автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.04, диссертация на тему:Изучение протеомных изменений мышечной ткани свинины под воздействием технологических факторов

На правах рукописи

4Ц4 13««-

УСАНОВА ОКСАНА ЕВГЕНЬЕВНА

ИЗУЧЕНИЕ ИРОТЕОМНЫХ ИЗМЕНЕНИИ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ СВИНИНЫ ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ

Специальность 05.18.04 - технология мясных, молочных,

рыбных продуктов и холодильных производств

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва 2011

О Г*»!""» ^ У *

О 1 1.1 нГ

4841582

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт мясной промышленности им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИМП им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии)

Научный руководитель:

доктор технических наук, профессор

Чернуха Ирина Михайловна

Официальные оппоненты:

доктор технических наук, профессор

Кудряшов Леонид Сергеевич

доктор ветеринарных наук, доцент

Кальницкая Оксана Ивановна

Ведущая организация:

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится «21 » апреля 2011 г. на заседании диссертационного совета ДМ 006.021.01 при ГНУ ВНИИ мясной промышленности им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии по адресу: 109316, Москва, ул. Талалихина, д. 26

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИМП

Автореферат разослан и размещен на сайте www.vniimp.ru « 16 » марта 2011 г.

Отзывы в двух экземплярах присылать по адресу: 109316, Москва, ул. Талалихина, д. 26

Ученый секретарь диссертационного совета, к.т.н.

А.Н. Захаров

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы:

Многие свойства мяса определяются изменениями, происходящими в белках. Это и формирование нежности, и вкуса, ВСС. В настоящее время мясоперерабатывающая промышленность идет по пути максимального удлинения сроков хранения мясного сырья. В связи с этим, ключевым вопросом является возможность определения изменений сырья под действием различных факторов, динамики течения процессов созревания, а также исследования изменений белков мышечной ткани в процессе длительного хранения мяса в различном термическом состоянии.

Сравнительные исследования физико-химических и технологических изменений сырья при различных условиях хранения в настоящее время представляет особый интерес в связи с рядом актуальных проблем: значительного увеличения сроков хранения свинины в охлажденном состоянии, возможности идентификации термического состояния мясного сырья, применяемого для производства мясных продуктов и пр. Однако наибольшую сложность представляет определение доли мышечнотканного белка в многокомпонентных мясных продуктах, прошедших термическую обработку.

Определение биохимических изменений белкового состава мясного сырья различного термического состояния, а также определение доли мышечнотканного белка в многокомпонентных термообработанных мясных продуктах, может быть решена с использованием современных электрофоретических методов. Эти методы давно используются в научных исследованиях.

Однако для применения их с целью экспертизы мясного сырья, пищевых продуктов и внедрения в практику экспертных лабораторий необходима разработка и стандартизация оптимальных условий экстракции нативных и коагулированных мышечных белков, а также разработка условий проведения процесса электрофоретического разделения. Это направление весьма перспективно и дает возможность наиболее качественного анализа мясного сырья. Решение этой проблемы имеет научное и практическое значение.

Решение задач, поставленных в работе, основано на трудах таких ученых как Соловьев В.И., Соколов A.A., Пезацки В., Смородинцев И.А., Остерман JI.A., Белоусов A.A., Кудряшов Л.С., Arakawa N., Koohmaraie M.

Целью диссертационной работы является изучение белковых изменений мышечной ткани свинины под действием технологических факторов с использованием электрофоретических методов исследования.

Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:

1. Разработать процедуры пробоподготовки сырья и мясных изделий для разделения нативных и коагулированных мышечных белков, как по массе, так и по изоэлектрической точке (р1);

2. Провести анализ результатов физико-химического, гистологического, микробиологического и электрофоретического методов исследований свинины в процессе длительного хранения в различном термическом состоянии и определить корреляционную зависимость между ними;

3.Изучить состав и свойства мышечных белков, а также закономерности их изменений под действием различных технологических факторов и процессов формирования заданных характеристик качества;

4. Исследовать возможности применения метода 2БЕ электрофоретического разделения, а также МАЫЛ-картирования высокомолекулярных продуктов протеолиза для определения белкового состава термообработанных мясных изделий на примере вареных колбас;

5.На основе комплексного анализа протекания автолитических процессов и фракционного состава белков термообработанных мясных продуктов разработать методику определения продолжительности хранения свинины в различном термическом состоянии.

Научная новизна работы:

Изучен характер и закономерности количественных и качественных изменений фракций мышечных белков свинины по массе и изоэлектрической точке под воздействием различных технологических факторов (температура, продолжительность хранения, термообработка, тип мышцы);

На основе методов протеомики предложены потенциальные белки-маркеры для идентификации мышечной ткани и прогнозирования срока хранения мясного сырья в зависимости от его термического состояния;

Разработаны математические модели протекания в свинине автолитических процессов и количественной идентификации

мышечной ткани термообработанных мясных продуктов - колбаса «Докторская»;

Методом электрофоретического разделения, а также MALDI-картирования высокомолекулярных продуктов протеолиза изучен белковый состав вареной колбасы «Докторская».

Практическая значимость:

- Определена возможность количественного определения доли мышечной ткани в термообработанных мясных продуктах.

Разработаны:

- Методика пробоподготовки и электрофоретическому разделению нативных и коагулированных мышечных белков;

- Методика определения продолжительности хранения свинины в различном термическом состоянии.

Разработанная математическая модель количественного определения мышечной ткани в мясных продуктах позволит значительно снизить долю фальсифицированной мясной продукции.

Уменьшение экономического ущерба путем снижения продаж фальсифицированной продукции в годовом исчислении составляет 1 млн. 80 тыс. рублей в ценах 2010 г.

Апробация работы: Основные результаты выполненных исследований были представлены на 11-ой (2008 г), 12-ой (2009 г) и 13-й (2010 г.) Международных научно-практических конференциях памяти Василия Матвеевича Горбатова, Москва, ВНИИМП; Международной научной конференции студентов и молодых ученых, Москва, ВНИИМП, 2008; 55th International meat industry conference, Belgrade,2009; 55th ICoMST, Copenhagen, Denmark 2009; 56th ICoMST, Jeju, Korea, 2010, Всероссийской научно-практической конференции, Углич, 2010 г.

Публикации: По результатам исследования опубликовано 17 печатных работ, в том числе рекомендованных ВАК - 4.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа включает введение, обзор научно-технической литературы, характеристику объектов и методов исследования, результаты исследования и их анализ, выводы, список источников использованной литературы и приложения. Содержание работы изложено на 138 страницах машинописного текста, содержит 44 рисунка, 8 таблиц и 2 приложения. Библиография включает 172 источника, в том числе 76 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность выбранного направления исследований, сформулированы научная новизна, практическая ценность работы и направленность исследований.

В главе 1 приведён аналитический обзор научной и технической литературы, посвященной вопросам анализа мышечных белков мяса убойных животных и характера их изменения под действием технологических факторов с использованием современных инструментальных методов исследования. Обоснована необходимость более глубокого рассмотрения вопросов инструментальной оценки мышечных белков мясного сырья и термообработанных пищевых продуктов. Анализ состояния вопроса позволил обосновать цель и сформулировать задачи исследования.

В главе 2 представлена схема проведения экспериментов, дана характеристика объектов и методов исследования.

В главе 3 приведены результаты собственных исследований. В том числе данные сравнительного анализа свинины с использованием методов физико-химического, гистологического и микробиологического исследования в процессе длительного хранения и в различном термическом состоянии Представлены результаты исследования закономерностей формирования заданных качественных показателей при термообработке и хранении свинины. Изложены выводы по выполненной работе.

В приложениях представлены методика определения продолжительности хранения свинины в различном термическом состоянии, а также расчет экономической эффективности контроля количества мышечной ткани мясных продуктов и снижения доли фальсифицированной продукции.

ОРГАНИЗАЦИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА,

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Проведение исследований осуществлялось в несколько этапов в соответствии со схемой, представленной на рис. 1.

В соответствии с целью и задачами работы объектами исследования являлись:

- мясное сырье:

- общая средняя проба (далее по тексту - осп) по плечелопаточному отрубу - свинина полутуши;

- осп выделенных тазобедренного и плечелопаточного

отрубов; 6

- модельные фаршевые системы;

- колбаса вареная «Докторская» по ГОСТ Р 52196-2003.

Экспериментальные исследования проводили в условиях: лабораторий Биотехнологии мяса, Испытательного центра ГНУ ВНИИМП им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии, Лаборатории изучения белков Института биохимии им. А.Н. Баха РАН, Лаборатории протеомики Института биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН, Череповецкого и Йошкар-

Олинского мясокомбинатов. Изучение состава и свойств объектов исследования проводили с использованием следующих методов анализа: - массовая доля белка - по ГОСТ 25011-81 (1);- жира - по ГОСТ 23042-86 (2);- влаги - по ГОСТ 9793-74 (3);-активная кислотность - по ГОСТ Р 51478-99 (4);- переваримость белков «in vitro» - методом A.A. Покровского и И.Д. Ертанова (5);-

количественное определение растворимого белка методом Бредфорд (6);-миофибриллярная фрагментация мяса (MFI) (7);-влагосвязывающая способность - методом Грау-Хамма (8);-микроструктура мяса и готовых изделий - гистологический метод по ГОСТ Р 52480-2005 (9);- электронная микроскопия. (10);-определение КМАФАнМ - по ГОСТ 10444.15-94 (11);- оценка аромата на приборе VOCmeter (12);- фракционный состав белков методом IDE электрофореза в модификации Леммли (13);-фракционный состав белков методом 2DE электрофореза в модификации О'Фарелла (14);- фракционный состав белков методом масс-спектрометрии MALDI-TOF (15);- экономическая эффективность (16);- статистическая обработка данных (17).

При проведении лабораторных исследований строго соблюдали правила средних проб. Достоверность всех полученных результатов подтверждали повторностью экспериментов, а также статистической обработкой результатов экспериментальных исследований.

