автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.10, диссертация на тему:Интенсификация гидролиза в биотехнологии и пищевой промышленности



Государственный комитет Российской Федерации по высшему образованию

Москоаская Государственная Академия пищевых производств

На правах рукописи

Тырош Юрий Александрович

УДК 663.12 ; 663.153.22(043.3) 661.731.9 ; 66,095.131 ; 665.3.011.002.5 ; 655.112

ИНТЕНСИФИКАЦИЯ ГИДРОЛИЗА В БИОТЕХНОЛОГИИ И ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

Специальности: 05.10.10 - Технология витаминных, ферментных

н белковых препаратов, чая и табака 05.18.00 - Технология жиров, эфирных масел и

парфюмерно-косметических продуктов

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора технических наук

Москва 1903

Работа выполнена в Московской Государственной Академии пищевых производств.

Официальные оппоненты:

заслуженный деятель науки и техники Российской Федерации, доктор технических наук, профессор U.C. Арутюшш доктор технических наук, профессор Р.Н. Гребсшова доктор технических наук, профессор С.Е. Траубенберг

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт прикладной биотехнологии

Защита состоится декабря 1993 г. в 10.00 часов на заседании специализированного совета Д.063.51.03 Московской государственной Академии пшцевых производств по адресу: 125080, Москва, А-80, Волоколамское шоссе, д. 11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГАПП. Автореферат разослан 8 ноября 1993. г.

Учёный секретарь специализированного совета, к.т.н., доцент

.(¿u3¿< ^АА. Иванова.

1. Общая характеристика работы.

Актуальность работы. Гидролиз, как комплекс обратимых обменных реакций леофильного замещения с участием органических соединений и воды, очень пространен в природе. Важность этих реакций трудно переоценить в обмене (еств живых организмов и в технологической деятельности человека - особенно в технология, медицине, пищевой, фармацевтической, парфюмерной, химической, >техимической и других отраслях промышленности.

Структурные компоненты наиболее важных биомолекул, таких как нуклеи-ые кислоты, белки, липиды, углеводы (олиго- и полисахариды типа гликогена, хмала, целлюлозы и т.п.), а также ряда других природных и полученных путем [ического синтеза соединений, как, например, некоторые алкалоиды, нейромеди-ры, лекарственные препараты, душистые вещества, глифталевые смолы, синтети-кие ткани (найлон, капрон и т.п.), поверхностно активные вещества и т.д., динекы так называемыми "ангидридными" связями, или эфирными в широком шманни этого слова. Эти связи образуются при отнятии молекулы воды или при той эквивалентной реакции в процессе анаболизма в живом организме или шческого синтеза.

Известно, что к эфирным связям, способным подвергаться гидролизу, относя пептидные, амидные, гликозилиминные (Ы-гликозидные), сложноэфирные, >стые эфирные, фосфоэфирные, фосфодиэфирные, фосфоангидридные, кислые :фоангидридные, гликозидные, тиогликозидные, тиоэфирные, сульфоэфирные \ьфатные), сульфонатные, ангидридные и некоторые другие.

Соединения с таким типом связей составляют основной объём органической •ерии на нашей планете и осуществление их синтеза и гидролиза в живой фоде и в технологических процессах имеют первостепенное значение, этехнологи и химики по-разному подходят к технической реализации этих 1КЦИЙ в промышленности. Первый подход заключается в биокатализе и разработке >ых технологий производства гидролитических ферментов, таких как амилазы, зтеиназы, липазы, целлюлазы и др. На их основе разрабатываются экономичные и «логически безопасные технологии переработки природного органического сырья, нако, несмотря на крупные успехи в этой области, остается много невыясненного «учении тонких механизмов ферментативного гидролиза. Имеются громадные 1ервы в разработке новых технологий непрерывного гидролиза и синтеза на юве иммобилизованных ферментов н интенсификации существующих технологий базе новых научных данных. Перспективным может оказаться также применение зых генно-инженерных штаммов - продуцентов гидролаз в пищевой умышленности, биотехнологии и очистке сточных вод.

Второй путь заключается в разработке технологий гидролиза и синтеза !динекий эфирной природы на основе гомогенного кислотного катализа, где в гестве доноров протонов применяются минеральные и органические кислоты, что ¡дает определенные технологические и экологические проблемы. Лишь недавно

1-1-4843

начались работы по созданию доноров протонов на твердых носителях ^ гидролитических процессов. Применение для этой цели известных катиотп ограничено, в первую очередь, из-за их низкой термостойкости и плохих гид} динамических характеристик при работе в проточпых реакторах колонного типа.

