автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.04, диссертация на тему:Разработка ПЦР-тест-системы для идентификации патогенного прионного белка крупного рогатого скота

На правах рукописи

Драгунова Екатерина Евгеньевна

РАЗРАБОТКА ПЦР-ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПАТОГЕННОГО ПРИОННОГО БЕЛКА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Специальность 05.] 8.04 - технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

2 8 НОЯ 2013

Кемерово 2013

005540734

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» (ФГБОУ ВПО «КемТИПП»),

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор

Просеков Александр Юрьевич

Официальные оппоненты: Громов Константин Георгиевич,

доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кемеровская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, заведующий кафедрой общей гигиены

Тихонов Сергей Леонидович,

доктор технических наук, доцент, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Уральская государственная академия ветеринарной медицины», заведующий кафедрой управления качеством

сельскохозяйственного сырья и потребительских товаров

Ведущая организация: Государственное бюджетное учреждение Ярославской области «Ярославский

государственный институт качества сырья и пищевых продуктов»

Защита диссертации состоится «19» декабря 2013 г. в 12-00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.089.01 в ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» по адресу: 650056, г.Кемерово, бульвар Строителей, 47, ауд. 4-я лекц. ауд. тел./факс: (8384-2) 39-68-88.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности». С авторефератом можно ознакомиться на официальных сайтах ВАК Минобрнауки РФ (http://vak.ed.gov.ru) и ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» (http://www.lcemtipp.ru). Автореферат разослан «18» ноября 2013 г.

Кригер Ольга Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность—работы. В последние годы обнаружена группа заболеваний, характеризующихся прогрессирующим поражением различных отделов нервной системы и имеющих необычный генетический механизм возникновения и развития. Прионные инфекции - категория трансмиссивных неиродегенеративных болезней животных и человека, объединенных на основе общности этиологии и клинических симптомов. Возбудителями заболевания являются прионы. Основные характеристики - длительный инкубационный период, медленно прогрессирующее течение, патологические изменения третичной структуры белка, вследствие чего нарушаются механизмы функционирования нервных тканей, отсутствие признаков инфекционного воспаления и иммунного ответа, неизбежный летальный исход.

Начало заболевания наступает, как правило, в среднем или позднем возрасте. Заражение человека чаще всего происходит при употреблении в пищу мясопродуктов, полученных от зараженных животных, либо при нейрохирургических вмешательствах, трансплантации тканей, назначении гормонов, полученных от зараженных доноров с нераспознанной прионной инфекцией, использовании для полива зараженных сточных вод.

В связи с вероятностью возникновения прионных заболеваний у человека и животных, что впоследствии может привести к их массовому распространению, а также в связи с неизбежной летальностью заболеваний, необходима разработка действенных методов диагностики, в том числе на ранних стадиях возникновения заболеваний.

Основными методами диагностики прионных заболеваний животных остаются различные варианты иммунологического анализа, а именно: иммуногистохимическое выявление аномальной формы приона на срезах тканей мозга, электроэнцефалография, вестерн-блоттинг и иммуноферментный анализ.

Существующие методы диагностики прионных инфекций в качестве объекта исследования используют ткани мозга животных или лимфоидные ткани. В процессе переработки животного сырья возможна перекрестная контаминация и заражение патогенной формой прионного белка нормальных прионов, присутствующих в других частях туши.

Данные методы имеют различную диагностическую ценность - одни требуют значительных затрат по времени, другие обладают низкой чувствительностью и специфичностью, высокой инфекционной опасностью для оператора.

Поэтому усовершенствование и разработка более чувствительных и специфичных, а также экспрессных методов идентификации патогенной формы прионного белка остаются актуальной проблемой.

Таким методом может быть разработка тест-системы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод ПЦР имеет ряд преимуществ -прямое определение ДНК возбудителя, высокая специфичность, высокая

чувствительность, универсальность процедуры, простота и удобство проведения анализа, сравнительно небольшие затраты времени на проведение анализа.

Степень проработки темы исследований. Постоянно увеличивающийся теоретический интерес к проблеме диагностики прионных заболеваний обусловлен результатами молекулярно-биологических исследований структуры прионных белков, позволивших собрать и систематизировать значительный материал о структуре, функции и накоплении в зараженном организме человека и животных данных инфекционных агентов, и определить новые направления в дальнейших подходах к диагностике и терапии прионных болезней.

Исследования по изучению прионов и вызываемых ими болезней обобщены в трудах российских и зарубежных ученых: В.Б. Григорьева, В.А.Зуева, В.И. Покровского, Б. Рплзтег (Стенли Прузинера), А. Aguzz¡ (Адриано Агуззи) и др.

Цель и задачи исследований. Целью работы является разработка прототипов молекулярно-генетических тест-систем для выявления патогенного прионного белка крупного рогатого скота.

Для достижения поставленной цели сформулированы основные задачи исследований:

- определить среди исследуемых объектов образцы животного происхождения с наиболее высокой степенью потенциальной опасности в отношении продукции патогенных форм прионного белка;

- провести анализ нуклеотидных последовательностей ДНК, кодирующей синтез патогенного прионного белка крупного рогатого скота;

- сконструировать олигонуклеотидные праймеры для амплификации специфических последовательностей патогенного прионного белка крупного рогатого скота;

- выбрать параметры и провести оптимизацию процессов амплификации фрагментов гена патогенного прионного белка;

- разработать положительный контрольный образец, являющийся индикатором работы амплификационной смеси и маркером длины ПЦР-продуктов;

- разработать внутренний контрольный образец для оценки эффективности проведения анализа;

изучить специфичность разработанной ПЦР-системы и олигонуклеотидных праймеров;

- оценить условия хранения ПЦР-тест-системы;

- провести испытания, направленные на установление сроков пригодности ПЦР-тест-системы для идентификации патогенного прионного белка крупного рогатого скота.

Научная новизна работы:

- исследована и оптимизирована температура отжига олигонуклеотидных праймеров, которая составила: для левого праймера 56°С, для правого праймера 55,80°С;

- экспериментально исследован и разработан состав реакционной смеси;

- разработан положительный контрольный образец, являющийся индикатором работы амплификационной смеси и маркером длины ПЦР-продуктов для последующей электрофорегической детекции;

- разработан внутренний контрольный образец с оптимальной концентрацией 1 пг в ПЦР-пробе, который добавляется на этапе выделения ДНК и исключает ошибки исследователя при постановке реакции;

- определены оптимальные условия хранения (в сухом, защищенном от света месте при температуре 4±2°С) и установлены достоверные сроки пригодности ПЦР-тест-системы (4 месяца, при соблюдении условий хранения).

