автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Исследование влияния параметров процесса культивирования на закономерности роста и размножения хлебопекарных дрожжей в аппаратах разной конструкции и разработка высокоэффективных технологий накопления биомассы

На правах рукописи

ии^иь?057 КХАЛИЛ МУХАННАД МУСТАФА

Исследование влияния параметров процесса культивирования на закономерности роста и размножения хлебопекарных дрожжей в аппаратах разной конструкции и разработка высокоэффективных технологий накопления биомассы

Специальность 05.18.07. — Биотехнология пищевых продуктов (растительного и животного происхождения)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Санкт -Петербург - 2007

003057057

Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном университете низкотемпературных и пищевых технологий

Научный руководитель Официальные оппоненты

Ведущее предприятие -

доктор технических наук, профессор Меледина Т.В.

- доктор технических наук профессор Красникова Л.В..

- кандидат технических наук с.н.с. Черныш В.Г.

Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет)

Защита диссертации состоится </}&> -¿¿¿¡Л 2007г. в часов на заседании диссертационного совета Д 212.234.02 при Санкт-Петербургском государственном университете низкотемпературных и пищевых технологий по адресу: 191002, Санкт-Петербург, ул. Ломоносова, 9, СПбГУНиПТ, тел./факс 315 30 15

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке СПбГУНиПТ

Автореферат разослан Qctn^teA AzOOlr.

Ученый секретарь

диссертационного совета, доктор технических наук, профессор Колодязная B.C. J>'i /

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Аюуальность работы. В настоящее время в Арабской Сирийской Республике наблюдается интенсивный рост всех отраслей промышленности, в том числе и пищевой. В частности, увеличивается выпуск и ассортимент хлебобулочных изделий, для изготовления которых требуются хлебопекарные дрожжи с высокой бродильной активностью. Это влечет за собой необходимость строительства новых заводов по выпуску коммерческих дрожжей и разработки более эффективных технологических схем, направленных на повышение выхода и качества выпускаемой продукции.

В России, рядом ученых (Розмановой Н.В., Витринской A.M., Мелединой Т.В.), научно обоснованы подходы к разработке эффективных режимов культивирования дрожжей, однако в этих исследованиях нет сведений о влиянии на метаболизм S.cerevisiae различных стрессов, которые претерпевают клетки в процессе выращивания и обработки их перед прессованием.

Поэтому изучение влияния физико-химических параметров, вызывающих стресс, и разработка эффективных режимов выращивания дрожжей, учитывающих реакцию дрожжей на неблагоприятные условия внешней среды, является актуальной задачей.

Цели и задачи исследований. Целью работы являлось исследование влияния параметров процесса культивирования на закономерности роста и размножения хлебопекарных дрожжей в аппаратах разной конструкции и разработка высокоэффективных технологий накопления биомассы.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи: -выявить зависимость физиологического состояния дрожжей и их бродильной активности от тоничности среды, концентрации этанола и перепада температур в ходе выращивания биомассы по бесприточному и воздушно-приточному способу культивирования;

- установить роль эффекта Кребтри и эффекта Пастера при культивировании дрожжей в простой периодической культуре;

- определить параметры процесса, применение которых способствует повышению выхода и бродильной активности дрожжей;

- разработать технологию накопления биомассы чистой культуры и коммерческих дрожжей, обеспечивающую высокую продуктивность и экономичность процесса.

Научная новизна.

установлено, что при культивировании дрожжей по бесприточному способу, на выход биомассы большее влияние оказывает кратность разбавления мелассы, в то время как удельный расход воздуха имеет второстепенное значение;

- показана взаимосвязь между концентрацией биотина в среде и удельным расходом воздуха при культивировании дрожжей с притоком питательных

компонентов в регулировании выхода дрожжей и их бродильной активности; - установлена взаимосвязь между физиологической активностью клеток и стрессами, вызванными повышением тоничности среды, концентрацией этанола в простой периодической культуре, перепадом температур при культивировании дрожжей с притоком питательных компонентов и обработкой коммерческих дрожжей раствором хлорида натрия. Практическая значимость. На основании изученных закономерностей размножения дрожжей разработана технология чистой культуры и коммерческих дрожжей, применение которой по сравнению с существующим в АСР регламентом, позволяет сократить число стадий, увеличить выход биомассы, снизить расход сырья на единицу продукции и сократить длительность процесса накопления биомассы дрожжей. Составлена технологическая инструкция по выращиванию чистой культуры и товарных дрожжей, которая прошла испытания на стендовой установке в лаборатории микробиологии, биохимии и технологии дрожжей Санкт-Петербургского института управления и пищевых технологий. Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы представлены на: 57,58 и 59 Научно-технической конференции ГОУ Санкт-Петербургского Государственного Университета Низкотемпературных и пищевых технологий (2005, 2006, 2007г), на 33-ей научно-практической конференции по итогам НИР за 2006 год профессорско-преподавательского состава, докторантов, аспирантов и сотрудников университета (Санкт-Петербург, 2007г.); на научно-практической конференции «Пищевая и морская биотехнология: проблемы и перспективы» (Калининград, 2006) Публикации результатов исследований. Основные положения работы опубликованы в 8 научных работах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов, списка литературы, содержащего 106 источников. Диссертация содержит 123 страницы машинописного текста, 52 иллюстрации и 23 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Обоснована актуальность работы, сформулированы цель и задачи исследований.

Экспериментальные исследования проводились в лаборатории Санкт-Петербургского государственного университета низкотемпературных и пищевых технологий и в лаборатории микробиологии, биохимии и технологии дрожжей Санкт-Петербургского института управления и пищевых технологий.

Материалы и методы исследования. Объектами исследования являлись штаммы хлебопекарных дрожжей 128 и ПК, полученные из лаборатории микробиологии, биохимии и технологии дрожжей Санкт-Петербургского института управления и пищевых технологий.

Закономерности размножения дрожжей изучали в условиях простой периодической культуры (бесприточная стадия) и в периодической культуре с притоком углеводного питания, скорость подачи которого соответствовала

заданной скорости роста и величине отношения сахара в начале каждого часа к биомассе, накопленной к этому времени.

Культивирование дрожжей проводили в ферментере, вместимостью 10 л с барботажной воздухораспределительной системой и в кожухотрубном струйно-инжекционном аппарате (КСИА). Подачу углеводного питания регулировали с помощью командно-электрического прибора (КЭП), подачу солевого питания (сульфат аммония и раствор аммиака) осуществляли вручную, в соответствии с показателем активной кислотности. В качестве питательной среды использовали мелассное сусло, к которому добавляли ионы калия и магния из расчета содержания в мелассе 0,15% магния и 3,5% калия. Источниками азота и фосфора служили 10% раствор сульфата аммония и 10% раствор диаммонийфосфата, которые вносили в соответствии с приростом биомассы.

