автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.04, диссертация на тему:Применение биотехнологических и протеомных методов при разработке продуктов питания гиполипидемического и вазопротекторного действия

На правах рукописи

Котенкова Елена Александровна

ПРИМЕНЕНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ И ПРОТЕОМНЫХ МЕТОДОВ ПРИ РАЗРАБОТКЕ ПРОДУКТОВ ПИТАНИЯ ГИПОЛИПИДЕМИЧЕСКОГО И ВАЗОПРОТЕКТОРНОГО ДЕЙСТВИЯ

Специальности:

05.18.04 - технология мясных, молочных и рыбных продуктов и

холодильных производств и 05.18.07 - биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ

13 СЕН 2015

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва 2015

005562516

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский институт мясной промышленности имени В.М.Горбатова» (ФГБНУ «ВНИИМП им. В.М. Горбатова»).

Научный руководитель:

Чернуха Ирина Михайловна

доктор технических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Абрамова Любовь Сергеевна

доктор технических наук, профессор, ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии», советник директора по рациональному использованию водных биоресурсов.

Кочеткова Алла Алексеевна

доктор технических наук, профессор ФГБНУ «НИИ питания», заведующий лабораторией пищевых биотехнологий и специализированных продуктов.

Ведущая организация:

ФГБНУ «Поволжский НИИ производства и переработки мясомолочной продукции».

Зашита диссертации состоится «29» октября 2015 г. в 13 часов 00 мин на заседании диссертационного совета ДМ 006.021.01 при ФГБНУ «ВНИИМП им. В.М. Горбатова» по адресу:

109316, Москва, ул. Талалихина. 26.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБНУ «ВНИИМП им. В.М. Горбатова» и на сайте www.vniimp.ru.

Автореферат разослан ч/б» сентября 2015 г.

Отзыв на автореферат (в двух экземплярах), заверенный печатью, присылать по адресу: 109316, Москва, ул. Таташхина. 26

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат технических наук, старший научный сотрудник ' А.Н. Захаров

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования.

В последнее время особое внимание в составе комплектной терапии алиментарнозависнмых заболеваний таких, как гиперлипидемия, атеросклероз и сердечнососудистые заболевания (ССЗ), уделяется питанию. Публикации последних лет показывают, что специальное питание может нивелировать развитие атеросклероза, оно также необходимо и для коррекции развитого метаболического синдрома.

Среди общей смертности в России ССЗ составляют 57%, в Европе смертность от ССЗ достигает 48%. Согласно статистике последних лет в структуре смертности от ССЗ, 85,5% приходится на долю ИБС (ишемическая болезнь сердца). Этой патологии, во многом обусловленной атеросклерозом, и отдается приоритет, когда разрабатывается программа профилактики ССЗ. немаловажным компонентом которой является коррекция рациона питания, а также применение продуктов функциональной направленности.

Примечательно, что во многих странах, где смертность быстро снижается, количество госпитализаций по причине ССЗ не уменьшается пропорционально. Снижение смертности от ССЗ связано с увеличением лечебно-профилактических мероприятий, пропаганде здорового образа жизни, включая здоровое питание. Тем не менее, риск развития заболеваний и их обострений все же остается.

Более того. ССЗ, с учетом наблюдаемой пандемии ожирения у детей и подростков, могут распространиться и на более молодые группы людей, а. следовательно, они будут оставаться крупнейшей проблемой здравоохранения в России и мире на протяжении ближайших десятилетий.

Ключевым звеном борьбы с ССЗ является коррекция нарушений метаболизма. Имеющиеся подходы к коррекции гиперлипидемий и атеросклероза преимущественно включают медикаментозную практику, для проведения медикаментозного лечения дислипидемий и атеросклероза применяются статииы. секвестранты (или сорбенты) желчных кислот (СЖК). никотиновая кислота (НК), фибраты. Как правило, все препараты имеют серьезные побочные действия, к тому же они дорогостоящи, поэтому важно разработать подход к коррекции атеросклероза и гиперлипидемий, который будет оптимальным по соотношению «цена-эффект».

Степень разработанности темы.

Известно, что коррегирующее липидоснижающее действие оказывают растительный белок, растительные волокна, витамины, антиоксиданты. Разработаны и уже имеются в ассортименте хлебобулочные и молочные продукты, содержащие липидоснижающие агенты. Мясная индустрия также движется в сторону создания продуктов с заданными гиполипидемическим, гипотензивными, антиоксидантными, противовоспалительными свойствами и направленным протекторным действием. В мясное производство внедряются методы обогащения мясных продуктов полиненасыщенными жирными кислотами, конъюгированной линолевой кислотой, природными антиоксидантами. частичная замена животного жира на растительный белок и пищевые волокна, ферментация самого сырья, прижизненная модификация мясного сырья. Также больше внимания стали уделять различным гидролизатам мясного сырья в силу содержания в них биоактивных пептидов, обладающих холестерин-снижающей и гипотензивной активностями. Неоспоримым преимуществом таких продуктов по отношению к лекарственным средствам служит их низкая цена, они не имеют противопоказаний или предельно допустимой дозы суточного

применения, их можно употреблять годами и, кроме того, обладая пищевой и биологической ценностью, они способствуют насыщению организма.

Значительный вклад в проработку теории функционального питания и его практической реализации внесли К. Arihara, F. Toldrá, М.-С. Aristoy, J. M. Fernández-Ginés B.K. Мазо, А.Б. Лисицын, И.М. Чернуха, A.B. Устинова, В.А. Тутельян, A.A. Кочеткова.

Таким образом, выявление, выделение, изучение действия и разработка новых функциональных мясных ингредиентов с кардио-вазопротекторными свойствами является актуальной задачей.

Цель и задачи.

Цель - разработать биотехнологию функционального продукта питания/ингредиента, обладающего кардио-вазопротекторным действием, на основе новых знаний о биологически активных соединениях и подтвердить его состав и заявленные свойства

Задачи:

1. Систематизировать научные данные, подтверждающие гипотезу о возможности выделения из животных органов и тканей белковых веществ, обладающих коррегирующим действием, определить направления исследования;

2. Провести сравнительный анализ физико-химических показателей, белкового и пептидного составов выбранного мясного сырья;

3. Разработать и апробировать модель экспериментального атеросклероза и на ней оценить лечебно-терапевтические свойства изучаемого сырья, в том числе гиполипидемические, и противовоспаштельные; на основе полученных данных определить наиболее активное сырье;

4. Оптимизировать условия выделения биологически активных фракций сырья, на модели атеросклероза in vivo и с применением протеомных методов подтвердить функциональные свойства фракций и готового продукта;

5. Разработать технологию функциональных пищевых продуктов и биологически активной добавки с заданным белково-пептидным профилем, обеспечивающим гиполипидемическое и вазопротекторное действия.

Научная новизна.

На основе научных изысканий и результатов физико-химических и протеомных технологий теоретически обоснован выбор тканей сердец и аорт КРС и свиней как потенциальных источников тканеспецифичных биологически активных, воалеченных в липидный обмен и нормализацию функции эндотелия. Обоснована возможность применения тканей сердец и аорт КРС и свиней для разработки функциональных пищевых продуктов в соответствии с Государственной политикой в области здорового питания населения на период до 2020 года от 25 октября 2010 г. N 1873-р.

Изучены потенциальные гиполипидемические, противовоспалительные и антиатеросклеротические свойства отобранного сырья, подтверждено наличие в свиной аорте Аполипопротеина А-1. участвующего в формировании ЛПВП, а также пероксиредоксина 1 -фермента участвующего в подавлении окислительного стресса

Разработана и апробирована модель экспериментального алиментарного атеросклероза на лабораторных животных стока Wistar, пригодная для оценки гиполипидемических, противовоспалительных и антиатеросклеротических свойств как функциональных ингредиентов, так и фармакологических субстанций.

Изучено влияние белковых и белково-пептидных фракций на липидный обмен и функцию эндотелия у лабораторных животных с моделью экспериментального атеросклероза

Теоретическая и практическая значимость работы.

Теоретическая. Со стороны теории содержания тканеспецифических биологически активных веществ в соответствующем органе показана возможность создания продуктов здорового питания на их основе или основе выделенных из него отдельных белково-пептидных фракций, с перспективой их использования как компонента лечебно-профилактических мер язя борьбы с ростом ССЗ.

Практическая. Разработаны: Стандарт организации СТО 00419779-003-2015 «Консервы мясные фаршевые стерилизованные дзя функционального питания из сердец и аорт свиней». Лабораторный регламент на производство Функционального мясного продукта. Методические рекомендации по экспериментальному моделированию сердечно-сосудистых заболеваний у лабораторных животных. Патент № 2524127 от 30.05.2014 г. на «Способ моделирования экспериментального атеросклероза». Патент № 2550649 от 10.04.2015 г. «Функциональный мясной продукт и способ его получения».

Методология и методы исследования. В работе, помимо рутинных методов исследований (химический, аминокислотный и жирнокислотный составы), использовались биохимические, гематологические. иммуноферментные, гистологические, патоморфологические методы для оценки действия мясного сырья и белково-пептидных фракций in vivo, а также электрофоретические и хромато-масс-спектрометрические - для анализа белково-пептидного профиля исследуемого сырья.

