: Структура и биосинтез еуклеиновых кислот: Учеб. для биол. спец. вузов / В. И. Агол, А. А. Богданов, В. А. Гвоздев и др.; под ред. А. С. Спирина. М.: Высш. шк., 1990. - 352 с.

52. Мосичев М. С., Складнев А. А., Котов В. Б. Общая технология микробиологических производств. М.: Легкая и пищевая пром - сть, 1982. -264 с.

53. Мюнх Г. Д. и др. Микробиология продуктов животного происхождения: Пер. с мен./ Г. - Д. Мюнх, X. Заупе, М. Шрайтер и др. - М.: Агропромиздат, 1985. - 592с.

54. Нежута А. А., Сербис Е. С. Разработка научно-обоснованных режимов сублимационной сушки биопрепаратов // Биотехнология, 2001, № 6, с. 59-67.

55. Осадчая А. И., Кудрявцев В. А., Сафронова Л. А. Влияние некоторых факторов на криорезистентность и сохранение жизнеспособности при лиофилизации культур Bacillus subtilis // Биотехнология. 2002. - № 3. -С. 45-54.

56. Патрушев Л. И. Экспрессия генов. М.: Наука, 2000. - 527 с.

57. Пехов А. П. Плазмиды бактерий. М.: Медицина, 1986. - 224 с.

58. Плазмиды. Методы: Пер. с англ. / Под ред. К. Харди. — М.: Мир,1989.-267 с.

59. Поповский В. Г. Основы сублимационной сушки пищевых продуктов. М.: Пищевая пром - сть, 1967. - 104.

60. Пушкарь Н. С., Белоус А. М. Введение в криобиологию. Киев : Наук, думка, 1975. - 344 с.

61. Пушкарь Н. С., Белоус А. М., Цветков Ц. Д. Теория и практика криогенного и сублимационного консервирования. Киев : Наук, думка, 1984.-264 с.

62. Рогов и. А., Хорольский В. В., Липатов Н. Н., Алексахина В. А., Черкасова Л. Г. Тенденция применения биотехнологии в рациональном использовании животноводческого сырья: Обзорная информация. М.: АгроНИИТЭИММП, 1994. 32с.

63. Розанов Н. И. Справочник по микробиологической технике. Руководство для ветеринарных врачей диагностических кабинетов. М.: Гос. изд-во с/х литературы. 1957 282 с.

64. Рыжов С. А. Математическая модель изменения показателя рН в процессе сушки-созревания сырокопченых колбас // Мясная индустрия, 1999, №5.

65. Сажин Б. С. Основы техники сушки. М.: Химия, 1984. - 319 с.

66. Саломатин А. Д., Берлова Г. А., Волокитина 3. В. Новые биотехнологические процессы в мясной и молочной промышленности. Обзорная информация. М.: АгроНИИТЭИПП. 1997. 24 с.

67. Семенов Г. В., Касьянов Г. И. Вакуумная сублимационная сушка. Основы теории и практическое применение. М.: МГУ lib, г. Краснодар: КубГТУ, 2001.-108 с.

68. Сидоров М. А., Корнелаева Р. П. Микробиология мяса и мясопродуктов /3-е изд., исправл. М.: Колос, 2000. - 240 с.

69. Сингер М., Берг П. Гены и геномы: В 2 х т. Пер. с англ. - М.: Мир,1998.-373 с.

70. Синицын А. П., Райнина Е. И., Лозинский В. И., Спасов С. Д. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. — М.: Изд во МГУ, 1994. -288 с.

71. Степаненко П. П. Микробиология молока и молочных продуктов. Учебник для ВУЗов. Сергиев Посад: ООО «Все для Вас - Подмосковье»,1999.-415 с.

72. СФЕРА: Ингредиенты. Оборудование. Упаковка. Технологии. — Информационно-аналитический журнал для специалистов мясоперерабатывающей и масложировой индустрии. № 8, 2002 38 с.