Как биотехнологический, так и химический подход к технологическому реи нию задач гидролиза и синтеза эфирных связей имеют свои перспективы и резер! Оба подхода могут быть не только альтернативными, но и взаимодополняемыми.

Решение всех вышеперечисленных задач путём разработки новых прогресс! ных или интенсификации уже существующих технологий гидролиза на оснс ферментных препаратов или нового поколения полимер-минеральных термостойк сульфокатионитов несомненно расширит наше понимание тонких механизм каталитического гидролиза и внесет в клал в ресурсо- и энергосбережение, позвол улучшить экологическое состояние ряда производств.

О важности и актуальности работы свидетельствует также и то, что о выполнялась в соответствии с комплексными программами ГКНТ СССР 0.38.07., заказам жироперерабатывающей промышленности (гос. регистрационный ном 0189004864) и в рамках сотрудничества с Болонским Университетом (Италия) Университетом Хоенхайм в Штутгарте (Германия).

Цель работы и направления исслелований. Основной целью работы являлс сравнительное изучение механизмов кислотного каталитического гидролиза с испо, зованием химических и биокатализаторов, теоретическое обобщение, научи обоснование и практическая разработка новых эффективных, экологически безо™ ных и менее энергоемких технологий гидролитических процессов применительно пищевой, микробиологической, химической промышленностям и биотехнологии, пищевой промышленности основной упор в разработке новых подходов веден гидролиза был сделан на переработку жиров, хлебопечение, гидролиз Сахаров крахмала. В биотехнологии предметом исследования было получение микробн: гидролаэ (глкжоамилаза, а-амилаза, липаза, протеиназа и др.), изучение их свойс механизмов регуляции их биосинтеза и секреции, способов иммобилизац! создание новых генно-инженерных штаммов - продуцентов. В химической облас исследования основной целью работы была разработка нового поколения катали: торов гидролиза и создание на их основе технологий непрерывного гетерогеннс катализа.

Поставленная цель достигалась решением следующих задач :

- системное изучение механизмов регуляции биохимических н микробиоло; ческих процессов в модельных системах (на гидролитических комплексах, состоящ из амилолитических, протеолитичесхих, липолитических и других ферментов);

- разработка технологий получения ферментных препаратов гидролитическс действия (глюкоамилаза, липаза) и научно-теоретическое обоснование их приме] ния в хлебопечении, жиропереработке и других областях биотехнологии и хи> ческон промышленности;

- реализация теоретических разработок на примере тестоприготовления, созда-е биохимической модели "идеального" хлеба и научно-теоретическое обоснование тей формирования качества хлеба изменением интенсивности гидролитических оцессов;

- научное обоснование и создание генно-инженерных штаммов пекарских дрож-2Й, синтезирующих и секретирующих глюкоамилазу, и-испытание их в хлебопече-ш и при утилизации крахмала сточных вод;

- разработка способов иммобилизации липазы и экспериментальное подтвер-а,ение возможности применения фермента в гидролизе жиров и синтезе восков и >ушх сложноэфирных соединений;

- научное обоснование и создание нового поколения полимер-минеральных тер-эстойких сульфокатионитов (на основе дешевого сырья и отходов химического и гдролизного производства) для гетерогенного высокотемпературного гидролити-зского катализа в химических процессах, жиропереработке и других областях;

- разработка на основе системного подхода единой универсальной химической одели кислотного гидролиза, синтеза и переэтерификации при химическом и (ерментативном катализе, позволяющей прогнозировать пути их интенсификации и эздание на ее базе химической модели функционирования активных центров идролаз и сульфокатионитов.

Научная новизна. Впервые выделен из культуры Епёотусорн'з яр. 20-9, очищен о гомогенного состояния фермент глюкоамнлаэа и исследованы его каталитические войства. Показано, что в каталитический центр глкжоамилазы входят серии и ирозин.

Изучение механизма регуляции синтеза и секреции глкжоамилазы •.пёотусорвк ¡р. 20-9 выявило, что регуляция осуществляется уровнем концентрации фермента в среде и добавление ряда соединений (некоторых ПАВ, Р-меркапто-»танола, "улиточного фермента" (комплекс из * 30 ферментов, преимущественно идролаз)) значительно усиливает секрецию фермента в среду.