Положения, выносимые на защиту:

- результаты физико-химических исследований сердец и аорт КРС и свиней, включая результаты протеомных исследований:

- методику экстракции БАВ с последующим выделением наиболее активной фракции методом ул ьтрафи л ьтраци и :

- экспериментальные доказательства гиполипидемических, противовоспалительных и антиатеросклеротических свойств исследуемого сырья и белково-пептидных фракций;

- экспериментальные подтверждения влияния тканеспецифичных БАВ на репарационные процессы при атеросклерозе, включая анализ реакции эндотелиального слоя сосудистой стенки.

Степень достоверности н апробации результатов.

Материазы исследования обсуждались на IX Международной научной конференции молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения», Москва МГУПБ, 2011: на 58 и 60 Международных конгрессах по науке и технологии мяса (ICoMST, 2012 Montreal. Canada 2014 Punta del Este. Uruguay): на 15-и (2012) и 17-й (2014) Международных научно-практических конференциях памяти В. М. Горбатова Москва ВНИИМП; на Научно-практической конференции «Научно-инновационные аспекты при создании продуктов здорового питания». Углич. 2012; на VII научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Отделения хранения и переработки сельскохозяйственной продукции «Научный вклад молодых ученых в развитие пищевой и перерабатывающей промышленности АПК», Москва 2013; на Международных научно-практических конференциях «Пути интенсификации производства и переработки сельскохозяйственной продукции в современных условиях. Переработка сельскохозяйственного сырья и пищевых продуктов», г. Волгоград. 2012, «Инновационные технологии в производстве сельскохозяйственной продукции в у словиях ВТО. Переработка сельскохозяйственного сырья и пищевых продуктов, г. Волгоград, 2013, «Новые подходы, принципы и механизмы повышения эффективности производства и переработки сельскохозяйственной проду кции», г. Волгоград, 2014; на 6-ой Конференции молодых ученых

и специалистов институтов Отделения хранения и переработки сельскохозяйственной продукции, г. Видное, 2012; на Международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы и современные технологии производства продуктов питания", Кутаиси, Грузия, 2014; на VIII Международной конференции молодых ученых и специалистов "Фундаментальные и прикладные исследования по безопасности и качеству пищевых продуктов", г. Видное, 2014; на Международной научно-практической конференции «Инновационные исследования и разработки для научного обеспечения производства и хранения экологически безопасной сельскохозяйственной и пищевой продукции», ФГБНУ ВНИИТТИ ФАНО, 6-26 апреля 2015; на X Международной научно-технической конференции «Техника и технология пищевых производств». «Могилевский государственный университет продовольствия», Беларусь. 23 - 24 апреля 2015; на Научно-практической конференции с международным участием «Спортивное питание и спортивная медицина», Москва 1-2 июня 2015.

Часть работ была выполнена при поддержке Государственного контракта № 14.512.11.0038 «Разработка комплекса биотехнологических методов контроля качества пищевых продуктов, в том числе включающих использование протеомных технологий с апробацией их на вновь созданных функциональных мясных продуктах» (шифр заявки «2013-1.2-14-512-0013-008»),

Результаты работы были удостоены:

- Золотой медали Всероссийского Смотра-конкурса лучших инновационных разработок 4-5 июня 2013 г., г. Волгоград «За инновационные технологии конкурентоспособных функциональных мясных продуктов и ингредиентов» (в соавторстве с Федуловой Л.В.);

- 1-го места в конкурсе VII научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Отделения хранения и переработки сельскохозяйственной продукции Россельхозакадемии, Москва 2013:

- Награды за Лучшую научно-исследовательскую работу на VIII Международной конференции молодых ученых и специалистов РАН "Фундаментальные и прикладные исследования по безопасности и качеству пищевых продуктов", 4-5 декабря 2014г.. г. Видное;

- Персональной стипендии им. В.М. Горбатова в области фундаментальных и прикладных исследований в науке о мясе за 2013г;

- Персональной премии имени В.М. Горбатова (в соавторстве с Федуловой Л.В.) за работу «Изучение молекулярно-биологических основ действия тканеспецифических биологически активных компонентов мясного сырья с целью разработки функциональных продуктов для снижения риска развития и последствий сердечно-сосудистых заболеваний» за 2014г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 22 печатных работы, в т.ч.. 4 -журналах, входящих в перечень ВАК Минобрнауки РФ. 1 - в иностранном журнале.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа наложена на 166 страницах машинописного текста и включает введение, 6 глав, заключение, список литературы и приложения. Диссертация содержит 49 таблиц и 68 рисунков. Список использованной литературы включает в себя 176 источников, в том числе 61 работу отечественных авторов и 115 иностранных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Обоснованы актуальность темы диссертации, степень ее разработанности, научная новизна теоретическая и практическая значимость работы, положения, выносимые на защиту, указана степень достоверности и апробации результатов.

Глава 1. Обзор литературы. Приведен аналитический обзор научно-технической литературы и состояния индустрии функционального питания в России и за рубежом, рассмотрены литературные данные о структуре липидного обмена этиологии атеросклероза; оценена степень адаптированное™ мясной промышленности к требованиям мирового научного и потребительского сообществ. Структурирована информация о методах, подходах и технологиях, а также научных решениях в области создания пищевых продуктов с заданным составом и свойствами как на основе природных компонентов, так и тканеспецифических биологически активных веществах животного происхождения. Анализ публикаций позволил определить цель и сформулировать задачи исследования.

Глава 2. Организация эксперимента, объекты и методы исследования.

1) Сердца и аорты КРС и свиней;

2) Экстракты и ультрафильтраты аорт свиней;

3) Лабораторные животные (крысы и морские свинки), у которых моделировались гиперлипидемия и атеросклероз, их органы и ткани, кровь и сыворотка крови.

Экспериментальные исследования проводили в условиях Клинико-эксперименталыюй лаборатории биологически активных веществ животного происхождения и других лабораториях ФГБНУ «ВНИИМП им. В.М. Горбатова», а также в ИНБИ РАН биохимии им. А.Н. Баха

Проведение исследований осущесталялось в несколько этапов в соответствии со схемой, представленной на Рисунке 1. Определяли содержание: 1 - оксипролина по ГОСТ 23041-78; 2 -жира по ГОСТ 23042-86: 3 - общего азота и белка по ГОСТ 25011 -81; 4 - золы по ГОСТ 317272012; 5 - общего фосфора по ГОСТ 32009-2013; 6 - железа и цинка по ГОСТ 30178-96; 7 -селена по ГОСТ 31707-2012; 8 - соединительно-тканного белка и развариваемое™ коллагена по методу Соловьева В.И. (1966); 9-12 - саркоплазматических. солерастворимых. водорастворимых и щелочерастворимых белков путем изалечения белков соответству ющим буферным раствором и последующем определении их количества 13-15 - небелкового, пептидного и остаточного азота соответствующей пробоподготовкой и дальнейшим определением азота методом Къельдаля по ГОСТ 250 11 -81: 16 - белкового азота - по разности между количествами общего и остаточного азота: 17 - калия, натрия и кальция по Скурихину И.М. (1998): 18 - промышленну ю стерильность по ГОСТ 30425-97: 19 - аминокислотный состав - методом ионообменной хроматографии: 20 - жирнокислотный состав - по Ску рихину И.М. (1998): протеомный профиль - методом (21) одномерного электрофореза по Леммли. (22) двумерного - по О'Фарреллу; (23) -ВЭЖХ: 24 - аптиоксидантнуто активность in vitro - по отношению к катиону-радикалу АБТС. (25) по отношению к пероксильному радикалу ORAC: 26 - ex vivo - при воздействии азоинициатора свободнорадикальных реакций на клетки эпителия кишечника человека линии НТ-29: 27 - антиокислительную активность - по скорости окисления восстановительной формы 2.6-дихлорфенолиндофенола (2.6-ДХФИФ) кислородом, растворенным в реакционной среде, включая активность кататазы - по уменьшению концентрации перекиси водорода в реакционной среде, активности супероксиддисмутазы - измерением автоокисления пирогаллола в реакционной смеси; 28 - оптимизацию методов экстракции проводили на ЛДУ (Лаботекс. Россия): 29-ультрафильлрацию проводили на у становке Vivaflow 200 (Sartorius. Германия) и досушивали ультрафильтрат в лиофилыюй сушилке ИНЕИ-4 (Россия,

