автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.04, диссертация на тему:Разработка технологии биологически активной добавки, обогащенной железом

На правах рукописи

КРИВОНОСОВА АННА ВЛАДИМИРОВНА

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ДОБАВКИ, ОБОГАЩЕННОЙ ЖЕЛЕЗОМ

Специальности 05 18 04 - Технология мясных, молочных, рыбных

продуктов и холодильных производств 05 18.07-Биотехнологияпищевых продуктов (перерабатывающие отрасли АПК)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

003160554

Улан-Удэ - 2007

003160554

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный технологический университет» (ВСГТУ)

Научный руководитель доктор технических наук, профессор

Хамагаева Ирина Сергеевна

Официальные оппоненты доктор технических наук, профессор

Ханхалаева Ирина Архиповна

кандидат технических наук, доцент Шевелева Ольга Владимировна

Ведущая организация Институт общей и экспериментальной

биологии СО РАН Бурятский научный центр (г Улан-Удэ)

Защита диссертации состоится 2 ноября 2007 г в 10 часов на заседании диссертационного совета К 212 03901 при ГОУ ВПО «ВосточноСибирской государственный технологический университет» по адресу 670013, г Улан-Удэ, ул Ключевская, 40в

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВСГТУ и на сайте www esstu ru

Автореферат разослан » сентября 2007 года

Ученый секретарь / (/

диссертационного совета \ Столярова А С

' л?

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Концепция оптимального питания предполагает в качестве одного из важнейших условий сохранения здоровья человека адекватную обеспеченность его организма как макро-, так и микронутриен-тами, в том числе и эссенциальными микроэлементами, в частности железом. Железодефицитные состояния по-прежнему остаются актуальной и, во многих отношениях, не решенной проблемой современной медицины Недостаток железа в организме приводит ко многим негативным последствиям. Одним из них является развитие железодефицитной анемии

Учитывая, что в повседневной жизни человек потребляет железо в составе растительных и животных продуктов и что наличие аминокислот и пептидов, а также белков животного происхождения способствуют лучшему усвоению организмом этого микроэлемента, представляется целесообразным обогащать рационы питания именно органическими формами железа. По нашему мнению, наиболее удобным объектом для биотехнологического получения железа в органической форме являются пропионовокислые бактерии, которые обладают способностью синтезировать значительное количество гемсодержащих ферментов и корриноидов, повышающих усвоение железа

Известно, что железо в организме может всасываться только в виде Бе2+ Однако двухвалентное железо подвергается быстрому химичеркому окислению, переходя в нерастворимую, неусвояемую организмом трехвалентную форму Для сохранения биодоступности железа привлекательной представляется роль хелатирующих «агентов», которые способствуют солю-билизации минералов, сохраняя их в растворимом состоянии. Одним из представителей такого рода хелаторов являются казеиновые фосфопептиды (СРРб). Следует отметить, что до сих пор казеиновые фосфопептиды недостаточно изучены и как хелатирующие «агенты» для минералов, и как потенциальные нутрицевтики в питании человека Кроме того, в литературе отсутствуют данные о влиянии СРРв на солюбилизацию железа. Поэтому исследование железосвязывающей способности СРРв представляет большой интерес.

Таким образом, разработка и создание биологически активной добавки, содержащей железо в органической хелатированной форме, является актуальным и эффективным способом кардинального улучшения здоровья населения нашей страны

Цель и задачи исследований. Целью диссертационной работы является разработка технологии биологически активной добавки на основе биомассы пропионовокислых бактерий, обогащенной органическим железом

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи исследований

- исследовать биохимический потенциал активизированных культур пропионовокислых бактерий,

- оценить адгезивные свойства изучаемых штаммов;

- исследовать влияние сульфата железа на рост и синтез внеклеточных факторов адаптации пропионовокислых бактерий,

- уточнить технологические параметры выделения казеиновых фосфо-пептидов,

- исследовать способность казеиновых фосфопептидов солюбилизиро-вать двухвалентное железо,

- разработать технологию жидкого бактериального концентрата, обогащенного железом

Научная новизна. В результате проведенных исследований установлено, что активизированные культуры пропионовокислых бактерий синтезируют гемсодержащие ферменты и обладают высокими адгезивными свойствами Выявлено, что с повышением концентрации железа в среде увеличивается синтез внеклеточных метаболитов, способствующих адаптации культур к металлу Определены оптимальные технологические параметры выделения казеиновых фосфопептидов Доказана высокая способность казеиновых фосфопептидов солюбилизировать двухвалентное железо Установлена взаимосвязь между концентрацией железа и степенью солюбилизации Отмечено, что железо, хелатированное казеиновыми фосфопептидами, сохраняется в двухвалентной форме в течение длительного срока хранения Теоретически обоснован и экспериментально подтвержден состав оптимизированной сульфатом железа и водным раствором казеиновых фосфопептидов питательной среды, обеспечивающий наибольшую эффективность биологически активной добавки

Практическая ценность работы. На основании результатов исследований разработана технология биологически активной добавки, обогащенной органическим железом. Предложена схема получения водного раствора казеиновых фосфопептидов с максимальным содержанием низкомолекулярных соединений На производство железосодержащей биологически активной добавки разработаны ТУ 9229-016-02069473-2007. Проведена опытно-промышленная проверка этих препаратов в научно-исследовательской лаборатории заквасок ВСГТУ

Апробация результатов работы. Результаты работы были доложены и обсуждены на научных конференциях ВСГТУ (Улан-Удэ, 2004 -2007гг), международном научно-практическом семинаре «Теория и практика новых технологий в производстве продуктов питания» (г Омск, 2005), международном молодежном симпозиуме «Устойчивость и безопасность в экономике, праве, политике стран Азиатско-Тихоокеанского региона» (г Хабаровск,

2005); международных научных конференциях «Техника и технология пищевых производств» (г Могилев, 2006), «Пищевые технологии» (г Казань

2006), международном научном семинаре «Пробиотики» (г Санкт-Петербург, 2007)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, аналитического обзора, методической части, результатов эксперимента и их

анализа, выводов, списка литературы и приложений Основная часть работы изложена на 120 страницах, включает 15 таблиц, 25 рисунков.

МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

Экспериментальная часть исследований проводилась в лаборатории кафедры «Технология молочных продуктов. Товароведение и экспертиза товаров» Восточно-Сибирского государственного технологического университета

Объектом исследования служили культуры пропионовокислых бактерий' штаммы РгорюшЬас1егшт й-еиёеппс1ш зиЬэр. зЬегтапн АС-2503, Ргор1-отЬайепит &еи<3етпс1ш БиЬвр й-еёепгешЫ! АС-2500, РгорютЬа^епит су-сЬЬехашсит Кизапо АС-2260 и РгорюшЬа(Легшт сус1оЬехашсит Кшапо АС-2259, полученные из фонда ВКМ Института Биохимии и Физиологии Микроорганизмов (Москва), активизированные уникальным биотехнологическим способом, разработанным в ВСГТУ. В качестве источника железа использовали двухвалентную соль (Ре804). Раствор казеиновых фосфопептидов получали путем ферментативного гидролиза нартиевого казеината

Схема проведения эксперимента представлена на рисунке 1.

В ходе экспериментальных исследований определяли следующие показатели активную кислотность - потенциометрическим методом по ГОСТ 3624-87; титруемую кислотность - по ГОСТ 3624-92, оптическую плотность -фотоколориметрическим методом на КБ -77 при 1=590 нм, количественный учет микроорганизмов - методом предельных разведений по ТУ 10-10-02789-192-95, морфологию пропионовокислых бактерий путем приготовления препаратов, окрашенных по Граму с последующим микроскопированием в иммерсионной системе, антимутагенную активность - по тесту Эймса, активность каталазы определяли колориметрическим методом; активность перок-сидазы определяли спекрофотометрически с о-дианизидиновым реактивом, активность супероксиддизмутазы определяли по аутоокислению адреналина, адгезивные свойства изучали на формалинизированных эритроцитах по развернутому методу В.И Брилис, концентрацию экзополисахаридов - антроно-вым методом, количество Реэ+ определяли спекгрофотометрическим методом, количество Ре2+ определяли референтным методом с использованием феррозина, молекулярно-массовое распределение пептидов в составе водного раствора СРРэ оценивали методом эксклюзиционной хроматографии, содержание витамина В]2- спектрофотометрическим методом, количество бактерий групп кишечной палочки определяли по ГОСТ 9225-84, контаминацию -по ГОСТ 9225-84

Полученные экспериментальные данные статистически обрабатывали методами математического и корреляционного анализа на ЭВМ, используя пакет стандартных программ.