Для выполнения работы использовали стандартные физико-химические и микробиологические методы исследования, принятые в дрожжевой промышленности. Численность популяции определели путем подсчета клеток в камере Горяева, биомассу определяли весовым методом. Эффективность использования субстрата оценивали по выходу биомассы. О характере метаболизма дрожжей судили по накоплению в среде спирта, который определяли в бражке с помощью анализатора «Колос» (Россия).

Выход биомассы или экономический коэффициент рассчитывали путем деления урожая дрожжей, содержащих 25% сухих веществ, на количество потребленного субстрата (мелассы с содержанием 46% сбраживаемых углеводов) и выражали в %.

Для определения концентрации кислорода в среде использовали анализатор растворенного кислорода МАРК- 403 (Нижний Новгород).

Бродильную активность дрожжей измеряли на аналитическом газоанализаторе (АГ), используемом в хлебопекарной промышленности.

Физиологическую активность клеток и интенсивность размножения оценивали по скорости снижения концентрации ионов Н1" в среде с глюкозой или мальтозой, а также по величине удельной скорости роста дрожжей.

При выполнении работы использовали математические методы планирования эксперимента. Статистическая обработка результатов проводилась с использованием программы Microsoft Excel 2000.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Закономерности размножения дрожжей в простой периодической

культуре

При получении производственной чистой культуры на первых стадиях технологического процесса используют бесприточный способ культивирования, где проявляются все законы, характерные для простой периодической культуры. Регулирование энергетического обмена при использовании данного способа выращивания дрожжей можно осуществлять с помощью создания условий для проявления эффектов Пастера или

Кребтри. Для установления значимости этих эффектов исследовали влияние кратности разбавления мелассы (КРМ) и интенсивности аэрирования среды в аппарате с барботажной воздухораспределительной системой. Прежде всего, обращает внимание отсутствие различий в кинетике изменения концентрации сухих веществ в пределах одного и того же значения КРМ, при изменении расхода воздуха с 30 до 214 м3/ч/м3 (рис.1). При этом установлено, что скорость потребления углеводов сусла снижается с 1,07 (г/100г)ч"' при КРМ 4 до 0,41 (г/100г)ч"' при КРМ 20, что указывает на переход к более экономичному потреблению углеводов (т.е проявляется снижение эффекта Кребтри). Однако, по этим результатам все же невозможно сделать вывод об эффективности процесса, т.к. углеводы могут участвовать как в спиртовом брожении, так и в энергетическом обмене дрожжей, связанном с приростом биомассы. Выяснить роль воздуха можно при установлении зависимостей выхода биомассы от расхода воздуха с одной стороны и от КРМ - с другой (рис.1). Установлено, что наибольшее влияние на энергетический обмен дрожжей оказывает начальная концентрация сбраживаемых Сахаров, т.к. при увеличении интенсивности аэрации с 31 до 214 м 3/ч/м3 (т.е. в 7 раз) выход биомассы независимо от КРМ увеличивается на 10±2%, в то время как увеличение кратности разбавления мелассы с 4 до 20 кг/кг приводит к увеличению выхода биомассы при одном и том же расходе воздуха в 3 раза.

КРМ=4

КРМ=8

у = -1.О670Ь< » 18,946 1=Г= 0,8949

* -О.ЭЗЭЗх ♦ 1 0.569 0,9374

у =-0,4107х * 4,7321 ^ = 0.9484

Рис. 1. Кинетика изменения содержания сухих веществ в процессе сбраживания сусла с разным начальным содержанием сухих веществ

Физиологическая активность дрожжей зависит от таких стрессовых факторов как тоничность среды и концентрация этанола, являющегося продуктом метаболизма самих дрожжей. Механизм их действия существенно отличается один от другого. В первом случае наблюдается плазмолиз клеток, во втором дегидратация клеточных оболочек с изменением проницаемости мембран.

В результате проведения экспериментов было установлено, что КРМ влияет на интенсивность размножения дрожжей (рис.2.), а именно: чем выше КРМ, т.е чем ниже тоничность среды, тем выше удельная скорость роста.

•V 0,3

| 0,25

| 0,2

8* 0.15

к

г О'1

I 0.05

г 0

0 1 2 3 4 5 6 Время,час

Рис. 2. Влияние КРМ на скорость роста дрожжей

Также было показано, что при оценке влияния тоничности среды необходимо учитывать нагрузку компонентов среды (питательных и балластных) на единицу биомассы (рис. 3).

СВ/дрожжи, кг/кг

Рис. 3. Влияние тоничности среды (СВ/дрожжи) на удельную скорость роста дрожжей в диапазоне изменения КРМ от 4 до 20 кг/кг

Это подтверждается также результатами, полученными при исследовании бродильной активности дрожжей, выращенных при КРМ=4, но

с варьированием величины 'засева, которая менялась от 0,1 до 10% от расхода мелассы, поэтому несмотря на то, что концентрация СВ во всех вариантах составляла 19%, величина СВ/дрожжи падала от 25 до 0,25 (рис.4).

80 1

СВ/дрожжи . Кг Кг я Зимаэная активность ж М альтазная активность

А - время (в мин), необходимое для выделения 10 см3 С02 при сбраживании дрожжами 5 % раствора мальтозы или глюкозы

Рис. 4. Влияние величины отношения СВ/дрожжи на бродильную активность

клеток

Еще больше, чем тоничлость среды па физиологическую активность дрожжей оказывает отрицательное действие концентрация этанола в среде выращивания, которая значительно увеличивается при снижении КРМ с 20 до 4 кг/кг, в результате увеличивается его нагрузка на дрожжи (рис.5).

При оценке физиологического состояния дрожжей по ускоренному методу, заключающемуся в определении скорости подкисления среды с глюкозой после внесения дрожжей (рис.6), установлено, что после 12-13 минутной лаг-фазы скорость подкисления (снижения рН) среды при внесении дрожжей, полученных при КРМ 20 и 8 значительно выше, чем у клеток, выращиваемых при КРМ 4.

При изучении бродильной активности дрожжей было установлено, что клетки, выращенные при КРМ 8, характеризовались самой высокой мальтазной и зимазной активностью, далее идут образцы биомассы, полученные при КРМ 20 и, самая низкая активность зарегистрирована у клеток, выращенных при КРМ 4, т,е наблюдается корреляция между физиологической активностью, определяемой методом подкисления среды, и активностью ферментов зимазного и мальтазного комплексов.