Рисунок 1 - Схема организации эксперимента

ИБП РАН): моделирование экспериментальных гиперлипидемии и атеросклероза у (30) крыс проводили в соответствии с патентом на изобретение № 2524127 от 30.05.2014 г.; (31) у морских свинок вызывали внутрижелудочным введением смеси холестерина с жирами из расчета 0.250.50 г/кг массы тела и витамина D2 из расчета 17500-35000Е/кг массы тела в течение 21 суток; 32 - исследования лечебно-терапевтических свойств свиного и говяжьего сырья на крысах проводилось добавлением исследуемых компонентов в рацион из расчета 5 г/голову в течение 28 суток; (33) на морских свинках - экстракта и ультрафильтратов свиной аорты, все исследуемые ультрафильтраты и экстракт вводились per os из расчета 8 мг белка/голову в течение 14 суток; 34 - микроструктурные исследования - по ГОСТ Р 51604 - 2000; окраска (35) гематоксилин-эозином. (36) Суданом III и (37) Oil Red О с докраской ядер гематоксилином; 38 -аназиз микроструктурных препаратов - на световом микроскопе «Axio Imager AI» (Carl Zeiss, Германия) с использованием видеокамеры AxioCam MRc 5 в программе AxioVision Rel.4.6; 39 -

биохимические показатели сыворотки крови - на полуавтоматическом анализаторе BioChem SA (HTI, США) и автоматическом анализаторе BioChem FC-360 в соответствии со стандартными методиками; 40 - гематологические исследования крови - на автоматическом анализаторе Abacus Junior Vet (Diatron, Австрия): 41 - интегральные показатели хронической интоксикации по Западнюк В.И., Захария Е.А. (1983): 42 - маркеры воспаления в крови - методом ИФА на фотометре ImmunoChem2100(НТ1, США); 43 - липидный спектр крови - на полуавтоматическом анализаторе BioChem SA (HTI, США) и автоматическом анализаторе BioChem FC-360 (HTI, США; 44 - остаточный холестерин рассчитывали по разности Общий холестерин - ХС ЛПВП -ХС ЛПНП, 45 - индекс атерогенности крови рассчитывази по формуле: (Общий холестерин - ХС ЛПВП)/ХС ЛПВП.

На первом этапе работ проводили анализ литературных данных с целью поиска подходящего животного сырья, гипотетически обладающего заданными функциональными свойствами (гиполипидемическими, антиатеросклеротическими и противовоспалительными), а также поиска адекватной модели экспериментальной гиперлипидемии и атеросклероза на крысах и морских свинках.

На втором этапе работ проводилось комплексное изучение характеристик говяжьего и свиного сырья. Изучали химический состав, физико-химические показатели, аминокислотный состав, белково-пептидный профиль и антиоксидантную емкость.

На третьем этапе на основании гистологических, патологоанатомических, биохимических и гематологических исследований разработана и апробирована модель экспериментальной гиперлипидемии и атеросклероза На крысах стока Wistar проводили сравнительную оценку гиполипидемической и антиатеросклеротической активностей говяжьего и свиного сырья. Было выбрало наиболее перспективное сырье для дальнейшего исследования.

На четвертом этапе проводился подбор методов экстракции и ультрафильтрации сырья для получения белковых и белково-пептидных фракций разных диапазонов молекулярных масс. Дазее проводили сравнительную оценку гиполипидемической и антиатеросклеротической активностей экстракта и ультрафильтратов свиной аорты, а также их влияние на сосудистый эндотелий, на модели экспериментальной гиперлипидемии и атеросклероза на морских свинках.

На пятом этапе работ проводилась опытная выработка наиболее эффективной белково-пептидной смеси и оценка ее физико-химического состава и свойств in vitro.

На шестом этапе проводилась разработка технической документации, производство функционального мясного проду кта и оценка его соответствия заявленным требованиям.

По резу льтатам анализа литературных источников были выбраны сердца и аорты КРС и свиней в качестве потенциальных источников тканеспецифичных биологически активных веществ, вовлеченных в липидных обмен и нормализацию фу нкции эндотелия.

Глава 3. Результаты комплексного исследования сердец и аорт КРС и свиней ex vivo как потенциального источника тканеспецифическнх биологически активных веществ.

Физико-химический состав исследуемого сырья представлен в Таблице 1.

Таблица 1. Общий физико-химический состав исследуемого сырья.

Показатель Сырье

Аорта свиней Аорта КРС Сердце свиней Сердце КРС

Массовая доля жира.% 13.27±0.21' 0.65±0.09 6.12±0.13 7.07±0.12

Массовая доля белка.'% 21.40tt0.30' 23.68±0.20' 13.23±0.25 16.43±0.25

Массовая доля золы.% 0.62±0.02 0.68±0.02 1.00±0.03' 1.05±0.03'

- р<0,05 по отношению к соответствующей мышечной ткани.

В целом, изученное сырье по физико-химическим показателям соответствовало функционально-структурным особенностям исследуемых тканей. Высокое содержание соединительнотканного белка в аортах обусловлено высоким содержанием коллагена и эластина в сердцах превалируют водо-, соле- и щелочерастворимые белковые фракции.

Увеличенное содержание зольных элементов в сердцах свиней и КРС: 67.3% и 54,4%, соответственно, (р<0,05 по отношению к аортам) обуслоалено функцией сердечной гладкомышечной ткани (сокращение и проводимость тканей), заключающейся в процессах сокращения и проводимости, которые требуют высокого содержания макроэргических молекул, содержащих фосфорные группы в связях (Таблица 2), дающих наибольших выход энергии при их расщеплении, и минералов (в частности, калия), обеспечивающих проводимость за счет выравнивания и/или накопления химического потенциала.

Таблица 2. Минеральный баланс исследуемого сырья.

Показатель Аорта Аорта КРС Сердце Сердце Свинина Говядина

свиней свиней КРС (M.L.dorsi) (M.L.dorsi)

Калий, мг/кг 136,50±2,23: 160,40±3,482 293,73±2,11 251,03±3,52' 242,00±3,62 324,50±2.98

Натрий, мг/кг 50,07±0,42 65,57±1,06 71,57±1,1б' 95,47±2,23' 51,00±1,42 62,50±2,44

Железо, мг/кг 136,50±2,23" 160,40±3,48: 293,73±2,11 251,03±3,52' 242,00±3,62 324,50±2,98

Кальции, мг/кг 50,07±0,42 65,57±1,06 71,57±1,1б' 95,47±2,23' 51,00±1,42 62,50±2,44

Цинк, мг/кг 136,50±2,23: 160,40±3,482 293,73±2,11 251,03±3,52' 242,00±3,62 324,50±2,98

Селен, мкг/100г 8,77±0,12 9,80±0,44: 11.40±1,10 20,03±1,763 10,00±0,56 4,50±0,34

Фосфор. % 0,087±0,0031 0,071 ±0.002' 0,186±0,003' 0,179±0,002' 0,122±0,013 0,131±0,009

- р<0,05 по отношению к соответствующей мышечной ткани. ~ - р<0,01 по отношению к соответствующей мышечной ткани, - р<0,001 по отношению к соответствующей мышечной ткани.

Стоит отметить высокое содержание селена в образцах. В сердцах КРС концентрация селена увеличена в 4.5 раза (р<0.001 по отношению к соответствующей мышечной ткани), а в аортах КРС - в 2.5 раза (р<0,01 по отношению к соответствующей мышечной ткани), что немаловажно, так как селен - сильный антиоксидант, его основной функцией является ингибирование перекисного окисления липидов в составе атерогенных классов липопротеинов.

В ходе проведенной работы ввиду обнаруженного увеличения концентрации микроэлементов, вовлеченных в процесс инактивации перекисных форм органических соединений в исследуемом сырье, была изучена антиоксидантная активность тканей сердец и аорт свиней и КРС in vitro и ex vivo на культивиру емых клетках.

По результатам in vitro экспериментов показано, что все исследованные препараты гидрофильных и липофильных фракций образцов смеси сердец и аорт свиней (1:1) и смеси сердец и аорт КРС (1:1) после термической обработки обладают антиоксидантной емкостью (АОЕ), при этом основной вклад в общую АОЕ вносит гидрофильная фракция, в то время как вклад липофилыюй фракции не превышает 10% от общей антиокислительной емкости образцов по отношению к катион-радикалу АБТС (ТЕАС) и 25% по отношению к пероксильному радикалу (ORAC). Установлено, что антиоксидантная емкость образцов говяжьего сырья превышает количественно АОЕ образцов из свинины на 4.1% по отношению к катион-радикалу АБТС (ТЕАС) и на 12.1% по отношению к пероксильному радикалу (ORAC). По результатам ex vivo экспериментов показано, что все исследованные

препараты гидрофильных фракций образцов из свиного и говяжьего сырья вызывают снижение свободно-радикального окисления в культивируемых клетках линии НТ-29. что говорит об их антиоксидантном действии. Установлено, что антиоксидантный эффект образцов из говяжьего сырья количественно превышает эффект от образцов, полученных при экстракции гидрофильных антиоксидантнов из свиных образцов, и приводит к снижению СРО до 22.5% (р<0.05 по отношению к контролю). Тем не менее. Бегреп е/ а1. (2012) сообщает, что антиоксидантная емкость по отношению к катион-радикалу АБТС составляет в среднем 35 мкмоль ТЭ/г фактического веса для свинины и 30 мкмоль ТЭ/г фактического веса для говядины. е? а/. (2012) сообщает, что антиоксидантная емкость по отношению к пероксильному радикалу (011АС) колеблется от 21 до 35 мкмоль ТЭ/г фактического веса. Примечательно, что антиоксидантная емкость сохраняется в образцах даже после термической обработки.

