автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.04, диссертация на тему:Разработка технологии ферментированной основы из молочного сырья с использованием консорциума микроорганизмов

На правах рукописи

ОЛМОЕВА ВАЛЕНТИНА ДАШИЕВНА

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ФЕРМЕНТИРОВАННОЙ ОСНОВЫ ИЗ МОЛОЧНОГО СЫРЬЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОНСОРЦИУМА МИКРООРГАНИЗМОВ

Специальность: 05.18.04 - Технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата технических наук

005550057

1 ^ и:он 2см

Улан-Удэ-2014

/¿Г

005550057

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления» (ВСГУТУ)

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор

Хамнаева Нина Ивановна

Официальные оппоненты: Цыдыпов Виктор Цыбанович

доктор ветеринарных наук, профессор, зав. кафедрой микробиологии, вирусологии и ветеринарно-санитарной экспертизы» ФГБОУ ВПО «Бурятская государственная сельскохозяйственная академия им. В.Р. Филиппова»

Енальева Лариса Викторовна

кандидат технических наук, доцент, зав. кафедрой технологии молока и пищевой биотехнологии ФГБОУ ВПО «Донской государственный аграрный университет»

Ведущая организация: ФГБУН «Институт общей и

экспериментальной биологии СО РАН» (г. Улан-Удэ)

Защита диссертации состоится 30 июня 2014 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 212.039.05 при ФГБОУ ВПО «ВосточноСибирский государственный университет технологий и управления» по адресу: 670013, г. Улан-Удэ, ул. Ключевская 40в, ауд. 8-124.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления» (www.esstu.ru).

Автореферат разослан « 30 » мая 2014 года.

Ученый секретарь /я

диссертационного совета ( ЙГ^ Столярова Анна Сергеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Для реализации Концепции государственной политики в области питания населения Российской Федерации до 2020 г. необходимо разработать широкий спектр функциональных продуктов, содержащих ингредиенты, которые повышают сопротивляемость заболеваниям, улучшают многие физиологические процессы в организме человека, позволяя ему долгое время сохранять активный образ жизни. В современных условиях специалистами уделяется повышенное внимание поиску способов использования всех составных частей молока. Одним из наиболее ценных в пищевом отношении является молочная сыворотка — уникальная по содержанию незаменимых факторов питания. Непосредственное использование молочной сыворотки, особенно творожной, на пищевые цели, сдерживается из-за неблагоприятного сочетания высокой кислотности и специфических органолептических показателей. Снижение кислотности возможно за счёт использования химических веществ или направленного культивирования микробных клеток. В этом плане заслуживают внимания природные минеральные воды с более низким значением кислотности и микробные «системы», отличающиеся естественно сложившимся симбиозом микроорганизмов, к которым относятся кефирные грибки.

Преимущества использования симбиоза микробных партнеров в биологически сформировавшихся консорциумах очевидны: повышение эффективности биоконверсии используемой питательной среды; возрастание удельной скорости роста микробных клеток, усиление сопротивляемости к воздействию внешних факторов. Наращивание биомассы кефирных грибков на молочной сыворотке изучены Рожковой И.В. Для повышения активности кефирных грибков в питательную среду добавляют стимуляторы роста - кукурузный, дрожжевой экстракт, гидролизованное молоко, регулируют интенсивность аэрации. Однако получение в микробной системе кефирных грибков высокого титра эукариотических клеток остается актуальной. Поэтому представляется целесообразным исследовать биопотенциал лактозосбраживающих дрожжей с последующим культивированием на молочной сыворотке с целью более полного использования компонентов молока.

Цель работы. Целью диссертационной работы являлась разработка технологии ферментированной основы из молочного сырья, обладающей функциональными свойствами, путем создания консорциума эу- и прокариотических микробных клеток, способной к максимальному накоплению активных клеток дрожжей.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- экспериментально обосновать компонентный состав питательной среды для получения активных клеток лактозосбраживающих дрожжей;

- разработать способ культивирования лактозосбраживающих дрожжей, подобрать режимы для роста и накопления биомассы дрожжей;

- получить микробный консорциум на основе активных клеток лактозосбраживающих дрожжей, микробной ассоциации кефирных грибков и промышленного штамма L. acidophilus 317/402 и изучить характер взаимного влияния культур;

- определить физико-химические, биохимические характеристики, установить сроки и условия хранения микробного консорциума;

- определить возможность использования микробного консорциума для ферментации комбинированной смеси на основе молочной сыворотки и природной минеральной воды;

- разработать технологию новой ферментированной основы, выявить биологическую ценность. Исследовать возможность её использования в производстве соусов.

Научная новизна. Обоснована возможность получения активной биомассы лактозосбраживающих дрожжей на основе биогенных элементов природной минеральной воды. Установлено, что подобранные условия культивирования стимулируют рост лактозосбраживающих дрожжей. С учетом кислотообразующей и антибиотической активности выбрано оптимальное соотношение микроорганизмов консорциума. Использование микроорганизмов для ферментации комбинированного сырья, состоящего из молочной сыворотки и минеральной воды, способствует синтезу витаминов группы В и обеспечивает высокое количество лактозосбраживающих дрожжей и ацидофильной палочки в ферментированном продукте.

Практическая значимость. Разработан проект технической документации на ферментированную основу из молочного сырья (ТУ 9229-086-020694732014). На способ получения питательной среды для культивирования лактозосбраживающих дрожжей получен патент РФ за № 2482173. Результаты работы внедрены в учебный процесс: используются при выполнении лабораторных, курсовых, дипломных работ на основе вновь разработанных методических указаний к выполнению лабораторных и научно-исследовательских работ студентов по специальности 100100 «Сервис» по дисциплине «Экспертиза и диагностика объектов и систем сервиса», «Материаловедение в производстве услуг». Работа выполнялась в рамках НИР № 01.20.08.07.257 от 17.07.2008 «Формирование рекреационных технологий в условиях экосистем Забайкалья». По выполняемой теме в 2011 г. выигран внутривузовский грант на конкурсе среди молодых ученых.

