автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Исследование процессов и разработка технологии получения концентрированных ферментных препаратов глюко- и альфа-амилазы

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ ОБЩЕХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПИЩЕВОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ. (ВНИИПБТ)

На правах рукописи

ПОГОРЖЕЛЬСКАЯ НАТАЛИЯ СЕРГЕЕВНА

УДК 577.15:663.1

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ И РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЦЕНТРИРОВАННЫХ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ ГЛККО- И ¿С- АМИЛАЗЫ

Специальность 05.18.07 "Технология продуктов брожения, алкогольных и безалкогольных напитков"

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва, 1993

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте пищевой биотехнологии (ВНИИПБТ).

Научный руководитель: кандидат технических наук,

старший научный сотрудник КУДРЯШОВ В. Л.

Официальные оппоненты: доктор технических наук,

профессор ЯРОВЕНКО В. Л.

Ведущее предприятие: Мичуринский экспериментальный завод

во Всероссийском научно-исследовательском институте пищевой биотехнологии по адресу: 109033, Москва, Самокатная, 46.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИПБТ.

кандидат технических наук ЛЕЩЕНЕВ В. П.

Защита диссертации состоится" ЬО " -2- 1993 г.

часов на заседании Специализированного Совета К-120.86. 01

Л, 1993 г.

в

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного Совета, кандидат технических наук

И. И. Бурачевский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИК^ РАБОТЫ

Актуальность проблемы и состояние вопроса. Одним из путей интенсификации экономики в настоящее время является создание и освоение передовых и 'принципиально новых наукоемких технологий.

Б области биотехнологии пищевых продуктов важное место занимает проблема производства ферментов микробного происхождения.

Общая годовая потребность АПК России в ферментных препаратах на 2000 год составляет 35-40 тыс. усл. тонн, в том числе амилолити-ческих - 10-12 тыс. усл. тонн.

Специфика технологических процессов таких отраслей как хлебопекарная, пивоваренная, производство соков, глюкозы, глюкозо-фрук-тозных сиропов (ГФС) и других сахарозаменителей требует применения ферментных препаратов в очищенном и концентрированном виде.

В спиртовой промышленности допускается использование нативной культуры микроорганизмов. Однако лишь 12 спиртзаводов в России имеют собственные ферментные цеха. Ферментные препараты, производимые в виде нативной культуры, имеют ограниченный срок хранения, относительно низкую удельную активность. На их транспортировку затрачиваются значительные средства.

Получить концентрированные очищенные препараты, увеличить их срок хранения по сравнению с нативной культурой, сократить транспортные затраты можно за счет применения современного мембранного процесса- ультрафильтрации (УФ). Процесс УФ позволяет: исключить энергоемкие фазовые переходы, провести процесс концентрирования с одновременной очисткой при мягких температурных режимах, а, следовательно, снизить потери активности ферментов.

Для отраслей, перерабатывающих крахмалсодержащее сырье, наибо лее важное значение имеют два фермента: оС~ и глюкоамилаза, обеспечивающие разжижение и осахаривание зернового и картофельного крах-

мала. Данный факт обусловил необходимость работы параллельно с двум продуцентами указанных ферментов: бактерией Bacillus subtilis-82 и плесневым грибом Aspt-rgill ius awamori ВУДТ-2.

Ранее во ВНИИПБТ бьши проведены работы, направленные на исследование собственно процесса концентрирования ферментных растворов методом УФ. Задача же создания производства концентратов требует решения всего комплекса проблем, включая стадии: отделения биомассы продуцентов, концентрирования и очистки, а также утилизации побочных продуктов. Поэтому настоящая работа была направлена на комплексное решение этих проблем с целью создания технологической линии в целом.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является исследование процессов и разработка технологии получения концентрированных ферментных препаратов и глюкоашлазы.

Поставленная цель достигается путем решения следующих задач:

- поиск оптимального способа и определение основных технологических параметров предподготовки культуральных жидкостей (к. ж.) грибного и бактериального продуцентов;

- определение оптимальных технологических параметров процесса концентрирования к. ж. (степень концентрирования, марка мембраны, рабочая температура, давление и др.);

- разработка способа утилизации побочных продуктов при получении концентрированных ферментов.

Научная новизна. В результате исследований:

- изучены основные закономерности, разработана математическая модель и определены на ее основе оптимальные параметры процесса фильтрования к. ж. Asp. awamori ВУДТ-2 - продуцента глюкоами-лазы;

- впервые показана возможность использования высокомолекулярных синтетических флокулянтов на стадии предподготовки к. ж. Вас. subtilis-82 - продуцента сб-амилазы;

- изучено влияние состава питательной среды и основных физико-химических факторов на предподготовку к. ж. Бас. яиМ 111э-82;

- совокупностью Щ£-спектроскопии и гелевой хроматографии интерпретирован механизм взаимодействия флокулянта с дисперсной фазой к. ж. Вас. зиМ 1115-82, детерминированы функциональные группы, ответственные за процесс флокуляции;

- изучены основные закономерности процесса концентрирования ферментных растворов оС- и глюкоамилазы методом УФ и физико-химические свойства ультраконцентратов:

- изучено влияние метацида на жизнедеятельность дрожжей и на процесс брожения в целом;

- исследованы способы утилизации пермеата и биомассы продуцентов в производстве этанола.

Практическая значимость работы.