Содержание белкового азота в сердцах в 2.5-3.0 раза ниже аналогичного показателя соответствующей мышечной ткани (р<0.01). Стоит отметить существенное увеличение содержания полипептидного азота в 10.8 в аортах свиней, в 22.5 раза в аорте КРС. в 11.6 раз в сердце свиней и в 27.1 раз в сердце КРС по сравнению с аналогичным показателем соответствующей мышечной ткани (р<0.001) (Рисунок 2).

■ Белковый азот,%

■ Небелковый ззот.;'ь

Остаточный азот,%

■Полипептидный азот,%

Оболги азот=3-440ао

Обппш азот=3.490ао

80%

233%

В

13% 1ШШ

53*%

233%

13% йШвЙ \

231%

Общ1ш азот=3.424%

Общий азот=3.789%

1 Белковый азот,%

I Небелковый азот,%

Остаточный азот,%

I Полипептидный азот,%

З43%

13%

30г%

З43%

13%

302% ■ Белковый азот.% £

Общий азот=2.117%

Общга! азот=2,629%

I Небелковый азот,54

Остаточный азот,%

I Полипептидный азот,%

Рисунок 2 - Распределение азота в исследуемом сырье, А - свинина (гп.Ь. Ооге1). Б - говядина (т.Ь. Ооге!). В - аорта свиней. Г - аорта КРС. Д - сердце свиней. Е - сердце КРС. 1 - р<0,05 по отношению к соответствующей мышечной ткани. 2 - р<0,01 по отношению к соответствующей мышечной ткани.' - р<0.001 по отношению к соответствующей мышечной ткани.

Не было отмечено достоверного увеличения концентрации липотропных аминокислот (цистеин. серии, диметилглицин (производное глицина), метионин и треонин, аспарагиновая кислота лизин, тирозин), за исключением глицина и серина в аорте свиней и глицина в аорте КРС и треонина в сердце КРС.

Анализ элеггрофореграммы (Рисунок 3) исследуемого сырья позволил сделать предположение о наличии в тканях сердец и аорт свиней и крупного рогатого скота

тканеспецифичных веществ (в диапазоне от 100 до 10 кДа). воадеченных в липидный обмен, экспрессируемых в эндотелии, и ответственных за восстановление поврежденного эндотелиального слоя, а также ряд антикоагулянтов и агентов фибринолиза. которые позволяют не только регулировать состояние сосудистой стенки, но и запускать механизмы защиты и восстановления поврежденных участков. Отмечено увеличение количества и интенсивности фракций в сырье после автолиза (4 суток при 4°С).

Ст 1 2 3-4 5 6

Рисунок 3 — Результаты электрофоретического анализа белков по Лэммли. Окраска азотнокислым серебром. Ст- стандарт молекулярных масс (Fermentas. США). I - замороженное сердце КРС. 2 - сердце КРС (автолиз), 3 — замороженное сердце свиней, 4 - сердце свиней (автолиз). 5 -аорта свиней (автолиз). 6 - аорта КРС (автолиз).

Из двумерных электрофореграмм (Рисунок 4) видно, что наиболее интенсивные полосы распадаются на ряд белков со сходной молекулярной массой, но разными изоэлектрическими точками.

ш 1 JÍ» J н

1 ПН —г— __ ____ 1 н

Рисунок 4 - Результаты протеомного анализа образцов сердца (А) и аорты (Б) КРС в сравнении с соответствующими данными (В. Г) сердец и аорт свиней. Окраска Кумасси 1^-250. Пунктирными прямоугольниками показаны зоны расположения актинов - красный, тропомиозинов -голубой и миозиновых легких цепей - зеленый.

На Рисунке 5 представлены двумерные электрофореграммы замороженной аорты свиней и аорты свиней после 4-х суточного автолиза и обозначены белковые фракции, отобранные для идентификации.

Рисунок 5 — Результаты протеомного анализа образцов замороженной аорты свиней(А) и аорты свиней после 4-х суточного автолиза (Б) аорт свиней. Окраска серебром.

Результаты подтвердили наличие в свиной аорте Аполипопротеина А-1 (13 и 14 на рис.эА). участвующего в формировании ЛПВП. а также пероксиредоксина 1 (10 на рис.5А) -фермента, участвующего в подавлении окислительного стресса Кроме того, в аортах также присутствует галектин-1, согласно Базе данных «Белки средней оболочки аорты», (littp://mp.inbi.ras.rii/inde\.php/admin/mainpage). являющийся индуктором апоптоза Т-лимфоцитов. и белки теплового шока.

Как видно из Рисунка 5 А. обнаруженные нами белки имеют молекулярную массу менее 30 кДа поэтому целесообразно в дальнейшем изучать белковые фракции от 30 кДа и ниже.

Глава 4. Оценка гиполипидемического, антиатеросклеротического и противовоспалительного эффектов исследуемого сырья /я vivo с использованием биохимических, гематологических и ИФА методов оценки эффекта. Нами разработана модель экспериментального алиментарного атеросклероза заключающаяся в введении в рацион животных моделяторов гиперлипидемии и атеросклероза на фоне воздействия стрессовых факторов, что приводит к значительной степени ожирения, депонированию жира на внутренних органах и внутри тканевых и клеточных структур, характерных для процесса инфильтрации, сбою иммунной системы и гемостаза а также к снижению скорости липидного обмена и его самого в целом как метаболизма липидов в организме.

Представленная модель позволяет воспроизвести экспериментальный алиментарный атеросклероз в течение 52 дней. Динамика развития всех патологических изменений, сопутствующих данному заболеванию, представлена на Рисунках 6 и 7.

По окончании моделирования животные опытных групп получали с рационом измельченные исследуемые образцы из расчета 5 г/голову: 1 группа - сердце КРС. 2 группа - аорта КРС. 3 группа - смесь сердец и аорт (1:1) КРС. 4 группа - сердце свиней, 5 группа -аорты свиней. 6 группа - смесь сердец и аорт (1:1) свиней. По окончании моделирования, на 14 сутки и 28 сутки лечения крыс усыпляли в камере для эвтаназии VETtech в соответствии с правилами гуманного обращения с животными, проводили аутопсию и забор крови на биохимические и гематологические исследования.

Рисунок 6 - Изменение стенки аорты крыс на 47 сутки: 1 — агрегация форменных элементов крови. 2 - активация эндотелия. 3 - скопления липидов охряно-желтого цвета. Обозначение: А - Активация эндотелия, агрегация форменных элементов. Окраска гематоксилин-эозином: Б-Отложение липидов в стенке аорты. Окраска Суданом III с докраской ядер гематоксилином Об. 10х В - Отложение липидов в стенке аорты. Окраска Суданом III с докраской ядер гематоксилином. 0б.20х

¡уЖРЩЗ б ¡ИМишО^

* mira

Рисунок 7 - Жировая инфильтрация печени: 1 — скопления липидов охряно-желтого цвета. 2 - ядра гепатоцитов насыщенного синего цвета. Окраска Суданом III с докраской ядер гематоксилином. Об. 40 х

Показано, что уже на 14 сутки лечения у животных опытных групп отмечается восстановление показателей крови: случаев лейкопений у животных всех групп не отмечалось, зафиксированы слабо выраженные лимфопении. На 28 сутки концентрация лимфоцитов в крови опытных животных всех групп нормализировалась, содержание смеси моноцитов, эозинофилов. базофилов и незрелых клеток в крови животных всех опытных групп уже на 14 сутки пришло в норму, наилучшая тенденция наблюдалась у крыс, получавших аорты КРС и свиней и смеси сердец и аорт КРС и свиней: в среднем показатель снизился в 15.5 раз по отношению к контрольной группе (р<0.001).

Лигшдный спектр сыворотки крови животных представлен в Таблице 3. У животных, потреблявших свиное сырье, отмечено выраженное снижение концентрации общего холестерина и триглицеридов уже на 14 сутки лечения на 22.4% (р<0.05). 38.6% (р<0.01) и 10.5% в крови животных четвертой, пятой и шестой групп: концентрация триглицеридов была ниже на 55.6%. 37.0% и 40.7% в крови животных четвертой, пятой и шестой групп, соответственно (р<0.05 по отношению к контролю). Аналогичная тенденция наблюдалась на 28 сутки лечения. Уже на 14 сутки лечения у животных всех опытных групп не детектировался остаточный холестерин (ЛПОНП и ЛППП). что указывает на ускорение липидного обмена. Отмечалось также резкое снижение ИА (индекса атерогенности) уже на 14 сутки лечения, в среднем на 47,6% по отношению к контролю.