/" тэ - \

Рагр а оотка методнч ескнх подход о б к отбору, подготовке проб и

разделения нативных н коагулированных мышечньзх белков по массе и изоэлектрической точке

Формализация целей н задач исследования

Выоор ооъектоз исследования

Свинина

т

Модельные фарши

Колбаса «Докторская» но ГОСТР 52154-2353

I

Изучение влияния технологическим параметров на нгменежш белков

- ;

Отруб упаковка тип отруба заморажиза: хранение

Полутуша замор ажизаг. хранение

Соотношение мясо-шпик (го-,;**'-,) Белковые добавки - нзолят соеЕого белка

Небелковые добавки картофельный крахмал к-каррагинан в?1 270

Изучение характера и закономерности количественных и качественных изменений фракций мышечных белков (6,13,14)

-Ф- Анализ общего физико-химического состава и биохимического со става исследуемых образцов (1-15)

4 +

Изучение характера м закономерности количественных и качественных изменений фракций мышечных белков по массе и изоэлектрической

точке с целью идентификации термического состояния сеинияы (13-15)

*

Ра:раооткаме-од!Е-з1 определения продолжительности храленил сеепшны б различном термическом состоянии (6,13,17)

Опенка возможности к перспективы прю.гекеки,т метсдсв злектрсфср-епгческсго разделение 5елксв для^Еллкза состав 2 термсс5р*5ст2нных мясных продуктов (13-15)

РасчетзкономическойзффектнБностипримененняметодаэлектрофор еза для контроля количественного содержании мышечной ткани мясных продуктов и снижения доли фальсифицированной продукции (16)

Разработка математических моделей протекания б сБинине автолитических процессовпо составу белковых фракций и количественной идентификации мышечной ткани мясных продувов -колбаса «Докторская» (6,13,17)

Рис 1. Схема проведения исследований

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка методических подходов к отбору, подготовке проб и разделению нашивных и коагулированных мышечных белков по массе и изоэлектрической точке электрофоретическим методом

Соблюдение условий проведения электрофореза и предфорезной обработки образцов является обязательным для возможности сравнения электрофореграмм, полученных в разное время. С этой целью в работе был проведен подбор оптимальных условий экстракции белков из нативных образцов мяса и термообработанных мясных продуктов, а также был проведен подбор плотности гелей, которая обеспечивала бы чёткое и воспроизводимое разделение белковых зон нативных и коагулированных мышечных белков.

Для оптимизации процедуры разделения белков методом IDE электрофореза в модификации Леммли были подобраны буферные растворы для экстракции: - суммарной фракции саркоплазматической и миофибриллярной фракций мышечных белков - 0,01 М трисовый буферный раствор, рН 7.6; - саркоплазматической белковой фракции -фосфатный буферный раствор, рН 7.8; - миофибриллярной белковой фракции - боратные буферные растворы, рН 6.8 и рН 8.6.

Подобраны два режима электрофореза: - для разделения нативных белков -20мА/100 V в течение 1 ч, а затем в течение 2,5 ч 35мА/200 V; -для разделения коагулированных белков -30мА/100 V в течение 0,5-1 ч, а затем в течение 2,5 ч 45-50мА/300 V.

I .11 || I : !

J «50 __________•■--"-----------

§ , " I 67 Jul"

5

£ 25

0 100 200 300 400 500

Молекулярная массз белы, кДа

Рис 2. Калибровочная кривая зависимости электрофоретической подвижности белков от десятичного логарифма его молекулярной массы.

В результате проведенных исследований установлено, что для удовлетворительного разделения белков требуется 2,5-3,5 ч. Полученные

белковые зоны идентифицировали и анализировали с помощью калибровочной кривой (рис. 2) зависимости электрофоретической подвижности белков от десятичного логарифма его молекулярной массы. Для построения калибровочной кривой использовали белки-свидетели с известными молекулярными массами.

Разделение белков методом 2РЕ электрофореза в модификации О'Фарелла осуществляли в 2-х направлениях: изоэлектрофокусирование (ИЭФ), основанное на изоэлектрической точке белков (р1) и ЗОБ-РАСЕ, основанное на величине молекулярной массы белков (М). Под действием электрического тока происходит миграции белковых молекул в градиенте рН в область со значением рН, равным изоэлектрической точке молекулы. Разделение белков по массе и по изоэлектрической точке дает возможность комплексной оценки фракционного состава исследуемых образцов.

Изучение влияния некоторых технологических параметров на скорость и характер изменения белков мышечной ткани

Изучение влияния способа хранения на характер автолитических процессов. Было проведено изучение автолитических процессов, происходящих в мышцах плечелопаточного отруба выделенного и интактного, оставленного в виде полутуши, а также влияния способа хранения на фракционный состав белков и сроки годности мяса.

Результаты изменения растворимости белков при хранении полутуш и отрубов в подвешенном состоянии без упаковки в условиях холодильной камеры при постоянной температуре 2+2 °С, относительной влажности 85 - 90% и скорости потока воздуха 0,5-1 м/с представлены на рис 3.

Рис. 3. Динамика изменения общей

-полутуша

-отруб растворимости белков

Продолжительность хранения, сут

Образование нерастворимого актомиозинового комплекса в первые 24 ч после убоя животного характеризуется резким уменьшением количества растворимых белков мышечной ткани на 55 % в осп по

полутуше и 18% в осп по отрубу по сравнению с исходным показателем в парном мясе. Следует отметить более быстрое развитие процессов автолиза в выделенном отрубе, что связано с более выраженными процессами сокращения и отсутствием механического повреждения мышечной ткани и соединительнотканных волокон, в следствие чего, количество растворимого белка достигает уровня парного мяса 2,1 г на 100 г на 4 сут холодильного хранения полутуши и на 2 сут хранения отруба, соответственно. Хранение свинины в виде выделенного отруба характеризуется плавным нарастанием количества растворимого белка, тогда как при хранении в полутуше наблюдается резкое его увеличение и достижение максимальной концентрации на 7 сут - 2,7 г/100 г мяса.

Степень миофибриллярной фрагментации является одним из показателей, характеризующих изменения в структуре мышечной ткани под воздействием различных факторов, и в первую очередь, характеризует течение автолитических процессов.

По мнению ряда авторов (Бпушап 1.0., БгуНпск Ь.) индекс миофибриллярной фрагментации позволяет более четко охарактеризовать изменения, происходящие в структуре мышечной ткани, поскольку эти процессы напрямую влияют на состояние мышечных белков, МБ1 также может характеризовать протеомные изменения. Изменения миофибриллярной фрагментации при формировании нежности мяса в процессе хранения на рис. 4.

?,0*107 1,0*10'

МММ! 9,0* 10* 9,0*1<Р /

5,0*10;'4.5Ч0-;

1 0 1С 1 / /

А 2

19

/ /

»»

2.

Рис. 4. Взаимосвязь изменений показателя миофибриллярной фрагментации (МР1)и КМАФАнМ при хранении свинины

4 6 8

Продолжительность хранения, сут

Динамика показателя N№1 образцов осп по полутуше и осп по отрубу различна. В образце осп по полутуше на протяжении срока хранения - 0-7 сут наблюдается плавное нарастание миофибриллярной фрагментации. При этом в период до 4 сут хранения, это изменение

происходит вследствие автолиза, а далее протеолиз резко усиливается под воздействием микрофлоры, что подтверждено результатами определения КМАФАнМ. В период 4-7 сут и 7-10 сут происходит резкое увеличение КМАФАнМ на 3 и 2 порядка соответственно. В выделенном плечелопаточном отрубе в течение 0-4 сут холодильного хранения показатель MFI остается на одном уровне, а затем наблюдается нарастание миофибриллярного распада, что также подтверждено результатами КМАФАнМ. С 4-7 сут происходит увеличение микробиологического показателя на 3 порядка и превышает допустимые нормы СанПиН. Определение данного показателя в совокупности с определением микробиологических параметров дает возможность комплексной оценки автолитических процессов - миофибриллярной фрагментации и микробной порчи мясного сырья. Полученные результаты также подтверждены с помощью электронной микроскопии исследуемых образцов на отдельных сроках хранения.

С увеличением продолжительности автолиза происходит высвобождение белков при разрушении мышечных волокон (тропонина-Т, миозина, коннектина, небулина, а-актинина), миофибрилл по Z-линиям. Многие ученые ассоциируют изменения в Z-линии с посмертной тендеризацией мышечной ткани, в результате чего высвобождается множество белков-субфрагментов с молекурными массами 180, 40, 33, 30 и 23 кДа (Davey C.L., Winger R.J.,1991/Tatsumi R.,Takahashi К.,1992). К 14 суткам длина миобрилл мышечной ткани уменьшается в 2,4 раза с 33-39 nm до 14-16 nm.

Электрофореграмма гомогенатов мышечной ткани осп отруба и полутуши на 0,2,4,7,10 суток хранения при 2+2 °С (рис 5), позволила более четко описать изменчивость белковых фракций и установления картины изменений, происходящих в процессе длительного хранения образцов при низких плюсовых температурах.

Анализ общей картины электрофоретического разделения образцов 1 и 2, показал наличие большего количества фракций с молекулярными массами <35 ГОа. Особый интерес составлял выявление белка тропонина-Т с молекулярной массой около 30 ГОа, который играет значительную роль в развитии нежности мяса и является наиболее характерным белком фрагментации белка мышечного волокна в процессе хранения. Результаты качественного анализа показали почти полное отсутствие фракции молекулярной массы 30 kDa на 0 сут в образце осп по полутуше, в отличие от образца осп по отрубу. Полученные результаты хорошо коррелируют с изменением показателя MFI.

Данные микробиологического исследования и значительное увеличение количества фракций с молекулярными массами <25 к!)а на 10 сут в образце осп по полутуше и 7 сут в осп по отрубу говорят о начале преобладания процессов микробной порчи над автолитическими биохимическими процессами в мясе.

Рис 5. Белковые фракции образцов плечелопаточного отруба в процессе хранения (образец №1-полутуша, образец №2-отруб)

Образец .N¡»1 ОоразецЛУ

Таким образом, результаты проведенных комплексных исследований позволяют выявить различия в интенсивности автолитических процессов в мышцах в зависимости от способа хранения (в виде отруба или в виде полутуши). Показано, что, за счет более интенсивного течения автолитических процессов, созревание в свинине при хранении в отрубах завершается на 2 суток раньше, чем в полутуше. Результаты определения КМАФАнМ показали гораздо более интенсивное течение процессов порчи, что приводит к сокращению сроков хранения свинины в виде выделенного отруба по сравнению с хранением в полутуше.

Изучение влияния типа мышцы на характер автолитических процессов в отрубах

Проведены биохимические исследования количественного и качественного определения изменений белковых фракций мышечной ткани различных отрубов свинины, обусловленных в процессе созревания. Образцы мышечной ткани были взяты из тазобедренного и плечелопаточного отрубов бескостных.

Количественные изменения растворимого белка мышечной ткани двух отрубов бескостных приведены на рис. 6.

Экстрагируемость белков осп по плечелопаточному отрубу на этапе созревания 6-12 суток хранения резко падает на 61 %, что связано с переходом значительной фракции растворимых белков в нерастворимое состояние. В осп по тазобедренному отрубу на данном этапе созревания наблюдается обратная картина изменения фракций растворимых белков.

Рис. 6. Динамика изменения количества растворимого белка осп плечелопаточного и тазобедренного отрубов бескостных в процессе хранения

Продолжительность хранения, сут — плечелолаточный отруб -тазобедренный отруб

Количество белка увеличивается в 2,5 раза и, что составляет 2,43 г/100 г мяса. Это объясняется, по-видимому, продолжающимся процессом окоченения, в связи с большей массой отруба и другими мышцами. Нагрузки, которые воздействовали на мышцы при жизни животного, влияют на скорость распада гликогена и, как следствие, на растворимость белков.