Апробация работы. Основные положения, результаты и выводы, сформулированные в диссертации, докладывались на международных, всероссийских и региональных семинарах и конференциях: «Экономика и бизнес. Взгляд моло-дых-2007» (г. Челябинск); «Научный прогресс на рубеже тысячелетий - 2007» (г. Днепропетровск); «Ломоносов — 2008» (г. Москва); конференции аспирантов и преподавателей ВСГУТУ - 2007, 2008, 2010, 2011, 2012, 2013, 2014 (г. Улан-Удэ); «Стратегии развития туризма в муниципальном образовании «Тункинский рай-он»-2009» (г. Улан-Удэ).

Публикации. По результатам выполненных исследований опубликовано 13 работ, в том числе 3 статьи в журналах рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Структура и объём диссертации. Работа состоит из введения, 3 глав, выводов, списка литературы, приложений. Основной текст диссертации изложен на 100 страницах, включает 14 рисунков, 21 таблицу и 4 приложения. Список литературы включает 185 наименований.

МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

Объектами исследований служили штаммы лактозосбраживающих дрожжей, выделенные из спонтанных микробных цинозов молочного сырья (заявка о выдаче патента РФ № 2008129628), микробная ассоциация кефирных грибков (А.с. РФ № 1622086), чистые культуры ацидофильных палочек (штамм L. acidophilus 317/402). Схема проведения исследований представлена на рис. 1.

Показатели:

1 - органолептические показатели;

2 - титруемая кислотность;

3 - активная кислотность;

4 — содержание сухих веществ;

5 - массовая доля лактозы;

6 - аминокислотный состав;

7 — содержание витаминов;

8 - содержание минеральных веществ;

9 - ИК — спектрометрия;

10 -морфологические показатели;

11 - количество лактозосбраживающих дрожжей;

12 -КМАФАнМ;

13 -количество ацидофильных палочек;

14 - содержание патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (БГКП, Salmonella, Staphilococcus aureus);

15— выход биомассы;

16 - антибиотическая активность,

17 - антагонистическая актив-

Рисунок 1 - Схема проведения исследований

При проведении экспериментов использовали общепринятые и современные физико-химические, биохимические и микробиологические методы исследований. Титруемую кислотность определяли стандартными методами; антибиотическую активность - методом последовательных разведений по методике Полонской М.С.; количественный учет термофильных и мезофильных лактобак-терий - на твёрдой питательной среде при температуре 40 и 30 °С соответственно; количество дрожжей, сбраживающих лактозу — на картофеле-лактозном агаре; количество дрожжей не сбраживающих лактозу - на среде Сабуро; количество клеток ацидофильной палочки - методом предельных разведений по ТУ 9229-

083-00419785-97 «Гидролизованное молоко с агаром»; наращивание биомассы -по оптической плотности фотоколориметричеким методом на концентрационном фотоэлектрическом колориметре КФК-2 при длине волны >.=550 нм; морфологию клеток — окрашиванием метиленовой синью и по Граму. Содержание витаминов, органических кислот определяли с помощью системы капиллярного электрофореза «Капель-105М»; спектрофотометрию культуральных жидкостей - с помощью ИК-Фурье спектрометра №со1е!-380. Статистическую обработку результатов исследований проводили в пакте 81ай51дса 12.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Обоснование компонентного состава питательной среды для получения активного инокулята дрожжей

Анализ физиологических компонентов (значение рН, уровень общей минерализации - 4100,7 мг/л; содержание - 0,1 г/л) природной минеральной воды Забайкалья, позволил выбрать её в качестве источника минерального питания эукариотических микробных клеток. Известные способы культивирования биоты кефирных грибков не обеспечивают высокий титр активных клеток лакто-зосбраживающих дрожжей, обладающих адгезивными свойствами, инициирующих в среде спиртовое брожение. Проведены исследования по подбору компонентов питательной среды для культивирования лактозосбраживающих дрожжей. Выявили зависимость выхода биомассы дрожжевых клеток (по общему микробному числу У1 и количеству активных клеток дрожжей Уг) от объема дрожжевого перевара Х1, природной воды Х2— статистическими методами. Содержание планирования эксперимента представлено в таблице 1.

Таблица! - Содержание планирования эксперимента

Условия планирования Значения факторов, %

X, х2

Основной уровень (0) 3,5 47,5

Интервал варьирования 1,8 23,75

Верхний уровень (+1) 5,3 71,25

Нижний уровень (-1) 1,7 23,75

Верхняя «звездная» точка (+2) 7 95

Нижняя «звёздная» точка (-2) 0 0

Характер изменения общего микробного числа имеет следующий вид:

У2 = 8,1786-0,1272*х-0,1444*у-0,2371*х*х-0,0878*х*у-0,2851*у*у (1)

Исследованиями морфологии активных клеток дрожжей, выращенных в питательной среде на основе природной минеральной воды, доказано отсутствие изменений формы, характера скопления клеток (рисунок 2).

В обоих случаях клетки дрожжей имели овальную, сферическую, изредка цилиндрическую форму, почкование было односторонним, расположение одиночное, в парах, редко в маленьких пучках или склеенных массах.

Размеры клеток составили (3,3-3,7) х (4,1-4,5) мкм.

а б в г

а - контроль (увеличение 7000), б - опыт (увеличение 7000), в - контроль (увеличение 10000), г-опыт (увеличение 10000)

Рисунок 2 - Микрокартина лактозосбраживающих дрожжей, полученных на модифицированной питательной среде (опыт) и среде Сабуро (контроль)

Колонии клеток дрожжей, полученных на твердой питательной среде, имели округлые формы, серовато-белый цвет с ровными краями, пастообразную консистенцию (рисунок 3).