Концентрация апо-белков в сыворотке крови подопытных животных представлена в Таблице 4. Ano A-I является главным белковым компонентом ЛПВП. Ano В-100 входит в состав ЛПОНП. ЛППП и ЛПНП, Ano Е находится в составе липопротеиновых частиц: ХМ. ЛПОНП. ЛППП и ЛПВП. Таким образом, концентрация Ano А-1 прямо пропорциональна концентрации ЛПВП и насыщенности этим белком липопротеиновой частицы, а

Таблица 3. Лнпидпый спектр сыворотки крови

Показатель Норма Интакг Больные Контроль 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа 5 группа 6 группа

14 сутки лечении

Холестерин, ммоль/л 0,51-2,85 1,7 (±0,22 1,92±0,21 2,10±0,02 1,98±0,58 1,88±0,60 1,78±0,171 1,63±0,251 1,29±0,21' 1,88±0,52

Тритлицериды, ммоль/л 0,56-2,23 1,45±0,24 1,07±0,36 1,08±0,16 1,17±0,06 1,47±0,32 1,13±0,58 0,48±0,08' 0,68±0,10' 0,64±0,11'

ЛП11Г1, ммоль/л - 0,45±0.07 0,54±0,18 0,52±0,06 0.57±0,16 0,47±0,14 0,48±0,07 0,48±0,06 0,40±0,03' 0,54±0,06

ЛИВП, ммоль/л - 1,28±0,19 1,08±0,19 1,19±0,01 1,39±0,35 1,40±0,46 1,31±0,19 1,15±0,27 0,92±0,16' 1,30±0,32

Остаточный холестерин 0 0 0,30±0,08 0,40±0,08 о,оз±о,ог 0,01±0,00' 0,00±0,003 0,01 ±0,01' 0,00±0,00' 0,04±0,0Г'

И1 [деке атерогег 1 е юсп 1 - 0,34±0,05 0,76±0,08 0,77±0,01 0,42±0,092 0,35±0,03' 0,36±0,092 0,44±0,122 0,41 ±0,03' 0,44±0.112

28 сутки лечении

Холестерин, ммоль/л 0,51-2.85 1,71±0,22 1,92±0,21 2,33±0,08 2,12±0,19 1,74±0,33 1,75±0,16л 1,52±0,37 1,53±0,40 1,99±0,211

Триглицериды, ммоль/л 0.56-2.23 1,45±0,24 1,07±0,36 1,94±0,6У 1,63±0,42 1,23±0,48 1,48±0,4^ 0,77±0.19 0,81 ±0,02 1,35±0,26

ЛГИ III, ммоль/л - 0,45±0,07 0,54±0,18 0,25±0,04 0,59±0,05' 0,61±0,08" 0,44±0,04' 0,54±0,05" 0,48±0,10 0,64±0,06

ЛГ1Ш1, ммоль/л - 1,28±0,19 1,08±0,19 0,60±0,04 1,53±0,14 1,15±0,14" 1,25±0,06 0,97±0.21" 1,09±0,26 1,33±0,23"

Остаточный холестерин 0 0 0,30±0,08 1,48±0,08 0,01±0,001 0,00±0,001 0.06±0,0Г1 0,01±0,001 0,00±0,00 0,02±0,00

Индекс атерогепности - 0,34±0,05 0,76±0,08 2.87±0,11 0,40±0,09 0,44±0,18 0,40±0,07' 0,56±0,12 0,39±0,08 0.51 ±0,1 Г

-р<0,05 по отношению к контрольным животным, 2-р<0,01 но отношению к контрольным животным,'-р<0,001 но отношению к контрольным животным. Таблица 4. Концентрация апо-белков в сыворотке крови

1кжаштель Ингакт Больные Контроль 1 труппа 2 группа 3 группа 4 группа 5 группа 6 группа

14 сутки лечении

Апо Л1, мг/мл 1,003±0,151 0,710±0,112 0,573±0.055 0,781±0,014' 0,690±0,056-' 0,738±0,0722 0,764±0,094-' 0,728±0,1652 0,817±0,1072

Лно С, мг/мл 0,086±0,033 0.137±0.039 0,185±0,018 0.124±0,0332 0,174±0,048 0.128±0,0352 0,123±0,013' 0,086±0,0111 0.092±0,007"'

Дно В-100, мг/мл 0,848±0,266 1.107±0,287 0,985±0,219 0,300±0,0132 1,137±0,246 0,595±0,059' 0,183±0.0492 0,299±0,0632 0,132±0,0492

28 сутки лечении

Дно А1, мг/мл 1,003±0,151 0,710±0,112 0,635±0,039 0.913±0,0842 0,971±0,1382 0,973±0,1132 1,189±0,2122 0,836±0,0842 1,012±0,1192

Лно Е. мг/мл 0,086±0,033 0,137±0,039 0,136±0,068 0,097±0,020' 0,092±0,019' 0,060±0,0202 0,088±0,0352 0.058±0,0212 0,073±0.018

Дно В-100, мг/мл 0.848±0,266 1.107±0,287 0,226±0,075 0,245±0,054 0,283±0,082 0,258±0,014 0,126±0,0872 0,188±0,060' 0.266±0,067

р<0,05 но отношению к контрольным животным, *-р<0,01 по отношению к контрольным животным, - р<0,001 по отношению к контрольным животным

концентрации Ano В-100 и Ano Е - концентрациям атерогенных классов липопротеинов. Уже на 14 сутки лечения отмечалось увеличение концентрации Ano A-I и снижение Ano Е в крови животных всех опытных групп по отношению к контролю. Отношение АпоВ/АпоА на конец эксперимента значительно снизилось и было в крови животных всех опытных групп в 4,48; 2,65; 2,13; 7,16; 4,18 и 10,61 раз меньше по отношению к контролю (р<0,001), соответственно (Рисунки 8, 9).

Косвенная оценка противовоспалительного эффекта исследуемого сырья осуществлялась путем определения концентрации в крови основных маркеров воспаления (VCAM-1, ICAM-1), концентрационные изменения которых непосредственно коррелируют с воспалительными стадиями атеросклероза (Таблица 5). Показано, что уже на 14 сутки лечения уменьшалась концентрация VCAM-1 в крови опытных групп и была на 39,4% (р<0,001), 37,6% (р<0,01), 41,4% (р<0,01), 48.2% (р<0,01). 25,8% (р<0,05) и 52,9% (р<0,001) ниже по сравнению с контролем; на 28 сутки тенденция сохранилась и составила в среднем 37,3% (р<0,05). В отношении 1САМ-1и vWf наблюдалась обратная тенденция. Концентрация ICAM-1 по окончании моделирования заболевания резко увеличилась у животных всех групп. Концентрация E-selectin уже на 14 сутки лечения нормализировалась у животных как контрольной, так и опытных групп, однако, у животных, потреблявших аорты КРС, сердце свиней и смесь сердец и аорт свиней она была снижена на 30,4% (р<0,05), 29,6% (р<0.05) и 48,1% (р<0,01) по отношению к показателям контрольных животных. Стоит отметить, что концентрация E-seIect¡n у всех опытных групп снижалась вплоть до 28-х суток, наилучшая конечная динамика была отмечена у животных, потреблявших ткани сердца и аорты КРС, сердца и смесь сердец и аорт свиней (54,1% (р<0,01), 29,3% (р<0,05), 36,8% (р<0.05) и 30.8% (р<0,05), соответственно).

В результате проведенного эксперимента было показано, что свиные ткани, особенно аорта свиней, обеспечивала лучший гиполипидемический эффект, чем сырье, полученное от КРС. Гиполипидемическое действие исследуемого сырья выражается в ускорении липидного обмена проявляющегося в снижении атерогенных фракций липопротеинов и ИА. что было подтверждено концентрационными изменениями Апо-белков. Кроме того, анализ данных и.м.муноферментного анализа позволил нам выдвинуть гипотезу о противовоспалительном и лечебном действии сердец и аорт КРС и свиней, преимущественно направленном на травмированную часть сосуда. Так, VCAM-1 и Е-selectin экспрессируется эндотелием и обеспечивает адгезию и пенетрацию моноцитов, Т- и В-лимфоцитов в пораженный участок, вызывая тем самым воспаление и лизис атероматозной бляшки с выходом ее содержимого в просвет сосуда. Fotis и др., 2014, в своих недавних исследованиях сообщил, что увеличение концентрации 1САМ-1 соответствует ранним стадиям атеросклеротических поражений, в то время как VCAM-1. вероятно, экспрессируется на более позднем этапе. Таким образом, увеличение концентрации растворимого ICAM-1 соответствует ранним изменений в стенке артерии (Gross и др.. 2012). VWf является ключевым фактором в процессе свертывания крови, и повышение его уровня связывают с риском развития атеротромботических осложнений и повреждения эндотелия (Montoro-García и др., 2012). По результатам проведенных исследований мы можем предположить, что вещества содержащиеся в тканях сердец и аорт, способствуют регрессии атеросклероза за счет элиминирования липидных бляшек, для

Таблица 5. Концентрация маркеров воспаления в сыворотке крови.