Спирт/дрожжи, Кг'Кг

Рис. 5. Влияние величины отношения спирт/дрожжи на скорость роста

дрожжей

время „мин

----КРМ—4 —--КРМ=8 -КРМ-20

Рис. 6. Влияние кратности разведения мелассы на снижение величины рН в

растворе с глюкозой

Влияние условий культивирования дрожжей с притоком питательных компонентов на бродильную активность клеток

Воздушно приточный способ культивирования используется на последних стадиях производства чистой культуры и стадиях накопления коммерческих дрожжей. Известно, что в этих условиях большое значение на тип энергетического обмена оказывают величины отношения сахара, приходящегося на единицу биомассы в начале каждого часа (величина отношения сахар/дрожжи), и удельный расход воздуха. Кроме того, на выход биомассы влияет концентрация некоторых витаминов, в частности биотина, по которому дрожжи являются абсолютными ауксотрофами. Между тем он входит в состав нескольких ферментов. Среди них особенно чувствительной

к недостатку этого витамина является пируваткарбоксилаза, при участии которой синтезируется оксалоацетат, идущий на биосинтетические процессы. Для этого существуют два пути: один - осуществляется биотинзависимым ферментом - пируваткарбоксилазой, другой - глиоксилатный путь, в ходе которого, оксалоацетат образуется без участия пируваткарбоксилазы, и биотин для этого не требуется. Однако второй путь функционирует только в аэробных условиях. В связи с этим потребность дрожжей в биотине при аэрации меньше, чем в условиях анаэробиоза. Исходя из этого, возникает необходимость выяснить, какая существует зависимость между потребностью клеток в биотине, воздухе и энергетическим обменом дрожжей, т.е. выходом биомассы. Также важно установить, как эти факторы влияют на хлебопекарные свойства дрожжей.

Изучение влияние биотина и аэрации на физиологическую активность дрожжей

Для установления взаимосвязи биотина и аэрации в метаболизме дрожжей был поставлен опыт с применением плана ПФЭ 22 (табл.1.).

Таблица 1

Влияние аэрации и биотина на выход и бродильную активность дрожжей

№ Натуральные Выход, Подъемная Мальтазная

опыта Значения факторов % сила, мин активность,

мин

Биотин,мкг/кг Воздух,м^ч/м3

1 80 60 66,4 41 82

2 350 60 73,7 39 87

3 80 120 80,0 43 90

4 350 120 87,9 44 77

В результате исследований, проведенных в аппарате с барботажной воздухораспределительной системой, которая представляла собой пористую пластину, установлено, что при внесении биотина из расчета от 80 до 350 мкг на прирост кг дрожжей (х0 и удельном расходе воздуха от 60 до 120 м3/ч/м3 (х2) жидкости выход биомассы (уб) в одинаковой мере зависит от этих факторов (у6 = 77,0 + 6,1 X] + 6,9 х2), в то время как мальтазная активность определяется в первую очередь дозировкой биотина (Х]), причем, при уменьшен™ количества биотина в среде повышение интенсивности аэрирования культуральной жидкости приводит к снижению мальтазной активности (У=84-2,0x1-4,ОХ1Х2). Как показал регрессионный анализ, зимазная активность, определяемая конститутивным комплексом ферментов, не зависит от количества подаваемого в среду воздуха.

При культивировании дрожжей в другом аппарате, где барботаж осуществлялся с помощью трубчатой воздухораспределительной системы в среде, с оптимальной концентрацией биотина отмечается тенденция повышения зимазной и мальтазной активности дрожжей.

Влияние поваренной соли на содержание сухих »сществ в клетках и их бродильную активность

С целью повышения бродильной активности дрожжей в технологии используют способ обработки дрожжевого концентрата поваренной солью.

Как видно на рис. 7, при одной и той же концентрации хлорида натрия в суспензии дрожжей наблюдается определенная зависимость между содержанием сухих веществ В клетках и количеством соли, приходящемся на един и ну биомассы: чем меньше концентрация клеток в среде, а ¡Следовательно больше величина отношения №С1/дрожжи, тем выше содержание в клетках сухих веществ.

□ 0,03 0,15 1,5

МаС1/дрожжи, Кг-Кг

Рис. 7 . Влияние величины отношения ЫаСТ/дрожжи на содержание в клетках

сухих веществ

Далее было отмечено, что бродильная активность обработанных раствором хлорида натрия дрожжей также была выше, чем у контрольных образцов дрожжей (рис.8.), причем, практически не имело значения, какова была концентрация дрожжевой суспензии.

Влияние перепада температур при культивирования дрожжей на нх бродильную активность

В процессе культивирования дрожжей из-за нарушения технологических режимов имеет место повышение температуры до 36-3 8°С, при этом скорость этого процесса может быть разной. Как следует из рис. 9, постепенное повышение температуры (!°С/ч) незначительно сказывается на активности ферментов зимазного и мальтазаош комплексов, в то время, как кратковременный температурный стресс (3 и 5 С/ч) приводит к снижению зимазной активности клеток с 56 до 86 мин, и мальтазной активности со 101 до 138 мин.

чао эо во то * 60 ^ 50 А О ЗО 20 1 О О

о О.ОЗ О, 15

1М0О1, Кг/дрожжи, Кг

о Мальтазная Зим а зная

анлолЕмнос-Пз. актменость,

А - время (в ми»), необходимое для выделения 10 cмJ СО2 при сбраживании дрожжами 5 % раствора мальтозы или глюкозы

Рис. 8. Влияние величины отношения КаС1/дрожжи на бродильную активность дрожжей

160 140 120 100 < 80 60 40 20 0

Контроль 13 5

Скорость повышениятемп&ратурььС/ч

о Зим аз пая активности □ Мальтазнэя активность

Л - время (в мин), необходимое для выделения 10 см3 СО; при сбраживании дрожжами 5 % раствора мальтозы или глюкозы

Рис. 9. Влияние скорости повышения температуры на бродильную активность

дрожжей

Разработка технологии дрожжей, направленной на повышение выхода и бродильной активности дрожжей

Разработана технология дрожжей, применение которой позволит сократить число лабораторных стадий культивирования с 5 до 3, а также, уменьшить количество стадий для получения коммерческих дрожжей с 6 до 4, а также позволит сократить длительность накопления 14,5т товарных дрожжей.

При этом удельный расход сырья и питательных солей снижается на 15-27% (таблица 2). Для повышения бродильной активности дрожжей концентрат биомассы после сепарирования обрабатывается хлоридом натрия из расчета 0,03 кг №С1 на 1 кг дрожжей.

