автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.04, диссертация на тему:Исследование свойств микроорганизмов Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus и разработка тест-системы для их идентификации

На правах рукописи

Беспоместных Константин Владимирович

ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ МИКРООРГАНИЗМОВ LACTOBACILLUSDELBRUECKIISUBSP. BULGARICUS И РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ИХ ИДЕНТИФИКАЦИИ

Специальность 05.18.04 - технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

2 9 СЕН 2011

Кемерово 2011

4855033

Работа выполнена в Федеральном Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» (ФГБОУ ВПО КемТИПП)

Научный руководитель: заслуженный деятель науки и техники РФ,

доктор технических наук, профессор Остроумов Лев Александрович

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор

Осинцев Алексей Михайлович

доктор технических наук Пасько Ольга Владимировна

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Омский государственный

аграрный университет им. П.А. Столыпина»

Защита диссертации состоится 12 октября 2011 года в 10-00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.089.01 при ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» по адресу: 650056, г. Кемерово, бульвар Строителей, 47.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности»

С авторефератом можно ознакомиться на сайте КемТИПП (www.kemtipp.ru).

Автореферат разослан 9 сентября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета , Н. Н. Потипаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В связи с интенсивным развитием молочной промышленности в настоящее время существует проблема производства кисломолочных продуктов с заданными стабильными показателями качества. Для контроля их качества до сих пор нет четко выработанной схемы, по которой бы определялась не только технологическая пригодность, но и безопасность использования чистых культур бактерий и бактериальных заквасок для производства кисломолочных продуктов.

Проблема достоверного определения качества и, прежде всего, видовая идентификация молочнокислых бактерий, входящих в состав бактериальных заквасок, являются особенно актуальными.

Одним из подходов к решению описанных проблем, связанных с контролем за качеством и экспертизой молочных продуктов, является использование тест-систем, основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР), для точной идентификации микроорганизмов, входящих в состав бактериальных заквасок, бактериальных концентратов и чистых культур, используемых в производстве кисломолочной продукции.

Бактерии Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus являются основным компонентом кисломолочных продуктов функционального питания. Употребление молочных продуктов, содержащих эти микроорганизмы, способствует нормализации кишечной микрофлоры, укреплению иммунитета организма.

В работах отечественных исследователей (А.Г. Точилина, С.Г. Ботина), посвященных использованию ДНК-методов для видовой идентификации молочнокислых бактерии, были показаны важные достоинства ПЦР -универсальность, высокая чувствительность и специфичность, способность к дифференцированию близкородственных бактерий.

Однако в доступной нам литературе, мы не обнаружили сведений об использовании разработанных ПЦР-тест-систем в промышленных условиях производства молочных продуктов, позволяющих совершенствовать систему контроля за качеством бактериальных заквасок и проводить экспертизу кисломолочных продуктов на более высоком уровне. Именно поэтому разработка ПЦР-тестов остается актуальной задачей и представляет самостоятельный научный и практический интерес.

Цель работы и задачи исследований. Целью диссертационной работы являлись: изучение биохимических свойств, структуры генома, разработка ПЦР-тест-системы для родовой и видовой идентификации микроорганизмов L. delbrueckii subsp. bulgaricus.

Для достижения поставленной цели определены следующие задачи исследования:

изучение биохимических и фенотипических свойств микроорганизмов L. delbrueckii subsp. bulgaricus;

- проведение анализа нуклеотидной последовательности ДНК, кодирующей синтез 16S рРНК микроорганизмов L. delbrueckii subsp. bulgaricus',

- подбор и синтез композиции универсальных праймеров для амплификации гена 16S рРНК микроорганизмов L. delbrueckii subsp. bulgaricus;

оптимизация параметров амплификации гена 16S рРНК микроорганизмов L. delbrueckii subsp. bulgaricus;

- изучение специфичности и чувствительности разработанной ПЦР-тест-системы;

- проведение сравнительной оценки метода видовой идентификации микроорганизмов L. delbrueckii subsp. bulgaricus, с использованием ПЦР и классического биохимического метода;

- описание ПЦР-тест-системы для идентификации микроорганизмов L. delbrueckii subsp. bulgaricus и расчет затрат на проведение исследования в микробиологических лабораториях молочных предприятий.

Научная новизна работы. Сконструированы родо- и видоспецифичные праймеры для амплификации гена 16S рРНК микроорганизмов L. delbrueckii subsp. bulgaricus, содержащихся в кисломолочных продуктах.

Проведена сравнительная оценка видовой специфичности методом ПЦР с классическим биохимическим методом.

Практическая значимость работы. В итоге проведенной диссертационной работы была разработана тест-система для идентификации молочнокислых бактерий в кисломолочных продуктах, что позволит совершенствовать контроль за качеством и проведение экспертизы производимой кисломолочной продукции.

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были предметом докладов и обсуждений на международных и межрегиональных научно-технических конференциях, семинарах, конгрессах: Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Инструментальные методы для исследования живых систем в пищевых производствах» (Кемерово, 2009); III ежегодного смотра-сессии аспирантов и молодых ученых по отраслям наук (Вологда, 2009); П Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы развития современной науки, техники и технологии» (Москва, 2010); Международного научно-практического семинара «Современные технологии продуктов питания: теория и практика производства» (Омск, 2010); III Всероссийской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Пищевые продукты и здоровье человека» (Кемерово, 2010); VII Специализированного конгресса Молочная промышленность Сибири (Барнаул, 2010); Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Проведение научных исследований под руководством приглашенных исследователей в 2010 году» (Кемерово, 2010); конкурса "Участник молодежного научно-инновационного конкурса" («У.М.Н.И.К.»)

Федерального Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере на территории Кемеровской области (Кемерово, 2010); VI Всероссийской научно-практической конференции «Качество продукции, технологий и образования» (Магнитогорск, 2011); IV Всероссийской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Пищевые продукты и здоровье человека» (Кемерово, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, в том числе - три в журналах, рекомендованных экспертным советом ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из следующих основных разделов: введение, аналитический обзор, объекты и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, практическая реализация результатов работы, результаты и выводы, список использованных источников и приложения. Основное содержание работы изложено на 106 страницах машинописного текста, содержит 28 таблиц и 21 рисунок. Список литературы включает 151 наименование.

МЕТОДИКА ВЫПОЛНЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

Теоретические и экспериментальные исследования проведены в соответствии с поставленными задачами в Научно-образовательном центре и на кафедре «Бионанотехнология» Федерального Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности». Общая схема исследований приведена на рис. 1.

В качестве объектов исследования использовали десять штаммов бактерий рода Lactobacillus, предоставленных ФГУП ГосНИИгенетика, пять из которых по паспортным данным принадлежали к L. acidophilus, а другие пять - к L. delbrueckii subsp. bulgaricus; бактериальные закваски и концентраты; кисломолочные продукты, приобретенные на потребительских рынках Кемеровской области.

Образцы кисломолочной продукции были разделены на несколько опытных групп в зависимости от вида входящих в их состав молочнокислых бактерий.

Экспериментальные исследования проводили в 3-кратной повторности, полученные данные анализировали и обрабатывали с использованием ПК.

Весь цикл исследований состоял из нескольких взаимосвязанных этапов.

На первом этапе для формулировки цели и задач собственных исследований проводили анализ доступной отечественной и зарубежной информации по теме диссертационного исследования.

На втором этапе изучали биохимические свойства штаммов L. delbrueckii subsp. bulgaricus и определяли молочнокислые бактерии в кисломолочных продуктах по культурально-морфологическим признакам.

Культивирование_лактобактерий_и_биохимическая

идентификация. Для выращивания культур бактерий рода Lactobacillus

использовали модифицированные питательные среды de Man, Rogosa, Sharpe (MRS) для выделения и культивирования L. delbrueckii subsp. bulgaricus: полужидкую, содержащую 0,15 % агара (MRS-2) и плотную, содержащую 2% агара (MRS-4). Штаммы для молекулярно-генетических исследований высевали на полужидкую среду MRS-2 и инкубировали в течение 12 часов при 37 "С. Полученные культуры бактерий стандартизировали спектрофотометрически (D60<pl) и использовали для выделения геномной

ДНК- 3

Лиофильно высушенные штаммы разводили в 1 см стерильного физиологического раствора и 0,1-0,15 см3 высевали на жидкую среду MRS-2. Инкубацию проводили 2 суток при 37 °С. Затем выполняли разведения от 10"1 до 10"8 в стерильном физиологическом растворе и высевали на чашки с плотной средой MRS-4. Посев выполняли с каждого разведения. Инкубировали в течение 2-3 суток при 37 °С в анаэробных условиях с использованием анаэростатов и газогенерирующих пакетов GasPack (BD BBL, США). Изолированные колонии, типичные для лактобацилл, пересевали на полужидкую среду MRS-2. Через 2 суток инкубации культуры из всех пробирок использовали для постановки так называемого «пестрого ряда».

В состав «пестрого ряда» входили 14 субстратов (сахаров и многоатомных спиртов): арабиноза, целлобиоза, галактоза, лактоза, мальтоза, маннит, манноза, мелибиоза, раффиноза, салицин, сахароза, трегалоза, ксилоза, сорбит.

