автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.04, диссертация на тему:Исследование и разработка технологии тонизирующих напитков на основе молочного сырья

На правах рукописи

Ои^4' ' ,

Сухих Станислав Алексеевич

ИССЛЕДОВАНИЕ И РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ТОНИЗИРУЮЩИХ НАПИТКОВ НА ОСНОВЕ МОЛОЧНОГО СЫРЬЯ

Специальность 05.18.04 - технология мясных, молочных, рыбных продуктов и холодильных производств

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

2 4 СЕН 2009

Кемерово 2009

003477404

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» (ГОУ ВПО Кем ТИПП).

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор

Просеков Александр Юрьевич

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор

Терещук Любовь Васильевна

кандидат технических наук Сагателян Минас Вазгенович

Ведущая организация: Федеральное Государственное образовательное

учреждение высшего профессионального образования «Кемеровский государственный сель-скохозяственный интитут»

Защита диссертации состоится «19» октября 2009 г. в 12-30 часов на заседании диссертационного совета Д 212.089.01 в ГОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» по адресу: 650056, г. Кемерово, бульвар Строителей, 47, ауд. 1207.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности».

Автореферат разослан «15» сентября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета ' Потипаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Известно, что производство и употребление алкоголя имеет давнюю историю и широко распространено во многих культурах человеческой цивилизации. В социумах употребление алкогольных напитков является частью определенных событий семейного и общественного плана. Уровень потребления алкоголя в России, в пересчете на чистый этанол превышает 12 литров в год на человека, что превышает средние европейские показатели примерно на 50%.

Этанол, в силу своих химических свойств и особенностей биотрансформации оказывает токсическое и наркотическое воздействие на живой организм. Одним из наиболее важных последствий потребления алкоголя является абстинентный алкогольный синдром.

Метаболическое окисление алкоголя происходит с участием этанол-метаболизирующей мультиферменгной системы (ЭМС), состоящей из двух энзимов: цитозольной алкогольдегидрогеназы (АДГ) и митохондриальной ацетальде-гидрогеназы (АЛДГ).

В нашей стране продукты питания и препараты, направленные на снижение токсического воздействия этанола и продуктов его метаболизма (ацетальдегида) на живой организм в достаточном количестве и ассортименте не производятся. В связи с этим создание конкурентоспособных отечественных мультиферментных препаратов и тонизирующих напитков, предназначенных для обезвреживания токсических продуктов метаболизма этилового спирта является актуальным и практически важным.

Значение напитков в рационе питания человека очень велико. Эта значимость определяется, прежде всего, пищевой, биологической и энергетической ценностью продукта, а также высокими органолептическими свойствами. Тонизирующие напитки обогащены витаминами, минеральными элементами, ненасыщенными жирными кислотами и пищевыми волокнами, которые способствуют предупреждению различных заболеваний.

Ведущую роль в производстве безалкогольных напитков по праву занимает молочная промышленность. Молочная отрасль для выпуска большого ассортимента тонизирующих напитков использует обезжиренное молоко, пахту и молочную сыворотку. В нашей стране к тонизирующим напиткам предъявляют особые требования, согласно которым напитки данного вида должны обладать не только тонизирующим действием, но и быть полезными для здоровья человека. Все вышеизложенное указывает на актуальность настоящего исследования.

При выполнении исследований автор использовал работы C.B. Калишевича, Г.В. Морозова, В.А. Тутельяна, А.Г. Храмцова, П.Д. Шабанова и других ученых.

Цель и задачи исследований. Целью является исследование и разработка технологии мультиферментного препарата на основе дрожжей Saccharomyces сеге-visiae, а также создание технологии тонизирующих напитков на основе вторичного молочного сырья, направленных на снижение токсического действия этилового спирта и продуктов его метаболизма (уксусного альдегида).

Для достижения поставленной цели сформулированы основные задачи исследований:

- исследовать закономерности процесса культивирования дрожжей S. сеге-visiae на молочной сыворотке в односекционном биореакторе;

- разработать технологию выделения и очистки ЭМС, изучить физико-химические свойства АДГ и АЛДГ, выделенных из дрожжей S. cerevisiae;

- исследовать влияние этанолметаболизирующего мультиферментного препарата (ЭМП) на физико-химические, микробиологические и органолептические показатели тонизирующих напитков;

- разработать технологию тонизирующих напитков, исследовать их состав и свойства, определить продолжительность хранения, внедрить результаты работы в производство.

Научная новизна работы заключается в следующем:

- изучены закономерности процесса культивирования дрожжей на молочной сыворотке в односекционном биореакторе, определены рациональные параметры: концентрация молочной сыворотки 50±2%, температура 36±2°С, рН 4,5-5,0 и продолжительность не менее 18±0,5 ч;

- изучен процесс разрушения дрожжей S. cerevisiae, подобраны рациональные условия: стеклянные бусы марки Glass beads approximately 80 mesh, скорость движения ротора составляет 7000±100 об/мин, продолжительность 3±0,2 ч;

- разработана технология выделения и очистки ЭМС из дрожжей S. cerevisiae: центрифугирование при 12000±100 об/мин в течение 30±0,2 мин, осаждение белка ацетоном при температуре минус 2±2°С, центрифугирование в течение 20±0,2 мин при 12000±100 об/мин;

- обоснованы параметры очистки ЭМС от балластных соединений (рН 8,0-9,5, мембрана УПМ-67) с последующей доочисткой от контаминирующей микрофлоры на мембранах фирмы «Millipore», изучены состав и свойства полученных препаратов.

Практическая ценность работы. Практическая ценность работы состоит в разработке технологии ЭМС на основе дрожжей S. cerevisiae, состоящей из двух ферментов: АДГ и АЛДГ. Подана заявка на выдачу патента (№ 2008139159/13 от 01.10.2008 «Способ производства биологически активной добавки тонизирующего действия»). В установленном порядке подготовлен комплект технических условий и технологических инструкций на напиток молочный тонизирующий «Бодрячек» (ТУ 9222-006-02068315-09) и напиток сыворочный тонизирующий «Тоник-милк» (ТУ 9222-007-02068315-09).

По результатам конкурса молодых ученых, проходившем в рамках пятого московского Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009) работа награждена дипломом и медалью за лучшую научно-исследовательскую работу, дипломом первой степени Всероссийского заочного конкурса «Научный потенциал XXI» (Москва, 2009); дипломом первой степени на конференции «Научный потенциал-XXI» (Москва, 2009); дипломом первой степени и кубком на третьей международной научной студенческой конференции «Научный потенциал студенчества в XXI веке» (Ставрополь, 2009).

Апробация работы. Основные положения диссертации получили одобрение на научно-практических конференциях, симпозиумах, семинарах и конгрес-

сах, в том числе на конкурсе «Инновационные и технологические предпринимательские проекты среди молодежи (г. Москва, 2008 г.), на первой всероссийской конференции студентов и аспирантов «Пищевые продукты и здоровье человека» (г. Кемерово, 2008 г.), на пятом международном конгрессе «Биотехнология: состояния и перспективы» (г. Москва, 2009 г), на всероссийской конференции «Научный потенциал XXI» (г Москва, 2009), на III Международной научной студенческой конференции «Научный потенциал студенчества в XXI веке», на Второй всероссийской конференции студентов и аспирантов «Пищевые продукты и здоровье человека» (Кемерово, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе в отраслевом журнале, рекомендованном ВАК «Достижения науки и техники АПК».

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из следующих основных разделов: введение, обзор литературы, объекты и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение, выводы, список использованных источников и приложения. Основное содержание работы изложено на страницах машинописного текста, содержит 24 таблицы и 30 рисунков. Список литературы включает 163 наименования.

МЕТОДИКА ВЫПОЛНЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

Теоретические и экспериментальные исследования выполнены в соответствии с поставленными задачами в Научно-образовательном центре Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» (ГОУ ВПО КемТИПП). Общая схема исследований представлена на рис. I.

Весь цикл исследований состоял из нескольких взаимосвязанных этапов. На первом этапе для формулировки цели и задач собственных исследований проводили анализ доступной отечественной и зарубежной информации.

На втором этапе исследовали закономерности процесса культивирования дрожжей. Определяли рациональные условия культивирования: концентрацию молочной сыворотки, температуру, pH реакционной среды, продолжительность процесса, учитывали влияние скорости перемешивания и подачи газа на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы (АДГ) и альдегиддегидрогена-зы (АЛДГ) дрожжей Candida maltosa Б-1, Candida tropicalis Б-2, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia Iipolytica и Endomycopsis fibuligera C-2, массовую долю белка и жира в биомассе дрожжей, удельную скорость роста и выход биомассы.

В этом же разделе проведен сравнительный анализ мелассы и молочной сыворотки как дополнительного фактора роста дрожжей в связи с получением этанол-метаболизирующей системы (ЭМС).

На третьем этапе изучали процесс трансформации дрожжей S. cerevisiae. Подбирали скорость вращения ротора, размер стеклянных шариков, продолжительность процесса, оценивали степень разрушения клеток дрожжей.