а б

а - колонии дрожжевых клеток, выращенные на среде Сабуро, б - колонии дрожжевых клеток, выращенные в питательной среде из природной минеральной воды

Рисунок 3 - Культуральные свойства клеток дрожжей

Исследованиями выявлен стимулирующий эффект состава природной минеральной воды (47,5%) на выход биомассы лактозосбраживающих дрожжей, увеличения титра их активных клеток. При этом морфологические, культуральные свойства клеток не изменяются.

Разработка способа получения консорциума микроорганизмов на основе активного инокулята дрожжей, микробной ассоциации кефирных грибков и промышленного штамма L. acidophilus 317/402

Важной характеристикой технологичности микроорганизмов, используемых для ферментации является их способность к сохранению высокого титра активных клеток в целевых продуктах, а также удельная скорость роста, устойчивость к внешним факторам, эффективность накопления продуктов жизнедеятельности. С этой целью изучено совместное развитие активных клеток дрожжей, полученных на модифицированной питательной среде, микробной ассоциации кефирных грибков (источник мезофильной микрофлоры), чистой культуры ацидофильных палочек.

Исследованиями сочетаемости, характера взаимоотношений, используемых эу- и прокариотических клеток (рисунки 4, 5, таблицы 2, 3) подобрано соот-

ношение активных дрожжевых клеток, микробной ассоциации кефирных грибков, ацидофильной палочки - 1:1:1.

Продолжительность культивирования, ч

Рисунок 4 - Динамика активной кислотности микробного консорциума

\ /

/у г

Продолжительность культивирования, ч

Рисунок 5 - Динамика титруемой кислотности микробного консорциума

Таблица 2 - Антибиотическая активность культур активных лактозо-сбраживающих дрожжей, микробной ассоциации кефирных грибков и L. acidophilus 317/402 и их сочетаний

Наименование культур Антибиотическая активность разведения

1:2 1:4 1:8 1:16 1:32

Лактозосбраживающие дрожжи - - + ++ ++

Микробная ассоциация кефирных грибков - - + ++ +++

L. acidophilus 317/402 - - - + ++

Консорциум: лактозосбраживающие дрожжи, микрофлора микробной ассоциации кефирных грибков, L. acidophilus 317/402: Вариант 1 в соотношении: 0,5 : 1 : 1,5 + ++ ++

Вариант. 2 в соотношении: 1,5 : 1 : 0,5 - - + ++ ++

Вариант 3 в соотношении: 1:1:1 - - + + ++

Примечание:

«-» - отсутствие роста тест-культуры; «++» - средний рост тест-культуры;

«+» - слабый рост тест-культуры; «+++»- обильный рост тест-культуры

Таблица 3 - Сочетаемость культур микробного консорциума

Вариант консорциума Число повторов Сочетаемость компонентов консорциума по активности брожения, % Рост L. acidophilus 317/402 в разведениях культуральной жидкости активных клеток лактозосбраживающих дрожжей и микробной ассоциации кефирных грибков

1:4 1:8 1:16 1:32

Вариант 1 25 50,0 + + ++ ++

Вариант 2 25 50,0 + + ++ ++

Вариант 3 25 75,0 +++ +++ +++ +++

Соотношение культур отличается высокой антибиотической активностью по отношению к условно-патогенному штамму Е. coli J53. Бактерицидное действие роста тест-культуры обнаружено в разведении 1:8. бактериостатическое в разведении 1:16. При оценке развития клеток ацидофильной палочки в культу-ральной жидкости разных соотношений микробного консорциума явления инги-бирования не обнаружено, стимулирование роста отмечено в фильтрате 1,0 часть лактозосбраживающих дрожжей : 1,0 часть микробной ассоциации кефирных грибков. Консорциум микроорганизмов характеризовался кислотообразующей способностью - изменение величины титруемой кислотности отмечено от 50 до 78° Т в течение 72 часов, тогда как при развитии активных клеток дрожжей кислотность за этот же период времени достигла 53° Т.

Далее было исследовано содержание витаминов Bi, В2, аскорбиновой кислоты. Результаты исследований свидетельствуют о накоплении витаминов В1 (0,03 мг/100 г), В2 (0,016 мг/100 г), аскорбиновой кислоты (0,109 мг/100 г) разработанным консорциумом микроорганизмов.

Данные о хранимоспособности консорциума микроорганизмов, приведены на рисунке 6.

w о

10

f 0 12 24 36 48 60 72 84 96

_о

^ Продолжительность хранения, ч

■ Лактозосбраживающие дрожжи ■ Мезофильные микроорганизмы Ацидофильная палочка

Рисунок 6 - Динамика соотношения микроорганизмов в консорциуме

в процессе хранения Анализ данных, приведенных на рис. 8 свидетельствует о стабильности микроорганизмов в составе микробного консорциума, которая сохраняется без изменений в течение 72 часов. Количество лактозосбраживающих дрожжей в консорциуме составило (КОЕ/см3): (7±1)><108, мезофильных лактобактерий -(5± 1 )* 106, клеток L. acidophilus 317/402 - (4± 1 )* 108. В последующие 24 часа содержание клеток снижается незначительно. Таким образом, определен срок хранимоспособности микробного консорциума - 72 часа при температуре (25±2)° С.

Способ получения микробного консорциума, разработанный экспериментально, обеспечил содержание активных клеток дрожжей.

Следующий этап - подбор условий культивирования лактозосбраживающих дрожжей на модифицированной питательной среде проводили на основе

двухфакторного эксперимента. Была изучена зависимость выхода биомассы дрожжей, степень утилизации лактозы от температуры культивирования и дозы посевного материала.

Уравнения регрессии, адекватно описывающие зависимости выхода биомассы дрожжей (2), степени утилизации лактозы (3) от изучаемых факторов, имеют вид уравнений второго порядка:

У1 = -67,24+4.8008*х+4,975*у-0,0788*х*х-0,0454*х*у-0,1975*у*у (2)

У2=14,2-0,6988*х-1,1234*у+0,0124*х*х+0,0028*х*у+0,0643*у*у (3)

Получена графическая интерпретация зависимостей в виде поверхностей отклика (рисунок 7, 8).