Качественный и количественный фракционный состав белков исследуемых образцов показан на гистограмме (рис 7).

Рис. 7. Фракционный состав мышечных белков

плечелопаточного и тазобедренного отрубов бескостных при хранении до 20 суток

Суткихранения

Ллешллвшлопаточнкй Та;осе-реннй;й отруб

Проведенные опыты показали, что число и интенсивность белковых полос, находящихся в области высоких молекулярных масс невелики. Анализируя исследуемые отруба, отмечено почти полное отсутствие к 12 суткам хранения фракции с молекулярной массой 150 кДа в тазобедренном отрубе бескостном. Это связано с распадом тяжелых цепей миозина и ряда белков, прочно связанных с миозиновыми и актиновыми нитями к 12 сут холодильного хранения. В плечелопаточном отрубе процесс распада белковых молекул происходит плавно. Распад фракции с молекулярной массой 150 кДа происходит на этапе 12-20 сут хранения. В обоих отрубах, начиная с 4 суток хранения, выявлены фракции с молекулярными массами 30-37 кДа, что соответствует фракции тропонина-Т. Количественное увеличение данной фракции на 12 сут и 15 сут в плечелопаточном и тазобедренном отрубах, соответственно, говорит об интенсивном распаде миофибрилл, что ведет к увеличению нежности мясного сырья.

В процессе дальнейшего созревания осп исследуемых отрубов происходит расщепление белковых молекул на фрагменты с меньшими молекулярными массами. Процесс интенсивного накопления продуктов распада наблюдается на 15-20 сут хранения для осп обоих отрубов.

Полученные различия подтверждают необходимость дифференцированного подхода к определению сроков годности и оптимального момента завершения процесса созревания мясного сырья в зависимости от типа мышц.

Изучение влияния способа упаковки на характер автолитических процессов в отрубах

Известно, что хранение мяса в вакууме, а значит и при низком парциальном давлении кислорода, либо прекращает, либо замедляет нежелательные процессы. Одновременно хранение в вакууме сопровождается сложным комплексом биохимических и физико-химических процессов, в результате которых мясо в упаковке созревает и приобретает более нежную консистенцию и сочность, становится более доступным действию пищеварительных ферментов. Известно, что наиболее высокие органолептические характеристики имеет мясо при степени вакуумирования 98% (остаточное давление не более 0,02 МПа).

На примере исследования осп плечелопаточного отруба бескостного в неупакованном и упакованном под вакуумом виде описана динамика изменения влагосвязывающей способности исследуемых образцов свинины (ВСС%) в процессе длительного хранения (рис. 8).

Упаковка отрубов в значительной степени влияет на характер и скорость автолитических превращений белков. Как видно на графике, влагосвязывающая способность осп неупакованного отруба значительно выше на всех сроках хранения. Влагосвязывающая способность мяса во время окоченения достигает минимума, и ее величина на 3% и 6% ниже для неупакованного и упакованного соответственно, чем у мяса через 2 ч после убоя. :

70,0 65,0 60,0 О 55,0 50,0 45,0 40,0

65,8 ■М.2,

*езУ 61,2 63,0

50,1 53,4

47,0

| —* упакованный отруб ---неупакованный отруб --1-1-1-1-1-

Рис. 8. Динамика изменения ВСС (%) осп упакованного и неупакованного под вакуумом плечелопаточного отруба бескостного

0 2 4 6 8 10 12 14

Продолжительность хранения, сут

Процесс связывания влаги и распад белковых молекул при созревании отрубов мяса четко взаимосвязаны. Как видно из представленных на рис 8 данных, максимум влагосвязывания осп упакованного охлажденного мяса в процессе окоченения и созревания наблюдается на 5 сут хранения и составляет 61,2%, а к 12 сут хранения ВСС медленно падает. Полученные нами данные во многом подтверждают опыты, проведенные на охлажденном сырье Гаммом, 1959 г. Однако комплексное изучение изменений влагосвязывающей способности исследуемых отрубов в совокупности с показателями, характеризующими изменения, происходящие в белковой системе мяса на более длительных сроках хранения, дает возможность дополнить ранее полученные данные.

Изучены изменения саркоплазматической и миофибриллярной фракций белков мышечной ткани. Состояние саркоплазматических белков мышечной ткани не может оказывать непосредственного влияния на изменение нежности мяса при его созревании и дальнейшем хранении. Однако изучение их превращений представляет особый интерес, так как среди этих белков присутствует большое количество тканевых ферментов, которые высвобождаются при разрушении миофибрилл и включаются в биохимические процессы, протекающие в мясе post mortem (рис. 9).

Изучение растворимости саркоплазматической фракции белков осп плечелопаточного отруба при хранении в охлажденном состоянии показало, что максимальная растворимость их свойственна парному мясу. Сразу же после его охлаждения растворимость белков снижается.

u 3

i 2,5

I 2

0

S

1 1,5

С.

Е i

: о

£

2,6

0,5

1,3

0,9

Рис. 9. Изменения фракций

миофибриллярных и саркоплазматических белков в процессе хранения

12

0 2 5

Продолжительность хранения, сут

* суммарная миофибриллярная фракция саркоплазматическая фракция

При этом максимально резкое уменьшение растворимости наблюдается к 3-5 сут холодильного хранения, что соответствует периоду максимального развития послеубойного окоченения и составляет 53%. от исходного значения экстрагируемости белка. Далее, вплоть до 12 суток хранения образцов, растворимость саркоплазматической фракции меняется незначительно и составляет примерно 0,9г/на 100 г мяса. Состояние миофибриллярных белков в большей степени определяют нежность мяса. Результаты изменений саркоплазматической и миофибриллярной фракций белков при созревании свинины и длительном хранении при низких плюсовых температурах.

Растворимость белков миофибриллярной фракции в процессе окоченения свинины (до 3-5 сут хранения) резко нарастает на 18%, по сравнению с минимальным значением в парном мясе. В процессе дальнейшего хранения исследуемых отрубов на 12-15 сут наблюдается стабилизация степени экстрагируемости белков миофибриллярной фракции белков. Предположительно, при дальнейшем хранении свинины в указанных условиях более 15 сут количество экстрагируемого белка будет увеличиваться, в связи с разрушением белковых фракций, в основном, ферментными системами микрофлоры.

Проведенное нами исследование по анализу растворимости миофибриллярной и саркоплазматической фракции мышечных белков

подтверждают и соотносятся с исследованиями, проведенными Соловьевым В.И. (1966 г) на мясе КРС.

Изучение влияния 1-кратного и 2-кратного замораживания на характер автолитических процессов

Анализируя процессы, происходящие с белком при длительном хранении мяса в различном термическом состоянии, была установлена картина изменения растворимости белков при хранении мяса в охлажденном (2±2°С) и замороженном (-18±2°С) состоянии (рис 10).

ш

6Й* Ш 2И 0« О сар коп,

1сар«ошазмаП(че£каяфракци*эмиофи6ри,шрнаяфра1!ция Есаркопшматическарфраицияпшофибри/гмриакфракция

Образцы 1 Образцы 2 Образцы 3

Рис. 10. Изменения фракционного состава саркоплазматической и миофибриллярных фракций белков свинины различного термического состояния: охлажденные образцы 0 и 5 суток хранения при 2±2°С (образцы 1), ]-кратно замороженном состоянии (образцы 2) и 2-кратно замороженном состоянии (образцы 3).

Максимальная растворимость суммарной фракции белков 3,37 г/100 г свойственна охлажденному мясу. Сразу же после его охлаждения растворимость белков снижается на 49%. При этом минимум растворимости белков в охлажденном мясе приходится на 5 сутки и составляет 1,71 г/100 г, что соответствует периоду максимального развития процесса окоченения. Растворимость белков на 5 сут хранения при низких отрицательных температурах составляет 47% от исходного показателя и процессами разрушения структуры мышечных волокон.

Растворимость белка свинины, оцененная сразу после 2-кратного замораживания, так и через 5 сут возросла на 70% и 189% соответственно, от уровня охлажденного мяса. Выявленные изменения связаны как с биохимическими, так и с физическими разрушениями мышечной ткани при многократном замораживании и из-за воздействия на ткани кристаллов льда.

Данные экспериментальных исследований указывают на увеличение растворимости мышечных белков мяса при холодильной обработке, причем наибольшие изменения происходят в саркоплазматических белках.

Разработка математических моделей протекания в свинине автолитических процессов по составу белковых фракций

По результатам проведенных исследований количественного определения растворимого белка были разработаны математические модели, представленные уравнениями регрессии протекания в свинине автолитических процессов под воздействием технологических факторов (табл. 1).

Таблица 1

Математические модели протекания автолитических процессов свинины

Образец Уравнение регрессии Стандартные ошибки II коэффициенты корреляции

Плече.топаточный отруб в виде полутупш у=1,34+0,49х-0,04х:, 5=1,21 Я-'=0,25

Плече.топаточный отруб, не упакованный под вакуум у=1,59+0,Зх-0, ОЗх-, 5=0.7" К:=0.24

Плече.топаточный отруб, упакованный под вакуум у=(3,4+0,69х)/( 1 +0,88х-0,04.4-), 8=0.2" &:=0.91

Тазобедренный отруб, не упакованный под вакуум у=О,27-0,11х)/(1-0,1х), 5=0,35 К:=0,77

где х - продолжительность хранения, сут у - количество растворимого белка г/100 г

Для каждого уравнения была рассчитана стандартная ошибка и коэффициент корреляции, которые составляют 0,65+0,34 и 0,54+0,29.Разработанные уравнения позволяют определять срок хранения мясного сырья в зависимости от вида отруба и способа его хранения (упаковка, способ хранения).

Изучение характера и закономерности количественных и качественных изменений фракций мышечных белков

Анализируя общую картину электрофоретического исследования мясного сырья различного термического состояния, важным является сравнение изменений количественного содержания белковых фракций на различных сроках хранения. В результате исследований электрофореграмм были выделены диапазоны молекулярных масс белков, являющиеся наиболее показательными. Для анализа выбраны сроки хранения: от 0 сут (парное мясное сырье) до 25 сут хранения при 2+2°С. Характер и закономерности изменений фракций мышечных белков охлажденного мясного сырья представлен на рис. 11.