Исследование биотехнологического Показатели

готенциала активизированных культур

пропионовокислых 1 Органолептические показатели

бактерий 2 Активная кислотность

1,2,4,13-16 3. Оптическая плотность

Изучение адгезивных свойств раз- 4. Количество клеток пропионово-

личных штаммов пропионовокислых кислых бактерий

бактерий 5 Антимутагенная активность

9,13 6. Активность каталазы

Исследование влияние сульфата же- 7 Активность пероксидазы

леза на рост и синтез внеклеточных 8 Активность супероксиддисмута-

факторов адаптации пропионово- зы (СОД)

кислых бактерий 9 Адгезивная активность

3,4,5-10,11-13 10. Концентрация экзополисахари-

Изучение способности казеиновых ДОВ

фосфопептидов солюбилизировать 11 Содержание железа

сульфат железа 12 Количество витамина В12

11,3,4,5-10,13 13. Микроскопический препарат

Разработка технологии жидкого бак- 14 Определение БГКП

териального концентрата пропионо- 15. Контаминация

вокислых бактерий, обогащенного 16 Показатели безопасности

железом

1,2,4,13-16

Обработка результатов

Рисунок 1 - Схема проведения эксперимента

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование биотехнологического потенциала пропионовокислых бактерий

На первом этапе исследований изучали биотехнологический потенциал разных штаммов пропионовокислых бактерий (ПКБ)

Известно, что ПКБ характеризуются как аэротолерантные бактерии, обладающие слабой кислотообразующей способностью Для повышения биохимической активности исследуемых штаммов была проведена активизация по ранее разработанному на кафедре ТМПТЭТ ВСГТУ биотехнологическому способу Характеристика основных биотехнологических свойств заквасок на основе активизированных культур пропионовокислых бактерий приведена в таблице 1.

Таблица - 1 Биотехнологический потенциал пропионовокислых бактерий

Показатели Характеристика штамма

Р &еип<1еп-геюЬн БиЬйр йгеидеге1сНи АС-2500 Р cyclohexa-mcum Kusano АС-2259 Р {геидегеюЬн эиЬэр зЬешапи АС- 2503 Р сус1оИеха-шсиш Кивало АС-2260

Внешний вид и консистенция Однородная, жидковатая консистенция Однородная вязкая консистенция Однородная, густая вязкая консистенция Однородная густая консистенция

Активность, ч 14±1 15±3 14±2 16±1

Кислотность Титруемая, °Т 76±2 71±1 72±4 70±2

Активная, рН 4,64±0,03 4,99±0,05 4,75±0,09 4,98±0,01

Предельная, °Т 142±3 Л0±1 148±2 122±1

Количество жизнеспособных клеток, КОЕ/см3 3*10" 4*109 4*109-1*10'° 1*109

Рост клеток при 20% желчи 40% желчи 2% №С1 4% ЫаС1 6% ШС1 рН =4,5 + ± + ± ± ± + ± + ± + ± + + + + + + + + н- +

Антимутагенная активность (ингибирование, %) 43,6 44,8 47,7 46,2

Количество витамина В12, мкг/мл 31,0 18,0 33,0 22,0

Активность гемовых ферментов СОД, ед/мг белка Каталаза, мкат/мл Пероксидаза, нмочь/(мин мг белка) 1,12 1749,5 1,37 1,11 1511,0 1,12 1,37 2110,8 1,42 1,13 1714,3 0,85

Примечание - отсутствие роста, ± - небольшой рост(105"6 кое/см+ - активный рос т (10'" кое/см3)

Из данных таблицы 1 видно, что все активизированные культуры обладают высокой биохимической активностью, о чем свидетельствует быстрая ферментация молока и максимальное количество жизнеспособных клеток в заквасках - Ю9"10 кое/см3 Отмечено, что исследуемые штаммы (кроме Р сус1оЬехашсиш Кивапо АС-2259) проявили устойчивость к высокой концентрации желчи (40%), ЫаС1 (6%) и развивались в среде с низким рН (4,5), что указывает на высокую выживаемость данных культур в неблагоприятных условиях ЖКТ человека Установлено, что наиболее ярко выраженный антимутагенный эффект (47,7%), значительный синтез корриноидов (33,0 мкг/мл), гемсодержащих ферментов (каталазы, пероксидазы) и супероксид-дисмутазы проявил штамм Р &еис1еге1с1ш виЬвр зЬеппапи АС- 2503 Далее по способности синтезировать гемсодержащие соединения следует отметить Р й-еиёепгеюЬп виЬвр й-еиёепгеюЬп АС-2500.

В результате проведенных исследований установлено, что изученные штаммы пропионовокислых бактерий обладают ценными биотехнологическими свойствами, что открывает широкие перспективы для их использования при создании БАД.

Изучение адгезивных свойств пропионовокислых бактерий

Одним из актуальных направлений современной микробиологии является изучение адгезивного процесса различных микроорганизмов. Адгезия -это межклеточное взаимодействие, выражающееся в прочном прикреплении клеток к субстрату. Что касается пропионовокислых бактерий, информация об их адгезивных свойствах в литературе нами не обнаружена.

Следует отметить, что от адгезивных свойств во многом зависит состав, стабильность и защитные свойства микрофлоры макроорганизма, В связи с этим дальнейшие исследования направлены на изучение адгезивных свойств разных штаммов пропионовокислых бактерий. В качестве клеток макроорганизма были выбраны клетки формадинизиро ванных эритроцитов. Адгезивный процесс ГТКБ с эритроцитами представлен на рисунке 2.

* т -тж^т

а) Р. Сге<1епге1сЬп киЬзр. зЬеппапп АС-2503

б) Р. сускЖехатсит Кизапо АС-2259

:,(■■ ^ »Л!

в) Р. й-еийетпсМ зиЬзр. 1гы1еп- г) Р. еусМехашсиш Кизапо

ге1сЫ[ АС-2500 АС-2260

Рисунок 2 - Взаимодействие ПКБ с эритроцитами

Анализ данных, представленных на рисунке 2, показывает, что про-пионовокислые бактерии обладают различной способностью адгезироваться

на эритроцитах Выявлено, что некоторые штаммы адгезируются в виде отдельных бактериальных клеток (рис, 2, б, в и г), а также агрегатов, которые почти полностью закрывают эритроциты (рис. 2, а)

Адгезивные свойства культур оценивали по среднему показателю адгезии (СПА), коэффициенту участия эритроцитов (КУЭ), об адгезивности штамма судили по индексу адгезивности микроорганизма (ИАМ) Согласно методике микроорганизмы считали неадгезивными при ИАМ менее 1,75; низкоадгезивными - от 1,76 до 2,5, среднеадгезивными - от 2,51 до 4,0; высокоадгезивными - при ИАМ более 4,0. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Адгезивность пропионовокислых бактерий

Штамм СПА КУЭ ИАМ (М±т) Адгезивность

Р йешккотешЬп БиЬэр (геи-с1еге1с1ш АС-2500 3,2 79% 4,0±1,5 Среднеадгезивный

Р. сускЖехатсит Кивало АС-2260 3,9 82% 3,7±1,2 Среднеадгезивный

Р Йеи<1еге1с1ш виЬзр. зИтапи АС-2503 4,6 85% 5,4±1,1 Высокоадгезивный

Р сусМгехатсит Кшапо АС-2259 3,3 80% 3,1±1,8 Среднеадгезивный

Из данных таблицы 2 следует, что пропионовокислые бактерии обладают достаточно высокими адгезивными свойствами. Установлено, что из всех изученных культур высокоадгезивным штаммом является РгорюшЬа^е-гтт й"ес1епге1сЫ1 виЬэр вЬегтапи АС-2503, о чем свидетельствует индекс адгезивности (ИАМ=5,4), а также показатели СПА (4,6) и КУЭ (85%). Следовательно, этот штамм лучше других закрепится на клетках кишечника, создавая защитный барьер. Остальные штаммы по всем исследуемым показателям проявили среднюю степень адгезивности

Изучение влияния сульфата железа на рост и синтез внеклеточных факторов адаптации пропионовокислых бактерий

Внеклеточные метаболиты, синтезируемые микроорганизмами и регулирующие их активность, называются ауторегуляторами. Важно подчеркнуть, что среди многочисленных функций ауторегуляторов крайне слабо изучены факторы, обеспечивающие адаптацию микроорганизмов к неблагоприятным физико-химическим условиям среды.