Высокий выход биомассы активных клеток дрожжей был получен при температуре культивирования 25 0 С и дозе посевного материала - 5%. Полученные результаты легли в основу технологии получения инокулята активных клеток лактозосбраживающих дрожжей.

Разработка технологической схемы приготовления ферментированной основы

На основании полученных экспериментальных данных разработана технологическая схема ферментированной основы (рис. 9).

Рисунок 7 - Зависимость выхода биомассы дрожжей от температуры культивирования и дозы посевного материала

Рисунок 8- Зависимость степени

утилизации лактозы от температуры культивирования и дозы посевного материала

Рисунок 9 - Технологическая схема производства ферментированной основы

Особенностью предлагаемой технологии является составление комбинированной смеси из молочного сырья (70%) и природной минеральной воды (30%), в результате которого снижается кислотность среды (рН=5,5), внесение разработанного симбиотического консорциума микроорганизмов в количестве 5% и ферментация комбинированной смеси при температуре 25 °С.

Подбор соотношения молочной сыворотки и природной минеральной воды проводили путем нивелирования сывороточного вкуса. Характеристика ферментированной смеси представлена в таблице 4.

Таблица 4 - Качественная характеристика ферментированной основы

Наименование показателя Характеристика

1 2

Органолептические

Консистенция и внешний вид Однородная жидкость без посторонних

примесей

Вкус Чистый, слегка дрожжевой

Цвет От бледно-зеленого до светло-желтого

Запах Выраженный, слегка дрожжевой

Физико-химические

Активная кислотность, рН 4,0±0,1

Продолжение таблицы 4

1 2

Титруемая кислотность, °Т 70±2

Массовая доля белка, % не менее 3

Массовая доля сухих веществ, % не менее 15

Микробиологические

Количество жизнеспособных клеток лактозосбраживающих дрожжей, КОЕ/см3 не менее (7±1)*108

Количество жизнеспособных клеток мезофильных микроорганизмов, КОЕ/см3 не менее (2±1)*106

Количество жизнеспособных клеток L. acidophilus 317/402, КОЕ/см3 не менее (2±1)*Ю8

БГКП (колиформы), в 0,01 см3 отсутствуют

Патогенные микроорганизмы (в том числе сальмонеллы), в 25 см3 отсутствуют

Данные таблицы 4 свидетельствуют о том, что ферментированная основа отличается содержанием сухих веществ (не менее 15%), белка (не менее 3%). Очевидно, это является следствием накопления биомассы микробного консорциума. Результаты исследования микробиологических показателей свидетельствуют о высоком числе активных клеток дрожжей (7±1)*108 КОЕ/см3 микрофлоры функционального назначения (L.acidophilus 317/402) -(2±1)*108 КОЕ/см3, мезофильных лактобакте-рий-(2±1)*106.

Микрокартина ферментированной основы приведена на рисунке 10.

Анализ данных, представленных на рисунке 10, свидетельствует о том, что микрофлора ферментированной основы представлена дрожжевыми клетками и клетками лактобактерий.

Исследование биологической ценности ферментированной основы

Изучена биологическая ценность ферментированной основы. Результаты исследования представлены в таблице 5.

Сравнительный анализ скора аминокислот в составе ферментированной основы и молочной сыворотки демонстрирует увеличение содержания аминокислот, что обусловлено жизнедеятельностью симбиотического микробного консорциума. Результаты исследования содержания витаминов в ферментированной основе показало их увеличение в сравнении с молочной сывороткой. Так, отмечено накопление витамина Bi на 80%, Bj — на 9%, аскорбиновой кислоты на 16 %,

Рисунок 10 - Микрокартина ферментированной основы

фолиевой кислоты - на 56 %. Увеличение содержания витаминов связано с деятельностью микрофлоры ферментированной основы.

Таблица 5 - Аминокислотный скор белков молочной сыворотки и ферментированной основы_

Аминокислота Химический скор, %

Молочной сыворотки Ферментированной основы

Валин 95 103,55

Изолейцин 107 117,7

Лейцин 133 139,6

Лизин 158 186

Треонин 113 178

Метионин +ЦИСТИН 85 130

Триптофан 176 220

Фенилаланин+тирозин 92 119,6

Результаты исследования хранимоспособности ферментированной основы свидетельствуют о том, что активная кислотность ферментированной основы остается стабильной в течение трех суток (4,0±0Д), после чего сдвигается в сторону увеличения и достигает (4,4±0,1).

Таким образом, разработанная ферментированная основа, характеризующаяся стабильными физико-химическими, микробиологическими показателями и хранимоспособностью в течение трех суток, может быть использована в качестве основы для производства соусов.

Практическое применение ферментированной основы

Современное состояние производства соусов в условиях предприятий питания характеризуется низкой ориентированностью на поддержание здоровья населения. Однако при этом соусы являются неотъемлемым компонентом широкого ассортимента блюд ежедневного потребления. Данный факт обусловил актуальность создания соуса с функциональными свойствами, улучшающий химический состав и органолегтгические показатели готового блюда, а также способствующие лучшему усвоению пищи.

Ферментированную основу с функциональными свойствами апробировали в условиях ООО «Оранж-Хаус» при производстве соуса «Молочный». Рецептура соуса молочного приведена в таблице 6.

Таблица 6 — Рецептура опытной партии соуса молочного, г.

Ингредиенты Соус Молочный Соус «Тонус Био»

(контроль) (опыт)

Молоко 3,2 % жирности 1000 -

Ферментированная основа - 890

Масло сливочное 50 50

Мука пшеничная 50 50

Сахар 10 10

Выход 1000 1000

Качественная характеристика опытного варианта соуса «Тонус Био» приведена в таблице 7.