Бульон с бромкрезоловым пурпурным засевали 2 каплями 48-часовой культуры со среды MRS-2 с последующим встряхиванием пробирки для лучшего размешивания.

После посева испытуемого микроорганизма в каждую пробирку асептически помещали по 1 диску с соответствующим углеводом. Посевы инкубировали в течение 48 часов при 35-37 "С. Результаты учитывали через 18 и 48 часов. При выращивании на бульоне с бромкрезоловым пурпурным образующаяся кислота способствует окрашиванию среды в желтый цвет, а газ скапливается в поплавке.

Определение молочнокислых бактерий в кисломолочных продуктах. Определение культурально-морфологических признаков L. delbrueckii subsp. bulgaricus проводили согласно ГОСТ Р 51331-99 «Продукты молочные. Йогурты. Общие технические условия».

На третьем этапе исследования с использованием компьютерной программы ClustalW (версия 2.1) проводили в режиме on-line сравнительный анализ 11 полных нуклеотидных последовательностей ДНК, кодирующей синтез 16S рРНК микроорганизмов L. delbrueckii subsp. bulgaricus, представленных в международной базе данных GenBank, с целью выявления консервативных участков нуклеотидных последовательностей для закладки родоспецифичных и видоспецифичных праймеров.

Изучение консервативных полинуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК и конструирование праймеров для ПЦР проводили с исполь-

Рис. 1 - Общая схема проведения исследований

зованием компьютерной программы Oligo 6,31, а с помощью программы Oligonucleotide Properties Calculator определяли температуры отжига праймеров и % GC состава. Специфичность выбранных праймеров теоретически изучали при помощи компьютерной программы BLASTA online.

Выделение ДНК из молочнокислых бактерий. ДНК из высушенной культуры бактерий выделяли с помощью «Набора для выделения геномной ДНК из бактерий» компании ЗАО «Синтол» (Москва). Перед проведением процедуры выделения бактериальной ДНК, брали навеску лиофилизированной культуры 5-10 мкг.

Процедуру выделения ДНК проводили согласно методике, прилагаемой к коммерческим наборам реагентов, представленных ЗАО «Синтол» (Москва).

ДНК из молочнокислых бактерий, содержащихся в кисломолочных продуктах, выделяли с помощью «Комплекта реагентов для выделения ДНК на сорбенте» компании ЗАО «Синтол» (Москва). Перед проведением процедуры выделения бактериальной ДНК из кисломолочных продуктов в центрифужные пробирки объемом 1,5 мл. «Эппендорф» вносили 100 мкл кисломолочного продукта.

Четвертый этап посвящен конструированию универсальных праймеров для амплификации гена 16S рРНК микроорганизмов L. delbrueckii subsp. bulgaricus и оптимизации параметров амплификации. Оптимизированы последовательности праймеров с целью повышения температуры отжига и увеличения специфичности получаемого ПЦР-продукта. Сконструированные пары родоспецифичных и видоспецифичных праймеров были синтезированы и очищены в полиакриламидном геле в ЗАО «Синтол» (Москва), и использовали их для постановки реакции амплификации гена 16S рРНК штаммов микроорганизмов L. delbrueckii subsp. bulgaricus, бактериальных заквасок и бактериальных концентратов, штамме Bifidobacterium bifidum №1, лактобактерий, содержащихся в кисломолочных пробиотических продуктах.

При приготовлении реакционной смеси брали следующие объемы компонентов в расчете на одну пробирку (табл. 1).

Таблица 1

Компонентный состав ПЦР-реакционной смеси_

№ п/п Наименование Объем, мкл

1 2,5 х Реакционная смесь* 2,5

2 Смесь праймеров, 10 пкмоль/мкл каждого 1.0

3 Тая ДНК-полимераза, 5 Е/мкл 0,5

4 Деионизованная вода 13,0

5 Образец ДНК 5,0

'содержит 2,5 х ПЦР буфер Б (КС1, ТрисНС1 (рН 8,8), глицерол, Tween 20), дезоксинуклеозидтрифосфаты, MgCb.

В микроцентрифужную пробирку вместимостью 0,5 мкл вносили (из расчета на каждую анализируемую пробу): 10 мкл 2,5 х реакционной смеси, 1 мкл прямого и обратного праймеров (концентрация 10 пкмоль/мкл каждого), 0,5 мкл фермента термостабильной Тац-полимеразы (концентрация 5 Е/мкл). Смесь разбавляли деионизованной водой объемом 13 мкл и осторожно перемешивали на вортексе (3-5 сек). Реакционную смесь осаждали кратковременным центрифугированием (10 - 15 сек). Анализируемую ДНК вносили по 5 мкл в микроцентрифужные пробирки с реакционной смесью для ПЦР. При использовании амплификатора типа «Терцик-МС2» («ДНК-технология», Москва) без подогрева крышки в каждую микроцентрифужную пробирку с реакционной смесью вносили по 30 мкл минерального масла для предохранения реакционной смеси от испарения водной фазы при ПЦР. Все микроцентрифужные пробирки со смесями помещали в амплификатор типа «Терцик», проводили ПЦР по программе, указанной в табл. 2.

Извлекали пробирки из амплификатора и переносили в комнату для детекции продуктов ПЦР.

Таблица 2

Рекомендуемые условия проведения ПЦР_

Шаг Температура, °С Время инкубации Число циклов

программы

1 95 300 с 1

2 62 50 с 35-45 '

95 20 с

3 72 120 с 1

Детекцию продуктов амплификации проводили методом электрофоретического разделения продуктов ПЦР в 1,5 %-ном агарозном геле, окрашенным бромистым этидием, с последующей визуализацией в ультрафиолетовом цвете (260 нм) и регистрацией полученных результатов с помощью гель-документирующей видеосистемы «УкгапРЬоШ».

На пятом этапе проводили оценку видовой специфичности ПЦР в сравнении с классическими биохимическими методами. Исследовали специфичность параллельной идентификации микроорганизмов Ь. с1е1Ьгиески зиЬвр. Ъи^апсш с использованием биохимического метода и методики на основе ПЦР.

Заключительный этап связан с описанием ПЦР-тест-системы для идентификации микроорганизмов Ь. с1е1Ьгиескп зиЬэр. Ъи1%апсиз и расчетом затрат на проведение исследования в микробиологических лабораториях молочных предприятий.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Изучение биохимических и фенотипических свойств штаммов микроорганизмов L. delbrueckii subsp. bulgaricus

Первым этапом работы явилось исследование биохимических признаков пяти штаммов L. delbrueckii subsp. bulgaricus, предоставленных ФГУП ГосНИИгенетика (Москва). Данные штаммы идентифицировались ранее по культурально-морфологическим признакам. Идентификация бактерий по биохимическим признакам не проводилась.

Классическая микробиологическая схема идентификации этих видов основана на изучении метаболизма Сахаров и представляет собой «пестрый ряд», состоящий из 14 субстратов. В результате работы нами был изучен спектр утилизируемых субстратов: углеводов, в том числе олигосахарида раффинозы, метаболизм которого вновь выделенными штаммами не был изучен ранее, многоатомных спиртов (сорбит, манит) и глюкозидов (салицин, эскулин).

Штаммы бактерий L. delbrueckii subsp. bulgaricus неспособны сбраживать пентозы, т.к. ферментация происходит по гликолитическому пути. Все исследуемые штаммы L. delbrueckii subsp. bulgaricus хорошо ферментируют лактозу. Один штамм L. delbrueckii subsp. bulgaricus В-3141 ферментирует сахарозу, два штамма (В-3141, В-6516) ферментируют мальтозу, два штамма (В-6515, В-6516) - маннозу. Таким образом, по своим свойствам изучаемые штаммы неоднородны.

Анализ нуклеотидной последовательности ДНК, кодирующей синтез 16S рРНК микроорганизмов L. delbrueckii subsp. bulgaricus

С целью конструирования видоспецифичных праймеров проведен сравнительный анализ одиннадцати полных нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК микроорганизмов L. delbrueckii subsp. bulgaricus, накопленных в GenBank на настоящий момент времени. Для этого проведен поиск по базе данных полных нуклеотидных последовательностей, соответствующих генам 16S рРНК типовых представителей бактерий рода Lactobacillus: L. delbrueckii subsp. bulgaricus, депонированных в GenBank National Center for Biotechnology Information (NCBI) (табл. 3).

Таблица 3

Номера последовательностей гена 16S рРНК представителей рода

Lactobacillus, депонированных в GenBank

№ п/п Номер последовательности гена 16S рРНК bNCBI Название штамма

1 FJ861093.1 L. delbrueckii subsp. bulgaricus KLDS 1.0625

2 СР000412.1 L. delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC

Продолжение таблицы 3

ВАА-365

3 EU483107.1 L. delbrueckii subsp. bulgaricus LC

4 EU642554.1 L. delbrueckii subsp. bulgaricus L3

5 FJ915706.1 L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMAU40169

6 EU547306.1 L. delbrueckii subsp. bulgaricus BCS113

7 CP000033.3 L. acidophilus NCFM

8 FM878603.1 L. casei LB 133

9 GU386757.1 L. paracasei B41

10 АМ491821.1 L. rhamnosus R-32689

11 DQ480531.1 L. plantarum SKI.002

После тщательного анализа выровненных последовательностей генов 16S рРНК, имеющихся в современных банках данных, выбраны наиболее консервативные участки, подходящие для создания праймеров, т.е. консервативных в пределах рода Lactobacillus, но имеющих значительные отличия от микроорганизмов других видов. Для повышения специфичности нуклеотидные последовательности в регионах, соответствующих позициям праймеров, были детально проанализированы с целью выявления нуклеотидных замен.

