автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.04, диссертация на тему:Обоснование переработки гаммаруса Балтийского моря (Gammarus lacustris) методами биотехнологии

На правах рукописи

Григорьева Евгения Васильевна

обоснование переработки гаммаруса балтийского моря

(аамма1ш$1лстт1б) методами биотехнологии

Специальности. 05 18 04 - Технология мясных, молочных, рыбных продуктов ахолодильных производств 051 & 07 - Биотехнология пищевых продуктов

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

ТОЛ 2008

Москва-2008

003172907

Работа выполнена во ФГОУ ВПО «Калининградский государственный технический университет» и Гамбургском университете (Институт технической и макромолекулярной химии), Германия

Ведущая организация ФГОУ ВПО «Дальневосточный государственный технический рыбохозяйственный университет» (ФГОУ ВПО «Дальрыбвтуз»)

Защита состоится 11 июня 2008 года в 1400 ч на заседании диссертационного совета Д 30700403 при ФГУП «Всероссийский научно - исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии» (ФГУП «ВНИРО») по адресу 107140, г Москва, ул Верхняя Красносельская, д 17, факс (499)264-91-87,3л почта йз1ш1§@уп1го ги

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «Всероссийский научно - исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии» (ФГУП «ВНИРО»)

Автореферат разослан мая 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета,

Научный руководитель

доктор технических наук, профессор Мезенова Ольга Яковлевна

Официальные оппоненты доктор технических наук,

старший научный сотрудник, Маслова Галина Васильевна,

кандидат технических наук, Ведерникова Ирина Владимировна

кандидат технических наук

ВА Татарников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы Природные биополимеры хитин и хитозан все шире применяются в различных отраслях промышленности, что обусловлено их уникальным химическим составом и свойствами (биосовместимость, нетоксичность, биодеградируемость, сорбцион-ностъ и др) Традиционным объектом для получения данных продуктов являются панцирь-содержащее сырье (ПСС), образующееся при разделке промысловых ракообразных (крабы, криль, креветки, раки и др) Несмотря на то, что запасы ПСС достаточно стабильны, отмечена положительная динамика новых источников получения хитина В последние годы изучены насекомые (пчелиный подмор, надкрылья тараканов, майских жуков), кораллы, термиты и др, для которых разработаны специальные технологии (О Ю Зуева, С В Немцев, 2003, R.A А Muzzarelh, 1997 и др)

Однако в акватории Балтики традиционное ПСС отсутствует, а переработка новых источников по ряду причин не развивается выше кустарного уровня В Балтийском море, Куршском и Вислинском заливах, озерах Калининградской области в большом количестве обитает недоиспользуемый в промышленности - рачок-бокоплав гаммарус {Gammarus lacustris) Относительно высокое содержание (25-30%) и малая толщина (100 - 500 мкм) панциря облегчают процесс его диспергирования, необходимого при всех способах получения хитина С учетом оценки его запасов и высокой способности рачка к размножению данную сырьевую базу можно считать потенциально значимой в регионе для получения хитина (ЕЭ Куприна, 1997, Г В Маслова, 1996, R.A А Muzzarelli, 1997)

Принимая во внимание факт присутствия в составе гаммаруса также других ценных компонентов (белки, лигшды, пигменты, минеральные вещества и др), целесообразным представляется его комплексная переработка методами биотехнологии с получением хитина и дополнительного белкового гидролизата, представляющего ценность для кормовой промышленности

Несмотря на актуальность применения хитозана в пищевой, медицинской и других сферах производства, внедренных решений не очень много, что объясняется как дефицитом биополимеров, так и отсутствием качественных разработок

Вопросами совершенствования производства и применения хитина и хитозана занимались многие ученые Албулов А И, Быков В П, Варламов В П, Вихорева Г А, Водолажская

С В, Гамзазаде А И, Дацун В M, Куприна Е Э, Маслова Г В, Немцев С В, Новиков M Ю, Нудьга JIM, Сафронова ТМ, Третениченко ЕМ, Hirano S, Johnson EL, Kaeßmann HJ Muzzarelh RAA, Pemston С Р, Peter M G, Struszczyk H и др

Однако в известных трудах отсутствуют технологические решения по комплексной переработке гаммаруса балтийского, имеющего специфические особенности состава и свойств На сегодня не изучен биотехнологический потенциал данного сырья, без знания которого нельзя однозначно применять известные способы для его переработки Отсутствуют решения по стабилизации активной биодепротеннирующей системы, составу и функциональным свойствам получаемых из гаммаруса биополимеров, рациональных областях и конкретных технологиях их применения Не разработаны соответствующие аппаратурные требования, необходимые для внедрения результатов исследования

С учетом сказанного представляется актуальным получать хитин и хитозан из балтийского гаммаруса с применением усовершенствованного способа предварительного фермен-тирования при его комплексной переработке Рациональным является синергептческое использование автоэнзимолиза в среде био- (фито-) консервантов с введением в качестве жидкой фракции гидромодуля молочной творожной сыворотки или раствора натуральных компонентов алоэ Последние надежно подавляют гнилостные процессы, развивающиеся при автодеструкции белков гаммаруса, но не ингибирует сами энзимы, что позволяет получить устойчивый антисептический эффект и использовать в кормовых целях образующийся бульон, обладающий приятными органолептическими свойствами и ценными биологически активными веществами (флавоноиды, гликозиды, алколоиды, витамины, минеральные, ли-пидные и др) При этом становится возможной последующая ускоренная дообработеа сырья и получение обогащенного белкового гидролизата при снижении агрессивной химической нагрузки процесса в целом

Цель работы заключалась в комплексной переработке балтийского гаммаруса с применением процессов автоэнзимолиза и биоконсервирования для получения хитозана и биологически ценного гидролизата.

Для достижения поставленной цели решались следующие основные задачи 1 Изучение техно-химических свойств балтийского гаммаруса и обоснование возможности его комплексной переработки с применением предварительного автоэнзимолиза в условиях биоконсервирования,

2 Исследование, моделирование и оптимизация технологического процесса автоэнзимолиза, как предварительного депротеинирования, при использовании молочной сыворотки и раствора компонентов алоэ,

3 Формализация и обоснование оптимальных параметров деминерализации полуфабриката хитина, направляемого в обработку после автоэнзимолиза гаммаруса,

4 Исследование состава и функциональных свойств полученного хитозана в технологии рыбы холодного бездымного копчения и при синтезе медицинских биопленок,

5 Получение биологически ценного гидролизата из белковой часта гаммаруса и исследование его качества,

6 Разработка комплексной схемы переработки гаммаруса и рекомендаций по применению конечных продуктов,

7 Производственная апробация технологической рекомендации по адгезионному копчению,

8 Оценка эффективности разработки,

9 Подготовка нормативной документации на технологический процесс и готовые продукты из балтийского гаммаруса

Научная новизна работы. Обосновано совершенствование биотехнологического метода получения хитина, хитозана и биоавтогидролизата из недоиспользуемого хитинсодержащего сырья - балтийского гаммаруса, сущность которого заключается в его предварительном автоэнзимолизе в среде биоконсервантов при последующих однократных процессах деминерализации и депротеинизации, что позволяет получать функциональные конечные продукты, осуществлять процесс комплексно и безопасно Установлены высокая авгопротеолитическая способность тканей сушеного рачка и характер деструкции тканей в биореакционной автосистеме, представляющей собой дисперсию измельченного гаммаруса в водной среде биоконсерванта. Обоснована рациональность применения молочной сыворотки и раствора компонентов алоэ, биологически активные вещества которых, надежно предотвращают микробиологическую порчу белковой части автосистемы, не влияя на активность ее ферментов Разработана математическая модель процесса автоэнзимолиза гаммаруса, а также деминерализации полуфабриката хитина, адекватно связывающие факторы процессов с качеством конечных продуктов и позволяющие его регулировать по органолегггическим и физико-химическим показателям Исследованы основные

качественные характеристики хитина и хитозана (минеральный состав, степень деацетилирования, молекулярная масса, вязкостные свойства растворов, термическая устойчивость, микробиологические показатели) Изучено качество биоавтогидролизата, содержащего в сохраненном виде биокомпоненты гаммаруса и натуральные биоконсерванты Установлены минеральный и жирно-кислотный составы рачка и биоавтогидролизата, представленные рядом ценных микроэлементов, моно- и полиненасыщенных жирных кислот Показана функциональность использования хитозана в пищевых и медицинских целях Разработана математическая модель состава коптильного геля с применением хитозана Исследован антисептический эффект биомедицинских пленок на основе хитозана, предназначенных для предотвращения воспалительных процессов кожи Новизна технологического решения подтверждена Патентом РФ № 2318831 «Способ комплексной переработки рачка гаммаруса»

Практическая значимость работы. Разработана комплексная технология переработки балтийского гаммаруса, позволяющая получать хитин, хитозан и биоавтогидролизат, обладающие высокими качественными характеристиками, приоритет которой подтвержден Патентом РФ № 2318831 «Способ комплексной переработки рачка гаммаруса»

Разработан проект нормативной документации на изготовление из балтийского рачка хитина, хитозана и биоавтогидролизата, что позволяет получать ценные биологически активные вещества из нового сырья практически безотходно, комплексно, по эффективным технологиям Предложены модели процессов и методики их расчетов, которые способны регулировать выход и качественные характеристики готовых продуктов Разработаны практические рекомендации по использованию получаемых биологически активных веществ и композиций в технологии пищевых, медицинских и кормовых продуктов

Действенность разработанных рекомендаций положительно апробирована в производственных условиях ИП «Черба» (Калининградская обл, п Васильково) в технологии бездымного копчения рыбы В условиях Гамбургского университета показана антисептическая функциональность хитозана в составе медицинских биопленок

Материалы работы использованы в учебном процессе подготовки студентов, магистрантов и аспирантов пищевых специальностей ФГОУ ВПО «Калининградский государственный технический университет», а также студентов Гамбургского университета (Германия), занимающихся технологиями высокомолекулярных биополимеров

Проведена оценка экономической и социальной целесообразности реализации разработанной комплексной технологии переработки гаммаруса и применения целевых продуктов

На защиту выносятся:

• Обоснование процесса автоэнзимолиза с биоконсервированием в технологии комплексной переработки гаммаруса при получении хитина и хитозана.

• Зависимости формирования качества хитина и хитозана в процессе переработки гаммаруса, установленные на основных этапах технологии

• Параметры качества, обосновывающие функциональность готовых продуктов переработки гаммаруса

Апробация работы Результаты выполненных исследований были представлены на коллоквиуме по макромолекулярной химии (Freiburg im Breisgau, 2005), Ш Международной научной конференции «Биотехнология состояние и перспективы развития», (Москва, 2005), НПК <8начение биотехнологии для здорового питания и решения медико-социальных проблем», (Калининград, 2005), фирме Байерсдорф AO (Hamburg, 2005), VIH Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана», (Казань, 2006), Международном симпозиуме «Биоматериалы» и 29-ом «Гамбургском симпозиуме по макромолекулярной химии» (Hamburg, 2006), Научно-практической конференции «Пищевая и морская биотехнология проблемы и перспекщвы», (Калининград, 2006), V Международной научной конференции «Инновации в науке и образовании 2007», «УМНИК », (Калининград, 2007), Ш Международной научно-технической конференции «Низкотемпературные и пищевые технологии в XXI веке» (Санкт-Петербург, 2007), заседаниях кафедры пищевой биотехнологии ФГОУ ВПО «КГТУ» 2005-07 гг

Публикации. По теме диссертации опубликовано 27 научных работ, в том числе 1 Патент РФ

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, литературный обзор, методическую и экспериментальную части, выводы, список использованной литературы и приложения Работа изложена на 235 страницах основного текста, содержит 50 таблиц, 60 рисунков, 8 приложений, ссылки на 216 литературных источников, в том числе 79 работ зарубежных авторов

Исследования проведены в ФГОУ ВПО «Калининградской государственный технический университет» по госбюджетной НИР № 30 36 100 2, а также Институте технической и

макромолекулярной химии Гамбургского университета (Германия) в рамках программы немецкого экологического фонда (Deutsche Bundesstiftung Umwelt)

Автор выражает благодарность всем причастным к данной работе, прежде всего, научному руководителю д т н, профессору О Л Мезеновой и руководителю стажировки в Германии, доктору наук, профессору В M Кулике (Университет Гамбурга, Институт технической и макромолекулярной химии)

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении обоснована актуальность, научная новизна и практическая значимость работы, сформулированы цель и задачи исследований, защищаемые положения

В первой главе «Обзор литературы» представлены обзор современного ХСС и перспективы его переработки, технологии получения полиаминосахаров при комплексной переработке сырья, состояние и перспективы развития технологий белковых гидролизатов, применение хитина/хитозана в промышленности

Во второй главе «Организация эксперимента и методы исследования» представлена схема эксперимента (рис 1), приведена характеристика объектов и методов исследования Основные эксперименты проводили на гаммарусе балтийском (Gommants ¡acustris) Органо-лептическую оценку целевых продуктов (хитина, хитозана, биоавтогидролизата, образцов копченой рыбы) осуществляли с применением действующей ЦЦ и разработанных 5 - балльных шкал с учетом коэффициентов значимости отдельных показателей качества Массовую долю воды, азотистых, минеральных веществ, жира, тяжелых металлов, а также микробиологические показатели определяли стандартными методами, молекулярную массу растворов хитозана измеряли методами вискозиметрии через индекс Штаудингера и гельпроникающей хроматографией, степень деацетилирования оценивали методами ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) и титрометрически, реологачекие исследования растворов хитозана осуществляли на реометре ТА Instruments Rheometnc Series ARES Rheometer (TA Instruments, Newcastle, DE, USA), жирнокислотный (ЖК) состав липидной фракции гаммаруса и белкового гидролизата анализировали методом капиллярной газовой хроматографии на установке

Анализ современного состояния вопроса обзор литературных источников, обоснование актуальности работы

i

Формулирование целей и задач исследований

♦ i

Сравнительный анализ технологий хитина/хитозана Обоснование биотехнологического подхода в производстве хитина/хитозана из гаммаруса

Изучение процесса получения хитина/хитозана с применением промышленных и собственных ферментов гаммаруса

у -

Обоснование области существования, моделирование и оптимизация процесса автоэнзимолиза гаммаруса методом математического планирования эксперимента

у —

Разработка технологической схемы получения хитина/хитозана из гаммаруса с применением процесса автоэнзимолиза и биоконсервирования

— i

Изучение качественных характеристик и физико-химических свойств хитина и хитозана из Gammarus lacustns

X

Обоснование технологии получения белкового гидролизата и его

характеристика

* -

Разработка рекомендаций по практическому использованию полученного хитозана и белкового гидролизата

х

(HP 6890 Senes GC System, DE) с предварительной экстракцией жира петро-лейным эфиром (стандартный метод ФРГ) и этерифи-кацией метилированием, вязкость растворов хитозана оценивали на капиллярном вискозиметре Уббелоде Тип 1с (Германия), микробиологическую обсемененность биоавтогидролизата определяли по стандартным методам Европейской фармакопеи (п 2 6 12 и 2 6 13), антисептическую активность хитозана и биопленок на его основе измеряли с использованием жидкой глюкозо-дрожжевой питательной среды No 1-бульон (фирмы VWG-Eurolab, Darmstadt) Моделирование и оптимизацию технологических процессов осуществляли методом планирования эксперимента с применением ортогонального центрального композиционного плана (ОЦКП) второго порядка для двух факторов Статистическую обработку данных проводили стандартными методами на ПЭВМ с пакетом прикладных программ Microsoft Office (Word, Excel) и Mathcad 200li Professional