Таблица 2

Сравнительная характеристика удельного расхода материалов при производстве дрожжей

Компоненты среды Удельный расход материалов, кг/т Снижение расхода, %

Технология в Сирии Разработанная технология

Меласса с 46% сахара 1280,00 1153,00 10,00

диаммонийфосфат 16,00 11,68 27,00

Сульфат аммония 75,40 58,48 22,40

Сульфат магния 8,50 8,00 6,00

Биотин 5*10"3 4,90*10"3 2,00

Рибофлавин 6,40*10"3 6,20*10'3 3,12

Пантотеновая кислота 3,90* Ю-3 3,70*10"3 5,10

Хлорид натрия - 30 -

ВЫВОДЫ

1. Выход дрожжей в простой периодической культуре регулируется в большей степени эффектом Кребтри, а не эффектом Пастера. Повышение кратности разбавления мелассы с 4 до 20 способствует повышению выхода биомассы в 2-3 раза, в то время как увеличение интенсивности аэрации с 30 до 214 м3/ч/м3 - на 5- 7 %.

2. Установлено, что независимо от величины удельного расхода воздуха,

скорость потребления углеводов сусла снижается при увеличении кратности разбавления мелассы (КРМ) с 1,07(КРМ 4) до 0,41 (г/100г)ч"'

(КРМ20).

3. При изучении влияния стрессовых факторов на физиологическую активность дрожжей в простой периодической культуре установлено, что увеличение отношения спирт/дрожжи с 0,001 до 0,01 кг/кг приводит к снижению скорости роста от 0,25 до 0,03.

4. Показано, что выход биомассы при культивировании дрожжей с притоком питательной среды и аэрацией зависит от концентрации биотина в среде, удельного расхода воздуха и их сочетанного действия. Мальтазная активность определяется концентрацией биотина и сочетанным действием изучаемых факторов. Получены уравнение регрессии, характеризующее эту зависимость.

5. Бродильная активность дрожжей зависит от скорости повышения температуры при культивировании дрожжей. Кратковременное повышение температуры со скоростью от 1 до 5 °С/ч снижает зимазную активность в 1,5-1,6 раза, а мальтазную - в 1,3-1,4 раза.

6. Обработка дрожжевого концентрата поваренной солью при повышении величины отношения NaCl/дрожжи с 0,03 до 1,50 г/г увеличивает содержание сухих веществ в клетках с 26,9 до 33,8 %. Бродильная активность дрожжей не зависит от величины отношения NaCl/дрожжи и определяется концентрацией поваренной соли.

7. Разработана технология хлебопекарных дрожжей, применение которой по сравнению с существующими в Арабской Сирийской Республике регламентами позволяет снизить удельный расход мелассы и питательных солей на 15-27%, уменьшить число стадий при получении чистой культуры с 5 до 3 и сократить длительность процесса накопления биомассы до 40 часов.

8.Разработана технологическая инструкция выращивания чистой культуры и товарных дрожжей с высоким выходом и бродильной активностью.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Меледина Т.В., Кхалил М.М. Закономерности роста и размножения дрожжей в отьемно-доливной культуре. В сб. « Пищевая и морская биотехнология: Проблемы и перспективы: материалы научно-практической конференции: Калининград,4-5 июля 2006.-М.: МАКС Пресс, 2006.-С. 77.

2. Кхалил М.М., Хао Сяопэн. Исследование влияния температурного стресса на бродильные свойства хлебопекарных дрожжей // Сб. Молодых ученых СПбГУНиПТ, 2006.-С.74-77.

3. Кхалил М.М., Смаль H.A. Влияние осмотического давления на жизнеспособность Saccharomyces cerevisiae II Сб. Молодых ученых СПбГУНиПТ, 2005.-С.37-40.

4. Жарков А.Ю., Иванов A.A., Смаль H.A., Кхалил М.М.. Влияние способа культивирования на флокуляционную способность дрожжей // Сб. Молодых ученых СПбГУНиПТ, 2005.-С.43-44.

5. Смаль H.A., Кхалил М.М, Изменение флокуляционной способности дрожжей верхового и низового брожения в ходе брожения и дображивания // Сб. Молодых ученых СПбГУНиПТ, 2005.-С.35-36.

6. Меледина Т.В., Гудь И.В., Кхалил М.М. Роль азотного и фосфорного питания при выращивании хлебопекарных дрожжей // Известия СПбГУНиПТ, 2005, В1.-С.58-60.

7. Меледина Т.В., Кхалил М.М. Закономерности роста и размножения хлебопекарных дрожжей на бесприточных стадиях технологического процесса накопления биомассы // Вестник Международной Академии Холода, 2006, В.4.-С.46-49

8. Тишин В.Б., Аль Асаад К., Кхалил М.М. Исследование влияния некоторых факторов на кинетику роста дрожжей Saccharomyces cerevisiae при периодическом культивировании // Вестник Международной Академии Холода, 2007, В.1.-С.44-47.

Подписано к печати 2, 04 Й? Формат 60x80 1/16. Бумага писчая. Печать офсетная. Печ. л. 1 0 . Тираж 80 экз. Заказ №96 СПбГУНиПТ. 191002, Санкт-Петербург, ул. Ломоносова, 9 ИПЦ СПбГУНиПТ. 19Ю02, Санкт-Петербург, ул. Ломоносова, 9.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ПО ПРОБЛЕМЕ РЕГУЛИРОВАНИЯ МЕТАБОЛИЗМА В КЛЕТКАХ ДРОЖЖЕЙ S.CEREVISIAE.

1.1.Энергетический обмен дрожжей.

1.1.1 Гликолиз.

1.1.2.Спиртовое брожение.

1.1.3.Аэробный метаболизм углеводов.

1.1.4.Пастеровский эффект и механизмы его регулирования.

1.1.5. Эффект Кребтри.

1.2 Конструктивный обмен дрожжей.

1.2.1. Углеводный обмен.

1.2.1.1 Метаболизм углеводов дрожжами в процессе хлебопечения.

1.2.2.0бмен азота.

1.2.3 Минеральный обмен дрожжей.

1.2.4.Витамины.

1.3 Физико-химические параметры процессы, влияющие на метаболизм дрожжей.

1.3.1 Влияние тоничности среды (осмотического давления) на микроорганизмы.

1.3.2 Роль температуры и длительность процесса дозреваняи дрожжей.

1.3.3.Влияние этилового спирта на дрожжи.

1.3.4. Влияние рН-значение интенсивности колебаний.

1.3.5.Стрессы, преодолеваемые дрожжами в дрожжерастительном процессе.

2. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯМ

2.1. Характеристика штаммов дрожжей.

2.2.Материал ы.

2.2.1. Показатели качества мелассы.

2.3 .Методы исследования.

2.3.1. Методы определения физиологического состояния дрожжей.