Показатель Интакт Вольные Контроль 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа 5 г руппа 6 группа

1-4 сутки .течения

УСЛМ-1, пг/мл 11,66±1,39 51,17±8,99 18,46±2,06 11,19±2,452 11,52±2,452 10,82±1,292 9,57±2,072 13,69±6,74' 8,70±2,19'

1САМ-1. иг/мл 54.27±6,67 54,04± 11,01 209,0±8,3 273.6±5,2' 179,7±2.5 138,9±9,8' 238,7±4,9 354.7±17,3' 276,9±11.5

vWГ, м кг/мл 0,89±0,08 1,31±0,12 5,20±0,01 3,43±0,20' 6,09±0,10' 4,34±0,152 6,70±0,10' 7,19±0,70' 6,83±0,911

Е-йе1есПп, иг/мл 1,57±0,05 2,46±0,17 1,35±0,28 1,52±0,34 0,94±0,161 1,69±0,48 0,95±0.20' 1,44±0.24 0,70±0.222

28 сутки лечении

УСАМ-1, пг/мл 11.66±1,39 51,17±8,99 14,07±0,38 9.82±1,67' 6,49±1,293 9,34±1,97' 8,04±1.632 10,81±2,11' 8,44±1,63

1САМ-1, пг/мл 54,27±6,67 54,04± 11,01 255,9± 15,04 302,9±13,5 278,74±10,0 411,22±22,1' 336,6± 14,6' 253,8±8,1 339,6±7,8'

у\¥Г, мкг/мл 0,89±0,08 1,3 (±0,12 6.54±0,94 7,34±0,65' 6,50±0,95 8,15±0,951 8,76±0,282 9,09±0,872 10,65±0,672

1>хе1ес1н1, пг/мл 1,57±0,05 2,46±0,17 1,33±0,08 0,61±0,082 0,94±0,22' 1,40±0,14 0,84±0,09' 1,55±0,16 0,92±0,13'

-р<0.05 но отношению к контрольным животным, --р«),01 но отношению к контрольным животным,''-р<0,001 но отношению к контрольным животным.

2

; 1,8 1,6 ■ 1,4 1,2 ' 1 0,8 0,6 0,4 0,2 О

1,719

1,559

0,845

-I-

0,3843

Я

0,806: 0,6483 -I-I

0,4113

0,243

00Д623

1,8

Я

<и 1,6 5 1,4

о 1,2 с

5. 1

СО

ё 0,8 <

$ 0,6

| 0,4 о

<5 0,2 о

1,559

0,845

-I-

0,356

0.2681 0,291 0,265"

Рисунок 8 - Отношение АпоВ/АпоА па 14 сутки лечения Рисунок 9 - Отношение ЛпоВ/АпоА на 28 сутки лечения

'-р<0,05 но отношению к контрольным животным, 2-р<0,01 но отношению к контрольным животным,3-р<0,001 но отношению к контрольным животным.

чего характерно увеличение концентрации растворимого ICAM-1 и уменьшение VCAM-1 в сыворотке крови животных опытных групп.

Полученные результаты показали, что аорта свиней обладает наибольшим гиполипидемическим эффектом среди всего сырья: наравне со снижением уровня холестерина, существенно снижается концентрация триглицеридов в сыворотке крови животных опытной группы, наблюдался выраженный противовоспалительный эффект. Поэтому для дальнейших исследований были отобраны аорты свиней.

Глава 5. Определение активной фракции экстракта аорты свиней с использованием биотехнологических методов и /и vivo исследований. На основании ранее проведенных исследований в качестве сырья для последующих исследований белковых фракций были отобраны аорты свиней, а в качестве разделяющего порога -отметка в ЗОкДа.

Технологические этапы извлечения БАВ представлены на рисунке 10.

В результате оптимизации методов экстракции и ультрафильтрации было выявлено, что наибольший выход при кислотной экстракции наблюдался в системе с 2% раствором уксусной кислоты, концентрация белка в экстракте составила 4,25±0,42 г/л; при солевой экстракции в системе с 0.9% натрия хлоридом концентрация белка в экстракте в данном случае составила 4.2±0.08 г/л. Существенного различия между кислотной и солевой экстракцией выявлено не было, поэтому в качестве экстрагента для дальнейших исследований был выбран физраствор (0.9% NaCl). В дальнейшем при приготовлении исследуемых образцов использовали следующий режим экстракции: гидромодуль 1:3, время экстракции 24 ч., температура 4-5°С со скоростью мешалки 1000 об/мин. Центрифугировали при 3500 об/мин в течение 8 мин на центрифуге СМ-6М (ELMI, Латвия). Ультрафильтрацию проводили па установке Vivaflow 200 (Sartorius, Германия) с использованием мембраны с диаметром отверстий ЗОкДа под давлением Р-2,5 бар.

Таблица 6. Концентрация белка в экстракте и ультрафильтратах аорт свиней.

Показатель Экстракт УФ>30кДа УФ<30 кДа

Концентрация белка г/л 13.98±0.60 40,93±1,49 1,21 ±0,24

Извлеченный белок. % 19.59±0,84 16,26±0.63 1,13±0,04

Далее низкомолекулярный ультрафильтрат подсушивали до заданной концентрации (2,45 г/л) в лиофильной сушилке ИНЕИ-4 (Россия. ИБП РАН). Высокомолекулярный ультрафильтрат и экстракт разбавлялись физраствором до заданной концентрации (2,45 г/л).

В опытах на морских свинках были проведены исследования гиполипидемических. антиатеросклеротических и противовоспалительных свойств экстракта и ультрафильтратов свиных аорт. По окончании моделирования животные контрольной группы получали физраствор, 1 группа животных получала экстракт (Э), 2 группа - высокомолекулярный ультрафильтрат (ВМУ. Мм>30кДа), 3 группы - низкомолекулярный ультрафильтрат (НМУ, Мм<30кДа). 4 группу составили интактные морские свинки. Все исследуемые ультрафильтраты и экстракт вводились per os из расчета 8 мг белка/голову. Лечение длилось 14 суток.

Рисунок 10 - Схема извлечения и исследования БАВ

Результаты гематологического исследования крови экспериментальных животных показали преимущество опытного препарата. В крови животных группы, получавших НМУ. концентрация лейкоцитов и лимфоцитов снизилась на П.8% и 10.8%, соответственно, по отношению к контролю и составила 37.50±3.46х10''/л и 29,95±4.27х10'/л. превышая показатель интактной группы в 2.4 раза и 3.5 раз. соответственно. Концентрация эритроцитов и гемоглобина, а также гематокрит были в норме у животных всех опытных групп, у животных контрольной группы наблюдалась анемия. Отмечалась также динамика снижения общей концентрации тромбоцитов в крови животных второй группы, получавших ВМУ по сравнению с контрольной группой.

Результаты биохимического исследования крови подопытных животных показали, что наиболее стабильное восстановление функций печени происходило у животных опытных групп, потреблявших Э и НМУ. Нормализация функции сердечной мышцы отмечалась у всех опытных групп.

Важно отметить, что уже на 14 сутки лечения у животных всех опытных групп остаточный холестерин (ЛПОНП и ЛППП) снизился на 53,8%, 66,7% и 79,5% по отношению к контролю (р<0,001), что говорит об ускорении липидного обмена (Рисунок 11). Отмечалось также резкое снижение ИА (индекса атерогенности) уже на 14 сутки лечения на 24,0% (р<0,01), 34,4% (р<0,01) и 43,7% (р<0,001) в крови животных первой, второй и третьей групп, соответственно, по отношению к контрольной группе (Рисунок 12).

Антиокислительная активность (АОА) сыворотки крови животных, потреблявших низкомолекулярный ультрафильтрат экстракта аорт свиней, увеличилась на 14,3% по отношению к контролю (р<0.05) (Рисунок 13).

С-реактивный белок синтезируется в печени, является представителем семейства белков острой фазы воспаления и участвует в привлечении моноцитов в зону атеросклеротической бляшки посредством связывания со специфическими рецепторами. Снижение концентрации СРВ в сыворотки крови напрямую коррелирует со снижением остроты воспазительного процесса. Наибольшее снижение концентрации СРБ отмечазось в сыворотке крови животных третьей опытной группы, получавших низкомолекулярный ультрафильтрат экстракта аорт свиней, и концентрация СРБ составила 0.99±0.06 мкг/мл, что на 34,0% (р<0.01) ниже аналогичного показателя контрольной группы (Рисунок 14).

Сосудистый эндотелиальный фактор роста (УПОР) является основным регулятором образования микрососудов. Он способствует вазодилатации, повышает проницаемость сосудов, влияет на выраженность воспалительного ответа и обладает рядом внесосудистых эффектов. Онкологические процессы, сахарный диабет, ревматоидный артрит, эндометриоз, гипертоническая болезнь, атеросклероз сосудов и ряд других патологических состояний сопровождаются увеличением содержания УЕОБ в крови и тканях. Наибольшее снижение концентрации УЕОБ отмечалось в сыворотке крови животных третьей опытной группы, получавших низкомолекулярный ультрафильтрат экстракта аорт свиней, и концентрация УЕОР составила 3,92±0.97 пг/мл, что на 58,3% (р<0,001) ниже аналогичного показателя контрольной группы.