В дальнейшем разрабатывали технологию выделения и очистки ЭМС. Варьируя параметры технологического процесса (скорость вращения ротора,

Рис. 1. Общая схема проведения исследований

продолжительность, температуру, размер и марку мембран, рН среды, скорость элюции, марка носителя), получали ЭМС с различным составом.

Ферменты, содержащиеся в ЭМС, оценивали по молекулярной массе, активности, наличию сопутствующих белковых веществ и некоторым физико-

химическим свойствам: изоэлектрической точке, аминокислотной последовательности и другим.

На следующем этапе разрабатывали технологию тонизирующих напитков с ЭМП, исследовали их состав и свойства, определяли продолжительность хранения (напитки «Бодрячок» и «Тоник-милк» вырабатывали как из обезжиренного молока, так и из молочной сыворотки).

На заключительном этапе результаты исследований внедряли в производство, оценивали эффективность выработки.

При выполнении диссертационной работы использовали стандартные, общепринятые и оригинальные методы исследований, к которым можно отнести физико-химические (экстракция, диализ, ионообменная хроматография, электрофорез, спектроскопию), биохимические, микробиологические, органолепти-ческие и другие.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Отбор продуцентов для гетерофазного глубинного культивирования проводили среди штаммов дрожжей Candida maltosa Б-1, Candida tropicalis Б-2, S. cere-visiae, Yarrowia Iipolytica и Endomycopsís fibuligera C-2, которые, исходя из литературных данных, обладают наибольшей активностью в отношении продуцирования АДГ. Эксперименты показали, что все исследованные штаммы способны активно расти на средах, содержащих в качестве источника углерода молочную сыворотку, обогащенную фосфором, азотом и другими микроэлементами. Для исследований отобран штамм S. cerevisiae, титр клеток которого в стационарной фазе превосходил титр клеток других штаммов.

Дрожжи S. cerevisiae культивировали в периодическом режиме в биореакторе при температуре 30±2°С и pH 4,5-5,0, перемешивании - 500±5 об/мин и аэрации. Выращивание дрожжей осуществляли до начала стационарной фазы. Особенности культивирования дрожжей на питательных средах, содержащую молочную сыворотку, представлены в табл. 1. В качестве контроля использовали мелассу.

Таблица 1

Особенности культивирования дрожжей на питательных средах, содержащих молочную сыворотку, обогащенную фосфором и азотом

Характеристика Контроль Массовая доля молочной сыворотки, %

' 25 50 75

1 2 3 4 5

Удельная скорость роста, ч"' 0,010± 0,012± 0,017± 0,017±

±0,0007 ±0,0008 ±0,0009 ±0,0009

Выход биомассы, г/г 0,60±0,03 0,70±0,04 1,25±0,07 1,25±0,07

Продолжение таблицы 1

Характеристика Контроль Массовая доля молочной сыворотки, %

25 50 75

1 2 3 4 5

Накопление биомассы дрож-

жей, г/л 19,8±1,20 24,1± 1,45 36,5±2,20 36,5±2,20

Удельная активность АДГ,

Е/мг белка 20,0± 1,20 20,0± 1,20 20,0±1,20 20,0± 1,20

Удельная активность АЛДГ, 0,30± 0,30± 0,30± 0,30±

Е/мг белка ±0,02 ±0,02 ±0,02 ±0,02

Состав биомассы дрожжей, %

массовая доля белка 42,0±2,50 50,8±3,05 75,3±4,50 75,3±4,50

массовая доля жира 11,6±0,70 9,5±0,60 3,4±0,25 3,4±0,25

В результате анализа данных, можно сделать вывод о том, что рациональными параметрами культивирования дрожжей S. cerevisiae являются: концентрация молочной сыворотки 50%, температура 30±2°С, рН 4,5-5,0. Рациональные условия культивирования позволяют увеличить выход биомассы дрожжей на 60-75%.

Выделение и очистку ЭМС проводили в несколько этапов. Для этого сначала клетки подвергали трансформации на планетарной шаровой мельнице РМ 400 в присутствии стеклянных бус марки Glass beads approximately 80 mesh, скорость движения ротора составляет 7000±100 об/мин, продолжительность 3,0±0,2 часа. Особенности биотрансформации дрожжей S. cerevisiae изучали с помощью микроскопа JTM-lOOEx(JEOL) с увеличением в 8000-10000 раз методом негативного контрастирования (рис. 2).

а)

¡¡¡ИР ш дамп

¡ИР* т тш я р

^v. »■«да--i-.il

KiW ' I

L' v „ ч« ' <» ^ г г ft

' - Г »Ж

|' \" - щ I 8 В^^Ва^ш

б)

1 яи.

ШШ Фсч-

•щ Щ0М

„ - -

I :

Рис. 2. Трансформация клеток дрожжей Б. сегеу1з1ае а - дрожжи до разрушения клеточных стенок б - дрожжи после разрушения клеточных стенок

Данные, представленные на рис. 2, свидетельствуют о полном разрушении клеточных стенок дрожжей Б. сегеу!$1ае.

Далее лизат центрифугировали при 12000±100 об/мин для удаления клеточного дебриса. Белки осаждали ацетоном при температуре минус 2±2°С с последующим центрифугированием в течение 20±0,2 мин при 12000 об/мин.

Для концентрирования раствора высокомолекулярных веществ и их очистки от балластных соединений использовали ультра- и микрофильтрацию. В табл. 2 представлен сравнительный анализ результатов ультрафильтрации лизата с использованием различных мембран, свидетельствующий о том, что оптимальное соотношение производительности, выхода лизата по активности АДГ и АЛДГ и степени очистки от низкомолекулярных белков в процессе ультрафильтрации обеспечивает полиамидная мембрана марки УПМ-67.

Таблица 2

Характеристика процесса ультрафильтрации ЭМП

Исследуемый раствор Марка мембраны Средняя производитель-ность, дм3/м2ч Объем, дм3 Массовая доля белка, % Удельная активность, Е/мг Степень очистки Выход по активности, %

АДГ АЛДГ

Исходный раствор - - 0,5 1,4 106 7,3 - -

Концентрат Фильтрат УПМ-20 15,8 0,05 0,45 9,0 0,4. 163 11,5 1,5 97,2

Концентрат Фильтрат УПМ-50 32,4 0,05 0,45 3.0 1.1 585 42,1 5,5 95,3

Концентрат Фильтрат УПМ-67 34,5 0,05 0,45 2,4 1,2 780 55,4 7,3 92,1

Концентрат Фильтрат УПМ-100 44,0 0,05 0,45 2,3 1,2 643 43,8 6,0 73,9

Изучение влияния рН среды при концентрировании лизата в процессе ультрафильтрации показало, что максимальная производительность (34,5 дм3/м2ч) наблюдается в зоне рН 8,0-9,5 (естественный рН ферментного раствора), а выход ферментов АДГ и АЛДГ в растворе при изменении значения рН изменяется незначительно. Данные, полученные в ходе исследований, свидетельствуют о том, что ферментный раствор может быть сконцентрирован в 10-15 раз на мембране УПМ-67 с общим выходом по активности 91-93% и степенью очистки 7,3.

С целью очистки концентрата от контаминирующей микрофлоры применен способ микрофильтрации с использованием мембран фирмы «МПНроге» с диамет-

рами пор 0,60; 0,40 и 0,22 мкм. Стерилизующая фильтрация через мембрану с размерам пор 0,22 мкм позволила получить ЭМП, соответствующий по микробиологическим показателям требованиям Государственной Фармакопии. Нормируемые и фактические микробиологические характеристики ферментных препаратов приведены в табл. 3.

Таблица 3

Нормируемые микробиологические показатели мультиферментного препарата

Показатель Норма Фактически

Бактерии группы кишечной палочки (коли-формы) в 0,1 г Не допускаются Не обнаружено

Патогенные микроорганизмы, в т.ч. L. monocytogenes и бактерии рода сальмонелл в 25,0 г Не допускаются Не обнаружено

St. aureus в 1,0 г Не допускаются Не обнаружено

Мезофильные аэробные, КОЕ/г, не более 5-104 3-Ю2

Факультативно анаэробные микроорганизмы, КОЕ/г, не более МО4 0,7-102

Очистку АДГ и АЛДГ от положительно заряженных белков проводили с использованием метода ионообменной хроматографии (ИОХ) на колонке с карбок-симетилцеллюлозой (КМ-целлюлоза). Для этого элюцию осуществляли ступенчато в фосфатном буфере (рН 6,5) со скоростью 10 см3/ч. В каждой фракции определяли содержание белка и каталитическую активность ЭМС. Степень очистки фермента на этой стадии составила 10,5, выход по активности и белку 25,4 и 4,3%, соответственно. На рис. 3 изображена хроматограмма, характеризующая десорбцию ЭМС на КМ-целлюлозе.

Рис. 3. Хроматограмма ЭМС на КМ-целлюлозе

На рис. 3 показано, что подобранные условия позволили сорбировать на носитель положительно заряженные белки. ЭМС вышла в пике несорбированных белков. Это позволило значительно повысить каталитическую активность АДГ и АЛДГ, а также удалить часть примесей белковой природы.