2.3.1.1. Определение состояния клеток (жизнеспособность) путем окрашивания метиленовым синим.

2.3.2. Определение ферментативной активности дрожжей по интенсивности выделения СОг.

2.3.2.1.Определение бродильной активности дрожжей газометрическим методом.

2.3.3. Оценка интенсивности потребления Сахаров по скорости снижения коннцентрации ионов Н* в среде.

2.3.4.Методика рассчета технологических режимов культивирования.

2.3.5. Определение коэффициента прироста биомассы дрожжей.

2.3.6. Определение экономического коэффициента (выход биомассы).

2.3.7. Определение содержания сухих веществ в клетках дрожжей.

2.3.8. Определение содержания трегалозы в клетках.

2.3.9. Определение количества растворенного в среде кислорода.

2.3.10. Статистическая обработка результатов опытов.

3 .РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Исследование влияния интенсивности аэрирования культуральной жидкости на метаболизм дрожжей.

3.1.1. Бесприточный способ.

3.1.2. Культивирование дрожжей в КСИА.

3.2. Культивирование дрожжей с притоком питательных компонентов.

3.2.1. Взаимосвязь метаболизма биотина и аэрации.

3.2.2. Исследование влияния интенсивности аэрации на метаболизм дрожжей в аппарате с трубчатой воздухораспределительной системой.

3.3. Исследование влияния тоничности среды на рост и бродильную активность хлебопекарных дрожжей.

3.3.1. Простая периодическая культура.

3.4. Исследование влияния обработки дрожжей поваренной солью на содержание сухих веществ в клетках.

3.4.1.Исследование влияния поваренной соли на жизнеспособность дрожжей.

3.4.2. Влияние поваренной соли на содержание сухих веществ в клетках и их бродильную активность.

3.5. Влияние перепада температуры при культивировании дрожжей на их бродильную активность.

4. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ДРОЖЖЕЙ, НАПРАВЛЕННОЙ НА ПОВЫШЕНИЕ ВЫХОДА И БРОДИЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ КЛЕТОК.

4.1. Анализ технологии накопления биомассы хлебопекарных дрожжей, применяемой в АСР.

4.1.1.Анализ технологии чистой культуры.

4.2. Разработка технологии выращивания чистой культуры с высоким выходом биомассы.

4.2.2. Технология чистой культуры для непосредственного использования в товарной стадии.

4.3 .Технологическая схема выращивания товарных дрожжей в концентрированной среде, направленная на повышение бродильной активности.

4.4. Повышение бродильной активности дрожжей.

ВЫВОДЫ.

Актуальность работы В настоящее время в Арабской Сирийской Республике (АСР) наблюдается интенсивный рост всех отраслей промышленности, в том числе и пищевой.

В частности, увеличивается выпуск и ассортимент хлебобулочных изделий, для изготовления которых требуется хлебопекарные дрожжи с высокой бродильной активностью. Это влечет за собой необходимость строительства новых заводов по выпуску коммерческих дрожжей и разработки более эффективных технологических схем, направленных на повышения выхода и качества выпускаемой продукции.

Существующие в АСР технологии характеризуются необоснованно длительным процессом накопления биомассы, особенно на первых стадиях технологического процесса, это сказывается на снижении общего выхода биомассы.

В России в течение последних 30 лет ведущими специалистами отрасли Палагиной Н.К., Розмановой Н.В. и Мелединой Т.В. даны подходы к разработке эффективных режимов культивирования дрожжей, однако в этих исследованиях нет сведений о влиянии различных стрессов на метаболизм дрожжей, которые претерпевают дрожжи в процессе выращивания и выделения их на брожении.

Поэтому исследования различного рода воздействий на дрожжи, таких как кислород, тоничность среды, колебания температур и разработка эффективной технологии выращивания дрожжей, учитывающей эти стрессовые факторы, является актуальной задачей. Цели и задачи исследований Целью работы являлось исследование влияния параметров процесса культивирования на закономерности роста и размножения хлебопекарных дрожжей в аппаратах разной конструкции и разработка высокоэффективных технологий накопления биомассы.

Для выполнения поставленной цели решались следующие задачи:

• исследовать влияние резких колебаний кислорода воздуха при выращивании дрожжей на их рост и размножение, а также бродильную активность клеток;

• исследовать влияние тоничности среды на интенсивность размножения дрожжей в простой периодической культуре, и периодической культуре с притоком питательных компонентов и их бродильную активность;

• изучить процессы, происходящие при искусственном повышении сухих веществ в клетках дрожжей;

• исследовать влияние резких колебаний температуры при выращивании дрожжей на их рост и размножение, а также бродильную активность клеток;

• разработать технологию хлебопекарных дрожжей с высокой бродильной активностью с учетом их реакции на стрессовые факторы.

Научная новизна.

- установлено, что при культивировании дрожжей по бесприточному способу, на выход биомассы большее влияние оказывает кратность разбавления мелассы, в то время как удельный расход воздуха имеет второстепенное значение;

- показана взаимосвязь между концентрацией биотина в среде и удельным расходом воздуха при культивировании дрожжей с притоком питательных компонентов в регулировании выхода дрожжей и их бродильной активности; - установлена взаимосвязь между физиологической активностью клеток и стрессами, вызванными повышением тоничности среды, концентрацией этанола в простой периодической культуре, перепадом температур при культивировании дрожжей с притоком питательных компонентов и обработкой коммерческих дрожжей раствором хлорида натрия.

Практическая значимость. На основании изученных закономерностей размножения дрожжей разработана технология чистой культуры и коммерческих дрожжей, применение которой по сравнению с существующим в АСР регламентом, позволяет сократить число стадий, увеличить выход биомассы, снизить расход сырья на единицу продукции и сократить длительность процесса накопления биомассы дрожжей. Составлена технологическая инструкция по выращиванию чистой культуры и товарных дрожжей, которая прошла испытания на стендовой установке в лаборатории микробиологии, биохимии и технологии дрожжей Санкт-Петербургского института управления и пищевых технологий.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов, списка литературы, содержащего 106 источников. Диссертация содержит 123 страницы машинописного текста, 52 иллюстрации и 23 таблицы.

выводы

1. Выход дрожжей в простой периодической культуре регулируется в большей степени эффектом Кребтри, а не эффектом Пастера. Повышение кратности разбавления мелассы с 4 до 20 способствует повышению выхода биомассы в 2-3 раза, в то время как увеличение

3 3 интенсивности аэрации с 30 до 214 м /ч/м - на 5- 7 %.