В третьей главе «Результаты исследования и их обсуждение» в разделе «Характеристика гаммаруса балтийского» приведены особенности его химического состава в сравнении с алтайским рачком (табл 1,рис 2)

Разработка проекта НД на хитин/хитозан пищевой, полученный при комплексной переработке гаммаруса с применением автоэнзимолиза с биоконсервированием

X

Разработка исходных требований на технологическое оборудование для изготовления хитина/хитозана и белкового гидролизата

I —

Производственные испытания хитозана ♦ +

Получение опытной партии рыбы холодного

копчения с применением геля на основе хитозана (ламинированнои) и определение качества готовой продукции

Е

Получение хитозановых мембран для медицинских

целей и изучение их функциональных свойств

X

Обоснование эффективности разработки

Рис 1 Схема экспериментальных исследований

Таблица 1

Сравнительный химический состав сушеного рачка Саттагт ¡аыШгк, выловленного в различных водоемах, % массы сырья

Гаммарус Вода Липиды Общий азот Минеральные вещества Хитин Хитозан

балтийский 12,2 4,7 9,1 18,8 7,5 4,5

алтайский* 10,8 7,7 7,8 26,0 7,0 -

| Балтийский рачок отличается от исследованного ранее сибирского вида уменьшенным содержанием липидов (4,7 против 7,7%), которые представлены насыщенными и ненасыщенными жирными кислотами (арахидоновой, эйкозапентаеновой, докозагексаеновой

и др), более низким содержанием минеральных веществ (18,8 против 26,0%) Полученные данные позволяют говорить о рациональности использования липидной части рачка и применении щадящих режимов деминерализации в технологии хитина Значение протео-литической активности собственных ферментов сушеного гаммаруса составило 1,4 ед/г, что свидетельствует об их высоких функциональных возможностях при проведении автоэнзимолиза

Обоснование целесообразности и оптимизацию процесса предварительного автоэнзимолиза гаммаруса в технологии хитина/хитозана проводили в серии специальных сравнительных экспериментов Апробировано 3 способа изготовления хитина из гаммаруса 1-е применением автоэнзимолиза при последующем воздействии 4%-ым раствором соляной кислоты и щелочи (эксперимент), 2 - получение хитина традиционным кислотно-щелочным способом по технологии ВНИРО (контроль 1), 3 - с применением промышленного ферментного препарата Протосубтилин Г20Х на стадии предварительного ферментолиза в концентрации 0,2 и 1,0% к массе сырья (контроли 2 и 3)

Сравнительный анализ результатов экспериментов, включающих определение выхода и качественную оценку полученного полуфабриката хитина, показал высокую эффективность экспериментального процесса, включающего автоэнзимолиз,

' - литературные данные

Рис 2 Рачок гаммарус

при котором количество депротеинизированного панциря возрастало до 49,0%, относительно 39,4 и 35,2% в контроле 2 и 3 При этом было достигнуто максимальное удаление сопутствующих хитину азотистых соединений (степень депротеинирова-ния экспериментальных образцов составила 65%)

Принимая во внимание длительность процесса, с учетом направленной эффективности автоэнзимолиза в качестве гидросреды использовали молочную творожную сыворотку и раствор компонентов алоэ, биологически активные вещества которых надежно предотвращают микробиологическую порчу, не влияя на активность ферментов, при этом существенно улучшаются органолептические свойства биоав-тогидролизата (Т Сенкевич, 1989, А Г Храмцов, ПГ Нестеренко, 2004, в 1лпс1еп 2000, Г П Яковлева, 2006, И П Неумывакин, 2007)

Установление оптимальных параметров процесса автоэнзимолиза гаммаруса осуществляли путем планирования эксперимента с применением ОЦКП В качестве частных факторов, подлежащих варьированию и оптимизации, использовали продолжительность автоэнзимолиза (тавт) и температуру (Ттт) Параметром оптимизации был выбран обобщенный показатель у, включающий качественную оценку полученного полуфабриката хитина (содержание общего азота (Мц), минеральных веществ {Ммв) и потери массы полуфабриката хитина, в % массы сырья (МПФ) Автоэн-зимолиз осуществляли при гидромодуле реакционной системы «измельченный гам-марус биоконсервант» соответственно «1.3»

Таблица2

План эксперимента по оптимизации процесса автоэизимолиза гаммаруса при биоконсервировашш молочной сывороткой и результаты его реализации

!? План эксперимента Частные отклики Обобщенный параметр оптимизации,}'

Тт.°С Мп % Мю, % Л/да, %

1 40 4,9 35£ 58,0 0,1967

2 12 40 6,1 28,0 51,0 03040

3 48 20 4,7 36,7 573 0,2020

4 12 20 53 35,5 49,9 03587

5 48 30 5,0 30,4 56,5 0,0945

6 12 30 53 333 52$ 0,2338

7 30 40 4,8 34,9 54,5 0,1655

8 30 20 5,7 323 49,2 0,2814

9 30 30 5,2 35,8 56,2 0,2360

Реализация плана эксперимента (табл 2) и обработка его данных позволили получить уравнение (1), адекватно связывающее качество полуфабриката с изменяемыми факторами

у = 0,1855 - 0,0672x1 - 0,0293х2 + 0,0123х,х2 + 0,0039х12 + 0,0632х,2 (1)

Графическая интерпретация полученной модели (рис. 3) наглядно показывает области локализации процесса, анализ которых, а также учет видовой специфики биоконсервирования позволили установить

Температура автоэнзимолиза, "С Продолжительность автоэнзимолиза, ч

Оптимум

Рис. 3 .Геометрическая интерпретация модели процесса автоэнзимолиза гаммаруса с биоконсервированием молочной творожной сывороткой

следующие рациональные значения процесса автоэнзимолиза гаммаруса: продолжительность процесса тМ1П -от 37 до 42 ч; температура Tmm - от 26 до 32°С.

Обоснование процесса деминерализации полуфабри-

„ . „ , честве частных факторов варьи-

Рис.4. 1 еометрическая интерпретация модели

прогресса деминерализации полуфабриката хитина ровали концентрацию раствора

раствором соляной кислоты „ , _.

соляной кислоты (Ск) и продолжительность деминерализации (тдо). Параметром оптимизации был выбран обоб-

Концентрация соляной кислоты, %

2

ката хитина, полученного после

рекомендовано при получении хитина из мелких ракообразных (В.М. Дацун, Е.Э. Куприна, Л.А. Нудьга, К.А.А. МиггагеШ, 1977).

Оптимизацию процесса вели с применением ОЦКП. В ка-

удаления продуктов автоэнзимолиза фильтрованием и промывкой водой, вели химическим воздействием соляной кислотой, что

щенный показатель у, включающий качественную оценку деминерализованного полуфабриката хитина по содержанию минеральных веществ (Мш) и потери массы полуфабриката хитина, в % массы сырья (Мпф)

В результате была получена модель (формула 2, рис 4), адекватно связывающая качество конечного продукта с факторами деминерализации полуфабриката хитина Параметры оптимума области локализации, определенные по геометрической модели, были следующими концентрация раствора соляной кислоты С„ - от 5,5 до 7,5 %, продолжительность процесса хдо - от 3,5 до б ч

у = 1,471 - 0,823x1 - 0,183X2 + 0,098х,х2+0,445х,2 + 0,089х22 (2)

Полуфабрикат хитина, полученный по данным факторам деминерализации, имел содержание минеральных веществ 0,8-1,6%, что в целом соответствует нормативным значениям

Анализ экспериментальных данных позволил обосновать рациональную технологию получения хитина и хитозана при комплексной переработке

(_Сырье (сушеный гаммарус (Оаттагоз ¡аси$1п5)_[

Измельчение [степень измельчения до размера частиц 0,5 - 2 мм] +

Автоэнзимолиз (биоконсерванты молочная сыворотка, раствор компонентов алоэ)

(т*к»" 37-42 ч, Т»«» 26 32'С, ^-13]

- ♦ -

Фракционирование

Полуфабрикат хитина + —

Бульон (жидкин гидролизат)

Деминерализация 1С,(НС1) »5,5-7 5%, т„ »3,5-6 ч, V™, « 1 8)

X

X

На доработку для получения сушеного гидролиэата

Промывка водой до нейтральной реакции

х

Депротеинизация [С^ИаОН) * 4%, Тя„ » 2 ч, Т*. * 95 ЮО'С Улдр = 1 7]

Промывка водой до нейтральной реакции

Хитин

~т~

Деацетилирование [Сщ(МаОН) * 50%, ТдМя 1,5ч Тдч* 100-120*0, ^,«120)

Сушка

гаммаруса (рис 5), учиты- | Промывка водой до нейтральной реакции |

вающую оптимальное измельчение гаммаруса до размера частиц панциря 0,5-2,0 мм, автоэнзимолиз, однократную деминерали-

Рис 5 Пооперационная схема получения хитина и хитозана при комплексной переработке гаммаруса

зацию, последующие традиционные депротеинизацию и деацетилирование (ТМ Сафронова, В М Дацун, 1988, В М Быкова, С В Немцев, 1997)

и

Оценку качества готовых хитина и хитозана проводили по органолептиче-ским, физико-химическим и микробиологическим показателям (табл 3)

Таблица 3

Показатели качества экспериментальных образцов хитина и хитозана

Характеристика показателя

Показатели Хитин Хитозлн (образец 1)* Хитозан (образец 2)*

Внешний ввд и цвет Чешуйки от белого до светло-кремового цвета Хлопья светло- Хлопья свстло-

кремового цвета кремового цвета

Запах Свойственный даниому продукту, без постороннего опенка

Выход готового продукта, (% массы сырья) 7,5 4,5 4,7

Массовая доля минеральных веществ, % Ifi 0,98 1,00

Массовая доля воды, % 9,0 8,4 8,9

Массовая доля нерастворимых веществ, % 1,5 Ifi

Выход D-глюкозаминахпорпирата, % 50 . -

КМАФАнМ, КОЕ/г, не более - 3,8*10' 3,6* КГ1

Бактерии группы Е coil, Pr vulgaris, S. aureus, КОЕ/г, не более - Не выделены Не выделены

Патогенные, в том числе сальмонеллы, микроорганизмы в 25 г продукта - Не выделены Не выделены

Плесневые грибы клеток, КОЕ/г, не более - 1,8*10* 1.7Ч01

Отеленьдеацетилнрования (СД), ЯМР 'Н, % 92,8 94,6

Индекс Штаудингера (Staudinger index 11), мл/л 323,6 4353

Молекулярная масса полимера Mi)***, кДа 165 244

Критическая концентрация полимера C*fril, % 0,77 0,57

Динамическая вязкость 3 %-го раствора хатозаия в 1%-м растворе уксусной кислоты q, (сПз) 100 150

Молекулярная масса полимера Mw****, кДа 140 190

Содержание макро- и микроэлементов, мг/кг

Кальций (Са) 10,85 11,00

Натрий (Na) 1,85 1,55

Магний (Mg) 1,15 0,96

Медь (Си) 0,74 0,82

Цинк (Zh) 0,62 0,23

Калий (К) 0,44 0,44

Железо (Fe) 0,42 0,33

Содержание тяжелых металлов, мкг/кг

Cd (<0,1) (<0,2)

Pb 0,1 0,9

Hg (<2,0) (<2,0)

Примечания * и "Образцы, обработанные соответственно 50- и 45%-м растворам гидроксида натрия при деацетилировании, " молекулярная масса полимера получена методом вискозиметрии, -молекулярная масса полимера получена методом гельпроникающей хроматографии

Из табл 3, а также рис 6 и 7 видно, что экспериментальные образцы хитозана обладают высоким значением показателя СД (92,8 и 94,6%) Молекулярно-массовое распределение пробы хитозана (рис 7, образец 1) находится в пределах от 2,2х104до 1,6x1 О6 г/моль, а для образца 2 - от 6,3х104 до Зх10б г/моль,

Рис 6 Сравнительный спектр ЯМР 1H хитозана (,образец 1 и 2 - пояснения см в табл 3)

Рис. 7. Графическое отображение сигналов светорассеивающего (MALLS), концентрационного (DRI) и распределения молекулярной массы хитозана (Molmasse), установленных методом жидкостной гельпроникающей хроматографии (образец 1 и 2 - пояснения см в табл 3)

что свидетельствует о значениях его молекулярной массы М„ на уровне 140 и 190 кДа Полученные данные указывают на способность биополимера к быстрому растворению в кислотных средах и проявлению достаточных структурообразующих свойств в пищевых системах

Из данных табл 3 следует также, что полученный хитозан безопасен по микробиологическим показателям Кроме того, в нем содержатся такие полезные минеральные вещества, как Са, Na, и Mg при практическом отсутствии тяжелых метал-

лов Это позволяет рекомендовать ценные биополимеры в составе пищевых продуктов, а также в качестве компонента БАД к пище

Определение рациональных путей использования биополимеров вели с учетом их показателей качества (табл 3) и результатов специальных модельных экспериментов Установлена целесообразность применения хитозана в качестве структурообразователя пищевых систем, компонентов биологически активной добавки (БАД), барьерного вещества в пищевых композициях, сорбента вкусо-ароматических композиций, энтеросорбента для очистки жидкостей от взвешенных частиц, жиропоглотителя, мембранного вещества в биологических процесса и др

Обоснования рациональности и функциональности хитозана в названных процессах вели на примере частных технологий бездымного адгезионного холодного копчения рыбы и в процессе приготовления медицинских биопленок

Обоснование оптимальной рецептуры коптильного геля с использованием хитозана осуществляли путем математического планирования эксперимента, смешивая варьируемые массовые доли 1-2,5%-ого раствора хитозана (Мх) в 1%-м растворе уксусной кислоты и коптильного препарата ВНИРО (Мт) по содержанию органических кислот Оптимизацию процесса вели по обобщенному показателю у, включающему качественную оценку полученного геля по кинематической вязкости (Вк) и органолептической оценке (Окг)

Полученное адекватное уравнение (3) позволило рассчитать оптимальную рецептуру коптильного геля Мх - от 1,2 до 1,8%, Мкп - от 0,2 до 0,4%

у = 5,417 - 3,820x1 - 1,268хг + 0,385х,х2 + 1,077х,: - 1,618х2* (3)

Экспериментально установленные данные были положительно апробированы в сравнительных производственных испытаниях по бездымному копчению скумбрии. При этом использовали коптильный препарат «Жидкий дым», а в качестве контрольной выработали партию рыбы традиционным дымовым копчением (табл 4)

Полученные оценки качества контрольных и экспериментальных образцов (табл 4) свидетельствуют о положительном проявлении свойств гелеобразователя

изготовленного хитозана в составе коптильного препарата в технологии бездымного копчения рыбы.