Последующую очистку проводили на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой (рис. 4). Для этого ЭМС наносили на предварительно уравновешенную фосфатным буфером рН 7,5 колонку с ДЭАЭ-целлюлозой. Элюцию сорбированных белков осуществляли раствором 4,5 №С1 в ступенчатом градиенте концентраций 0-15 моль/л.

Степень очистки АДГ и АЛДГ составила 90,3%, при этом каталитическая активность АДГ была зарегистрирована в первом пике, а АЛДГ - во втором пике. Активные фракции для создания ЭМП объединяли. Концентрацию белка полученной фракции определяли методом Бэдфорда на спектрофотометре. Степень чистоты определяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (рис. 5).

Рис. 4. Ионообменная хроматография ЭМС на колонке с ДЭАЕ-целлюлозой

Рис. 5. Электрофореграмма фракции после ионообменной хроматографии:

1 - белок-маркер;

2-ЭМС

20,0 -. - >

1 2

В результате анализа данных, представленных на рис. 5, можно сделать вывод о том, что полученная фракция не содержит побочный белков.

Дрожжи Б. сегеУ151ае содержат в своем составе АДГ и АЛДГ, отличающиеся между собой аминокислотной последовательностью и специфичностью. С целью

45,0

30,0 -■

АЛДГ АДГ

идентификации их в полученном растворе проводили секвенирование методом Эдмана. Результаты секвенирования фракций ЭМП представлены на рис. 6.

111 И 15«

■Л Ю Я 1®

FLISEQQAR.ADFEKLFITDADQAAKVILQCVRKHKRRV СЮК A ¥QA ARL AFSLGST WREWD A.SERG RLLDKLADLVG RDRATLA

IIJfiM

¡wiiafill

Ш

М

и I

шш

1М 1!« 120 1!1

rilStQQAmFEKlFlTDADQAAnUQGVmmV

11 80 50 100 110

WDKUQHlUFSlGSVWEMDlSElGRLlCKUDL5GHBlf,TU

Ш1

liiiMM

Рис. 6. Результаты секвенирования фракций после ионообменной хроматографии: 1- стандартный фермент АДГ специфичный к этанолу; 2 - стандартный фермент АЛДГ, специфичный к ацетальдегиду; 3 - полученный фермент АДГ; 4 -выделенный фермент АЛДГ

По результатам, приведенным на рис. 6, можно сделать вывод о том, что полученная белковая фракция содержит только два фермента АДГ и АЛДГ, способных катаболизировать этиловый спирт и ацетальдегид. В результате проведенных исследований удельная активность АДГ и АЛДГ повысилась более чем в 10 раз при значительном снижении количества сопутствующих белков.

Таким образом, в результате проведенных операций разработана технология получения этанол-окисляющего ферментного препарата с удельной активностью АДГ 1293 Е/мг белка, АЛДГ 92,5 Е/мг белка, степенью очистки 7,3, выходом по активности 80%. Результаты по очистке ЭМП представлены в табл. 4.

С целью устранения действия пептидаз на полученный высокоочищенный ЭМП и создания оптимальных условий его работы в живом организме (рН 8-9,5, присутствие коферментов НАД и НАДН) подвергли его полимеризации с помощью агарозы. Полимеризацию вели при температуре плюс 2±2°С в течение 1 ч.

Изучение каталитического действия ЭМП, полимеризованного в агарозе, проводили in vitro в условиях, приближенных к живому организму (кислотность реак-

ционной среды рН 2 и наличие пептидаз, температура реакционной среды 36±2°С). В табл. 5 представлены основные характеристики процесса полимеризации.

Таблица 4

Стадии процесса Объем, масса, см3, г Массовая доля белка, % Удельная активность, Е/мг белка Выход, %

АДГ АЛДГ

Экстракция сырья 150,0 1,60 43,0 2,1 100

Диализ 80,0 1,17 206,0 27,3 95

Ультрафильтрация 25,0 1,00 643,0 43,8 82

ИОХ на ДЭАЕ-целлюлозе 15,0 0,54 1293,0 92,5 80

Таблица 5

Характеристика полимеризованного ЭМП

Массовая доля агарозы, % Удельная активность ферментное, Е/мг белка

АДГ АЛДГ

1,00 0,00 0,00

3,00 0,00 0,00

5,00 715,00 54,00

9,00 1109,00 81,5

15,00 859,00 66,9

20,00 0,00 0,00

Согласно данным, приведенным в табл. 5, наибольшая каталитическая активность ЭМП наблюдается при концентрации агарозы 9%.

Изучение каталитической активности ЭМП показало, что максимальная активность в реакции окислительного превращения субстрата (этилового спирта) в промежуточный продукт (альдегид уксусной кислоты) и конечный продукт (уксусную кислоту) наблюдается при температуре реакционной смеси 36±2°С и рН среды 8,0-10,5.

Изоэлектрическая точка АДГ и АЛДГ определена методом изоэлектриче-ского фокусирования на электрофорезе, для АДГ она составила 5,2±0,05, а для АЛДГ 5,0±0,05. Молекулярная масса полученного биологического катализатора определена методом гель-фильтрации на хроматографе РРЬС с использованием тестовых белков.

Таким образом, изучены основные физико-химические и каталитические свойства АДГ и АЛДГ (табл. 6), входящих в состав ЭМС.

Таблица 6

_Свойства ЭМС, выделенной из Б. сегеу151ае_

Показатель АДГ АЛДГ

1 2 3

Оптимум рН среды 8,0-10,5 8,8-10,5

Продолжение таблицы 6

Показатель АДГ АЛДГ

1 2 3

Оптимальная температура,иС 37±2 37 ±2

Термостабильность, иС Не более 45 Не более 50

Молекулярная масса, кДа 150 180

Изоэлектрическая точка 5,2 5,0

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ТОНИЗИРУЮЩИХ НАПИТКОВ

На основании собственных исследований теоретически обоснована и доказана возможность создания технологии тонизирующих молочных напитков для снижения токсического действия алкоголя и продуктов его метаболизма в живом организме. Разработана и утверждена техническая документация на напиток молочный тонизирующий «Бодрячок» (ТУ 9222-006-02068315-09) и напиток сыворочный тонизирующий «Тоник-милк» (ТУ 9222-007-02068315-09). На рис. 9 приведена технологическая схема производства продукта.

Технология включает следующие операции: приемку и оценку качества сырья, очистку, охлаждение молока, сепарирование, охлаждение обезжиренного молока, пастеризацию, охлаждение, дозирование и смешивание компонентов (сироп, ЭМП), охлаждение, фасовку, хранение и реализацию.

Приготовление ЭМП включает следующие стадии: микрофильтрацию ЭМС, ионообменную хроматографию, полимеризацию и смешивание ЭМП с обезжиренным молоком.

Рецептуры тонизирующих напитков, представлены в табл. 7.

Таблица 7

Рецептура тонизирующих напитков, кг_

Компоненты Рецептуры

«Бодрячек» «Тоник-милк»

Молоко 814,95 -

Подсырная сыворотка - 744,91

Алкогольдегидрогеназа 0,006 0,01

Альдегидцегидрогеназа 0,04 0,08

Никатинамиддинуклеатид 10,0 15,0

Никатинамиддинуклеотид восстановленный 10,0 15,0

Раствор фосфатного буфера, рН 8,5 25,0 50,0

Агароза 9,0 9,0

Вода 91,0 91,0

Сахар 40,0 75,0

Итого 1000,0 1000,0

В табл. 8 приведены нормируемые физико-химические показатели тонизирующих напитков «Бодрячок» и «Тоник-милк».

молока

Таблица 8

Нормируемые органолептические и физико-химические показатели тонизирующих напитков

Показатель

Вид напитка

«Бодрячок»

«Тоник-милк»

Органолептические показатели

Консистенция

Однородная, без наличия частиц введенного препарата_

Внешний вид

Цвет молочно-белый без от тенков

Цвет светло-желтый

Вкус и запах

Чистый молочный

Кисло-сладкий, сывороточный

Физико-химические показатели

Массовая доля сахарозы, %, не менее 4,0±0,3 7,5±0,2

Активность АДГ, мг/100 г молока, не менее 503,0±5,0 460,2±4,0

Активность АЛДГ, Е/100 г молока, не менее 25,8±0,3 19,2±0,2

Титруемая кислотность, °Т, не более 20±1 80±4,0

Тонизирующие напитки должны храниться при температуре не более 4±1°С не более 10 суток с момента окончания технологического процесса.

Выводы и результаты

1. Изучены закономерности процесса культивирования дрожжей S. сеге-visiae на молочной сыворотке в связи с получением ЭМС в односекционном биореакторе, определены рациональные условия культивирования дрожжей: концентрация молочной сыворотки 50%, температура 30±2°С, рН 4,5-5,0 и продолжительность не менее 18±0,5 ч.