Выбранные нами нуклеотидные последовательности использованы для сравнительного филогенетического анализа, результаты которого отражены на рис. 2.

99 91

86

91

FJ861093.1 СР00(Н12.1 EU483107.1 EU642554.1 FJ915706.1 EU547306.1 CP000033.3 FM878603.1 GU38S757.1 АМ491821.1 DQ480531.1

Рис. 2. Филогенетическое дерево, основанное на анализе структур фрагментов гена 16S рРНК, отражающее родственные связи исследуемых штаммов микроорганизмов рода Lactobacillus

Одиннадцать использованных последовательностей гена 16S рРНК разных видов лактобацилл распределились в два кластера: в первый кластер вошли типовые штаммы видов L. delbrueckii subsp. bulgaricus (FJ861093.1, EU483107.1, СР000412.1, EU642554.1, FJ915706.1); во второй кластер вошли штаммы - L. delbrueckii subsp. bulgaricus (EU547306.1), L. acidophilus (CP000033.3), L. casei (FM878603.1), L. plantarum (DQ480531.1), L. paracasei (GU386757.1), L. rhamnosus (AM491821.1). Данное филогенетическое дерево

(рис. 1) построено в компьютерной программе ClustalW (версия 2.1.). Согласно полученным данным при анализе полных нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, гомология строения гена разных представителей рода Lactobacillus, входящих в первый кластер составляет 97 - 99 %, во второй кластер - 84 - 99 %.

Таким образом, даже имея возможность определения нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК штамма со спорным внутривидовым названием внутри подвидов, с помощью филогенетического анализа можно точно установить, к какому подвиду относится штамм.

Информация, полученная при анализе филогенетического дерева, дополняет сведения о таксономическом положении штаммов по отношению к типовому представителю L delbrueckii subsp. bulgaricus.

Конструирование универсальных праймеров для амплификации гена 16S рРНК L. delbrueckii subsp. bulgaricus

По результатам сравнительного анализа ДНК микроорганизмов рода Lactobacillus оптимизировали последовательности праймеров с целью повышения температуры отжига и увеличения специфичности получаемого ПЦР-продукта. По результатам анализа в качестве общего праймера были синтезированы родоспецифичные праймеры длиной 22 п.н. (названные 16S for-16S rev): 16S for: 5'- AGA GTT TGA ТСС TGG CTC AGG А (22); 16S rev: 5'- ACG CTT GCC ACC TAC GTA TT А С (22) для амплификации гена 16S рРНК длиной 566 п.н. В качестве видоспецифичных праймеров для идентификации L. delbrueckii subsp. bulgaricus были выбраны видоспецифичные праймеры (16SbulF-16SbulR): 5'- CAA CAG ААТ CGC ATG ATT CAA GTT TG (26), 16SbulR: 5'- ACC GGA AAG ТСС CCA ACA CCT A (22) для амплификации гена 16S рРНК длиной 675 п.н.

Оценка специфичности сконструированных праймеров при помощи компьютерной программы BLASTA подтвердила гомологичность выбранных праймеров с нуклеотидными последовательностями гена 16S рРНК бактерий рода Lactobacillus, и отсутствие значимой гомологичности с нуклеотидными последовательностями других родов и видов бактерий.

На следующем этапе работы для подтверждения теоретических расчетов нами была проведена экспериментальная оценка специфичности сконструированных праймеров к ДНК чистых культур молочнокислых бактерий и содержащихся в кисломолочных продуктах.

Для анализа использовано десять образцов, пять из которых принадлежала к L. acidophilus, а другие пять - к L. delbrueckii subsp. bulgaricus (табл. 4).

Таблица 4

Штаммы микроорганизмов из ВКПМ (ГосНИИгенетика)_

№ п/п № в коллекции ВКПМ Название штамма Источник

1 В-6551 L. а. Т-3 Фесцес новорожденного ребенка

Продолжение таблицы 4

2 В-8153 L. а. АЕ-5 Получен из штамма L. А. АТ-44

3 В-194 L. a. Ik Выделен из курицы

4 В-8634 L. а. 3 Самоквасная простокваша

5 В-5863 L. a. 57S Самоквасное молоко

6 В-6516 L. d. b. 21 Выделен из молока

7 В-3964 L. d. b. Сырое молоко

8 В-3141 L. d. b. Л20/2 Мацони

9 В-6543 L. d. b. Б-259 Самоквасный молочный продукт

10 В-6515 L. d. b. 19 Выделен из молока

ДНК из высушенной культуры бактерий выделяли с помощью набора для выделения геномной ДНК из бактерий компании «Синтол» (Москса). ПЦР проводили в амплификаторе типа «Терцик-МС2» по программе амплификации: 95 °С - 200 сек - 1 цикл, [62 "С - 50 сек, 95 °С - 20 сек] - 25 циклов, 72 °С - 120 сек - 1 цикл. Наличие продукта проверяли электрофорезом в 1,5 %-ном агарозном геле (рис. 3).

На рис. 3 видно, что в дорожках геля наблюдаются фрагменты ДНК размера 566 п.н., соответствующие пробам ДНК бактерий рода Lactobacillus. Лабораторные испытания показали, что полимеразная цепная реакция с использованием родоспецифичных праймеров 16S for-16S rev, специфична в отношении представителей рода Lactobacillus.

12 3 4 5

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Рис. 3. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента ДНК гена 168 рРНК молочнокислых бактерий с использованием синтезированных родоспецифичных праймеров: А) гель 1:1- Маркер молекулярной массы ДНК (п.н.); 2-L.d Ь. Б-259; 3 -I. ¿. Ъ. 19; 4 - Отрицательный контроль Н20; 5 - Маркер молекулярной массы ДНК (п.н.); Б) гель 2: \ - L. а. Т-3; 2-Х. а. АЕ-5; 3 -Ь.а. 1к; 4 -Ь. а. 3; 5 -I. а. 57Б; 6 -Ь. ± В. 21; 7 - ¿. d. В.-8-1. й. В. Л20/2; 9 - Маркер молекулярной массы ДНК (п.н.)

Обоснованная специфичность данных пар родоспецифичных праймеров была подтверждена экспериментально на бактериальных

заквасках (БЗ) и бактериальных концентратах (БК), на штамме Bifidobacterium bifidum №1, пробиотических продуктах, содержащих лактобактерии и кисломолочных продуктах (рис. 4 - 5).

800 600

Рис. 4. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента ДНК гена 16S рРНК микроорганизмов L. delbrueckii subsp. bulgaricus с использованием пары родоспецифичных праймеров 16Sfor-16Srev: 1 -Концентрат Str. thermophilus вязкой консистенции; 2 - Бактериальная закваска (БЗ) для напитка «Южный»; 3 - БЗ для варенца; 4 - Бактериальный концентрат (БК) для йогурта; 5 - БЗ для йогурта; 6 - БЗ болгарская палочка; 7 - БЗ ацидофильная палочка; 8 - БЗ для ряженки; 9 -В. bifidum №1; 10 - Е. coli', М - маркер молекулярной массы ДНК (п.н.)

! ; j > £ ■ у

800 600

Рис. 5. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента ДНК генома представителей рода Lactobacillus, содержащихся в различных субстратах с использованием пары родоспецифичных праймеров 16Sfor-16Srev: 1 - Иммуно-комплекс классический «Бионапиток кисломолочный, обогащенный витаминами L. rhamnosus GG™; 2 - Молочный продукт, обогащенный L. casei imuntass и витаминами В6 и D3, сладкий «Актимель иммуновитамины»; 3 - Напиток кисломолочный с соком, обогащенный пробиотическими культурами, витаминами и минералами «3 Актив»; 4 -Варенец; 5 - Напиток кисломолочный ацидолакт; 6 - Йогурт; 7 -Положительный контроль; М - Маркер молекулярной массы ДНК (п.н.)

На рис. 4 видно, что фрагменты ДНК искомого размера (566 п.н.) наблюдаются лишь в тех дорожках агарозного геля, куда нанесены прсбы ДНК лактобактерий. В дорожках геля, соответствующих пробам ДНК бактерий Str. thermophilus и Bifidobacterium bifidum №1, не наблюдается положительных сигналов.

На рис. 5 видно, что в дорожках агарозного геля, куда нанесены пробы ДНК лактобактерий, содержащихся в кисломолочных пробиотических продуктах, наблюдаются положительные сигналы, что подтверждает родоспецифичность праймеров.

Для видовой идентификации бактерий рода L. delbrueckii subsp. bulgaricus сконструированы праймеры: 16SbulF: 5'- САА CAG ААТ CGC ATG АТТ САА GTT TG (26), 16SbulR: 5'- АСС GGA AAG ТСС ССА АСА ССТ А (22) для амплификации гена 16S рРНК длиной 675 п.н.