Таблица4

Органолептическая оценка качества скумбрии холодного копчения, полученной дымовым и бездымным способами

Показатель Рыба холодного копчения, полученная

Традиционной обработкой дымом (контроль) Обработкой коптильным гелем на основе хитозана (эксперимент) с последующей подсушкой

Интенсивность окраски (цвет) Цвет - золотисто-коричневый, с выраженным блеском поверхности Цвет - золотисто-желтый, с ярко выраженным блеском поверхности

Равномерность окраски поверхности Слегка неравномерно окрашенная Равномерно окрашенная

Увлажненность поверхности Сухая Сухая

Белково-жировые и жировые натеки Незначительные Отсутствуют

Аромат копчености Ярко выраженный Ярко выраженный

Вкус копчености Ярко выраженный, без постороннего привкуса Достаточно выраженный, без постороннего привкуса

Консистенция Плотная, сочная Плотная, сочная

Функциональность хитозана в медицинских технологиях подтверждена получением биомембран, предназначенных для предотвращения воспалительных процессов кожи, возникающих при порезах, ожогах и других повреждениях (рис. 8).

1—-г { Хитозан | Подготовка раствора хитозана 1

1

Кислота (уксусная, молочная) Пластификатор (глицерин)

» 1 Смешивание |

/"А Раствор хитозана Хитозановая V А. мембрана V А. сушка 60°С .... .

и / с;:.' ,"

а) б)

Рис. 8. Схема получения биомембран на основе хитозана (а) и их внешний вид (б)

Для этого в разработанную технологию гладких биомембран (Г.А. Вихорева, Л.С.

Гальбрайх, 2002; Н.-1 КаеВтап, 1995; "\У.М. КиНске, Т.Д. \Vilchelms, 2006) в состав

рецептуры вводили хитозан гаммаруса. Сущность технологии заключалась в полу-

чении 2,5-3% раствора хитозана в 1-2,5%-ом уксусно- или молочно-кислом растворе, добавлении в качестве пластификатора глицерина (0,5-1,0% массы раствора), нанесении полученного геля на гладкую поверхность (пластиковая плата из поликарбоната) и сушке при температуре около 60°С Полученные образцы были прозрачными, эластичными, имели гладкую поверхность и толщину при раскатке в 4мм в высушенном виде 0,09 - 0,15 мм (рис 8, б) Биопленки имели высокую степень на-бухаемости - до 40% массы сухой мембраны (при погружении образца в воду на 10 мин) Полученные мембраны эффективно способствовали ускорению заживления кожных ран, что объясняется созданием прямой преграды от проникновения микроорганизмов (барьерный эффект) и иммобилизацией патогенных микроорганизмов (антисептический эффект, рис 9) (ДВ Герасименко, 2003, Р Не^щ, 2006, Н -] КасВтап, 1995, Я А А МиггагеШ, 1997 и др).

с 8 ЕЮ

тш 7

оО,0

Г>1-1 5

CL

о о

а. *

s

S

X о н

О)

С X

о Q.

10

10

3

10

10

10

10

Рис 9 Динамика роста микроорганизмов MRSA (Methicillin-resistente S aureus) схитозановой биомембраной (кривая 2) и без нe¿ (кривая 1) на глюкозо-дрожжевой питательной среде

— -1

1 ■ 1

00 0 5 1 0 15 20 25 30 35 40 45 50

Продолжительность [ч]

Антисептический эффект иллюстрирован динамикой роста модельных микроорганизмов, приведенной на рис 9 Видно резкое снижение роста бактерий рода стафилококков (Methicilhn-resistente S aureus) уже через 90 минут инкубирования пробы и их отсутствие через 210 минут с начала эксперимента

Обоснование технологии получения белковых гидролизатов в технологии хитина из жидкой части, образующейся при комплексной переработке гаммаруса, проводили экспериментальным путем с учетом рекомендаций специалистов (ГМ Василькова, 1983, ЛЯ Телишевская, 2000, С В Володажская, 2001) и др Сушку

обогащенного биокомпонентами бульона осуществляли лиофильным способом до конечного содержания воды 11,3% (Т = -18°С, Д = 6 Па) Готовый продукт включал (в %) 67,1 азотистых веществ, 3,41 липидов, 18,2 минеральных веществ (в том числе соответственно (в %) 34,5, 1,48, 9,7 из молочной сыворотки), имел чешуйчатую структуру, был рассыпчат и характеризовался высокими органолептическими показателями качества(табл 5)

Таблица 5

Качественная характеристика сушеного биоавтогидролнзата

Показатели Характеристика показателя

Цвет- Чешуйки желто-коричневого цвета

Запах Свойственный рыбной продукции

Массовая доля воды, % ИЗ

Массовая доля общего азота, % 10,73

Массовая доля азотистых веществ, % 67,10

Массовая доля лшщдов, % 3,41

Массовая доля минеральных веществ, % 18,20

Выход готового продукта (% массы бульона) 15,10

КМАФАиМ, КОЕ/г 1,75 хЮ4

Бактерии группы К colt,Pr vulgaris, Я. aureus в 1г продукта Не выделены

Патогенные, в том числе сальмонеллы, микроорганизмы в 25г продукта Не выделены

Плесневые грибы клеток, дрожжи, КОЕ/г, не более Не выделены

Одним из ключевых индикаторов биологической ценности кормового продукта является качественный и количественный состав микроэлементов и жирных кислот (ЖК) в липидах Анализ минерального состава сушеного гидролизата свидетельствуют о наличии в нем таких полезных элементов (в мг/кг), как кальций (165,0), магний (32,4) натрий (117,8), калий (203,8), цинк (0,60), медь (1,0), железо (0,25), а также отсутствии тяжелых металлов (кадмия, свинца и ртути)

Повышенное содержание калия, кальция и натрия в продукте обусловлено использованием в качестве экстракционной среды биоавтосистемы гаммаруса молочной сыворотки В случае применения в качестве биоконсерванта раствора компонентов алоэ в гидролизате присутствуют такие биологически активные вещества, как кальций, селен, цинк, витамины группы В, С и Е, бета-каротин и флавоноиды

Результаты сравнительных исследований жирно-кислотного состава липидной фракции гидролизата свидетельствуют о достаточной сохранности в нем ценных характерных для гидробионтов насыщенных и ненасыщенных жирных кислот и его высокой биологической эффективности (табл 6) С учетом содержания других биологически активных веществ, необходимых для развития организма (витамины, ми-

неральные вещества, органические кислоты), полученный биоавтогидролизат рекомендован в качестве кормовой добавки, предназначенной для сельскохозяйственных животных

Таблица 6

Жирно-кислотный состав липидов гаммаруса и сушеного биоавтогидролизата,

% массы лнгшдов

Жирные кислоты Гаммарус сушеный (Gammarus lacustris) Сушеный гидролизат

Сумма насыщенныхЖК (НЖК), е там числе 27J9 52,29

(С14 0) Мирнсгиновая 8,75 14,43

(С16 0) Пальмитиновая 15,26 3139

(С18 0) Стеариновая 2,14 5,70

(C2Ü 0) Арахиповая 1,24 0,77

(CZ2 0) Бегеновая - -

(С24 0) Лигаоцерпновая . -

СуммамопоиенасшценныхЖК (МНЖК), в том числе 38,91 28,05

(С141) Миристоолепновая 0,36 .

(С16 1) Пальмитооленновая 16,65 10,11

(С18 1ш9(олеаг) Олеиновая 17^9 14,64

(С18 1оз9(вакцеиат) Цнс-вакценовая 3,19 2,70

(С20 1)га9 Гондоиновая 0,82 0,60

(С22 1)(а9Эруковая - -

(С24 1)<о9 Нервоновая - .

Сумма полинеиасыщеппыхЖК (ПНЖК), в там числе 3¿3 2,38

(С18 2)со6Линшгевая 0,54 131

(С18 3)ю3 Лииоленовая 0,58 0,50

(С20 2)ю6 Эйкозадиеновая 0,22 .

(С20 3)са3 Эйкозатриеновая ■

(С20 4)ю6 Арахццоновая -

(С20 5)юЗ Эйкозапеитаеновая 1¿2 0,57

(С22 6)юЗДокозагексаеновая 0,57 -

Сумма ЖК тЗ сем 2,47 1,07

Сумма ЖК <об сем 1,33 131

Сумма ЖК ш9 сем 21,90 17,94

На основании результатов исследований была разработана комплексная технологическая схема переработки гаммаруса с получением хитина, хитозана и сушеного биоавтогидролизата. Сущность технологии заключается в использовании предварительного автоэнзимолиза данного сырья в растворе биологически активного консерванта (молочной сыворотки или раствора компонентов алоэ) с последующим удалением оставшихся минеральных и азотистых веществ соответственно однократной обработкой соляной кислотой и гидроксидом натрия Получение хитозана осуществляется традиционной обработкой хитина концентрированной щелочью Жидкий биоавтогидролизат высушивают при мягких условиях На технологический процесс и основную продукцию разработан проект нормативной документа-

ции (ТИ и ТУ «Хитин и хитозан пищевой из балтийского гаммаруса»), а также исходные требования на разработку соответствующего аппаратурного оформления

В разделе «Оценка эффективности разработанной технологии» показаны ее основные составляющие (социальный, экономический, экологический и производственный эффекты), базирующиеся на получении функциональных продуктов при полноценном использовании биопотенциала гаммаруса, сокращении технологического процесса, уменьшении расхода химических реактивов и других аспектах

Способ использования полученного хитозана в технологии бездымного копчения апробирован в производственных условиях ИП «Черба» (пос Васильково, Калининградская обл ) Была выработана опытная партия рыбы холодного бездымного копчения из скумбрии атлантической с введением хитозана в состав коптильного геля Качество готовой продукции положительно оценено специалистами предприятия, а результаты испытаний рекомендованы к внедрению

ВЫВОДЫ

1 Обоснована эффективная безотходная экологически безопасная технология хитина и хитозана из балтийского гаммаруса при его комплексной переработке с применением предварительного автоэнзимолиза сырья, которая позволяет изготавливать ценные биополимеры и обогащенный гидролизаг, содержащий натуральные биологически активные компоненты молочной сыворотки или алоэ Функциональные свойства готовых продуктов иллюстрированы частными примерами получения пищевой, медицинской и кормовой продукции

2 Изучены техно-химические свойства гаммаруса балтийского, особенностью которых является уменьшенное содержание липидов и минеральных веществ по сравнению с гаммарусом алтайским Установлена активность собственного ферментного комплекса высушенного рачка, что позволило переводить в растворимую форму до 49% его массы и до 80% протеинов при автоэнзимолизе

3 Исследован процесс автоэнзимолиза гаммаруса с применением в качестве биоконсерванта молочной сыворотки и раствора компонентов алоэ Разработаны математические модели процесса автоэнзимолиза, адекватно связывающие продолжительность и температуру автоэнзимолиза с выходом и качеством готового продукта Определены оптимальные значения параметров процесса продолжительность процесса - от 37 до 42 ч и температура - от 26 до 32°С

4 Разработана математическая модель процесса деминерализации соляной кислотой полуфабриката хитина, устанавливающая зависимость выхода готовой про-

дукции и ее основных характеристик Рассчитаны оптимальные значения процесса концентрация раствора кислоты - от 5,5 до 7,5 % и продолжительность - от 3,5 до 6ч

5 Дана качественная характеристика полученных хитина и хитозана по комплексу органолептических, физико-химических и микробиологических показателей Показано, что хитозан обладает степенью деацетилирования 92,8 и 94,6%, молекулярной массой 140 и 190 кДа, способностью растворяться в различных кислых средах с образованием вязких растворов По содержанию тяжелых металлов, макро- и микроэлементов, а также микробиологическим показателям образцы адекватны традиционным полимерам Определены области рационального применения экспериментально полученного хитозана

6 Установлена структурообразующая функция хитозана в технологии холодного бездымного копчения рыбы Разработана математическая модель процесса образования коптильного геля на основе хитозана и коптильных препаратов ВНИРО и «Жидкий дым», функциональность которой доказана в практической технологии бездымного копчения рыбы ИП «Черба»

7 Разработан процесс синтеза медицинских биопленок, приготовленных на основе хитозана с добавлением глицерина, предназначенных для предотвращения воспалительных процессов кожи Подтверждена функциональность хитозана в составе данных биопленок установлением их высокой антисептической способности относительно бактерий из рода стафилоккоков (Methicillin-resistente S aureus)

8 Исследовано получение из биоавтогидролизата гаммаруса сушеного продукта, основанное на методе лиофильного обезвоживания, качество которого оценено по органолептическим, физико-химическим и микробиологическим показателям Показана его высокая кормовая ценность по содержанию азотистых и минеральных веществ, липидов, отсутствию тяжелых металлов, наличию ценных жирных кислот (эйкозапентаеновая и др), БАВ растительного и молочного происхождения

9 Обоснована технология хитина в комплексной схеме переработки гаммаруса, заключающаяся в предварительном автоэнзимолизе в среде биоконсерванта с последующими однократными процессами деминерализации и депротеинизации полуфабриката хитина соляной кислотой и раствором гидроксида натрия Показана рациональность получения хитозана традиционным методом обработки концентрированным раствором щелочи (50%)

10 На технологический процесс и готовую продукцию подготовлен проект нормативной документации (ТИ и ТУ «Хитин и хитозан пищевой из балтийского

гаммаруса»), а также исходные требования на разработку «пилотного» экстрактора для производства биополимеров Эффективность разработки оценена по производственной, социальной, экономической и экологической составляющим

Основные положения диссертации опубликованы в следующих работах

1 Григорьева Е В Комплексная переработка балтийского гаммаруса с целью получения хитина, хигозана и белкового гидролизата /ЕВ Григорьева, О Л Мезенова // Известия вузов Пищевая технология - Краснодар, 2007 -№3 -С 30-32

2 Григорьева Е В Комплексная переработка гаммаруса /ЕВ Григорьева // РЫБПРОМ -2008- №1 - С 26-27

3 Kuhcke W -M Synthese und Charaktensierung von hydrophilen, porosen Membranen zur großflächigen Wundversorgung von Problemwunden / W -M Kulicke, T Wilchelms, В Sultanova, E Gn-goiyeva // Makromolekulares Kolloquium Freiburg im Breisgau, 24 -26 Februar 2005, - p.F9

4 Gngoryeva E Antibactenal Activity of Chitosan Membranes, Chitosan Powder and Bacterral Cellulose Membrane in Nutntion Liquid / E Gngoryeva, T Claussen, P Heisig, W -M Kulicke // International Symposium ,3iomatenals" and 29л Hamburger Makromolekulares Symposium" (October Iя-4th) Universität Hamburg -2006 - P 78

5 Gngoiyeva E V Das Verfahren zur Chitosan - Gewinnung aus dem baltischen Krebs Gam-marus lacustns / E V Gngoryeva, О J Mezenova // Chemie Ingenieur Technik -2007 - 79(8),P 11891194

6 Gngoryeva E Rationelles Verfahren zur Chitosan - Gewinnung aus dem baltischen Krebs Gammaruslacustns/E Gngoryeva, О Mezenova//Die Ernährung -2008 -V32(l) -C 16-22

7 Патент РФ № 2318831, МПК С 08 В 37/08 Способ комплексной переработки рачка гаммаруса / О Л Мезенова, ЕВ Григорьева (Россия)