2. Разработана технология выделения и очистки ЭМС из дрожжей S. cerevisiae. Рациональными параметрами выделения являются центрифугирование при 12000±100 об/мин в течение 30,0±0,2 мин, осаждение специфических белков ацетоном при температуре минус 2±2°С, центрифугирование в течение 20±0,2 мин при 12000±100 об/мин. Рациональными параметрами очистки от балластных соединений являются: рН 8,0-9,5, мембрана УПМ-67, для очистки от контаминирующей микрофлоры целесообразно использовать мембраны фирмы «Millipore» с диаметрами пор 0,22 мкм. Подобраны условия проведения ионообменной хроматографии на колонке с КМ-целлюлозой и ДЭАЕ-целлюлозой.

3. Изучены физико-химические свойства АДГ и АЛДГ. Молекулярная масса фермента АДГ составила 150 кДа, изоэлектрическая точка 5,2, оптимальная температура 37±2сС, рН 7,5-10,0, каталитическая активность АДГ 1293,0 Е/мг белка, молекулярная масса фермента АЛДГ составила 180 кДа; изоэлектрическая точка 5,0; оптимальная температура 37±2°С, рН 8,8-10,5; каталитическая активность - 92,5 Е/мг белка.

4. Разработана технология получения тонизирующего напитка на основе молочного сырья с ЭМП. Исследовано влияние ЭМП на физико-химические, микробиологические и органолептические показатели тонизирующего напитка.

5. Изучена хранимоспособность тонизирующего напитка с ЭМП. Установлено, что в процессе хранения активность АДГ и АЛДГ сохраняется и срок годности тонизирующего напитка, выработанного из обезжиренного молока, не должен превышать 7 суток при температуре плюс 4±1°С, а срок годности тонизирующего напитка, выработанного из молочной сыворотки, не должен превышать 5 суток при тех же условиях хранения.

6. Разработана и утверждена техническая документация (ТУ 9222-00602068315- 09 и ТУ 9222-007-02068315-09) на тонизирующие напитки на основе молочного сырья. Результаты работы прошли апробацию и внедрены на предприятиях отрасли.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Сухих, С.А. Технология тонизирующих напитков на основе вторичного молочного сырья / С.А. Сухих, C.B. Фролов // Достижения науки и техники АПК. -2008.- №5.- С.54-55.

2. Глебова, С.Ю. Перспективы развития новых технологий переработки молока / С.Ю. Глебова, И.С. Разумникова, С.А. Сухих // Актуальные проблемы техники и технологии переработки молока: Сборник научных трудов с международным участием.* Выпуск 5 / ГНУ Сибирский НИИ сыроделия СО Россельхозакадемии.-Барнаул, 2008,- С.303-308.

3. Просеков, А.Ю. Принципы производства биологически активной добавки, снижающей токсическое действие этилового спирта на организм человека / А.Ю. Просеков, С.А. Сухих // Безопасность пищевых продуктов и товаров народного потребления: Материалы международной научно-практической конференции (2728 ноября 2008 г.).- Алматы: АТУ, 2008,- С.348.

4. Сухих, С.А. Актуальность производства тонизирующих напитков // Современные наукоемкие технологии переработки сырья и производства продуктов питания: состояния и перспективы развития: сборник трудов международной научно-практической конференции,- Омск: AHO ВПО Омский экономический институт, 2008,-С.91.

5. Сухих, С.А. Научные и практические аспекты создания тонизирующего напитка на основе молочного сырья // Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты: Материалы VI международной конференции,- М.: МГУПП, 2008,- С.34-39.

6. Сухих, С.А. Принципы создания биологически активной добавки тонизирующего действия на основе алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы // Пищевые продукты и здоровье человека: Материалы первой Всероссийской конференции студентов и аспирантов,- Кемерово, КемТИПП.- 2008,- С.56-57.

7. Просеков, А.Ю. Принципы производства биопродукта на основе этанол-окисляющей мультиферментной системы, снижающий токсическое действие этилового спирта на организм человека / А.Ю. Просеков, С.А. Сухих // Материалы

пятого Московского международного конгресса (Москва 16-20 марта, 2009 г.).-Часть 2,- М.: Экспо-биохим-технологии, РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2009.- С.142-143.

8. Просеков, А.Ю. Практические аспекты создания биологически активной добавки, содержащей алкогольдегидргеназу и альдегиддегидрогеназу / А.Ю. Просеков, С.А. Сухих // Материалы Пятого съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчиникова: Москва, 2-4 декабря 2008 г. / под ред. Р.Г. Василова.- М.: ГОУ ВПО МГУЛ, 2009,- С.167-169.

9. Сухих, С.А. Анализ спиртных напитков с помощью метода электрофореза / С.А. Сухих, С.А. Равнюшкин, H.A. Сартина // Здоровый образ жизни человека -национальная проблема современного общества: Сборник материалов межрегиональной научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученных (17 марта 2009 г).- В 2 т.- Т.2 / под ред. А.И. Барановского,- Омск: Изд-во Омского экономического института, 2009.- С.185-189.

10. Сухих, С.А. Производство продуктов питания нового поколения, позволяющие учитывать генетические особенности человека // Реализация государственной программы развития сельского хозяйства и регулирование рынков сельскохозяйственной продукции, сырья и продовольствия: инновации, проблемы, перспективы: материалы международного научно-технического форума Омского государственного аграрного университета,- Омск: ФГОУ ВПО ОмГАУ, 2009.- С.367-369.

11. Сухих, С.А. Выделение и очистка ферментных препаратов, применяемых в пищевой промышленности / С.А. Сухих, A.B. Крупин // Пищевые продукты и здоровье человека: Материалы второй Всероссийской конференции студентов и аспирантов. - Кемерово, КемТИПП,- 2009,- С.56-57.

12. Сухих, С.А. Разработка технологии создания ферментного препарата, снижающего токсическое действие алкоголя и продуктов его метаболизма в живом организме // Научный потенциал студенчества в XXI веке: Материалы III Международной научной студенческой конференции.- Ставрополь: СевКавГТУ, 2009,- С.47.

Подписано в печать 01.09.2009. Формат 60x86/16. Тираж 80 экз. Объем 1,1 п.л. Заказ № 156. Кемеровский технологический институт пищевой промышленности. 650056, г. Кемерово, б-р Строителей, 47. Отпечатано в лаборатории множительной техники КемтТИППа. 650010, г. Кемерово, ул. Красноармейская, 52

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР.

1.1. Классификация, состав и свойства напитков, в том числе на основе молочного сырья и их значение в питании человека.

1.2. Особенности строения и свойств этанол-метаболизирующей системы.

1.2.1. Характеристика состав и свойств фермента алкогольдегидрогеназы.

1.2.1.1. Эволюция алкогольдегидрогеназы.

1.2.2. Характеристика химического состава и каталитических свойств алкогольдегидрогеназы.

1.3. Роль АДГ и АЛДГ в метаболизме алкоголя живого организма.

Известно, что производство и употребление алкоголя имеет давнюю историю и широко распространено во многих культурах человеческой цивилизации. В социумах употребление алкогольных напитков является частью определенных событий семейного и общественного плана. Уровень потребления алкоголя в России, в пересчете на чистый этанол составляет 12-15 литров в год па человека, включая детей, что превышает средние европейские показатели примерно на 50% [ 1, 74, 79 ).

Этанол, в силу своих химических свойств и особенностей биотраис-формации оказывает токсическое и наркотическое воздействие на живой организм. Одним из наиболее важных последствий потребления алкоголя является абстинентный алкогольный синдром. Метаболическое окисление алкоголя происходит с участием этанол-метаболизирующей мультиферментной системы (ЭМС), состоящей из двух энзимов: цитозольной алкогольдегидро-гепазы (АДГ) и митохондриальной ацетальдегидрогепазы (АЛДГ) [72, 73 851.

В пашей стране продукты питания и препараты, направленные на снижения токсического действия этанола и продуктов его метаболизма (ацеталь-дегида) па живой организм в достаточном количестве и ассортименте не производятся. В связи с этим создание конкурентоспособных отечественных мультифермептных препаратов и тонизирующих напитков, предназначенных для обезвреживания токсических продуктов метаболизма этилового спирта является актуальным и практически важным.

Значение напитков в рационе питания человека очень велико. Эта значимость определяется, прежде всего, пищевой и энергетической ценностью продукта, а также высокими оргаполептическими свойствами. Тонизирующие напитки обогащены витаминами, минеральными элементами, ненасыщенными жирными кислотами и пищевыми волокнами, которые способствуют предупреждению различных заболеваний [2, 231.

Ведущую роль в производстве юпизирующих безалко1 ольных напш-ков по праву занимает молочная промышленность. Молочная отрасль для выпуска большого ассортимента тонизирующих напитков использует л акта!, обезжиренное молоко, пахту и молочную сыворотку. В нашей стране к юнизирующим напиткам предъявляют особые требования, согласно которым папипш данного вида должны обладать не только тонизирующим дей-С1вием, но и быхь полезными для здоровья человека. Все вышеизложенное указывас1 на аклуальносп, настоящею исследования [103, 106].