Таблица 7 - Показатели соуса на ферментированной основе

Показатели Значение

Контроль [ Опыт

Органолептические

Вкус и аромат Выраженный вкус и аромат Ярко выраженный вкус и аромат

Консистенция Жидкая Жидкая

Физико-химические

Содержание влаги, % 75 80

Энергетическая ценность, ккал 118,0 72,6

Микробиологические

Количество клеток лактозосбраживающих дрожжей, КОЕ/см3 (4±1)*107

Количество клеток мезофильных микроорганизмов, КОЕ/см3 (2±1)*105

Количество клеток ацидофильной палочки, КОЕ/см3 - 4±1*107

БГКП (колиформы), в 0,01 см3 отсутствуют отсутствуют

Патогенные микроорганизмы (в том числе сальмонеллы), в 25 см3 отсутствуют отсутствуют

Ферментированная основа с функциональными свойствами была введена в состав соуса вместо молока. Введение ферментированной основы позволило снизить энергетическую ценность (на 45,4 ккал), при этом соус обогащен активными клетками лактозосбраживающих дрожжей, мезофильных микроорганизмов и ацидофильной палочки.

Таким образом, обоснована целесообразность введения ферментированной основы в качестве нового ингредиента соуса молочного.

Выводы

1. На основании проведенных исследований разработана технология ферментированной основы из молочного сырья с использованием консорциума микроорганизмов, обладающей функциональными свойствами.

2. Экспериментально обоснован компонентный состав питательной среды с включением природной минеральной воды Забайкалья для получения активного инокулята дрожжей. Выявлено увеличение титра активных клеток лактозосбраживающих дрожжей при культивировании на модифицированной пита-

тельной среде. Исследованиями морфологических, культурально-физиологических свойств дрожжевых клеток доказано отсутствие изменений микробных клеток.

3. Разработан способ культивирования лактозосбраживающих дрожжей, подобраны температура (25±2)° С и доза посевного материала (5%) для роста и накопления биомассы дрожжей.

4. Получен микробный консорциум на основе активного инокулята дрожжей, микробной ассоциации кефирных грибков и промышленного штамма L. acidophilus 317/402 в соотношении 1:1:1, обеспечивающее содержание (7±2)*108 КОЕ/см3 клеток дрожжей, (5±1)*10б КОЕ/см3 клеток мезофильных лак-тобактерий, (4±l)*10s КОЕ/см3 клеток ацидофильной палочки. Изучение процесса взаимного влияния культур разработанного консорциум микроорганизмов свидетельствует о наличии симбиотических отношений.

5. Исследованиями биологической ценности разработанного консорциума микроорганизмов определено накопление витаминов Bi (0,038 мг/100 г), В2 (0,071 мг/100 г), фолиевой кислоты (0,085 мг/100 г) культурами консорциума. Установлена устойчивость эу- и прокариотических клеток консорциума микроорганизмов при хранении - в течение 5 суток при температуре 4-6° С.

6. Установлена эффективность использования консорциума микроорганизмов для получения ферментированной основы из молочной сыворотки и природной минеральной воды. Ферментация в течение 24 ч. при температуре 25° С позволила получить ферментированную молочную основу кислотностью 70° Т, pH 4,4, высоким содержанием активных клеток дрожжей (7±1)*108, мезофильных лактобактерий (2±1)* 10б, живых клеток пробиотической микрофлоры (2±1)*108.

7. Ферментированная основа позволяет получить соусы, характеризующиеся высокими потребительскими и функциональными свойствами.

По материалам исследований опубликованы следующие работы:

Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ:

1. Хамнаева Н.И. Состояние проблемы и перспективы снижения риска здоровью населения от загрязнения объектов в байкальском регионе / Хамнаева Н.И., Олмоева В.Д. // Экология и промышленность России. 2013. № 6. С. 47-49.

2. Хамнаева Н.И. Влияние химического состава природных минеральных вод на развитие лактозосбраживающих дрожжей / Хамнаева Н.И., Олмоева В.Д. // Экология и промышленность России. 2013. № 1. С. 58-59.

3. Хамнаева Н.И. О воздействии химического состава природных минеральных вод на развитие лактозосбраживающих дрожжей / Хамнаева Н.И., Олмоева В.Д. // Вестник ВСГУТУ. 2012. № 4. С. 102-105.

Статьи в журналах и сборниках материалов конференций:

4. Хамнаева Н.И. Исследование процесса ферментации молочной сыворотки лактозосбраживающими дрожжами / Хамнаева Н.И., Доржиева Ч.Б., Олмоева В.Д., Балданова Н.Ц. // Мат-лы II междунар. науч.-практ. конф. «Научный прогресс на рубеже тысячелетий - 2007». - Днепропетровск: Наука и образование. 2007. С. 73-74.

л

5. Олмоева В.Д. О возможности использования природных минеральных вод Бурятии в технологии питательной среды для лактозосбраживающих микроорганизмов / Олмоева В.Д., Хамнаева Н.И. // Окружающая среда и здоровье: Сб. статей IV всерос. науч.-практ. конф. - Пенза:Изд-во РИО ПГСХА. 2007 С. 140-142.

6. Олмоева В.Д. О культивировании лактозосбраживающих микроорганизмов с целью получения новых продуктов питания / Олмоева В.Д., Хамнаева Н.И. //: Мат-лы всерос. науч.-практ. конф. студентов и аспирантов «Экономика и бизнес. Взгляд молодых». - Челябинск: изд-во ЮУрГУ. 2007. С. 174.

7. Олмоева В.Д. О новом способе получения активных культур лактозосбраживающих микроорганизмов / Олмоева В.Д., Хамнаева Н.И. // Мат-лы VI междунар. науч. конф. студентов и молодых учёных «Живые системы и биологическая безопасность населения». -М.: Изд-во МГУПБ. 2007. С. 74-75.

8. Олмоева В.Д. Разработка новой технологии приготовления питательной среды для культивирования лактозосбраживающих дрожжей / Олмоева В.Д., Хамнаева Н.И. // Мат-лы докладов XV междунар. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» — М.: Изд-во МГУ; СП МЫСЛЬ. 2008. — 1 электрон. опт. диск (CD-ROM).