8 Мезенова О Л Технология получения хитин/хитозана из сушеного гаммаруса с применением авгоферменголиза / ОЛ Мезенова, А С Лысова, Е В Григорьева, СМ Вильт // Известия КГТУ научный журнал - 2004 - №5 - С 72-76

9 Мезенова О Я Технология комплексной переработки гаммаруса ! ОЯ Мезенова, Е В Григорьева//Рыбная промышленность -2006 - №3 - С 22-23

10 Григорьева Е В Жирнокислотный состав липидной фракции рачка гаммаруса и получаемого из него белкового биоавтогидролизата/ ЕВ Григорьева, О.Я Мезенова //Рыбная промышленность - M, 2007 -№2 - С 26-28

11 Мезенова О.Я Получение хитина и хигозана из балтийского гаммаруса / ОЯ Мезенова, А С Лысова, Е В Григорьева // Наука и образование - 2003 Всероссийская науч -техн конф материалы/МГТУ - Мурманск, 2003 -44 - С 202

12 Мезенова О.Я Технология хигин/хигозана из балтийского гаммаруса / ОЛ Мезенова, А С Лысова, Е В Григорьева // Современные технологии переработки животного сырья в обеспечение здорового питания наука, образ, пр-во международная науч Техн конф материалы / Воронеж, 2003

13 Мезенова ОЛ Гаммарус балтийский - потенциальный источник получения хитина и хи-тозана / О Л. Мезенова, А С Лысова, Е В Григорьева // Современные перспективы в исследовании хитина и хигозана. седьмая междунар конф (15-18 сент) материалы / Санкт-Петербург -Репино, 2003 - С 32-33

14 Мезенова О Л Технология получения хитин/хитозана из сушеного гаммаруса с применением ферментолиза / О Л Мезенова, А С Лысова, Е В Григорьева, С M Вильт // Инновации в

науке и образовании - 2003 междунар науч конф, посвященная 90-летию рыбохозяйственного образования в России (13-15 окт) материалы/ЮЛУ -Калининфад -2003 -С 141-142

15 Мезенова О Л Совершенствование технологии получения и применения аминополисаха-ридов из нетрадиционных гидробионтов / О Л. Мезенова, А С Лысова, Е В Григорьева, С М Вильт // Журнал Украинского национального университета пищевых технологий «Харчова про-миловисть»(21-23 жовгня) додаток до журнала № З.Украина, Киев, 2003 -С 24

16 Мезенова О-Я Совершенствование технологии хигина/хитозана из балтийского гаммару-са с применением автоэнзимолиза / О Л Мезенова, А С Лысова, ЕБ Григорьева // Инновации в науке и образовании - 2004 международная науч конф, посвященная 10-летию КПУ (20-22 окг) материалы/КГТУ, Калининград, 2004 - С 100

17 Мезенова О Л Биотехнологический способ получения хитозана из гаммаруса балтийского / О Л Мезенова, А С Лысова, Е В Григорьева // Биотехнология состояние и перспективы развития третий междунар Конгресс материалы/Москва-2005 - С 29

18 Мезенова О Л Биоконсервирование процесса автоэнзимолиза в технологии хитина и хитозана / О Я Мезенова, Е В Григорьева // Инновации в науке и образовании - 2005 (19-21 окт ) международная науч конф, посвящ 750-летию Кенигсберга-Калининграда труды / КГТУ -Калининград, 2005 - С 270-271

19 Мезенова О Я Обоснование биотехнсшогического способа получения аминополисахари-дов из балтийского гаммаруса / О Л Мезенова, Е В Григорьева //1 Международная науч техн конф молодых ученых «Аюуальные проблемы технологии живых систем» (21-23 декабря) сб материалов/Владивосток, 2005 -С 12-15

20 Мезенова О Л Совершенствование технологии хитина/хшозана из балтийского гаммаруса / О Л Мезенова, Е В Григорьева // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана восьмая междунар конф (12-17 июня) материалы/Казань, 2006 - С 40-42

21 Григорьева ЕВ Пути рациональной комплексной переработки гаммаруса с целью получения хитина, хитозана и белкового гидролизата /ЕВ Григорьева, О Л Мезенова // Пищевая и морская биотехнология проблемы и перспективы науч пракг конф материалы / КГТУ. - Калининград 2006 -С 35-36

22 Григорьева ЕВ Физико-химические свойства хитозана, полученного при комплексной переработке балтийского рачка гаммаруса /ЕВ Григорьева, ОЛ Мезенова // П Международная научно-техническая конференция молодых ученых, посвящ актуальным проблемам технологии живых систем (26-29 сент) материалы /ТГЭУ - Владивосток, 2007 - С 13-16

23 Григорьева Е В Комплексная переработка гаммаруса с целью получения хитина, хитозана и белкового гидролизата / Григорьева ЕБ, Мезенова ОЛ // Ш Международная научно-техническая конференция «Низкотемпературные и пищевые технологии в XXI веке» материалы /СПбГУНиГТГ -СПб,2007 -С 317-318

24 Мезенова ОЛ Возможности практического применения продуктов переработки балтийского рачка гаммаруса в пищевых и кормовых целях / Григорьева Е В, Мезенова О Л. // V Международная научная конференция посвящ инновациям в науке и образовании - 2007», (23-25 окт) материалы /КГТУ - Калининфад, 2007 - С 348-351

25 Григорьева Е В Комплексная переработка балтийского гаммаруса с целью получения хитина, хитозана и белкового гидролизата /ЕВ Григорьева, О Л Мезенова // V Международная научная конференция, посвящ инновациям в науке и образовании - 2007 (23-25 окг) доклады номинации «УМНИК» /КГТУ - Калининград, 2007 - С 71-74

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Современное хитинсодержащее сырье и перспективы его переработки.

1.2. Современные технологам получения хитина/хитозана и возможности комплексной переработки хитинсодержащего сырья.

1.2.1. Химический способ получения хитина/хитозана:.•.

1.2.2. Электрохимический способ получения биополимеров.

1.2.3. Ферментативный (биотехнологический) способ получения хитина/ хитозана

1.2.4. Нетрадиционные способы получения хитина и хитозана.

1.2.5. Комплексные технологии по переработке хитинсодержащего сырья.

1.3. Состояние и перспективы развития технологий белковых гидролизатов.

1.4. Применение хитина и хитозана в промышленности.•.

Актуальность работы. Природные биополимеры хитин и хитозан все шире применяются в различных отраслях промышленности, что обусловлено ртх уникальным химическим составом и свойствами (биосовместимость, нетоксичность, биоде-градируемость, сорбционность и др.). Традиционным сырьем для получения данных продуктов являются панцирьсодержащее сырье (ПСС), образующееся при разделке промысловых ракообразных (крабы, криль, креветки, раки и др.). Несмотря-на то, что* запасы ПСС достаточно стабильны, отмечена положительная динамика новых источников получения хитина. В последние годы изучены насекомые (пчелиный подмор, надкрылья тараканов, майских жуков), кораллы, термиты и др., для которых разработаны специальные технологии. [16, 84, 85,119,189,190].

Однако в акватории Балтики традиционное ПСС отсутствует, а переработка новых источников по причине их небольших запасов, специфики технологии и низкого выхода готовой продукции не развилась выше кустарного уровня.

В Балтийском море, Куршском и Вислинском заливах, озерах Калининградской области в большом количестве обитает недоиспользуемый в промышленности - ра-чок-бокоплав гаммарус (Саттагш /ясмя/га). Относительно высокое содержание (2530%) и малая толщина (100 - 500 мкм) панциря облегчают процесс его диспергирования, необходимого при всех способах получения хитина. С учетом оценки его запасов и высокой способности рачка к размножению данную сырьевую базу можно считать потенциально значимой в регионе для получения хитина [19,90, 112, 113].

Принимая во внимание факт присутствия в составе гаммаруса, помимо хитина, также других ценных компонентов (белки, липиды, пигменты, минеральные вещества и др.), целесообразным является-его комплексная переработка методами биотехнологии с получением хитина и дополнительного белкового гидролизата, представляющего ценность для кормовой промышленности. Мировые тенденции в данной сфере направлены на инновации с применением природных систем, максимальное сохранение биопотенциала сырья, регулируемость процессов, что предопределяет актуальность введения биотехнологической составляющей в базовую химико-экстракционную технологию хитина.

Несмотря на актуальность применения хитозана в пищевой, медицинской и других сферах производства, внедренных решений не очень много, что объясняется как дефицитом биополимеров, так и отсутствием качественных разработок.

Вопросами совершенствования производства и применения хитина и хитозана занимались многие ученые: Албулов А.И., Быков В.П., Варламов В.П., Вихорева Г.А., Во-долажская C.B., Гамзазаде А.И., Дацун В.М., Куприна Е.Э., Маслова Г.В., Немцев С.В:, Новиков М.Ю., Нудьга Л.М., Сафронова Т.М., Третениченко Е.М., Hirano S., Johnson E.L., Kaeßmann H:J. Muzzarelli R.A. A., Peniston C.P., Peter M.G., Struszczyk H и др.

Однако в известных трудах отсутствуют технологические решения по комплексной переработке гаммаруса балтийского, имеющего специфические особенности состава и свойств. На сегодня не изучены биотехнологический потенциал данного сырья, его «поведение» при автоэнзимолизе, что не позволяет однозначно применять известные способы для его безотходной переработки. Отсутствуют также способы стабилизации активной-биодепротеинирующей системы, отличающиеся безопасностью и инертностью к ферментам, а также определенным биологическим потенциалом, позволяющим в период ферментации повышать биологическую ценность конечных продуктов. В литературе нет данных по функциональным свойствам получаемых из гаммаруса биополимеров, рациональных областях и конкретных технологиях их применения. Не разработаны соответствующие аппаратурные требования, необходимые для внедрения результатов исследования.

С учетом сказанного представляется актуальным получать хитин и хитозан из балтийского гаммаруса с применением усовершенствованного способа его комплексной переработки. Потенциал совершенствования резервирован- в сфере фер-ментирования, где рациональным является синергетическое использование совокупности автоэнзимолиза и фитотехнологий наряду со вторичными ресурсами АПК. В процессах экстракции и биодеградации сегодня в пищевой и медицинской отраслях с успехом применяются фитокомпозиции (лекарственные растения, фитосборы и др.), а также продукты переработки молока (творожная и подсырная сыворотки, пахта и т.д.), обладающие полифункциональными свойствами.

На стадии автоэнзимолиза рациональным является введение в качестве жидкой фракции гидромодуля молочной творожной сыворотки или раствора натуральных компонентов алоэ. Последние надежно подавляют гнилостные процессы, развивающиеся при деструкции белков гаммаруса, но не ингибируют ферменты рачка. При этом повышается качество процесса и целевых продуктов, что обусловливается физико-химическим взаимодействием ценных компонентов системы друг с другом, приводящее к аддитивности их биопотенциалов. В'итоге в автолизируемой системе проявляется устойчивый антисептический эффект, образующийся бульон имеет высокое качество за счет приобретения приятных органолептических свойств и ценных компонентов (флавоноиды, гликозиды, алкалоиды, витамины, минеральные, липид-ные и др. природные вещества), в технологии хитина становится возможной последующая ускоренная традиционная дообработка сырья при получении дополнительного продукта - обогащенного биоавтогидролизата с высокими функциональными свойствами. По совокупности эффектов в целом снижается агрессивная химическая нагрузка процесса, повышается комплексность переработки гаммаруса и уровень использования его биопотенциала.

Переработка региональных запасов гаммаруса по новой технологии позволит снизить биологические загрязнения курортных зон Балтийского моря, повысить их экологический уровень, выпустить на региональный рынок доступные ценные биополимеры, обладающие определенными достоинствами, что в итоге будет способствовать решению важных социальных задач страны - обеспечение здоровья нации и внедрение комплексных безопасных технологий.

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в разработке из балтийского гаммаруса на основании автоэнзимолиза и использования биоконсервантов эффективной технологии целевого продукта хитозана и биологически ценного гидроли-зата.

Для достижения поставленной цели решались следующие основные задачи:

1. Изучение техно-химических свойств балтийского гаммаруса и обоснование возможности его комплексной переработки с применением предварительного автоэнзимолиза в условиях биоконсервирования;

2. Исследование, моделирование и оптимизация технологического процесса автоэнзимолиза, как предварительного депротеинирования, при использовании молочной сыворотки и раствора компонентов алоэ;

3. Формализация и обоснование оптимальных параметров деминерализации полуфабриката хитина, направляемого в обработку после автоэнзимолиза гаммаруса;

4. Исследование состава и функциональных свойств полученного* хитозана в технологии рыбы холодного бездымного копчения и при синтезе медицинских биопленок;

5. Получение биологически ценного гидролизата из белковой части гаммаруса и исследование его качества; ' |

6. Разработка комплексной схемы переработки гаммаруса и рекомендаций по применению конечных продуктов;

7. Производственная апробация технологической рекомендации по адгезионному копчению;

8. Оценка эффективности разработки;

9. Подготовка нормативной документации на технологический процесс и готовые продукты из балтийского гаммаруса.

Научная новизна работы. Обосновано совершенствование биотехнологического метода получения хитина, хитозана и биоавтогидролизата из недоиспользуемого хитинсодержащего сырья - балтийского гаммаруса, сущность которого заключается в его предварительном автоэнзимолизе в среде биоконсервантов при последующих однократных процессах деминерализации и депротеинизации, что позволяет получать функциональные конечные продукты, осуществлять процесс комплексно и безопасно. Установлены высокая автопротеолитическая способность тканей сушеного рачка и характер деструкции тканей в биореакционной автосистеме, представляющей собой дисперсию измельченного гаммаруса в водной среде биоконсерванта. Обоснована рациональность применения молочной творожной сыворотки и раствора компонентов алоэ, биологически активные вещества которых надежно предотвращают микробиологическую порчу белковой части автосистемы, не влияя на активность ее ферментов: Разработаны математические модели процессов автоэнзимолиза гаммаруса и деминерализации полуфабриката хитина, адекватно связывающие факторы процессов с качеством конечных продуктов и позволяющие его регулировать по органолептическим и физико-химическим показателям. Исследованы основные качественные характеристики хитина и хитозана (минеральный состав, степень деацетилирования, молекулярная- масса, вязкостные свойства растворов, термическая устойчивость, микробиологические показатели). Изучено качество дополнительного продукта? комплексной переработки гаммаруса -биоавтогидролизата, содержащего в сохраненном виде биокомпоненты гаммаруса и натуральные биоконсерванты. Установлены. минеральный и жирно-кислотный составы рачка и биоавтогидролизата, представленные рядом ценных микроэлементов, моно- и полиненасыщенных жирных кислот. Показана рациональность и функциональность использования хитозана в пищевых и медицинских целях. Разработана математическая модель состава коптильного геля, содержащего в качестве структурообразователя хитозан. Исследован антисептический эффект биомедицинских пленок на основе хитозана, предназначенных для предотвращения воспалительных процессов кожи.

Новизна технологического решения подтверждена Патентом РФ № 2318831 «Способ комплексной переработки рачка гаммаруса» (см. Приложение 7).

Практическая значимость работы. Разработана комплексная технология переработки балтийского гаммаруса, позволяющая получать хитин, хитозан и биовто-гидролизат, обладающие высокими качественными характеристиками, приоритет которой подтвержден Патентом РФ № 2318831 «Способ комплексной переработки рачка гаммаруса».