г г

¡и

□

«35-30 кДа 056-35 кДа

□ 25-14 кДа

Рис

Количество фракций

11. Количество

Копичествофракций

белковых фракций при длительном хранении охлажденного мясного сырья на различных сроках хранения

Результаты проведенного анализа выявили значительные изменения количества фракций в диапазоне молекулярных масс 56-35 кДа в зависимости от срока хранения мясного сырья. В интервале 5-12 сут созревания наблюдается увеличение количества фракций белков за счет биохимических процессов созревания, разрушения актомиозинового комплекса и выхода белка-актина (молекулярная масса 56 кДа). Дальнейший процесс автолиза ведет к разрушению высокомолекулярных белков и образованию большего числа фракций с молекулярной массой <25 кДа. Характер и закономерности изменений количества фракций мышечных белков свинины различного термического состояния может быть представлен в виде диаграммы (рис. 12).

56 кДа

□ Охлажденное

сырье

□ 1-кратно замороженное сырье

Рис. 12.Количество белковых фракции 56 к Да, в зависимости от термического состояния свинины на различных сроках хранения

2 з

Количество фракций

Анализ количественного содержания фракции молекулярной массы 56 кДа в зависимости от термического состояния является

показательным и важным для его идентификации и что более важно определения многократно размороженного мясного сырья. На всех сроках хранения (0, 5, 12 сут) наблюдается увеличение данной фракции, в 2 раза, а на 12 сут - в 4 раза. Полученные результаты позволяют нам выделить данную фракцию как маркера размораживания свинины.

Изучение фракционного состава белков термообработанных пищевых продуктов и идентификация потенциальных белков-маркеров мышечной ткани

Проводили с 15 образцами модельных фаршей (табл. 2) с добавлением различных растительных компонентов, таких как изолят соевого белка, крахмал картофельный и к-каррагинан ОР1 270.

Таблица 2

Состав модельных фаршей

.V» образца Характеристика образца Ы замены мышечной ткани

№1 100 ib ыьппечная ткань -

№2 50 *í мышечная ткань - 50 Н шпик 50

ЛвЗ 33 % мышечная ткань - 67 "í шшк 67

№4 1 % соевый белок (гидранта 1:4) 5

№5 4 % соевый белок (гндращня 1:4) 20

№6 10 % соеЕый белок {гидратация 1:4) 50

№7 15 % соевый белок (гидратация 1:4) 75

м 1 % крахмал картофельный (гидратация 1:6) 7

м 4 % крахмал картофельный (гидратация 1:6) 28

№10 7 % крахмал картофельный (гидратация 1:6) 50

№11 11М крахмал картофельный (гидратация 1:6) 77

№12 0,2к-каррагинан GP1 270 (гидратация 1:50) 10

№13 0,5 % к-каррагияан GP1 270 (гндращня 1:50) 25

№14 1 % к-каррагннан GPI 270 (гндраташ 1:50) 50

№15 1.5 !í к-каррагннан GPI 270 (гидратация 1:50) 75

Исследования показали, что в зависимости от состава модельных фаршей, наблюдаются изменения количества растворимого белка (рис. 13).

» 1,85

0,98

4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5

Рис. 13. Зависимость количества

растворимого белка от доли мышечной ткани в модельных фаршах.

100,0 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0

шпик "®-со«вый белок - ° крахмал/каррагикан

Добавление 10 % изолята соевого белка снижает уровень растворимого белка до значений сопоставимых со значениями, полученными при 50% замене мышечной ткани шпиком в образце фарша №2. При замене мышечной ткани растительными компонентами более 50% наибольшее влияние на содержание растворимого белка оказывает добавление в фарши крахмала картофельного или к-каррагинана СР1 270, и составляет 0,98 г белка на 100 г фарша (11% и 1,5% соответственно). При замене мышечной ткани изолятом соевого белка на 67% наблюдаются более высокие количества растворимого белка, составляющие 135% соответствующего при замене шпиком.

Большой научный интерес представляет изучение состава мышечных белков термообработанных мясных продуктов. С этой целью были проведены исследования на образцах колбасы «Докторская» различных производителей. В результате разработаны уравнения регрессии и корреляции для добавок, применяемых в качестве замены мясного сырья (белковый и небелковый компонент).

В соответствии с выведенными уравнениями, определены расчетным путем количества мышечной ткани в образцах, содержащих небелковые компоненты (табл. 3).

Таблица 3

Расчетное количество мышечной ткани

№ образца Кол-во общ белка,% (х)

15,36 11,5 10,35 11,08

Расчетное кол-зо мышечной ткани

77,75 55,89 49,24 53,44

Результаты гистологического анализа

крахмал/каррагинан крахмал/каррагинан крахмал/каррагинан крахмал/каррагинан

Дальнейшие исследования термообработанных мясных продуктов заключались в изучении коагулированных мышечных белков методом электрофореза 2БЕ. Типичная электрофореграмма белков термообработанного продукта, которая была получена при фракционировании образцов методом 2ЭЕ электрофореза, представлена на рис. 14. Величины р1 белковых фракций определяли по их электрофоретической подвижности.

м.

кДа

150 I

95 | 72 &

55 43 36

26 .V ' .и

17

10 №

Рис. 14. Результаты электрофоретического фракционирования белков. Стрелками с номерами обозначены белки, идентифицированные с помощью масс-спектрометрии

р!

.10

8.70

9.50

Для идентификации мышечной ткани методом масс-спектрометрии с геля были выделены белковые фракции, общие для образцов термообработанных продуктов. В табл. 4 суммированы результаты идентификации белковых фракций. Помимо большого числа тканевых ферментов и белков, всегда присутствующих в мышечной ткани, такие как мышечная креатинкиназа, аденилкиназа, миоглобин, миозин, актин, нами был идентифицирован тропонин-Т, образующийся в результате распада миофибрилл.

Значения Мда и р1, приведенные в табл. 4, являются средними арифметическими значениями измерений. Для каждого белка был определен процент совпадения, который отражает отношение суммарной длины выявленных пептидов по отношению к аминокислотной последовательности белка. Для каждого идентифицированного белка была проведена оценка вероятности (рис 15), которая определяется как максимальное совпадение пептидной и аминокислотной последовательности соответствующему белку баз данных, где ось абсцисс - процент совпадения, а ось ординат - число совпадений

Таблица 4.

Результаты идентификации белковых фракций _ 2DE электрофореза__

Фракция Mw, ГОа/ pi Белок Совпадение, %

2DE

1 43.0/6.61 muscle creatine kinase (pig) 29

7 39.4/8.45 fructose-bisphosphate aldolase A (cattle) 29

8 36.6/8.18 L-lactate dehydrogenase A chain (pig) 34

9 35.7/6.63 dehydrogenase, glyceraldehydephosphate (domestic pig) 46

10 28.7/8.86 phosphoglycerate mutase 2 48

11 26.7/6.54 triosephosphate isomerase 1 (pig) 58

12 21.6/8.38 adenylate kinase isoenzyme 1 (pig) 37

18 29.8/7.74 troponin T 22

19 35.7/6.63 dehydrogenase,glyceraldehydephosphate 56

20 29.7/8.39 troponin T beta isoform 34

25 43.0/6.77 creatine kinase M-type 31

26 19.0/4.57 myosin light chain 2 57

27 43.0/6.61 creatine kinase M-type 47

28 32.8/4.64 unnamed protein product 39

29 20.9/4.9 myosin light chain 1/3 66

30 16.9/6.54 chain A, High Resolution X-Ray Structures Of Pig Metmyoglobin And Two Cd3 Mutants Mb(Lys45-> Arg) And Mb(Lys45-> Ser) 84

31 17.0/6.9 myoglobin 35

33 43.5/5.94 unnamed protein product 44

34 9.7/8.57 gp80 [Mycobacterium phage KBG] 40

35 59.4/8.99 similar to AGAP005134-PA isoform 1 23

37 39.8/5.24 actin chain D 43

IDE

1 - muscle creatine kinase + beta-enolase isoform 1

2 84.0 muscle glycogen Phosphorylase (pig)

3 42.9 creatine kinase M chain (pig)

4 47.1 beta-enolase (pig)

Каждая идентифицированная фракция была проанализирована в нескольких базах данных N0131 и 8\у158-Рго1:. Установлена аминокислотная

последовательность пептидов, фракции 18. Использованная модификация 2ЭЕ не только расширила возможности протеомного анализа мышечных белков термообработанных продуктов, но и позволила выявить белки-маркеры (тропонин-Т и миоглобин) для количественного определения доли мышечной ткани в мясных продуктах.

Рис 15. Оценка вероятности выявления и идентификации , белковых фракций с помощью

! масс-спектрометрии

50 60 70 80

Probability Based Howse Score

По результатам работы был проведен расчет экономической эффективности применения электрофоретического метода для контроля количества мышечной ткани и снижения фальсификации вареной колбасы, выработанной по ГОСТ Р. Результаты показали, что при проверке 0,3% общего объема выработки в год количество фальсификации снизилось на 20% и составляет не 80% (2009г), а 60% (20 Юг). При этом ужерб за счет обмана потребителей снижается на 27 млн. руб в год.

ВЫВОДЫ:

1. Отработаны процедуры пробоподготовки и разделения: нативных мышечных белков - подобраны 3-й буферных раствора для экстракции различных фракций белков, а также режимы электрофореза- 20мА/100 V -1 ч и 35мА/200 V-2,5 ч; и коагулированных мышечных белков - буферный раствор с 8М мочевиной;

2. На основе анализа результатов физико-химического, гистологического и микробиологического исследования свинины в процессе длительного хранения и в различном термическом состоянии определена корреляционная зависимость между показателями количества растворимого белка, ВСС, MFI, электрофоретическим разделением и результатами, полученными при исследовании классическими методами исследования;

3. Проведен протеомный анализ мышечных белков. Изучено влияние некоторых технологических параметров на скорость и характер изменения белков мышечной ткани, таких как:

- способ хранения. Хранение сырья в виде отруба, значительно ускоряет автолитические процессы в сравнении с таковым в интактном состоянии (в полутуше). Количество растворимого белка на 4 сут в полутуше и на 2 сут в отрубе находятся на одном уровне (2,1 г белка/100 г мяса), что также подтверждено результатами определения MFI и результатами определения КМАФАнМ. Максимальное содержание фракции - маркера нежности мяса с молекулярной массой 30 кДа на 7 сут и 4 сут хранения в образцах осп полутуши и отруба, соответственно. Полученные результаты хорошо коррелируют с изменением показателя MFI.

- упаковка. Хранение отрубов в упакованном и неупакованном виде четко характеризуется показателем ВСС,%, который во время окоченения достигает минимума, и его величина на 3% и 6% ниже для неупакованного и упакованного сырья соответственно, чем через 2 ч после убоя.

- тип отруба. Экстрагируемость мышечных белков осп плечелопаточного отруба на этапе созревания 6-12 сут хранения резко падает на 61 %. В тазобедренном отрубе наблюдается увеличение в 2,5 раза, что составляет 1.43 г/100 г мяса. Результаты электрофоретического разделения белков исследуемых отрубов показывают полное отсутствие фракции с молекулярной массой 150 кДа в тазобедренном отрубе бескостном, однако в плечелопаточном отрубе процесс распада белковых молекул происходит плавно. Распад фракции с молекулярной массой 150 кДа происходит на этапе 12-20 сут хранения.