Показано, что разработанная ПЦР-тест-система имеет ряд конкурентных преимуществ по сравнению с имеющимися на мировом рынке аналогами для определения патогенной формы прионного белка - обладает более высокой чувствительностью и специфичностью, позволяет проводить диагностику прионных заболеваний на ранних стадиях возникновения, способствует снижению инфекционной опасности для оператора при исследовании пробы, находящейся в закрытой пробирке.

Практическая значимость работы заключается в разработке ПЦР-тест-системы, позволяющей осуществлять прижизненную идентификацию патогенного прионного белка у животных в ветеринарии, контроль качества сырья животного происхождения при производстве препаратов медицинского назначения, оценку содержания патогенной формы прионного белка животного происхождения в продуктах питания, производимых пищевой промышленностью.

По результатам исследований разработан проект технических условий и методические указания по использованию ПЦР-тест-системы для идентификации патогенного прионного белка.

Работа выполнена в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы». Государственный контракт от «16» февраля 2011 г. № 16.512.11.2077.

Методология и методы исследования. Определение содержания общего белка в пробах проводили по методике выполнения измерений массовой доли общего и белкового азота в мясе, мясных продуктах и белоксодержащих пищевых продуктах методом сжигания по Дюма на анализаторе белкового азота «Rapid N cube».

Молекулярно-массовое распределение белков в объектах оценивали с помощью белкового электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) методом Лэмли. Просмотр и фотографирование гелей проводили на УФ-трансиллюминаторе ТСР-20М («Vilber Lourmat», США) при длине волны излучения-312 нм.

Идентификацию белков проводили методом фингерпринта пептидных масс, для чего получали масс-спектр аминокислотной последовательности белка после проведения гидролиза трипсином в ПААГ. Масс-спектры обрабатывались с помощью программы «FlexAnalysis 2.4».

Для анализа последовательностей ДНК, кодирующей синтез гена PRNP прионного белка, использовали базу данных NCBI.

Для сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей ДНК, кодирующей синтез гена PRNP прионного белка, и построения филогенетического дерева была использована компьютерная программа «CrustalW».

Компьютерный анализ подбора праймеров для амплификации специфических последовательностей патогенного прионного белка проводили с помощью программ: «NSBI Blast2» - для определения гомологии при секвенировании соответствующих праймеров, «Primer3 Output» - для подбора и оценки параметров праймеров.

Исследования с использованием метода ПЦР в режиме реального времени были осуществлены в соответствии с требованиями нормативно-технической документации относительно определения патогенных микроорганизмов в продуктах переработки крупного рогатого скота (ГОСТР 52833-2007(ИСЮ 22174:2005) и МУ 1.3.1794-03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности»).

Степень достоверности и апробация работы. Основные положения диссертации получили одобрение на научно-практических конференциях, в том числе: на Международном научном форуме «Пищевые инновации и биотехнологии» (г. Кемерово, 2013г.), VII Международной научно-практической конференции «Тенденции и инновации современной науки» (г. Краснодар, 2013), VI Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых с международным участием «Технологии и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности» (г. Бийск, 2013), Международной научно-практической конференции «Проблемы развития биотехнологий» (г.Екатеринбург, 2013), Международной научно-практической конференции «Техника и технологии: роль в развитии современного общества» (г. Краснодар, 2013), II Международной научно-практической конференции «Сельскохозяйственные науки и агропромышленный комплекс на рубеже веков» (г. Новосибирск, 2013), VI Международной студенческой научной конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии» (г. Ульяновск, 2013).

По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе две статьи в отраслевых журналах, рекомендованных ВАК: «Техника и технология пищевых производств», «Фундаментальные исследования».

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из следующих основных разделов: введение, аналитический обзор, организация, объекты и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, практическая реализация результатов исследований, выводы, список использованных источников и приложения. Основное содержание работы изложено на 146 страницах машинописного текста, содержит 36 таблиц и 29 рисунков. Список литературы включает 158 наименований.

МЕТОДИКА ВЫПОЛНЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

Теоретические и экспериментальные исследования проведены и соответствии с поставленными задачами на кафедре «Бионанотехнология» Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности». Общая схема проведения исследований приведена на рисунке 1.

Разработка ПЦР-тест-системы для идентификации патогенного нрионного ___белка крупного рогатого скота

Анализ отечественной и зарубежной литературы, формулировка цели и задач исследований

Определение образцов животного происхождения с наиболее высокой степенью потенциальной опасности в отношении продукции патогенных форм прионного белка -1——- Г " - выделение белков с молекулярной массой 30-40 кДа - идентификация белков -оценка количественного содержания нормального прионного белка

Анализ нуклеотидных последовательностей ДНК, кодирующей синтез гена РШЧР | - последовательность нуклеогидов - филогенетическое дерево

Конструирование универсальных праймеров для амплификации гена РІ*>ІР патогенного прионного белка 1 - подбор параметров для разработанных праймеров - синтез универсальных праймеров

Оптимизация параметров реакции амплификации гена РЮч|Р патогенного прионного белка - температурно-временной профиль программы амплификации - параметры и компоненты ПЦР

Разработка положительного контрольного и внутреннего контрольного образцов -1—■—-- | - синтез образцов - определение необходимой концентрации образцов - специфичность и чувствительность

Исследование специфичности разработанной тест-системы и олигонуклеотидных праймеров 1 - определение патогенного прионного белка в образцах - сравнительный анализ ПЦР-гесг-системы и ИФА-системы «ТеБеЕ™»

Практическая реализация результатов исследования

Рисунок 1 - Общая схема проведения исследований

Весь цикл исследований состоял из нескольких взаимосвязанных этапов. На первом этапе проводили анализ отечественных и зарубежных литературных данных по теме исследования, формулировали цель и задачи собственных исследований.

На втором этапе определяли образцы животного происхождения с наиболее высокой степенью потенциальной опасности в отношении продукции патогенных форм прионного белка посредством выделения белков с молекулярной массой, соответствующей массе нормального прионного белка (30-40 кДа), идентификации белков и оценки количественного содержания нормального прионного белка в составе биологических образцов.

На третьем этапе с использованием компьютерной программы «CrustalW» в режиме on-line проводили сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей ДНК, кодирующей синтез патогенного прионного белка, с целью выявления консервативных участков нуклеотидных последовательностей для закладки родоспецефичных и видоспецефичных праймеров и построения филогенетического дерева, устанавливающего генетическую связь патогенного прионного белка. Выбраны наиболее консервативные участки, подходящие для создания праймеров.

Четвертый этап посвящен конструированию олигонуклеотидных праймеров для амплификации специфических последовательностей патогенного прионного белка крупного рогатого скота и оптимизации параметров амплификации.

На пятом этапе для оценки эффективности протекания ПЦР. обеспечения высокой чувствительности анализа и предотвращения ошибок персонала ПЦР-лаборатории были разработаны положительный контрольный и внутренний контрольный образцы.