На основе экспериментальных данных комплексных исследований разработана концепция прогнозирования и формирования качества хлеба путем регулирования гидролитических реакций в процессе тестоприготовления.

Впервые на модельных системах проведено изучение влияния глкжоамилазы Епскзтусорзк. зр. 20-9 на формирование качества хлеба. Генно-инженерными методами созданы новые штаммы пекарских дрожжей, способные к синтезу и секреции глкжоамилазы, росту на крахмале и обладающие хорошими пекарскими свойствами.

Из полученного по нашей технологии ферментного препарата "Липоризин ГЗХ" (продуцент ЯЬугория огугае) была выделена, очищена и охарактеризована липаза. Осуществлена её иммобилизация. Показана возможность применения липаз не только в гидролитических реакциях, но и в реакциях органического синтеза соединений сложноэфирной природы, таких как воски или аскорбил-6-пальмитат в микроводных средах.

1-Г

Научно обосновано создание нового поколения термостойких полим< минеральных сульфокатионитов путём поликонденсации ряда отходоп химическо! гидролизной промышленности на гранулированном алюмосиликате или цеолите технологий их применения в процессах гетерогенного катализа гидролиза и сини некоторых органических соединений сложноэфирной природы (нейтральные жир фосфолипиды, воски и т.п.) и гликозидной природы (ди- и олигосахариды растворимые полисахариды типа инулина и амилозы).

Получены новые данные о структуре дрожжевой клеточной стенки, ро белков и полисахаридов в её формировании, роли некоторых ферментов по/ фосфатного обмена (фосфогндролаз) в клеточном цикле дрожжей и их взаимосвяз! обменом нуклеиновых кислот.

Предложена единая универсальная схема кислотного гидролиза, синтеза переэтерификацни при химическом и ферментативном катализе и на ее осно разработана химическая модель функционирования активных центров гидролаз сульфокатионитов.

Практическая значимость, Разработана технология культивирования End mycopsis sp. 20-9 - продуцента глюкоамилазы, и схема выделения и очмсп фермента. Получен высокоочищенный препарат глюкоамилазы в опытно-промьн ленных условиях.

На основе разработанной концепции формирования и прогнозирования к чества хлеба был подобран и рекомендован ряд соединений (глюкоамилаза, мети нин, аскорбил-6-пальмитат и др.), позволяющих регулировать метаболизм дрожжей улучшать качество хлеба, особенно при интенсивных технологиях (A.C. 1630747).

Получены новые штаммы пекарских дрожжей Saccharomyces ccrevisiae ВКП1 У-1320 с высокими технологическими показателями (A.C. 4852331) и на их ochoi генно-инженерными методами получен штамм Saccharomyces cercvisiae ВКПМ У-153 обладающий способностью к синтезу и секреции глюкоамилазы, росту на крахмал а также с повышенными пекарскими качествами (A.C. 1742320). Показана возмоя нссть замены мелассы на крахмалсодержащее сырье в культуральной средс пр производстве пекарских дрожжей на основе нового штамма, что значительи удешевляет их производство.

Показана высокая эффективность применения новых штаммов глюкоамила; ных дрожжей при ускоренных технологиях хлебопечения нз муки с пониженным хлебопекарными свойствами.

Предложен способ применения новых штаммов глюкоамнлазных дрожжей дл утилизации крахмала крахмалсодержащих сточных вод картофелеперерабатывающн предприятий и крахмалопаточных производств, что позволяет одновременн очистить сточные воды от крахмала и получить дрожжевую биомассу д\я корме производства.

Экспериментально доказана перспективность и реальность разработки новы, технологий гидролиза и синтеза соединений сложноэфирной природы с использова иием иммобилизованных липаз.

Разработана технология нового поколения термостойких полимер-минеральных ьфокатионнтов ш дешевого сырья. Установлена высокая эффективность примене-: полученных сульфокатионитов п качестве катализаторов п процессах гидролиза тральных жиров и фосфолипндов, а также синтеза метиловых эфиров жирних лот, аналогов природных восков и других сложных эфиров. Указанные процессы лизованы D реакторах проточного типа при 100-220'С, при этом достигали90-99% ¡версии н почти количественной селективности образования целевых эфирог казана возможность гидролиза триацилглицеролов (саломаса, растительного масла, рона дистилляции жирных кислот) с целью получения глицерина и жирных лот при упрощении технологии и переводе её на непрерывный процесс, ращении энергозатрат и повышении содержания глицерина в глицериновой воде 20%. Разработаны рекомендации для внедрения предложенной технологии на сковском жировом комбинате. Это позволит сократить отходы производства и ;ти им новые области применения (A.C. 1662984).

