автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.04, диссертация на тему:Разработка технологии получения биопрепарата для переработки кератинсодержащих отходов

На правах рукописи

ЛИННИК АННА ИГОРЕВНА

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ ПЕРЕРАБОТКИ КЕРАТИНСОДЕРЖАЩИХ ОТХОДОВ

05.18.04 - технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

12 ФЕВ 2015

005558772

Кемерово 2015

005558772

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» (ФГБОУ ВПО «Кем-ТИПП»)

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор

Просеков Александр Юрьевич

Официальные оппоненты: Ханхалаева Ирина Архиповна,доктор

технических наук, профессор, ФГБОУ ВПО«Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления», кафедра«Стандартизация, метрология и управление качеством», заведующая кафедрой

Курбанова Марина Геннадьевна, доктор технических наук, доцент, ФГБОУ ВПО «Кемеровский государственный сельскохозяйственный институт», кафедра «Технология хранения и переработки сельскохозяйственной продукции», заведующая кафедрой

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт технологии консервирования»

Защита диссертации состоится «25» марта 2015 г. в 10:00 часов на заседании диссертационного совета Д212.089.01при ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности»по адресу: 650056, г. Кемерово, бульвар Строителей, 47,ауд 4., тел./факс: (3842)39-68-88.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности». С авторефератом можно ознакомиться на официальных сайтах ВАК Минобрнауки РФ (http://vak.ed.gov.ru/). ФГБОУ ВПО «КемТИПП» (http://www.kemtipp.ru/).

Автореферат разослан «/{?» января 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Кригер Ольга Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Вклад птицеводческой отрасли в производство мяса в России составляет 1,2 млн. т в год. При этом образуется 0,4 млн. т отходов потрошения птицы, что создает значительную проблему для перерабатывающей отрасли и требует решения следующих задач: обеспечение биологической безопасности; обеспечение экологической безопасности; производство полезных для человека продуктов (белков, жира, биологически активных веществ и т.д.); производство энергии.

Среди всех отходов потрошения птицы наибольший интерес представляет перопуховое сырье, в котором содержится около 65 % кормового белка. Решение проблемы перевода основного белка пера в усвояемую форму имеет первоочередное значение как с позиции мобилизации резервов животного белка, так и с точки зрения охраны окружающей среды.

Следует признать, что технологические решения по переработке органических отходов биологическим способами в промышленном птицеводстве не имеют достаточной научной базы. Без знания особенностей процесса биотермической переработки органических смесей процесс ферментации может привести к неизвестным и даже отрицательным результатам. Вместо ценных новых видов продукции можно получить в лучшем случае балластный материал, в худшем - большие объемы дополнительного экологически опасного отхода с большим количеством патогенной микрофлоры.

Ферментативный гидролиз кератинов приобретает важное значение в связи с возможностью создания на его основе различных добавок и гидролиза-тов не только кормового, но и пищевого значения. В связи с этим создание высокоэффективных продуцентов и производство на их основе ферментных препаратов позволит решить актуальную проблему рациональной переработки ке-ратинсодержащих отходов птицеперерабатывающей промышленности.

Степень проработки темы исследований. Вопросами рациональной переработки кератинсодержащих отходов и получения препаратов посвящены работы многих учёных и исследователей в этой области: И.А. Рогова, О.В. Козлова, В.Г. Волика, C.B. Полянских, Н.И.Осипова, В.О.Попова, А.Б. Лисицына, Л.В. Антиповой, E.H. Афанасьева, И.В. Семененко, Н.Г. Ковалева, Г.Ю. Рабиновича и др.

Несмотря на обширный теоретический и практический материал, в настоящее время продолжаются исследования по разработке и получению новых методов и культур микроорганизмов для эффективной переработки кератинсодержащих отходов в связи с получением белка кормового назначения. Одним из актуальных интенсивно разрабатываемых научно-исследовательских и практических направлений является совершенствование существующих и создание новых конкурентоспособных биопрепаратов, способов их применения в переработке керотинсодержащих отходов для получения белка с заданными свойствами и составом.