9. Олмоева В.Д. Разработка новой технологии приготовления питательной среды для культивирования лактозосбраживающих дрожжей / Олмоева В.Д., Хамнаева Н.И. // Сб. науч. тр. Серия Биотехнология. Технология пищевых продуктов: Вып. 15. Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ. 2008. С. 156.

10. Олмоева В.Д. Об эффективности использования природных минеральных вод в технологии приготовления питательных сред для культивирования лактозосбраживающих дрожжей / Олмоева В.Д., Хамнаева Н.И. // Сб. науч. тр. Серия Биотехнология. Технология пищевых продуктов. Вып. 17. Улан-Удэ- Изд-во ВСГТУ. 2010. С. 237 с.

11. Олмоева В.Д. Производство биоактивной основы «живых» соусов / Олмоева В.Д, Холодова Е.А. // Каталог инновационных проектов. Улан-Удэ 2011. С. 14.

12. Olmoeva V.D. About method of increasing biochemical activity of lactose fermentative yeast / Olmoeva V.D., Khamnaeva N.I. // International journal of applied and fundamental research. 2011. №1. P. 110-111.

Патент РФ:

13. Пат. № 2482173 Российская Федерация, МПК C12N1/16, C12R1/85 Способ получения питательной среды для культивирования лактозосбраживающих дрожжей / Хамнаева Н.И., Олмоева В.Д. - № 2012101092; заявл. 12.01.2012-опубл. 20.05.2013 г. бюл. №14.

Подписано в печать 25.04.2014 г. Формат 60x84 1/16 Усл.печ.л. 1.16. Тираж 100 экз. Заказ № 164

Издательство ВСГУТУ 670013. г. Улан-Удэ, ул. Ключевская, 40в © ВСГУТУ, 2014

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Восточно - Сибирский государственный университет технологий и

управления»

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ФЕРМЕНТИРОВАННОЙ ОСНОВЫ ИЗ МОЛОЧНОГО СЫРЬЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОНСОРЦИУМА МИКРООРГАНИЗМОВ

Специальность: 05.18.04 - Технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств

04201459836

На правах рукописи

ОЛМОЕВА ВАЛЕНТИНА ДАШИЕВНА

Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор Хамнаева Н.И.

Улан-Удэ-2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение..........................................................................................................................................................................3

Глава 1 Обзор литературы..............................................................................................................................5

1.1 Современные направления создания ферментированных продуктов с 5 функциональными свойствами.........................................................

1.2 Источники, свойства лактозосбраживающих дрожжей. Управление 9 процессами их культивирования........................................................

1.3 Биотехнологический потенциал молочной сыворотки................................................20

1.4 Заключение по обзору литературы, цели и задачи исследований......................24

Глава 2. Материалы и методы исследований..................................................................................26

2.1 Объекты исследований и постановка эксперимента......................................................26

2.2 Физико-химические методы исследований........................................................................28

2.3 Микробиологические методы исследований........................................................................29

2.4 Статистическая обработка результатов......................................................................................31

Глава 3. Разработка технологии получения активного консорциума......................33

3.1. Обоснование компонентного состава питательной среды для 33 получения активного инокулята дрожжей............................................

3.2. Разработка способа получения консорциума микроорганизмов на 43 основе активного инокулята дрожжей, микробной ассоциации кефирных грибков и промышленного штамма L. acidophilus 317/402......................

3.3. Разработка технологической схемы приготовления 54 ферментированной основы..............................................................

3.4. Исследование биологической ценности ферментированной основы 61

3.5. Практическое применение ферментированной основы....................................67

Выводы..............................................................................................................................................................................73

Библиография............................................................................................................................................................75

Приложения..................................................................................................................................................................95

Введение

Для реализации Концепции государственной политики в области питания населения Российской Федерации до 2020 г. необходимо разработать широкий спектр функциональных продуктов, содержащих ингредиенты, которые приносят пользу здоровью человека, повышают сопротивляемость заболеваниям, улучшают многие физиологические процессы в организме человека, позволяя ему долгое время сохранять активный образ жизни [42, 66, 67, 69, 72].

Удовлетворение населения в продуктах питания функционального назначения, особенно на основе сырья животного происхождения одна из актуальных задач современности [139, 145, 147, 148]. Решение её возможно при рациональном использовании всех имеющихся ресурсов животного сырья, для чего необходимо создание и внедрение научно обоснованных методов его переработки. Поэтому в современных условиях специалистами уделяется повышенное внимание поиску способов использования всех составных частей молока [123, 127].

Одним из наиболее ценных в пищевом отношении является молочная сыворотка - уникальная по содержанию незаменимых факторов питания. Непосредственное использование молочной сыворотки, особенно творожной, на пищевые цели, сдерживается из-за неблагоприятного сочетания высокой кислотности и специфических органолептических показателей. Увеличение степени использования нативной творожной сыворотки возможно за счёт снижения кислотности химическими веществами или направленным культивированием микробных клеток. В этом плане заслуживают внимания природные минеральные воды, с более низким значением кислотности и микробные «системы»; отличающиеся естественно сложившимся симбиозом микроорганизмов, к которым относятся кефирные грибки [142].

Преимущества использования симбиоза микробных партнеров в биологически сформировавшихся консорциумах очевидны: повышение

эффективности биоконверсии используемой питательной среды; возрастание удельной скорости роста микробных клеток, усиление сопротивляемости к воздействию внешних факторов.

Наращивание биомассы кефирных грибков на молочной сыворотке изучены Рожковой И.В. Для повышения активности кефирных грибков в питательную среду добавляют стимуляторы роста - кукурузный, дрожжевой экстракт, гидролизованное молоко, регулируют интенсивность аэрации. Однако получение в микробной системе кефирных грибков высокого титра эукариотических клеток остается актуальной.