На шестом этапе проводили исследование специфичности разработанных олигонуклеотидных праймеров путем сравнительного анализа результатов определения патогенного прионного белка, полученных с использованием вновь разработанной ПЦР-тест-системы и существующей ИФА-системы «TeSeE™».

Седьмой этап связан с практической реализацией результатов исследования: описанием ПЦР-тест-системы для идентификации патогенного прионного белка крупного рогатого скота, оценкой условий хранения разработанной ПЦР-тест-системы, расчетом затрат на проведение исследований с использованием ПЦР-тест-системы в микробиологических лабораториях предприятий, проводящих контроль качества сырья животного происхождения и оценку содержания патогенной формы прионного белка в продуктах питания и кормовых добавках для сельскохозяйственных животных, оценкой рыночного потенциала полученных результатов.

При выполнении работы использовали стандартные, общепринятые и оригинальные методы исследований, в том числе филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей белка, дифференциальную амплификацию специфических последовательностей, метод полимеразной цепной реакции в

режиме реального времени, а также описательные, аналитические,

индуктивные и дедуктивные методы обобщения отечественной и зарубежной литературы по оценке существующих технологий производства тест-систем для идентификации прионных заболеваний человека и животных.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

С целью проведения исследования по определению образцов животного происхождения, потенциально инфицируемых патогенной формой прионного белка, были подготовлены образцы проб крупного рогатого скота и животного сырья, проведено определение фракционного состава белков говядины, определено содержание общего белка в пробах (таблица 1).

Таблица 1 - Общее количественное содержание белка в образцах

Объект исследования Вес, мг Содержание общего азота, % Коэффициент пересчета Общий белок, % Погрешность измерения, ±5,%

Цельное молоко 195,60 0,656 4,64 3,02 0,31

192,40 0,648

Желатин 188,12 15,123 5,55 84,32

180,72 15,538 0,89

Цельная кровь 214,50 3,462 6,25 21,97

254,80 3,571 1,32

Сыр 189,70 4,686 4,64 21,46 0,95

229,60 4,653

Говядина 126,50 3,222 5,62 18,46 ----_ ..----

110,00 3,347 1,11

Фракция водорастворимых белков говядины 97,40 1,148 5,62 6,48 0,41

96,50 1,167

Фракция 136,30 1,520

солерастворимых белков говядины 142,25 1,528 5,62 8,52 0,53

Фракция белков 186,80 0,675 5,62 3,78

стромы говядины 171,20 0,679 0,23

На основании данных, представленных в таблице 1, можно сделать вывод, что количественное содержание общего белка в говядине составляет 18,46 г/100г, из них водорастворимой фракции - 6,48 г/100г, солерастворимой -8,52 г/100г, фракции стромы - 3,78 г/100г. Также были проведены исследования количественного содержания общего белка в различных продуктах переработки животного сырья, а именно - в желатине содержание общего белка составляет 84,32 г/100г, в цельной крови - 21,97 г/100г, образцах цельного молока -3,02 г/100г, в сыре -21,46 г/100г.

В дальнейшем было проведено исследование электрофоретического разделения в ПААГ белковых фракций в образцах. Подобрать условия для

электрофоретического разделения образцов, состоящих из цельной крови крупного рогатого скота, не удалось, поэтому проводили исследование плазмы крови (рисунок 2).

ЗЗ^р в ::; т»

^ » - г ;; .■ ' -

::: | , ' " ¿4

к»1 ^ & * & «

ШШ1 -

ШВШ . ' „ ШШШ%

Рисунок 2 - Электрофорез в ПААГ: М - маркер; А - фракция водорастворимых белков говядины; В - фракция солерастворимых белков говядины, С - плазма крови, О - желатин, Е - цельное молоко, Р - сыр.

Отсутствие в образцах белковых фракций массой от 30 до 40 кДа, соответствующих массе нормального прионного белка, свидетельствует о низкой вероятности содержания прионного белка в образцах цельного молока, сыра, желатина, фракциях солерастворимых белков и белков стромы говядины', следовательно, о низкой степени потенциальной опасности исследуемых проб Для их использования достаточно стандартной процедуры ветеринарного контроля, т.е. свидетельства о пригодности туши для употребления в пищу.

Полученные результаты указывают на то, что водорастворимая фракция белков говядины и плазма крови имеют потенциально высокую степень опасности в отношении продукции патогенных форм прионного белка.

Для однозначной идентификации содержащихся белковых фракций в вышеуказанных образцах как нормальной формы прионного белка были проведены исследования по идентификации и оценке количественного содержания нормального прионного белка. Проведенные исследования указывают, что данные образцы действительно сбдержат нормальные прионные белки крупного рогатого скота. В водорастворимой фракции белка говядины относительное содержание белковых фракций массой 37,42 кДа и 32,38 кДа составляет 0,74 и 0,51 г/100 г пробы соответственно. В плазме' крови относительное содержание белковых фракций массой 39,17 кДа и 34,89 кДа составляет 2,05 и 0,1 г/100 г пробы соответственно.

Дальнейшей задачей при разработке ПЦР-метода определения патогенной формы прионного белка было исследование разнообразия в строении гена РЯМ> прионного белка у различных представителей крупного рогатого скота для выявления внутривидовых различий в последовательности этого гена и возможности использования результатов данного исследования при молекулярной идентификации патогенного прионного белка, конструировании универсальных праймеров для амплификации гена РКЫР.

Для выбора ДНК-мишени проведено выравнивание нуклеотидных последовательностей гена PRNP, кодирующего синтез нормального прионного Ьелка (РгР ) и патогенного прионного белка (РгР&). Для сравнения были выораны следующие прионные последовательности PRNP- Equus caballus (домашняя лошадь), Equus asinus (домашний осел), Sus scrofa (свинья) Bos taurus (корова) Bos javanicus (бык яванский), Bubalus bubalis (буйвол), Syncerus catter caffer (африканский буйвол), Capra hircus (коза), Ammotragus lervia (баран гривистыи), Ovis aries (уриал), Rangifer tarandus grand (северный олень) Capreolus capreolus (косуля), Alces alces alces (лось), Cervus elaphus nelson! (североамериканский лось), Cervus dama (лань), Homo sapiens (человек)

Для отображения степени эволюционного родства последовательностей прионного белка было построено филогенетическое дерево (рисунок 3)

,«il119489801Bos Г " J )•

-ei|5412548QBos Ц—9¡|541255M8ubalus П—Bi|541254HSi«icerus i-g¡|119514499Caxa —(— g¡|119655282ftmmotragus y¡891609510ws

1-е

g¡!27733849Equus gi|1ia514511Equus -gi|119489983Sus

Lr9i|1587t4095Cera,S -9Ü30819492SH™

'— !J[|504«22S5CenMS

räWSMRanjjef

Puit50442265RangifH I—9itS0442321Capreollls —gii50442307Atees

Рисунок 3 - Филогенетическое дерево последовательностей гена PRNP прионного белка