Цель и задачи исследований. Целью работы является разработка биопрепарата на основе микроорганизмов Bacillus pumilus для включения в технологическую линейку рациональной переработки кератинсодержащих отходов птицеперерабатывающей промышленности в кормовую белковую добавку.

Для достижения поставленной цели сформулированы основные задачи исследований:

- идентифицировать штамм микроорганизма полученного из природного источника по генетическим, морфологическим, фенотипическим особенностям и изучить биохимические свойства;

- изучить влияние технологических параметров культивирования на ферментные системы штамма Bacillus pumilus;

- подобрать оптимальный состав питательной среды для эффективной экспрессии метаболитов штамма Bacillus pumilus-,

- разработать рецептуру и технологическую схему получения кормовой добавки с применением биопрепарата на основе метаболитов штамма Bacillus pumilus;

- изучить состав и свойства кормовой добавки из кератинсодержащих отходов птицеперерабатывающей промышленности;

- разработать техническую документацию на биопрепарат и кормовую добавку;

- рассчитать ожидаемую экономическую эффективность, провести промышленную апробацию технологии.

Научная новизна работы заключается в следующем:

- изучены физиолого-биохимические, фенотипические и генетические свойства штамма выделенного из природного источника;

- установлено, что штамм относится к роду Bacillus, а генетический анализ позволил определить на 99 % вид микроорганизма; учитывая проведенные исследования и особенности штамма, его можно идентифицировать как Bacillus pumilus;

- на основании полученных результатов выбраны технологические параметры культивирования штамма Bacillus pumilus-, температура составляет (37±2) °С, pH среды 7,0-8,0, объем аэрации 1,150 дм3/мин, скорость перемешивания от 50 до 100 об/ мин;

- оптимизирован состав питательной среды, обеспечивающий максимальную продуктивность штамма Bacillus pumilus при культивировании: триптон -12%, панкреатический гидролизат - 12%, хлорид натрия - 0,2%, хлорид кальция - 0,6 %, фруктоза - 0,5% при температуре 37 °С и pH 7,00 в течение 24 ч;

- установлено, что культивирование на подобранной питательной среде в течение 12 ч при 37°С приводит к повышению протеолитической активности, которая составляет 24,13 Е/мг.

Практическая значимость работы. На основании полученных результатов описаны основные параметры получения биопрепарата с кератиназной активностью из штамма Bacillus pumilus. Разработан способ получения биопрепарата с использованием распылительной сушки при следующих параметрах:

температура сушки 60 °С; продолжительность сушки 6 ч. Штамм депонирован в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» с целью пополнения коллекции и правовой защиты штамма, обладающего кератиназной активностью. Разработана техническая документация (ТУ 9225-096-02054145-2014), регламент и рецептура биопрепарата. Проведена промышленная апробация технологии в компании ООО «Кера-Тех». Разработана технология переработки кератинсодержащих отходов птицефабрик в кормовую белковую добавку с применением биопрепо-рата, регламент и рецептура кормовой добавки. Проведена промышленная апробация технологии в компании ООО «Птицефабрика Инская».

Положения, выносимые на защиту:

- генетические, фенотипические особенности и биохимические свойства штамма Bacillus pumilus;

- технологические параметры культивирования и активность метаболитов штамма Bacillus pumilus;

- состав питательной среды и условия культивирования штамма Bacillus pumilus с кератиназной активностью;

- рецептура и технологическая схема получения кормовой добавки с применением биопрепарата на основе метаболитов штамма Bacillus pumilus.