73. Теппер Е. 3. и др. Практикум по микробиологии / Е. 3. Теппер, В. К. Шильникова, Г. И. Переверзева. Изд. 2-е, перераб. и доп.- М.: Колос, 1979. -216с.

74. Технология мяса и мясопродуктов / Алехина JL Т., Большаков А. С., Боресков В. Г. и др.; Под ред. Рогова И. А. М.: Агропромиздат, 1988. - 576 с.

75. Торможение жизнедеятельности клеток./ Под ред. М. Е. Бекера. — Рига: Зинатне, 1987, 239 с.

76. Тутова Э. Г., Куц П., С. Сушка продуктов микробиологического производства. -М.: Агропромиздат, 1987. 303 с.

77. Ураков Н.М., Волков В .Я., Боровик Р.В. //Биотехнология.-1988. № 4. - С. 420 -433.

78. Харитонов Д. В., Райдна Е. И. Изучение некоторых аспектов криозамораживания микробной биомассы // Хранение и переработка сельхозсырья, 2003, № 9, с. 64 66.

79. Хорольский В. В., Алексахина В. А., Папина В. А. Использование ароматизаторов в мясной промышленности: Обзорная информация. — М.: АгроНИИТЭИММП. 1994. 40 с.

80. Цветков Ц. Д. Сублимационное консервирование (лиофилизация) биологических материалов. В кн.: Актуальные проблемы криобиологии / Под ред. Пушкаря Н. С., Белоуса А. М. Киев : Наук, думка, 1981, с. 428 - 482.

81. Цуцаева А. А., Аграненко В. А., Федорова JI. И. и др. Криоконсервирование клеточных суспензий / Под общ. ред. Цуцаевой А. А. — Киев : Наук, думка, 1983. 240 с.

82. Шиффнер Э. и др. Бактериальные культуры в мясной промышленности: Пер. с нем./ Э. Шиффнер, В. Хагедорн, К. Оппель. М.: Пищевая пром-сть, 1980. - 96 с.

83. Alley G., Cours D., Demeyer D. Effect of nitrate, nitrite and ascorbate on colour and colour stability of dry, fermented sausages prepared using «back slopping» // Meat Sci. 1992. - № 32. - P. 279 - 287.

84. Bello J., Sanchez-Fuertes M. A. Application of a mathematical model for the inhibition of Enteriobacteriaceae and Clostridia during a sausage curing process // J. Food Protection. 1995. - № 58. - P. 1345 - 1350.

85. Berdague J. L., Monteil P., Montel M. C., Talon R. Effects of starter cultures on the formation of flavor compounds in dry sausage.// Meat Science. — 1993.-№35.-P. 275-287.

86. Brian C. S. To, Mark R. Etzel. Spray drying, freeze drying, or freezing of three different lactic acid bacteria species. // J. of Food Science. 1997. - V. 62.- № 3. P. 573 -578.

87. Bruna J. M., Hierro E. M., Hoz L., Mottram D. S., Fernandez M., Ordonez J. A. The contribution of Penicillium aurantiogriseum to the volatile composition and sensory quality of dry fermented sausages. // Meat Science. — 2001.-№59.-P. 97- 107.

88. Cassens R. G. Residual nitrite in cured meats // Food Technology. -1997.-№7.-P. 53-55.

89. Chasco J., Beriain M. J., Bello J. A study of changes in the fat content of some varieties of dry sausage during the curing process // Meat Sci. 1993. - № 34.-P. 191 -204.

90. Chasco J., Lizaso G., Beriain M. J. Cured colour development during sausage processing // Meat Sci. 1996. - № 44. - P. 203 -211.

91. Comi G., Cantoni C. Yeasts in matured raw sausages // Industr. Aliment.- 1980.-№ 19.-P. 857-860.

92. Conrad P. В., Miller D. P., Cielenski P. R ., de Pablo J. J. Stabilization and preservation of Lactobacillus acidophilus in saccharide matrices. // Cryobiology. Aug 2000. - № 41. - P. 17 - 24.