1. На основании проведенных исследований:

- разработаны комплексные технологии производства концентрированных ферментных препаратов об- и глюкоамилазы, включающие стадии предподготовки к. ж. и утилизации побочных продуктов:

- создано опытно-промышленное производство Глюкаваморина Г18х и Амилосубтилина Г18х на Мичуринском экспериментальном заводе и наработаны опытные партии препаратов;

- разработаны проекты цехов по производству ультракюнцентра-тов об- и глюкоамилазы для Воскресенского и Стерлитамакского ферментно-спиртовых заводов мощностью 300 усл. т ферментов в год.

2. Результаты научных исследований использованы при разработке следующей технической документации:

- Технологического регламента на производство Глюкаваморина

Г18х;

- Экспериментального технологического регламента на производство Амилосубтилина Г18х;

- Технических условий на препараты ферментные Глюкаваморин

Г18х и Амилосубтилин Г18х;

- Рекомендаций по параметрам проведения процесса выделения биомассы и утилизации побочных продуктов применительно к Стерли-тамакскоку и Воскресенскому ферь;ентно-спиртовым заводам.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы бит доложены на заседания Ученого Совета ВНИИПБТ. Результаты исследований докладывались на Всесоюзной конференции молодых ученых и специалистов (Руза, 1989), Всесоюзной научно-практической конференции "Ферменты - народному хозяйству" ( Черновцы, 1990 ), Всесоюзной конференции "Применение природных и синтетических ВМС в производстве пищи" (Суздаль, 1991), конференции "Мембранные процессы в биотехнологии, медицине и пищевой промышленности.(Москва, 1951).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, в том числе патент.

Струкл'ура и объем диссертационной работы. . Диссертационная работа состоит из Еведения, пяти глав, заключения, списка литературы из 143 наименований, 12 приложений. Основной текст диссертации изложен на /V/ страницах машинописного текста, содержит 31 таблицу и 26 рисунков. Приложения содержат акты производственных испытаний, таблицы результатов экспериментов, расчет экономической эффективности разработанных технологических схем производства концентрированных ферментов.

КРАТКОЕ С0ДЕРКАШ1Е РАБОТЫ 1. Обзор литературы

В обзора представлены данные, характеризующие совромоиноо состояние мембранной тохнологшг ¡i порспоктиш оо примсноння п пищевой биотехнологии и, превдо всего, для концентрирования ферментов.

Рассмотрены основные направления предварительной подготовки к. ж. перед ультрафильтрациеи: гидромеханические способы (фильтрование под давлением, под вакуумом, через различные фильтрующие перегородки, разделенно в центробежном поле с помощью центрифуг и сепараторов и т.д.) и физико-химические способы (воздействие) различных коагулянтов, флокулянтов, варьирование pH и т.д.).

Рассмотрены способы утилизации побочных продуктов производства концентратов ферментов.

Анализ опубликованных данных показал, что в плане решения порочислонных проблем к. ж. Asp.nwamorl ВУДТ-2 и Вас. subt 111я-П2 практически не изучены, что и обусловило постановку указанных выше цели и задач исследования.

2. Объекты, материалы и методы исследования

Объектами исследования служили высокоэффективные продуценты - и глкжоамилазы, используемые в настоящее время при производстве ферментов для спиртзаводов: бактерия Bacillus subti 11s-82 и плесневый гриб Aspergí 11 lus awamori ВУДТ-2, выращенные глубинным способом на регламентных питательных средах.

Исследования проводились во ВЛШЛБТ, но Московском опытном (МОС) и Мичуринском экспериментальном заводах (МЭЗ).

Изучение фильтрационных свойств к.ж. Asp. awamori ВУДТ-2 осуществляли по методике ШИХИММАШа на лабораторной ячейке ФМ-02-1000.

Концентрированно ферментных растворои осуществляли на лабораторной УФ-установке и полупроизводственном УФ-аппарате с плоско-параллельными элементами. При этом использовали мамбрпны П поколеня (на подложке) на основа ацетатцеллюлозы (типа УАМ) к полисульфонамида (типа УПМ), производимых в НПО "Полиыерсинте;

I

(г. Владимир).

Глюкоамилазную (ГлС) и анилолитическую (АС) активности определяли по ГОСТ 20264.4-8Э; общее содержание растворимых белковых веществ - по методу Лоури (Лоури, 1951); содержание углеводов -колориметрическим антроновым методов (Рухлддева, 1986); сухие вещества - рефрактометрическим методом и высушиванием до постоянного веса при 105°С; величину рН - с помощью иономера И-120.1.

Мутность растворов оценивали по оптической плотности (Д.) иг фотоэлектроколориметре КФК-2 при 1 =670 нм и толщине кюветы 5 мм.

• Механизм флокуляции исследовали методом ИК-споктроскопии на приборе Specord М-82 с предварительным обезвоживанием образцов с КБг и методом жидкостной гелевой хроматографии на полиакриламвд-ном геле Sephadax G-50.

Определение концентрации метацида в ферментных растворах определяли фотометрией образующегося комплекса с эозином (Клячко, Шнайдер, 1984).

Влияние метацида на жизнедеятельность дрожжей 'определяли , подсчетом дрожжевых клеток в камере Горяёва.

Исследования по осахариванию и сбраживанию крахмалсодержаще-го сырья проводили методом бродильных проб. "' Качество брожения .оценивали по содержаниюгв бражке общих'и' растворимых ' углеводов, определяемых, ' колориметрическим антроновым методом,

содержание спирта в зрелой бражке, определяемом интерферометри-

ческим методом (Рухлядева, 1986).

Опытные партии ферментных препаратов нарабатывались на МОС и МЭЗе.