Степень достоверности и апробация работы. Основные положения и результаты работы были предметом докладов и обсуждений на международных и межрегиональных научно-практических конференциях, семинарах, конгрессах: I Международной научно-практической конференции молодых ученых (Таганрог, 2011); Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых с международным участием «Технологии и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности» (Бийск, 2011); IV всероссийской конференции с международным участием студентов, аспирантов и молодых ученых «Пищевые продукты и здоровье человека» (Кемерово, 2011); школе-конференции молодых ученых «Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины-2011»,(Москва, 2011); всероссийской научно-практической конференции «Биомедицинская инженерия и биотехнология», (Курск, 2012); I международной научно-практической конференции «Проблемы современной биологии», (Москва, 2012); 16-ой международной Пущиновской школы - конференции молодых ученых «БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА» ( Пущино, 2012); конкурсе «Евразия - технология будущего» в номинации «Лучший экологический инновационный проект. Green progect 2012» (Екатеренбург, 2012); международном конкурсе «Молодой ученый Alltech» в области сельского хозяйства (Кентукки, 2012); VII международном симпозиуме «ЕС-Россия: сотрудничество в области биотехнологии, сельского, лесного, рыбного хозяйства и пищи в седьмой рамочной программе» (Москва, 2012); российской агропромышленной выставке «Золотая осень -2012», (Москва, 2012); 6-ой Международной биотехнологической выставке — ярмарке «Ро-сБиоТех — 2012» (Москва,2012); V международной школе молодых ученых по молекулярной генетике «Непостоянство генома» (Звенигород, 2012); VII московского международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития", (Москва, 2013); всероссийской молодежной научной конференции с

международным участием «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук», (Кемерово, 2013); 3rd International scientific conference "European Applied Sciences: modern approaches in scientific researches (Штудгард, 2013); Национальная премия «Зворыкинская премии» в области инноваций для молодых ученых и специалистов в номинации «Чистые технологии» (Москва , 2013)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе три - в журналах, рекомендованных ВАК министерства образования и науки РФ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из следующих основных разделов: введение, обзор литературы, объекты и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение, выводы, список использованных источников и приложения. Основное содержание работы изложено на 103 страницах машинописного текста, содержит 34 таблиц и 15 рисунок. Список литературы включает 166 наименований.

МЕТОДИКА ВЫПОЛНЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

Теоретические и экспериментальные исследования выполнены в соответствии с поставленными задачами на кафедре «Бионанотехнология» Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности». Отдельные этапы работы выполнены в рамках:

- конкурса научных проектов, выполняемых совместно с молодыми учеными и стран СНГ в научных организациях Российской Федерации в 2013 году" (№13-08-90902), организованном Российским фондом фундаментальных исследований (РФФИ) по теме "Получение бесплазмидного рекомбинантного штамма Bacillus licheniformis - продуцента кератиназы", (объем финансирования 280 тыс. рублей);

- ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 по теме: «Разработка технологии получения ферментных препаратов для решения задач пищевой, биотехнологической и фармацевтической промышленности методам генной инженерии и изучение полученных свойств», гос. контракт №14.В37.12.2074, (объем финансирования 2,5 млн. руб);

- ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» по направлению 1.2.1 по теме «Исследование и разработка комплексной технологии переработки отходов сельского хозяйства, пищевой и зерноперерабатывающей промышленности в функциональные продукты питания», гос. контракт№ 16.740.11.0058.

Весь цикл исследований состоял из нескольких взаимосвязанных этапов. Общая схема исследований представлена на рисунке 1. На первом этапе проводили анализ отечественных и зарубежных литературных данных по теме исследования, формулировали цель и задачи собственных исследований.

Рисунок 1. Общая схема проведения исследований

Второй этап исследований связан с идентификацией по морфологическим, культуральным и физиолого-биохимическим свойствам, молекулярно-генетическим характеристикам штамма, выделенного из природного источника.

Третий этап посвящен изучению влияния технологических параметров культивирования на активность штамма. Изучали влияние pH среды, температуры, продолжительности процесса культивирования на концентрацию биомассы, массовую долю белка и кератиназную активность штамма.

На четвертом этапе определяли оптимальный состав питательной среды для культивирования штамма с целью повышения активности продуцируемого фермента и увеличения степени гидролиза кератинсодержащего сырья.

В дальнейшем разрабатывали технологию получения биопрепарата для переработки кератинсодержащего сырья. Для этого разрабатывали рецептуру и технологическую схему получения биопрепарата, изучали состав и свойства продуктов гидролиза.