Системный анализ полученных данных и разработка универсальной схемы лотного гидролиза, синтеза и переэтерификации при химическом и фермента-ном катализе позволяют прогнозировать оптимальные пути интенсификации ролитических и обратных процессов в существующих и разрабатываемых новых нолошях.

Теоретические положения данной работы используются в учебных курсах "Хи-I жиров" и "Биохимические основы биосинтеза биологически активных веществ", аемых автором. Методические приемы, отработанные в процессе научных последний, систематизированы, изданы отдельными сборниками и используются в бном процессе.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались к обсуждались следующих съездах, симпозиумах, конгрессах, конференциях и коллоквиумах :

Всесоюзное совещание "Кристаллические ферменты" (Вильнюс, 1975); Всесоюз-: конференция "Научные основы технологии промышленного производства вете-трных биологических препататов" (Москва, 1978); Международный симпозиум \ерации европейских микробиологических обществ (FEMS) "Регуляция мнкробно-метаболизма факторами внешней среды" (Пущино, 1983); Всесоюзная конферен-г "Пути совершенствования технологических процессов и оборудования для шзводства, хранения и транспортировки продуктов питания" (Москва, 1984); 1-я союзная конференция молодых ученых "Современные проблемы биохимии и зико-химическон биологии" (Москва, 1985); Съезд Всесоюзного биохимического цества (Киев, 1985); 5-я Научная конференция Национального института легкой »мышленности (Бумердес, 1987, Алжир);ХП/ Менделеевский съезд по общей и неладной химии (Ташкент, 1989); 1 Международный конгресс по лип идам (Анже, 9, Франция); Конференция по прикладной химии, процессам и аппаратам латонфюред, 1989, Венгрия); X Международный конгресс по химической техноло-и оборудованию (Прага, 1990, Чехословакия); 33-н Симпозиум IUPAC по м<зкро-№кулам (Монреаль, 1990, Канада); 1 Национальный конгресс по химии питания 1-2-1813

(Мессина, 1990, Италия); VI Симпозиум по ионному обмену (Будапешт, 1 Венгрия); Международный симпозиум по полимерным материалам (Мельбурн, 1 Австралия); Научная конференция МТИПП "Научное обеспечение хранен!» переработки растительного сырья в пищевой промышленности" (Москва, 1991); Конференция молодых ученых и специалистов МТИПП (Москва, 1991); 2-й Еврог ский технический симпозиум по полиимидам и высокотемпературным полиме (Монпелье, 1991, Франция); Симпозиум ШРАС "Рецикл полимеров, наука и техн< гия" (Марбелла, 1991, Испания); 4-я Конференция "Биоантиоксидант" Инсткп химфизики РАН (Москва, 1992); 3-й Европейский технический симпозиум полиимидам и высокотемпературным полимерам (Монпелье, 1993, Франция); Кол/ виум по биотехнологии Института Биотехнологии РейнскоВестфальской Техничес; Высшей школы (Аахен, 1993, Германия).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 60 работ в отеч« венных и зарубежных журналах, в материалах Международных и всесоюз» съездов, конгрессов, симпозиумов и конференций. Имеется 4 авторских свидет« ства на изобретения.

Структура диссертации, Диссертация состоит из введения, аналитическ обзора, методической части, экспериментальной части, выводов, списка литератур) приложения нормативно-технической документации и актов испытаний. Структ ная схема направлений научных исследований, представленных в диссертациош работе, показана на рис.1.

2. Основное содержание работы.

Представленная'работа является обобщением научных исследований, провед ных в период с 1973 г. по 1993 г.

Различные разделы работы выполнялись на кафедрах "Молекулярная био. гия" Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова, "Биотехно, гия микробных производств и экологическая безопасность", "Технология жиров биоорганического синтеза", "Технология хлебопекарного, кондитерского и макар< ною производств" Московской Государственной Академии Пищевых Производс "Органическая химия и химия нефти" Государственной Академии Нефти и газа им И.М.Губкина, "Растительные масла и жиры" Института Аграрной Индустрии Бол< ского Университета (Италия), "Технология жиров", "Органическая химия" Нац) нального Института Легкой Промышленности (Алжир), в лаборатории "Иммоби/ зация ферментов и клеток" ВНИИ "Биотехнология" и в лаборатории "Оптимизап экспрессии генов" ВНИИ Генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

2.1. Объекты и методы исследований.