2. Установлено, что независимо от величины удельного расхода воздуха, скорость потребления углеводов сусла снижается при увеличении кратности разбавления мелассы (КРМ) с 1,07(КРМ 4) до 0,41 (г/ЮОгК1 (КРМ 20).

3. При изучении влияния стрессовых факторов на физиологическую активность дрожжей в простой периодической культуре установлено, что увеличение отношения спирт/дрожжи с 0,001 до 0,01 кг/кг приводит к снижению скорости роста от 0,25 до 0,03.

4. Показано, что выход биомассы при культивировании дрожжей с притоком питательной среды и аэрацией зависит от концентрации биотина в среде, удельного расхода воздуха и их сочетанного действия. Мальтазная активность определяется концентрацией биотина и сочетанным действием изучаемых факторов. Получены уравнение регрессии, характеризующее эту зависимость.

5. Бродильная активность дрожжей зависит от скорости повышения температуры при культивировании дрожжей. Кратковременное повышение температуры со скоростью от 1 до 5 °С/ч снижает зимазную активность в 1,5-1,6 раза, а мальтазную - в 1,3-1,4 раза.

6. Обработка дрожжевого концентрата поваренной солью при повышении величины отношения NaCl/дрожжи с 0,03 до 1,50 г/г увеличивает содержание сухих веществ в клетках с 26,9 до 33,8 %. Бродильная активность дрожжей не зависит от величины отношения NaCl/дрожжи и определяется концентрацией поваренной соли.

7. Разработана технология хлебопекарных дрожжей, применение которой по сравнению с существующими в Арабской Сирийской Республике регламентами позволяет снизить удельный расход мелассы и питательных солей на 15-27%, уменьшить число стадий при получении чистой культуры с 5 до 3 и сократить длительность процесса накопления биомассы до 40 часов.

8.Разработана технологическая инструкция выращивания чистой культуры и товарных дрожжей с высоким выходом и бродильной активностью.

1. Аннемюллер Г., Мангер Х.-И. Аэрация при получении чистой культуры- максимально не значит оптимально // Brouwelt Мир пива, 2000, №2.-С.7-14

2. Аннемюллер Г., Мангер Х.-Й. Границы и последствия размножения дрожжей в пивном сусле // Brauwelt. Мир пива, 2000, №2. -С. 12-17.

3. Анисимов С. А. Интенсификация процессов массообмена в дрожжерастильных аппаратах// Автореф. дис. канд. техн. наук, СПб, СПбТИХП, 1992.—16с.

4. Василинец И. М. Математическая обработка экспериментальных данных с использованием ЭВМ// Методические указания для студентов специальностей 270300 и 270500. СПб.: СПбГУНиПТ, 2002, 19с.

5. Бекер М.Е., Дамберг Б.Э., Рапопорт А.И. Анабиоз микроорганизмов. //Рига. Зинатне. 1981.- 253с.

6. Грунюшкин И.П., Баулина Т.В. Изучение влияния переменных температурных режимов на накопление биомассы дрожжами // Саранск, 2002, 8с., Деп.в ВИНИТИ 31.10.2002, N 1878-В2002.

7. Грунюшкин И.П., Баулина Т.В. Влияние мелассы на рост биомассы дрожжей // Саранск, 2002, 5с., Деп.в ВИНИТИ 31.10.2002, N 1880-В2002.

8. Гуляева Ю.Н., Новоселов А.Г., Тишин В.Б. Повышение эффективности промышленных ферментеров// Вестник международной академии холода. С.-Петербург Москва, 1998, вып.1.-С.36-38.

9. Дамберг В.Э. Роль трегалозы в росте и восстановлении дрожжей S.cerevisiae.// Изв. АН Латв. ССР, 1982,№8. С. 93-98.

10. Дарков Г.В. Исследование кинетики роста чистой культуры пивных дрожжей в кожухотрубном струйно-инжекционном аппарате (КСИА)// Автореф. дис. канд. техн. наук, СПбГУНиПТ, 2002.-16с.

11. Жвирблянская А.Ю. и др. Дрожжи в пивоварении// М.: Пищ. Промышленность. 1979,-248с.

12. Ждан-Пушкина С.Н. Основы роста культур микроорганизмов //J1.: ЛГУ, 1983-187с

13. Инструкция по микробиологическому и технохимическому контролю дрожжевого производства// Москва "Легкая и пищевая пром-сть", 1984.- 190с.

14. Кунце В., Мит Г. Технология солода и пива: пер. с нем// СПб., Изд-во «Профессия», 2001.- 912с.

15. Козлов Ю.П., Братковская Л.Б., Новаков К.Н., Добрина С.К., Полищук Р.Ф., Коган В.Е. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах // Биофизические и физико-химические исследования в вмтаминологии.-М.-1981.-С.9-12.

16. Котельникова А.В., Звягильская Р.А. Биохимия дрожжевых митохондрий//М. Наука. 1983. -256с.

17. Кулаев И.С. Лавениекс М.Г. Роль запасных веществ в энергетическом обмене S. Cerevisiae при обезвоживании // В кн.: Экспериментальный анабиоз. Тезисы докл. на 11 Всесоюзн. конф. по анабиозу. Рига 1986. -С.21-22.

18. Кхалил М.М, Хао Сяопэн. Исследование влияния температурного стресса на бродильные свойства хлебопекарных дрожжей // Сб. Молодых ученых СПбГУНиПТ, 2006.-С.74-77.

19. Кхалил М.М, Смаль Н.А. Влияние осмотического давления на жизнеспособность Saccharomyces cerevisiae И Сб. Молодых ученых СПбГУНиПТ, 2005.-С.65-67.

20. Ленинджер А. Биохимия. Молекулярные основы структуры и функций клетки. // М.: Мир. -1976. -957с.

21. Логинова Л.Г. Жизнь микроорганизмов при высоких температурах // М.: Наука. -1966. -98с.

22. Мазур П.Я. Повышение активности хлебопекарных дрожжей// Хлеб, и конд. пр-ть. 1980,№1.-С.32-33.

23. Меледина Т. В. Некоторые закономерности размножения Saccharomyces cerevisiae и пути повышения эффективности процесса получения чистой культуры дрожжей// Диссертация на соиск.уч. ст. к.б.н.-JI.1980.- 249с.

24. Меледина Т.В. Научное обоснование и разработка высокоэффективных технологий дрожжей Saccharomyces cerevisiae //Авт.дис.на соиск.уч.ст.док. техн. наук -М.2002 31с.

25. Меледина Т.В., Дарков Г.В., Тишин В.Б., Смирнова М.В. культивирование дрожжей в кожухотрубном струйно-инжекционном абсорбере // Изв.СПбГУНиПТ,2002.-Ш.-С.75-79.