На заключительном этапе проводили расчет экономической эффективности технологии по получению кормовой добавки из кератинсодержащих отходов с применением биопрепарата, проводили промышленную апробацию технологии на предприятии отрасли.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Идентификация штамма, полученного из природного источника, и изучение его свойств

Чистую культуру бактерий Bacillus pumilus, обладающую кератиназной активностью, получали из подгнившего мяса говядины. Для изучения феноти-пических свойств использовали визуальный метод и метод микроскопирования. Анализировали форму, размер клеток, характер контура края, рельеф, поверхность, цвет структуру, консистенцию колоний.

Полученные данные свидетельствуют о том что, микроорганизмы, полученные из мяса, близки по фенотипическим показателям к бактериям рода Bacillus.

С целью анализа штамма по биохимическим свойствам использовали стандартизированные тест-системы API 50 СНВ с программным обеспечением идентификации Apiweb производства BioMerieux (Франция). Выявлено, что грамположительные палочки ферментировали глицерол, L-арабинозу, рибозу, D-ксилозу, D-глюкозу, D-фруктозу, D-маннозу, инозитол (циклогексан-1,2,3,4,5,6-гексол), маннитол, сорбитол (глюцит), а- метил-D - маннозид, ами-гдалин, арбутин (бета-О-глюкопиранозид), эскулин, салицин. Бактерии обладали способностью вырабатывать целлобиозу (4-(/?-глюкозидо)-глюкоза), мальтозу, сахарозу, трегалозу, крахмал, глюкоген, туранозу. Данные биохимические характеристики соответствуют виду Bacillus licheniformis на 98 %, а тест на вид Bacillus subtilis показал принадлежность у таксона данного микроорганизма на 1,1 %.

По результатам исследований показано, что культура обладает устойчивостью к лизоциму, который на ранних стадиях развития культуры снижает скорость развития, но не ингибирует данный штамм.

Далее провели генетическую идентификацию штамма Bacillus до вида с помощью анализа генов, кодирующих 16S РНК. Первичный скрининг по базе данных GenBank и RDP-II показал, что исследуемый штамм принадлежит к следующим систематическим группам Bacteria; Firmiertes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus.

Последовательности выравнивали с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий, доступными из базы данных GenBank, наибольшее совпадение длины участка наблюдается у Bacillus vallismortis, однако если рассматривать показания по скору в NSBI, то наиболее близкими к Bacillus safensis и Bacilluspumilus. Дальнейший анализ по RDP II 16S рРНК базе данных показал гомологию с теми же видами бактерий.

По данным анализа было построено филогенетическое дерево с гомологичными штаммами (рисунок 2).

(-«Bacillus amyloüquefaciens (Т); NBRC 15535 Bacte metnyiotrcpiras (Т); СВМВ205

.Bacillus aeropliilus (T); type strain:28K flteacilus stratosphericus (TJ, type strain 41 KF2a Bacillus pumilus (T),ATCC 70St

-.АЫ6

*-Bacillus itensis (T); SMC 4352-2

Bacillus safensis |T), FO-оЗбЪ L—Bacillus aiKudmis (T); type stra«T4lKF2b Bacillus subtilis (T); NRRL B-23049 Bacillus valiismoiti$(T);DSMH03i

001

UUbtli

|Ba t

Рисунок 2. Филогенетическое дерево гомологичных штаммов

Критерием отнесения микроорганизма к тому или иному виду считается гомология не менее 97%. По этому критерию исследуемый штамм можно отнести к нескольким видам рода Bacillus.

Анализ филогенетического родства, построенный с использованием типовых штаммов близкородственных бактерий, показал, что наиболее близкими к исследуемому штамму являются виды Bacillus pumilus и Bacillus safensis.

С учетом культурально-морфологических и биохимических свойств штамм, полученный из природного источника, относится к роду Bacillus, а генетический анализ позволил определить на 99 % вид микроорганизма, учитывая проведенные исследования и особенности штамма. Его можно идентифицировать как Bacillus pumilus.