- замораживание. Максимальная растворимость суммарной фракции миофибриллярных белков свойственна охлажденному мясу (2±2°С). Сразу же после его охлаждения растворимость белков снижается на 49%. Растворимость белков на 5 сут хранения при низких отрицательных температурах (-18±2°С) составляет 47% от исходного показателя. Растворимость белка свинины, оцененная сразу после 2-кратного замораживания (0 сут), так и через 5 сут возросла на 70% и 189% соответственно, от уровня охлажденного мясного сырья.

4. Изучена возможность применения метода электрофоретического разделения коагулированных мышечных белков 2DE, а также MALDI-картирования высокомолекулярных продуктов протеолиза для анализа фракционного состава белков термообработанных мясных продуктов;

5. Систематизированы и проанализированы результаты комплексного изучения характера протекания автолитических процессов и разработана методика определения продолжительности хранения свинины в различном термическом состоянии.

Опубликованные работы по теме диссертации:

1. Грищенко В.М. Чернуха И.М., Усанова О.Е. Изменения фракционного состава белков свинины в процессе длительного хранения при низких плюсовых температурах//Тенденции и перспективы развития инновационных и информационных технологий мясной промышленности. Сборник докладов 11-й Международной научно-практической конференции памяти Василия Матвеевича Горбатова. - М.,

2008, с.168-171;

2. Лисицын А.Б., Чернуха И.М., Грищенко В.М., Усанова О.Е., Борисова Т.Г. Адаптация метода электрофореза для исследования эндогенных биологически активных пептидов в мясном сырье //Тенденции и перспективы развития инновационных и информационных технологий мясной промышленности. Сборник докладов 11-й Международной научно-практической конференции памяти Василия Матвеевича Горбатова. - М„ 2008, с. 93-97;

3. Усанова О.Е. Исследование белков мяса методом SDS-электрофореза// Живые системы и биологическая безопасность населения. Материалы Международной научной конференции студентов и молодых ученых.- М., 2008, с. 109-111;

4. Chernukha I., Usanova О., Grischenko V. Changes in Fractional Composition of Sarcoplasmic and Myofibrillar Pork Proteins During Long-term Storage at Low Positive Temperatures (-1 to +4C)// 55th International meat industry conference. - Belgrade, 2009, p 137-139;

5. Чернуха И. M., Усанова О. Е Динамика изменения белков свинины в зависимости от вида отруба и срока хранения при низких плюсовых температурах//Живые системы и биологическая безопасность населения. Материал международной научной конференции студентов и молодых ученых,- М.,2009;

6. Чернуха И.М., Усанова О.Е., Лазарев К.В. Физико-химические и технологические изменения свойств свинины при длительном холодильном хранении //Тенденции и перспективы развития инновационных и информационных технологий мясной промышленности. Сборник докладов 12-й Международной научно-практической конференции памяти Василия Матвеевича Горбатова. - М.,

2009. - с 247-253.;

7. Chernukha I., Usanova О. Influence of Pork-Shock Modification of Pork on Amino-Acid Composition of Muscle Tissue and Composition of Ecstracted Low Molecular Peptides// 55th International Congress of Meat Science and Technology. - Copengagen, Danmark, 2009;

8. Chernukha I., Usanova O., Grischenko V. Changes in Fractional Composition of Sarcoplasmic and Myofibrillar Pork Proteins in the process of long-term storage at Low Positive Temperatures //Tehnologija mesa,2009, № 3-4, p 223-226;

9. Chernukha I.M., Lisitsyn A.B., Usanova O.E. et al//55th ICoMST. -2009. - Kopenhagen, Denmark. Proceedings, PE9.29 - P.110-112;

10. Чернуха И.М., Усанова O.E. Изучение фракционного состава белков охлажденной свинины// Мясная индустрия, 2010, №3, с. 15-18;

11. Чернуха И.М., Усанова О.Е. Физико-химические и технологические изменения свойств свинины при длительном холодильном хранении //Мясные технологии, 2010;

12. Чернуха И.М., Усанова О.Е. Методы идентификации мышечной ткани в мясных продуктах//Вестник РАСХН. - М., 2010. - с 80-82;

13. Юшина Ю.К., Усанова О.Е., Мищенко А.А. Определение белков сои в термически обработанных мясопродуктах методом иммуноферментного анализа//Все о мясе, № 6, 2010, с. 58-59;

14. Чернуха И.М., Усанова О.Е. Изучение изменений белков в процессе хранения свинины в охлажденном, замороженном и многократно размороженном состоянии// Всероссийская научно-практическая конференция, Углич, 2010 г., 2010, с. 297-300;

15. Чернуха И.М., Усанова О.Е., Хвыля С.И. Изучение изменений белков в процессе хранения свинины в различном термическом состоянии// FleischWirtschaft International, Россия - 2/2010, - с.66-68;

16. Chernukha I.M. Modification of meat raw materials by manipulation with animals / Chernuha I.M., Fedulova L.V., Motylina N.S., Makarenko A.N., Usanova O.E. // 56th ICoMST, August, 2010, Jeju, Korea, B022. P. 72

17. Чернуха И.М., Усанова O.E. Изучение показателей фракционного состава белков с целью возможности идентификации сырья //Тенденции и перспективы развития инновационных и информационных технологий мясной промышленности. Сборник докладов 13-й Международной научно-практической конференции памяти Василия Матвеевича Горбатова. - М., 2010, с. 132-134.

Заказ № 199-1/03/2011 Подписано в печать 14.03.2011 Тираж 80 экз. Усл. п.л. 1,4

-:ч ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

,, О3"/} \v\vw.cfr.ru; е-таИ:т/о@с/г.ги

Введение.- 4

Цель и задачи исследования.- 5

Научная новизна.- 6

Практическая значимость.- 6

1. Обзор научно-технической литературы.- 7

1.1. Микроскопическое строение мышечной ткани.- 8

1.2. Автолитические процессы мышечной ткани.- 12

1.3. Общие сведения о белках мышечной ткани.- 18

1.3.1. Миофибриллярные мышечные белки.- 18

1.3.2. Саркоплазматические мышечные белки.- 25

1.3.3. Белки стромы.-21

1.4. Методические приемы идентификации и контроля качества сырья и термообработанных пищевых продуктов.-21

1.5. Протеомный анализ сырья и пищевых продуктов.- 33

1.6. Метод электрофоретического разделения белков: принципы и использование в экспертизе пищевых продуктов.- 36

1.6.1. Электрофорез БОБ-РАОЕ (ШЕ).- 38

1.6.2. Двумерный электрофорез (2БЕ).- 40

Многие свойства мяса определяются изменениями, происходящими в белках. Это и формирование нежности, и вкуса, ВСС. В' настоящее время мясоперерабатывающая промышленность идет по пути максимального удлинения сроков хранения охлажденного мясного сырья. В связи с этим, ключевым вопросом является возможность определения изменений сырья под действием различных факторов, динамики течения процессов созревания, а также исследования изменений белков мышечной ткани в процессе длительного хранения мяса в различном термическом состоянии. Сравнительные исследования физико-химических и технологических изменений сырья при различных условиях хранения в настоящее время представляет особый интерес в связи с рядом актуальных проблем: значительного увеличения сроков хранения свинины в охлажденном состоянии, возможности идентификации термического состояния мясного сырья после холодильного хранения, применяемого для производства мясных продуктов и пр. Однако наибольшую сложность представляет определение доли мышечнотканного белка в многокомпонентных мясных продуктах, прошедших термическую обработку.

Определение биохимических изменений белкового состава мясного сырья различного термического состояния, а также определение доли мышечнотканного белка в многокомпонентных термообработанных мясных продуктах, может быть решена с использованием современных электрофоретических методов. Эти методы давно используются в научных исследованиях.

Однако для применения их с целью экспертизы мясного сырья, пищевых продуктов и внедрения в практику экспертных лабораторий необходима разработка и стандартизация оптимальных условий экстракции нативных и коагулированных мышечных белков, а также разработка условий проведения процесса электрофоретического разделения. Это направление весьма перспективно и дает возможность наиболее качественного анализа мясного сырья: Решение этой проблемы имеет научное и практическое значение. • .

Решение задач, поставленных в работе, основано на трудах таких ученых как Соловьев В.И., Соколов A.A., Пезацки В., Смородинцев И.А., Остерман JI.A., Белоусов A.A., Кудряшов JI.C., Arakawa N., Koohmaraie М.

Цель и задачи исследования

Целью диссертационной работы является изучение изменений белков мышечной ткани свинины под действием технологических факторов с использованием электрофоретических методов исследования.

Для достижения поставленной цели предполагается решить следующие задачи:

1. Разработать процедуры пробоподготовки сырья и мясных изделий для разделения нативных и коагулированных мышечных белков, как по массе, так и по изоэлектрической точке (pl);

2. Провести анализ результатов физико-химического, гистологического, микробиологического и электрофоретического методов исследований свинины в процессе длительного хранения в различном термическом состоянии и определить корреляционную зависимость между ними;

3. Изучить состав и свойства мышечных белков, а также закономерности их изменений под действием различных технологических факторов и процессов формирования заданных характеристик качества;

4. Исследовать возможности применения метода 2DE электрофоретического разделения, а также MALDI-картирования высокомолекулярных продуктов протеолиза для определения белкового состава термообработанных мясных изделий на примере вареных колбас;

5. На основе комплексного анализа протекания автолитических процессов и фракционного состава белков термообработанных мясных продуктов разработать методику определения продолжительности хранения свинины в различном термическом состоянии.

Научная новизна . - .

Научная новизна состоит в следующем:

Изучен характер и закономерности количественных и качественных изменений фракций мышечных белков свинины по массе и изоэлектрической точке под воздействием различных технологических факторов (температура, продолжительность хранения, термообработка, тип мышцы);

На основе методов протеомики предложены потенциальные белки-маркеры для идентификации мышечной ткани и прогнозирования срока хранения мясного сырья в зависимости от его термического состояния;

Разработаны математические модели количественной идентификации продолжительности созревания свинины, а также мышечной ткани термообработанных мясных продуктов - колбаса «Докторская»;

Методом электрофоретического разделения, а также МАЫН-картирования высокомолекулярных продуктов протеолиза изучен белковый состав вареной колбасы «Докторская».

Практическая значимость

Разработаны:

- Определена возможность количественного определения доли мышечной ткани в термообработанных мясных продуктах.

Разработаны:

- Методика пробоподготовки и электрофоретическому разделению нативных и коагулированных мышечных белков;

- Методика определения продолжительности хранения свинины в различном термическом состоянии.