Разработан проект нормативной документации на изготовление из балтийского рачка хитина, хитозана и биоавтогидролизата, что позволяет получать ценные биологически активные вещества из нового сырья практически безотходно, комплексно, по эффективным технологиям. Предложены модели процессов и методики их расчетов, которые способны регулировать выход и качественные характеристики готовых продуктов. Разработаны практические рекомендации по использованию получаемых биологически активных веществ и композиций в технологии пищевых, медицинских и кормовых продуктов.

Действенность разработанных рекомендаций положительно апробирована в производственных условиях ИП «Черба» (Калининградская обл., п. Васильково) в технологии бездымного копчения рыбы. В условиях Гамбургского университета показана антисептическая функциональность хитозана в составе медицинских биопленок.

Материалы работы использованы в учебном процессе подготовки студентов, магистрантов и-аспирантов, пищевых специальностей ФГОУ ВПО «Калининградский государственный технический- университет», а также студентов Гамбургского университета (Германия), занимающихся технологиями высокомолекулярных биополимеров.

Проведена оценка экономической и социальной целесообразности реализации разработанной комплексной технологии переработки гаммаруса и применения целевых продуктов.

На защиту выносятся:

• Результаты обоснования.автоэнзимолиза с биоконсервированием в технологии комплексной переработки гаммаруса при получении хитина и хитозана.

• Зависимости формирования качества хитина и хитозана в процессе переработки гаммаруса, установленные на основных этапах технологии.

• Параметры качества, обосновывающие функциональность, достоинства и безопасность готовых продуктов переработки гаммаруса.

13 1

Апробация работы; Результаты выполненных исследований были представлены на коллоквиуме по макромолекулярной химии (Freiburg im: Breisgau, 2005), ПГ Международной научной конференции «Биотехнология: состояние и перспективы г; развития», (Москва, 2005); НПК/«Значение биотехнологии дляздорового питания и решения: медико-социальных проблем», (Калшшнград, 2005), фирме Байерсдорф АО (Hamburg, 2005), VIII Международной конференции «Современные- перспективы в исследовании хитина и хитозана», (Казань, 2006), Международном симпозиуме «Биоматериалы» и 29-ом «Гамбургском симпозиуме по макромолекулярной химии» Hamburg, 2006), Научно-практической конференции «Пищевая и морская биотехнология: проблемы и перспективы», (Калининград, 2006), V Международной научной конференции «Инновации в науке и образовании 2007», «У.М.Н.И.К.», (Калининград, 2007), ГШ Международной научно-технической конференции «Низкотемпературные и пищевые технологии в; XXI веке» (Санкт-Петербург, 2007), заседаниях кафедры.пищевой биотехнологии ФГОУ ВПО «КГТУ» 2005-07 гг.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 27 научных работ, в том числе 1 Патент РФ.

Структура и объем работы; Диссертация включает введение, литературный обзор, методическую и экспериментальную части, выводы, список использованной литературы и приложения. Работа изложена на 235 страницах стандартного текста, содержит 50 таблиц, 60 рисунков, 8 приложений, ссылки на 216 литературных источников, в том числе 79 работ зарубежных авторов:

Результаты исследования микробио;ю1"ичсских показателей приведены в табл. 3:14. л •.'/.■■- ■ . Таблица3.14

Микробиологические показатели хитозана, полученного изтаммаруса Наименование показателя Нормативный показатель Фактическое, содержание

Мезофильные аэробные и факультативно анаэробные микроорганизмы, КОЭ в 1г продукта^ не более 4*10- 3^8* 104 ;

Бактерии группы Е. соЩ Pr. vulgaris- S. aureus : в-1 г продукта Г. • .• * , ; - • • не. • допускается;; не . • обнаружены

Патоген! u>ie, в том числе сальмонеллы, ; микроорганизмы в 25г продукта /не допускается* не обнаружены

Плесневые фибы клеток в 1г, не более 2*102 1,8*10" ;

Сравнивая полученные данные с регламентированными в СанПин 2.3.2.1078-01 [103], можно констатировать, лпо но данным: санитарно-гигиеническим показателям полученньш )штозан соотве1,ствукуг требованиям, предъявляемым к биологически активным добавкам, применяемым в пищевой промышленности.

3153: Физико-химические характеристики;:

Особый интерес представляют значения, химических показателей полученных веществ. Достаточно высокий уровень содержания минеральных компонентов (0,981,51 %), среди; которых, как показали: наши исследования' (см. гл. 3.2), большая доля приходится на кальций,, позволяет говорить о целесообразности использования полученных хитина/хитозана в составе лечебно-профилактических добавок,-предназначенных для коррекции питания? в случае нарушений опорногдвигательных функций,; а именно - в качестве источника минеральных веществ биологическогопроисхождения.

Анализ данных, приведенных в табл. 3:15; показывает, что хитозан, полученный из гаммаруса, независимо от способа его конечного депротеинирования, отличается высокой степенью деацетилирования (СД. составляет 92,8 и 94,6%). Это свидетельствует о еговысоких функциональных возможностях, как полимера, способного к быстрому растворению в кислотных растворах.

По показателям рЫ и кинематической вязкости полученные биополимеры также «вписываются» в существующий банк свойств, установленных для различных по происхождению данных веществ. Так, значение вязкостной характеристики 1 %-го раствора хитозана, приготовленного в 1%-м растворе уксусной кислоты (27 сПз), позволяет рекомендовать данный полимер не только в качестве структурообразующей? добавки, обеспечивающей свойства загустителей и гелеобразователей; в системах, а также в со. ставе функциональных растворов, способных быстро биодеградировать и обладающих повышенной растворимостью (например, в качестве носителя лекарственных-веществ, экологического сорбента, в рецептуре пищевых продуктов и т.д.) [9; 39,154,169]: Результаты определения сгенсни деацетилирования (СД) хитозана мегодом

ЯМР. Степень дезацетилирования хитозана - это отношение количества глюкозамин-ных звеньев к общему числу мономерных звеньев в молекуле полимера СД хитозана -один из важнейших показателей его качества, определяющий уровень и скоросгь растворения биополимера в разбавленных кислотных растворах. Свойства хитозана, а, следовательно; и обласп> его использования значительно зависят от степени деацетилиро-вания: Поэтому очень важно определить этот показатель как можно точнее.

Ниже приведены результаты исследований, проведенные методом протонного ядерно-магнитного резонанса, позволяющие из: соотношения, интегральной площади отдельных пиков ядер водородных атомов; используя: специальные формулы, вычислить СД хитозана (см. гл. 2.2).

В данном методе исследования проводятся в режиме анализа полученных физических характеристик относительно молекулярного строения вещества На рис. 3.9 приведена структурная формула хитозана с расстановкой позиций отдельных атомов, что позволяет распознавать отдельные сигналы водородных атомов спектров полимера.

Рис. 3.9. Структурная формула хитозана с позициями атомов ррт

Рис. 3.10. Спектр ЯМР 'il хитозана (образец 1)

400 MHz, D20 + DCl): ô (ррт) = 0,00 (TMSP); 2,08 (s, CH3-ацетил); 3,23 (t, H2 - деацетилиро-ван); 3,62-3,98 (m, H2-6); 4,52 (HOD); 4,93 (d, H1-D деацети-лирован), T=70°C

Рис. 3.11. Спектр ЯМР ^ хитозана (образец 2)

400 MHz, D20 + DCl): S (ppm) = 0,00 (TMSP); 2,05 (s, CH3-ацетил); 3,23 (t,H2- деацетилиро-ван); 3,78-3,93 (m, H 2-6); 4,52 (HOD); 4,92 (d, H 1-D деацетили-рован), T = 70 °C

H 2/6 ppm

Спектры хитозана (образец 1 и 2), представленные на рис. ЗЛО - 3.11, показывают идентичное распределение атомов гликозидного кольца и ацетильной группы, входящей в боковую цепь полимера. Спектр 'н позволяет через различные соотношения сигналов атомов вычислить среднюю степень деацетилирования (СД) полимера. При этом традиционно используют три основные формулы (180, 190, см. также гл. 2.2) для расчета Точность определения СД в большей степени зависит от качества полученного спектра и его обработки, и может колебаться в незначительных пределах. На рис. 3.12-представлены сравнительные ЯМР спектры 1Н хитозана (образец 1 и 2).

Рис. 3.12. Сравнительный спектр химических сдвигов ЯМР ]Н хитозана образец 1 и 2), при 70 °С

На рис, 3.13 - 3.14 представлены широкополосные ЯМР 13С спектры хитозана (образец 1 и 2), позволяющие определить молекулярное строение вещества и рассчитать СД полимера. Ввиду относительно низкой молекулярной массы хитозана пробы были измерены без деградации полимера. Первый спектр получен при растворении хитозана в дейтерированной соляной кислоте (ОС1) во избежание наложения (перекрывания) ацетильной группы полимера и уксусной кислоты.

С4 СЗ сб

С2

2000 iL.^uJi-â ULy

T ™ ^^щг wf

НИЗШИМ 0 ppm

1 7

Рис. 3.13. Спектр ЯМР С хитозана (образец 1 )

100 MHz, DiO + DCl): 57,16 (s, C2); 61,65 (s, C6); 71,22 (s, C3); 75,95 (s, C4);

78,45 (s, C5); 98,65 (s, Cl)

CH3 от уксусной кислоты c=o от уксусной кислоты

С4 м«1 et»

11

Рис. 3.14. Спектр ЯМР ' С хитозана (образец 2, в уксусной кислоте)

100 MHz, Dp + CDtCOOD): 22,70 (CHrAcOH); 57,01 (s, C2); 61,30 (s, C6); 71,58 (s, C3); 75,76 (s, CA); 78,10 (s, C5); 90,00 (s, Cl); 170,46 (C=0, уксусная кислота)

На рис. 3.14 отображен спектр хитозана, растворенного в уксусной кислоте, где и наблюдаются пик перекрытия СН3 группы по краю спектра. Обе пробы показывают практически идентичное распределение сигналов отдельных атомов гликозидного кольца. Соотношение интенсивности сигналов к площади поверхности пиков спектра позволяет вычислить СД хитозана.

В представленной работе степень деацетилирования рассчитывали принимая во > внимание спектры протонного ядерно-магнитного резонанса (см. табл. 3.15).

Определение молекулярной массы.

Молекулярную массу (ММ) хитозана определяли двумя методами (см. гл. 2.2). На рис. 3.15 представлены результаты определения ММ методом капиллярной вискозиметрии двух образцов хитозана. На диаграмме показана зависимость концентрации кислотных растворов полимера от специфической вязкости. Расчетные значения молекулярной массы занесены в табл. 3.15.

600 п

550 с; 500

450 и 400

О.

П 350

300

250

5,Е-05 3,Е-04 5.Е-04 7,Е-04 Концентрация с (г/мл)

9,Е-04

Рис. 3.15. Кривые растворов хитозана (образец 1 и 2) для определения молекулярной массы методом капиллярной визкозиметрии

На рис. 3.16-3.17 отображены данные проб хитозана (образец 1 и 2), молекулярная масса которого определялась хроматографически, в части распределения частиц исследуемого вещества по молекулярной массе. Видно, что молекулярно-массовое распределение пробы хитозана (образец 1) лежит в пределах от 2,2x104 до 1,6x106 г/моль, а для пробы (образец 2) - в диапазоне от 6,3x104 до 3x106 г/моль. Видно, что кривая распределения молекулярной массы (Мо1шаззе), приведенная на рис. 3.17, имеет тенден циго к подъему, что может свидетельствовать об абсорбционном эффекте.

Образец 1

----DRJ

-*- MALLS • Molmasse

Элюируемый объем (мл)

Рис. 3.16. Графическое отображение сигналов: светорассеивающего (MALLS), концентрационного (DRf) и распределения молекулярной массы (Molmasse) хитозана (образец 1), установленных методом жидкостной гельпроникающей хроматографии

Образец 2

Элюируемый объем (мл) я-MALLS V • Molmasse

Рис. 3.J7. Графическое отображение сигналов: светорассеивающего (MALLS), концентрационного (DR1) и распределения молекулярной массы (Molmasse) хитозана (образец 2), установленных методом жидкостной гельпроникающей хроматографии

Расшифровкаприведенных выше данных позволяет усгановитьколичественные значения молекулярных масс (М№) анализируемых биополимеров (образец 1 и2: метод вискозиметрии - 165 и 244 кДа; метод хроматографии - 140 и 190 кДа), которые свидетельствуют об их среднем уровне [189,190,204]. Этот уровень дает основание рекомендовать» полученные вещества: также в технологии еще более1 низкомолекулярного (вплоть до; олишаминосахаров) хитозана, ^.следовательно; его водорастворимых форм -и соответствующих биологически активных композиций: Данное направление сегодня чрезвычайно актуально как в пищевой промышленности, так и медицине:

В^табл. З Л 5; приведены .обобщенные значения , физико-химических показателей двух образцов хитозана;

Заключение

Благодаря развитию теории и прикладных методов науки о биополимерах постоянно- возрастают возможности получения и применения уникальных природных полиаминосахаров — хитина и хитозана. Последние постепенно вытесняют синтетические аналоги из различных отраслей промышленности, приобретая устойчивую популярность и доверие у населения. Данная, ситуация обуславливает необходимость и рациональность изыскания новых сырьевых источников и технологий получения названных продуктов. В основе более совершенной технологии должна находиться комплексная переработка хитинсодержащего сырья, предусматривающая передовые методы его обработки (автодеградацию, биоконсервирование, щадящую химическую экстракцию, лиофильную сушку и др.). При получении биополимеров из нового биологического сырья необходимо, прежде всего, изучить его состав и функционально-технологические свойства конечных продуктов - молекулярную массу, вязкость, наличие примесей и т.д., а также функциональные свойства (способность растворяться, формировать гели, проявлять барьерные свойства и др.) Знание данных характеристик позволит обосновать рациональные направления использования целевых продуктов и тем самым открыть новые возможности в их применении.

Высокое содержание хитина в рачке гаммарусе и устойчивые сырьевые запасы в Балтийском регионе позволяют отнести его к доступному и перспективному источнику получения заданных биополимеров. Комплексная технология переработки данного рачка с применением автоэнзимолиза в биоконсервированной системе позволит максимально полноценно переработать данное сырье в щадящих условиях, получая наряду с функциональными хитином и хитозаном важный дополнительный продукт — биоавто-гидролизат, предназначенный для кормовых и микробиологических целей.

На реализацию сказанного направлена данная диссертационная работа, задачи которой последовательно и логично отражают достижение поставленной цели.

2.1. Схема исследований

Экспериментальные работы выполнялись в соответствии с аналитической схемой, приведенной на рис. 2:1.

Анализ современного состояния вопроса^ обзор литературных источников; обоснование актуальности работы

Формулирование целей и задач исследований .