Обоснованная специфичность данных пар видоспецифичных праймеров была подтверждена экспериментально на бактериальных заквасках и концентратах, на штаммах бактерий L. delbrueckii subsp. bulgaricus, штамм Bifidobacterium bifidum №1, пробиотических продуктах, содержащих лактобактерии и кисломолочных продуктах (рис. 6 - 7).

4. 5 6 " S 9 10 М

Рис. 6. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента ДНК гена 16S рРНК микроорганизмов L. delbrueckii subsp. bulgaricus с использованием пары видоспецифичных праймеров 16SbulF-16SbulR: 1 -Концентрат Str. thermophilus вязкой консистенции; 2 - БЗ ацидофильная палочка вязкая; 3 - БЗ для варенца; 4 - БК для йогурта; 5 - БЗ для йогурта; 6 - БЗ болгарская палочка невязкая; 7 - БЗ для напитка «Южный»; 8 - БЗ для ряженки; 9 - В. bifidum №1; 10 - Е. coli-, М - маркер молекулярной массы ДНК (п.н.)

i : ? j 5 ь 7 .м

Рис. 7. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента ДНК генома представителей рода Lactobacillus, содержащихся в различных субстратах с использованием пары видоспецифичных праймеров 16SbulF-16SbulR: 1 - Напиток кисломолочный ацидолакт сладкий; 2 - Молочный продукт, обогащенный L. casei imuntass и витаминами В6 и D3, сладкий «Актимель иммуновитамины»; 3 - Напиток кисломолочный с соком, обогащенный пробиотическими культурами, витаминами и минералами «3 Актив»; 4 - Варенец; 5 - Йогурт; 6 - Иммуно-комплекс классический «Бионапиток кисломолочный, обогащенный витаминами и L. rhamnosus GG™»; 7 - Положительный контроль; М - Маркер молекулярной массы ДНК (п.н.)

На рис. 6 видно, что фрагменты ДНК искомого размера (675 п.н.) наблюдаются лишь в тех дорожках агарозного геля, куда нанесены прсбы ДНК лактобактерий. В дорожках геля, соответствующих пробам ДНК бактерий Str. thermophilus и Bifidobacterium bifidum №1, не наблюдается положительных сигналов.

На рис. 7 видно, что праймеры идентифицировали микроорганизмы вида L. delbrueckii subsp. bidgaricus, входящих в состав закваски.

Полученные данные позволяют утверждать, что сконструированная и исследованная нами система праймеров для выявления гена 16S рРНК, может быть использована в ПЦР для видовой идентификации L. delbrueckii subsp. bulgaricus. Более того, ее применение будет способствовать расширению возможностей исследователей при молекулярно-генетичестай характеристике микроорганизмов L. delbrueckii subsp. bulgaricus.

Сравнение видовой специфичности ПЦР с классическими биохимическими методами

Для постановки опыта были использованы пять штаммов микроорганизмов L. delbrueckii subsp. bulgaricus: ВКПМ В-3141, ВКПМ В-6545, ВКПМ В-3964, ВКПМ В-6515, ВКПМ В-6516. Исследования

биохимических, в частности, сахаролитических свойств этих штаммов были проведены нами впервые.

Результаты опыта по параллельной идентификации лактобактерий биохимическим методом и с помощью ПЦР-методики показаны в табл. 5.

Таблица 5

Результаты параллельной идентификации бактерий рода Lactobacillus с использованием биохимического метода и методики на основе ПЦР

№ п/п Штамм Идентификация биохимическим методом Идентификация ПЦР-методом

1 L. delbrueckii subsp. bulgaricus ВКПМ B-3141 L. bulgaricus L. bulgaricus

2 L. delbrueckii subsp. bulgaricus ВКПМ B-6545 L. bulgaricus L. bulgaricus

3 L. delbrueckii subsp. bulgaricus ВКПМ B-3964 L. bulgaricus/L. acidophilic L. bulgaricus

4 L. delbrueckii subsp. bulgaricus ВКПМ B-6515 L. bulgaricus L. bulgaricus

5 L. delbrueckii subsp. bulgaricus ВКПМ B-6516 L. bulgaricus L. bulgaricus

Из представленных данных следует, что при использовании классического биохимического метода при идентификации, лишь четыре штамма из пяти получили удовлетворительные ответы. Методика идентификации исследуемых штаммов на основе ПЦР позволяет с точностью отнести микроорганизм к определенному роду, виду и подвиду, что свидетельствует о специфичности и чувствительности реакции. В случаях, когда идентификация классическим методом не давала удовлетворительных результатов, использование ПЦР-методики позволило точно установить вид

исследуемой культуры.

Суммируя вышесказанное, можно заключить, что результаты идентификации видов Ь. с1е1Ъгиескп БиЬзр. Ьи^апсш и других лактобактерий, полученные с использованием полимеразной цепной реакции, сопоставимы с результатами классического биохимического метода идентификации на основе сахаролитической активности различных видов лактобацилл.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Изучены впервые биохимические свойства штаммов L. delbrueckii subsp. bulgaricus.

2. Проведен анализ нуклеотидных последовательностей ДНК, кодирующей синтез 16S рРНК бактерий рода Lactobacillus, представленных в GenBank, с целью выявления консервативных участков нуклеотидных последовательностей для закладки родоспецифичных и видоспецифичных праймеров и построения филогенетического дерева, устанавливающего генетическую связь бактерий.

Выявлено, что практически созданные праймеры обладают наибольшей степенью гомологии к участкам нуклеотидной последовательности ДНК 16S рРНК микроорганизмов L. delbrieckii subsp. bulgaricus и обладают высокой специфичностью.

3. Сконструированы и синтезированы новые праймеры для амплификации гена 16S рРНК бактерий и оптимизированы параметры проведения амплификации. Температурно-временной профиль программы амплификации составляет: 95°С - 200 сек - 1 цикл, [62°С - 50 сек, 95°С - 20 сек] - 25 циклов, 72°С -120 сек - 1 цикл.

4. Экспериментально подтверждена более высокая специфичность и чувствительность ПЦР-метода идентификации молочнокислых бактерий, входящих в состав кисломолочных продуктов. Исследования были проведены на широком спектре кисломолочных продуктов.

5. Проведена сравнительная оценка видовой специфичности ПЦР с классическими биохимическими методами. Результаты идентификации видов L. bulgaricus и других лактобактерий, полученные с использованием полимеразной цепной реакции, сопоставимы с результатами классического биохимического метода идентификации на основе сахаролитической активности различных видов лактобацилл.

6. Разработана тест-система для идентификации молочнокислых бактерий в кисломолочных продуктах, что позволит совершенствовать контроль за качеством и проведение экспертизы производимой кисломолочной продукции.

Работа выполнена в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 20092013 годы. Гос. контракт П-423.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНО В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ

В журналах, рекомендованных экспертным советом ВАК РФ:

1. Просеков, А.Ю. Использование тест-систем в молочной промышленности / А.Ю. Просеков, Е.В. Короткая, К.В. Беспоместных // Молочная промышленность. - 2009. - № 11. - С. 72 - 74.

2. Беспоместных, K.B. Конструирование родоспецифичных и видоспецифичных праймеров для индикации и идентификации штаммов бактерий рода Lactobacillus / K.B. Беспоместных, О.О. Бабич, А.Ю. Просеков, Е.В. Короткая // Техника и технология пищевых производств. -2010.-№ 1.-С. 64-68.

3. Беспоместных, К.В. Исследование биохимических и морфологических свойств штаммов бактерий рода Lactobacillus / K.B. Беспоместных, А.Г. Галстян, Е.В. Короткая // Техника и технология пищевых производств. - 2011. - № 2. - С. 60 - 64.

Статьи в других журналах и сборниках материалов конференций:

1. Просеков, А.Ю. Использование тест-систем в молочной промышленности / А.Ю. Просеков, Е.В. Короткая, К.В. Беспоместных /./ Материалы III ежегодных смотров-сессий аспирантов и молодых ученых по отраслям наук: в 2-х т. - Вологда: ВоГТУ, 2009. - Т. 1: Технические науки. -С. 153-159.

2. Короткая, Е.В. Генетическое разнообразие штаммов бактерий вида Lactobacillus bulgaricus / Е.В. Короткая, К.В. Беспоместных, О.О. Бабич // Актуальные вопросы развития современной науки, техники и технологии: материалы II Всероссийской научно-практической (заочной) конференции. -М.: Издательско-полиграфический комплекс НИИРРР. - 2010. - С. 67 - 70.

3. Беспоместных, К.В. Генотипирование штаммов бактерий рода Propionibacterium методом филогенетического анализа / К.В. Беспоместных, О.О. Бабич, А.Ю. Просеков, JI.A. Остроумов // Современные технологии продуктов питания: теория и практика производства: материалы международного научно-практического семинара Омского гоударственного аграрного университета (23 апреля). - Омск: Вариант-Омск, 2010. - С. 36 -39.