В результате проведенного эксперимента было показано, что низкомолекулярный ультрафильтрат свиной аорты обладает выраженным гиполипидемическим действием, приводящим к снижению доли атерогенных фракций липопротеинов и ИА. Кроме того, снижение концентрации УЕОИ и С-реактивного белка могут свидетельствовать о нормализации функционирования эндотелия сосудов, повышении его защитной реакции.

По итогам проведенных исследований в качестве наиболее перспективного был признан низкомолекулярный ультрафильтрат экстракта аорт свиней.

Остаточный холестерин

1 ■ ХС ЛПВП

■ ХСЛПНП

I т т

■ь

Г

Интакт Больные Контроль 1 группа 2 группа 3 группа

6,87

6ДЗ

I

5,22" к

-^тИ2-

3,873

тш

Интакт Больные Контроль 1 группа 2 группа 3 группа

Рисунок 11 - Влияние экстракта и ультрафильтратов аорт свиней па _динамик) липидного спектра сыворотки крови_

Рисунок 12 - Влияние экстракта и ультрафильтратов аорт свиней на _динамику индекса атерогенности крови_

1,5

1,87

1,74

ш

Х27т

щ.

1,99»

5

* 2 §

ас о

^ 1 ^

8.0,5

2,18

—1т34—

1,26 Л

1,24 И

0,992 ■I,

Интакт

Контроль 1 группа

2 группа

3 группа

Интакт Больные Контроль 1 группа 2 группа 3 группа

Рисунок 13 - Влияние экстракта и ультафильтратов аорт свиней на антиокислительную активность (К„) сыворотки крови

Рисунок 14 - Влияние экстракта и ультафильтратов аорт свиней на концентрацию С-реактивного белка в сыворотке крови.

-р<0.05 по отношению к контрольным животным, "-р<0.01 по отношению к контрольным животным. -р<0.001 по отношению к контрольным животным

Глава 6. Разработка технологии продуктов и добавок функционального питания. Схема технологического процесса фаршевых консервов для функционального питания из свиных сердец с добавлением свиных аорт представлена на Рисунке 15.

Рисунок 15 - Технологическая схема производства фаршевых консервов функционального питания из сердец и аорт свиней.

Рецептура: сердце свиней - не более 70%. аорта свиней - не более 26,6%, крахмал -не более 3%, соль - от 0,2 до 0, 4% включительно.

Характеристика продукции: Фаршевые консервы из сердец свиней с добавлением аорт свиней. Продукт представляет собой однородную массу светло-коричневого цвета различной интенсивности, с размером частиц не более 0,3 мм, плотной консистенции, запах - насыщенно мясной, вкус слабосоленый, без посторонних привкуса и запаха. Массовая доля белка не менее 16%. жира - не более 5%, поваренной соли - от 0,2 до 0,4% включительно, крахмала - не более 3%.

Основное назначение - для функционального питания взрослого населения в качестве профилактики риска развития и терапии гиперлипидемий и атеросклероза.

По микробиологическим показателям фаршевые консервы должны удовлетворять требованиям Технического регламента Таможенного союза «О безопасности мяса и мясной

продукции» (TP ТС 034/2013). Консервы хранят при температуре от 0°С до 6°С и относительной влажности воздуха (75 ± 5) %. Срок годности - 6 месяцев.

По результатам проведенный исследований был рассчитан Индекс атерогенности (ИА) по формуле, приведенной Ulbriht T.L.V. и Southgate D.A.T., (1991):

ИА=(С12+С14+С16+Транс ЖК): (ПНЖК+С18:1+другие МНЖК)

ИА составил 0,43, что ниже среднего ИА рациона человека, равного 0.74. по данным Лисицына А.Б., и др. (2011) на 41.9%. а также ниже ИА таких продуктов, как баранина (0.97). говядина (0.79), свинина (0.52) и мясо птицы (0.50).

Изучение влияние термической обработки фаршевых консервов на сохранность целевых белков (Рисунок 16) с применением 2D-электрофореза показало, что стерилизация не приводит к значительным потерям Апо А-1. однако потери пероксиредоксина-1 могут достичь 100%.

Рисунок 16 - 2-0 электрофореграммы: замороженные аорты (А) и сердца (В) свиней (Окраска серебром). Термообработанная смесь сердец и аорт свиней (Б) (Окраска Кумасси). Голубым цветом показан тропомиозин. 33 кДа красным - Апо А-1. 23-24 кДа зеленым - легкие цепи миозина 18-19. 21-22 кДа синим - пероксиредоксин 8.8кДа идет в смеси с трансгелином. 22 кДа.

На основании выполненных исследований разработаны: Стандарт организации СТО 00419779-003-2015 «Консервы мясные фаршевые стерилизованные для функционального питания из сердец и аорт свиней». Лабораторный регламент на производство Функционального мясного продукта. Методические рекомендации по экспериментачьному моделированию сердечно-сосудистых заболеваний у лабораторных животных. Новизна разработок подтверждена Патентом № 2524127 от 30.05.2014 г. на «Способ моделирования экспериментального атеросклероза» и Патентом № 2550649 от 10.04.2015 г. «Функциональный мясной продукт и способ его получения».

Себестоимость производства консервов из свиных сердец и аорт составляет 25.91 руб. на физическую банку (100 г), при этом себестоимость консервов «Сердце» с добавлением препарата «Янтарная капля» (аналог) на 19.62 тыс. руб. выше. При уровне рентабельности - 10%. экономия составит 68670 руб. на ТУБ.

выводы

1. На основе литературного поиска были выбраны сердца и аорты КРС и свиней в качестве источника тканеспецифичных биологически активных веществ гиполипидемического, противовоспалительного и антиатеросклеротического действия. Получены данные, подтверждающие гипотезу о возможности выделения из животных органов и тканей белковых веществ, обладающих корригирующим действием.

2. Проведенные исследования состава сырья показали наличие в нем веществ белковой природы, обуславливающих гиполипидемические, противовоспалительные и антиатеросклеротические эффекты, в частности, Аполипопротеина А-1, участвующего в формировании липопротеинов высокой плотности, а также пероксиредоксина 1 - фермента, участвующего в подавлении окислительного стресса.

3. Разработана и апробирована на лабораторных животных (крысы и морские свинки) модель экспериментального атеросклероза по этиологии приближенная к человеку, и на ней были подтверждены лечебно-терапевтические свойства изучаемого сырья, биологически активных фракций ультрафильтратов и готового мясного продукта в том числе гиполипидемические, гипотензивные и противовоспалительные, приводящие к снижению доли атерогенных фракций липопротеинов и индекса атерогенности (от 20 до 40% к контролю). Кроме того, снижение концентрации сосудистого эндотелиального фактора роста и С-реактивного белка могут свидетельствовать о нормализации функционирования эндотелия сосудов, повышении его защитной реакции. Оригинальность методики подтверждена патентом № 2524127 от 30.05.2014 г. на «Способ моделирования экспериментального атеросклероза».

4. Определены режимы извлечения биологически активных веществ искомой функциональной направленности: экстракция 0,9% КаО в течение 24 часов, гидромодуль 1:3 при 4-5°С и скорости оборотов мешалки 1000 об/мин. Наиболее активным признаны ткани аорт свиней, наиболее активной фракцией - ультрафильтрат белково-пептидной смеси экстракта аорт свиней Мм менее 30 кДа.

5. Предложена технология фаршевых консервов из сердец и аорт свиней для функционального питания в качестве поддерживающей терапии лиц, страдающих от гиперлипидемии и атеросклероза. Экономический эффект на тысячу условных банок составит 68.67 тыс. руб.

6. Разработаны Стандарт организации СТО 00419779-003-2015 «Консервы мясные фаршевые стерилизованные для функционального питания из сердец и аорт свиней» и Лабораторный регламент получения ФМП. В опытах на лабораторных животных подтверждена сохранность биологически активных веществ, обеспечивающих гиполипидемическое и вазопротекторное действия с учетом адаптации режимов термообработки для сохранения целевых биологически активных веществ в готовом продукте.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы: Научные статьи в журналах, рекомендованных ВАК Мннобрмауки РФ:

1. Лисицын. А.Б. Ткани сердца и аорты крупного рогатого скота и свиней как функциональный мясной ингредиент с заданным белково-пептидным профилем / А.Б. Лисицын. U.M. Чернуха. Л.В. Федулова. Е.А. Котенкова. С.С. Шишкин // Все о мясе. - 2013. - № 5. - С.48-51.

2. Чернуха, U.M. Применение функциональных мясных продуктов - инновационный подход к профилактике и лечению сердечно—сосудистых заболеваний / U.M. Чернуха, Л.В. Федулова, Е.А. Котенкова // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2013. - № 6. -С.70-72.

3. Чернуха. И.М. Биотрансформация побочного мясного сырья как инновационный подход к созданию протеомно-пептидных средств направленного действия / И.М. Чернуха, Л.А. Люблинская. Л.В. Федулова, Е.Р. Василевская. Е.А. Котенкова. А.Н. Макаренко // Все о мясе. -№2.-2015.-С.14-17.

4. Котенкова Е.А. Тканеспецифичные биологически активные вещества как инновационный подход к нормализации функционирования сосудов и сердечной мышцы / Е.А. Котенкова // Вопросы питания. - 2015. - пр. к Т.84. - № 3. - С.35-36 (Международная реферативная база данных «Scopus»).