3. Теоретические и экспериментальные исследования 3.1. Исследование процесса предподготовки к. ж. Asp. awa morí ВУДТ-2

Учитывая, что природа продуцента во многом определяет технологические приемы, применяемые на стадии предподготовки к. ж., на первом этапе исследований было установлено, что отделение биомассы грибной культуры Asp. awamori следует осуществлять фильтрованием под давлением, бактериальной - осаждением в центробежном поле.

С целью поиска оптимального режима фильтрования к.ж. Asp. aviamori ВУДТ-2 были исследованы ее физико-химические и фильтрационные свойства, а также влияние таких технологических параметров, как давление и температура на процесс фильтрования.

Эксперименты по изучению влияния давления и температуры на

скорость фильтрования показали, что она имеет максимальное значе-

о

ние при давлении 0,2-0,3 МПа и температуре 35-40 С (рис.1). При

л/А 36

0,2 0,4 0,6

Давление, МПа

60

Температура, °С

Рис. 1 Влияние давления (а) и температуры (б) на среднюю скорость фильтрования к.ж. Аяр-аигатг! ВУДТ-2 (за 2 часа)

дальнейшем повышении давления и температуры увеличения средней скорости фильтрования не происходило.

Далее нами установлено, что фильтрование к. ж. Asp. awamori ВУДТ-2 является фильтрованием с образованием осадка и'описывается уравнением:

А1'- Р

dt' f (oiy • 8 + ft) (1)

где: У' - удельный объем фильтрата (объем фильтрата, полученный

3 2

с единицы фильтрующей поверхности), м /м ; Т - продолжительность процесса фильтрования, с; Р - 'давление при фильтровании, Па; jn - вязкость фильтрата, Па. с;

сбу- среднее удельное объемное сопротивление осадка, $ - толщина слоя осадка, м;

ft - сопротивление фильтрующей перегородки, отнесенное к

r -I

единице вязкости, м

Уравнение кинетики фильтрования имеет вид:

„ • ff

"о 1 (2)

где: У' - удельный объем фильтрата, м^м2;

У0' - удельный объем фильтрата, полученный за первую минуту, В - показатель степени. м^/м^мин ;

На основании проведенных экспериментов, последующей графической и математической обработки были определены значения входящих в уравнения (1) и (2) переменных при различном давлении и температуре (табл. 1). ; ,

Установлено, что осадок Asp. awamori относится к легко деформируемым осадкам: с увеличением давления происходит его уплотнение., увеличивается среднее уделькие объемное сопротивление Лу . С увеличением температуры также происходит увеличение d v , однако вязкость фильтрата снижается. ' Взаимодействие названных факторов

Таблица 1.

Влияние давления, температуры и длительности хранения на фильтрационные свойства к. ж. Asp. avamori ВУДТ-2

Параметр

Значе ние

Основные свойства к. ж.

Уд. объем Ное соп-ротивл. осадка,

обу -2 in1'

м хЮ

Отнош-е объема осадка к объему фильтрата

3 2 и , ы /и

т-г

Уд. объем фильтрата получ. за

1 мин, &

м /м 'ш хЮ3

Показатель степени "Ь"

т г

Толщина осадка, получ. за 1 мин,80 м/иин

хЮ

3

Вязкость фильтрата, ,Па. с

хЮ

,3

Давление МПа

0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

4,16 7,35 10,41 14,20 17,41

0,25 0,25 О, 25 0,25 О, 21

7.02 8,04

8.03 7,22 5,60

0,48 0,48 0,48 0,49 0,51

1, 75

2, 00 2, 00 2, 66 1,18

1,837 1, 837 1, 837 1, 837 1, 837

Температура,

13 22 35 45

5,93 7,41 8,10 13,52

0,22 О, 25 О, 27 О, 27

7,21

8.04 9,13

9.05

0,48 0,48 0,48 0,48

1, 58 2,00 2,46

2, 44

2,351 1, 837 1, 346 1,078

Срок | 1 1 8,4

хране| 2 1 12,2

ния, | 5 1 18,4

сутки| 12 1 24,8

О, 25 О, 23 0,22 0,19

8, 81 8, 32 7,04 4,79

0,48 0,48 0,48 0,48

2,15 1, 76 1, 50 1,04

1, 837 1, 837 1, 837 1, 837

штегрируется в величине Vo . Она имеет максимальное значение при давлении 0,2 Ша и температуре 35°С, которые следует принять в сачестве оптимальных при фильтровании к. ж. Asp. awamori ВУДТ-2. 1олученные расчетные данные объясняют и полностью согласуются с цанными рисунка 1.

При хранении к. ж. в ней происходят необратимые физиологи-4еские и биохимические изменения, которые ухудшают фильтрационные свойства: осадок уплотняется, увеличивается его сопротивление.

что приводит к снижению скорости фильтрования (табл. 1). Поэтому для обеспечения максимальной скорости фильтрования срок хранения к. ж. не должен превышать одних суток.

С целью подбора фильтрующей перегородки был испытан ряд тканей из натуральных и синтетических волокон: х/б "Бельтинг", капроновая, капро-лавсановая, лавсановая, полипропиленовая. На основании сравнительного анализа для фильтрования к. ж. Азр. агатов ВУДТ-2 была выбрана капролавсановая ткань арт. 86036, имеющая наименьшее сопротивление и низкие адгезионные свойства к биомассе.

С целью более полного извлечения фермента из осадка изучались режимы его промывки. Были исследованы режимы с дробной подачей прошеной жидкости, с единовременной подачей и с рециркуляцией промывной жидкости. В качестве промывной жидкости применяли воду и пермеат.