Изучение влияния технологических параметров культивирования на кератинолитическую активность Bacilluspumilus

Культивирование проводили в течение 12 ч при 37±2 °С. В ходе исследований параметры pH варьировали от 5,0 до 12,0 с шагом 1,0. Активность фермента определяли до и после разрушения клеточной стенки ультразвуковой установкой. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Кератинолитическая активность штамма Bacillus pumilus в зависимости от pH питательной среды_____

Активность, Е/мг pH питательной среды

5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 12,0

До разрушения 9,50± 0,28 10,25± 0,40 12,15± 0,40 12,53± 0,41 11,77± 0,38 10,63± 0,35 8,73± 0,28 7,21± 0,23

После разрушения 10,63 ±0,35 10,63± 0,35 12,91± 0,42 13,29± 0,44 13,67± 0,45 12,53± 0,41 10,25 ±0,40 8,73± 0,28

В результате анализа данных, представленных в таблице 1, установлено, что оптимальным диапазоном pH среды для культивирования является 7,0-8,0. В данном диапазоне происходит максимальная активация фермента и его накопление в культуральной жидкости.

Для анализа выбрали три скорости перемешивания 50, 100, 150 об/мин. Культивирование проводили при температуре 37±2 °С изучали скорость прироста биомассы, белка и активность фермента. Оптимальный диапазон скорости перемешивания для микроорганизма составляет от 50 до 100 об/ мин.

Подбор оптимального состава питательной среды для культивирования штамма Bacillus pumilus

В ходе исследований варьировали источники азота (пептон, сульфат аммония, дрожжевой экстракт) и углерода (глюкоза, лактоза, фруктоза, сахароза, сорбит). Варьировали как состав питательных сред, так и соотношение вносимых компонентов. Выбор питательной среды проводили по активности керати-назы при культивировании микроорганизма.

Оптимальным составом питательной среды для культивирования микроорганизмов является среда, в состав которой входит фруктоза. При культивировании на данной среде достигается максимальная активность фермента и его накопление в культуральной жидкости. Использование сорбита, наоборот, снижает эффективность накопления фермента и его наработку.

Проводили варьирование в питательной среде концентрации фруктозы. Для этого ее содержание меняли от 5 до 20 г/дм3 с шагом 5 г/дм . Контроль и выбор оптимальной концентрации фруктозы определяли по показателям прироста биомассы, белка и активности фермента. Полученные данные представлены в таблицах 2-3.

Таблица 2 - Накопление белка микроорганизмов Bacillus pumilus в зависимости от концентрации фруктозы в питательной среде___

Массовая доля фруктозы г/дм3 Содержание белка, мг/дм3, при продолжительности культивирования, ч

4 8 12

5 321,886±12,8 344,607±13,7 375,779±15,0

10 189,607±35,6 217,041±70,8 222,865±48,8

15 144,738±21,7 190,287±19,6 171,905±18,8

20 102,937±40,8 127,452±50,8 148,033±59,2

Из таблицы 2 видно, что наибольшее содержание белка в течение 4 ч культивирования наблюдается при массовой доле фруктозы 5 г/дм3. Также анализ результатов показал, что с увеличением продолжительности времени культивирования содержание белка при концентрации фруктозы 5 г/ дм3 увеличивается, следовательно, целесообразно внесение наименьшей концентрации фруктозы в состав питательной среды.

Таблица 3 - Накопление биомассы микроорганизмов Bacillus pumilus в зависимости от концентрации фруктозы в питательной среде__

Массовая доля фруктозы г/дм3 Содержание биомассы, г/дм3 при продолжительности культивирования, ч

4 8 12

5 1,655± 0,005 1,716±0,006 1,837±0,006

10 1,213±0,004 1,196±0,005 1,183±0,004

15 0,491±0,001 0,876±0,004 1,228±0,004

20 0,456±0,001 0,950±0,004 1,118±0,004

При анализе данных таблицы 3 можно сделать вывод о том, что интенсивный прирост биомассы наблюдается при концентрациях фруктозы 5 г/дм . Полученные данные свидетельствуют о том, что при сравнении показателей биомассы наибольшее значение имеет микроорганизм, развивающийся при концентрации фруктозы 5 г/дм3. Зависимость аэрации от насыщенности кислородом питательной среды представлена в таблице 4.