Расширение ассоршменга «полезных» и «функциональных» напитков раскрывает возможности управления процессом поступления биологически активных веществ в организм человека. С технологической точки зрения напитки — наиболее удобная модель для создания новых продуктов, в юм числе и с использованием натурального растительного сырья [117J.

При выполнении исследований автор использовал работы В.А. Тутель-яна, А.Г. Храмцова, П.Д. Шабанова, C.B. Калишевича, Г.В. Морозова и дру-i их ученых

Целыо являе!ся исследование и разрабопса [ехпологии мулыифер-мешиого препарата на основе дрожжей Saccharomyccs cerevisiae, а также создание технологии тонизирующих напитков на основе вторичного молочного сырья, направленных на снижение токсического действия эшлового спирт и продуктов его метаболизма (уксусного альдегида).

Для досшжения поставленной цели сформулированы основные задачи исследований:

- исследовать закономерноеiи процесса культивирования дрожжей S. cerevisiae на молочной сыворопсе в односскциопиом биореакюре;

- разработать технологию получения и очистки ЭМС, изучить физико-химические свойства АДГ и АЛДГ, выделенных из дрожжей Б. сегеУ1з1ае;

- исследовать влияние этанолметаболизирующего мультиферментного препарата (ЭМП) на физико-химические, микробиологические и органолепти-чсскис показатели тонизирующих напитков;

- разработать технологию тонизирующих напитков, исследовать их состав и свойства, определить продолжительность хранения, внедрить результаты работы в производство.

По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе в отраслевом журнале, рекомендованном ВАК «Достижения науки и техники АПК», подана заявка на получение патента № 2008139159/13 «Способ производства биологически активной добавки тонизирующего действия» (приоритет от 01.10.2008).

ВЫВОДЫ

1. Изучены закономерности процесса культивирования дрожжей S. cerevisiae на молочной сыворотке в связи с получением ЭМС в односек-ционном биореакторе, определены рациональные условия культивирования дрожжей: концентрация молочной сыворотки 50%, температура 36±2°С, рН 4,5-5,0 и продолжительность не менее 18±0,5 ч.

2. Разработана технология выделения и очистки ЭМС из дрожжей S. cerevisiae. Рациональными параметрами выделения являются центрифугирование при 12000±100 об/мин в течение 30,0±0,2 мин, осаждение специфических белков ацетоном при температуре минус 2±2°С, центрифугирование в течение 20±0,2 мин при 12000±100 об/мин. Рациональными параметрами очистки от балластных соединений являются: рН 8,0-9,5, мембрана УПМ-67, для очистки от контаминирующей микрофлоры целесообразно использовать мембраны фирмы «Millipore» с диаметрами пор 0,22 мкм. Подобраны условия проведения ионообменной хроматографии на колонке с КМ-целлюлозой и ДЭАЕ-целлюлозой.

3. Изучены физико-химические свойства АДГ и АЛДГ. Молекулярная масса фермента АДГ составила 150 кДа, изоэлектрическая точка 5,2, оптимальная температура 37±2°С, рН 7,5-10,0, каталитическая активность АДГ 1293,0 Е/мг белка, молекулярная масса фермента АЛДГ составила 180 кДа; изоэлектрическая точка 5,0; оптимальная температура 37±2°С, рН 8,8-10,5; каталитическая активность - 92,5 Е/мг белка.

4. Разработана технология получения тонизирующего напитка на основе молочного сырья с ЭМП. Исследовано влияние ЭМП на физико-химические, микробиологические и органолептические показатели тонизирующего напитка.

5. Изучена хранимоспособность тонизирующего напитка с ЭМП. Установлено, что в процессе хранения активность АДГ и АЛДГ сохраняется и срок годности тонизирующего напитка, выработанного из обезжиренного молока, не должен превышать 7 суток при температуре плюс 4±2°С, а срок годности тонизирующего напитка, выработанного из молочной сыворотки, не должен превышать 5 суток при тех же условиях хранения.

6. Разработана и утверждена техническая документация (ТУ 9222-00602068315-09 и ТУ 9222-007-02068315-09) на тонизирующие напитки на основе молочного сырья. Результаты работы прошли апробацию и внедрены на предприятиях холдинга «СДС-Алко».

1. Алкоголизм. Руководство для врачей / Под ред. Г.В. Морозова, В.Е. Рожно-ва, Э.А. Бабаяна.- М.: Медицина, 1983.- 432 с.

2. Анацкая, А.Г. Создание новых молочных продуктов // Молочная промышленность.- 2000.- № 5.- С. 35-36.

3. Антипова, Л.В. Прикладная биотехнология / Л.В. Антипова, И.А. Глотова, А.И. Жаренов.- Воронеж, 2000.- 332 с.

4. Бакаринов, П.В. Модификация гепарином токсического действия ацетальде-гида // http://fibkh.Serpukliov.suA/"s99/tesis/Biomed/ ust/Bacarinov.html. 1999.

5. Баньковский, A.A. Изоферменты альдегиддегидрогеназы печени и их роль в предпочтении крысами этанола / A.A. Баньковский, Ю.Н. Островский, В.И. Сатановская // Вопросы медицинской химии.- 1986.- Т.32.- №2.- с. 34-36.

6. Безалкогольные напитки: медико-биологические аспекты обеспечения качества / Е.Т. Зуев, В.И. Гурьев, В.И. Еремец, Э.Ф. Токарик, Л.А. Ковальская // Пищевая промышленность.- 2001.- № 4,- С. 46-48.

7. Березов, Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин / Под ред. акад. АМН СССР С.С. Дебова.- М.: Медицина, 1990.- 528 с.

8. Бернхард, С. Структура и функция ферментов / Пер. с англ. Л.М. Гинодма-на и И.И. Рапановича. Под ред. и с пред. акад. А.Е. Браунштейна.- М.: Мир, 1971.-336 с.

9. Биохимия человека. В 2 т. / Р. Марри, Д. Греннер, П. Мейес, В. Родуэм. Пер. с англ. Т.1.- М.: Мир, 1993.- 382 с.

10. Блюгер, А.Ф. Мишень для алкоголя // Химия и жизнь. 1985.- №11.- С. 2833.

11. Божко, Г.Х. Роль ацетальдегида в механизмах действия этанола // Успехи физиологических наук.- 1990.- Т.21.- №3.- С. 98-114.

12. Божко, Г.Х. Сравнение взаимодействия этанола и ацетальдегида с компонентами хроматина ядер клеток печени крыс / Г.Х. Божко, Е.И. Хоменко // Вопросы медицинской химии.- 1988.- Т.34.- №2.- С. 19-23.

13. Бокий, И.В. Использования анализа активности алкогольдегидрогеназы и липидного состава крови в качестве дополнительных критериев для диагностики острой и хронической интоксикации алкоголем: Методические рекомендации.- Л., 1985,- С. 20.

14. Бородина, Г.Л. Состояние иммунитета липоперекисного окисления у больных алкоголизмом // 4 Научный съезд спец. по клин. лаб. диагност. Респ. Беларусь, 17-18 сентября, 1992: Тез. докл. / Гродн. гос. мед. ин-т.- Гродно, 1992.-С. 178-179.

15. Буеверов, А.О. Алкогольная болезнь печени / А.О. Буеверов, М.В. Маев-ская, В.Т. Ивашкин // Русский медицинский журнал.- 2001.- Т.З.- №2.- С. 61-65.

16. Бурмистров, С.О. Роль свободно-радикальных реакций в действии этанола на центральную нервную систему // Вопросы наркологии.- 1993- №6.- С. 25.

17. Буров, Ю.В. Поиск новых лекарственных средств для выведения из острой алкогольной интоксикации / Ю.В. Буров, С.Е. Меткалова, Л.Е. Давыдова // Вопросы наркологии.- 1994,- № 4.- С. 50-56.

18. Бутвиловский, A.B. Молекулярная эволюция алкогольдегидрогеназ класса I хордовых животных / A.B. Бутвиловский, Е.В. Барковский, В.Э. Бутвиловский // БМЖ.- 2007.- №2 (20).- С. 30-34.

19. Бутвиловский, A.B. Эволюционные дистанции и скорость эволюции нук-леотидных последовательностях мРНК алкогольдегидрогеназы класса IV мыши и человека // БМЖ.- 2005.- № 2 (12).- С. 23-29.

20. Васильева, P.A. Лечебно-профилактические свойства напитков из сыворотки // Известия вузов. Пищевая технология.- 1998.- № 2- 3.- С. 5-7.

21. Волкова, Т.А. Новые напитки на основе молочной сыворотки / Т.А. Волкова, Э.Ф. Кравченко // Сыроделие.- 2000.- № 3.- С. 41.

22. Волошин, П.В. Роль ацетальдегида в действии алкоголя на центральные катехоламинергические механизмы / П.В. Волошин, Т.П. Бойко, Г.Х. Бошко // Журнал невропатологии и психиатрии им. С.С. Корсакова.- 1991.- Т.91,-№10.- С. 63-65.