В связи с этим в дальнейших исследованиях изучали влияние сульфата железа на синтез экзометаболитов пропионовокислыми бактериями Известно, что биологический эффект взаимодействия ^микроорганизмов с металлами

определяется концентрацией металла, степенью его токсичности и метаболическим потенциалом микроорганизмов

Результаты наших исследований (рис 3) показали, что сульфат железа до определенной концентрации (0,25 мг/мл для Р й-еис!етпсМ БиЬэр &еёеп-ге1сЬн' АС-2500 и 0,35 мг/мл для всех остальных штаммов) повышает удельную скорость роста пропионовокислых бактерий, что свидетельствует о необходимости железа для нормального метаболизма клетки Дальнейшее увеличение концентрации в среде Ре804 приводит к замедлению скорости роста При этом количество жизнеспособных клеток остается на высоком уровне (1011 кое/см3) Следует отметить, что избыточное содержание металла инги-бирует метаболизм, в этом случае включаются защитные механизмы, компенсирующие отрицательное действие металла

0 0,1 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55

Количество вносимого железа, мг/мл

—В—Propionibacterium freudemrichn subsp fredenreichn АС-2500 —X—Propionibacterium cyciohexanicum Kusano AC-2260 —H—Propionibacterium cyciohexanicum Kusano AC-2259 —в—Propionibacterium fredenreichn subsp shermann AC-2503

Рисунок 3 — Влияние сульфата железа на скорость роста пропионовокислых бактерий

При исследовании биотехнологического потенциала нами было установлено, что пропионовокислые бактерии синтезируют значительное количество гемсодержащих ферментов Поскольку синтез и активность гемовых ферментов зависят от содержания в среде ионов железа, дальнейшие исследования направлены на изучение влияния Ре504 на биосинтез каталазы, пе-роксидазы и СОД. Результаты исследований приведены в таблице 3,

Анализ данных таблицы 3 показал, что с увеличением дозы железа у всех изученных штаммов происходит увеличение активности таких ферментов, как каталаза и СОД Увеличение концентрации сульфата железа в среде до 0,45-0,55 мг/мл приводит к возрастанию активности каталазы (в среднем) в 1,5 раза, а СОД в 1,7-1,85 раза Что касается пероксидазы, то ее активность во всех опытных образцах практически не изменялась. Вероятно, это объясняется накоплением только эндофермента. Установлена корреляционная за-

висимость между активностью ферментов (У) и концентрацией сульфата железа

У, = -38,90х2 + 40,61х+19,40 - по СОД,

У2 = -0,115х2 + 0,861х+0,514 - по каталазе

Коэффициенты корреляции Я) 2 составляют 0,990 и 0,898 соответственно

Следует отметить, что увеличение активности каталазы и СОД значительно повышает способность пропионовокислых бактерий защищаться от окислительного стресса, поскольку именно эти ферменты способны выводить из клеток супероксидные радикалы

Таблица 3 - Влияние железа на активность антиокислительных ферментов, синтезируемых пропионовокислыми бактериями

Активность ферментов

Штамм Содержание железа, мг/мл Катапаза (мкат/мл) Пероксидаза (нмоль/(мин мг белка)) СОД, ед/мг белка

Р freuden-richu subsp fredenreichu AC-2500 0 0,25 0,35 0,45 0,55 1280,0 1290,5 1300,9 1492.5 1490.6 1,573 1,572 1,572 1.570 1.571 1,02 1,77 1.77 1.78 1,78

P cyclohex-anicum Kusano AC-2260 0 0,25 0,35 1712.2 1802,5 1895.3 0,905 0,890 0,85э 1,03 1.85 1.86

0,45 0,55 1907,4 1912,3 0,850 0,853 1,86 1,86

P cyclohex-anicum Kusano AC-2259 0 0,25 0,35 1561,9 1807.0 1991.1 1,118 1,125 1,122 1,01 1,83 1,83

0,45 0.55 2007,0 2091,3 1,119 1,119 1.83 1.84

P fredenreichu subsp shermanu AC-2503 0 0,25 2318,6 2554,8 1 ИЗ 1,112 1,17 1,98

0,35 0,45 0,55 2789,3 2954,3 2952,3 1,113 1,112 1,113 1,99 2,01 2,01

Из литературных данных известно, что зашита от токсичной концентрации металла у микроорганизмов проявляется в образовании различных веществ, связывающих металл в форме малотоксичных соединений В связи с этим дальнейшие исследования были посвящены изучению влияния сульфата железа на синтез внеклеточных факторов адаптации бактерий Результаты исследований представлены в таблице 4

Таблица 4 - Влияние сульфата железа на синтез внеклеточных метаболитов

Штамм Содержание железа, мг/мл Показатель

Адгезивная активность (ИАМ) ЭПС мкг/мл Ингибирование (антимутагенная активность), % Количество витамина В]2, мкг/мл

0 4,0 29,81 43,6 31,0

Р йеийсппсЬи 0,25 4,0 29,96 44,2 32,0

эиЬэр й-едепгеюЬи 0,35 4,2 30,05 44,8 32,5

АС-2500 0,45 4,6 35,50 48,9 34,0

0,55 5,1 36,80 48,6 34,5

0 3,7 31,85 46,2 22,0

Р сус1оЬехапсит 0,25 3,8 32,56 48,9 26,0

Кшапо 0,35 3,9 36,98 48,7 27,0

АС-2260 0,45 4,4 37,20 48,6 29,0

0,55 4,7 48,30 57,9 28,0

0 2,8 36,65 44,8 18,0

Р сусиЖехапсит 0,25 3,1 36,90 46,2 18,0

Кивало 0,35 3,6 36,99 47,5 18,0

АС-2259 0,45 4,2 38,70 52,8 19,0

0,55 4,6 44,78 54,2 19,5

Р й-ес1епге1сЫ1 яиЬяр зЬегтапп АС-2503 0 0,25 0,35 0,45 0,55 5,4 5,4 5,8 6,1 6,3 41,30 44,52 49,56 50,20 56,58 47,7 49,6 50.1 51.2 57.3 33,0 35,0 35,5 36,0 36,0

Данные, приведенные в таблице 4, свидетельствуют, что добавление ионов железа в питательную среду для культивирования ПКБ стимулирует синтез внеклеточных метаболитов Так, было отмечено, что с увеличением дозы Ре804 наблюдается более высокая антимутагенная активность пропио-новых бактерий, что указывает на индукцию антимутагенеза Повышенный биосинтез экзополисахаридов (ЭПС) при добавлении железа - это проявление неферментативной защиты бактерий, когда ЭПС препятствуют проникновению излишнего железа в клетку за счет её обволакивания. Увеличение адгезии объясняется не только защитной реакцией культур по отношению к металлу, но и тем, что, согласно литературным данным, наличие в среде двух- и трехвалентных катионов приводит к уменьшению толщины двойных заряженных слоев на поверхностях в водных средах, что способствует адгезии за счет уменьшения электростатических сил отталкивания.

При исследовании морфологии пропионовокислых бактерий, культивируемых при разных концентрациях железа, было отмечено, что с увеличением дозы Ре804 до 0,55 мг/мл наблюдалось скопление клеток (когезия). Вероятно, в условиях межклеточных контактов посредством агрегации клетки поддерживают свою жизнеспособность.

Полученные результаты свидетельствуют, что синтез экзометаболитов способствует адаптации пропионовокислых бактерий к ионам железа. Выявленные закономерности позволяют не только понять принцип метаболической организации у пропионовокислых бактерий, но и служат научной основой для разработки технологии железосодержащей Б АД

Влияние казеиновых фосфопептидов на солюбилизацию железа в питательной среде

При проведении экспериментальных исследований нами было отмечено, что при содержании железа в среде 0,45 мг/мл и более изменяется окраска концентратов и выпадает осадок, что свидетельствует об образовании нерастворимых Ре3+ ионов В связи с этим в дальнейших исследованиях изучали влияние казеиновых фосфопептидов (СРР8) на солюбилизацию (хелатирова-ние) железа в питательной среде СРРв - это фосфорилированные пептиды, образующиеся из казеинов коровьего молока при их переваривании пищеварительными протеиназами.