Научные статьи в зарубежных журналах:

5. Chernukha. I.M. The study of risk factor and consequences of alimentary' atherosclerosis in Wistar rat / I.M. Chernukha L.V. Fedulova, E.A. Kotenkova // Maso.Reznicke noviny - 2013. - 6. - P.28-30. Материалы конференции:

6. Chernukha, I.M. Meat enriched with polyunsaturated fatty acids against hyperlipidemia / I.M. Chernukha. L.V. Fedulova. N.S. Motylina. E.A. Kotenkova // 60th International congress of meat science and technology. Montreal. Canada. - 2012.

7. Котенкова. E.A. Выделение пептидов, обладающих гиполипидемическпм действием / Е.А. Котенкова // Материалы IX Международной научной конференции молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения». Москва. МГУПБ,- 2011. - С. 131-133.

8. Котенкова. Е.А. Разработка мясных продуктов нового поколения, обладающих антиатерогенными и гиполипидемическими свойствами, и их апробация на лабораторных животных с моделью экспериментального атеросклероза / Е.А. Котенкова. Л.В. Федулова // Фундаментальные основы и передовые технологии в пищевой и перерабатывающей промышленности. Научные труды 6-ой конференции молодых ученых и специалистов институтов Отделения хранения и переработки сельскохозяйственной продукции, г. Видное. -2012.-С.141-145.

9. Чернуха. U.M. Изучение гиполипидемических свойств аорт и сердец молодых телят на модели экспериментального атеросклероза / И.М. Чернуха. Е.А. Котенкова, Л.В. Федулова // Пути интенсификации производства и переработки сельскохозяйственной продукции в современных условиях. Материалы Международной научно-практической конференции. Часть 2. Переработка сельскохозяйственного сырья и пищевых продуктов, г. Волгоград. - 2012. -С.14-18.

10. Чернуха. И.М. Изучение лечебно-терапевтических свойств тканей сердец и аорт молодых бычков и предположительного механизма их действия на лабораторных животных с моделью экспериментального атеросклероза / И.М. Чернуха. Е.А. Котенкова. Л.В. Федулова // 15-ая международная научная конференция, посвященная памяти В. М. Горбатова. Мясная промышленность - приоритеты развития и функционирования. Том 2. Москва. — 2012.- С. 171— 181.

11. Котенкова. Е.А. Разработка функциональных продуктов питания, обладающих антиатерогенными свойствами, модифицированных добавлением измельченных тканей сердец и аорт молодых бычков / Е.А. Котенкова. Л.В. Федулова. И.М. Чернуха // Сборник материалов всероссийской научно-практической конференции. Научно-инновационные аспекты при создании продуктов здорового питания. Углич. -2012.-С.120-123.

12. Котенкова, Е.А. Инновационный подход к изучению гиполипидемичееких. гипотензивных и антиатеросклеротичееких свойств вторичного сырья как способ создания конкурентоспособных функциональных мясных ингредиентов / Е.А. Котенкова // Материалы Международной научно-практической конференции: Инновационные технологии в производстве и переработке сельскохозяйственной продукции в условиях ВТО. Часть 2. Переработка сельскохозяйственного сырья и пищевых продуктов, г. Волгоград. - 2013. - С.52-55.

13. Котенкова, Е.А. Изучение лечебно-профилактических свойств и протеомного профиля тканей сердец и аорт КРС как перспективного источника биологически активных веществ, обладающих гиполипидемической и антиатеросклеротической активностью, на модели экспериментального атеросклероза на крысах линии Wistar / Е.А. Котенкова // Материалы VII Конференции молодых ученых и специалистов Россельхозакадемии. г. Москва. - 2013. - С. 198— 204.

14. Чернуха, И.М. Изучение молекулярно-биологических основ гиполипидемической и противовоспалительной активности функциональных ингредиентов с целью создания на их основе продуктов питания направленного биокорригирующего действия / И.М. Чернуха. Л.В. Федулова, Е.А. Котенкова // Международная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы и современные технологии производства продуктов питания». - Кутаиси, Грузия. -2014. - С. 155-159.

15. Котенкова, Е.А. Оптимизация методов экстракции для выделения максимального количества тканеспецифических биологически активных веществ. обладающих гнполкпидемически.м и антиатеросклеротическим действиями / Е.А. Котенкова, А.Г. Ахремко // Материалы Международной научно-практической конференции «Новые подходы, принципы и механизмы повышения эффективности производства и переработки сельскохозяйственной продукции», г. Волгоград.-2014.-С. 155-157.

16. Chernukha I. M. Hypolipidemic and anti-inflammatory effect of cattle and pig heart and aorta tissues / I.M. Chernukha L.V. Fedulova, E. A Kotenkova/ 60th International congress of meat science and technology. Punta del Este, Uruguay. - 2014.

17. Котенкова. Е.А. Изучение тканеспецифических биологически активных веществ и оценка их функциональных свойств / Е.А. Котенкова И.М. Чернуха // Сборник научных трудов VIII Международной конференции молодых ученых и специалистов «Фундаментальные и прикладные исследования по безопасности и качеству пищевых продуктов», г. Видное. ФГБНУ «ВНИИТеК»,- 2014. -С. 130-133.

18. Чернуха И.М. Комплексный подход к оценке гиполипидемичееких и антиатеросклеротических свойств сырья животного происхождения для создания на их основе функциональных продуктов питания / И.М. Чернуха Е.А. Котенкова // Материалы 17-ой Международной научно-практической конференции, посвященной памяти В. М. Горбатова. -2014. - С.232-234.

19. Котенкова, Е.А. Функциональные продукты питания как способ лечения и профилактики атеросклероза / Е.А. Котенкова// Международная научно-практическая конференция «Инновационные исследования и разработки для научного обеспечения производства и хранения экологически безопасной сельскохозяйственной и пищевой продукции», ФГБНУ ВНИИТТИ ФАНО,-2015 г.-С. 322-325.

20. Котенкова Е.А. Разработка модели экспериментатыюго атеросклероза для оценки эффективности функциональных продуктов питания антиатеросклеротического действия / Е.А. Котенкова, IO.E. Лысенко // Тезисы докладов X Международной научно-технической конференции «Техника и технология пищевых производств», «Могилевский государственный университет продовольствия», Беларусь. - 23 - 24 апреля 2015. - С. 158.

Патенты:

21. Лисицын А.Б.. Чернуха И.М., Котенкова Е.А., Федулова Л.В. Способ моделирования экспериментального атеросклероза. Патент на изобретение № 2524127 от 30.05.2014 г.

22. Лисицын А.Б., Чернуха И.М., Котенкова Е.А.. Федулова Л.В. Функциональный мясной продукт и способ его полунения. Патент № 2550649 от 10.04.2015 г.

Список сокращений Ii условных обозначений

ССЗ - сердечно-сосудистые заболевания ХС - холестерин

ИБС - ишемическая болезнь сердца ТГ - триглицериды

ФПП - функциональный пищевой продукт ЛПВП -липопротеины высокой плотности

ФМП - фу нкциональный мясной проду кт ЛПНП - липопротеины низкой плотности

КРС - крупный рогатый скот ЛПОНП - липопротеины очень низкой плотности

СЖК - секвестранты (или сорбенты) желчных кислот ЛППП - липопротеины промежуточной плотности

НК - никотиновая кислота ОХ - остаточный холестерин

ЛДУ - лабораторная диспергирующая установка ИА - индекс атерогенности

УФ - ультрафильтрат Апо А 1 -аполипопротеин А 1

ИФА - иммуноферментный анализ Апо В-100-аполипопротеин В 100

ЭФ - электрофорез Апо Е -аполипопротеин Е

кДа - килодальтон Апо А/Апо В - отношение концентрации аполипопротеина А 1 к аполипопротеину В 100

Мм — молекулярная масса АсАт-аспартатминотранефераза

АОЕ - антиокислительная емкость АлАт-аланинаминотрансфераза

АОА - антиокислительная активность ГГТ - гамма-глутамилтрансфераза

ТУБ - тысяча условных банок ЩФ - щелочная фосфатаза

АТБС -2.2'-азнно-бис (3-этил-2.3-дигидробензтиазолин-6-сульфокислота) VCAM-1 -vascular cellular adhesion molecule-1 -молекула адгезии сосудистого эндотелия 1 типа

ORAC - Oxygen radical absorbance capacity 1САМ-1 - intercellular adhesion molecule-1 -молекула межклеточной адгезии 1 типа

ТЕАС - Trolox equivalent antioxidant capacity vWF - Фактор Виллебранда

AAPH - 2.2'-азобис(2-метилпропионамидин) дигидрохлорид СРБ -С-реактивный белок

С - концентрация VEGF — vascular endothelial growth factor — васкулярный эндотелиальный фактор роста

Тираж экз. 100 заказ №72

ФГБНУ «ВНИИМП им В.М. Горбатова 109316 г. Москва, ул. Талалихина д. 26