23. Вольд, И. Полиморфизм алкогольдегидрогеназы в польской популяции. / И. Вольд, М. Кваст // Алкоголизм и наследственность.- М.: Медицина, 1987.- С. 57-59.

24. Воронов, П.П. Этанолметаболизирующие ферменты семенников человека / П.П. Воронов, A.M. Хоха// Биохимия.- 1990.- Т.55.- №8,- С. 1451-1460.

25. Высокогорский, В.Е. Роль оксидоредуктаз и их множественных форм в метаболических процессах при алкоголизации и развитии алкогольной мотивации // Автореф. дис. д-ра мед. наук.- Томск, 1992, 42 с.

26. Высокогорский, В.Е. Роль оксидоредуктаз и их множественных форм в метаболических процессах при алкоголизации и развитии, алкогольной мотивации // Автореф. дис. д-ра мед. наук.- Томск.- 1992.- 42 с.

27. Гаврилова, Н.Б. Низколактозный кисломолочный напиток / Н.Б. Гаврилова, C.B. Мяло // Молочная промышленность.- 2005.- №12.- С. 44-46.

28. Гаврилова, Н.Б. Ферментированная молочная сыворотка // Молочная промышленность.- 2006.- №6.- С. 30.

29. Гаврилова, Н.Б. Биотехнология комбинированных молочных продуктов: Монография." Омск: Вариант-Сибирь, 2004.- 224 с.

30. Гаврилова, Н.Б. Современная технология комбинированных продуктов на молочной основе для специального питания / Н.Б. Гаврилова, О.В. Пасько.-Омск, 2003.- 110 с.

31. Горбатова, К.К. Биохимия молока и молочных продуктов: учебник.- М.: Колос, 1997.-288 с.

32. Груздева, К.Н. Ферменты окисления этанола и его метаболитов при острой алкогольной интоксикации и иммобилизационном стрессе / К.Н. Груздева, В.Е. Высокогорский, В.Г. Купор // Вопросы наркологии.- 1991.- № 4.- С. 2-4.

33. Дарбе, А. Практическая химия белка.- М.: Мир, 1989.- 623 с.

34. Диксон, М. Ферменты: Пер. с англ./ М. Диксон, Э. Уэбб.- М.: Мир, 1982.-Т1.-323 с.

35. Диксон, М. Ферменты: Пер. с англ./ М. Диксон, Э. Уэбб.- М.: Мир, 1982.-Т2.-515 с.

36. Диксон, М. Ферменты: Пер. с англ./ М. Диксон, Э. Уэбб.- М.: Мир, 1982.-ТЗ.- 1115 с.

37. Дроздов, Э.С. Алкоголизм: 100 вопросов и ответов / Э.С. Дроздов, Е.И. Зен-ченко.- М.: Сов. Россия, 1986.- 144 с.

38. Ермолаева, Г.А. Сырье для сокосодержащих напитков // Пиво и напитки.-2003.- №4.- С. 44-45.

39. Жидков, В.Е. Напитки из сыворотки / В.Е. Жидков, Г.И. Холодов, Ю.С. Чистова // Переработка молока.- 2002.- № 12 (38).- С. 20-21.

40. Жукова, Л.П. Напитки из молочной сыворотки с натуральными овощными соками / Л.П. Жукова, Э.Г. Жукова // Пищевая промышленность.- 2002.- № 4.- С. 78-79.

41. Захарова, Л.М. Кисломолочные белковые продукты с овсяными хлопьями / Л.М. Захарова, И.А. Мазеева, И.М. Пушмина // Пищевая промышленность.-2008.- №3.- С. 36-37.

42. Зиматкин, С.М. Активность альдегиддегидрогеназы мозга крыс в онтогенезе / С.М. Зиматкин, P.E. Лис // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии.-1990,- Т.98.- №5.- С. 27-33.

43. Зиматкин, С,М, Альдегиддегидрогеназа крыс при остром введении этанола / С.М. Зиматкин, Л.Е. Лис // Фармакология и токсикология.- 1988.- Т. 51.-№6.- С. 92-94.

44. Зиматкин, С.М. Особенности альдегидокисляющей системы мозга крыс, различающихся устойчивостью к алкоголю / С.М. Зиматкин, К.О. Линдрос // Вопросы наркологии.- 1990.- Т.98.- №5.- С. 20-23.

45. Зуев, Е.Т. Функциональные напитки: их место в концепции здорового питания //Пищевая промышленность.- 2004.- № 7.- С. 90-95.

46. Иванец, H.H. Алкоголизм. / H.H. Иванец, Ю.В. Валентик.- М.: Наука, 1988.- 176 с.

47. Ингибирование активности альдегиддегидрогеназы печени крыс цикло-пропилэтилсодержащими амидами бензойных кислот / О.В. Кислова, Е.Г. Виноградова, К.Л. Коноплицкая, Ф.Ф.Щербина // Украинский биохимический журнал.- 1993.- Т.65.- №6.- С 50-56.

48. Калинин, A.B. Алкогольная болезнь печени // Фарматека.- 2005.- №1.- С. 48-54.

49. Кершенгольц, Б.М. Биферментная система окисления этанола и ее роль в развитии алкоголизма / Б.М. Кершенгольц, В.Г. Алексеев, P.C. Тазлова // Биохимия алкоголизма: тез. докл. Всесоюз. симп.- Минск: Наука и техника.1980.- С. 69.

50. Кершенгольц, Б.М. Некоторые методические подходы к изучению метаболизма этанола / Б.М. Кершенгольц, Е.В. Серкина // Лабораторное дело.1981.-№2,-С. 126.

51. Кершенгольц, Б.М. Некоторые методические подходы к изучению метаболизма этанола / Б.М. Кершенгольц, Е.В. Серкина // Лабораторное дело.-1981.-№2.- С. 126.

52. Кислова, О.В. Сравнительная характеристика мембранных форм альдегид-дегидрогеназы / О.В. Кислова, Е.Г. Виноградова, Г.А. Пхакадзе // Украинский биохимический журнал.- 1995.- Т. 67.- №6.- С. 38-45.I

53. Кисломолочный напиток с пробиотиками «Лаэль» / И.А. Евдокимов, В.В. \ Крючкова, A.B. Серов, Д.В. Харитонов // Молочная промышленность. -2004.-№5.- С. 33-34.

54. Кольман, Я. Наглядная биохимия: пер. с англ. / Я. Кольман, К.-Г. Рем.- М.: Мир, 2000.- 472 с.

55. Коновалов, С.А. Биохимия дрожжей.- М.: Пищевая промышленность, 1980.-271 с.

56. Коноплицкая, К.Л. Влияние циклопропилэтилсодержащих аминов и амидов на изоферментные формы альдегиддегидрогеназы печени крыс / К.Л. Коноплицкая, О.В. Кислова, Е.Г. Виноградова // Химикофармацевтический журнал.- 1994.- Т.28.- №1.- С. 7-10.

57. Коноплицкая, К.Л. Субклеточное распределение и свойства альдегиддегидрогеназы печени крыс / К.Л. Коноплицкая, Г.И. Кузьмина, Л.А. Кузь-минко // Украинский биохимический журнал.- 1984.- Т.56.- №6.- С.624-628.

58. Коноплицкая, K.JI. Ферменты обмена этанола печени крыс с различной алкогольной мотивацией при острой алкоголизации / Коноплицкая K.JL, Мы-шенко Т.П., Запашун Т.Е. // Украинский биохимический журнал.- 1993.- Т. 65.- № 4,- С. 33-39.

59. Коноплицкая, K.JI. Ферменты основного пути метаболизма и их ингибиторы.- Киев: Наукова думка, 1992.- 116 с.

60. Корнеев, A.A. О биологическом значении ацетальдегида как клеточного регулятора дыхательной цепи митохондрий / A.A. Корнеев, И.А. Комиссарова // Успехи современной биологии.- 1994.- Т.114.- №2.- С. 212-221.

61. Кочетов, Г.А. Практическое руководство по энзимологии.- М.: Высшая школа, 1980.-272 с.

62. Кравченко, Э.Ф. Использование ресурсов вторичного молочного сырья / Э.Ф. Кравченко, Н.В. Плисов // Сыроделие и маслоделие.- 2005.- № 2.- С. 30-31.

63. Кравченко, Э.Ф, Состояние и перспективы использования молочной сыворотки // Сыроделие.- 2000.- № 2.- С. 28-29.

64. Крупин, A.B. Молочные напитки со спиртовыми морсами / A.B. Крупин, С.Г. Козлов // Молочая промышленность,- 2003.- № 5.- С. 42-43.

65. Кунижев, С.М. Новые технологии в производстве молочных продуктов / С.М. Кунижев, В.А. Шуваев.- М.: ДеЛи принт, 2004.- 202 с.

66. Куценко, С.А. Основы токсикологии,- СПб, 2002,- 302 с.

67. Куценко, С.А. Основы токсикологии. Научно-методическое издание.-СПб.: Фолиант,- 2004.- 720 с.