4. Беспоместных, К.В. Экспресс-метод идентификации бактерий рода Lactobacillus на основе полимеразной цепной реакции // Пищевые продукты и здоровье человека: материалы III Всероссийской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых. - Кемерово, 2010. - С. 9-11.

5. Беспоместных, К.В. Идентификация микроорганизмов в кисломолочных продуктах / К.В Беспоместных, Е.В. Короткая // VII Специализированный конгресс: Молочная промышленность Сибири. -Барнаул, 2010.-С. 23-25.

6. Беспоместных, К.В. Проблема производства кисломолочных продуктов с заданными показателями качества и безопасности // Проведение научных исследований под руководством приглашенных исследователей в 2010 году: материалы Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи (18-22 октября) / под общей ред. В.П. Юстратова. -Кемерово, 2010. - С. 45 - 47.

7. Беспоместных, К.В. Ферментационная активность штаммов и бактериальных заквасок болгарской палочки / К.В. Беспоместных, А.Г, Галстян, Е.В. Короткая // Качество продукции, технологий и образования:

материалы VI Всероссийской научно-практической конференции. -Магнитогорск: МГТУ им. Г.И. Носова, 2011. - С. 75 - 78.

8. Беспоместных, К.В. Изучение кислотообразующей активности молочнокислых бактерий // Пищевые продукты и здоровье человека: материалы IV Всероссийской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых. - Кемерово, 2011. - С. 3 - 4.

Отчеты по НИР:

1. Проведение научных исследований коллективами под руководством приглашенных исследователей в области биологии, сельскохозяйственных наук и технологии живых систем / Г.А. Аватисян, А.Ю. Просеков, О.О. Бабич, К.В. Беспоместных и др. // Научно-технический отчет №15.06-04.071 по государственному контракту №02.740.11.5133. -Кемерово, 2010. - 82 с.

2. Проведение научных исследований коллективами под руководством приглашенных исследователей в области биологии, сельскохозяйственных наук и технологии живых систем / Г.А. Аватисян, А.Ю. Просеков, О.О. Бабич, К.В. Беспоместных и др. // Научно-технический отчет №01.10-04.072 по государственному контракту №02.740.11.5133. - Кемерово, 2010. - 53 с.

3. Разработка биотехнологии получения специфических ферментов, продуцируемых микроорганизмами / А.Ю. Просеков, Л.А. Остроумов, О.О. Бабич, К.В. Беспоместных и др. // Научно-технический отчет по проекту №2.1.2/3566 аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 годы)» (3-й этап). -Кемерово, 2010.-67 с.

4. Разработка биотехнологии получения специфических ферментов, продуцируемых микроорганизмами / А.Ю. Просеков, Л.А. Остроумов, О.О. Бабич, К.В. Беспоместных и др. // Научно-технический отчет по проекту №2.1.2/3566 аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 годы)» (4-й этап). -Кемерово, 2010. - 68 с.

Подписано в печать 05.09.11 г. Формат 60x86/1 б. Тираж 70 экз. Объем 1.25 п.л. Закат № 112. Отпечатано в редакционно-издательском центре КемТИПП. 650010, г. Кемерово, ул, Красноармейская, 52

ВВЕДЕНИЕ.

1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР.

1.1. Общие принципы и схемы классификации молочнокислых бактерий.

1.2. Фенотипические и физиолого-биохимические характеристики бактерий рода Lactobacillus.

1.2.1. Таксономические характеристики бактерий рода Lactobacillus.

1.2.2. Морфологические свойства бактерий рода Lactobacillus bulgari-cus.

1.2.3. Культуральные свойства лактобактерий.

1.2.4. Биохимические свойства лактобактерий.

1.3. Особенности молекулярно-генетической структуры микроорганизмов рода Lactobacillus.

1.4. Молекулярно-генетические методы в идентификации молочнокислых бактерий.

В связи с интенсивным развитием молочной промышленности в настоящее время существует проблема производства кисломолочных продуктов с заданными стабильными показателями качества. Для контроля за их качеством до сих пор нет четко выработанной схемы, по которой бы определялась не только технологическая пригодность, но и безопасность использования чистых культур бактерий и бактериальных заквасок, используемых в производстве кисломолочных продуктов.

Идентификация микроорганизмов, входящих в состав заквасочных культур, которая проводится в микробиологических лабораториях, основывается почти исключительно на классических или традиционных тестах по морфологическим, культуральным, физиологическим и биохимическим признакам. Этого бывает достаточно для выдачи предварительного ответа о виде обнаруженного микроорганизма. Перспективно также использование серологического метода, позволяющего с довольно высокой достоверностью определить видовую принадлежность молочнокислых бактерий. Обычно этот метод применяют как дополнительный.

Следует отметить, что как набор признаков, так и способы изучения их варьируют в различных лабораториях, что значительно осложняет работу по диагностике видов этих микроорганизмов, существенным условием совершенствования которой является стандартизация методов исследования свойств бактерий.

Для успешного культивирования того или иного микроорганизма питательные среды по своим свойствам должны быть приближены к естественным условиям его обитания.

Используемые для изучения признаков бактерий основные среды должны быть адекватны в отношении необходимых источников питания. Часто в работах по диагностике видов молочнокислых бактерий имеются разногласия, которые обусловливаются тем, что отдельные исследователи применяют среды, неполноценные по своему составу.

Для преодоления описанных проблем, связанных с контролем за качеством и экспертизой молочных продуктов, целесообразно использование тест-системы, основанной на полимеразной цепной реакции (ПЦР), для точной идентификации микроорганизмов, входящих в состав бактериальных заквасок, бактериальных концентратов и чистых культур, используемых в производстве кисломолочной продукции.

Актуальной проблемой в настоящее время является индикация и идентификация пробиотических микроорганизмов. Бактерии Lactobacillus del-brueckii subsp. bulgaricus являются основным компонентом препаратов-пробиотиков, БАДов к пище и молочных продуктов функционального питания. Употребление молочных продуктов, содержащих эти микроорганизмы, способствует нормализации кишечной микрофлоры, укреплению иммунитета организма.

Разработка метода идентификации с применением полимеразной цепной реакции основывается на выборе специфического гена микроорганизма. Самым распространенным геном молочнокислых бактерий рода Lactobacillus является ген 16S рРНК. Ген 16S рРНК несет как консервативные, так и вариабельные участки нуклеотидной последовательности, что позволяет использовать его как для определения рода, так и видовой идентификации микроорганизмов.

В работах отечественных исследователей (А.Г. Точилина, С.Г. Ботина), посвященных использованию ДНК-методов для видовой идентификации молочнокислых бактерий, были показаны важные достоинства ПЦР - универсальность, высокая чувствительность и специфичность, способность к дифференцированию близкородственных бактерий.

Однако, сведений о внедрении и адаптации разработанных ПЦР-тест-систем к промышленных условиям производства молочных продуктов, позволяющих совершенствовать систему контроля качества бактериальных заквасок и проводить экспертизу кисломолочных продуктов на более высококачественном уровне, что обеспечит выпуск здоровой и полезной продукции для потребителей, в доступной литературе мы не обнаружили. В связи с этим внедрение надежных ПЦР-тестов на предприятия молочной промышленности для проведения контроля за качеством и экспертизой кисломолочных продуктов остается актуальной задачей и представляет самостоятельный научный и практический интерес.

Возможность использования молекулярно-генетических, иммунологических, биохимических и микробиологических методов в молочной промышленности обеспечит выбор оптимальных решений для идентификации молочнокислых бактерий и повышения эффективности исследований.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Впервые изучены биохимические свойства штаммов L. delbrueckii subsp. bulgaricus. Отмечено, что штаммы пригодны для составления симбио-тической бактериальной закваски. Проведено определение молочнокислых микроорганизмов в кисломолочных продуктах по изучению культурально-морфологических признаков.

2. Проведен анализ нуклеотидных последовательностей ДНК, кодирующей синтез 16S рРНК бактерий рода Lactobacillus, представленных в GenBank, с целью выявления консервативных участков нуклеотидных последовательностей для закладки родоспецифичных и видоспецифичных прайме-ров и построения филогенетического дерева, устанавливающего генетическую связь бактерий.

Выявлено, что практически созданные праймеры обладают наибольшей степенью гомологии к участкам нуклеотидной последовательности ДНК 16S рРНК микроорганизмов L. delbrieckii subsp. bulgaricus и обладают высокой специфичностью.

3. Сконструированы и синтезированы новые праймеры для амплификации гена 16S рРНК бактерий и оптимизированы параметры проведения амплификации. Температурно-временной профиль программы амплификации составляет: 95°С - 200 сек - 1 цикл, [62°С - 50 сек, 95°С - 20 сек] - 25 циклов, 72°С - 120 сек - 1 цикл.

4. Экспериментально подтверждена более высокая специфичность и чувствительность ПЦР-метода идентификации молочнокислых бактерий, входящих в состав кисломолочных продуктов. Исследования были проведены на широком спектре продуктов.

5. Проведена сравнительная оценка видовой специфичности ПЦР с классическими биохимическими методами. Результаты идентификации видов L. bulgaricus и других лактобактерий, полученные с использованием по-лимеразной цепной реакции, сопоставимы с результатами классического биохимического метода идентификации на основе сахаролитической активности различных видов лактобацилл.