Продолжительность роста микроорганизмов, ч_

Насыщенность кислородом, %_

Скорость аэрация, дм3/мин_

1

46,5± 0,46

0,465± 0,005

26,3± 0,26

0,263± 0,003

8

86,5± 0,87

0,865± 0,009

12

110,2± 1,10

1,102± 0,010

18

114,8± 1,2

1,150± 0,015

Таблица 4 - Зависимость аэрации от насыщенности кислородом питательной среды

24

114,8± 1,2

1,150± 0,015

Из таблицы 4 видно, что оптимальной для роста и развития штамма Bacillus pumilus скорость аэрации должна составлять 1,150 дм3/мин, так как данного объема хватает на развитие микроорганизмов без кислородного голодания.

Оптимальным вариантом культивирования в ферментере объёмом 5 дм3 является продолжительность 21ч, при перемешивании 80 об\мин. В таблице 5 представлены параметры процесса культивирования продуцентов кератиназы Bacillus pumilus в биореакторе.

Таблица 5 - Параметры культивирования продуцентов кератиназы Bacillus pumilus

Параметры Значения

Продолжительность, ч 21,0 ±5

Температура, °С 37,0 ± 2

РН 7,0 ±1,0

Число оборотов мешалки, об/мин 80,0 ±10,0

Скорость аэрация, дм~Умин 1,150 ±0,250

ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕАЛИЗАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

На основании анализа данных разработана технологическая схема получения биопрепарата для биотрансформации кератинсодержащего сырья (рисунок 3).

Рисунок 3. Технология получения биопрепарата для биотрансформации кератинсодержащего сырья

Сушку растворов биопрепарата вели на экспериментальной установке, с возможностью регулировки подачи скорости рабочего раствора и распыляющего потока газа. Проводили гидролиз кератинсодержащего сырья, а именно перьевых отходов птицефабрик.

Технологический процесс получения кормовой добавки на основе гидро-лизованного пера осуществляют согласно схеме (рисунке 4), которая состоит из последовательных и взаимосвязанных этапов: подготовка перопухового сырья, активизация культуры Bacillus pumilus - продуцента фермента кератиназы, ферментативный гидролиз перопухового сырья, инактивация продуцента и фермента, фильтрация гидролизата, распылительная сушка, контроль показателей безопасности готовой белковой добавки и ее фасовка. Очистку фермента проводили с применением сульфата аммония.

Рисунок 4. Технологическая схема получения кормовой добавки

На первом этапе технологической схемы осуществляют подготовку перопухового сырья. Перо, полученное на птицефабрике, очищают промывкой от животноводческих загрязнений и продуктов убоя птицы, далее обрабатывают слабым щелочным раствором, который не оказывает отрицательного действия на перо. По-

еле промывки перо сушат, проверяют на наличие посторонних примесей и измельчают с добавлением карбоната кальция для простоты измельчения.

Параллельно проводят посев микроорганизмов на питательную жидкую среду с целью активации для получения работоспособных культур микроорганизмов Bacillus pumilus и наработки кератолитических ферментов. Для активации и накопления биомассы микроорганизмов используют питательную среду определенного состава, культивирование осуществляют при температуре 37± 1°С, pH среды 6,8-7,0, в течение 12 - 32 ч с постоянным перемешиванием 50-100 об/мин.

После культивирования культуру микроорганизмов обрабатывают ультразвуком, ультразвук можно заменить охлаждением культуры до 5° С для инактивации клеток, далее отделяют клетки от культуральной жидкости с помощью фильтрования под вакуумом. Полученную культуральную жидкость при необходимости сушат на распылительной сушилке для получения однородной консистенции, мелкодисперсного порошка.

В обезжиренное измельченное перо вносят полученный активный биопрепарат вместе с питательной средой и воду, в соотношении 25 г пера на 1 дм3 воды и 3 г биопрепарата.

Далее проводят процесс ферментативного гидролиза в течение 28±0,5 ч при температуре 37±1°С. Температурный режим выбран таким образом, что нагрев сырья с внесенным биопрепаратом позволяет активизировать ферменты для перевода кератина пера в усвояемую форму. Соответственно, процесс биотрансформации начинается сразу после внесения биопрепарата.