Поэтому представляется целесообразным исследовать биопотенциал лактозосбраживающих дрожжей и последующим культивированием на молочной сыворотке с целью более полного использования компонентов молока.

Глава 1 Обзор литературы

1.1 Современные направления создания ферментированных продуктов с функциональными свойствами

В настоящее время интенсивно проводятся исследования по созданию продуктов, которые могли бы обеспечить необходимое поступление в организм человека полезных веществ, ингредиентов (пищевых волокон, витаминов, минеральных веществ, полиненасыщенных жирных кислот, антиоксидантов, олигосахаридов, микроэлементов), а также предупредить различные заболевания [82, 110, 153, 155, 173].

Потребительские свойства функциональных продуктов включают три составляющие: пищевую ценность, вкусовые качества, физиологическое воздействие. Создание продуктов "здорового" питания, имеющих сбалансированный состав, может быть реализовано, за счет их многокомпонентности. Обогащение пищевых продуктов функциональной компонентой осуществляется за счёт введения в состав пищевых продуктов биокомпонентов животного и растительного происхождения, а также процесса ферментации [73, 118, 128, 168, 169, 172].

Разработка комбинированных, молочных, молокосодержащих

продуктов, доступных и потребляемых широкими слоями населения, позволяет увеличивать объем их производства и реализации, что способствует удовлетворению потребности населения в продуктах питания с функциональными свойствами [138, 176].

Важным компонентом сбалансированного питания являются белки, которые расщепляясь, высвобождают энергию и распадаются до легкоусвояемых аминокислот и низкомолекулярных пептидов [28, 111, 117, 152, 175]. Белки животного происхождения являются полноценными по их аминокислотному составу. Однако, дрожжевой белок, состоящий из 466 аминокислотных остатков, характеризуется высокой сбалансированностью эссенциальных аминокислот [11, 107, 108, 126, 171].

Кроме того, в связи с возрастающим распространением среди населения ферментопатии, связанной с отсутствием или низкой активностью фермента лактазы, большую роль в создании ферментированных продуктов функционального назначения играют лактозосбраживающие дрожжи, способные подвергать расщеплению лактозу [20, 22, 40, 113, 136].

Большинство видов дрожжей не имеет значения для молочного хозяйства, некоторые виды выступают как вредные микроорганизмы. Лактозосбраживающие дрожжи могут привести к образованию кислодрожжевых запаха и вкуса в кислосливочном масле. Они могут также вызвать изменение запаха в йогурте, простокваше, свежих сырах (употребляемых без созревания) и сливках, используемых для приготовления масла. У недостаточно зрелых гарцского мягкого сыра и сыра камамбер рост специфических культур уменьшается под влиянием неспорогенных видов Тоги1ор81з. В твороге и сырах, в которых всегда имеются дрожжи, образуется горький вкус под влиянием Тоги1орз1з. Дрожжи и плесень в небольшом количестве используются для приготовления сыров. При сильном поражении сыров этими микроорганизмами может произойти значительное разложение казеинов [178, 184].

Однако существует ряд культур лактозосбраживающих дрожжей обладающих способностью синтезировать промышленно важные продукты жизнедеятельности [24, 112, 140]. По природе синтезируемых веществ и их значению для микробной клетки они делятся на три основные группы:

- крупные молекулы (ферменты, полисахариды с молекулярной массой от 10 тыс. до нескольких миллионов);

- первичные метаболиты (соединения, необходимые для роста микроорганизмов: витамины, пуриновые и пиримидиновые основания, аминокислоты и др.);

- вторичные метаболиты (соединения, ненужные для роста микроорганизмов: токсины, алкалоиды, антибиотики и др.).

Спектр синтезируемых лактозосбраживающими дрожжами метаболитов, обусловливает их высокую производственную ценность. Сегодня дрожжи используются для получения спирта, различных ферментных препаратов, органических кислот, полисахаридов, многоатомных спиртов, витаминов и витаминных добавок, а также во множестве других мелкомасштабных процессах [154, 177, 182, 183].

Дрожжи, сбраживающие лактозу широко используются при производстве диетических и лечебных кисломолочных напитков, а также кисломолочных напитков, приготовляемых из обезжиренного молока, пахты, сыворотки [10, 163, 165, 170].

Дрожжи издавна применяют для приготовления кисломолочных продуктов, являющихся излюбленными пищевыми продуктами большинства населения, а потому имеющих большой спрос. Кисломолочные продукты, полученные с применением комплекса микроорганизмов - дрожжей и кисломолочных бактерий - кефир, кумыс, простокваша, курунга и другие, употребляются как диетические продукты, обладающие как питательными, так и лечебными свойствами. В ряде стран применяются кисломолочные продукты, приготовленные на местных заквасках, включающих комплекс молочнокислых бактерий и дрожжей: лебен (Египет), мацони (Кавказ), айран (Туркменистан), курунга (Монголия, Бурятия), чал (Туркмения и другие страны Средней Азии) [2, 150].

Лактозосбраживающие дрожжи, играющие важную роль в молочной промышленности (к ним относятся роды Torulopsis, Kluyveromyces и др.) при приготовлении кефира и кумыса, сбраживают молочный сахар, образуя спирт и углекислоту, вследствие чего улучшается вкус продукта и повышается его усвояемость организмом. По данным Скородумовой A.M. [116] в различных видах простокваши - болгарской, мацуне, йогурте, донской, кубанской, приготовленных на естественных заквасках, дрожжи обнаруживаются в большом количестве.

Исключительна роль дрожжей в производстве не только кисломолочных продуктов, но и молочных консервов. Известно, что лактозосбраживающие дрожжи, инициируя спиртовое брожение в питательной среде накапливают витамины, антибиотические вещества, активные против туберкулёзных палочек и других бактерий, в том числе и кишечной палочки, активизируют развитие молочнокислых бактерий [10].