68. Кушнерова, Н.Ф. Регуляция метаболизма этилового спирта в организме олигомерными проантоцианидинами как способ профилактики его токсического воздействия / Н.Ф. Кушнерова, В.Г. Спрыгин, Ю.А. Рахманин // Гигиена и санитария.- 2003.- №5.- С. 58-61.

69. Лекции о влиянии алкоголя на организм человека. Алкоголь и потомство. / В.А. Таболин, С.А. Жданова, И.Н. Пятницкая, Г.А. Урывчиков.- М.: Высшая школа, 1988.- 110 с.

70. Линдрос, К.О. Альдегиддегидрогеназа мозга и ее возможное участие в патогенезе алкоголизма / К.О. Линдрос, Дж. Д. Синклер // Фармакология экспериментального алкоголизма: сб. ст.- Москва, 1982.- С 112-118.

71. Лиопо, A.B. Связывание ацетальдегида при его инкубации с эритроцитами человека у больных хроническим алкоголизмом / A.B. Лиопо, А.Е. Тейтель-баум, Ю.М. Островский // Вопросы наркологии.- 1992.- №1.- С. 62-63.

72. Логинов, A.C. Лекции о влиянии алкоголя на организм человека. Алкоголь и печень / A.C. Логинов, Ю.Е. Блок, К.Д. Джалалов.- М.: Высшая школа, 1987.- 96 с.

73. Маевская, М.В. Алкогольная болезнь печени // Клинические перспективы гастроэнтерологии,гепатологии.- 2001.- №1.- С. 4-9.

74. Мансурова, И.Д. Содержание этанола, малонового диальдегида и активность этанолокисляющей системы в сыворотке крови больных алкоголизмом при лечении тетурамом / И.Д. Мансурова, М.С. Истамкулов // Вопросы мед химии.- 1986,- Т.32.- №2.- С. 26-30.

75. Матвеева, И.М. Активность альдегидцегидрогеназы в эритроцитах больных алкоголизмом// Лабораторное дело.- 1988.- №1. С 16-19.

76. Матвеева, И.М. Активность альдегиддегидрогеназы в эритроцитах больных алкоголизмом / И.М. Матвеева, М.А. Петрова, М.С. Усатенко // Лабораторное дело.- 1991.- №6.- С. 20-24.

77. Метаболические предпосылки и последствия потребления алкоголя / Под ред. Ю.М. Островского, В.И. Сатановской, С.Ю. Островского и др.- Минск: Наука и техника, 1988.- 263 с.

78. Микронутриенты в питании здорового и больного человека: справочное руководство по витаминам и минеральным веществам / В.А. Тутельян, В.Б. Спи-ричев, Б.П. Суханов, В.А. Кудашева.- М., 2002.

79. Молекулярные механизмы действия эндогенного и экзогенного этанола / И.А. Комиссарова, А.Ю. Магалиф, Ю.С. Ротенберг, Ю.В. Гудкова // Известия Академии Наук СССР. Серия: Биологическая.- 1983.- № 2.- С. 260-267.

80. Молочные продукты для лечебно-профилактического питания детей ивзрослых, обогащенные бифидогенными факторами / П.Ф. Крашенинин, В.Н. Сергеев, Э.Г. Щербакова и др. // Обзорная информация. Серия «Молочная промышленность».- М.: АгроНИИТЭММП, 1995.- 46 с.

81. Мохно Г.Н. Переработка молока / Г.Н. Мохно.- Улан-Удэ: Издательство ВСГТУ, 2000.- 440 с.

82. Некоторые причины уменьшения активности альдегиддегидрогеназы печени и крови крыс при хронической алкогольной интоксикации / Б.М. Кер-шенгольц, В.Г. Алексеев, Е.М. Гаврилова, Н.Г. Ли // Вопросы мед. химии.-1985.- Т.31,- №1.- С.47-51.

83. Нечаев А.П. Пищевые добавки (понятие, аспекты современного использования в пищевых технологиях, проблемы, тенденции развития) // Пищевая промышленность.- 1998.- №6.- С. 12-15.

84. Нужный, В.П. Токсикологическая характеристика этилового спирта, алкогольных напитков и содержащихся в них примесей // Вопросы наркологии.-1995.-№3.- С. 65-74.

85. Орещенко, A.B. Пищевая комбинаторика теория разработки новых видов безалкогольных напитков / A.B. Орещенко, А.Д. Дурнев // Пищевая промышленность.- 1999.- № 9.- С. 15-17.

86. Остерман, Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот.- М.: Наука, 1985.- 536 с.

87. Островский, Ю.М. Биологический компонент в генезисе алкоголизма / Ю.М. Островский, В.И. Сатановская, М.Н. Садовник.- Минск: Наука и техника, 1986.- 95 с.

88. Островский, Ю.М. Этанол и обмен веществ. Под ред. Островского, Ю.М. Минск.- 1982.-С 38.

89. Оценка новой группы традиционных русских напитков сбитней / В.М. Позняковский, Н.Г. Бабанская, А.Н. Австриевских, A.A. Вековцев // Пиво и напитки.- 2002.- № 5.- С. 36-37.

90. Панченко, Л.Ф. Активируемая клофибратом альдегиддегидрогеназа перокси-сом печени крысы / Л.Ф. Панченко, C.B. Пирожков, В.Д. Антоненков // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины- 1982 T. XCIV.- №9.- С. 5255.

91. Пирожков, C.B. Роль альдегиддегидрогеназ в метаболизме малонового ди-альдегида в печени крысы / C.B. Пирожков, Л.Ф. Панченко // Биохимия.-1988.- Т.53.- №9.- С. 1443-1448.

92. ЮО.Писарницкий, А.Ф. Эффект окисления этанола ацетальдегидом // Виноград и вино России. 1993.- № 6.- С. 6-8.

93. Плакунов, В.К. Основы энзимологии.- М.: Логос, 2001.- 128 с.

94. Плетенева, Т.В. Токсикологическая химия.- М.: ГЭОТАР-Медиа, 2005.512 с.

95. Политика здорового питания. Федеральный и региональный уровни / В.Н. Покровский, Г.А. Романенко, Г.Г. Онищенко, В.А. Тутельян, В.М. Позняковский.- Новосибирск: Сибирское университетское изд-во, 2002.- 344 с.

96. Полыгина, Г.В. Определение активности ферментов. Справочник / Г.В. По-лыгина, B.C. Чередниченко, Л.В. Римарева.- М.: ДеЛи принт, 2003.- 375 с.

97. Помозова, В.А. Технология слабоалкогольных напитков: теоретические и практические аспекты / КемТИПП.- Кемерово, 2002.- 152 с.

98. Пономарева, А.Г. Напитки для реабилитации / А.Г. Пономарева, В.М. Медведев // Пиво и напитки.- 2001.- № 6.- С. 30-31.

99. Пономарева, А.Г. Масло, сыр и все из молока: учебник / Т.М. Пономарев, Г.Л. Беленький.- Ростов-на-Дону: Феликс, 2000.- 352 с.

100. Прогнозирование напитков на основе молочной сыворотки / А.Г. Храмцов, С.В. Василисин, И.А. Евдокимов, Т.С. Воротникова // Молочная промышленность.- 1996.- № 5.- С. 18-19.

101. Пронько, П.С. Концентрация ацетальдегида в крови у интактных крыс при алкогольной интоксикации и действии ингибиторов альдегиддегидрогеназы / П.С. Пронько, А.Б. Кузьмич, С.М. Зиматкин // Вопросы наркологии.-1993.-№3.- С. 40-42.

102. ПО.Россихина, Г.А. Новые молочные продукты с фруктовыми и стабилизирующими добавками // Молочная промышленность.- 1998.- № 2.- С. 15-16.

103. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов / И.М. Скурихин, В.А. Тутельян.- М.: Брандес, Медицина, 1998.- 340 с.

104. Сатановская, В.И. Система обмена этанола и ацетальдегида печени крыс при развитии толерантности к этанолу // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.- 1990.- T.CIX.- №2.- С. 161-162.

105. Семенихина, В.Ф. Кисломолочные продукты нового поколения / В.Ф. Се-менихина, И.В. Рожкова, М.Б. Сундукова // Молочная промышленность, 1999.-№7.-С. 29-30.

106. Сизенко, Е.И. Проблемы комплексной переработки сельскохозяйственного сырья и производства высококачественных пищевых продуктов // Хранение и переработка сельхозсырья.- 1999.- № 10.- С. 12-16.

107. И5.Скобелева, Н.В. Новый фитопродукт на молочной основе коктейль кефирный «Долюцар» / Н.В. Скобелева, A.B. Царьков // Молочная промышленность.- 2002.- № 8.- С. 38-39.

108. Скоупс, Р Методы очистки белков.- М.: Мир, 1985. 358 с.

109. Смирнова, И.А. Кисломолочные напитки с медом / И.А. Смирнова, H.A. Перова // Молочная промышленность.- 2007.- №10.- С. 76-77.