Известно, что металлосвязывающая способность СРРв зависит от степени фосфорилирования. С целью получения гидролизата с максимальным содержанием низкомолекулярных фосфорилированных пептидов и свободных аминокислот, способных в дальнейшем образовывать растворимые комплексы с железом, нами были уточнены технологические параметры выделения СРРэ При получении СРРэ применяли схему одностадийного гидролиза казеината № с использованием пепсина и трипсина при разной продолжительности гидролиза Результаты исследований представлены в таблице 5

Таблица 5 - Молекулярно-массовое распределение пептидных фракций

Время гидролиза, мин Диапазон молекулярных масс, кД Содержание фракций (%) в диапазоне молекулярных масс, в зависимости от используемого фермента

пепсин 1% пепсин 3% трипсин 1% трипсин 3%

40 более 138 1,8 1,6 1,7 2,0

138-10,5 5,4 5,6 Ъ2 4,0

10,5-5,1 9,5 10,3 7,8 6,2

60 более 138 2,1 1,8 1,7 2,1

138-10,5 6,3 5,6 4,2 4,3

10,5-5,1 9,8 11,0 7,8 6,4

120 более 138 2,2 2,3 2,2 2,1

138-10,5 7,1 11,2 6,2 6,4

10,5-5,1 11,9 18,7 10,3 10,8

240 более 138 1,8 1,9 1,7 1,7

138-10,5 9,5 16,5 10,4 4,5

10,5-5,1 12,9 18,1 10,9 10,4

Из результатов, приведенных в таблице 5, видно, что при гидролизе натриевого казеината 3%-ным пепсином уже через 120 мин достигается максимальное содержание низкомолекулярных (10,5-5,1 кД) структур: 18,7%.

Дальнейшее увеличение продолжительности гидролиза не приводит к заметному изменению в содержании низкомолекулярных фракций. Кроме того, полученные данные позволяют утверждать, что проведение гидролиза пепсином существенно эффективнее по сравнению с трипсином. Гак, при одной и той же концентрации фермента (3%) низком ол е кулярящх пептидных фракций при гидролизе пепсином образуется в 1,7 рала больше, чем при гидролизе трипсином.

Таким образом, с учетом определения м ол е кулярно-м ассово го распределения пептидных фракций были выбраны оптимальные технологические параметры выделения казеиновых фосфопептилов.

На следующем этапе исследований в питательную среду вносили различные дозы водного раствора СРР; и сульфата железа. За процессом связывания -железа следили по количеству образованного хедатированного Ке2" {% железа, оставшегося в двухвалентной форме ог первоначальной дозы). Результаты исследований {средние показатели по всем изученным штаммам) представлены на рисунке 4.

Как показывают данные, представленные на рисунке 4, наличие в среде казеиновых фосфопептилов способствует солюбнлизации железа и сохранению его в виде Ре"т ионов. Максимальное количество растворимых комплексов железа (90-95%) образуется при внесении 20% водного раствора казеиновых фосфопептилов и 0,45 мг/мл сульфата железа. Интересным является тот факт, что с увеличением дозы Ре50_1 степень солюбилизации железа снижается. Это, вероятно, объясняется тем, что СРР5 могут связывать только ограниченное число молекул железа, то есть количество ионизированного минерала не должно превышать количество имеющихся анионных гидрофильных участков аминокислот казеиновых фосфопеп гидов. ^

■

ШШЛ—-- ^Н И содержание

железа н Среде 0,45 ; мг/мл

Г - 2 I* | П содержание

железа я среде 0,55

-У-,--V—f мг/мл

10% 20%

Содержание водного раствора казеиновых фосфопсптидов в среде |% от обьеми)

Рисунок 4 - Зависимость содержания в средах усвояемого (хелатированного) Fe""* от количества ¿одного раствора казеиновых фосфопептилов

100-, 90 ЭО 70 60 50-| 40 302010 0

контроль

Существует мнение, что искусственные хелатные формы минералов лри хранении разрушаются и теряют свою эффективность, поэтому они уступают природным органическим солям этих элементов. В связи с этим исследовали сохранность железа, хелатированного казеиновыми фосфопепти-дами, в двухвалентной форме в процессе длительного хранения Результаты исследований представлены в таблице б

Таблица 6- Влияние СРР5 на процесс солюбилизации железа при хранении

Штамм Содержание СРРв, % Содержание Ре2+в среде при хранении (% от первоначальной дозы внесения), суг

30 60 90 120

Р Йеис1епг1с1ш эиЬзр йеёепгеюЬи АС-2500 контроль 19,0 19,0 19,5 18,5

10 58,0 62,0 62,5 60,0

20 88,0 88,0 88,5 88,0

Р сус1о11ехашсит Кшапо АС-2260 контроль 30,0 29,5 30,0 28,5

10 69,0 70,5 70,0 69,0

20 94,5 95,0 95,0 94,5

Р сус1о11ехашсит Кшапо АС-2259 контроль 32,0 32,0 30,5 29,0

10 60,0 60,5 60,0 59,5

20 75,0 75,0 75,5 75,0

Р 1ге<1епге1с1ш эиЬвр вЬегтапи АС-2503 контроль 22,0 25,0 25,5 19,0

10 66,0 67,0 66,0 63,5

20 95,0 96,0 96,0 95,0

Данные, приведенные в таблице 6, указывают на то, что в процессе хранения количество хелатированного железа в концентратах, содержащих раствор СРР8, практически не изменилось Тогда как в контроле наблюдалось значительное снижение содержания растворимых ионов Ре2+

Совокупность полученных данных указывает на то, что казеиновые фосфопептиды являются перспективными хелатирующими агентами для получения новых, биодоступных форм железа В результате исследований подобраны оптимальные дозы Ре304 и водного раствора СРР5, обеспечивающие максимальное количество солюбилизированного железа

Разработка технологии получения бактериального концентрата пропионовокислых бактерий, обогащенного железом

Результаты проведенных исследований показали, что наиболее высоким биотехнологическим потенциалом обладает штамм Р &еис1еге1с1ш виЬвр зЬегтапп АС-2503, который в дальнейшем был использован в качестве ино-кулята для получения бактериального концентрата

Полученные результаты позволили оптимизировать питательную среду за счет внесения Ре804 и водного раствора СРР3, обеспечивающих высокую солюбилизацию железа и активный рост пропионовокислых бактерий

Технологическая схема получения бактериального концентрата представлены на рисунке 5

Схема приготовления водного раствора СРРя

Рисунок 5 - Схема приготовления железосодержащей биологически активной добавки

В отличие от других существующих средств профилактики дефицита железа разработанная биологически активная добавка содержит пробиотиче-

ские микроорганизмы и дозированное количество железа в солюбилизиро-ванной биодоступной форме

Качественная характеристика бактериального концентрата представлена в таблице 7

Таблица 7 -Качественная характеристика бактериального концентрата

Наименование показателя Характеристика показателя

Консистенция и внешний вид Однородная, допускается отделение сыворотки

Цвет От светло-желтого до зеленоватого с белыми вкраплениями

Вкус и запах Чистый, слегка кисловатый, без посторонних привкусов

Предельные значения рН 4,5-7,0

Температура при выпуске с предприятия, °С, не более 4

Количество жизнеспособных клеток на конец срока годности, КОЕ/см3, не менее 1 107

Масса продукта (см3), в которой не допускаются БГКП (колиформы) S aureus Патогенные микроорганизмы (в т ч сальмонеллы) 10 10 50

Дрожжи и плесени, КОБ/г, не более 10

Микроскопический препарат Кокковидные формы, собранные в длинные цепочки

Данные таблицы 7 показывают, что железосодержащий бактериальный концентрат обладает высокими биохимическими свойствами, содержит профилактическую дозу биодоступного хелатированного железа и высокое количество жизнеспособных клеток пропионовокислых бактерий, 5 мл БАД содержит 2,25 мг железа, что составляет 20% от рекомендуемой суточной нормы потребления

Таким образом, на основании проведенных экспериментов разработана технология получения нового пищевого источника органической формы железа в виде биологически активной добавки

Выводы

1. В результате проведенных исследований разработана технология получения биологически активной добавки на основе биомассы пропионово-кислых бактерий, обогащенной органическим железом

2. Установлено, что активизированные культуры пропионовокислых бактерий синтезируют гемсодержащие ферменты (каталазу, СОД, пероксида-зу), что открывает широкие перспективы для их практического применения