Букановой В.И. [13] выявлено, что лактозосбраживающие дрожжи способствуют накоплению бактерицидных веществ в кефирной симбиотической закваске. Однако при культивировании их в молоке образуется лишь небольшое количество бактерицидных веществ. Исследованиями Скородумовой A.M. [116] подтверждена антагонистичность

лактозосбраживающих дрожжей к протею, палочке синего гноя, холерному вибриону, гноеродному кокку. Известно, что гнилостные процессы, происходящие в кишечнике, в присутствии лактозосбраживающих дрожжей заметно ослабляются [8]. Установлено положительное влияние лактозосбраживающих дрожжей на качество сливочного масла, подавление плесневения и прогоркания [59].

Важнейшими для молочного хозяйства являются лактозосбраживающие Saccharomyces lactis. Они используются для приготовления кефира (из коровьего молока) и кумыса (из кобыльего молока). Известен способ производства кумысного продукта на основе молочной сыворотки с использованием живых клеток дрожжей [4, 125, 151].

Активно ведётся разработка и оценка эмульсионных жировых продуктов с функциональными свойствами [45, 47, 97, 179].

Актуальным в разработке функциональных продуктов является создание новых видов соусов, с содержанием живых клеток микроорганизмов. Имеются сведения о разработке соусов функционального назначения, удовлетворяющих суточную потребность организма в биологически активных веществах[13, 17, 21, 23, 49, 99]. Функциональность разрабатываемых соусов обусловлена также содержанием веществ с антиканцерогенными свойствами [180].

Известен способ производства функционального кисломолочного продукта (соуса), предусматривающий получение молочной основы соуса и обогащение её закваской пропионовокислых бактерий Propionibacterium Shermanii [96].

Новые исследования микробных корректоров пищевого назначения свидетельствуют о функциональных свойствах лактозосбраживающих дрожжей [11].

Приведенные данные исследований в области современных направлений создания ферментированных продуктов свидетельствуют об актуальности использования биологического потенциала клеток лактозосбраживающих дрожжей, клеток лактобактерий в технологии ферментированных продуктов с функциональными свойствами. При этом актуальным является разработка функциональных продуктов для создания новых видов соусов.

1.2 Источники, свойства лактозосбраживающих дрожжей. Управление процессами их культивирования

Исследованиями Скородумовой А. М. [116] доказано, что среди дрожжей, выделенных из кисломолочных продуктов (приготовленных на естественной закваске), число дрожжей, самостоятельно сбраживающих лактозу, сравнительно невелико — из 150 штаммов — 32 (21%). Наибольший процент дрожжей, сбраживающих лактозу, был выделен из кефирных грибков и закваски (34,1%). Дрожжи, сбраживающие лактозу, были идентифицированы Скородумовой А. М. как Fabospora fragilis, Saccharomyces lactis, реже Zygosaccharomyces lactis. Способностью сбраживать лактозу обладают также некоторые виды Candida и Torulopsis — Candida pseudotropicalis var. lactosa, Torulopsis kefir, Torylopsis sphaerica, выделенные из кефирного грибка [133].

В мире насчитывается около 700 видов дрожжеподобных организмов, из них всего 1% способны сбраживать молочный сахар. Вероятно, в силу того, что

лактоза (молочный сахар) по своей химической структуре является одной из наименее поддающихся усвоению микроорганизмами [5,6].

По данным Наканиши Т. и Араи Дж. [145] наиболее распространенными видами лактозосбраживающих дрожжей, выделенных из сырого молока, являются Saccharomyces lactis, Torulopsis versatilis, Torulopsis sphaerica, Candida pseudotropicalis.

Голубевым В.И., Голубевым H.B. [24] среди ассимилирующих лактозу 105 штаммов дрожжей, поддерживаемых во Всероссийской коллекции микроорганизмов, выявлены культуры клюйверомицетов, сбраживающие молочную сыворотку. Содержание спирта после 2-3 суток сбраживания при температуре 30 °С отобранными штаммами молочной сыворотки с 10% лактозы составляло 4-5°.

Дрожжи рода Torulopsis активно сбраживают лактозу и имеют круглые или овальные почкующиеся клетки. Псевдомицелии род Torulopsis не образует или исключительно редко образует примитивные формы. В жидкой среде дрожжи дают осадок, кольцо, редко плёнку, которая никогда не бывает сухой, матовой, затягивающей. По данным авторов [13, 146] лактозосбраживающие дрожжи рода Torulopsis формируют лучистые колонии при росте на твёрдых питательных средах.

Общие для лактозосбраживающих дрожжей культуральные свойства представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Культуральные свойства лактозосбраживающих дрожжей

Показатель Значение

1 2

Температура роста дрожжей, °С:

оптимальная 25-30

минимальная 5-12

Температура гибели клеток, °С при режимах пастеризации 75-76° С с выдержкой 15-20 с.

Продолжение таблицы 1

1 2

Пределы рН, при которых происходит развитие 3-6 (предпочитают кислую реакцию среды)

Рост при содержании в плотной питательной среде (в расчёте на водную фазу), %: сахара соли 40-55 8

Отношение к кислороду факультативные аэробы, но лучше развиваются при наличии в среде кислорода

Известны штаммы лактозосбраживающих дрожжей, выделенные из природных источников - коровье, козье молоко, монгольский напиток айраг, микробная ассоциация кефирных грибков [41]. Идентификация выделенных штаммов проведена в ФГУП Гос. НИИ Генетика. При этом, клетки дрожжей, выделенные из коровьего молока, характеризовались овальной, изредка цилиндрической формой, почкование одностороннее, расположение клеток одиночное и в парах, редко в маленьких пучках или склеенных массах, размер клеток (3,3-3,7)х(4,1-4,5) мкм. Клетки дрожжей, выделенные из козьего молока, имели форму от короткоовальной до длинно-овальной при одиночном расположении и разностороннем почковании, размер клеток составлял (3,4-3,8)х(4,1-4,5) мкм, а клетки дрожж