110. Степанов, В.П. Молекулярная биология. Структура и функции белков: учебник.- М.: Изд-во Московского университета: Наука, 2005.- 336 с.

111. Судовцов, В.Е. Алкогольдегидрогеназы цитозоля дрожжей Torulopsis candida//Биохимия.- 1976.- Т.41.- Вып. 12.- С. 2173-2178.

112. Судовцов, В.Е. Исследование активности алкогольдегидрогеназ из цитоплазмы клеток некоторых дрожжей // Прикладная биохимия и микробиология.- 1991.- Т.27.- Вып.1.- С. 61-67.

113. Судовцов, В.Е. К вопросу об электрофоретической оценке множественных молекулярных форм ферментов и их соотношениях на примере алкогольдегидрогеназы из цитозоля печени млекопитающих // Вопросы медицинской химии.- 1985.- Т.31.- Вып. 3.- С. 71-77.

114. Судовцов, В.Е. Сравнительное исследование влияние пиразола на активность ферментов семейства алкоголь/полиолдегидрогеназ // Прикладная биохимия и микробиология.- 1992.- Т. 28,- Вып.1.- С. 44-49.

115. Судовцов, В.Е. Условия непрерывной регистрации ферментативной активности // Биологические науки.- 1989.- №2.- С. 97-100.

116. Судовцов, В.Е. Физико-химические характеристики сорбидолдегидрогена-зы из цитоплазмы клеток печени быка / В.Е. Судовцов, Т.Ю. Жармухомедо-ва // Вопросы медицинской химии.- 1987.- Т.ЗЗ.- №3.- С.81-84.

117. Технология молока и молочных продуктов: Учебник / Г.В. Твердохлеб, З.Х. Диланян, JI.B. Чекулаева, Г.Г. Шиллер.- М.: Агропромиздат, 1991.- 463 с.

118. Теречик, Л.Ф. Молочная сыворотка и физиология питания // Сыроделие, 1999.-№ 1.- С. 15.

119. Тимофеева, Л.В. Динамика соматовегетативных показателей в условиях острого алкогольного опьянения / Л.В. Тимофеева, В.Л. Громов // Вопросы наркологии.- 1993.- № 3.- С. 43-46.

120. Уманский, М.С. Химия и физика молока: лабораторный практикум для студентов спец. 271100 «Технология молока и молочных продуктов».- Кемерово, 2001.

121. Ферментированные напитки из молочной сыворотки с пробиотиками // Вестник международной академии холода.- 1999.- № 1,- С. 47.

122. Фершт, Э. Структура и механизм действия ферментов.- М.: Мир, 1980.432 с.

123. Харитонов, В.Д. Краткий справочник специалиста молочной промышленности / В.Д. Харитонов, Ю.А. Незнанов.- СПб.: ГИОРД, 2003,- 128 с.

124. Харитонов В.Д. Проблемы и перспективы молочной промышленности XXI века // Хранение и переработка сельхозсырья, 2002. №11.- С. 16-18.

125. Храмцов, А.Г. Биотехнология напитков из молочной сыворотки: Технологическая тетрадь / А.Г. Храмцов, В.Е. Жидков, Г.И. Холодов.- Ставрополь, 1996.- 146 с.

126. Храмцов, А.Г. Молочная сыворотка.- М.: Агропромиздат, 1990.- 240 с.

127. Хромцов, А.Г. Продукты из обезжиренного молока, пахты и молочной сыворотки / А.Г. Хромцов, Э.Ф. Кравченко, К.С. Петровский.- М.: Легкая и пищевая промышленность, 1982.- 296 с.

128. Храмцов, А.Г. Реализация инновационных технологий переработки молочной сыворотки // Переработка молока.- 2009.- №5.- С.8-11.

129. Храмцов, А.Г. Мировые тенденции в переработке сыворотки / А.Г. Храмцов, С.А. Рябцева // Переработка молока,- 2009.- №5.- С. 18-20.

130. Шабанов, Д.А. Биология алкоголизма / П.Д. Шабанов, С.Ю. Калишевич.-СПб.: Издательство «Лань», 1998.- 272 с.

131. НО.Шаманова, Г.П. Микробиологические и технологические аспекты производства продуктов функционального питания // Молочная промышленность.- 1998.- № 1.- С. 16-18.

132. Шидловская, В.П. Органолептические свойства молока и молочных продуктов: Справочник.- М.: Колос, 2000.- 280 с.

133. Шингарева, Т.И. Исследование процесса ферментации молочной сыворотки / Т.И. Шингарева, О.И. Купцова // Хранение и переработка сельхозсы-рья.- 2006.-№ 1.- С. 28-31.

134. Шубина, О.Г. Функциональные добавки в напитках / О.Г. Шубина, Ю.Г. Околелова // Пищевая промышленность,- 2001.- № 5.- С. 25-26.

135. Экспертиза напитков / В.М. Позняковский, В.А. Помозова, Т.Ф. Киселева, JI.B. Пермякова.- Новосибирск, 1999.- 334 с.

136. Этиловый алкоголь / Н.П. Скакун, А.С. Саратиков, А.Н. Олейник, А.И. Венгеровский.- Томск: Издательство Том. Университета, 1985.- 135 с.

137. Consalvi Valerio. Human alcoholdehydrohenases and serotonin metabolism / V. Consalvi, Mardh Goran, Vollee Bert L. // Bio-chem. and Biophys. Res. Commun.- 1986,- 139.- № 3,- P. 1009-1016.

138. Dianzanl, M.U. Lipid peroxidation in ethanol poisoning:a critical reconsideration / M.U. Dianzanl // Alcohol and Alcohol.- 1985.- 20.- № 2.- P. 167-173.

139. National Institute of Alcohol Abuse and Alcoholism. Fetal alcohol syndrome. Alcohol Alert 13 (PH295): 1-4, July 1991.

140. Spohr, H.L. Prenatal alcohol exposure and long-term developmental consequences. Lancet / H.L. Spohr, J Willms, H.C. Steinhausen.- 341:907.- 910.- 1993.

141. Yoshihara S. Purification and characterization of hepatic aldehyde oxidase in male and female mice / S. Yoshihara, K. Tatsumi // Arch. Biochem. Biophys.-1997.- V. 338.-№ l.-P. 29-34.

142. Yoshida A. Genetic polymorphisms of alcohol metabolizing enzymes related to alcohol sensitivity and alcoholic diseases / A. Yoshida // Alcohol and Alcoholism.- 1994.-V. 29.- № 6.- P. 693-696.

143. Zgombic, M. DNA elements mediating retinoid and thyroid hormone regulation of alcohol dehydrogenase gene expression / M. Zgombic, G. Duester // Adv. Exp. Med. Biol.- 1993.- V.328.- P. 571-580.

144. Vrij-Standhardt, W.G. Effects of alcohol on the metabolism of macronutrients / W.G. Vrij-Standhardt // Biomed. and Soc. Aspects of Alcohol Use: A Review of Literature.- 1991.- P. 62-71.

145. Azzalis, L.A. Absence of stimulation of hepatic microsomal ethanol oxidizing system (MEOS) by chronic ethanol feeding in rats /. L.A. Azzalis, K.A. Simon, L. Giavarotti et al. // Biochemical Archives.- 1994.- V. 10.- № 4.- P. 221- 235.

146. Tuma, D.J. Acetaldehyde and malondialdehyde react together to generate distinct protein adducts in the liver during long-term ethanol administration. / D.J. Tuma, G.M. Thiele, D. Xu // Hepatology.- 1996.- V. 23.- № 4.- P. 872-880.

147. Adachi J. Acetaldehyde-induced formation of 1-methyl-1,2,3,4-tetrahydro-beta-carboline-3-carboxylic acid in rats. / J. Adachi, Y. Uen, Y. Ogawa et al. // Bio-chem. Pharm.- 1993.- V. 45.- № 4.- P. 935-941.

148. Agarwal, D.P. Racial differences in biological sensitivity to ethanol: the role of alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase isozymes / D.P. Agarwal, S. Ha-rada, H.W. Goedde // Alcohol.: Clin, and Exp. Res.- 1981.- V. 5.- № 1.- P. 12-16.

149. Chen, W.J. Alcohol-metabolizing genes and alcoholism among Taiwanese Han men: Independent effect of ADH2, ADH3 and ALDH2 / W J. Chen, E.W. Loh, Y.P. Hsu et. al. // British J. of Psychiatry.- 1996.- №168.- P. 762-767.

150. Takagi T. Assessment of the role of non-ADH ethanol oxidation in vivo and in hepatocytes from deermice / T. Takagi, J. Alderman, J. Gellert, C.S. Lieber // Biochemical Pharmacol.- 1986.- V. 35.- № 20.- P. 3601-3606.

151. Agarwal, D.P. Aldehyde dehydrogenase from humun erythrocytes: structural relationship to the liver cytolic isozymes / D.P. Agarwal, P. Cohn, H.W. Goedde, J.Hempel // Enzyme.- 1989.- Vol.42.- №1.- P. 47-52.