3 Установлено, что из всех изученных культур высокоадгезивным штаммом является РгорюшЬасЯепит йгеёепгетсЬп БиЬэр зЬегтапп АС-2503 Остальные штаммы проявили среднюю степень адгезивности

4. Подобраны оптимальные дозы сульфата железа, обеспечивающие активный рост и высокое количество жизнеспособных клеток пропионовокислых бактерий

5 Отмечено, что добавление ионов железа в питательную среду стимулирует синтез внеклеточных метаболитов, которые способствуют адаптации пропионовокислых бактерий к металлу

6 С учетом молекулярно-массового распределения пептидных соединений при гидролизе казеина был выбран наиболее эффективный способ выделения казеиновых фосфопептидов

7 Установлено, что казеиновые фосфопептиды обладают высокой способностью солюбилизировать железо и поддерживать его в двухвалентной форме в течение длительного срока хранения

8 Оптимизирован состав питательной среды за счет введения Ре804 и водного раствора СРРИ обеспечивающий наибольшую эффективность железосодержащей БАД

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Хамагаева И С., Кривоносова А В Исследования антимутагенной активности штамма РгорюшЬайепит й-еиёетпсЬп БиЬэр &ес1епгасЬн АС-2500 // Теория и практика новых технологий в производстве продуктов питания. Сб тр межрегион науч-практ семинара - Омск, 2005-С 99-101

2. Хамагаева И С , Кривоносова А В , Битуева Н Н. Образование экзо-полисахаридов пропионовокислыми бактериями // Технологии и техника агропромышленного комплекса- Мат-лы всерос науч.-практ. конф. -Улан-Удэ, 2005 - С. 86-91

3 Хамагаева И С , Кривоносова А В , Битуева Н Н. Исследование антимутагенной активности пропионовокислых бактерий // Новые эколого-безопасные технологии для устойчивого развития регионов Сибири Мат-лы всерос науч -практ конф - Улан-Удэ, 2005 - С 76-78

4 Хамагаева И С , Кривоносова А.В Подбор условий культивирования пропионовокислых бактерий штамма РгорютЬайепит б-еиёетпсЬи зиЬвр

firedenreichii AC-2500 // Научная конференция преподавателей, научных работников и аспирантов, посвященная 80-летию со дня рождения Д Ш Фролова Сб.науч тр - Улан-Удэ, 2005 - С. 98-99

5 Кривоносова A.B. Исследования активности каталазы в бактериальном концентрате пропионовокислых бактерий штамма Propionibacterium freudemrichn subsp fredenreichn AC-2500 // Устойчивость и безопасность в экономике, праве, политике стран Азиатско-Тихоокеанского региона. Мат-лы докладоввсерос. науч.-практ конф -Хабаровск, 2005 -С131-133

6 Хамагаева И С., Кривоносова A.B. Влияние железа на рост и активность пропионовокислых бактерий // Вестник ВСГТУ № 4. - Улан-Удэ, 2005. -С 47-52

7. Кривоносова А В., Хамагаева И С Влияние pH питательной среды на рост и активность пропионовокислых бактерий // Техника и технология пищевых производств- V междунар. науч. конф студентов и аспирантов -Могилев, 2006г - С 180

8 Кривоносова А.В Влияние ионов железа на рост пропионовокислых бактерий // Пищевые технологии Всерос конф. молодых ученых с международным участием. - Казань, 2006 - С 189-191

9 Хамагаева И С., Кривоносова A.B. Влияние сульфата железа на биосинтез антиоксидантных ферментов пропионовокислых бактерий // Сб науч тр Изд-во ВСГТУ, - Улан-Удэ, 2006. - С 99-101

10 Хамагаева ИС, Кривоносова AB. Разработка биологически активной добавки, обогащенной железом // Вестник ВСГТУ №6 - Улан-Уда, 2006. - С 32-38

11 Хамагаева И.С, Кривоносова А В Влияние сульфата железа на биохимическую активность пропионовокислых бактерий //Молочная промышленность. - 2007 - № 6 - С 33

Подписано в печать 24 09 2007г Формат 60x842/16 Обьем в уел п.л 1,16 Тираж 100 экз Заказ № 138

Издательство ВСГТУ 670013 г Улан-Удэ, ул Ключевская, 40в

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. СОСТОЯНИЕ ВОПРОСА И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ

1.1 Биологическая роль железа в организме.

1.2 Процесс хелатирования и солюбилизации минералов.

1.3 Биохимические свойства пропионовокислых бактерий.

1.4 Внеклеточные факторы адаптации микроорганизмов к неблагоприятным условиям среды.

Концепция оптимального питания предполагает в качестве одного из важнейших условий сохранения здоровья человека адекватную обеспеченность его организма как макро-, так и микронутриентами, в том числе и эссенциаль-ными микроэлементами, в частности железом. Железодефицитные состояния по-прежнему остаются актуальной и, во многих отношениях, не решенной проблемой современной медицины. Недостаток железа в организме приводит ко многим негативным последствиям. Одним из них является развитие железоде-фицитной анемии.

Учитывая, что в повседневной жизни человек потребляет железо в составе растительных и животных продуктов и что наличие аминокислот и пептидов, а также белков животного происхождения способствуют лучшему усвоению организмом этого микроэлемента, представляется целесообразным обогащать рационы питания именно органическими формами железа. По нашему мнению, наиболее удобным объектом для биотехнологического получения железа в органической форме являются пропионовокислые бактерии, которые обладают' способностью синтезировать значительное количество гемсо-держащих ферментов и корриноидов, повышающих усвоение железа.

Известно, что железо в организме может всасываться только в виде Fe2+. Однако двухвалентное железо подвергается быстрому химическому окислению, переходя в нерастворимую, неусвояемую организмом трехвалентную форму. Для сохранения биодоступности железа привлекательной представляется роль хелатирующих «агентов», которые способствуют солюбилизации минералов, сохраняя их в растворимом состоянии. Одним из представителей такого рода хелаторов являются казеиновые фосфопептиды (CPPs). Следует отметить, что до сих пор казеиновые фосфопептиды недостаточно изучены и как хелати4 рующие «агенты» для минералов, и как потенциальные нутрицевтики в питании человека. Кроме того, в литературе отсутствуют данные о влиянии CPPs на солюбилизацию железа. Поэтому исследование железосвязывающей способности CPPs представляет большой интерес.

Таким образом, разработка и создание биологически активной добавки, содержащей железо в органической хелатированной форме, является актуальным и эффективным способом кардинального улучшения здоровья населения нашей страны.

ВЫВОДЫ

1. В результате проведенных исследований разработана технология получения биологически активной добавки на основе биомассы пропионовокислых бактерий, обогащенной органическим железом.

2. Установлено, что активизированные культуры пропионовокислых бактерий синтезируют гемсодержащие ферменты (каталазу, пероксидазу, СОД), что открывает широкие перспективы для их практического применения.

3. Установлено, что из всех изученных культур высокоадгезивным штаммом является Propionibacterium fredenreichii subsp. shermanii AC-2503. Остальные штаммы проявили среднюю степень адгезивности.

4. Подобраны оптимальные дозы сульфата железа, обеспечивающие активный рост и высокое количество жизнеспособных клеток пропионовокислых бактерий.

5. Отмечено, что добавление ионов железа в питательную среду стимулирует синтез внеклеточных метаболитов, которые способствуют адаптации пропионовокислых бактерий к металлу.

6. С учетом молекулярно-массового распределения пептидных соединений при гидролизе казеина был выбран наиболее эффективный способ выделения казеиновых фосфопептидов.

7. Установлено, что казеиновые фосфопептиды обладают высокой способностью солюбилизировать железо и поддерживать его в двухвалентной форме в течение длительного хранения.

8. Оптимизирован состав питательной среды за счет введения FeS04 и водного раствора CPPS, обеспечивающих наибольшую эффективность железосодержащей БАД.

1. Абилеев С.К. Антимутагенные свойства бактерий // Прикладная биохимия и микробиология. -2002. -Т 38. - № 2.- С. 115-127

2. Авцын А.П., Жаворонков А.А., Рош М.А., Строчкова Л.С. Мик-роэлементозы человека -М: Медицина.- 2005.- 496 С.

3. Алекперов У.К. Антимутагенез: теоретические и практические аспекты. М.: Наука.- 2005,- 100 С.

4. Аркадьева Г.В. Диагностика и лечение железодефицитных состояний: Учебно-методическое пособие.- М.: Агропромиздат. -1999. -С. 2225.