93. Coppola R., Iorizzo M., Saotta R., Sorrentino E. and Grazia L. Characterization of micrococci and staphylococci isolated from soppressatamolisana, a Southen Italy fermented sausage. // Food Microbiol. 1997. - 14. - P. 47-53.

94. Cordero M. R., Zumalacarregui J. M. Characterization of Micrococcaceae isolated from salt used for Spanish dry-cured ham. // Lett. Appl. Microbiol. 2000. - № 31. - P. 303 - 306.

95. Demeyer D. Quality and safety of fermented meat products // Flair Flow Reports. 1995. - F-FE 169/95.

96. Desmons, S., Krhouz, H., Evrard, and Thonart, P. Improvement of lactic cell production. // Appl. Biochemistry and Biotechnology. Spring 1998. - V. 70 -72. P. 513 -526.

97. Dominguez M. C., Zumalacarregui J. M. Lipolytic and oxidative changes in «chorizo» during ripening // Meat. Sci. 1991. - № 29. - P. 99 - 107.

98. Fairhead, H., Setlow, В., Waites, W. M. // Appl. and Environ. Microbiol. 1994. - V. 60. - № 7. - P. 291 - 298.

99. Garcia de Fernando G. D., Fox P. F. Study of proteolysis during the processing of a dry fermented pork sausage // Meat Sci. 1991. - № 30 - P. 367 -383.

100. Hammes W. P., Hertel C. New developments in meat starter cultures // J. Meat Science. 1998. - No Suppl. - P. 125 - 138.

101. Hammes W. P. and Knauf H. J. Starters in the processing of meat products. // Meat Sci. 1994. - № 36. - P. 155 - 168.

102. Hower R. O. Freeze-drying biological specimens: a laboratory manual. Washington: Smithsonian institution press city, 1979. - 196 p.

103. Klement J. Т., Cassens R. G., Fennema R. G. The effect of bacterial fermentation on protein solubility in a sausage model system // J. Food Sci. 1974. -№39.-P. 833 -835.

104. Komemushi S. Problems of heat sterilization kinetics. J. Ferment Technol. (Japan). 1971. - V. 49. - N 8. - P. 706 - 715.

105. Lucke F. K. Microbiological processes in the manufacture of dry sausage and raw ham. // Fleischwirtschaft. - 1986. - № 66. - P. 1505 - 1509.

106. Luzaso G., Chasco J., Beriain M. J. Microbiological and biochemical changes during ripening of salchichon, a Spanish dry cured sausage. // Food Microbiology. 1999. - № 16. - P. 219 - 228.

107. MacKenzie A. P. //Develop. Biol. Standard. 1966. - V. 36. - P. 5168.

108. MacKenzie A. P. Changes in electrical resistance during freezing and their application to the control of the freeze-drying process. Commission С 1 and С 2, Reports.-Tokio, 1985.-P. 155-163.

109. MacKenzie A. P. Collaps during Freeze-Drying qualitative and quantitative Aspects: Freeze-Drying and Advanced Food Technology. - London: Academ Press, 1975. - P. 277 - 308.

110. MacKenzie A. P. The phisiko chemical basis for the freeze-drying process. (S. Karger, Bassel) Develop. Biol. Standard. - 1977. - V. 36. - P. 51 - 68.

111. Merkle R. C. The technical feasibility of cryonics // Medical Hypotheses. 1992. V. 39. P. 6.

112. Miralles M. C., Flores J. and Perez-Martinez G. Biochemical tests for the selection of Staphylococcus strains as potential meat starter cultures. // Food Microbiol. 1996. - № 13. - P. 227 - 236.

113. Montel M. C., Masson F., Talon R. Bacterial role in flavor development.// Meat Science. 1998. - № 49. - P. 111 - 124.

114. Montel M. C., Reitz J., Talon R., Berdague J. L., Rousset-Akrim S. Biochemical activities of Micrococcaceae and their effects on the aromatic profiles and odours of a dry sausage model.// Food Microbiology. 1996. - № 13. - P. 489 -499.