Проведено выравнивание последовательностей гена патогенного и нормального прионного белка организма Ovis aries, которое показало что нуклеотидные последовательности РгРс и PrPsc являются идентичными, весьма консервативными и различаются лишь информацией и связанной с ней устойчивостью к протеолизу (рисунок 4).

l\ GGGTCAAGGTGGTAGCCÄCAGTCAGTGGAACAAGCCCAGTAAGCCAiAAACC№CMGPA 60

14702S553PrP ;gg™GTGGTAGCCACAGT=

пІІ47П^^рРоРЗС GGf GTCGCAGGAGCTGCTGCAGCTGGAGCAGTGGTAGGGGGCCTT^T^CTlra^ 120

її ! SC GGGMGTGCCATGAGCAGGCCTCTTATACATTTTGGCAATGACTATGA^reCTT^Tl ^ 80

gx 147028553РГР GG™^™GCAGGCCTCTm^ "э

gi ! 47028553PrpP^C

3PrP 299

S ! 4 7028553PrpPSC CACCACCACC^GGC™^ ^0

giI341942290PrPsc GGAGCAAATGTGCATCACCCAGTACCAGAGAGAATCCCAGGCTT 404 giІ47028553РГР GGAGCAAATGTGCATCACCCAGTACCAGAGAGAATCCCAGGCT- 402

Рисунок 4 - Выравнивание нуклеотидных последовательностей гена PRNP нормального РгРс и патогенного PrPsc прионного белка Ovis aries

Идентичность нуклеотидных последовательностей РгРс и PrPsc не позволяет выбрать ДНК-мишень из прионных последовательностей для последующего анализа с помощью ПЦР.

Поэтому была выбрана разновидность ПЦР - метод иммуно-ПЦР в реальном времени, который позволяет обнаружить патогенный прионный белок с использованием специфических антител.

В результате исследования было подобрано мышиное моноклональное антитело 15ВЗ (компании «Prionics»), которое получено с помощью 3-х различных последовательностей (эпитопа) пептида РгР человека: 15ЬЗ-1 включает в себя аминокислотные остатки 142-148 GSDYEDR(YY); 15ЬЗ-2 остатки 162-170 YYRPVDQYS; 15b3-3 остатки 214-226 CITQYQRESQAYY (рисунок 5).

giI56180813SUS MVKSHIGGWILVLFVAAWSDIGLCKKRPKPGGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGG- 59

giI119514512Equus MVKSHVGGWILVLFVATWSDVGLCKKRPKPGG-WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGG- 58

gi|61106150vis MVKSHIGSWILVLFVAMWSDVGLCKKRPKPGGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGG- 59

gi|114 9617Capra MVKSHIGSWILVLFVAMWSDVGLCKKRPKPGGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGG- 59

gi I 34334038BOS MVKSHIGSWILVLFVAMWSDVGLCKKRPKPGGGWNTGGSRYPGQGSPGC-NRYPPQGGGGR 60

giI89160954Homo —MANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGG-WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGG- 56

giI56180813SUS -------WGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGGWGQGGGSHGQWNKPSKPKTN 112

giI119514512Equus -------WGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGGWGQGG-SHGQWNKPSKPKTN 110

gil61106150vis -------WGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGGWGQGG-SHSQWNKPSKPKTN III

giI114 9617Capra -------WGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGGWGQGG-SHSQWNKPSKPKTN 111

gi|34334038BOS GQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGGWGQGG-THGQWNKPSKPKTN 119

giI89160954Homo -------WGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPKGGG-WGQGGGTHSQVTOKPSKPKTN 108

giI56180813SUS MKHVAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPLIHFGSDYEDRYYRENMYRYPNQVYYRPVDQ 172

gi | 119514512Equus MKHVAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPLIHFGfiDYEDRYYRENMYRYPNQVYYRPV$fi| 170

gil 61106150vis MKHVAGAAAAGAWGGLGGYMLGSAMSRPLIHFG^DYEDRYYRENMYRYPNQVYYRPVDQ 171

giI114 9617Capra MKHVAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPLMHFGlfDYEDRYYRENMYRYPNQVYYRPVDQ 171

gi | 34334038BOS MKHVAGAAAAGAWGGLGGYMLGSAMSRPLIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPVDQ 179

gi | 89160954НОШО MKHMAGAAAAGAWGGLGGYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDSYYRENMHRYPNQVYYRPtlDB 168

gil 56180813Sus YSNQNSFVHDCVNITVKQHTVTTTTKGENFTETDVKMIERVVEQMCITQYQ^EÄAYi|QR 232

gi I 119514 512Equus YSNQNNFVHDCVNITVKQHTVTTTTKGENFTETDVKIMERVVEQMCITQYQ||e5{^QR 230

giI61106150vis YSNQKNFVHDCVNITVKQHTVTTTTKGENFTETDIKIMERVVEQMCITQYQRESQAYYQR 231

gil 114 9617Capra YSNQNNFVHDCVNITVKQHTVTTTTKGENFTETDIKIMERVVEQMCITQYQRESQAYYQR 231

giI34334038BOS YSNQNNFVHDCVNITVKEHTVTTTTKGENFTETDIKMMERVVEQMCITQYQRESQAYYQR 239

gi|89160954НОШО HSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQR 228

giI56180813SUS GASVILFSSPPVILLISFLLFLIVG 257 giI119514512Equus GASVVLFSSPPVVLLISFLIFLIVG 255 giI61106150vis GASVILFSSPPVILLISFLIFLIVG 256 giI114 9617Capra GASVILFSPPPVILLISFLIFLIVG 256 giI34334038BOS GASVILFSSPPVILLISFLIFLIVG 264 giI89160954Homo GSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG 253

Рисунок 5 - Аминокислотная последовательность гена PRNP прионного белка

Экспериментально было показано, что 15ВЗ реагирует с PrPsl человека, крупного рогатого скота, овцы, оленя, мыши и хомяка, но не реагирует с нормальными РгР1 прионами. Поэтому 15ВЗ может использоваться в качестве детектирующего антитела для анализа.

Для проведения иммуно-ПЦР анализа выбрана ДНК-матрица (ДНК-хвост):

AGGAGGTGGCCACGACTGCGAAGGAGGTGGCGTAGGATAGAGTCAGTC CTTGGCCTCCTTGGCCCAGTTAAGAAGTTGCAGCCACACACGCTGTTGT TGGGTTCGGGGCGGAGTTGCAGCCATCTACACAAACGATACCCTCGTGC AGCTGGAGAAGCAGCACGGCCTATTACCTGGAGGAGGATCGAAACTGA

Анализ в GenBank с помощью программы «Blast» показал, что созданная последовательность и последовательности базы данных гомологов не имеют.