Установлено, что требуемый объем промывной жидкости составляет 100 % к массе осадка. Однако промывную жидкость следует подавать не одним потоком, а двумя порциями по 50 % к массе осадка (с промежуточной отдувкой). При этом промытый осадок имел активность 10 ед/мл (ГлС исходного осадка - 80 ед/мл), что с учетом объемов составило 10,4 % глюкоамилазы от содержащейся в исходном осадке или 1,4 % от содержащейся в исходной к. ж.

Выявлена нецелесообразность промывки с рециркуляцией промывной жидкости, так как в этом случае устанавливается равновесие между содержанием фермента в промывной жидкости и осадке, и дальнейшего извлечения глюкоамилазы не происходит.

С целью оптимизации фильтрования на основании полученной модели и данных таблицы 1 были рассчитаны оптимальные параметры этого процесса (таблица 2), а также по уравнению (3) максимальная удельная производительность по фильтрату:

п -б

Таблица 2.

Оптимальные параметры процесса фильтрования к. ж. Asp. awamori ВУДТ-2

¡Режим работы IV , ъ?/ь?\ Ь 1 К пр. i К с. \Т вс. ¡< 1 1 1 ^ср.тах,

|с промывкой 1 9. 1 —3 ' 1x10 10,48 1 1 I 1 1 10, 23 | 160 | 1 1 1 1,45 х 10~2 |

¡без промывки 1 1 9, 1 Q 1 1x10 | 0,48 | - 10,07 1 80 1 i i i 3, 07 х Ю-2 |

При работе на промышленной фильтр-прессе Р0М-56М в периодическом режиме с этими оптимальными параметрами максимальная производительность собственно фильтрования равна 30, 7 л/м ч, с учетом времени промывки - 14,5 л/м^1.

Данные лабораторных исследований были взяты за основу при разработке проектов цехов концентрирования (отделений фильтрования) для производства концентрированного ферментного препарата Глюкаваморин Г18х на Мичуринском и Стерлитамакском спиртовых заводах.

3.2. Исследование процесса предподготовки к. ж. Вас. subtilis-82

К. ж. Вас.subtilis-82 характеризуется высокой агрегативной и седиментационной устойчивостью, обусловленной высоким значением электрокинетического потенциала бактериальных клеток и кол-

лоидных частиц. Электрокинетический потенциал имеет максимальное значение при рН культивирования и может быть снижен при изменении рН системы, использовании коагулянтов и флокулянтов.

В качестве коагулянтов были испытаны неорганические соли: СаС12, MgS04, MgCLj, ZnS04, ZnCl^, A12(S04)3, как индивидуально, так и в сочетании с бентонитом.

Наилучший эффект осветления был достигнут при использовании хлористого кальция в количестве 1%. Однако даже в этом случае

полного разделения суспензии не происходило. Надосадочная жидкость разделялась по высоте на 2 фракции: верхнюю, наиболее прозрачную, имеющую собственно оптическую плотность 0,45, и нижнюю, мутную.

Последнее обстоятельство обусловило дальнейший поиск эффективных реагентов иной природы. В качестве таковых были выбраны высокомолекулярные синтетические флокулянты направленного действия.

В таблице 3 представлены флокулянты катионного, анионного и неионогенного типов, которые применялись в наших исследованиях.

Максимальный осветляющий эффект был получен при использовании катионного флокулянта на основе полигексаметиленгуанидинхло-рида (метацида) с молекулярной массой 40-100 тысяч. Супернатант имел оптическую плотность 0,14 без инактивации фермента.

Из литературы известно, что метацид, как представитель гуа-нидиновых соединений, обладает высокой антимикробной, в том числе антибактериальной активностью. На основании экспериментальных данных установлено, что обработка им к. ж. Вас. зиЫл 1 1б-82 и наличие остаточного количества метацида в супернатанте и ультраконцентрате положительно сказываются на хранении препаратов, обеспечивая их прозрачность и стабильность (последнее подтверждено данными по хранению).

С учетом перечисленных преимуществ метацид был выбран для предподготовки к. ж. Вас. бчЫл 182.

При изучении влияния рН на процесс флокуляции было установлено (рис.2), что с увеличением рН в щелочную сторону качество осветления улучшается. Однако при рН>8, 5 начинается инактивация об-амилазы. Таким образом, оптимальным значением рН для предподготовки является 8, 0-8,5.

Таблица 3.

Сравнительная характеристика флокулянтсв

1 | Наименование | флокулянта i | Оптимал. | дозлров-| ка, % i Оптическая исходного i плотность суперн. | i 1 |7 суток хранения| i

| Метацид 1 0,15 0,14 1 0,14 |

i Praestol 611 ВС ! о.оз ' 0,26 ! о, 46 i

| Praestol 2540 ВС | 0,02 0,32 1 0,55 |

| АР-30 | 0,02 0,42 1 0,70 |

| ОКФ | 0,03 0,60 1 0,66 |

| Fennopol К-504 | 0,03 0,60 1 0,86 |

| ВБК-402 1 0,15 1,20 ! 1,50 |

| Применение Snnflok СН-569 Р, технического ПАА и |

| полиоксиэтилена эффекта не дало, i 1

5,0 6,0 7,0

8,0 9,0 10,0 11,0 рН

1,4 1,2

1 - АС ксх.к.я.

2 - АС к.ж., осветленной

мегацвдом

3 - оптическая плотность

ECS, к.я.