115. Nychas G. J., Arkoudelos J. S. Staphylococci: their role in fermented sausages // J. Appl. Bacteriol. Symp. 1990. - № 67. (Suppl.) vi.

116. Papamanoli E., Kotzekidou P., Tzanetakis N. and Litopoulou-Tzanetaki E. Characterization of Micrococcaceae isolated from dry fermented sausage. // Food Microbiology. 2002. -№ 19. - P. 441 - 449.

117. Patent USA. Raccach. Fermentation composition using a selected Lactobacillus, April 30, 1985, № 4,514,424.

118. Patent Great Britain. Laurence Flockhart N. A., Robert F. White. -Improvements in or relating to freeze-drying biological material, June 16, 1965, № 995,362.

119. Patent USA. Olsen, et al. Bacterial product useful for making sausage, June 1, 1976, № 3,960,664.

120. Patent USA. Raccach. Method and bacterial compositions for fermenting meats, December 1, 1981, № 4,303,679.

121. Patent USA, Satz. Method and composition for the production of fermented sausage, December 9, 1980, № 4,238,513.

122. Patent USA. Sing. Culture of sour dough bacteria, May 3, 1977, № 4,021,581.

123. Patent USA. Swartz. Production of fermented type sausage, December 7, 1982, № 4,362,750.

124. Patent USA. Wiggins, Philippa M. Methods for the lyophilization of living biological materials, March 21, 2000, № 6,040,132.

125. PCR protocols a guide to methods and applications. Edited by Michel A. Innis, David H. Jelfand // Academic Press Inc. 1990. - P. 482.

126. Perry R. M. Cryonic suspensions: cumulative listing and some unusual highlights // Cryonics. 1994. - July. - P. 4 - 8.

127. Podile, A. R., Prakash, A. P. // Can. J. Microbiol. 1996. - V. 42. - № 6.-P. 533 -538.

128. Rassach M. Some aspects of meat fermentation // Food Microbiol. -1992. -№ 9.-P. 55-65.

129. Rebecchi A, Crivori S, Sarra P. G. and Cocconcell P. S. Physiological and molecular techniques for the study of bacterial community development in sausage fermentation.// The Society for Applied Microbiology. 1998.

130. Sajber C., Mitic P., Karakas R. Influence of some starter cultures upon the changes in proteins of «Stajer» sausages during fermentation // In Proceedings of the 17th European Meeting of Meat Research Workers, Bristol, UK. 1971. - P. 767.

131. Samelis J., Aggelis G., Metaxopoulos J. Lipolytic and microbial changes during the natural fermentation and ripening of Greek dry sausages // Meat Sci.-1993.-№35.-P. 371 -385.

132. Simatos D., Turc J. M. Freeze-drying and advanced food technology. Fundamentals of freezing in biological systems. London: Acad. Press. — 1975. P. 17-28.

133. Sorensen В. B. Lipolysis of pork fat by the meat starter culture Staphylococcus xylosus at various environmental conditions. // Food Microbiol. — 1997.-№ 14.-P. 153-160.

134. Stahnke L. H. Dried sausages fermented with Staphylococcus xylosus at different temperatures and with different ingredient levels. Chemical and bacteriological data//Meat Sci. 1995. - № 41. - P. 179 - 191.

135. Stahnke L. H. Aroma components from dry sausages fermented with Staphylococcus xylosus. // Meat Science. 1994. - № 38. - P. 39 - 53.

136. Sutic M., Joksimovic J. A contribution to the investigation on pure and conjoint cultures of streptococci and micrococci in the ripening of sausages. In Proceedings of the 19th European Meeting of Meat Research Workers. 1973. — P. 1629- 1644.

137. Terrell R. N., Quintanilla M., Vangerzant C., Gardner F. A. Effects of reduction or replacement of sodium chloride on growth of Micrococcus, Moraxella and Lactobacillus inoculated ground pork // J. Food Sci. 1983. - № 48. - P. 122 -124.