6. Разработана тест-система для идентификации молочнокислых бактерий в кисломолочных продуктах, что позволит совершенствовать контроль за качеством и проведение экспертизы производимой кисломолочной продукции.

Работа выполнена в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы. Гос. контракт П-423.

1. Ананьева, H.B. Изучение процесса культивирования молочнокислых палочек на питательных средах различного состава / Н. В. Ананьева и др. // Переработка молока. 2007. - №2. С. 20 - 21.

2. Банникова, Л. А. Микробиологические основы молочного производства / Л. А. Банникова, Н. С. Королева, В. Ф. Семенихина; под ред. канд. техн. наук Я.И. Костина. М.: Агропромиздат. - 1987. - 400с.

3. Банникова, Л. А. Селекция молочнокислых бактерий и их применение в молочной промышленности / Л. А. Банникова. М.: Пищевая промышленность, 1975.-256с.

4. Белоусова, H.H. Новые исследования в производстве чистых культур молочнокислых бактерий: обзорная информация / H.H. Белоусова. -М.: ЦНИИТЭИмясомолпром СССР, 1975. 52с. - (Цельномолочная промышленность).

5. Богданов, В.И. Микробиология молока и молочных продуктов: учебник / В.М. Богданов. 5-е изд. - М.: Пищевая промышленность, 1969. -366с.

6. Бондаренко, В.М. Прикладные аспекты молекулярной биологии бифидобактерий и лактобацилл // Журнал микробиологии. 2006. - №2. - С. 89-97.

7. Бондаренко, В.М. Дисбактериозы желудочно-кишечного тракта / В.М. Бондаренко, Б.В. Боев, Е.А. Лыкова и др. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. 1998. - №1. - С. 66 -70.

8. Бондаренко, В.М. Клонирование и экспрессия генов в молочнокислых бактериях / В.М. Бондаренко, В.А. Белявская // Журнал микробиологии. 2004. - № 2. - С. 67-73.

9. Бондаренко, В.М. Обоснование и тактика назначения в медицинской практике различных форм пробиотических препаратов / В.М.

10. Бондаренко, А.А. Воробьев, M.J1. Гершанович и др. // Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы: сборник материалов Международной конференции 2-4 июня. Москва, 2004. - С. 5 -6.

11. Борисова, Г.В. Закваски для кисломолочных продуктов: классификация, характеристики, качество / Г.В. Борисова, Е.В. Ожиганова, Т.П. Бурыкина // Молочная промышленность. 2008. - №6. - С. 73 - 74.

12. Бору нова, С.Б. Подбор компонентного состава питательной среды для получения бактериального концентрата болгарской палочки / С.Б. Борунова, Н.Н. Фурик, Н.В. Дудко // Пищевая промышленность: Наука и технология. 2009. - №1(3). - С. 9 - 14.

13. Ботина, С.Г. Классификация отечественных пробиотических культур рода Lactobacillus / С.Г. Ботина и др. // Журнал микробиологии. -2010.-№5.-С. 3-7.

14. Ботина, С.Г. Генетическое многообразие штаммов молочнокислых термофильных бактерий на территории стран СНГ / С.Г. Ботина и др. // Биотехнология. 2004. - №2. - С. 3 - 12.

15. Ботина, С.Г. Видовая идентификация и паспортизация молочнокислых бактерий методами молекулярно-генетического типирования // Молочная промышленность. 2008. - № 3. - С. 52 - 54.

16. Ботина, С.Г. Генетическое разнообразие природных штаммов бактерий вида Streptococcus thermophilus / С.Г. Ботина, О.В. Пиксасова, Ю.Д. Цыганков // Генетика. 2007. - Т. 43. - № 5. - С. 601 - 608.

17. Ботина, С.Г. Идентификация промышленных штаммов молочнокислых бактерий методами молекулярно-генетического типирования / С.Г. Ботина, Ю.Д. Цыганков, В.В. Суходолец // Генетика. 2006. - Т. 42.12.-С. 1621 1635.

18. Ботина, С.Г. Сравнительный анализ размеров геномов штаммов Streptococcus thermophilus / С.Г. Ботина, О.В. Пиксасова, Ю.Д. Цыганков // Генетика. 2007. - Т. 43. - С. 891 - 897.

19. Ботина, С.Г. Идентификация подвидов Lactococcus lactis / С.Г. Ботина, В.Ф. Семенихина, И.В. Рожкова // Молочная промышленность. -2009,-№6.-С. 68-69.

20. Ботина, С.Г. Филогенетический анализ типовых штаммов бактерий группы Salivarius рода Streptococcus на основании данных о строении генов 16S рРНК / С.Г. Ботина, Ю.Д. Цыганков, В.В. Суходолец // Микробиология. 2007. - Т. 76. - №3. - С. 429 - 432.

21. Буркин, A.B. Пробиотики в лечении и профилактике ротавирусной инфекции // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2005. - №4. - С. 48-51.

22. Ганина, В.И. Интегрированный подход к созданию отечественных стартовых культур прямого внесения / В.И. Ганина и др. // Молочная промышленность. 2005. - №11. - С. 23 - 24.

23. Ганина, В.И. Изучение стабильности свойств молочнокислых бактерий // Молочная промышленность. 2006. - №10. - С. 39 - 40.

24. Генетика: учебник для вузов / под ред. академика РАМН В.И. Иванова. М.: Академкнига. - 2006. - 638с.

25. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак; перевод с англ. М.: Мир. - 2002. - 589с.

26. Глушанова, H.A. Биологические свойства лактобацилл // Бюллетень сибирской медицины. 2003. - №4. - С. 50 - 58.

27. Горбатова, K.K. Биохимия молока и молочных продуктов. СПб: ГИОРД, 2003.-320с.

28. Горбатова, К.К. Химия и физика молока. СПб: ГИОРД, 2004.288с.

29. Горелов, A.B. Пробиотики: механизмы действия и эффективность при инфекциях желудочно-кишечного тракта / A.B. Горелов, Д.В. Усенко // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2006. - №4. - С. 53 - 56.

30. Гостищева, Н.М. Использование сухих питательных сред микробиологического контроля в молочной промышленности: обзорная информация / Н.М. Гостищева. М.: ЦНИИТЭИмясомолпром, 1983. - 47с. -(Цельномолочная промышленность).

31. ГОСТ Р 51331-99. Продукты молочные. Йогурты. Общие технические условия. М.: Стандартинформ, 2008. 22с.

32. ГОСТ 26781-85. Молоко. Метод измерения pH. М.: Стандартинформ, 2001. 30с.

33. ГОСТ 26809-86. Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовки проб к анализу. М.: Стандартинформ, 2001.-30с.

34. ГОСТ 3624-92. Молоко и молочные продукты. Титриметрические методы определения кислотности. М.: Стандартинформ, 2001. 30с.

35. ГОСТ 9225-84. Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа. М.: Стандартинформ, 1985. -25с.

36. ГОСТ 10444.11-89. Продукты пищевые. Методы определения молочнокислых микроорганизмов. М.: Стандартинформ, 1990. 18с.

37. Гриневич, А.Г. Молочнокислые бактерии. Селекция промышленных штаммов / А.Г. Гриневич. 2-е изд.; перераб. и доп. -Минск: высш. шк. - 1981. - 164с.

38. Ефимочкина, Н.Р. Молекулярно-генетические методы в идентификации пищевых патогенных бактерий // Вопросы питания. 2007. -Т. 76.-№2.-С. 4-15.

39. Ефимочкина, Н.Р. Совершенствование методических подходов к конструированию и оценке качества сухих питательных сред / Н. Р. Ефимочкина и др. // Молочная промышленность. 2006. - №3. - С. 36 - 38.

40. Ивашкина, Н.Ю. Оригинальный отечественный пробиотик аципол: молекулярно-биологические и метаболические характеристики / Н.Ю. Ивашкина, С.Г. Ботина // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. 2009. - Т. 19. - №2. - С. 58 - 64.

41. Квасников, Е.И. Молочнокислые бактерии и пути их использования / Е.И. Квасников, O.A. Нестеренко. М.: Наука. - 1975. -389с.

42. Коваленко, Н.К. Использование ПЦР для идентификации представителей родов Lactobacillus и Streptococcus / H.K. Коваленко, JI.H. Бурьяновский, B.C. Подгорский // Микробиологический журнал. 2000. -№62 (6). - С. 7 - 14.

43. Королев, С. А. Основы технической микробиологии молочногодела / С. А. Королев. 3-е изд. М.: Пищевая промышленность, 1974. - 343с.

44. Королева, Н.С. Техническая микробиология кисломолочных продуктов. М.: Пищевая промышленность, 1975. - 271с.

45. Королева, Н.С. Симбиотические закваски термофильных бактерий в производстве кисломолочных продуктов / Н.С. Королева, М.С. Кондратенко. М.: Пищевая промышленность, 1978. - 168с.

46. Красникова, J1.B. Непрерывное культивирование молочнокислых бактерий с целью накопления биомассы и продуктов метаболизма: обзорная информация / JI.B. Красникова, И.Е. Кострова. М.: ЦНИИТЭИмясомолпром, 1979. - 25с. - (Цельномолочная промышленность).