Сравнительный анализ технологиихитина/хитозана Обоснование биотехнологического подхода в производстве хитина/хитозана из гаммаруса;

Изучение процесса получения хитин^хитозана с применением промышленных и собственных ферментов гаммаруса Ж

Обоснование областисугцествования, моделирование и оптимизация процесса а втоэнзимолиза гаммаруса методом математического планированияэксперимента

-. "' "' " "■"' ~~~~

Разработка технологической схемы получения <; хитина/хитозана из гаммаруса с применением процесса автоэнзимолиза и биоконсервирования Ж

Изучение качественных характеристики физико-хймических свойств хитина и хитозана изваттагиз 1асив1гт Ж ж

Обоснование технологии получения белкового гидролизата и его характеристика у= ~—

Разработка рекомендаций по практическому использованию полученного хитозана и белкового гидролизата

Р^^отма-провкга-НД не! хитин/хитозан пищевой, полученный при комплексной переработке гаммаруса с применением автоэнзймолйза'с биоконсервированием: у.

Разработка йсходныхтребований на технологическое оборудование для изготовления хитина/хитозана и белкового гидролизата

3.

Производственные испытания хитозана Ж

Получение опытной партии рыбы холодного копчения с применением геля на основе хитозана (ламинированной) и определение качества готовой продукции И

Получение :хитозановых мембран для медицинских целей и изучение их функциональных свойств Ж

Обоснование-эффективности разработки

Рис. 2.1. Схема экспериментальных исследований

2.2. Методики исследований

В экспериментальных образцах гаммаруса, полуфабрикатах и готовых продуктах (хитин, хитозан, белковый гидролизат, рыба холодного копчения, хитозановые пленки и др.) определяли следующие показатели качества:

2.2.1. Органолептические показатели (внешний вид, цвет, запах, вкус) оценивали по ТУ 15-01-472-87, ТУ 9289-067-00472124-97, ТУ 15-1207-96 на рыбу х/к ламинированную, а также с применением специально разработанных органолептических балловых шкал (см. гл. 3).

2.2.2. Физико-химические характеристики:

2.2.2.1. Массовые доли воды, жира (липидов), общего азота, минеральных веществ (золы), отдельных микроэлементов определяли по ГОСТ 7636.

2.2.2.2. Качественный и количественный состав тяжелых металлов и микроэлементов оценивали методом атомно-абсорбционной спектроскопии по ГОСТ 30178-96 [164, 184, 185]. Сущность данного-метода заключается в-растворении пробы и введении ее растворов в виде аэрозоля в пламя для'испарения в графитовом анализаторе с целью получения светопоглощающего атомарного пара (термическое разложение растворенной пробы на атомы), его облучении источником света, разложении света и выделении линии поглощения. Далее осуществлялась оценка оптической плотности стандартных и анализируемых растворов, определение градуировочной характеристики и расчет концентрации определяемого компонента. При анализе тяжелых металлов хитозана также был использован метод атомно-абсорбционной спектроскопии, включающий пламенную и графитную техники измерения с использованием паров охлаждающего агента. Исследования проводились на оборудовании Perkin Elmer 5000, Perkin Elmer 4100 ZL и Spectro Merc Hg-Analysator (Германия, Гамбургский университет).

2.2.23. Определения содержания хитина в гаммарусе и продуктах его переработки вели методом, основанным на выделении частиц хитина растворителем и определении в них азота макрометодом по ГОСТ 7636.

2.2.2.4. Определение протеолитической активности собственных ферментов гаммаруса формольиым титрованием. Сущность метода заключается в определении массовой доли азота концевых аминогрупп методом формольного титрования.

Определение активности ферментного препарата протосубтилина Г20Х проводили по методу Ансона по ГОСТ 20264.4. Сущность метода заключалась в оценке активности коммерческого фермента протосубтилина по количеству тирозина, содержащегося в продуктах протеолиза, не осаждаемых трихлоруксусной кислотой.

2.2.2.5. Определение массовой доли частиц депротеинизированого панциря проводили по ГОСТ 7636. Метод основан на выделении панциря из анализируемого продукта щелочным гидролизом и весовом определении его.

2.2.2.6. Определение выхода Д-глюкозаминахлоргидрата хитина вели путем гидролиза хитина концентрированным раствором соляной кислоты для выделения образовавшегося Д-глюкоэаминахлоргидрата с последующим определением его массовой доли [106,125].

2.2.2.7. Определение степени деацетилирования хитозана (СД) вели двумя методами.

1. Потенциометрическое титрование [88, 190]. Определение СД основано на обратном алкалиметрическом потенциометрическом титровании хлористого водорода, связанного с аминогруппами молекул хитозана, в солянокислом растворе, который проводили автоматически с помощью титриметрической установки и вручную с помощью бюретки и рН-метра. Раствор продукта титровали раствором гидроокиси натрия, вычисляли разность объемов титранта, которая соответствует значению объема титранта, пошедшего на титрование солянокислого хитозана (с/Кд<аои в см ). СД (в %) вычисляли по формуле:

203,2-100)

СД = с

42,0 +1000 ■ --—

С -¿V

V КаОН и * КаПИ У

1) где: то - масса хитозана в навеске, г;

Скюн ~ точная концентрация раствора гидроокиси натрия, моль/дм3; dVNaOH - объём- раствора гидроокиси- натрия; пошедший на титрование аминогрупп, см3;

203,2; 42,0; 100; 1000 - пересчётные коэффициенты.

2. Метод1Н;13С ядерно - магнитного резонанса (ЯМР) [42, 146, 151, 155, 180]. Метод основан на взаимодействии: внешнего магнитного поля с ядрами; молекул,, имеющими магнитный момент (ядрами с ненулевым спином). К ним относятся 'Н, l3C, 15N, 35Р и другие. ЯМР на ядрах 'Н в настоящее время наиболее развит и получил название протонный магнитный резонанс (FIMP): Возбуждение: ядер осуществляют не "постоянной волной", а. с помощью короткого импульса продолжительностью в несколько микросекунд: В результате импульсной: спектроскопии - получают изображение затухающих резонансных колебаний; в котором смешаны все сигналы от всех резонирующих ядер - так называемый "спад свободной индукции" (PID,/га? indiiction decay). Для преобразования! данного спектра используют математические методы (так называемое Фурье-преобразование); по которому любая функция может быть представлена в виде суммы множества гармонических колебаний. Г

Измерения образцов проводили на приборе Bruker Avance 400 Spectrometer (Rheinstetten; Германия) при температуре 70°С. Время релаксации, составляло - 5 секунд. .

СД хитозана (в %) рассчитывали по формуле (2) [180]:

СД(%) = Г-- —-1-100 (2)1

J [то + нлс/ъ) w

2.2.2.8. Определение молекулярной массы, хитозана расчетным методом вели с предварительным измерением- вязкости уксуснокислых растворов;^ полимера [49, 50, 106, 178]. Динамическую вязкость определяли, капиллярнымвискозиметром. Уббелоде тип 1с на приборе фирмы Schott-Geräte (Hofheim, Германия): Сущность метода заключается в измерениишремени истеченияюпределенного объема испытуемой; жидкости под влиянием силы тяжести. Навеску хитозана растворяли в уксусной кислоте и/или в ацетатном буферном растворе (0,5М СН3СООН/ 0,2 М NaOH). Измерения производили при постоянной температуре, равной 25°С, поддерживаемой с помощью термостата.

В ходе измерения получали ряд зависимости специфической вязкости от концентрации уксуснокислого раствора хитозана, необходимых для вычисления индекса Штаудингера [г|]. Это величина характеризует вязкостные характеристики системы «полимер-растворитель». Штаудингер-индекс (Staudinger index) исследуемого раствора хитозана (в мл/л) вычисляли по калибровочному графику (рис. 2.2).

112.00 -,

110,00

108,00

106,00 ь. С 104,00

102,00

Л * 100,00

9В,00

96,00

94,0(/^

92,00

6.00Е-03 7,00Е -03 8.00Е-03 9.00Е-03 1.00Е-02 1.10Е-02 1.20Е-02 1.30Е-02 Концентрация с [г/мл ]

Рис. 2.2. Зависимость Штаудингер-индекса tjq/c от концентрации раствора с

Для определения Штаудингер-индекса прямую зависимости концентрации измеряемого раствора от специфической концентрации г^ проводили до пересечения с осью ординат [г|] с последующим использованием полученных значений в уравнении (3): = [77] + Кп [i]f • с Уравнение Хаггинса [178] (3) с

Молекулярную массу (ММ) полимера рассчитывали по уравнению Марк-Хаувинка (Mark-Houwink) [177,178] (4):

H = VMe (4) где: [т|] - индекс Штаудингера, мл/л; кл, а — соответствующие константы;

М- вискозиметрическая молекулярная масса пробы, г/моль. Подставляя параметры коэффициентов в уравнение Тербоича [172, 190] (5), получаем:

77] = 3,5 • 10"2 • М0 76 (Terbojevich) (5)

2.2.2.9. Определение молекулярной массы хитозана* методом жидкостной гель-проникающей хроматографии'[7, 170, 175, 188, 190] вели на специальной комбинированной установке, включающей SEC (Size Exclusion Chromatography), MALLS (Multi Angle Laser Light Scattering) и DRI (Differential Refractometer).

Для подготовки пробы к анализу определенное количество хитозана растворяли в ацетатном буферном растворе (0,5 M НАс/0,2 M NaAc). Полученный раствор фильтровали с помощью нейлонового фильтра (размер пор 11 мкм). Разделение раствора хитозана на компоненты проводили с помощью четырех хроматографических колонок TSK-PWXL (30,40, 50, 60) фирмы TosoHaas (Stuttgart, Германия). При измерениях также использовали рассеивающий фотометр фирмы Wyatt Technology Corp., Santa Barbara, USA, с He-Ne-лазером (Ào = 632,8 nm). Определение концентрации раствора проводили с помощью дифференциального рефрактометра фирмы Shodex RI SE-71 (Showa Denko, Tokyo, Япония). Для вычисления- полученных данных использовали прирост показателя преломления, равный для*хитозана dn/dc = 0,19 [172]. Расчет вели с использованием пакета программы Astra 4.9.1.

2.2.2.10i Устойчивость* хитозана (хитозановых мембран)к тепловому воздействию определяли методом дифференциально-термического анализа (ДТА), основанного на регистрации изменения массы образца в зависимости от его температуры в условиях программированного изменения температуры среды. Возможны два способа проведения ДТА: 1 - изотермический, т.е. проводимый при постоянной температуре печи, и 2 - динамический, основанный на изменении температуры печи во времени при постоянной скорости нагрева. Последний был реализован в данной работе. В'результате эксперимента были получены, дифференциально-термическая (ДТА) и термогравиметрическая (ТГ) кривые зависимости изменения массы образца от температуры.

При подготовке к анализу образец хитозана массой 20 мг или хитозановой пленки (10мм х 10мм) сжигали в печи (температура от 22°С до 300°С) при скорости нагревания пробы 0,2 и 5 К/мин. Измерения проводили на дериватографе STA 409, NETZSCH (Германия). Обработку данных осуществляли с помощью программы NETZSCH Proteus — Thermal Analysis.

2.2.2.11. Исследования реологических свойств биополимеров-вели по оценке 1-4% растворов хитозана в уксусной кислоте [49, 67,111,147, 149, 166, 171, 177]. Вязкость и вязко-эластичные свойства растворов хитозана, их характер текучести определяли по изменению величины динамической вязкости растворов. Определения проводили на свежее при готовленных растворах полимера, а также хранившихся в течение 1-4 суток.

Для проведения измерений пробу хитозана (1-4 г) растворяли в 1% -м растворе уксусной (или 0,5М/0,2М ацетатном буферном растворе) в течение 1-3 ч. Полученный раствор исследовали на реометре ТА Instruments Rheometric Series ARES Rheometer (TA Instruments, Newcastle, DE, USA) с использованием фиксируемых насадок (плата-плата (plate and plate) диаметром 25 и 50 мм, определяя зависимость эффективной вязкости раствора хитозана от скорости сд вига.

2.2.2.12. Определение жирнокислотного состава липидной фракции сушеного гаммаруса и белкового гидролизата определяли методом капиллярной газовой хроматографии [137] на газовом хроматографе HP 6890 Series GC System (Германия). Подготовка пробы основана на предварительной экстракции жира в экстракторе (типа Сокслета) с последующим щелочным гидролизом триглицеридов до свободных жирных кислот и получением реакцией этерификации метиловых эфиров жирных кислот. Хроматографическое разделение метиловых эфиров жирных кислот проводили на газовом хроматографе HP 6890 Series GC System (Германия) (см. рис 2.3, табл. 2.1) с пламенно-ионизационным детектором и установленной капиллярной колонкой фирмы J&WDB-WAXEtr длинною 30 метров, внутренним диаметром 0,25 мм и толщиною фазы 0,25мкм. Обработку хроматограмм проводили с использованием программного обеспечения HP-Chem Station.

Технические характеристики хроматографа HP 6890 Series GC System (Германия) представлены в табл. 2.1.

1. Адлер Ю.П. Планирование эксперимента при поиске оптимальных условий / Ю.П. Адлер, ЕБ. Маркова, Ю.П. Грановский. М., 1976: - 280 с.

2. Т. Албулов > А.И. Хитозан в косметике. Хитин и хитозан Получение, свойства- и . применение / А.И:;Албулов, АЖ Самуйленко,.М.А. Фролова: М:, 2002. - С. 360-363. "V .-v-' • •

3. Абдулин В.Ф! Технология и свойства биополимера хитозана из панциря речного рака:, автореф. дисс. .канд. техн. наук: 05^17.06 Технология! и переработка полимеров и композитов / Сарат. ГТУ; В.Ф. Абдулин. - Саратов, 2006. - 20 с.

4. Т.М. Сафронова. М:, ВИИРО,. 1993. - С. 60-75. ' V

5. Борисочкина Л.И: Безотходные технологии нерыбных объектов / Л.И. Борисочкина//Рыбное хозяйство. 1989. - №6. - С. 89-92.1.. Быканова О.Н. Перспективы использования, хитозана в качестве БАД к пище /

6. О.Н. Быканова, С.Н; Максимова, Г.А. Тарасенко // Современные перспективы» в исследовании хитина и хитозана: седьмая междунар. конф. (12-17 июня): материалы / КГГУ. Казань, 2006. - С. 275-276:

7. Быков В.П.Технологаякомплексной переработки панцирьсодержащих отходов. криля / В.П. Быков, В.М. Быков, С.В. Немцев // Краткие результаты научной деятельности института за1988 г. /ВНИРО:.- Москва; 1988:- С. 22-25:,

8. Быков В.П: : Сырье рыбной- промышленности и комплексная - технология антарктического криля:/. Быков: B.I I. // Технология: переработки гидробио!пов: междунар.конф.:материальг/ВНИРО.-Москва,1994.-С.35-42

9. Быков В.П: Состояние исследований и перспективы организации-производства хитозана из ракообразных / Быков ВЛ1. //Технология рыбных продуктов: труды / ВНИРО. Москва, 1997. - С. 208-221. \

10. Быков В.П: Получение хитозана из гаммаруса; / В.П. Быков, Д.И. Фурман // Новые перспективы в исследовании: хитина? и хитозана: пятая науч. конф.: материалы / ВНИРО. -1999. С. 18-21.

11. Быкова В.М. Сырьевые источники и способы- получения?хитина?и; хитозана.' Хитин и хитозан. Получение, свойсгваиприменение/ В.М. Быкова, С.В. Немцев. М:, 2002: - С. 7-23.