4 ~ оптическая плотность

к.н., осветленной метавддом

Рис.2. Влияние рН на предподготовку к.ж. Вас.subtilis-82

Исследования показали, что с помощью метацида можно осветлять культуру, выращенную на концентрированных питательных средах. При этом с увеличением концентрации муки в питательной среде

увеличивается содержание коллоидов в культуральной жидкости и, следовательно, возрастает расход флокулянта. При увеличении концентрации муки в питательной среде с 6 до 18 % концентрация мета-цида должна быть увеличена с 0,2 до О, 5 %.

3. 3. Исследование механизма флокуляции

В связи с тем, что в литературе отсутствуют данные по механизму флокуляции метацидом сложных полидисперсных систем, каковой является к. ж. Вас. бцЫ 1 Пз-82, нами были идентифицированы функциональные группы, ответственные за процесс флокуляции. Для этой цели была применена ИК-спектроскопия.

Сравнение спектров осадка, не содержащего метацид (1), и осадка с метацидом (2) (рис.3) показывает на изменение характера поглощения в области валентных' колебаний гидроксильных групп 3400-3600■см-1. Это позволило предположить, что в процессе флокуляции участвуют стерически свободные гидроксильные группы полисахаридов дисперсной фазы, образующие водородные связи с Ш-группа-ми вводимого полимера.

На ИК-спектре не обнаружено прямого химического взаимодействия флокулянта с белками. По-видимому, их выведение происхо^-дит как за счет снятия коллоидной защиты полисахаридов, так и по электростатическому механизму.

Аналитически определено, что в процессе предподготовки до 5% от вносимого в культуральную жидкость метацида остается в супер-натанте. Используя метод жидкостной гелевой хроматографии (рис.4), было установлено, что метацид в супернатанте образует с ферментом интерполимерный комплекс, который при фракционировании необратимо адсорбируется на геле, но не инактивирует фермент, а напротив, стабилизирует его структуру и повышает' устойчивость ©6-амилазы при хранении.

Содержание белка, иг/мл

Амилолитическая активность, ед/мл

si

3. 4. Исследование процесса концентрирования культуральных жидкостей

Очищенные и осветленные к.ж. Азр.агатог! ВУДГ-2 и Вас.эиЬи-118-82 подвергали концентрированию на УФ-мембранах.

С целью выбора типа и марки УФ-мембраны для концентрирования каждой из к. х. были проведены сравнительные испытания мембран на основе ацетатцеллюдозы типа УАМ и на основе полисульфонамида типа УПМ с различным диаметром пор. При этом критерием оценки была максимальная удельная производительность при 100% селективности по ферменту. На основании анализа полученных данных для концентрирования с^амилазы бьша рекомендована полисульфзнамидная мембрана УПМ-20, а для концентрирования глюкоакилазы - УШ-50 и УПМ-67.

Из литературы известно, что основными параметрами мембранных процессов являются: давление, температура, скорость потока и режим течения в межмембранном канале, определяемый вязкостью и плотностью концентрируемого раствора, а также степенью концентрирования.

Ряс. 5 ■ Зависвдосгь удельной -срадзводатальяосги ыедкЗрая от давления (а) ж гемпературы (б) (•) глвкоаыилаза, мембрана УШ-50, (к) «¿-вывлаза, мэыбраяа УШ-20 I, 2, 3, 4 - уд.проиэвсщдталькость, 5 - ГлС, б - АС

При изучении влияния давления и температуры на процесс концентрирования ферментных растворов (рис. 5) было установлено, что оптимальным давлением для концентрирования является 0,3 МПа и температура 35-40°С. Дальнейшее повышение температуры в сочетании с механическим воздействием приводит к инактивации фермента.

Исследовано изменение биохимических показателей (ферментативной активности, удельной активности, содержания сухих веществ, белка, углеводов) в зависимости от степени концентрирования (рис.6), получены математические зависимости вязкости и плотности ферментных растворов от содержания сухих веществ и температуры (рис. 7,8, уравнения (4)-(9).

Для глюкоашшазы Для -амилазы

V^expMx+I,!*2 (4) v = yB3Xp42x,2t4x2 (5)

р = /вехр 0,0045 х (6) / =/вехр 0,0045 х (?)

х = 0,76 Хр (8) х = 0,82 Хр (9)

где: V и V g - кинематическая вязкость ферментного раствора и воды, соответственно, м^/с;

р и р в - плотность ферментного раствора и воды, соответственно, кг/м3;

х и Хр - содержание сухих веществ истинное и по рефрактометру, соответственно, %.

Для обоснования степени концентрирования был проведен анализ качественных показателей амилолитических ферментных препаратов, поступающих на мировой рынок (прежде всего, датской фирмы "Novo Industri A/S"), a также требований, предъявляемых основными потребителями ультраконцентратов, в том числе производством глюко-зо-фруктозных сиропов. Обобщение этих данных показало, что конку-рентноспособные концентраты должны иметь активность глюкоамилазы )2000 ед/мл, о^-амилазы - >1000 ед/мл. Для достижения этих показателей степень концентрирования по объему составляет: для глюкоамилазы - 12-15 раз, ¡¿-амилазы - 15-20 раз, что соответствует со-

ГлС, ад/ыл лио АС, ед/ия

»«

2400 тгпо

2000 1000

1600 еоо

1200 еоо 600 400

400 200

0 0

е I 0 • I

4 6 в 10 13 14 16 16

Степень хондвятркровакЕЯ (по объем?)