47. Красникова, J1.B. Метаболизм молочнокислых бактерий / JI.B. Красникова, И.Е. Кострова, В.И. Шаробайко // Обзорная информация. Серия «Цельномолочная промышленность». М.: ЦНИИТЭИмясомолпром, 1980. -40с.

48. Красникова, JI.B. Роль микрофлоры закваски в повышении качества молочных продуктов: обзорная информация / JI.B. Красникова, И.Е. Кострова.- М.: АгроНИИТЭИММП, 1989. 37с. - (Молочная промышленность).

49. Лащевский, В.В. Дизайн праймеров для ДНК лактобактерий / В.В. Лащевский, Н.К. Коваленко // Микробиологический журнал. 2003. -№65 (3). - С.46 - 53.

50. Леванова, Г.Ф. Размер генома, нуклеотидный состав и гомология ДНК некоторых лактобактерий / Г.Ф. Леванова, И.Н. Мурыгина, Е.И. Квасников // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1986. - №7. - С. 26-29.

51. Леек, А. Введение в биоинформатику / А. Леек; пер. с англ. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. - 318с.

52. Лихачева, А.Ю. Классификация и методы идентификации бифидобактерий и лактобацилл / А.Ю. Лихачева, Г.Ф. Леванова // Журнал микробиологии. 1997. - №5. - С. 114-117.

53. Лобунова, Н.В. Влияние протосимбиотических смесей чистых культур молочнокислых бактерий на формирование молочных сгустков при производстве йогуртов // Вестник Дальневосточной государственной академии экономики и управления. 2004. - №1. - С. 78 - 83.

54. Лопухов, Л.В. Полимеразная цепная реакция в клинической микробиологической диагностике / Л.В. Лопухов, М.В. Эйделыитейн // КМАХ. 2000. - Т. 2. - №3. - С. 96 - 106.

55. Микробиология продовольственных товаров. Санитария и гигиена: учебник для студ. высш. учеб. заведений / Г. Г. Жарикова. М.: Академия, 2005. - 304с.

56. Минаев, М. Ю. Методы ПЦР для определения сырьевых компонентов в готовой продукции / М. Ю. Минаев, Б. А. Лисицын, Т. А. Фомина // Мясная индустрия. 2008. - №6. - С. 36 - 37.

57. Молекулярная эволюция и филогенетический анализ / В.В. Лукашов. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. - 256с.

58. Пищевые продукты и пищевые добавки. Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка пищевой продукции, полученной с использованием генетически модифицированных микроорганизмов: методические указания: МУ 2.3.2.1830-04.

59. Производство и применение бактериальных заквасок и препаратов в сыроделии: обзорная информация / Г.Д. Перфильев и др. М.: АгроНИИТЭИММП, 1985. - 44с. - (Молочная промышленность).

60. Раскошная, Т. А. Питательные среды для культивирования ацидофильной молочнокислой палочки / Т.А. Раскошная, В.Ф. Семенихина // Молочная промышленность. 2010. - №11. - С. 39.

61. Ребриков, Д.В. ПЦР «в реальном времени» / Ребриков, Д.В. Саматов, Г.А., Трофимов, Д.Ю. и др.; под ред. д-ра биол. наук. Д.В. Ребрикова; предисл. Л.А. Остермана и акад. РАН и РАСХН Е.Д. Свердлова. -М.: БИНОМ. Лаборатория знаний. 2009. - 215с.

62. Рябцева, С.А. Сохранение жизнеспособности заквасочной микрофлоры / С.А. Рябцева и др. // Молочная промышленность. 2010. - №1. -С. 22-23.

63. Садуахасова, С.А. Характеристика антагонистических и кислотообразующих свойств Lactobacillus casei / С.А. Садуахасова, А.Р.

64. Кушугулова, С.Е. Рахимова и др. // Журнал микробиологии. 2007. - №1. -С. 84-87.

65. Самарцев, А.А. Протеолитические ферменты пробиотических микроорганизмов // Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты: сборник научных трудов. 2007. - Т. 1. - С. 65 - 77.

66. Соловьева, Е. Новые заквасочные культуры для кисломолочных продуктов и сыров // Молочная промышленность. 2005. - №9. - С. 14-15.

67. Соловьева, И.В. Изучение биологических свойств новых штаммов рода Lactobacillus / И.В. Соловьева, А.Г. Точилина, Н.А. Новикова // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. 2010. -№2 (2). - С. 462 - 468.

68. Степаненко, И.Ю. Инновационные решения в области микробиологического контроля на предприятиях молочной промышленности // Переработка молока. 2007. - №3. - С. 14-15.

69. Степаненко, И.Ю. Совершенствование методов микробиологического контроля при производстве молочных продуктов // Переработка молока. 2006. - №5. - С. 38 - 39.

70. Степаненко, П.П. Микробиология молока и молочных продуктов: учебник для студентов вузов. Сергиев Посад: Все для Вас - Подмосковье. -1999.-412с.

71. Сыроделие: технологические, биологические и физико-химические аспекты / под редакцией С.А. Гудкова. 2-е изд., испр. и доп. -М.: ДеЛи принт. - 2004. - 804с.

72. Тамим, А.Й. Йогурт и другие кисломолочные продукты / А.Й. Тамим, Р.К. Робинсон; перевод с англ. под научн. ред. д-ра техн. наук, проф.

73. JI.А. Забодаловой. СПб.: Профессия. - 2003. - 661с.

74. Токаев, Э.С. Повышение качества продуктов с пробиотическими культурами // Молочная промышленность. 2007. - №9. - С. 65 - 66.

75. Точилина, А.Г. Биохимическая и молекулярно-генетическая идентификация бактерий рода Lactobacillus: автореф. дис. канд. биол. наук: 03.00.04, 03.00.07: защищена 19.12.2009 / Точилина Анна Георгиевна. -Нижний Новгород, 2009. 25с.

76. Турова, Т.П. Мультикопийность рибосомных оперонов прокариот и ее влияние на проведение филогенетического анализа // Микробиология. 2003. - Т. 72. - №4. - С. 437 - 452.

77. Турова, Т.П. Применение данных ДНК-ДНК-гибридизации и анализа генов 16S рРНК для решения таксономических проблем на примере порядка Haloanaerobiales // Микробиология. 2000. - Т. 69. - № 6. - С. 741 -752.

78. Ускова, М. А. Антиоксидантные эффекты молочнокислых бактерий пробиотиков и йогуртных заквасок / М. А. Ускова, Л. В. Кравченко // Вопросы питания. - 2009. - №2. - С. 18-23.

79. Хамагаева, И.С. Комбинированная закваска для кисломолочных продуктов / И.С. Хамагаева, Н.В. Митыпова // Молочная промышленность. -2006.-№9. -С. 35 -36.

80. Хоулт, Дж. (ред.) Краткий определитель бактерий Берги. М.: Мир. - 1980.-495с.

81. Шлегель, Г. Общая микробиология / Г. Шлегель. М.: Мир. -1987.-567с.

82. Шуляк, Т. JI. Влияние физико-химических показателей молочной сыворотки на кислотообразующую активность молочнокислых бактерий // Известия вузов. Пищевая технология. 2006. - №4. - С. 32 - 33.

83. Amann, R. Modern methods in subsurface microbiology: in situ identification of microorganisms with nucleic acid probes / R. Amann et al. // FEMS Microbiol. Rev. 1997. - V. 20. - P. 191 - 200.

84. Amann, R. Ribosomal RNA-targeted nucleic acid probes for studies in microbial ecology / R. Amann, W. Ludwig // FEMS Microbiol. Rev. 2000. - V. 24.-P. 555 -565.

85. Amann, R. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation / R. Amann et al. // Microbiol. Rev. -1995.-V. 59.-P. 143- 169.

86. Andrighetto, C. Molecular identification and cluster analysis of homofermentative thermophilic lactobacilli isolated from dairy products / C. Andrighetto, P. De Dea, A. Lombardi et al. // Res. Microbiol. 1998. - V. 149. -№9.-P. 631 -643.

87. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology / Eds Krieg N.R., Holt J.G. // Baltimore: Williams and Wilkins. 1984. - P. 8 - 11.

88. Bizzarro, R. Phenotypic and genotypic characterization of lactic acid bacteria isolated from Pecorino Toscano cheese / R. Bizzarro, G. Torri Tarelli, G. Giraffa, E. Neviani // Ital. J. Food Sci. 2000. - V. 12. - P. 303 - 316.

89. Bolotin, A. Complete genome sequence and comparative genome analysis of the dairy bacterium Streptococcus thermophilus / A. Bolotin, B. Quainquis, P. Renault et al. // Nature Biotechnology. 2004. - Vol. 22, №12. - P. 1554- 1558.

90. Boutrou, R. Identification and characterization of Streptococcus thermophilus strains by pulsed-field gel electrophoresis / R. Boutrou, D. Thuault, C.M. Bourgeois // J. Appl. Bacteriol. 1995. - V. 79. - P. 454 - 458.

91. Colwell, R.R. Polyphasic taxonomy of the genus Vibrio: numerical taxonomy of Vibrio cholera, Vibrio parahaemolyticus, and related Vibrio species.