К синтезированному ДНК-хвосту подобраны 2 праймера размерами 20 п.н. С помощью программы «Primer3» подобраны параметры для соответствующих праймеров (таблица 3).

Таблица 3 - Параметры праймеров

Вид праймера Стартовая позиция, п.н CG Длина, п.н Т °С 1 mi ^ Последовательность

Левый праймер 41 55 20 60.25 AGTCAGTCCTTGGCCTCCTT

Правый праймер 193 55 20 59,80 CAGTTTCGATCCTCCTCCAG

На основании опытных исследований параметры проведения амплификации (таблица 4).

подобраны оптимальные

Операция Температура, °С Продолжительность, мин Количество циклов

Предварительная денатурация 95 1,0 1

Денатурация 95 0,5 30 І !

Отжиг 56 1,0

Элонгация 72 0,5

Элонгация 72 10 1 1

Выбраны два флуоресцентных зонда для реализации ПЦР в режиме реального времени:

- флуоресцентный зонд №1 с параметрами: стартовая позиция - 153. длина - 20 п.н., Тт - 60,00°С, ОС - 50.00%, последовательность -АСААССАОСАССОССТАТТА;

- флуоресцентный зонд №2 с параметрами: стартовая позиция - 135. длина - 25 п.н., Тт - 69,00°С, вС - 56,00%. последовательность -

АТАСССТССТСС АССТСв Ав ААвС А.

Установлен оптимальный состав реакционной смеси для амплификации (таблица 5). Таблица 5 - Состав реакционной смеси ПЦР

Компонент Конечная концентрация Количество компонента на 25 мкл смеси

10Х ПЦР-буфер IX 2,5 мкл

I ОмМ смесь дНТФ 0,2 мМ каждого 0,5 мкл

Праймер 1 (50 мкМ) 1 мкМ 0,5 мкл

Праймер 2 (50 мкМ) 1 мкМ 0,5 мкл

Тац-ДНК-полимераза 1,25 ед. 0.25 мкл

25мМ 1,5 мМ 1 мкл

ДНК-матрица 0,1-1 мкг Варьирует от концентрации образца

Деионизированная вода - До 25 мкл

Исследование специфичности разработанной ПЦР-тест-системы проводили на примере анализа мясного фарша, состоящего из смеси мышечных тканей говядины и свинины и содержащего 1,0%, 2,0%. 5,0%, 10,0% и 15,0% мяса свиньи, зараженного патогенным прионным белком.

Каждый этап выделения ДНК сопровождался добавлением внутреннего контрольного образца. Наличие в тканях свиньи патогенного прионного белка подтверждалось анализом с использованием коммерческой ИФА-тест-системы «Те8еЕ™».

Проведенный анализ показал высокую специфичность разработанной ПЦР -тест-системы: неспецифических реакций со 100%-ным содержанием рыбной муки и куриного фарша, а также их смесей обнаружено не было (рисунок 6).

Рисунок 6 - Оценка специфичности и чувствительности тест-системы: М - маркер; 1-1,0 % зараженного мяса свиньи в мясном фарше;

2 - 2,0 % зараженного мяса свиньи в мясном фарше;

3 — 5,0 % зараженного мяса свиньи в мясном фарше;

4-10,0 % зараженного мяса свиньи

в мясном фарше; 5 - 15,0 % зараженного мяса свиньи в мясном

фарше; 6-100 % мясной фарш; 7 - рыбная мука; 8 - куриный фарш

Кроме того, специфичность разработанной тест-системы исследовали на основании сравнительного анализа результатов определения патогенного прионного белка для 200 образцов, полученных с использованием предлагаемой ПЦР-тест-системы и существующей ИФА-системы «ТеБеЕ™» (таблица 6).

М 1 2 3 4 5 6 7 8 м

М 12345 678 М

Таблица 6 - Сравнение результатов тестирования образцов свинины с использованием ПЦР-тест-системы и ИФА-системы «Те5еЕ™»

Количество проанализированных образцов

«+» п = 60 «-» п = 140

Относительная специфичность

ПЦР-тест-система

«+»

58

139

«инг»

96,7

ИФА-система «ТеБеЕ™»

«+»

57

134

«ИНГ»

95,0

Сопоставление результатов, полученных с использованием разработанной ПЦР-тест-системы, с результатами референтного метода свидетельствует о высокой специфичности разработанного ПЦР-метода в режиме реального времени.

РАЗРАБОТКА ПЦР-ТЕСТ-СИСТЕМЫ

Разработан проект инструкции по применению ПЦР-тест-системы для идентификации патогенного прионного белка.

Рисунок 7 - Методика изготовления ПЦР-тест-системы

Методика изготовления ПЦР-тест-системы, представленная на рисунке 7, включает в себя следующие операции: анализ нуклеотидных последовательностей ДНК, кодирующей синтез гена РМЧР прионного бечка включающии филогенетический и сравнительный анализ нуклеотидных

последовательностей гена нормального и патогенного прионного белка крупного рогатого скота; конструирование универсальных праймеров для амплификации гена РЯЫР патогенного прионного белка; подбор и синтез универсальных праймеров для амплификации гена РЯ№ патогенного прионного белка; оптимизацию параметров реакции амплификации; разработку положительного контрольного и внутреннего контрольного образцов для оценки эффективности протекания ПЦР, обеспечения высокой чувствительности анализа и предотвращения ошибок персонала ПЦР-лаборатории.

Выбраны оптимальные условия хранения разработанной ПЦР-тест-системы: хранить тест-систему целесообразно в сухом, защищенном от света месте при температуре 4±2°С.

Испытания эффективности и чувствительности разработанной ПЦР-тест-системы, проводимые на протяжении четырех месяцев, позволяют сделать вывод о том, что в пределах изучаемого периода тест-система сохраняет высокие значения показателей ее эффективной работы (процент положительных проб от общего числа исследованных составляет не менее 96,6%, чувствительность - 10 пг ДНК крупного рогатого скота в пробе

Рисунок 8 - Результаты исследования чувствительности

ПЦР-тест-системы в зависимости от срока хранения: М - маркер, К+ - положительный контроль, К- - отрицательный контроль, 1 - срок хранения 2 недели, 2-4 недели, 3-6 недель, 4-8 недель, 5—10 недель, 6-12 недель, 7-14 недель, 8-16 недель

ВЫВОДЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Среди исследованных образцов животного происхождения определены образцы с наиболее высокой степенью потенциальной опасности в отношении продукции патогенных форм прионного белка - фракция водорастворимых белков говядины и плазма крови.