По окончании ферментативного гидролиза гидролизат подвергается инактивации. Параметры инактивации выбраны таким образом, чтобы ферменты прекращали свое действие на гидролизат. Так как фермент кератиназа работает в широком температурном диапазоне от 24±2°С до 65±2°С, в связи с этим для инактивации выбрана низкая температура 0±1°С в течение 10±1 мин. Данные параметры оптимальны для инактивации в производственных масштабах.

Высушенную кормовую добавку анализировали на содержания аминокислот методом капиллярного электрофореза (таблица 6). Выявлено, что не происходит потери аминокислот перопухового сырья, соответственно данная кормовая добавка так же представляет интерес по составу незаменимых аминокислот и может использоваться для расчета рецептуры комбикормов с применением ее в их составе.

Далее проводили анализ кормовой добавки для определения общей кислотности (число Неймана) составляет 0,36 °Н, что в свою очередь соответствует нейтральной pH кормовой добавки 7,3 и может применяться в составе комбикормов для сельскохозяйственных животных.

Важными показателем, характеризующим безопасность биопрепарата, являются микробиологические показатели, соответствующие Единым санитарно-эпидемиологическим и гигиеническим требованиям к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому надзору, приведенным в таблице 7.

Таблица 6 - Определение массовой доли аминокислот в кормовой добавке

Наименование образца Определяемый параметр Массовая доля аминокислоты в образце, мг/ г продукта

Аргинин 663,60±265,44

Лизин 148,25±50,40

Тирозин 42,63±12,79

Фенилаланин 62,02± 18,61

Гистидин 36,75±18,38

Лейцин + Изолейцин 148,77±38,68

Метионин 43,33±14,73

Кормовая добавка Валин 73,42±29,37

Пролин 92,02±23,92

Треонин 56,49±22,60

Серин 92,02±23,92

Алании 113,51±29,51

Глицин 109,82±37,34

Глутаминовая кислота 289,66±115,86

Аспарагиновая кислота 111,06±44,42

Цистин 390,00±195,00

Таблица 7 - Микробиологические показатели белковой кормовой добавки

Наименование показателя Нормы Фактические

Количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ), КОЕ/г 5-Ю4

Бактерии группы кишечных палочек (БГКП, колиформы), в 1 г не допускается Не обнаружено

Наличие сальмонелл, КОЕ/ 25 г не допускается Не обнаружено

Наличие бактерий, КОЕ/1 г Не более 30 Не обнаружено

Плесени, КОЕ/г 50 Не обнаружено

Дрожжи, КОЕ/г 50 Не обнаружено

Высев бактерий Споры в целом генерируют Bacillus

Анализ полученных результатов показал, что по содержанию санитарно-показательных и патогенных микроорганизмов исследуемые образцы кормовой добавки отличаются высокой надежностью, поскольку искомые микроорганизмы (бактерии группы кишечной палочки, золотой стафилококк, сальмонеллы) в нормируемых массах продукта отсутствуют.

ВЫВОДЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ

1 .Установлено, что микроорганизмы, выделенные из природного источника, относятся к бактериям рода Bacillus и устойчивы к антибиотику лизо-цим. Филогенетический анализ подтвердил родовую принадлежность, а так же позволил определить вид pumilus.

2. Изучено влияние технологических параметров культивирования на активности штамма Bacillus pumilus. Установлено что при температуре 37±2°С накопленный микроорганизмами фермент наиболее активен (28,47 Е/мг),

3. Подобран оптимальный состав питательной среды, обеспечивающий максимальную продуктивность штамма Bacillus pumilus при культивировании: триптон - 12%, панкреатический гидролизат - 12%, хлорид натрия - 0,2%, хлорид кальция - 0,6 %, фруктоза - 0,5%

4. Разработаны рецептура и технологическая схема получения кормовой белковой добавки из кератинсодержащего сырья. Кормовая добавка соответствует санитарно-гигиеническим требованиям, обладает высокой биологической активностью.

5. Разработана техническая документация, регламент и рецептура биопрепарата (ТУ 9225-096-02054145-2014). Используемый в технологической схеме штамм депонирован в ФГУП «ГосНИИгинетика». Промышленная апробация технологии проведена а ООО «Птицефабрика Инская».