В работе в качестве источников гидролитических ферментов использова ытаммы дрожжеподобных микроскопических грибов Епйотусор$1в вр. 20-9 (МТИП1 дрожжей ЗассЬаготусс.ч ссгетзгае - промышленных (ЛВ-7, АО ВНИИХП; 4 ВНИИГенетнка) и лабораторных (с геном глюкоамилазы из 5ассЛатотуссз (Иая1аИ(

к

и >

я >

I

£

£

а

О

-о Щ

и

г

ч сг

£ Я

О и • ст; 2 га

[гидролитический слабокислотный катализ

[ферментативный гидролиз

амилолитические ферменты

[химический гидролиз^ [фосфогидролазы 1 [гомогенный катализ"

[гетерогенный катализ"

в > I

г- >

ю и) >

51

? I

м ш

Я >

т; в 3 X 0) я в

ы т и>

n -1

—* >

К) ы

СП >

3

— о о ¡5'

Сл а ч и

1С. 5 о

■=5 *

К о*

* в

н 0

£ I.

а

0

1

получение ферментных препаратов и характеристика; изучение механизма регуляции синтеза и секреции; получение генно-инженерных штаммов'

5

о "О

получение пре-

ферментного парата и хар-ка; иммобилизация; метод гидролиза и синтеза сложных эфиров

г ё

5 3

У з л

регулирование биохимического состава качества хлеба

и

г

р

а к1

п> и

Ся С» 1л

п

о- а

Изучение и/, роли а обмене полифосфатов и синтезе нуклеиновых кислот

Синхронизация дрожжей

И

Е а

п ¿Г

0 о

54 з

§ *

X 21

1

I

> Я

ь» и и О х

I

5

го

В >

Т

^ п

5 <

5 о"

I

х о

„ ^

п з

3 в

в т

термостойкие полимермине-ральные суль-фокатиониты (новое поколение - пссс на минеральном носителе)

п

ГП

-о

х >

а *

з:

о ь О

-I >

ацетон, ацетилацетон, ацетофенон, нафталин, уксусная к-та,

лигнин, поливиниловые спирты

технология их промышленно-

го получения (в т.ч. на основе отходов); технология непрерывного гидролиза жиров с получением жирных кислот и глицерина; до-расщепление гудрона дистилляции жирных к-т; технология непрерывного синтеза аналогов природных восков и других сложных эфиров; гидролиз фосфолипидов; гидролиз САХАРОВ и полисахаридов_

сравнительное изучение процессов гидролиза для выявления общих закономерностей; построение универсальной модели кислотного катализа и определение путей интенсификации этих процессов

А

ь.

и др., ВНИИГенетика), дрожжей Schizosaccharomyces pombe (ВК.ПМ ВНИИГенетш хрибов Rhizopus oryzae (МТИПП), бактерий Bacillus subtilis (МГУ), фермента препараты "Липоризин ГЗх", "Глюкаваморин ПОх", "Амилосубтнлин Г10х", "улит ный фермент", выделенный из кишечника виноградной улитки Helix pomatia, ш ничную муку 1 сорта. В качестве химических катализаторов гидролиза использов* синтезированные полимер-минеральные термостойкие сульфокатиониты типа "Ф лосорб" и "Лигносорб". В качестве субстрата ферментативного и химическ катализа использовали крахмал картофельный, крахмал картофельный растворим (амилозу), крахмал кукурузный, крахмал пшеничный, крахмал рисовый, инулин топинамбура, сахарозу, лактозу, оливковое масло, подсолнечное масло, триацет трибутирин, трикаприлин, суммарные фосфолипиды дрожжей Candida utilis, разл ные жирные кислоты и алифатические спирты.

В работе применяли общепринятые и специальные физические, фиэи химические, химические, биохимические, микробиологические, генно-инженерн органолептические методы исследований, в том числе хроматографические, элект форетические, спектрофотометрические, колориметрические, изоэлектрофокуси вание, ультрацентрифугирование, электронную микроскопию (Тырсин, 1978 а, б, i 1985; Tyrsin, 1980 a, b; и др.).

Проводили статистическую обработку полученных экспериментальных дань с целью определения однородности собранного материала, его достоверности точности с позиции принятого уровня значимости (ошибка не более 3%).

Непосредственный обсчет числового массива и графическое представле! полученных экспериментальных данных осуществляли на ЭВМ IBM PC/AT 38i использованием программы "CHEMCAD" ("Chemstations", Хьюстон, США).