Разработанная математическая модель количественного определения мышечной ткани в мясных продуктах позволит значительно снизить долю фальсифицированной мясной продукции.

Выводы.

1. Отработаны процедуры пробоподготовки и разделения: нативных мышечных белков - подобраны 3-й буферных раствора для экстракции различных фракций белков, а также режимы электрофореза- 20мА/100 V -1 ч и 35мА/200 У-2,5 ч; и коагулированных мышечных белков - буферный раствор с 8М мочевиной;

2. На основе анализа результатов физико-химического, гистологического и микробиологического исследования свинины в процессе длительного хранения и в различном термическом состоянии определена корреляционная зависимость между показателями количества растворимого белка, ВСС, МИ, электрофоретическим разделением и результатами, полученными при исследовании классическими методами исследования;

3. Проведен протеомный анализ мышечных белков. Изучено влияние некоторых технологических параметров на скорость и характер изменения белков мышечной ткани, таких как:

- способ хранения. Хранение сырья в виде отруба, значительно ускоряет автолитические процессы в сравнении с таковым в интактном состоянии (в полутуше). Количество- растворимого белка на 2 сут в полутуше и в отрубе находятся на одном уровне (2,1 г белка/100 г мяса). Максимальное содержание фракции - маркера нежности мяса с молекулярной массой 30 кДа установлено на 7 сут и 4 сут хранения в образцах осп полутуши и отруба, соответственно. Полученные результаты коррелируют с изменением показателя МИ;

- упаковка. Хранение отрубов в упакованном и неупакованном виде четко характеризуется показателем ВСС,%, который во время окоченения достигает минимума, и его величина на 3% и 14% ниже для упакованного и неупакованного сырья, соответственно, чем через 2 ч после убоя;

- тип отруба. Экстрагируемость белков осп по плечелопаточному отрубу на^ этапе созревания 6-12 суток хранения ~ плавно'"падает на 16 %. В тазобедренном отрубе на данном этапе созревания наблюдается иная картина изменения фракций растворимых белков - количество растворимого белка увеличивается на 0,5 г/100 г мяса, что составляет 25% Результаты электрофоретического разделения белков исследуемых отрубов показывают полное отсутствие фракции с молекулярной массой 150 кДа в тазобедренном отрубе бескостном, однако в плечелопаточном отрубе процесс распада белковых молекул происходит плавно. Распад фракции с молекулярной массой 150 кДа происходит на этапе 12-20 сут хранения;

- замораживание. Максимальная растворимость суммарной фракции миофибриллярных белков свойственна охлажденному мясу (2±2°С). Сразу же после его охлаждения растворимость белков снижается на 49%. Растворимость белков на 5 сут хранения при низких отрицательных температурах (-18±2°С) составляет 47% от исходного показателя. Растворимость белка свинины, оцененная сразу после 2-кратного замораживания (0 сут), так и через 5 сут возросла на 70% и 189% соответственно, от уровня охлажденного мясного сырья;

4. Изучена возможность применения метода электрофоретического разделения коагулированных мышечных белков 2DE, а также MALDI-картирования высокомолекулярных продуктов протеолиза для анализа фракционного состава белков термообработанных мясных продуктов;

5. Систематизированы и проанализированы результаты комплексного изучения скорости и характера протекания автолитических процессов в свинине в зависимости от различных факторов (тип мышцы, отруб или полутуша, упаковка под вакуумом, охлаждением и размораживание) разработана методика определения продолжительности хранения свинины в различном термическом состоянии.

1. Александрова, Н.А Методы оценки качества мяса и мясопродуктов за рубежом / Н.А Александрова. М.: Наука, 1997. - 156 с.

2. Алехина, JI.B. Современные методы анализа качества мяса и мясопродуктов / Л.В. Алехина, В.И. Андреенко, В.И. Ивашов. М.: Мясная промышленность, АгроНИИТЭИММП, 1991. - 35 с.

3. Антипова, Л.В. Методы исследования мяса и мясных продуктов / Л.В. Антипова, И.А. Глотова И.А. Рогов. М.: Колос, 2001. -572 с.

4. Арчаков, А.И. Биоинформатика, геномика, протеомика науки о жизни. / А.И. Арчаков. // Вопросы медицинской химии. - 2000. - Т. 46. -№1. - С. 3-7.

5. Базарова, В.И. и др. Исследование продовольственных товаров / В.И. Базарова. М.: Экономика, 1986. - 295 с.

6. Большаков, Л.С. Влияние условий посола на протеолитичсскую активность катепсинов говядины / Л.С. Большаков, Л.С. Кудряшов, Л.В. Горшкова.// Пищевая технология. -1986. №6. - С 24-26.

7. Бутко, М.П. Санитарно-гигиенические проблемы экспертизы мяса пернатой дичи / М.П. Бутко, Л.П. Шапкина. // Сб. трудов 7-го Всероссийского конгресса «Здоровое питание населения России», Москва. 2003. - С. 90.

8. Бэгшоу, К. Мышечное сокращение / К. Бэгшоу. М.: Мир, М.:, 1985.-С. 43-57.

9. Габриэлянц, M.JI. Товароведение мяса и мясных товаров / M.JI. Габриэлянц. М.: Экономика, 1974.

10. Горегляд, Х.С. Ветеринарно-санитарная экспертиза с основами технологии переработки продуктов животноводства / Х.С. Горегляд и др. -М.: Колос, 1981.

11. Горожанина, Е.С. Разработка метода идентификации сырья и продуктов животного и растительного происхождения на основе SDS-электрофореза: дис. канд. техн. Наук: защищена 2007 / Е.С. Горожанина. -М.: Изд-во МГУПБ, 2007. 150 с.

12. ГОСТ 9793-74 Продукты мясные. Методы определения влаги Текст. М.: Изд-во стандартов, 1974.

13. ГОСТ 10444.15-94 Продукты пищевые. .Методы определения количества мезофильных аэробных и факультативо-анаэробных микроорганизмов Текст. М.: Изд-во стандартов, 1994.

14. ГОСТ 19496-93 Мясо. Метод гистологического исследования Текст. М.: Изд-во стандартов, 1993.

15. ГОСТ 23042-86 Мясо и мясные продукты. Методы определения жира Текст. М.: Изд-во стандартов, 1986.

16. ГОСТ 25011-81 Мясо и мясные продукты. Методы определения белка Текст. М.: Изд-во стандартов, 1981.

17. ГОСТ Р 50207-92 Мясо и мясные продукты. Метод определения Ь(-)-оксипролина Текст. М.: Изд-во стандартов, 1992.21; ГОСТ Р- 50453-92 Мясо ш мясные продукты: Определение содержания азота (арбитражный метод) Текст. М.: Изд-во стандартов, 1992.

18. ГОСТ Р 52196-2003 Изделия колбасные вареные. Технические условия Текст. М.: Изд-во стандартов, 2003.

19. ГОСТ Р 51478-99 Мясо и мясные продукты. Контрольный метод определения концентрации водородных ионов (рН) Текст. М.: Изд-во стандартов, 1999.

20. ГОСТ Р 52427-2005 Промышленность мясная. Продукты пищевые. Термины и определения Текст. М.: Изд-во стандартов, 2005.

21. ГОСТ Р 52480-2005 Мясо и мясные продукты. Ускоренный гистологический метод определения структурных компонентов состава Текст. М.: Изд-во стандартов, 2005.

22. ГОСТ Р 52986-2008 Мясо. Разделка свинины на отрубы. Технические условия Текст. М.: Изд-во стандартов, 2008.

23. Дроздов, Н.С. Практическое руководство по биохимии мяса / Н.С. Дроздов. М.: Птицепромиздат, 1950. - С. 249-270.

24. Долгов,' В.А. Методические аспекты оценки качества и безопасности пищевой продукции и продовольственного сырья / В.А. Долгов, С.А. Лавина. // Сб. трудов 7-го всероссийского конгресса «Здоровое питание населения России», Москва. 2003. - 162 е.

25. Донченко, Л.В. Безопасность пищевого сырья и продуктов питания / Л.В. Донченко, В.Д. Надыкта. М.: Пищепромиздат, 1999. - 352 с.* 31. Донченко, Л.В. Безопасность пищевой продукции / Л.В. . Донченко, В.Д. Надыкта. - М.: Пищепромиздат, 2001. - 525 с.

26. Дубинская, А.П. Изменения белков фракции актомиозина мяса буйволов в процессе его созревания, а. также под влиянием препарата протеолитического фермента: автореф. дис. канд. техн. наук: защищена 2000 / Дубинская А.П. Москва: Изд-во ВНИИМП, 2000.- 26 с.

27. Дэвени, Т. Аминокислоты, пептиды и белки / Т. Дэвени, Я. Гергей. М.: Мир, 1976. - С 7-45.

28. Елисеева, Л.Г. Товароведение и экспертиза продовольственных товаров / Л.Г. Елисеева. М.: Международный центр финансово-экономического развития, 2005. - 800 с.

29. Житенко, П.В. Справочник по ветеринарно-санитарной экспертизе продуктов животноводства / Житенко П.В. и др. М.: Колос, 1980. - 319 с.

30. Журавская, Н.К. Исследование и контроль качества мяса и мясопродуктов / Н.К. Журавская, Л.Т. Алехина, Л.М. Опряшенкова. М.: Агропромиздат, 1985. - 296 с.

31. Загаевский, И.С. Ветеринарно-санитарная экспертиза с основами технологии переработки продуктов животноводства / И.С. Загаевский, Т.В. Жмурко. М.: Колос, 1983.

32. Заяс, Ю.Ф. Качество мяса и мясопродуктов / Ю.Ф. Заяс. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1981. - 312 с.

33. Иваницкий, Г.Р. Биофизические и биохимические методы исследования мышечных белков / Г.Р. Иваницкий. Л.: Наука, 1978. - С. 139.

34. Колесников, В.Т. Товароведение пищевых продуктов / В.Т. Колесников и др. Киев.: Высшая школа, - 1976. - 226 с.

35. Крылова, H.H. Биохимия мяса / H.H. Крылова, Ю.Н. Лясковская. М.: Пищевая промышленность, - 1968. - С. 139-149, 186-225.

36. Кудряшов, JI.C. Катепсины и их роль при созревании и посоле мяса / JI.C. Кудряшов, H.H. Потипаева. М.: АгроНИИТЭИММП, Выпуск 2,- 1995.-С. 1-13.

37. Кудряшов, JI.C. Физико-химические и биохимические основы производства мяса и мясных продуктов / JI.C. Кудряшов. М.: Дели, 2008. -С. 100-117.

38. Кузнецова, Т.Г. Оценка морфологических свойств мясного сырья и колбасных изделий по микроструктурным показателям: автореф. дис. канд. техн. наук: защищена 1997 / Кузнецова Т.Г. Москва: Изд-во ВНИИМП, 1997.- 30 с.