12. Василькова Г.М. Производство пищевых шдролизатов из объектов морского промысла / Г.М. Василькова, А.Пг Ярочкин // Рыбное хозяйство. 1983. - №5. - С. 65-67:

13. Вихорева Г.А. Плёнки и волокна на основе хитина и его производных. Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение / F.A. Вихорева, JT:C. Ральбрайх. -М., 2.002.-С. 254-279.

14. Водолажская С.В: Гаммарус перспективный источник для получения хитина; хитозана и белковых гидролизатов, / С.В. Водолажская, ИЛО. Козлова, Е.Э. Куприна// Академия. - 1997. - №4. - С. 56-57.

15. Водолажская С.В. Технология получения белковых гидролизатов электрохимическим способом1 для производства микробиологических питательных сред: автореф. дисс. канд. техн. наук / СПбГТИ (ТУ); С.В. Водолажская. СПб, 2001. - 20 с.

16. Горовой Л.Ф., Косяков В.Н. Сорбционные свойства хитина и его производных. Хитин и хитозан: получение, свойства, применение / Л.Ф. Горовой,- В.Н. Косяков; под ред. К.Г. Скрябина, В.П. Варламова. М., 2002. - С. 368.

17. ГОСТ 7636-85 Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Методы анализа. М., 1985. -142 с.

18. ГОСТ 7631-85 Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Правила приема, методы оценки качества, методы отбора проб для лабораторных испытаний. М., - 1985.

19. ГОСТ 10444.12-88 Продукты пищевые. Методы определения дрожжей и плесневых грибов. М., - 1988.

20. ГОСТ 28560-90 Продукты пищевые. Метод выявления- бактерий рода Proteus, Morganetta, Providencia. М., - 1990.

21. ГОСТ Р* 50474-93 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечной палочки (колиформных бактерий). М., -1993.

22. ГОСТ Р 50480-93' Продукты пищевые. Метод выявления бактерий' рода Salmonella.-Ы.,-\99Ъ.

23. ГОСТ 10444.2-94 Продукты пищевые. Методы выявления и определения Staphylococcus aureus. М., - 1994.

24. ГОСТ 10444.15-94 Продукты пищевые. Методы определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов. М.,1994.

25. ГОСТ 30178-96 Сырье и продукты пищевые. Атомно-абсорбционный метод определения токсичных элементов. М., - 1996.

26. Государственная фармакопея СССР XI издания. М., 1987. - ч. 1,2.

27. Грезе И.И. О количестве хитина и кальцита в панцирях бокоплавов (АтрЫросЬ, Саттапска) / И.И. Грезе // Зоологический журнал. 1967. — Т. ХЬУ1, Вып.11. -С. 1655-1658.

28. Григорьева-Е.В. Жирнокислотный состав липидной фракции рачка гаммаруса и получаемого из него белкового биоавтогидролизата' / Е.В. Григорьева, О.Я. Мезенова // Рыбная промышленность. М., 2007. - №2. - С. 26-28.

29. Григорьева Е.В. Комплексная переработка балтийского гаммаруса с целью получения хитина, хитозана и белкового гидролизата / Е.В. Григорьева, О Л. Мезенова // Известия вузов. Пищевая технология Краснодар, 2007. - №3. - С. 3032.

30. Григорьева Е.В. Комплексная переработка балтийского гаммаруса с целью получения хитина, хитозана и белкового гидролизата / Е.В. Григорьева, ОЛ.

31. Мезенова // V Международная научная конференция, посвящ. инновациям в науке и образовании 2007 (23-25 оьсг.): доклады номинации «У.М.Н.И. К.» /КГТУ. Калининград, 2007. - С. 71-74.

32. Понтер X. Введение в курс спектроскопии ЯМР / X. Понтер. М., 1984. - Гл. 14,10.

33. Дацун В.М. Вторичные ресурсы рыбной промышленности. Использование высокоминерализованных отходов / В.М. Дацун. М., 1995. - 96 с.

34. Дацун В.М. Биологически активные вещества. Технология продуктов из гидробионтов / В.М. Дацун, Б.Н. Семенов; под ред. Т.М. Сафроновой, В.И. Шендерюка. М., 2001. - С. 448-486. ■

35. Дацун В.М. Кормовые продукты. Технология продуктов из гидробионтов / В.М. Дацун М., Колос, 2001. - С. 403-432.

36. Дехант И. ИК спектры полимеров / И. Дехант, Р. Данц M., 1976. - 463 с.

37. Децина А.Н. Белковые гидролизаты / А.Н. Децина, А.Г. Бачинский, В.И. Байбаков // Обзорн. инф. / ВНИИСЭНТИ. М., 1985. - Вып. 3. - 68 с.

38. Дутова E.H. Техническая микробиология рыбных продуктов / E.H. Дутова, М.М. Гофгарм, И.И. Призренова М., 1976. - 266 с.

39. Евдокимов И.А. Физико-химические характеристики растворов хитозана / И.А. Евдокимов, C.B. Василисин, JT.P. Алиева // Вестник СевКавГТУ, Сер. Продовольствие. 2003. - №1(6).

40. Евдокимов И.Н. Молекулярные механизмы вязкости жидкости и газа. 4.1, Основные понятия / И.Н. Евдокимов, Н.Ю. Елисеев.—М., 2005. 59 с.

41. Инструкция по санитарно-микробиологическому контролю производства пищевой продукции из рыбы и морских беспозвоночных (МЗ СССР № 5319-91

42. ОТ22:02.91).-м;,-.1991. • -.':"■;'; . . '

43. Куприна Е.Э. Способы получения и активации хитина и; хитозана. Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение / Е.Э. Куприна, С.В. Володажская; под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. М., 2002; - С. 44-63.

44. Курко В.И. Метода исследования процесса копчения и копченых продуктов / В.И. Курко М.,1977. - Вып. 192. ;

45. Курко В.И. Основы бездымного копчения /В.И. Курко. М., 1984; - Вып. 232.

46. Лебская Т.К. Химический состав и биохимические свойства гидробионтов прибрежной зоны Баренцева и Белого морей / Т.К. Лебская, Ю.В; Двинин, Л.Л.1. ■■ •• . • ■ ■•;; ■ ■■;■••-.•■. •.'■.■ . " ■ ■. мв - ' '. . • .: . . ■ . .

47. Констнтинова. Мурманск, ПИНРО, 1998. - С. 102-108. .

48. Г. Фармакогнезия: уч. Пособие / под ред. Г.П. Яковлева. СПб., 2006: - С.522-525.

49. Людгрюс Л.Л. Возможности использования ферментных .препаратов врыбообработке / Л.Л. Людгрюс //' ЦНИИГЭИРХ. Серия «Обработка рыбы и морепродуктов». - М., 1982: - Вып. 10. - С. 16-21.

50. Максимова О.Н. Антимикробная активность разномолекулярного хитозана в ' пищевых средах / С.Н. Максимова,. Е.В. Ситникова, ИЛ I. Ким и др. //

51. Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана: седьмаямеждунар. конф. (12-17 июня): материалы/Казань, 2006.- С. 296-298; ч

52. Мезенова О.Я. Разработка способа горячего копчения рыбы с применением коптильных препаратов и электростатического поля: дисс. канд. техн. наук:: 05.18.04 Технология мясных, молочных и рыбных продуктов / КТИРПХ; О.Я.

53. Мезенога:-Калининград, 1986;-248 с; •69: Мезенова О.Я. Научные основы. и технологии производства копченых продуктов: уч. пособие/ КГТУ;Ь^Я. Мезенова.-Калининград,,1997.-134с.,

54. Мезенова О.Я. Обоснование принципов технологии рыбных продуктов при использовании дифференциальных жидких коптильных сред / Мезенова О Л. -Калининград, 2000. 287 с.

55. Мезенова* ():Я. Получение хитина; и хитозана* из балтийского гаммаруса / О.Я. Мезенова, A.C. Лысова; Е.В. Григорьева // Наука, и образование — 2003:• Всероссийская 11ауч.-тех11. конф.: .материалы / М1 '1У. Мурманск, 2003. - 4:4. - С.• 202. .

56. Мезенова 0:Я. Технология получения хитин/хитозана из сушеного-гаммаруса с применением автоферментолиза / ОЛ: Мезенова, A.C. Лысова; Е.В. Григорьева,; С.М. Вильт// Известия Kl ТУ: научный журнал. 2004: - №5. - С. 72-76.,

57. Мезенова О.Я. Биотехнологический способ получения < хитозана: из Гаммаруса Балтийского>7 О.Я. Мезенова, A.C. Лысова; Е.В: Григорьева // Биотехнология:. состояние: и перспективы развития:, третий междунар. Конгресс: материалы. / Москва, г 2005.-С. 29.

58. Мезенова 0:Я. Совёршенствование.технологии хитина/хитозана из балтийского гаммаруса:/ ©^.Мезенова; E.B; Григорьева?// Современные перспективы в исследовании; хитинам и хитозана: восьмая; междунар. конф. (12-17 июня): материалы / Казань, 2006. С. 40-42.

59. Мезенова ОЛ. Технология комплексной^ переработки гаммаруса / О.Я. Мезенова, Е.В. Григорьева//Рыбная промышленность. 2006. - №3. - С. 22-23:178 л /.У

60. Мезенова О.Я. Биотехнология; морепродуктов / О.Я. Мезенова, Л.С. Байдалинова, А.С. Лысова М., 2006. - 560 с.

61. Мищукова Л.М. Химический состав; и. энергетическая ценность озерного бокоплава / А.М. Мищукова// Гидрологический журнал. 1986. - Т.22. - №1. - С.. ■ 61-64. ■ ' • / . . ■■ ; . . " .,;• .'' .

62. Моделирование и оптимизация технологических процессов- производства продуктов питания путем математического планирования эксперимента: метод, указания /КТТУ; О.Я: Мезенова. Калининград, 1995. - 50 с.

63. Немцев С.В. Хитозан из подмора новый продукт! пчеловодства / С.В. Немцев,-ОДО. Зуева,-.РЖ ^сма1улин//Ичел6юдстао:--2001с.--№5:.- 'С/50^5Ь85. , 11емцев С.В. Кутикула жуков станет новым источником хитина и хитозана / С.В.

64. Немцев, О.Ю. Зуева, В.Я. Исмаилов, В.П. Варламов // Современные иерсиекгавьт в исследовании хитш!а и хитозана: седьмая междунар. конф. (15-18 сент.): материалы / ВНИРО. СПб, 2003. - С. 36-38.

65. Неумывакин И.П. Алоэ. Мифы и реальность / И.П. Неумывакин. М., 2007. -128с.

66. Новиков М.Ю. Кинетика реакции деацетилирования хитина и хитозана / М.Ю. Новиков, Т.А. Орлова, И.Е. Веронина // Изв. Высш. Учебн. Завед., Сер. Пищевая Технология. -1990. №5. - С. 54.

67. Нудьга JI.M. Получение хитозана и изучение его фракционного состава / Л.М: 1 Нудьга, Е.А. Плиско, С.Н. Данилов // Журнал органической химии. — 1971. Т.1. XLI.-C. 111.

68. Панова B.C. Биохимический состав некоторых беспозвоночных / B.C. Панова, ' И.К. Трубачева, В.П. Барашков // Гидробиологический'журнал. 1982. - Т. 18; -№4. - С. 58-62.

69. Пат. 4199496 США, Способ получения хитозана / К.П. Пенистон, Э.Л. Джонсон. Перевод с англ. КЕЧ9121 ( Patent US 4199496 А). - Киев. -1984. - 20 с.

70. Пат. 2000066 РФ, Способ переработки мелких ракообразных с получением хитозана / В.П. Быков и др. (Россия). -1992.

71. Пат. 2123269 РФ, Способ безотходной комплексной переработки хитинсодержащего сырья / С.В. Левоньков, Н.М. Купина, Ю.Г. Блинов (Россия). -2003.

72. Пат. 2318831 РФ, Способ комплексной переработки рачка гаммаруса / О.Я.

73. Мезенова, Е.В. Григорьева (Россия). 2006.

74. Перетрухина А.Т. Практикум по общей микробиологии / А.Т. Перетрухина. -Мурманск. 1998. - 171 с.

75. Ржавская Ф.М. Жиры рыб и морских млекопитающих / Ф.М. Ржавская. М., 1976.-470 с.

76. Рогов И.А. Электрофизические методы обработки пищевых продуктов / И.А. Рогов.-М:, 1988.-272 с.

77. Роговина С.З. Твердофазная модификация хитина и хитозана в. условиях механического воздействия. Хитин и хитозан. Получение, свойства, и применение / С.З. Роговина; под ред. Т.М.' Сафроновой, В.И: Шендерюка. М., 2002. -С. 64-78.

78. ЮГ. Розенталь А.Д: Биотехнологические основы, переработки панциря антарктического криля: автореф. дисс. канд. биол. наук / ЛТИ им. Ленсовета; А.Д. Розенталь. Ленинград, 1988. - 17 с.

79. СалемОмер А. Разработка технологии получения хитина и хитозана из сепиона каракатицы: автореф.*дисс:. канд. техн. наук / А. Салем Омер Москва, 1995. -24 с.

80. СанПиН 2.3.2.1078-01- Гигиенические требования» безопасности и пищевой ^ ценности пищевых продуктов. М., 2001 i

81. Сафронова Т.М. Биохимические свойства хитинсодержащего сырья / Т.М. Сафронова, Г.П. Выговская, Т.Д: Щеголева // Э.И: ЦНИИТЭИРХ. М., 1974. -Вып.11.-С. 3-7.

82. Сафронова Т.М. Аминосахара промысловых рыб и беспозвоночных и их роль в формировании качества продукции / Т.М. Сафронова. М., 1980. - 280 с.

83. Сафронова Т.М. Производство кормовых, технических и медицинскихпродуктов из криля / Т.М. Сафронова, В.М. Дацун, В.Д. Богданов. Владивосток,1985.-71 с.

84. Сафронова Т.М. Применение хитозана в производстве пищевых продуктов. Хитин и хитозан.1 Получение, свойства и применение / Т.М. Сафронова; под ред. Т.М. Сафроновой, В.И. Шендерюка. М., 2002.- С. 346-359.

85. Семенова Н.К. Разработка технологии консервирования хитинсодержащих отходов переработки ракообразных / Н.К. Семенова. Владивосток, 1999: - 30 с.

86. Сенкевич Т. Молочная сыворотка: переработка и использование вагропромьпшгенном комплексе / Т. Сенкевич, K.JI Ридель. М., 1989. - 253 с.

87. Сидорчук Н.В. Использование некоторых белковых гидролизатов для приготовления питательных сред / Н.В. Сидорчук, Г.И. Яринова, H.H. Лизько // Микробиологическая промышленность. -1971. №8. - С. 11-13.

88. Скляр А.М. Исследование реологических свойств разбавленных и умеренно концентрированных растворов хитозана / А.М. Скляр, А.И. Гамзазаде, JI.3. Роговина // Новое в реологии: материалы XI Всесоюзного симпозиума по реологии // Суздаль, 1981. С. 86.

89. Скопцов В.А. Рост, обмен озерного бокоплава при разных температурах /

90. B.АСкопцов // Экология. -1981. №2. - С. 97-98.

91. Современные тенденции в способах получения и применения хитина и хитозана / Е.Э. Куприна, И.Ю. Козлова, К.Г. Тимофеева // Серия Обработка рыбы и морепродуктов: инф. пакет ВНИПКИЭИАСУРХа. М., 1999. - Вып. 3(1). - 60 с.