2.2. Исследование условий продуцирования ферментов выделения фермент! препаратов гидролитического действия и их применение.

2.2.1 Получение гомогенной глюкоамилазы, продуцируемой дрожжеподоби грибом Endomycopsis sp. 20-9, и ее характеристика.

2.2.1.1. Сравнительное изучение методов осаждения и очистки глюкоамилазь

Были проведены предварительные исследования влияния различных катио на активность глюкоамилазы в фильтрате культуральной жидкости. Оказалось, катионы Fe^+, Си2 + , и РЬ2+ обладают сильно ингибирукпцим действи

Zn2 + , Са2 + , Mg2+ снижали активность глюкоамилазы на 10-15%. U+, К + , N« Ва2 + , Са2 + , Мп2 + , Со^+ и практически не влияли на ферментатив!

активность при концентрациях солей в интервале 0,005-0,1М. Активируют действия не было обнаружено.

pH-Стабильность глюкоамилазы была в интервале 4,0-8,0 (от 2 до 24 ч. инк} ции) при 20-22'С.

В качестве осадителен били изучены этанол, изопропанол, ацетон и таш Наилучшие результаты осаждения были получены с ацетоном в соотношении I

ш температуре около О'С. Фильтрат культуральной жидкости предварительно конвоировали методом ультрафильтрации до содержания сухих веществ около 4,5%.

Полученный ферментный препарат ресуспендировали в специально подобран->м 0.05М фосфатно-цитратном или ацетатном буферном растворе. Далее глюко-шлаэу, а-амилазу, мальтазу и небольшое количество протеазы, присутствующие в ом препарате, разделяли разработанным нами методом ионообменной хромаго-афнн на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой. Десорбцию осуществляли линейной адиентной по ионной силе элюцией раствором ЫаС1 в ацетатном буфере (рН 6,2) 0,2М до О.ЗМ. Основная часть глюкоамилазы элюировалась при концентрации ли 0,23-0,25М.

Дальнейшую очистку проводили методом гель-фильтрации на колонке с рилексом П-100 в 0,05М ацетатном буфере (рН 6,2), после чего удельная активность юкоамилязы возросла в 1,52 раза. 'Фракцию элюата, содержащую глюкоамилазу, ализовали и лиофильно высушивали. Проведённые исследования легли в основу емы получения высокоочищенной глюкоамилазы (рис. 2), которая была испытана в лупромышленных условиях на Московском опытном заводе ферментных 1впаратов. По этой схеме выход практически гомогенного фермента достигает 25%, очистка 37 крат. Гомогенность глюкоамилазы устанавливалась применением мплекса химических, физических и физико-химических методов. Результаты ьтрацеитрифугирования свидетельствуют, что мы имеем однородный по моле-лярной массе белок с коэффициентом седиментации 4,3 Б. Изоэлектрическая жусировка глюкоамилазы в градиенте рН 3-10 показала, наличие одного белка с оэлектрической точкой в интервале рН 3,80-3,85. При диск-электрофорезе в лиакриламидном геле (рН геля 8,9; рН электродного буферного раствора 9,5) юкоамилаза также давала только одну белковую зону, в то время как исходный епарат, осажденный ацетоном из культуральной жидкости, делился на 5 мпонентов.

Таким образом, результаты, полученные методами с хорошей разрешающей особностью, свидетельствуют, что получена гомогенная глюкоамилаза. В дальней-;м она использовалась для изучения кинетики гидролиза, субстратной специфич-сти, рН- и температурных оптимумов и стабильности, молекулярного веса, амино-слотного и углеводного составов, характеристики активного центра, а также в спериментах по регулированию биохимического состава и качества хлеба (раздел !.3.в.).

2.2.1.2. Изучение структуры и свойств глюкоамилазы.

Изучение субстратной специфичности и механизма действия гомогенной юкоамилазы проводили, используя в качестве субстратов углеводы с различным пом связей и степенью полимеризации. Было показано, что глюкоза в р-кномерной )рме является единственным низкомолекулярным продуктом на всех стадиях дролиза крахмала. Это свидетельствует об отщеплении глюкозы с нередуцирующих нцов молекулы крахмала с инверсией конфигурации и о том, что глюкоамилаза 1-3-4843

Рис. 2. Схема выделения и очистки глкжоамилазы (ГА) из культуральной жидкости Еп/Зотусоруэ зр. 20-9.