5. Асонов Н.Р. Микробиология М.: Агропромиздат. - 1989.-351 С.

6. Бабский В.Г. Явление самоорганизации у бактерий на клеточном и популяционном уровнях // Нелинейные волны. Динамика и эволюция.-2001. -С.299-303

7. Белозерова Л.М. Разработка технологии кисломолочного продукта с использованием пропионовокислых бактерий. Канд. дис. - Улан-Удэ. -2001.- 108 С.

8. Белозерская Т.А., Гесслер Н.Н. Окислительный стресс и диффе-ренцировка у микроорганизмов // Микробиология. 2006. - Т 75. - № 4. - С. 497-501

9. Ботвинко И.В. Экзополисахариды бактерий // Успехи микробиологии. -1999. -Т.20.- С. 79-12

10. В.И. Брилис, Т.А. Брилене, Х.П. Ленцнер, А.А. Ленцнер // Журн. Микробиол. 1982. - №9. - С. 75-78.

11. Брюханов A.JI., Тауэр Р.К., Нетрусов А.И. Каталаза и суперок-снддисмутаза в клетках строго анаэробных микроорганизмов // Микробиология.-2001.- Т 70. №5.- С. 330-335

12. Бухарин О.В., Гинцбург А.Л., Романова Ю.М., Эль-Регистан Г.И. Механизмы выживания бактерий.- М.: Медицина. -2005. 367 С.

13. Веницианов Е.В. Физико-химические основы моделирования миграции и трансформации металлов в природных водах Екатеринбург: Рос-НИИВХ. - 2002 . - С. 236;

14. Владимиров Ю.А. Оленев В.И., Суслова Т.Б. и др. Механизм пе-рекисного окисления липидов и его действие на биологические мембраны. -М.: Биофизика. 1985 - Т.5. - С. 56-117.

15. Войнар А.И. Биологическая роль микроэлементов в организме животных и человека. -М.: Высшая школа. 1960.-544 С.

16. Воробьева Л.И., Алтухова Е.А., Наумова Е.С. Дисмутагенное действие культуральной жидкости, полученной в результате пропионовокис-лого брожения // Микробиология. -1993. -Т 69. -№ 6. -С. 1093-1100

17. Воробьева Л.И., Абилев С. К. Антимутагенные свойства бактерий. // Прикладная биохимия и микробиология. Т.38. - 2002. - №2 - С.115-127.

18. Воробьева Л.И., Ходжаев Е.Ю., Пономарева Г.М. Внеклеточный белокпропионовокислых бактерий ингибирует индуцируемые мутации у штаммов Salmonella typhimurium // Микробиология. 2001. - Т. 70. - № 1. -С. 39-44.

19. Воробьева Л.И., Ходжаев Е.Ю., Пономарева Г.М. // Микробиология. -2003. Т 72. - № 3. -С. 482-487

20. Воробьева Л.И., Ходжаев Е.Ю., Пономарева Г.М., Брюханова А.112

21. Прикладная биохимия и микробиология. Т.39 - 2003. - №2 - С.202-207.

22. Воробьёв А.А., Лыкова Е.А. Бактерии нормальной микрофлоры: биологические свойства и защитные функции // Микробиология. 1999. - № 6.-С. 102-105.

23. Воробьева Л.И. Наиполезнейшие из анаэробов. Пропионовокис-лые бактерии для биотехнологии//Химия и жизнь.-1984.-№5.-С.19-22

24. Воробьева Л.И. Пропионовокислые бактерии. М.: Изд-во МГУ, 1999.-300с.

25. Воробьева Л.И. Стрессоры, стрессы и выживаемость бактерий // Прикладная биохимия и микробиология. -2004. -Т.40. -№ 3. С. 261-269

26. Воробьева Л.И., Чердынцева Т.А., Абилев С.К. Антимутагенное действие против мутегенеза, индуцируемого 4- НХО у сальмонеллы // Микробиология . -1995. Т 64.- № 2.- С. 228-233.

27. Высотский В.В., Вайсман И.Ш., Чемурзиев Н.В. // Журнал микробиологии, эпидемалогии и иммунологии. -1999.- № 9. -С. 54

28. Высотский В.В., Лазарева Г.И., Рапопорт А.И. // Микробиология.- 1991.-Т 60. -вып. 2. -С. 328

29. Высотский В.В., Мазурова И.К., Шмелева Е.А. // Журнал микробиологии, эпидемалогии и иммунологии. -1997. -№ 8. -С. 90-95

30. Высотский В.В., Смирнова- Мутушева М.А., Ефимова О.Г., Ба-кулина Н.А. Когезия клеток //. Микробиология. -2003. -Т 28. № 4. -С. 271

31. Ганина В.И., Ананьева Н.В., Рожкова Т.В. Интегрированный подход к созданию отечественных стартовых культур прямого внесения // Молочная промышленность. -2005. -№11. -С. 23-24

32. Гаппаров М.М., Стан Е.Я. Влияние казеиновых фосфопептидовна биодоступность минералов // Вопросы питания.-2003. -№6.-С.40-441. ИЗ

33. Гесслер Н.Н., Леонович О.А., Рабинович Я.М., Рудниченко М.Н. Сравнительное исследование компонентов антиоксидантной защиты в процессе роста мицелия дикого // Прикладная биохимия и микробиология. -2006. Т.42.- № 4. -С. 354-358

34. Грабович М.Ю., Чурикова В.В., Дубинина Г.А., Поправка И.П. Изучение активности ферментов, взаимодействующих с продуктами неполного восстановления кислорода // Микробиология. 1988. -Т 57,- вып. 6 -С.929-934

35. Дворецкий Л.И. Железодефицитная анемия. -М.: Ньюдиамед, 1998.-40 С.

36. Дубинина Р.А. О функциональном значении окисления двухвалентного железа и марганца. -В кн.: Микробиология. М.: Наука. 1978. -Т. 17- вып.5- С. 783-789

37. Езупчук Ю.В. Патогенез как функция макромалекул.- М.: Меде-цина. -1995.-С. 4-77

38. Зазнобов М.Е., Сайфутдинов Р.Г. Способ лечения железодефи-цитной анемии: Патент № 2272647 // Бюл. изобрет. -2006. №9

39. Звягенцев Д.Г. Взаимодействие микроорганизмов с твердыми поверхностями. -М.: Изд-во МГУ. -1993. -255 С.

40. Иброгимова С.И., Нерова Н.М., Работнова И.Л. Влияние ионов водорода на некоторые свойства пропионовокислых бактерий // Микробиология. -1991.-Т 40.-№ 5. -С. 833-837

41. Канопкайте С. Кобаламины. -Вильнус.: Мокслас. -1978. -144 С.

42. Кольямов Я.В., Рем К.Г. Наглядная биохимия. -М.: «Мир»,-2000.- С. 350-351

43. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова Н.О., Токарев В.Е. Метод определения активности каталазы // Лабораторное дело. -1988.- № 1. -С.16

44. Корпухина Л.В., Мельникова У.Ю., Соболева Е.Ф. и др. // Микробиология. -1999. -Т 68. -№ 4. -С. 445-447

45. Кулаева О.Н. Энциклопедия «Современное естествознание»- М.: Магистр-пресс. -2000. -Т 2. -С. 271-279

46. Куликова А.К., Летунова Е.В. Метод определения активности |3-галактозидазы с лактозой в качестве субстрата // Прикладная биохимия и микробиология. -1995. -Т 20.- вып 3.- С. 139-144

47. Курьята Н.В., Елинская Н.В. Влияние пищеварительных ферментов на адгезивные свойства лактобацилл // Вестник конференции «Совет молодых ученых».- 2005. -№ 5. -С. 37-38

48. Конев С.В. Структурная лабильность мембран и регуляторные процессы.- М.: Наука и техника. -1998.- 240 С.

49. Лебедева О.В., Угарова Н.Н., Березин И.В. Кинетическое изучение реакции окисления о-дианизидина перекисью водорода в присутсивии пероксидазы из хрена // Биохимия. -1977. -Т 42.- № 8.- С. 1372-1379

50. Липелис Г.П. Лечение острых кишечных инфекций и железоде-фицитной анемии у детей // Здоровье Украины.- 2002,- №6.- С. 36

51. Мазо В.К., Гмошинский И.В., Скальный А.В., Сысоев Ю.А. // Вопросы питания.-2002.-Т.71.- №3.-С.46-51.