92. Спиридонов A.A. Планирование эксперимента: уч. пособие / A.A. Спиридонов, Н.Г. Васильев. Свердловск, 1975. - 150 с.

93. Справочник Антарктический криль / под ред. В.М. Быкова М., 2001. - 208 с.

94. Справочник по химическому составу и технологическим свойствам водорослей, беспозвоночных и морских млекопитающих./ под ред. В.П. Быков. М., 1999. - С. 118.

95. Стыскин E.J1. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография / E.J1. Стыскин, Л.Б. Ициксон, Е.В. Брауде М., 1986. - 213 с.

96. Султанов 3.3. Производство микробиологических питательных сред из отходов / 3.3. Султанов, М.М. Меджидов, Э.Д. Степанова // Рыбное хозяйство. 1991. - №6.1. C.74-75.

97. Телишевская Л.Я. Белковые гидролизаты. Получение, состав, применение / Л.Я. Тслишевская. М., 2000.—296 с.

98. ТУ 15-02-538-89 Хитин для производства Д(+)-глюкозамина гидрохлорида. М., 1989. • '■/'.■'.' '.■■"■/:•:.,. ' .: , у126. '1У 9289-067-00472124-97 Хитозан пищевой. М, 1997. • .

99. ТУ 9289-003-42260732-97 Гаммарус для.промышленной переработки. М.', 1997:128: ТУ 9283-024-0476492-2002 Гаммарус кормовой сушеный. М.,2002.

100. Утеушёв Р.Р. Разработка технологии/ комплексной, переработки панцирьсодержащего сырья из ракообразных Волга-Каспийского . региона: автореф. дисс. канд. техн. наук / Астраханский I ТУ; Р.Р. Уюушев. Москва,2006.-26с. ■• '■■:;•■,.':.;• .v . ; ■■'■:. ' '

101. Феофилова Е.П. Хитин мицелиальных грибов: методы выделения, идентификации и физико-химические свойства / Е.П: Феофилова, В.М. Терешина, A.C. Менорская // Микробиология. -1995. Т. 64. - №1. - С. 26-30.

102. Феофилова Е.П. Перспективные источники получения хитина из природных объектов / Е.П: Феофилова, В.М. Терешина // Новые перспективы висследовании хитина и хитозана: V Всероссийская конф. (25-27 мая): материалы / ВНИРО. Москва-Щелково, 1999. - С. 76-78.

103. Франченко Е.С. Получение и использование хитина и хитозана из ракообразных / Е.С. Франченко, М.Ю. Тамова. Краснодар. - 2005. - 110 с.

104. Франченко Е.С. Получение хитозана из панциря речных раков / Е.С. Франченко, М.Ю. Тамова, ИМ." Сорокоумов и др. // Известия высших учебных заведений. Сер. Пищевая технология.»-2005. 5-6(288-289). - С. 125-126.

105. Цибизова М.Е. Разработка технологии получения белковых продуктов из отходов t рыбообрабатывающих предприятий: дисс. канд. техн. наук / Астраханский РТУ; М.Е. Цибизова. Астрахань, 2001. - 24 с.136. www.zoomir.spb.ru. гаммарус

106. Adam K.P. Analytik biogener Arzneistoffe. Phaimazuetische Biologie / K.P.' Adam, H. Becker. Stuttgart, 2000: - Band 4.

107. Advances in Chitin science, Volume IV, EUCHIS'99 The European Chitin Society / M.G. Peter. Potsdam, 2000. - 650 p.

108. AI-Bahra M.M. Darstellung von Chitinderivaten zur antimikrobiellen Ausrüstung von Textilien: Dissertation / Technische Hochschule Aachen; M.M- AI-Bahra. Aachen, 2004.-234 S.

109. Arndt K.-F. Polymer Charakterisierung / K.-F. Arndt, G. Müller. Dresden, Merseburg, 1996. "

110. Balau L. Physico-chemical properties of Chitosan films / L. Balau, G. Lisa, M: I. Popa // Central European J.of Chemistiy. 2004. - 2(4). - P. 638-647.

111. Bandemer H. Statistische Versuchsplanung/H: Bandemer, A'. Bellmann Stuttgart, 1994.-164 S.

112. Burchard W. Static and dynamic light scattering from branched polymers and biopolymers/ W. Burchard//Advances inPolymer Science. 1983,48. - P. 1-124.

113. Barnard J.L. & CH:M. Barnard. Freshwater Amphipoda of the world. I. Evolutionary Patterns, II. Handbook and bibliography / Barnard J.L. & CH:M. Barnard: Mt. Vernon, 1983.-830 p.

114. Callaghan P.T. H-l NMR! spectroscopy of polymers under shear and extensional flow / P.T. Callaghan, A.M. Gil//Rheologica Acta:-1999. 38(6). -P. 528-536.

115. Clasen* C. Formation and Characterisation of Chitosan Membranes / C. Clasen, T.A. Wilhelms, W.-M. Kulicke // Biomacromolecules. 2006. - 7(11). - P. 3210 - 3222.

116. Claußen T. Antibakterielle Aktivität der Chitosanhaltigen Wundauflage Chitoskin in vitro / T. Claußen, P. Mayer, P. Heisig // Zeitschrift fur die Wundversiegelung. 2006. -Nr.6. - S. 230-234.

117. Dais P. High-field 13G-NMR spectroscopy of b-D-glucans, amylopectin, and glycogen / P. Dais, A.S. Perlin // Carbohydr. Res. -1982. -100. P: 103-116.

118. Dostovalova A.I. Chitosanous gel influence on<microbe semination of burned wound / A.I. Dostovalova, V.N. Iljina // Sibirien Consilium: 2004. - №6 (36). - P. 48-51.

119. Dumitriu S. Polymeric Biomaterials /S. Dumitriu. Sherbrooke, Quebec, Canada, 2002. - 1168p.

120. Dumitriu S. Polysaccharides — Structural diversity and fiinctional versatility (2.ed.) / S. Dumitriu New York, 2005. - 1204 p.

121. Elbert A. Solid-state NMR spectroscopy of chitin and chitosan. Chitin Handbook / A. Elbert, H. Fink; ed. by R.A.A. Muzzarelli, M.G. Peter. Ancona, Italy, 1997. - P. 137

122. Eurorean Pharmacopoeia 5.0, Volum 1,01/2005.

123. Global Fish Standarts, Fish News, 1961. P. 28.

124. Gnelinski V. Verdampfung, Kristallisation, Trocknung: mit 30 Übungsbeispielen / V. Gnelinski, A. Mersmann, F. Thurner. Braunschweig, 1993. - 260 S.

125. Grigoryeva E.V. Das Verfahren zur Chitosan Gewinnung aus dem baltischen Krebs Gammarus lacustris / E.V. Grigoryeva, OJ. Mezenova // Chemie Ingenieur Technik. - 2007. - 79(8). - P. 1189-1194.

126. Grigoryeva E. Rationelles Verfahren zur Chitosan Gewinnung aus dem baltischen Krebs Gammarus lacustris / E. Grigoryeva, O. Mezenova // Die Ernährung. - 2008: — V.32 (l).-C. 16-22.

127. Gröber A. Biochemische und1- strukturelle Charakterisierung des chitinbindenden Proteins (CHB1): Dissertation / Universität Osnabrück; A. Gröber. Osnabrück, 2001. -156 S.

128. Günter H. NMR-Spektroskopie / H. Günter. Stuttgart, 1983. - 357 S:

129. Hillmann. P. Spurenanalytische Bestimmung von Schwermetallen mittels der Gaschromatographie / P. Hillmann. -1992. 104 S.

130. Hu R, Statistische Versuchsmethodik / R. Hu. -1994. 15 S.

131. Hwang J.K. Rheological properties of chitosan solutions / J.K. Hwang, H.H. Shin // Korea-Australia Rheology J: Vol. 12, Nr. 3A - P.-175-179.

132. Jaswal A.S. Amino acid hydrolysate from crab prosessing waste / A.S. Jaswal // J. Food Sei. 1990. - V.55(2). - P. 379-386.

133. Jolles P. Chitin and Chitinases / P. Jolles. Basel, 1999.-340 p.

134. Khan T.A. Reporting degree of deacetylation values of chitosan: the influence of analytical methods / T.A. Khan, K.K. Peh, H.G. Ching // J. Pharm Pharmaceut Sei.2002.-5(3).-P. 205-212.

135. Klein J. Chromatographie zur Bestimmung der Molmasse- und Teilchengrößenverteilung von Polymeren / J. Klein, W.-M. Kulicke, J. Hollmann. -Heidelberg, 1998. S. 317-349.

136. Knarr M. Rheologische Untersuchung und Modellierung der Sol-Gel-Charakteristika von Methylcellulose und kappa-Carrageenan: Dissertation / Universität Hamburg, FB Chemie; M. Knarr. Hamburg, 2003. - 221 S.

137. Knop S. Synthese und Charakterisierung von Symplex-Membranen zur Pervaporationvon Alkohol-Wasser-Mischungen: Dissertation / Universität Hamburg, FB Chemie; S.j

138. Knop. Hamburg, 2000. - 161 S.

139. Köblitz T. Die schonende Trocknung von temperaturempfindlichen Granulaten im Hochfrequenzfeld: Dissertation / Nürnberger Technischer Universität; T. Köblitz. — Nürnberg, 1984. -142 p.

140. Kraeber GmbH & CO, Pharmazeutische Rohstoffe. cited; Available from: http://www.kraeber.de/en/products/.

141. Kratochvil P. Classical light scattering from polymer solutions / P. Kratochvil. Elsivier Science Publishers B. V, 1987. - 334 p.

142. Krön S. Herstellung, Charakterisierung und Anwendung von kurzkettigen Chitosanen: Dissertation / Universität Kiel; S. Krön. Kiel, 2003. -166 S.

143. Kulicke W.M. Fließeigenschaften von Stoffen und Stoffgemischen / W.M. Kulicke. -Basel, Heidelberg, New York, 1987. 488 S.

144. Kulicke W.-M. Viscometry of Polymers and Polyelectrolytes / W.-M. Kulicke, C. Clasen. Berlin, Heidelberg, New York, - 2004. - 120 p.

145. Lavertu M. A vailidated 'H-NMR method for the determination of the degree of deacetylation of chitosan / M. Lavertu, Z. Xia // J. of Pharm, and Biochem. Anal. — 2003.-32.-P. 1149-1158.

146. Lengerken; J. Qualität und: Qualitätskontrolle bei,: Futtermitteln:; Methodik. Analytik. Bewertung/J! Lengerken.-2003;-314 p.

147. Linden G. New ingredients, in: food processing. . Biochemistry and; agriculture / G. Linden, D. Lorient Cambridge, England, 2000. - p. 100^117. ■1831. Liu H. Chitosan kills bacteria through; celllmembi^edknage'/ H; Liu, Y. Du: M., X.

148. Wang // infc J. of Food Microbiology. 2004. - 95(2). -P. 147-155. :

149. Nakashima^T. Mechanical Properties and Antimicrobial Efficacy of Chitosan Films / T. Nakashima, M: Matsuo, Y. Bin//Biocontrol Science.- 11(1). 2006:

150. S.P. Meyers, K.S. Lee // J; Agr. and Food Chem. -1989. 37(3). - P. 575-579.

151. Oetjen G.-W. Gefriertrocknen / G.-W. Oetjen. Weinheim, 1997. - 251 S.

152. Patent DE 4322956 AI, Folie aus Chitosan zur Wundversiegelung und Verfahren zu ihrer Herstellung/H:-J: Kaeßman (Germany), 1995.196: Patent DE 19530689 AI, Verfahren zur Herstellung, von Chitosan / Loth, Fritz (Germany), 1998.

153. Patent EP 0817803 Bl, Verfahren zur Aktivierung, von Polysaccharieden, danach hergestellte Polysaccharide und deren Verwendung / K. Ties (Germany). 1998.

154. Patent DE 102004047 115 B3, Verfahren zur Herstellung einer Wundauflage;/ W.M. Kulicke, T.A. Wilchelms (Germany), 2006.

155. Polymer Handbook. 4 ed./ed.-byJ. Brandrup, E.H: Immergut.-New York, 1999. 200: Produktnormen zur GMP-Regelung für den Tierfuttersektor GMP 14; 17-08-2005.

156. Ratajska M. The degree of deacetilation of chitosan: Optimization of the IR method / . M. Ratajska, M.H. Stms/czyk, S. Boiyriicc, M.G. Peter, F. Loth, // Polimeiy. 1997.

157. Vol.42(9). P. 576-579. , '

158. Revol J.-F. Effect of Degree of deacetylation of Chitin: on the Properties; of Chitin Crystallites / J.-F. Revol, J. Marchessault, R. H: Li //J. Appl. Polym. Sei. -1997. 65.

159. P.373-380. .,'.';v: ;V . ; ■203; Ritohie A.H. Preparation of fish protein hydrolysates / A.H. Ritohie, I.M. Mackie // Animal. l;eed Sci.Techn:-1982. Vol.7(2). - P. 125-133. ; ' ; V.-;'

160. Roberts G.F.A. Chitosan production routes and 'their in determining the' structure and properties of the product / G.F.A-. 'Roberts // Advances in cMtin; science, 7th ICCC (3-5 ' Sept.).-Lyon,France, 1997.-P.22-31. .

161. Rohstoffe K.G.G.P.Ghitosan: icited;Available from:. .- http://www.kraeber.de/en/products/| ' .

162. Struszezyk M.H. Herstellung von• Chitosan und«einige Anwendungen: Dissertation / Universität Potsdam; M.H: Struszezyk. Potsdam, 2000. -198 S.

163. Taschenbuch, für Lebensmittelchemiker: Lebensmittel, Bedarfsgegenstände, Kosmetika, Futtermittel / ed. by F. Wolfgang. Berlin, 2006. - 1162 p.

164. Tarky W. Protein hydrolysate from fish waste / W. Tarky, O.P. Agarwala, G.M. Pigott //J. Food Sei. -1973. V.38(6). - P. 917-918.

165. Tsai G.-J. Antibacterial Activity of Shrimp Chitosan against Escherichia coli / G.-J. Tsai, W-H. Su // J. of Food Protection. -1999. 62. - P. 239-243.

166. Uragami Z. Material Scince of Chitin and Chitosan / Z. Uragami, S. Tadashi, G. Tokura -2006.-277 p.

167. Wilhelms T.A. Neuartige hydrophile makromolekulare Netzwerke: Dissertation / Universität Hamburg; T.A. Wilhelms-Hamburg, 2005. 276 S.

168. Yamada T. Microbial Synthesis of Hyaiuronan and Chitin: New Approches / T. Yamada, T. Kawasaki // J. of Bioscience and Bioengineering. 2005. - Vol. 99(6). - P. 521-528.

169. Zakaria H. Chitin deacetylasen aus marinen Bakterien. Begutachtung Schwerpunkt Meeresbiotechnologie / H. Zakaria // Bericht. 2000.

170. Zotkin M. A. Thermal Modifikation and Study of the Structure of Chitosan Films / M. A. Zotkin, G.A. Vikhoreva, T.V. Smotrina // Fibre Chemistiy. 2004. -Nr. 1 - P. 16-20.