2. С помощью компьютерных программ «0^оСа1с» и «Стегав» был проведен анализ нуклеотидных последовательностей ДНК, кодирующих синтез гена РЯЫР прионного белка, включающий филогенетический и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена нормального и патогенного прионного белка крупного рогатого скота.

3. Сконструированы и синтезированы олигонуклеотидные праймеры для амплификации гена РШМР патогенного прионного белка.

ПЦР) (рисунок 8).

М К+ К- 1 1 } 4

4. Проведен выбор и оптимизация параметров проведения амплификации. Температурно-временной профиль программы амплификации составляет: 95°С - 1 мин - 1 цикл; 95°С - 30 с - 30 циклов; 56°С - 1 мин -30 циклов; 72°С - 30 с - 30 циклов, 72°С - 10 мин - 1 цикл. Установлен оптимальный состав реакционной смеси для проведения ПЦР-реакции.

5. Экспериментально получен положительный контрольный образец являющийся маркером длины ПЦР-продуктов, обеспечивающий высокую чувствительность определения видовой специфичности тканей животного происхождения.

Экспериментальным путем разработан внутренний контрольный образец с оптимальной концентрацией 1 пг в пробе, который добавляется на этапе выделения ДНК и исключает ошибки исследователя при постановке реакции.

6. Подтверждена высокая специфичность разработанной тест-системы и олигонуклеотидных праймеров путем электрофоретического разделения образцов мясного фарша, содержащего патогенный прионный белок, а также путем сравнительного анализа результатов определения патогенного прионного белка, полученных с помощью ПЦР-тест-системы и ИФА-системы «ТеБеЕ™».

7. Проведена оценка условий хранения и установлены достоверные сроки пригодности разработанной ПЦР-тест-системы.

Условия хранения: в сухом, защищенном от света месте при температуре 4±2°С.

Гарантийный срок хранения: 4 месяца, при соблюдении условий хранения. Испытания эффективности и чувствительности, проводимые на протяжении 4-х месяцев, свидетельствуют о том, что в пределах изучаемого периода ПЦР-тест-система сохраняет высокие значения показателей ее эффективной работы.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы: Статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. ^ Просеков, А.Ю. Исследование количественного содержания животной ДНК в пробах биологического происхождения и многокомпонентных составах на их основе / А.Ю. Просеков, И.С. Милентьева, М.В. Новоселова, Е.Е. Драгунова // Техника и технология пищевых производств. — 9013 - № 1 -С. 122- 126.

2. Драгунова, Е.Е. ПЦР-тест-система для идентификации патогенного прионного белка: необходимость разработки, методика изготовления и основные характеристики / Е.Е. Драгунова, И.С. Милентьева, О.В. Кригер, М.В. Новоселова // Фундаментальные исследования - 2013 -№ 10 (часть 8). - С. 1739 -1744.

Материалы конференций, конгрессов, симпозиумов, семинаров

3. Драгунова, Е.Е. Разработка ПЦР-тест-системы для идентификации патогенного прионного белка / Е.Е. Драгунова, А.Ю. Просеков,

М.В. Новоселова // Научно-теоретический и прикладной журнал «Мичуринский агрономический вестник». - 2013. - №1. - С. 90 - 93.

4. Кригер, О.В. Филогенетический анализ степени эволюционного родства последовательностей прионного белка / О.В. Кригер, И.С. Милентьева, М.В. Новоселова, Е.Е. Драгунова // Материалы международного научного форума «Пищевые инновации и биотехнологии». - Кемерово, 2013. - С.172-180.

5. Драгунова, Е.Е. Актуальность разработки методов диагностики прионных заболеваний / Е.Е. Драгунова // Материалы VII Международной научно-практической конференции (тезисы докладов) «Тенденции и инновации современной науки». - Краснодар, 2013. - С. 69.

6. Драгунова, Е.Е. Оценка условий хранения и установление достоверных сроков пригодности ПЦР-тест-системы, используемой для диагностики прионных заболеваний / Е.Е. Драгунова, И.С. Милентьева, М.В. Новоселова // Материалы VI Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых с международным участием «Технологии и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности». - Бийск, 2013 - С. 231 - 235.

7. Драгунова, Е.Е. Разработка методики составления ПЦР-тест-системы, используемой для диагностики прионных заболеваний / Е.Е. Драгунова, А.Ю. Просеков, М.В. Новоселова // Сборник материалов международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы развития биотехнологий». - Екатеринбург, 2013. - С. 64 - 66.

8. Драгунова, Е.Е. Оценка степени инфективности образцов животного происхождения в отношении содержания нормального прионного белка / Е.Е. Драгунова // Материалы Международной научно-практической конференции «Техника и технологии: роль в развитии современного общества». - Краснодар, 2013. - С. 63 - 66.

9. Просеков, А.Ю. Прионные заболевания - классификация и методы диагностики / А.Ю. Просеков, Е.Е. Драгунова // Сборник материалов II Международной научно-практической конференции «Сельскохозяйственные науки и агропромышленный комплекс на рубеже веков». - Новосибирск, 2013. - С. 22 - 27.

10. Драгунова, Е.Е. Разработка ПЦР-тест-системы, используемой для диагностики прионных заболеваний / Е.Е. Драгунова // Материалы VI Международной студенческой научной конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии». - Ульяновск, 2013. - С. 78 - 80 (часть II).

Подписано в печать 14.11.2013. Формат 60x86/16. Тираж 80 экз. Объем 1,1 п.л. Заказ Кемеровский технологический институт пищевой промышленности. 650056, г. Кемерово, б-р Строителей, 47. Отпечатано в лаборатории множительной техники КемТИПП. 650002, г. Кемерово, ул. Институтская, 7

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» (ФГБОУ ВПО «КемТИПП»)

Драгунова Екатерина Евгеньевна

РАЗРАБОТКА ПЦР-ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПАТОГЕННОГО ПРИОННОГО БЕЛКА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Специальность 05.18.04 - технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств

На правах рукописи

04201452106

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата технических наук

Научный руководитель:

доктор технических наук, профессор

А.Ю. Просеков

Кемерово 2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................. 4

ГЛАВА 1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР........................................... 9

1.1. Строение прионных белков, их функции в организме..................... 9

1.2. Прионные болезни. Классификация, механизмы возникновения и развития прионных энцефалопатий у человека и животных.................. 16

1.3. Методы выявления возбудителей и диагностика прионных болезней. Контроль качества сырья животного происхождения........................... 24

1.4. Заключение по обзору литературы и задачи исследований.............. 43

ГЛАВА 2. ОРГАНИЗАЦИЯ, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ........................................................................

2.1. Организация выполнения работы............................................. 45

2.2. Объекты исследований......................................................... 48

2.3 Методы исследований............................................................. 48

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ

56

ОБСУЖДЕНИЕ.........................................................................