40.и

зи.и

Л 1

30,0 - /» 2

*о //[ 3

10,0

-> 8.0 \

Й 6,0 ;

о • I'

1 ■

к 4,0 / у

/ 2

5 3,0 /

о У* 3'

£ 2,0 /У/

£

СО £

г»; ,1.0

о,е -

0.6

Рис. 7.

Концентрация сухих веществ, х, %

Зависимость кинематической вязкости ультраконцентратов об-амилазы (1,2,3) я глхжоамилазы (х'з'э') от концентрация сухих 1

I, I7- ± = 20°С, 2, г'- 30°С, 3, з'- ¿ = 40°С

1

о

<4

О 2 4 £ 0 10 13 14 16 18 20 £

Степень концентрирования (по объему)

о

, Зависимость ферментативной (г, I). удельной (2, 2) активностей, содержания Концентрация сухих веществ, х. *

Оаяка (3, 3^, сухих веществ (4, 4.) и углеводов (5, от степени концентрирования РиС. £ , Зависимость плотности ультраконцентратов 1...5 - глвкоамнлааа, I ...5' - «С-ашлаэа оО-амилазы (х) и глюкоамилаэы (•) от

концентрации сухих веществ

держанию сухих веществ: для глюкоамилазы - 25-30 %, для <L-амилазы - 15-18 %.

Зная степень концентрирования, а, следовательно, содержание сухих веществ и вязкость, расчетным путем была найдена скорость потока, обеспечивающая турбулентное движение жидкости в межмембранном канале. Для УФ-установки типа УПТ-3 на Мичуринском экспериментальном заводе скорость потока имеет значение: для глюкоамилазы - 1,8 м/с, для о£-а!<1илазы -4,2 м/с.

Полученные ультраконцентраты Глюкаваыорин Г18х, Амилосубти-лин Г18х, а также пермеаты и осадки были охарактеризованы по следующим показателям (табл.4).

Таблица 4.

Характеристика продуктов, получаемых при производстве ультраконцентратов

1 | Продукт ГлС, ед/мл (ед/г) 1 1 1 АС, | СВ, | | Углеводы, ед/мл | % | pH |г/100 мл (ед/г)| | |(г/100 г) 1 1 1 Кол-во посторонней микрофлоры, кол. /мл (кол. /г)

Глюкаваморин Г18х

| Ультракон- 1500- 1 1 1 104- 10?

|центрат 2000 123-30[3, 0-3,4110, 0-12,0

|Пермеат 5-30 110-1213,0-3,41 6,0-7,5 0

j Осадок 20-40 j 78-82 j - | 2,0-3,0 104- ю5

Амилосубтилин Г18х

| Ультракон- 750- | | | 4 5

| центрат 1000 112-1518, 0-8, 5| 2, 0-4, 0 10 - 10

| Пермеат 2-10 | 4-7 |8,0-8,5| 0,6-1,0 4° S

| Осадок I 70-80 | 80-851 - | 0,2-0,5 1 1 1 10 - 10°

Полученные данные были использованы при составлении ТУ на препараты Глюкаваморин Г18х и Амилосубтилин Г18х. Характеристика пермеатов^ и биомассы положена в основу при разработке основных путей их утилизации.

3.5. Утилизация побочных продуктов производстве

При производстве ультраконцентратов с1~ и глюкоамилазп образуются побочные продукты произьодства - биомасса продуцентов и пермеат.

Учитывая, что осадок Вас. БиМ 1115-82 содержит метацид, обладающий антисептическим! свойствами, было изучено его влияние на жизнедеятельность дрожжей. Для этой цели использовали подсчет дрожжевых клеток в камере Горяева. Культивирование дрожжей осуществляли на сусле, содержащем метацид. Установлено, что при концентрации ыетацида до 7 мг/л ингибирования дрожжей не происходит.

Затем было определено содержание метацида в ультраконцентрате, пермеате и осадке, и рассчитано содержание метацида в сусле. Установлено, что при разжижении и осахаривании замеса ультраконцентратом и пермеатом с1 -амилазы содержание метацида в сусле составляло 0,4 и 2,5 мг/л, соответственно; при использовании осадка - 26 мг/л. Снизить этот показатель до допустимого предела (7 мг/л) можно, используя биомассу лишь на разжижение, а осахари-вание проводить пермеатом.

Установлено, что использование пермеата с?£ -амилазы на брожение неэффективно ввиду низкого содержания сбраживаемых углеводов (менее 1%).

При использовании пермеата на приготовление замеса надо учитывать, что он содержит небольшое количество с^—амилазы (до 10 ед/мл) и фактически будет использован как осахариваший материал. Поэтому пермеат следует вносить в замес лишь в объеме, обеспечивающем требуемую дозировку ¿¿-амилазы по единицам активности.

При изучении путей утилизации биомассы и пермеата, содержащих глюкоамилазу, экспериментально была подтверждена возможность их использования в качестве осахаривающих материалов. Учитывая высокое содержание в пермеате растворимых сбраживаемых углеводов

(6,2 г/100 мл), из которых 90 % составляет глюкоза (5,5 г/100 ил), была установлена целесообразность использования пермеата на стадии брожения для получения дополнительного количества спирта.

Получен положительный результат при замене части воды, идущей на замес, пермеатом глюкоамилазы в условиях "мягкого" режима разваривания (^95° С). В этом случае с пермеатом в замес также вносится дополнительное количество глюкозы, что приводит к получению соответствующего количества спирта в бражке.