обладает стереохимической специфичностью к конфигурации расщепляемой связи

продуктов гидролиз

Табл. 1. Гидролиз крахмала глюкоамилазой ЕпдатусорьЫ 20-9

Крахмал Гидролиз субстрата во времени, ч., %

0.25 0.67 2,0 17.5 24,0

Картофельный 18,0 32.4 62.5 92,0 98.6

Кукурузный 17.4 28.1 72,0 94,0 98,0

Пшеничный 18.2 34.1 69.3 94.8 99.4

Рисовый 14.8 26.2 61.7 89.4 96.8

Расторимый кяртофельиый 20.3 52,0 63.9 92,0 98,0

Это указывает 1 прохождение реакщ однократного нукле филыюго замещеш типа

Гидролиз ид практически полно

ью до глюкозы и степень гидролиза не зависит от вида крахмала (табл. 1).

Сравнительное изучение способности глюкоамилазы Endomycopsis sp. 20-9 идролизовать субстраты с различными типами связей показало, что выделенный >ермент гидролизует а-гликозидные связи в крахмале, амилозе, амилопектние, [альтозе, мальтотриозе и изомальтозе. Однако скорость реакции была различной и величивалась с повышением степени полимерности субстрата. Низкая степень идролиза изомальтозы по сравнению с мальтозой свидетельствует о том, что в исахаридах скорость гидролиза а-1,4 связей выше, чем а-1,6 связей. Исследуемая мокоамилаза практически не гидролизовала декстран низкой молекулярной массы 20000 дальтон), а-1,2 связи в сахарозе, а-1,2 и а-1,б связи в рафинозе, а-1,4-сияэь в актозе, р-1,4-свяэь в целлобиозе. Из этих данных следует, что для глюкоамилазы арактерна стереохимическая специфичность в отношении типа связи - сродство к идролнзу ос-связи. Отсутствие гидролиза рафинозы, сахарозы, лактозы и «-1етилглюкозида свидетельствует, что на скорость ферментативной реакции ущественное влияние оказывает природа замещающей группы в молекуле глюкозы.

При хроматографическом анализе продуктов гидролиза мальтотриозм было >бнаружено, что в ходе реакции образуется глюкоза и мальтоза, последняя очень 1едленно гидролизуется до глюкозы. Накопление в гидролизате мальтозы свиде-сльстпует о том, что скорость гидролиза а-1,4-свяэи в мальтотриозе выше, чем этой ке связи в мальтозе.

Были определены оптимумы рН для гидролиза крахмала (5,7-6,0) и мальтозы 5,5-6,0). Температурный оптимум равнялся 50"С как для мальтазной активности люкоамилазы, так и для гидролиза крахмала.

Зона рН-стабильности гомогенной глюкоамилазы находилась в интервале 4,01,0, как и в случае фермента в культуральной жидкости (раздел 2.2.1.1.).

Изучение термостабильности показало, что глюкоамилаза стабильна при темпе->атурах 20*С и ниже. Выдерживание при ЗО'С в течение 2-х часов снижало ее |ктивность на 4-5%, а при 50*С- на 80% (причем 50% активности терялось в первые 30 (инут). При 55"С фермент полностью инактивировался через 30 мин. инкубации.

Были определены константы Михаэлиса (Кт) для реакций гидролиза раство-¡имого крахмала и мальтозы, равные, соответственно, 0,11 и 2,01 мг/мл, что свидетельствует о повышенном сродстве глюкоамилазы к высокополимерным субстратам.

Молекулярная масса глюкоамилазы была определена методом гель-хроматогра-^>ии вместе с маркерными белками (цитохром С, рибонуклеаза, ингибитор трипсина, >ычий сывороточный альбумин) в тонком слое сефадекса Г-100 (сверхтонкий), вреднее расчетное значение молекулярной массы оказалось равным 53000 дальтон.

Было показано наличие полисахаридного фрагмента в молекуле глюкоамилазы, вставляющего 8,5% от общего веса (27-28 гексозных остатков), что позволяёт отнести >тот фермент к гликопротеинам .

Определение аминокислотного состава глюкоамилазы (табл. 2) позволило рас-:читать, что белковая часть молекулы фермента состоит из 473 аминокислот. В состав зелка не входят цистеин и метионин. Глюкоамилазу следует отнести к кислым 1-3'

гликопротеинам (процентное соотношение суммы глютаминовой и аспарагинов! кислот к сумме лизина, гистидина и аргинина равно 3,6), что подтверждается также результатами изоэлектрофокусирования.