39. Лисицын, А.Б. Методы практической биотехнологии* / А.Б. Лисицын, А.Н. Иванкин, А.Д. Неклюдов. М.: ВНИИМП, 2002. - С. 46101.

40. Лисицын, А.Б. Теория и практика переработки мяса / А.Б. Лисицын и др. М.: ВНИИМП, 2004. - 378 с.

41. Лисицын, А.Б. Производство мясной продукции на основе биотехнологии / А.Б. Лисицын и др. М.: ВНИИМП, 2005. - 369 с.

42. Лисицын, А.Б. Мясо и здоровое питание / А.Б. Лисицын и др. М.: ВНИИМП 2007. - 289 с.

43. Лори, А. Наука о мясе / Лори А. М.: Пищевая промышленность, 1973.- С. 148-161.

44. Макаров, В.А. Ветеринарно-санитарная экспертиза с основами технологии и стандартизации продуктов животноводства / В.А. Макаров идр. М.: Агропромиздат, 1991. ' " < - -

45. Марч, Д. Органическая химия / Д. Марч. М.: Мир, 1987. - 481с.

46. Матрозова, С.И. Технохимический контроль в мясной и птицеперерабатывающей промышленности / С.И. Матрозова. М.: Пищевая промышленность, 1977. - 183 с.

47. Маурер, Г.Р. Диск-электрофорез / Г.Р. Маурер. М.: Мир, 1969,247 с.

48. Месхи, А.И. Биохимия мяса, мясопродуктов и птицепродуктов / А.И. Месхи. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1984. - С. 152-173.

49. Миронов K.M. Влияние биотехнологической обработки парного сырья на качество ямных консервов: дис. канд. техн. наук: защищена 2006 / K.M. Миронов. Улан-Удэ.: Изд-во г. Улан-Удэ, 2006. -160 с.

50. Михаленко, В.Е. Товароведение пищевых продуктов / В.Е. Михаленко. М.: Колос, 1989.

51. МУК Метод определения изолята соевого белка в термообработанных мясных продуктах Текст. М.: 2010 (на утверждении).

52. МР Определение свежести мяса на приборе «VOCmeter» Текст. М.: Изд-во ВНИИМП, 2008.

53. Николаева, М.А. Идентификация и фальсификация пищевых продуктов / М.А. Николаева, Д.С. Лычников, А.Н. Неверов. М.: Экономика, 1996.

54. Остерман, Л.А. Методы исследования*белков- и. нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование / Л.А. Остерман. М.: Наука, 1981.-320 с.

55. Остерман, Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами / Л.А. Остерман. М.: Наука, 1983. - 304 с.

56. Остерман, Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот / Л.А. Остерман. М.: Наука, 1985.

57. Овчинникова, С.И. Практикум по биологической химии. Качественный и количественный анализ аминокислот, белков, ферментов / С.И. Овчинникова. // Учеб. пособие УМО университетов России, Мурманск.: Изд-во МГТУ, 2001. 4.1. - 149 с.

58. Пезацки, В. Послеубойные изменения животного сырья / В. Пезацки. М.: Пищевая промышленность, 1964. - С. 9-63.

59. Писарева, В.М. Идентификация белков животного происхождения в пищевых продуктах электрофоретическим методом: дис. канд. техн. наук: защищена 1999 / В.М. Писарева. М.: Изд-во МГУ lib, 1999. - 135 с.

60. Поттхаст, К. Химия белковых веществ / К. Поттхаст // Разработка ученых Института химии и физики Федерального центра по исследованию мяса, сборник трудов / Химия и физика мяса, Кульмбах, Германия, 1981. С.22-39 (перевод ВНИИМП 2004).

61. Рогов, И.А. Технология мяса и мясных продуктов / И.А. Рогов, А.Г. Забашта, Г.П. Казюлин. // Книга 1. Общая технология, мяса. М.: Колос, 2009. - 565 с.

62. Рогов, И.А. Химия пищи / И.А. Рогов, Л.В. Антипова, Н.И. Дунченко. М.: Колос, 2007. - 853 с.

63. Рогов, И.А. Биотехнология мяса и мясопродуктов: курс лекций / И.А. Рогов и др. М.: ДеЛи принт, 2009. - 296 с.•' '73. ' ■ Рогожин^В.В. Биохимия мышц мяса / В:В. :Рогожин.->Санкт-Петербург.: Гиорд, 2006.-240 с.

64. Розанцев, Э.Г. Биохимия мяса и мясных продуктов (общая часть) / Э.Г. Розанцев. М.: ДеЛи принт, 2006. - 236 с.

65. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов. / Под ред. И.М. Скурихина., В.А. Тутеляна. М.: Изд-во. «Брандес», «Медицина», 1998. - 232 с.

66. СанПин 2.3.2. 1078-01 Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов Текст. М.: Изд-во стандартов, 2001.

67. Сергеева, Е.Л. Изменения миофибриллярных белков в процессе холодильной обработки и хранения мяса / Е.Л. Сергеева. М.: Холодильная техника, 1983. - № 1. - С. 30-32.

68. Сертификация пищевых продуктов и продовольственного сырья в Российской Федерации. М., 1996. - 191 с.

69. Скалинский, Е.И. Микроструктура мяса / Е.И. Скалинский, A.A. Белоусов.//Пищевая промышленность, 1978.- с. 155-175.

70. Скоупс, Р. Методы очистки белков / Р. Скоупс. М.: Мир, 1985, С. 56-81, 197-239, 316-337.

71. Смородин, A.B. Особенности автолитических процессов мышечной ткани животных различных пород / A.B. Смородин, Е.П. Мирошникова. М.: Мясные технологии, 2010. - №2. - С. 134-135.

72. Смородинцев, И.А. Биохимия мяса ЛИ.А. Смородинцев. М.: Птицепромиздат, 1952, С. 211-216.

73. Соколов A.A. Физико-химические и биохимические основы технологии мяса и мясопродуктов / A.A. Соколов. М.: Пищевая промышленность, 1965.

74. Соловьев В:И. Биохимия созревания мяса: автореф. дис. докт. биол. наук: защищена 1965 / В.И. Соловьев. М; 1965.- 32 с.85. * Соловьев, В.И. .Созревание мяса (теория и практика процесса) / В.И.Соловьев. М.: Пищевая промышленность, 1966. - 337 с.

75. Спирин, А.С. Биосинтез белка и нуклеиновых кислот / А.С. Спирин. -М.: Наука, 1965.- С. 171-193.

76. Степанов, В.М. Молекулярная биология / В.М. Степанов. М.: Высш. шк., 1996. - 337 с.

77. Стрекозов, Н.И. Сертификация и требования к качеству продукции агропромышленного комплекса России / Н.И. Стрекозов и др. М.: Изд-во «Дубровицы», 1998. - С. 357.

78. Тертон, М. Новые методы иммуноанализа / М. Тертон и др. -Пер. с анг. М.: Мир, 1991, 280 с.

79. Тимофеева, В.А. Товароведение продовольственных товаров /

80. B.А. Тимофеева. М.: Феникс, 2005. - С. 234.

81. Тихонов, С.Л. Прогнозирование качества мясного сырья / С.Л. Тихонов, В.М. Поздняковский. // Хранение и переработка сельхозсырья, 2007. №12. - С. 64-65.

82. Фишер, X. Изменения в мышцах после убоя / X. Фишер. // Разработка ученых Института химии и физики Федерального центра по исследованию мяса, сборник трудов // Химия и физика мяса, Кульмбах, Германия, 1981, С. 76-89 (перевод ВНИИМП 2004).

83. Хамм, Р. Структура и функции мышц / Р. Хамм // Разработка ученых Института химии и физики Федерального центра по исследованию мяса, сборник трудов // Химия и физика мяса, Кульмбах, Германия, 1981,

84. C. 59-75 (перевод ВНИИМП 2004).

85. Хвыля, С.И. Практическое применение гистологических методов анализа / С.И. Хвыля, В.В. Авилов, Т.Г. Кузнецова. // Мясная промышленность, 1994. №6. - С. 9-11.

86. Хехт, X. Созревание и нежность мяса / X. Хехт // Труды ученых Федерального центра по исследованию мяса // Кульмбахскиесборники, выпуск 6' /- Физико-химические -признаки качества . мяса, . -г Кульмбах, Германия, 1986, С. 41-66.

87. Ali, A.S. Effect of some ante-mortem stressors on peri-mortem and post-mortem biochemical changes and tenderness in broiler breast muscle: a review / A.S .Ali, A.P. Harrison, J.F. Jensen. // Poultry Science, Mont Morris, 1999, v.55, p. 403-414.

88. Arakawa, N. Effect of Temperature and pH on Tropomyosin-Troponin and Purified a-Actinin from Rabbit Muscle / N. Arakawa, E. Darrel. // Departments of Animal Science, Biomchemistry and Biophysics, and Food Technology, v.23, p. 340- 405, 2000.

89. Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M.M. Bradford. // Analyt. Biochem., 1976, v.72, p. 248-254.

90. Brownstein, M.J. Functional Genomics / M.J. Brownstein, A. Khodursky. Humana Press. Totowa, 2003. - 272 p.

91. Caroline, M. Tenderness An enzymatic view / M. Caroline, L. Paul, G. Ronald. //Meat Science 84 (2010) p. 248-256.

92. Choi, Y.M. Muscle fiber characteristics, myofibrillar protein isoforms, and meat quality / Y.M. Choi, B.C. Kim. // Livestock Science 1222009) p. 105-118.

93. Christensen, L. Texture changes and myosin oxidation during ripening of salted herring / L. Christensen, E. Andersen, M. Christensen. // 55th International Congress of Meat Science and Technology. Copenhagen, Denmark, Proceedings. - 2009.

94. Clausen, I. Modified atmosphere packaging affects lipid oxidation, myofibrillar fragmentation index and eating quality of beef / I. Clausen, M. Jakobsen. // Packaging technology and science. 2009, p. 85-96.

95. Codex Alimentarius Volume Thirteen. Methods of analysis and sampling//Vol. 13,FAO, WHO, 1994, 134 p.

96. Codex Alimentarius Volume Ten. Meat and meat products including soups-and broths. // Vol. 10, FAO, WHO, 1994, 222 p.

97. Culler, R.D. Relationship of Myofibril fragmentation index to certain chemival, physical and sensory characteristics of bovine longissimus muscle / R.D. Culler, F.C. Parrish, G.C. Smith. // Journal of Food Science, 43, 1978, p. 1177-1180.

98. Del Moral, F.G. Image analysis application for automatic quantification of intramuscular connective tissue in meat / F.G. Del Moral, F. O'Valle, M. Masseroli, R.G. Del Moral. //Journal of Food Engineering, 81 (2007) 33-41.