Таким образом, исследования показали, что наиболее рациональным способом утилизации побочных продуктов для ферментных цехов, расположенных на территории спиртзаводов, является использование биомассы и пермеата непосредственно в технологии этанола.

4. Исследование процесса предподготовки к. ж. Вас. БиМ 1И 5-82 в полупроизводственных условиях

С целью выбора типа оборудования для отделения биомассы к. е. Вас. БиЫл Пб-82 на Московском опытном заводе и Мичуринском экспериментальном заводе были проведены сравнительные испытания с использованием сепаратора АСГ-ЗМ и барабанного вакуум-фильтра с намывным слоем.

При использовании сепаратора АСГ-ЗМ при двухкратном сепарировании был получен высокоочшценный супернатант с оптической плотностью 0,11. В супернатант перешло 88 % «¿-амилазы от содержащейся в исходной к. ж. (по балансу), 12 % осталось в осадке. Применение двухкратного сепарирования обусловлено высоким содержанием твердой фазы в к. ж. (до 15 %).

Существенными недостатками отделения биомассы на вакуум-фильтре явились: сильное разбавление к. ж. водой, содержащейся в порах намывного слоя; удаление со срезаемым слоем до 50 % фермента (по балансу) и проблема утилизации осадка, содержащего ве-

щество намывного слоя (перлит или др.).

Учитывая вышесказанное, в качестве способа отделения биомассы к. ж. Вас. subtilis-82 было выбрано сепарирование. В аппаратурное оформление промышленной технологической схемы были заложены сепараторы типа ВВС (или ВСК-2) для первоначального осветления и саморазгружающийся сепаратор А1-АСЭ-Б для тонкой очистки супер-натанта.

5. Разработка технологических схем производства концентрированных ферментных препаратов

На основании проведенных лабораторных и полупроизводственных исследований разработаны технологические схемы производства концентрированных ферментных препаратов Глюкаваыорина Г18х и Ами-лосубтилина Г18х, включающие:

- стадию основных технологических процессов:

- переработку побочных продуктов производства;

- вспомогательные операции.

Стадия основных технологических процессов представлена на рисунке 9. Она предусматривает: а) для к. ж. Asp. awamori ВУДТ-2 -- фильтрование на фильтр-прессах (с промывкой осадка); б) для к. ж. Вас. subtilis-82 - реагентную обработку с последующим отделением осадка двойным сепарированием; концентрирование растворов на УФ-установке; стабилизацию, розлив готовых продуктов и хранение.

Технологическая схема производства Амилосубтилина Г18х была опробована на Московском опытном заводе, а производство Глюкава-морина Г18х по разработанной схеме начато на Мичуринском экспериментальном заводе. Разработанные технологии были положены в основу проектов цехов по производству ультраконцентратов для Воскресенского и Стерлитамакского ферментно-спиртовых заводов. Полученные концентраты об- и глюкоамилазы помимо спиртового произ-

Рио. 9. Принципиальная обобщенная технологическая схема основного производства Глюкаваыорина Г18х и Аыилосубтилина Г18х

водства были испытаны и получили положительную оценку на Ефре-мовском крахмало-паточном комбинате при производстве глюкозы и в НПО по крахмалопродуктам при производстве глюкозо-фруктозных сиропов.

ОБЩИЕ ВЬШОДЫ

1. Исследования и сравнительный анализ различных способов предварительной обработки показали, что отделение биомассы к. ж. Asp. awamori ВУДТ-2 следует осуществлять фильтрованием под давлением, а Вас. subtilis-82 - осаждением в центробежном поле.

2. Изучены фильтрационные свойства суспензии, получено обобщенное математическое описание процесса фильтрования к. ж. Asp. awamori ВУДТ-2 как процесса с образованием осадка и определены значения соответствующих коэффициентов.

Установлены следующие оптимальные условия фильтрования и промывки: температура - 35 °С; давление -0,2 МПа; фильтрующая перегородка - капролавсановая ткань арт. 86036; срок хранения культуры не более одних суток; промывка водой или пермеатом - двумя порциями по 50% к массе осадка с промежуточной отдувкой.

3. Разработан и предложен способ предварительной подготовки к. ж. Вас. subti1is-82 с применением флокулянта полигексаметиленгу-анидинхлорида (метацида). Установлены оптимальные параметры и условия обработки: предварительное подщелачивание к. ж. до рН 8,0-8,5; введение флокулянта в количестве 0, 2-0, 5%; отделение твердой фазы сепарированием.

4. Исследован механизм флокуляцш к. ж. Вас. subt il is-82 мета-цидом. Совокупностью методов ИК-спектроскопии и гелевой хроматографии установлено, что в процессе флокуляции участвуют стерически свободные гидроксильные группы полисахаридов дисперсной фазы, образующие водородные связи с КН-группами вводимого полимера; за-

фиксировано существование в фильтрате интерполимерного комплекса ¿етацид- d -амилаза, стабилизирующего фермент.

5. Исследован процесс ультрафильтрации к. ж. Вас. subt i lis-82 i Asp. awamori ВУДТ-2. Подобраны марки ультрафильтрационных мембран для каждой из концентрируемых к. ж.: для Вас.subtilis-82 - по-кисульфонамидная мембрана УПМ-20, для Asp. awamori ВУДГ-2 - УПМ-50 i УШ-67.

Установлены оптимальные технологические параметры концентрирования: температура 35-40°С; давление 0,25-0,30 МПа; скорость ютока в кежиембраннои канале: не менее 1,8 м/с (для глюхоанилазы) а 4,2 м/с (для сЬ -амилазы) при турбулентном режиме; степень концентрирования по объему: 12-15 раз (для глюкоакилазы) и 15-20 раз (для -амилазы).