26. Меледина Т.В., Кхалилл М.М. Закономерности роста и размножения хлебопекарных дрожжей на бесприточных стадиях технологического процесса накопления биомассы // Вестник MAX, 2006.-В.4.-С.46-49.

27. Мирскова А.Н., Левковская Г.Г., Гусева С.А., Воронков М.Г., Меледина Т.В., Витринская А.М., Карпишева И.А., Озерова В.П. Способ выращивания дрожжей// А.С.№1350172.1987.Бюл.№41.-С.100.

28. Мирскова А.Н.,Левковская Г.Г.,Гусева С.А.Воронков М.Г.Меледина Т.В.,Карпишева И.А.,Озерова В.П. Стимуляторы роста хлебопекарных дрожжей// А.С. № 1475124.1989.Бюл. №11.-С.79.

29. Меласса свекловичная. //ОСТ 18-395-82. -18с.

30. Палагина Н.К. Методическое руководство по расчету технологических режимов дрожжевого производства. //Ml111 СССР, ВНИИХП, ЛО., М. 1977, 290с.

31. Плевако Е.А. Технология дрожжей.- М: Пищ. Пр-ть.- 1970. -299с.

32. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток.//-М:Мир,-1978.- 331с.

33. Работнова И.Л. Изучение лаг-фазы у микроорганизмов. I Влияние внешних условий на длительность лаг-фазы у Torula utilis и Pseudomonas fluorescens //Микробиология. 1 959.-t.28.-C.352.

34. Работнова И.Л. Некоторые данные о закономерностях роста микроорганизмов.//- Журнал общей биологии, 1972,33,5 с. 539-554.

35. Работнова И.Л. Роль физико-химических условий рН и гН2 в жизнедеятельности микроорганизмов.// -М: АН ООСР,-1961.- 275с.

36. Саубенова М.Г., Шигаева Н.К., Семенченко Г.В. Значение трегалозы для сохранения активности сухих дрожжей.//- Вестн. АН Каз.ССр, 1976,3, -С.64-65.

37. Работнова И.Л.: 1У междун. Специализир. Симпозиум по дрожжам. //Микробиология, т.48,в. 1,1979, -С. 165-168.

38. Рудин Д., Уилки Д. Биогенез митохондрий.// М.: Мир, 1970. - С. 84-122.

39. Семихатова Н.М. Хлебопекарные дрожжи.-М:Пищ. пр-ть.- 1980.-200с.

40. Теория и практика непрерывного культивирования микроорганизмов. //Микробиология, 4, ВИНИТИ, Итоги науки и техники, М., 1975.-172с.

41. Технология дрожжей «Методическое руководство по расчету технологических режимов дрожжевого производства. //МПП СССР, ВНИИХП, ЛО., М. 1977. 290 с.

42. Фараджева Е.Д., Болотов Н.А. Производство хлебопекарных дрожжей: практичсекое руководство.-СПб.: Изд-во «Профессия»,2002.-167с.

43. Филишюв В. В. Функции и синтез биотина в живом организме.//-М: Наука. 1985.-217с.

44. Черныш В.Г., Бочарова Н.Н. Использование консервантов для увеличения сохранности и активации размножения маточных дрожжей//Хлебопек. и конд. пром-сть, 1984. С. 12.

45. Черныш В.Г., Бочарова Н.Н. Влияние температуры и активной кислотности среды на метаболизм резервных углеводов и выживаемость пекарских дрожжей// Прикл. биохим. и микробиол, 1981, т. 17, с. 389.

46. Черныш В.Г. Стойкость хлебопекарных дрожжей и пути ее повышения.//Авт.дис.на соиск.уч.ст.канд.техн. наук -М. 1977 . 25с

47. Черныш В.Г., Бочарова Н.Н. Влияние температуры и активной кислотности среды на метаболизм резервных углеводов и выживаемость пекарских дрожжей.//- Прикл.биохим. и микробиол., 1975,11. -С.662-668.

48. Шестаков С.Д., Волохова Т.П. Новая эффективная технология активации хлебопекарных дрожжей.// Хлебопечение России 2000, №6. -С.33-34.

49. Шлегель Г.Общая микробиология // М:Мир, 1987.- 195с.

50. Энгельгард В.А., Саков Н.Е. О механизме пастеровского эффекта // Биохимия.- 1943, В.8. -С.9-36.

51. Aguilera А. & Benitez Т. Role of mitochondria in ethanol tolerance of Saccharomyces cerevisiae// Archives of Microbiology, 1985, № 142, pp. 389392.

52. Alexandre H., Rousseaux I. & Charpentier C. Relationship between ethanol tolerance, lipid composition and plasma membrane fluidity in Saccharomyces cerevisiae and Kloekera apiculata// FEMS Microbiology Letters, 1994, № 124, pp. 17-22.

53. Arcay-Ledezma G.J. and Slaughter J.C the response of Saccharomyces Cerevisiae to fermentation under carbon dioxide pressure//journal of the Institute of Brewing, 1984,№90,pp. 81 -84

54. Att field P.V,Roman A.and Norlhcolt C.J, FEMS, Microbiology Letters,1992, №94, P 271-276.

55. Brewing yeast fermentation performance/Editer by K.Smart/ Blackwell Science.2003.-308c

56. Brown C.M., Johnson B. Influence of concentration of glucose and galactose on the physiology of Saccharomyces cerevisiae in continuous culture.//-J. Gen. Microbiol., 1970, 64,3, p.279-287.

57. Casey G.P. and Ingledew W.M. Ethanol tolerance in yeasts// CRC Critical Reviews in Microbiology, 1986, № 13, pp. 219-280.

58. Costa V., Amorin M.A., Reis E., Quintanilha A. & Moradas-Ferreira P. Mitochondrial superoxide dismutase is essential for ethanol tolerance in the post-diauxic phase//Microbiology, 1997, № 143, pp. 1649-1656.

59. D'Amore Т., Panchal C.J., Russell I. and Stewart G.G. Critical Reviews in Biochemistry, 1990, № 7, p. 287.

60. Dodic S. S., Popov S.L., Marcov S.L. Viability of S.cer. and biosorption of zinc ions.// Acta period tecnol. 1999,30.-p.l99-205.

61. Dodic S. S., Popov S.L. ,Ruzic N.E. et al Bioaccumulation of zinc ions in S.cer. cell. //Acta period tecnol. 1999.30.- p. 165-172.