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Морозова (Линник), А.И. Изучение влияния технологических факторов на процесс биотрансформации кератинсодержащего сырья с целью разработки технологии получения комбикормов/ А.И. Морозова, П.В. Митрохин// Всероссийская научно-практическая конференция «Биомедицинская инженерия и биотехнология», отв. ред. A.A. Краснов,- Курск, 2011. - С. 136 - 138.

2. Морозова (Линник), А.И. Белковый и аминокислотный анализ продуктов биотрансформации кератинсодержащего сырья / А.И. Морозова, П.В. Митрохин // Проблемы современной биологии Материалы I Международной научно-практической конференции. - М.: Издательство «Спутник»,2011,-С. 101-103.

3. Морозова (Линник), А.И. Основные аспекты гидролиза вторичного кератинсодержащего сырья иммобилизованным ферментом / А.И. Морозова, Л.С. Солдатова // Материалы научной школы для участников программы «Участник Молодежного Научно-инновационного Конкурса» под общей ред. В.П. Юстратова; КемТИПП.- Кемерово, 2011. - С. 68-72.

4. Бабич О.О. Переработка вторичного кератинсодержащего сырья и получение белковых гидролизатов на пищевые и кормовые цели / О.О. Бабич, И.С. Разумникова, А.Ю. Полетаев, А.И. Морозова (Линник) // Техника и технология пищевых производств. - 2011. - №2. - С. - 7-12.

5. Линник, А.И. Использование биодобавок для консорциума микроорганизмов, окисляющих отходы сельскохозяйственных птиц / А.И. Линник, Л.А. Остроумов, ОБ. Кригер // Вестник КрасГАУ. - 2012. - №. 1. - С. 122 -124.

6. Линник, А.И. Исследование и разработка технологии переработки отходов сельского хозяйства и пищевой промышленности / А.И. Линник, Л.А. Остроумов, О.В. Кригер и др. // Вестник Бурятской государственной сельскохозяйственной академии им В.Р. Филиппова. - 2012. - №4 (29). -С. 77-82.

7. Линник, А.И. Экспрессия гена ker для получения сверхпродуцента кера-тиназы / А.И. Линник //«X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова»: научная конференция по биоорганической химии и биотехнологии. - Москва-Пущино, 2011. - Т.2. - С.34-35.

8. Линник А.И. Рационально-эффективная переработка органических отходов птицефабрик страны / А.И. Линник // V Международная школа молодых ученых по молекулярной генетике «Непостоянство генома»: тезисы докладов. - М.: Мегакатолог, 2012. — С.41.

9. Линник А.И. Функциональная переработка пухоперьевых отходов с применением штамма сверхпродуцента / А.И. Линник //Сборник работ победителей отборочного тура Всероссийского смотра - конкурса научно-технического творчества студентов вузов. — Новочеркасск: ЛИК, 2012. -122-123с.

10.Линник, А.И. Изучение влияния технологических факторов на процесс биотрансформации кератинсодержащего сырья с целью разработки технологии получения комбикормов /А.И. Линник, П.В. Митрохин // Всероссийская научно-практическая конференция «Биомедицинская инженерия и биотехнология». - Курск, 2011. - 45-48с.

1 l.Linnik, A.I. Optimization of cultivation parameters Bacillus subtilis / A.I. Lin-nik, O.O. Babich, AJ. Prosekov, P.V. Mitrohin // 3rd International scientific conference "European Applied Sciences: modern approaches in scientific researches". - Germany: Stuttgart, 2013. - Vol. 2. - P. 35-37.

12.Линник, А.И. KeraTech / А.И. Линник // Каталог научно-инновационных проектов конкурса «Изобретатель XXI Века». - Иркутск: Фестиваль науки, 2013.-С. 26.

Подписано в печать 20.12.2014. Формат 60x86/16. Тираж 80 экз. Объем 1,1 п.л.

Заказ № 141

Кемеровский технологический институт пищевой промышленности. 650056, г. Кемерово, б-р Строителей, 47. Отпечатано в лаборатории множительной техники КемтТИППа. 650010, г. Кемерово, ул. Институтская, 7