6. Изучено влияние метацида на процесс брожения. Показано, тго метацид в концентрации до 7 мг/л не влияет на жизнедеятельность дрожжей.

7. Установлены основные пути утилизации побочных продуктов со стадий предподготовки и концентрирования культуральных жидкостей в технологии этанола:

- пермеата и биомассы cL- и глюкоакилазы - в качестве разжижа ющего и осахаривающего материалов;

- пермеата глюкоамилазы - на брожение и на замену воды в замесе при "мягком" режиме разваривания (t<95°C).

8. Разработаны безотходные технологические схемы производства концентрированных ферментных препаратов Глюкаваморина Г18х и Ами-лосубтилина Г18х, включающие стадии предподготовки, концентрирования ультрафильтрацией и утилизации побочных продуктов производства з технологии этанола.

' 9. Технико-экономическая оценка разработанной безотходной технологии производства концентратов показывает, что себестоимость ферментов'увеличивается'не более • so % по сравнению с натив-

ной культурой, что компенсируется сокращением расходов при транспортировке на 150 км.

При этом себестоимость ульграконценгратов ниже их цены на мировом рынке в 2,8 раза (для глюкоамилазы) и в 3,8 раза (для оС -амилазы).

Основные положения диссертации отражены в следующих публикациях:

1. Павлова Е. С., Кудряшов В. Л., Погоржельская Н. С. Исследование способов предочистки культуры Бас. subtilis-82: (по материалам Всес. конф. молодых ученых и специалистов по биотехнологии). Тезисы. -Руза. -1989. -с. 22.

2. Павлова Е. С., Кудряшов В. Л,, Погоржельская Н. С. Очистка культуры Вас. subtilis-82 перед концентрированием методом ультрафильтрации. //Деп. в АгроНИИТЭШШ, N 2121. -1990. - 14 с. -Б. У. "Дед. рукописи", ВИНИТИ, М. -1990. -N 2. -с. 89.

3. Павлова Е. С., Кудряшов В. JI., Погоржельская Н. С. Концентрирование глюкоамилазы ультрафильтрацией и исследования по применению ее в крахмало-паточной промышленности.//Деп. в АгроНИИТЭШП, N 2122.-1990.-7 с.-Б.У. "Деп. рукописи", ВИНИТИ, М. -1990. -N 2. -с. 8Î

4. Павлова Е. С., Кудряшов В. Л., Погоржельская Н. С., Лапидус Т. В. Исследование возможности применения Глюкаваморина Г18х в крахмало-паточной промышленности: (по материалам Всес. научно-практ. конф. "Ферменты - народному хозяйству"). Тезисы. - Черновцы. -1990. -с. 59.

5. Павлова Е. С., Кудряшов В. Л., Погоржельская Н. С. Исследование возможности применения флокулянтов для разделения к. ж. Вас. subtilis-82: (по материалам Всес. научно-практ. конф. "Ферменты -народному хозяйству"). Тезиса-Черновцы.-1990.-с. 101.

6. Кудряшов В. Л., Павлова Е. С., Погоржельская Н. С. Технология получения концентрированных ферментных препаратов, оптимально совместимая с заводами по производству этанола: (по материалам

науч. конф. "Научное обеспечение хранения н переработки растительного сырья в пищевой промышленности"). Тезисы. - П., НТИПП.-1991. -с. 24-25.

'7. Кудрлшоп Б. Л., Hiuuionn B.C., Погоржгип.скпи И. С. и др. Высокопроизводительная ультрафильтрпционная устппопкп марки KM3-302 для концентрирования форконтных препаратов: (по млтернп-лам конф. "Мембранные процессы в биотехнологии, медицине и пищевой промышленности"). Тезисы. - М.-1991.-с. 35.

8. Погоржельская Н. С., Кудряшов В. Л. .Шнайдер М. А., Павлова Е. С. Использование селективных флокулянговдля осветления к. ж. Вас. subt i 1 is-82. //Деп. в АгроНИИТЭИПЛ, N 2471. -1992. -17 с. -Б. У. "Деп. рукописи", ВИНИТИ, М. -1992. -N 4. -с. 71.

9. Шнайдер М. А., Погоржельская Н. С., Павлова Е. С., Кудряшов В. Л. Гембицкнй П.А. Интенсификация процесса выделения J, -амилазы высокомолекулярными флокулянтами-антисептиками: (по материалам Всес. конф. "Применение природных и синтетических ВМС в производстве пищи"). Тезисы. -Суздаль. -1991. -с. 36.

10. Шнойдор М. Л. , Погоржольскоя Н. С. Фотометрический мотод определения флокулянта мотацида в ферментных растворах.// Доп. и АгроНИИТЭИПП, N 2531. -1993. -7 с.

11. Шнайдер И. А., Авакян В. Г., Погоржельская Н. С., Гембицкнй П. А. Исследование процесса флокуллцпи при осветлении культу-ральных жидкостей катонным флокулянтом метацидом. //Деп. в АгроНИИТЭИПП, N 2532. -1993. -9 с.

12. Шнайдер М. А., Погоржельская Н. С., Павлова Е. С., Кудряшов В. Л., Гембицкнй П. А., Гринберг А. П. Способ очистки культу-ральной жидкости микроорганизма - продуцента гидролитических ферментов. Заявка на патент N 5017659/13 от 7. 06. 93, полож. решение.