3.1. Определение образцов животного происхождения с наиболее высокой степенью потенциальной опасности в отношении продукции пато- 56

генных форм прионного белка......................................................

3.2 Исследование и анализ нуклеотидных последовательностей гена ^ РИКР прионного белка.................................................................

3.3. Конструирование олигонуклеотидных праймеров для дифференциальной амплификации специфических последовательностей прионного 76 белка......................................................................................

3.4. Выбор параметров и оптимизация процессов амплификации фраг-

80

ментов гена Р1ШР патогенного прионного белка.............................

3.5. Разработка положительного контрольного и внутреннего контроль- ^ ного образцов для оценки эффективности протекания ПЦР...................

3.6. Исследование специфичности разработанной тест-системы и олиго-

нуклеотидных праймеров..............................................................

ГЛАВА 4. ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕАЛИЗАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ..................................................................

4.1. Методика изготовления ПЦР-тест-системы и ее описание...............

4.2. Оценка условий хранения и установление достоверных сроков пригодности ПЦР-тест-системы..........................................................

4.3. Расчет затрат на проведение исследования с помощью ПЦР-тест-системы.................................................................................

4.4. Проведение технико-экономической оценки рыночного потенциала

полученных результатов...............................................................

ВЫВОДЫ.............................................................................. 129

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК............................................ 131

ПРИЛОЖЕНИЯ........................................................................ 147

ПРИЛОЖЕНИЕ А Государственный контракт № 16.512.11.2077 на

выполнение научно-исследовательских работ................................. 148

ПРИЛОЖЕНИЕ Б Технические условия на ПЦР - тест систему для

идентификации патогенного прионного белка................................. 151

ПРИЛОЖЕНИЕ В Методические указания по использованию

ПЦР - тест системы................................................................... 159

ПРИЛОЖЕНИЕ Г Акт результатов испытаний № 1 чувствительности ПЦР-тест-системы для идентификации патогенного прионного белка

крупного рогатого скота.............................................................

ПРИЛОЖЕНИЕ Д Акт результатов испытаний №2 достоверных сроков пригодности ПЦР-тест-системы для идентификации патогенного прионного белка крупного рогатого скота.......................................

110 110 113

118

ВВЕДЕНИЕ

Прионы (от англ. «proteinaceous infectious particles» - белковая инфекционная частица) - особый класс чисто белковых инфекционных агентов, не содержащих нуклеиновых кислот, вызывающих тяжёлые заболевания центральной нервной системы у человека и ряда высших животных.

Прионный белок может существовать в двух формах - неинфекционного белка, который является жизненно необходимым белком, обнаруживаемым в организме всех млекопитающих, включая и человека, и инфекционного белка, который является мутацией нормального прионного белка и вызывает прионные болезни животных и человека.

Прионные болезни - это группа трансмиссивных нейродегенеративных заболеваний животных и людей. Эти болезни имеют длительные инкубационные периоды, но быстро прогрессируют с момента клинического начала заболевания. Все прионные болезни смертельны и в настоящее время не существует эффективных способов их лечения.

Изучение прионов и вызываемых ими заболеваний является новой, быстро развивающейся областью биомедицинских исследований, которая в последние годы приобрела важное научно-практическое значение.

Практический интерес связан, прежде всего, с разразившейся эпизоотией губчатой энцефалопатии коров в Великобритании, а также с выявлением, в основном в Великобритании, молодых людей с болезнью Крейтцфельд-та-Якоба и доказательством возможности передачи этого заболевания людям в результате употребления в пищу мясопродуктов, полученных от зараженных животных.

Также одним из путей заражения человека губчатой энцефалопатией являются нейрохирургические вмешательства, трансплантация тканей, назначение гормонов, полученных от зараженных доноров с нераспознанной болезнью Крейтцфельдта-Якоба (ятрогенные случаи болезни Крейтцфельдта-Якоба), использование для полива овощей и фруктов сточных вод, в которые

попали прионные белки вместе с отходами мясоперерабатывающих предприятий.

Губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота была зарегистрирована не только в Великобритании, но и в ряде других европейских стран: Швейцарии, Ирландии, Португалии, Франции, Германии, Нидерландах, Италии, Дании и на Фолклендских островах. Данные случаи возникновения заболевания связаны либо с импортом этими странами зараженных животных, либо с импортом зараженной мясо-костной муки, полученной из продуктов убоя и голов овец и использовавшейся для выкармливания молодняка.

Случаи возникновения прионных заболеваний обуславливают необходимость учета растущей вероятности возникновения прионных болезней у человека и животных.

По статистическим данным, в России с населением примерно 150 миллионов человек при уровне заболеваемости болезнью Крейтцфельдта-Якоба 1 случай на 1 млн ежегодно должно поражаться около 150 человек. Однако учет таких пациентов ведется несистематично: случаи заболевания не выявляются и не регистрируются.

Профилактика прионных болезней основывается на недопущении в пищу инфицированных мясных продуктов или других продуктов убоя. В связи с этим в Постановлении Главного государственного санитарного врача РФ от 15.12.2000г. №15 «О мерах по предупреждению распространения болезни Крейтцфельдта-Якоба на территории Российской Федерации» впервые определены профилактические меры, направленные на недопущение завоза спон-гиоформной энцефалопатии из зарубежных стран.

Постоянно увеличивающийся теоретический интерес к проблеме обусловлен результатами молекулярно-биологических исследований структуры прионных белков, позволивших собрать и систематизировать значительный материал о структуре, функции и накоплении в зараженном организме человека и животных данных инфекционных агентов.

Именно результаты молекулярно-биологических исследований структуры прионных белков дали основание определить новые направления в дальнейших подходах к диагностике и терапии прионных болезней.

Цель и задачи исследований. Целью работы является разработка прототипов молекулярно-генетических тест-систем для выявления патогенного прионного белка крупного рогатого скота.

Для достижения поставленной цели сформулированы основные задачи исследований:

- определить среди исследуемых объектов образцы животного происхождения с наиболее высокой степенью потенциальной опасности в отношении продукции патогенных форм прионного белка;

-провести анализ нуклеотидных последовательностей ДНК, кодирующей синтез патогенного прионного белка крупного рогатого скота; -сконструировать олигонуклеотидные праймеры для амплификации специфических последовательностей патогенного прионного белка крупного рогатого скота;

- выбрать параметры и провести оптимизацию процессов амплификации фрагментов гена патогенного прионного белка;

- разработать положительный контрольный образец и внутренний контрольный образец для оценки эффективности проведения ПЦР-анализа;

- изучить специфичность разработанной ПЦР-системы и олигонуклеотидных праймеров;

- оценить условия хранения ПЦР-тест-системы и провести испытания, направленные на установление сроков пригодности ПЦР-тест-системы.