52. Методы и достижения бионеорганической химии / под ред. К. Мак Олиф. -М.: Мир.- 1978.-415 С.

53. Мишаева Р.Н. Модификация каталазы глутаровым альдегидом //

54. Прикладная биохимия и микробиология. -2006. -Т 42. -№ 4. -С. 404.115

55. Мягконосов Д.С., Захарова Н.П. Влияние пропионовокислых бактерий на вкус молочных продуктов // Сыроделие и маслоделие.- №5.- 2003.-С. 16-15

56. Нево А.С., Пшеничникова А.Б., Складнев Д.А., Швец В.И. Влияние дейтерометанола и оксида дейтерия на ростовые характеристики и биосинтез экзополисахарида облигатными метилотрофными бактериями // Биотехнология. -2003. -№ 6. -С. 38-46

57. Новинюк JI.B., Новицкая И.Б. Использование хелаторов в продуктах функционального назначения // Проблемы создания продуктов здорового питания. Наука и технологии: Сб. мат.науч.-практ.конф. -Углич.- 2006.-С. 38

58. Николаев Ю.А., Мулюкин A.JI., Степаненко И.Ю., Эль-Регистан Г.И. Ауторегуляция Стрессового ответа микроорганизмов // Микробиология.- 2006. -Т 75- №4- С. 489-496

59. Николаев Ю.А. Внеклеточные факторы адаптации бактерий к не- . благоприятным условиям среды // Прикладная биохимия и микробиология.-2004.-Т 40.-№4.- С. 387-397

60. Николаев Ю.А., Просерр Дж.И. Свойства адгезина и антиадгези-на // Микробиология.- 2000.-Т 69.- №2. -С. 237-242

61. Николаев Ю.А., Просерр Дж.И. Внеклеточные факторы, влияющие на адгезию бактерий на стекле // Микробиология. -2000. -Т 69.- № 2. -С. 231-236

62. Николаев Ю.А., Паников Н.С. Внеклеточная протеиназа как регулятор адгезии // Микробиология.-2002.-Т 71. -№ 5. -С. 629-634

63. Новик Г.И., Высотский В.В. Архитектоника популяций бифидо-бактерий: субмикроскопический аспект когезии клеток // Микробиология. -1995. Т 64. -№ 2. -С. 222-227

64. Ноздрюхина JI. Р., Гринкевич Н. И. Нарушение микроэлементного обмена и пути его коррекции.— М.: Наука,- 1990.— 280 с.

65. Олескин А.В., Ботвинко И.В., Цавкелова Е.А. Колониальная организация и межклеточная коммуникация у микроорганизмов // Микробиология. -2000. -Т.69,- № 3. -С. 309-327

66. Островский Д.Н. Окислительный стресс у бактерий. 53-е Бахов-ское чтение.- М.: ИНБИ РАН.- 1997.24 С.

67. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. -М.: Мир.- 1998.-331 С.

68. Петров В.Н.Физиология и патология обмена железа. -Д.: Лениз-дат.- 1989- 233С.

69. Порт Е.В. Изучение адгезивных свойств синегнойной палочки // Вестник Харьковского национального университета,- 2004. -№ 639. -С. 12-14

70. Подкопаева Д.А., Грабович М.Ю., Дубинина Д.А. Окислительный стресс и система антиоксидантной защиты клеток у микроаэрофильной бактерий // Микробиология. -2003. -Т 72.- № 5. -С. 600-608.

71. Полянская И.С., Топал О.И., Шмакина А.Ф. Метод обогащения Б АД микроэлементами. Патент №22873 02//Бюл. Избр. №36,- 2006

72. Полянская И.С. Нано-, микро-, милли- и макроэлементы в функциональных продуктах.// Технологии и продукты здорового питания. Материалы международ, конференции. -М.: МГУПП. 2005.- С. 175-182

73. Проскурин И.К., Гусева К.Е., Агапова А.Е. Эколого-биохимические исследования в модельной водной экосистеме // Ярославский педагогический вестник. -2003. -№ 2. -С. 35-40

74. Раилкин А.И. Процессы колонизации и защита от биообрастания. -СПб.: Изд-во СпбГУ. -1998. -272 С.

75. Радионова Т.А., Николаев Ю.А. Защитное действие обратимой адгезии термофильной бактерии от N-этиламилеимида // Микробиология.-2004. -т 73. -№ 1. -С. 133-134

76. Родионова Т.А., Шеховцова Н.В., Паников Н.С., Николаев Ю.А. Рост и адгезия в зависимости от условий культивирования // Микробиология. -2003.-т 72. -№ 4. -С. 521-527

77. Романова Ю.М., Смирнова Т.А., Андреев А.Л., Ильина Т.С., Ди-денко Л.В., Гинцбург А.Л. Образование биопленок- пример «социального» поведения бактерий //Микробиология.- 2006.- Т 75.- №4.-С. 556-561.

78. Савенкова М.И., Курченко В.П., Метелица Д.И. // Биохимия,-1984.-Т49.- вып. 5. -С. 850

79. Семенихина В.Ф., Рожкова И.В. Новые достижения в технологии кисломолочных продуктов // Молочная промышленность.- №9.- 2002.- С .4142

80. Сидорчук И.И. Антагонистическая активность пропионовокислой палочки Шермана и эффективность ее использования в лечении дисбакте-риозов // Автореф. дис. докт. мед. наук. -К.- 2002. 36 с.

81. Сирота Т.В. Новый подход в исследовании процесса аутоокисле-ния адреналина и использование его для измерения активности супероксид-дисмутазы // Вопросы медицинской химии. -1999. -№ 3. -С.22-33

82. Синицин А.П., Райнина Е.И., Лозинский В.И., Спасов С.Д. Иммобилизация клетки микроорганизмов -.М.: Изд-во МГУ. -1994. -288 С.

83. Смирнов И.В., Кольцов Г.Н., Гладун В.В., Левина А.А. Референтный метод определения железа // Проблемы гематологии и переливания крови. -1999.-№ 1. -С. 50-53

84. Смирнова Г.В., Закирова О.Н., Октябрьский О.Н. Роль антиоксидантных систем в отклике бактерий на тепловой шок // Микробиология.-2001.-Т 70.- №3.- С. 595-601

85. Спиричев В.Б. Научные принципы обогащения пищевых продуктов микронутриентами // Ваше питание.- 2000.- №4.- С. 45-46

86. Спиричев В.Б., Шапнюк л.Н., Позняковский В.М. Обогащение пищевых продуктов витаминами и минеральными веществами. Наука и тех-нология.-Новосибирск: Изд-во Сиб.унив.- 2004.- С.54-52

87. Стан Е.Я.//Вопросы питания,-1987.-Т.56,.-№5.-С.З-9

88. Таширев А.В. Взаимодействие микроорганизмов с металлами // Микробиология.- 1995. -Т.57.-№2. -С.95-104

89. Теория и практика непрерывного культивирования микроорганизмов. М.: Микробиология.- 2004,- Т 4.- 211 С.

90. Транскликолизирующее действие ферментов препаратов р-галактозидаз // Тихомирова А.С., Церетели А.К., Куликова А.К. и др. Прикладная биохимия и микробиология. -1980. -Т 16. -вып. 1. -С. 65-71.

91. Тутельян В.А. К вопросу коррекции дефицита микронутриентов с целью улучшения питания и здоровья детского и взрослого населения на пороге третьего тысячелетия // Ваше питание.- 2004.- №4.- С. 25-27

92. Тутельян В.А., Спиричев В.Б., Шатнюк JI.H. Коррекция микро-нутриентиого дефицита важнейший аспект концепции здорового питания населения России // Вопросы питания.- 1999.- № 1.- С. 3-11.

93. Федичкина Н.В., Кирпичникова И.В. Обогащение продуктов питания минеральными веществами // Хранения и переработка сельхозсырья.-2003.-№4- С.91-93

94. Хамагаева И.С. Научные основы биотехнологии кисломолочных продуктов для детского и диетического питания: Монография. Улан-Удэ.: Изд-во ВСГТУ. -2005. -279 С.