99. Dransfield, E. Modeling post-mortem tenderization. Ill Role of calpain in conditioning / E. Dransfield. // Meat Science, Savoy, v.31, p.57-73, 1992.

100. Ducating, L. Effect of cicatrical stimulation on post-mortcn changes in the activities of two Ca dependent nuetra) proteinases and their inhibitor in beef muscle / L. Ducating, C. Valin, S. Schoolmcycr. //Meat Sciense. 1988. N4. p. 193-202.

101. Failla, S. Changes in meat quality characteristics of two beef muscles during ageing. Tenderness and myofibrillar degradation / S. Failla et al.. // 55th International Congress of Meat Science and Technology. -Copenhagen, Denmark, Proceedings. 2009.

102. Fleming, J. Lumbley. // Food Sciens and technology today, v. 9, № 2, 1995, p.84.85.

103. Flores, M. Nitrogen compounds as potential biochemical markers of pork meat quality / M. Flores, V.J. Moya, F. Toldra. // Food Chemistry, 69 (2000), 371-377.

104. Frylinck, L. Evaluation of biochemical parameters and genetic markers for association with meat tenderness in South African feedlot cattle / L. Frylinck, G.L. van Wyka. // Meat Science, 83 (2009), p. 657-665.

105. Göll, D.E. What causes post-mortem tenderization? / D.E Göll, M.L. Boehm, G.H. Geesink. // Reciprocal Meat Conference, Savoy, v.50, p. 6067, 1997.

106. Helman, E. E. Effect of dietary protein on calpastatin in canine skeletal muscle / E. E. Helman et al.. // 55th International Congress of Meat Science and Technology. Copenhagen, Denmark, Proceedings. - 2009.

107. Hoffmann, K. Identification and determination of meat and foreign proteins by means of dodecylsulfat poliacrylamid gel electrophoresis / K. Hoffmann. // Ann. Nutr. Alim., v. 31, № 2, 1997, p. 207-215.

108. Hoffmann, K. Methode zur identifizierung und quantitatizen Bestimmund von Fleisch und Fremdeiness mit Hilfe de SDS. Polyacrylamid -Electrophorese and Flachgelen / K. Hoffmann, I.T. Penny. // Fleischwirtschafi, v.53, 1973, p. 252-254.

109. Koohmarie, M. Effect of post-morten storage on muscle protein degradationranalisis by SDS-poliacrilamide gel electrophoresis / M. Koohmarie, W. Kennick, E. Elgasim. // Food Sceinse, v 49,№1. P.292-293.

110. Koohmaraie, M. Muscle proteinases and meat aging / M. Koohmaraie. //Meat Science, Savoy, v.38, 1994, p.93-104.

111. Koohmaraie, M. Role of the neutral proteinases in post-mortem muscle protein degradation and meat tenderness / M. Koohmaraie. // Reciprocal Meat Conference, Savoy, v.45, p.63-71, 1992.

112. Koohmaraie, M. The Role of Ca-2+-Dependent Proteases (Calpains) in Postmortem Proteolysis and Meat Tenderness / M. Koohmaraie. //Biochimie (1992) 74, p. 239-245.

113. Kronmann, M.I. Meat aging and freezing. Post-Mortem changes in the Water-Soluble Proteins of Bovine skeletal Muscle during Aging and Freezing / -M.I. Kronmann, R.I. Winterbottom. // Journal of Agricultural and Food Chemistry, 8.1, 1960, p. 67-72.

114. Kussmann, M. Proteomics in nutrition and health / M. Kussmann, M. Affolter, L. Fay. // Combinatorial Chem.&High. Throng. Screening, Vol. 8., 2005, p. 679-696.

115. Kwasiborski, T. Pig Longissimus lumborum proteome: Part II: Relationships between protein content and meat quality / T. Kwasiborski, C. Sayd, V. Chambón. // Meat Science, 80 (2008), p. 982-996.

116. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage / U.K. Laemmli. // Nature, T4, v.227, 1970, p.680-683.

117. Lametsch, R. Identification of Protein Degradation during Postmortem Storage of Pig Meat / R. Lametsch, P. Roepstorff, E. Bendixen. // 55th- International Congress of."Meat Science and' Technology.~ Copenhagen, Denmark, Proceedings. - 2009.

118. Lee, Y.S. Effect of post-morten pH and temperature on bovine muscle structure and meat tenderness / Y.S. Lee. // Food Science. 1986, v.SI, №3. p. 774-780.

119. Lesiak, M.T. Effects of post-mortem time before chilling and chilling temperatures and texture of turkey breast muscle / M.T. Lesiak et al.. // Poultry Science, Blacksburg, v.16, 1997, p.552-556.

120. Li, W. Identification of pork quality parameters by proteomics / W. Li. // Meat Science 77 (2007) 46-54.

121. Lonergan, E.H. Interaction between myofibril structure and proteolytic tenderization in beef / E.H. Lonergan, S.M. Lonergan. // 55th-International Congress of Meat Science and Technology. Copenhagen, Denmark, Proceedings. - 2009.

122. Lonergan, S.M. Postmortem proteolysis and tenderization of top loin steaks from brangus cattle / S.M. Lonergan, E. Huff-Lonergan. // 55th International Congress of Meat Science and Technology. Copenhagen, Denmark, Proceedings. - 2009.

123. Mckee, S.R. Rigor mortis development at elevated temperatures induces pale, soft and exudative turkey characteristics / S.R. Mckee, A.R. Sams. // Poultry Science, Blacksburg, v.77, p.169-174, 1998.

124. Miller, R.K. Method for Improving meat tenderness / R.K. Miller et al.. // Reciprocal Meat Conference, Savoy, v.49, p.106-121, 1997.

125. Morzel, M. Proteome changes during pork meat ageing following use of two different pre-slaughter handling procedures / M. Morzel, C. Chambon, M. Hamelin. // Meat Science 67 (2004), p. 689-696.

126. Ouali, A. Proteolytic and physicochemical mechanisms involved in meat texture development / A. Ouali. // Biochimie, Paris, v.74, p.251-265, 1992.

127. Pomponio, L. Evidence for post-mortem m-calpain autolysis in porcine muscle / L. Pomponio et al.. // Meat Science 80 (2008), p. 761-764.

128. Rowe, L.J. Influence of early postmortem protein oxidation on beef quality / L.J. Rowe, K.R. Maddock, S.M. Lonergan. // 55th International Congress of Meat Science and Technology. Copenhagen, Denmark, Proceedings. - 2009.

129. Rowe, L.J. Relationship between a measure of troponin-T degradation and beef tenderness / L.J. Rowe, E. Huff-Lonergan, G.H: Rouse. // Journal of Animal Science (2001), 79, (Suppl.l) 443.

130. Sante-Lhoutellier, V. Effect of animal (lamb) diet and meat storage on myofibrillar protein oxidation and in vitro digestibility / V. Sante-Lhoutellier, E. Engel. //Meat Science, 79, (2008), p. 777-783.

131. Schagger, H. Tricine-sodium dodecylsulfate electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa / H. Schagger, G. von Jagow. // Analyt.Biochem., 1987, v. 166, p.368-379.

132. Schreurs, F.J. Post-mortem changes in chicken muscle / F.J. Schreurs. // Poultry Science, MontMorris, v.56, p.319-346, 2000.

133. Seymour, C. Electrophoresis technology: food and reverage analysis / C. Seymour. // Food Tech. Europe, 1993, Sept/Nov., p. 127-152.- . 158. Shering; B. Zur.Verkehrsfahigkeit von Geflugel wurst./B. Shering.//-Fleischwirtschaft, 2007, №1, p 84-88.

134. Soltanizadeh, N. Comparison of fresh beef and camel meat proteolysis during cold storage / N. Soltanizadeh et al.. // Meat Science 80, (2008), p. 892-895.

135. Snyman, J.D. Comparison of two methods to determine myofibril fragmentation post mortem / J.D. Snyman, L. Frylinck, P.E. Strydom. // 55th International Congress of Meat Science and Technology. Copenhagen, Denmark, Proceedings. - 2009.

136. Soyer, A. Effects of freezing temperature and duration of frozen storage on lipid and protein oxidation in chicken meat / A. Soyer, B. Ozalp, U. Dalmis, V. Bilgin. //Food Chemistry, 120 (2010), p. 1025-1030.

137. Stewart, M.K. The effect of hot boning broiler breast meat muscle on post-mortem pH decline / M.K. Stewart et al.. // Poultry Science, Blacksburg, v.63, p. 2181-2186, 1984.

138. Stomakhin, A.A. DNA sequence analysis by hybridization with oligonucleotide microchips: MALDI mass spectrometry identification / A.A. Stomakhin, V.A. Vasiliskov. // Nucl. Acid Res, 2000, Vol. 28, p. 1193-1198.

139. Tribot, L.P. Ageing time effect on meat tenderness of 5 beef muscles provided by steers and dairy cows / L.P. Tribot, C. Evrat-Georgel, P. Cartier. // 55th International Congress of Meat Science and Technology. -Copenhagen, Denmark, Proceedings. 2009.

140. Vallejo-Cordoba, B. Capillary electrophoresis for bovine and ostrich meat characterization / B. Vallejo-Cordoba, R. Rodmguez-RamHrez, A.F. Cyrdova. // Food Chemistry 120 (2010), p. 304-307.

141. Wang, S. Chymotryptic proteolysis accelerated by alternating current for MALDI-TOF-MS peptide mapping / S. Wang et al.. // Journal of proteomics, 72(2009), p. 640-647.

142. Wheeler, T.L. Variation in proteolysis, sarcomere length,collagen content, and tenderness among major pork muscles / T.L. Wheeler, S.D.• Shackelford, M. Koohmaraie. //.Journal of-Animal Science;- (2000)-78, -p. .958-. 965.

143. Williams, K.W. A carrier ampholyte for isoelectric focusing / K.W. Williams, L. Soderberg. // International Laboratory, № 96, 1979, p. 263-278.

144. Yamamoto, K. Quantitative descriptive analysis. / K. Yamamoto, H.J. Pearce. // Applied sensory analysis of food, New York : CRC, 1988. p.43-71.

145. Youling, L. Tenderness and oxidative stability of post-mortem muscles from mature cows of various ages / L. Youling, E., Oliver. //Meat Science 77 (2007) 105-113.

146. Young, L.L. Effect of postchill and sodium tripolyphosphate on moisture binding properties, color, and Warner Bratzer shear values of chicken breast meat / L.L. Young; C.E. Lyon. // Poultry Science, Blacksburg, v.78, p.1587-1590, 1997.

147. Zecc, M. Effect of catepsin D on bovine miolibrits under deflects of postmortem pH and temperature / M. Zecc, K. Kanton, R. Robson. // Food Science, 1986, v.51. №3. p. 769-773.