Научная новизна работы. Показано, что разработанная ПЦР-тест-система для идентификации патогенного прионного белка крупного рогатого скота имеет ряд конкурентных преимуществ по сравнению с имеющимися на мировом рынке аналогами для определения патогенной формы прионного белка - обладает более высокой чувствительностью и специфичностью, позволяет проводить диагностику прионных заболеваний на ранних стадиях

возникновения, способствует снижению инфекционной опасности для оператора при использовании тест-системы для исследуемой пробы, находящейся в закрытой пробирке.

Практическая значимость работы заключается в разработке ПЦР-тест-системы, позволяющей осуществлять прижизненную идентификацию патогенного прионного белка у животных в ветеринарии, контроль качества сырья животного происхождения при производстве препаратов медицинского назначения, оценку содержания патогенной формы прионного белка животного происхождения в продуктах питания, производимых пищевой промышленностью.

По результатам исследований разработан проект технических условий и методические указания по использованию ПЦР-тест-системы для идентификации патогенного прионного белка.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Филогенетический анализ нуклеотидной последовательности ДНК, кодирующей синтез патогенного прионного белка крупного рогатого скота.

2. Олигонуклеотидные праймеры для амплификации специфических последовательностей патогенного прионного белка крупного рогатого скота.

3. Оптимальные параметры проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

4. Положительный контрольный образец, являющийся индикатором работы амплификационной смеси и маркером длины ПЦР-продуктов.

5. Внутренний контрольный образец с оптимальной концентрацией 1 пг в ПЦР-пробе, который добавляется на этапе выделения ДНК и исключает ошибки исследователя при постановке реакции.

6. Компонентный состав разработанной ПЦР-тест-системы.

7. Оптимальные условия хранения и достоверные сроки пригодности разработанной ПЦР-тест-системы.

Методология и методы исследования. При выполнении работы использовали стандартные, общепринятые и оригинальные методы исследований, в том числе описательные, аналитические, индуктивные и дедуктивные методы обобщения отечественной и зарубежной литературы по оценке существующих технологий производства тест-систем для идентификации прион-ных заболеваний человека и животных.

Апробация работы. Материалы по разработке тест-систем для идентификации патогенного прионного белка в пробах животного происхождения крупного рогатого скота представлены и получили одобрение на Международном научном форуме «Пищевые инновации и биотехнологии» (г. Кемерово, 2013г.).

Материалы диссертации используются в учебном процессе, осуществляемого кафедрой «Бионанотехнология» Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» по направлению подготовки «Биотехнология».

Работа выполнена в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы». Государственный контракт от «16» февраля 2011 г. № 16.512.11.2077.

ГЛАВА 1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР

В настоящем обзоре проведен анализ современной научно-технической, нормативной, методической литературы по вопросам, посвященным изучению свойств прионных белков, их структуры, функций прион-ных белков в здоровом организме, механизмах возникновения патогенного прионного белка, методах идентификации прионного белка в мясе крупного рогатого скота. На основании данного анализа литературных источников выбраны объекты и методы, сформулированы цель и задачи собственных исследований.

1.1. Строение прионных белков, их функции в организме

Прионный белок (от англ. «proteinaceous infectious particles» - белковая инфекционная частица) представляет собой сиалогликопротеид с молекулярной массой 33000-35000 дальтон, состоит из 254 аминокислот. Он найден у всех млекопитающих и является составной частью наружных клеточных мембран. Схема образования прионов в нервных клетках представлена на рисунке 1.1 [18,39,40].

Рисунок 1.1- Образование прионов в нервных клетках

Открытие прионов тесно связано с историей открытия и становления учения о медленных инфекциях. В 1954 г. В. Sigurdsson [2, 5, 6] изложил результаты своих многолетних исследований по изучению массовых заболева-

ний среди овец (на примере скрепи (scrapie) - заболевания, которое в природе встречается среди овец и коз). Несмотря на явные клинические различия и неодинаковую локализацию повреждений органов и тканей, В. Sigurdsson сумел обнаружить среди изученных им заболеваний принципиальное сходство и сформулировать четыре главных признака, отличающих медленные инфекции:

- длительный инкубационный период (месяцы и годы);

- медленно прогрессирующий характер течения;

- необычность поражения органов и тканей;

- неизбежность смертельного исхода.

Согласно литературным данным более поздних научных исследований было доказано, что медленные инфекции могут поражать не только животных, но и людей [11, 13].

В начале 80-х годов американский биохимик S. Prusiner показал, что возбудителем наиболее распространенной в природе медленной инфекции -скрепи, является безнуклеиновый низкомолекулярный (27-30 кДа) белок [16]. S. Prusiner назвал его «инфекционный прионный белок», а в качестве инфекционной единицы предложил наименование «прион» [18, 133].

Прионный белок (РгР) может существовать в двух формах - неинфекционной и инфекционной [32, 54].

л

РгР (аббревиатура от англ. - Prion Protein of Cell) - неинфекционный прионный белок, который носит наименование «клеточный». Является жизненно необходимым белком, обнаруживаемым в организме всех млекопитающих, включая и человека. Одной из отличительных черт клеточного прионного белка является его высокая чувствительность к

л

переваривающему действию протеазы К, под действием которой РгР полностью разрушается [113, 129].

PrPSc (PrPd) - инфекционный прионный белок, который вызывает скрепи у овец и коз и другие прионные болезни животных и человека. Считается, что PrPSc является мутацией РгРс [11, 113, 129].

il

J

Большинство экспериментальных данных свидетельствует о том, что формирование патогенного белка PrPSc происходит из-за конформационного перехода нормального клеточного белка в изоформу с уменьшением а-спиралей молекулы с 42 до 21% [2, 6, 7, 71]. Содержание Р-складчатых структур в этой аномальной форме патогенного приона увеличивается с 3 до 54% [12]. В бесклеточной системе продемонстрировано появление устойчивости к протеолизу изоформы прионного белка [11, 120], однако in vitro никому еще не удалось получить инфекционную форму PrPSc из нормального клеточного или рекомбинантного белка. Предполагается, что конформацион-ный переход нормального белка в патогенную форму обеспечивают неизвестные до сих пор кофакторы, или помощники, аналогичные молекулярным шаперонам [9, 90]. Полагают, что вновь образованная патогенная форма молекулы посредством неизвестного механизма, используя молекулы-посредники клетки хозяина, преобразует все большее количество нативных клеточных молекул РгР в аномальную форму, что аналогично цепной реакции расщепления атомного ядра. Накопление практически нерастворимой формы белка в клетках нейронов вызывает их вакуолизацию с последующей однозначной гибелью клеток [130, 132].

Ген (PRNP), кодирующий синтез нормального прионного белка (РгР ) и инфекционную изоформу данного белка (PrPSc), расположен в коротком плече хромосомы 20 у человека и хромосомы 2 у мыши. PRNP-ген регулируется в процес