95. Хамагаева И.С., Качанина JI.M. Кисломолочный напиток «Целебный» // Молочная промышленность. -2005. -№ 5.- С. 66-68

96. Чернов В.М. и др. Применение внутримышечных и внутривенных препаратов железа в клинической практике // Гематология и трансфу-зиология.- 2004.- Т 49.- №3.- С. 46-49

97. Шакирзянова М.Р., Рузнецова Д.М. и др. Способность некоторых штаммов пропионовокислых бактерий к синтезу витамина В!2 // Микробиология.- 2002.-Т 71.- №4.- С. 570

98. Шапиро Дж. А. Бактерии как многоклеточные организмы // В мире науки. -1998. -№8. -С. 46-54

99. Эрвольдер Т.М., Гудков А.В. Влияние ионов металлов на рост бифидобактерий в гидролизатно молочной среде // Микробиология. -1997.-№6.-С. 25-26

100. Эрвольдер Т.М., Гудков А.В., Семенова Л.П., Гончалава Г.И. Воздействие ферментных гидролизатов на накопление биомассы бифидобак-терий //Молочная промышленность. -1980. -№ 2.-С. 15-17

101. Adamson N.J., Reynolds Е.С. // Biotech. Bioengin. -1995.- Vol.45.-№ l.-P. 196-204

102. Andrews N.C. Disorders of Iron Metabolism.- N.:Engl.Med. -1999.-341.-№26.- P. 1986-1995

103. Asida K., Narajima Т., et al // Anim. Sci.Technol. -2002.- Vol.67.-№11.-P. 967-974

104. Bell G.J. // Sciens. -1998. -V.200. -P.618

105. Berracol R., Chanson S., Juillerat M.A. et al // J. Daiiy Res. 1989.-Vol.56.- № 3.- P. 335-341

106. Bezwoda WR et al. The relationship between marrow iron stores, plasma ferritin concentrations and iron absorption. Scand J Haematol. 1999.-№ 22.- P.l 13-20.

107. Cerning J., Bouillanne C., Landon M., Desmazeaund M.J. // Sci. Ali-mens. -2000. V.10-P. 443-451

108. Cerning J // fed. Eur. Microbiol. Soc. Microbiol. Rev. 2000. - V.87 -P. 113-130

109. Conrad M.E., Umbreit J.H. A Consive Review: IronAbsorption the Mucin-Mobilferrin-Integrin Pathway. A Competitive Pathway for Metal Absorption.- Am.J.Hematol.- 1993.- 42. - P.67-73

110. Conrad M.E., Umbreit J.H. Iron Absorption and Transport An Update.- Am.J.Hematol.- 2000.- V.64.- P.287-298

111. DworkinM.//Microbiol. Rev. -1999. -V.60. -№ 1. -P.70-84

112. Finch С. Regulators of Iron Balance in Humans.- Blood.- 1994. -V.84.-6.-P.1697-1702

113. Fitz-Gerald RJ. // Ibid. -1998.- Vol.8.- № 5.6.- P. 451-457

114. Fletcher M. Bacterial Adhesion (Mechanisms and Significance) // London. Premium Press. -2000. -P. 339-362

115. Fletcher M. Effect of solid on the activity of attached bacteria // Bacterial Adhesion (Mechanisms and Significance).: London. Premium Press. -2002.-P. 639-672

116. Fletcher M. Bacterial attachment in aquatic environments // Bacterial Adhesion. Molecular and ecological diversity.-N.Y.: Wiley-Liss. -1998. -P. 1-25

117. Entec J.D., Woodrow J.R., Quirk A.V. Investigation of cadmium resistance in an Alcaligenes sp. // Appl. and Environ. Microbiol.- 2005.- V.51.- № 3.-P. 133-157

118. Kunst A. Process to isolate phosphopeptides. European Patent Application EPO 476 199A1 1990

119. Kasait., Iwasari R., Tanara M. et al // Biosci. Biotech. Biochem.-2001-Vol.59, №1.-P. 26-30

120. Kitts D.D., Yuan Y.V. // Trends Food Sci. techno!. -2002.- Vol.3. № 1.-P. 31-35

121. McDonagh D., Fitz-gerald RJ. et al // Int.Dairy J. 1998.-Vol.8. № 1.- P. 39-45

122. Marshal K.C. Mechanisms of bacteria adhesion at solid- water interfaces // Bacterial Adhesion. -N.Y.: Premium Press.- 2000. -P. 339-362

123. Milman N., Bergholt Т., et. al. Iron reguirements and iron balance during pregnancy.: Useskr Laeger.-2000. P. 159

124. Mitra R.S. Protein synthesis in Escherichia coli during recovery from exposure to low levels of Cd // Appl. and Environ. Microbiol.- 2004. -V.47. -№ 5.-P. 1012-1016

125. Gordon A.S., Howell L.D., Harwood V. Responses of diverse heterotrophic bacteria to elevated copper concentrations // Can. J. Microbiol . -2004. -V.40.- № 5.-P. 408-411

126. Holt C. // Eur. J. biochem. .-1998.- Vol.252.- № l.-P. 73-75

127. Iarette W.D. A rewiew of the important trace elements in deiry products.- J. Deiry Technol.- 1979.- Vol.34- №1- P. 28-34.

128. Juillerat M.A., Baechler R., Berrocol R. et al // J. Dairy Res. 1989.-Vol.56.- № 3.- P. 603-611

129. PerezChaia A., Zirate G., Oliver G. The probiotic properties of propionibacteria// Lait. -1999. -V. 79.- P. 175-185.

130. Ponka P. Cellular Iron Metabolism.- Kidney International- 1999.-vol.55.-Suppl.69.- P.S2-S11

131. Report of the UNICEF/WHO Regional Consultation Prevention and Control of Iron Deficiency Anemia in Women and Children. 3-5 February 1999, Geneva, Switzerland (http://www.who.int/nut/ida.htm).

132. Reynolds E.C., Cain C.J., et al // J. Dent.Res. -1995.-Vol.74. №6.-P. 1272-1279

133. Rowbury R.J. // Sci. progress. -2001 -V.84.-№ 3. -P. 205-233/

134. Sato R., Naguchi Т., Naito N. // J. nutr. Sci. vitaminol. -1986.-Vol.32.-№ l.-P. 67-76

135. Sato R., Shindo M., et al // Biochim. Biophys. Acta.- 2001.-Vol.77, .-pp 413-415

136. SchlimmeE., Meisel H. //Nahrung. .-1995.- Vol.39.№ l.-P. 1-20.123

137. Scudiero R., Capasso C., Madonna L. Identification of a metalbinding complex from thermophilic bacteria growth in the presence of heavy metals // Int. Conf. Thermophiles: Sci. and Technol., Reykjavik. 23-26 th Aug.- 2002. -Reykjavik.- 2002.-P.38

138. Sigel A, Sigel H. Metal Ions in biological systems: Iron transport and storage in microorganisms, plants and animals. -New York.- 1998.

139. Shapiro D.A., Dworkin M. Bacteria as multicellular Organisms. -N.Y.: Oxford Univ. Press.- 2000. -P. 33-69

140. Vorobjeva L.I., Khodjaev E.Y. // Proc. 3 rd Int. Conf. Predictive Modeling in Foods. Leuven. Belgium.- 1998. -P. 182-184

141. Wirth R., Muscholl A., Wanner G. // Terends Microbiol.- 1997.- V.4. -P. 96-103

142. Yoshirawa M., Sasari R., Chiba H. // Aric. Biol. Chtm.-1981.-Vol.45.-№ 4.-P. 909-914

143. ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Восточно-Сибирский государственный технологический университет»1. ГОУВПОВСГТУ)1. ОКП92 2900 Группа Н 181. ОКС 67.100.99)

144. Технические условия ТУ 9229-016-02069473-2007 (вводятся впервые)I1. РАЗРАБОТАНО:всгп:;

145. В научно-исследовательской лаборатории по производству бактериальных препаратов ВСГТУ была проведена опытно-промышленная проверка и лабораторные испытания концентрата на основе биомассы пропионовокислых бактерий, обогащенного железом.

146. Для проведения опытно-промышленной проверки имеется необходимая нормативно техническая документация ТУ 9229-016-02069473-2007 «Гемопропиовит».

147. Опытно-промышленная проверка технологии бактериального концентрата, обогащенного железом, предусматривает:

148. Приготовление водного раствора казеиновых фосфопептидов

149. Получение активного инокулята пропионовокислых бактерий

150. Приготовление специально подобранной среды для культивирования пропионовокислых бактерий

151. Внесение сульфата железа и водного раствора казеиновых фосфопептидов

152. Получение бактериального концентрата на основе биомассы пропионовокислых бактерий, содержащего железо6. Проверка качества