92. J. Bacterid. 1970. - V. 104. - P. 410 - 433.

93. Dellaglio, F. Lactobacillus delbrueckii subsp. Indicus subsp. Nov, isolated from Indian dairy products / F. Dellaglio, G.E. Felis, A. Castioni et al. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. - V. 55. - P. 401 - 404.

94. De Ley, J. Modern molecular methods in bacterial taxonomy: evolution, application, prospects // In: Proc. 4th Int. Conf. Plant Pathogenic bacteria. 1978. - V. 1. - Gilbert-Clarey, Tours, France.

95. De Vries, M.C. Lactobacillus plantarum survival, functional and potential probiotic properties in the human intestinal tract / M.C. De Vries, E.E. Vaughan, M. Kleerebezem et al // Int. Dairy J. - 2006. - Vol. 16, Is.9. - P. 1018 -1028.

96. Dubernet, S. PCR-based method for identification of lactobacilli at the genus level / S. Dubernet, N. Desmasures, M. Gueguen // FEMS Micribiol Lett. -2002. Vol. 10, 214(2). - P. 271 - 275.

97. Fitz-Gibbon, S.T. Whole genome-based phylogenetic analysis of free-living microorganisms / S.T. Fitz-Gibbon, C.H. House // Nucl. Acid. Res. 1999. -V. 27.-P. 4218-4222.

98. Gerald W. Tannock. Identification of Lactobacilli and Bifidobacteria // Current Issues Molec. Biol. 1999. - V. 1(1). - P. 53 - 64.

99. Germond, J.-E. Evolution of the Bacterial Species Lactobacillus delbrueckii: A Partial Genomic Study with Reflections on Procaryotic Species Concept / Jacques-Edouard Germond et al. // Mol. Biol. Evol. 2003. - V. 20(1). -P. 93- 104.

100. Goodfellow, M. Introduction to chemosystematics / M. Goodfellow, D.E. Minnikin // Chemical Methods in Bacterial Systematics. London: Acad. Press. - 1985.-P. 1 - 16.

101. Goodfellow, M. Handbook of New Bacterial Systematics / M. Goodfellow, A.G. O'Donnell // L.: Acad Press Ltd. 1993. - P. 3 - 54.

102. Grimont, P.A.D. Use of DNA reassociation in bacterial classification / P.A.D. Grimont // Can. J. Micribiol. 1988. - V. 34. - P. 541 - 546.

103. Grimont, P.A.D. Reproducibility and correlation study of three deoxyribonucleic acid hybridization procedures / P.A.D. Grimont, M. Y. Popoff, F. Grimont, C. Coynault, M. Leminin // Curr. Microbiol. 1980. - V. 4. - P. 325 -330.

104. Gutell, R.R. Lesson from evolving rRNA: 16S and 13S rRNA structures from a coparative perspective / R.R. Gutell, N. Larsen, C.R. Woese // Microbiol. Rev. 1994. - V. 58. - P. 10 - 26.

105. Hammes, W.P. The genus of Lactobacillus and Carnobacterium / W.P. Hammes, C. Hertel, A. Balows et al. // The Procaryotes. Vol. 4, Edition 2. -1992. - Springer-Verlag, New-York.

106. Holzapfel, W.H. Taxonomy and important features of probiotic microorganisms in food and nutrition / W.H. Holzapfel, P. Haberer, R. Geisen et al. // Am J. Clin Nutr. 2001. - Vol. 73. - P. 365 - 373.

107. Johnson, J.L. Bergey's manual of systematic bacteriology / Eds. Krieg N.R., Holt J.G. Baltimore: Williams and Wilkins, 1984. - P. 8 - 11.

108. Klaenhammer, T. Discovering lactic acid bacteria by genomics / T. Klaenhammer, E. Altermann, F. Arigoni et al. // Antonie Van Leeuwenhoek. 2002. -V. 82.-P. 29-58.

109. Klein, G. Taxonomy and physiology of probiotic lactic acid bacteria / G. Klein, A. Pack, C. Bonaparte, G. Reuter // Int. J. Food Microbiol. 1988. - V. 41.-P. 103- 125.

110. Kumar, S. MEGA: molecular evolutionary genetic analysis, version10. / S. Kumar, K. Tamura // The Pennsylvania State University, University Park, PA. 1993.

111. Kumar, S. MEGA: A biologist-centric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences / S. Kumar, K. Tamura // Briefings in bioinformatics. 2008. - Vol. 9. No. 4. - P. 299 - 306.

112. Kumar, S. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment / S. Kumar et al. // Briefings in bioinformatics. 2004. - Vol. 5. No. 2. - P. 150 - 163.

113. Lloyd, A.T. Evalution of the recA gene and the molecular phylogeny of bacteria / A.T. Lloyd, P.M. Sharp // J. Evol. 1993. - V. 37. - P. 399 - 407.

114. Ludwig, W. Phylogeny of bacteria beyond the 16S rRNA standard / W. Ludwig, K.-H. Schleifer // ASM News. 1999. - V. 65. - P. 752 - 757.

115. Lupski, J.R. Short, interspersed repetitive DNA sequences in prokaryotic genome / J.R. Lupski, S. Weinstock // J. Bacteriol. 1992. - V. 174. -P. 4525-4529.

116. Maidak, B.L. The RDP (Ribosomal Database Project) continues / B.L. Maidak, J.R. Cole, T.G. Lilburn // Nucl. Acids Res. 2000. - V. 28. - P. 173 -174.

117. Muller, M.R.A. Multiplex PCR for the detection of Lactobacillus ponis and two related species in a sourdough fermentation / M.R.A. Muller, M.A. Ehrmann, R.F. Vogel // Appl Environ Microbiol. 2000. - Vol. 66, №5. - P. 2113 -2116.

118. Mündt, J.O. Lactic acid streptococci. Bergey's manual of systematic bacteriology, vol.2: The Williams & Wilkins o., Baltimore, Md. 1986.

119. Olsen, G.J. The ribosomal RNA database project / G.J. Olsen, G. Larsen, C.R. Woese // Nucleic Acid Res. 1991. - V. 19. - P. 2017 - 2021.

120. Orla-Jensen. J. Hauptlinien des naturlichen Bacterien-sustems // Zbl. Bact. Paras. Infect. Hyg. 1960. - Bd. 22. - S. 305 - 346.

121. Requena, T. Identification, detection and enumeration of human Bifidobacterium species by PCR targeting the transaldolase gen / T. Requena, J. Butron, T. Matsuki et al. // Appl Enveron Microbiol. 2002. - Vol. 68, №5. - P. 2420-2427.

122. Roussel, Y. Strain characterization, genome size and plasmid content in the Lactobacillus acidophilus group (Hansen and Mocquot) / Y. Roussel, C. Colmin, J.M Simonet, B. Decaris // J. Appl. Bacteriol. 1993. - V. 74. - №5. - P. 549-556.

123. Roy, D. Molecular differentiation of Bifidobacterium spesies with amplified ribosomal DNA restriction analysis and alignment of shott regions of the ldh gene / D. Roy, S. Sirois // FEMS Microbiol Lett. 2000. - Vol. 191. - P. 17 -24.

124. Snel, B. Genome phytogeny based on gene content / B. Snel, P. Bork, M.A. Huynen // Nat. Genet. 1999. - V. 21. - P. 108 - 110.

125. Stacketbrandt, E. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present definition in bacteriology / E. Stacketbrandt, B.M. Goebel // Int. J. Syst. Bacterid. 1994. - V. 44.-P. 846-849.

126. Stackerbrandt, E. Molecular taxonomy and phylogenetic position of lactic acid bacteria / E. Stackerbrandt, M. Tauber // Biochimie. 1988. - Vol.70. -P. 317-324.

127. Stiles, M.E. Lactic acid bacteria of foods and their current taxonomy / M.E. Stiles, W.H. Holzapfel // Int. J. Food Microbiol. 1997. - Vol.36 (1). - P. 1

128. Tamura, K. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) Software Version 4.0 / R. Tamura et al. // Mol. Biol. Evol. 2007. - Vol. 24(8).-P. 1596- 1599.

129. Vandamme, P. Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics / P. Vandamme, B. Pot, M. Gilis, P. Vos De, J. Swings // Microbiol. Rev. 1996. - V. 60. - P. 407 - 438.

130. Ward, L.J. Differentiation of Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei and Lactobacillus rhamnosus by polymerase chain reaction / L.J. Ward, M.J. Timmins // Lett Appl Microbiol. 1999. - Vol. 29. - P. 90 - 92.

131. Ward, L.J. Two methods for the genetic differentiation of Lactococcus lactis ssp. lactis and cremoris based on differences in the 16S rRNA gene sequence / L.J. Ward, J.C. Brown, G.P. Davey // FEMS Microbiol. Lett. 1998. - 66(1).

132. Welsh, J. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers / J. Welsh, M. McClelland // Nucleic. Acid Res. 1990. - V. 18. - P. 7213 - 7218.

133. Woese, C.R. Bacterial evolution // Microbiol. Rev. 1987. - V. 51. -P. 221 -271.