62. Elliott B.,Hallwanger R.S.Q Futcher B. Synergy between Trehalose and HSP 104 for Thermotolerance in Saccharomyces Cerevisiae//Genetics, 1996,144,99 923-933

63. Fiechter V.C., Piggot J.R. Continuous cultivation of yeast.// Methods of Cell Biology, 1975, Д, -p.97-130

64. Fujita K.Iwahashi H.,Kodama O.&Komatsuy.Induction of heat shock proteins and a ccumulation of Trehalose by TPN in Saccharomyces cerevisiae //Biochemical and Biophysical research communications, 1995,№216,pp.1041-1047

65. Galinski,E. A.,stein,M, Amendt,B.and kinder,M.( 1997) the Kosmotropic (structure-forming)effect of compensatory Solutes.comp.Biochem, Physiol. 117A.

66. Grba S.,Oura E., Suomalainen H. On the formation of glycogen and trehalose in baker's yeast//.-Eur.J. Appl. Microbiol., 1976, 2,-p.29-37.

67. Hammond,J.Davis,D.,Lee,V.and storey,K.(2001) Does osmotic pressure affect yeast performance in high gravity fermentation? Proc.Eur.Brew.Conv. Budapest.

68. Hohmann,S.and Mager,W.H.(Cds),R.G.Landes Austin, 1997 Shaping up:The response of yeast to osmotic stress.

69. Hammond J.,Brennan M.and price A. the control of microbial spoilage of beer//jurnal of the Institute of brewing, 1999,№105,pp.113-120

70. Hammond J. Yeast growth and nutrition/ In: Brewing Yeast Fermentation Performance, K.Smart (ed) // Blackwell Science, Oxford, 2000.-P.77-85.

71. Keller F., Schelenberg M., Wimken A. Localisation of trehalose in vacuoles and trehalose in cytosol of yeast ( S.ctrevisiae)//.- Arch.Microbiol., 1982,131,-p.298-301.

72. Kessler H.Diplomarbeit,TU // Muhchem 1964.-p.32

73. Kolbach W.,Kolbach.,Schilde .WO.F.Pr.//1963.- №16.- p.21

74. Lindquist S.L., Craig E.A. The heat shock proteins//Annual review of genetics, 1988,№22,pp 631-677

75. Mansour Т.Е. Studies on heart phosphofructokinase: purification, Innibition and activation. //-J. Biol. Chem., 1963, 238, 7, -p.2285-2292.

76. Moat A.G.,Wilkens G.,Friedman H. A role for biotine in parine biosyntesis. //J.Biol.Chem. 1956.-V.223.-p.985-991.

77. Novotny C., Flieger M., Panos J.& Karst F. Effect of 5, 7-unsaturated sterols on ethanol tolerance in Saccharomyces cerevisiae// Biotechnology and Applied Biotechnology, 1992, № 15, pp. 314-320.

78. Oura E.,Suomalalnen H. Blotln-Actlv compounds, their exitence In nature and the blotin requlrments of yeasts// J.Inst.Brew: Sept-Octob.1982.-v.88.-p.299-308.

79. Oura E. Some aspects of the growth process of baker's yeast// Proc. Thlrd.Int.Spec.symp. onyeats.-Helsinki,1973.-v.ll.-p.215-230.

80. Oura E.,Suomalalnen H. Biotin and metabolism of baker's yeast// J.Inst.Brew. 1978.-v.84,n.65. -p.283-287.

81. Oura E. Effect of aeration intensity on the biochemical composition of baker's yeast. I. Factors affecting the type of metabolism.// Biotechn. A Bioeng., 1974,16,-p.l 197-1212.

82. Panchol,C.J.and stewart,G.G.(1980) the effect of osmotic pressure on the production and excretion of ethanol and glycerol in brewing yeast strain S.J.Inst.Brew.86.207.210

83. Panek A.D. Trehalose synthesis during starvation of baker's yeasts.-//Europ.J.Appl.Microbiol.,1975,2,-p.39-46.

84. Piper P.W.,Talreja K.,panaretou B.et.al.Induction of major heat shock proteins of Saccharo my ces cerevisiae including plasma membrane HSP by ethanol levels bove acritical Threshold//Microbiology,1994,№140, pp 30313038

85. Qualin D.,Thurston P., Tubb R. The structural and storage carbohydrates of S.cerevisiae. Changes during fermantation of wort and role the glycogen catabolism in lipid biosinthesis.// J. Inst. Brew. 1981,87,-p. 108-111.

86. Reed G,. peppier H.yeast Technology 11 J.N.C.1973.part 5-p.53-102.

87. Riger M., Kappeli О., Fiechter a. The role of limited respiration in the incomplete oxidation of glucose by Saccharomyces cerevisiae // J. Gen. Microbiol., 1983,129,3,-p.653-661.

88. Sales K., Brandt W., Rumbak E. and Lindsey G. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes, 2000, p. 1463.

89. Schlesinger MJ. Heat shock proteins// Journal of Biological Chemistry, 1990, №265, pp. 12111-12114.

90. Sharma S.C.A Possible role of Trehalose in osmotolerance and ethanol tolerance in Saccharomyes Cerevisiae , FEMS Microbiology1.tters, 1997,152,pp.11-15

91. Singer, M.A.and Lindguist,S.(1998) Thremotolerance in Saccharomyces Cerevisiae: The yinand yang of Trehalose.Trend s Biotechnol. 16,460-468

92. Smart, K.(2000) the death of the yeast cell.in: Brewing yeast fermentation performance, Smart, K.(ed).// Blackwell Science,0xford.-pp.l80-130.

93. Sols A., Gancedo C., Dela Fuente. Energy-yielding metabolism in yeasts. The yeast, ed by Rose A.H. a Harrison J.S. //-Vol.2- London. Acad.Press.-1971. -P.271-303.

94. Tajima K.,Yoshizumi H.//J.Ferment technol 1972,v.50,pp.764.

95. Ter Linde J.J. M., Liang H., Davis R.W., Steensma H.Y., van Dijken J.P. and Pronk J.T. Journal of Bacteriology, 1999, № 181, p. 7409.

96. Vallee, B. L. Zinc and other Active Site Metals as Probes of Local Confirmation and Function of Enzymes, //Carlsberg Research Commun. 45, 1980.-p. 423-441.

97. Walker,G.M.( 1998) Yeast: Physiology and Biotechnology. Jhon Wiley and Sons, chichester,pp.l63-167

98. Watson T.G.//J.Microbiol,1970,v.64,pp.91.

99. Weis W.I. and Dickamer K. Annual Review of Biochemistry, 1996, № 65, p. 441.

100. Wiemken,n.(1990) Trehalose in yeast: stress protectant rather than reserve carbohydrate.Antonie van Leeuwen hoek 5 8,209-217

101. Young T.W. The biochemistry and physiology of yeast growth.// In: Brewing - Microbiology. New York. 1987. Chapt.2. - p. 15-45.