Несмотря 1 довольно высок» содержание гидр фобных аминокисл (около 203

глюкоамилаза хород растворима в во, благодаря соответствующей конформации, экранирующей их вн три глобулы, наличию углеводно части.

В эксперимента с хелатообразующим соединениями, таким как ЭДТА и 1 оксихинолин, был показано, что ион: металлов не входят в активный центр глюкоамилазы.

Парахлормеркурийбензоат (реагент на 5Н-группы) и перекись водород (реагент на метионин) также не снижали активности глюкоамилазы. Это согласуете с данными аминокислотного анализа, показывающими отсутствие серосодержащи аминокислот в белке. Дитиотреитол, известный как активатор БН-группы некоторы ферментов, не оказывал существенного влияния на активность глюкоамилазы.

Активность глюкоамилазы снижалась на 25-40% в присутствии фенилмети/ сульфонилфторида (реагент на серин) и на 85% - в присутствии иода. Эти факт! свидетельствуют о возможном участии в каталитическом действии глюкоамилаз! аминокислот серина и тирозина.

2.2.2. Изучение механизма регуляции синтеза и секреции глюкоамилазы и а амилазы у Епйотусорьгв ер. 20-9 и роли белка в структуре клеточной сгенк] дрожжей.

В этой части работы изучали воздействие различных классов ПАВ (В1Ш-35 I 58, тритон Х-100 и Х-305, додецилсульфат натрия, дезоксихолат натрия, твин-21, 40 60, 61, 65, 80), меркаптанов ((5-меркаптоэтанол) и "улиточного фермента" на секрецик глюкоамилазы и а-амилазы дрожжеподобным грибом Епйотусорыь гр. 20-9. Некото рые твины, а также меркаптаны и "улиточный фермент" вызывали значительно!

Табл. 2. Аминокислотный состав глюкоамилазы.

Название аминокислоты Аминокислотные остатки

% молярные число остатков на молекулу*

1. Лизин 4,17 15,8 16

2. Гистидин 0,75 2,7 3.

3. Аргинин 2,45 14,7 15

4. Аспарагиновая 17,20 72,6 73

кислота

5. Треонин 6,50 31,2 31

6. Серин 11,01 61,3 61

7. Глутаминовая 9,30 35,0 35

кислота

8. Пролин 3,97 18,7 19

9. Глицин 6,95 59,2 59

10. Алании 7,55 51,2 51

11. Валин 4,03 15,6 16

12. Изолейцин 3,65 15,9 16

13. Лейцин 9,20 38,2 38

14. Тирозин 7,20 21,4 21

15. фенилаланин 4,20 13,9 14

16. Триптофан** 1.77 4.6 5

Общая сумма 100,00 473

* Число остатков аминокислот рассчитано для белковой части

фермента - 48500 дальтон (за вычетом углеводной части) ** Триптофан определён спектрофотометрически

елнчение секреции амилолитических ферментов, что не обусловлено усиленным коплением биомассы или снятием ферментов с клеточной поверхности. На основе лученных данных можно предположить с большой долей вероятности, что синтез юкоамилазы и а-амилаэы у Endomycopsis sp. 20-9 является индуцибельным и дпержен катаболитной репрессии, однако при росте на минимальной среде с юкозой наблюдается их незначительный синтез (базовый уровень). Было также казано, что на среде с крахмалом секреция глюкоамилазы регулируется уровнем ее нцентрации в среде (1-й пороговый уровень).

Можно предположить наличие следующего механизма рефляции у данных ожжеподобных микроорганизмов. Гены обоих ферментов заключены в одном [дуцибелыюм опероие (аммилазный оперой) с позитивной регуляцией. В отсут-вии крахмала и индуктора (вероятно, мальтозы) происходит лишь "фоновый" ктез ферментов, обеспечивающий их базовый уровень. При появлении крахмала и. ответственно, индуктора начинается интенсивный синтез и секреция ферментов до 1-го порогового уровня, обеспечивающего блокирование рецепторов клеточной верхносги, сигнал от которых о прекращении синтеза ферментов идет на ансляционный аппарат. Некоторые детергенты кеспецифически блокируют эти цепторы, а меркаптаны и "улиточный фермент", вероятно, нарушают их способ-сть связывать ферменты; при этом сигнал о прекращении синтеза ферментов не разуется, и синтез с секрецией продолжается до 2-го порогового уровня фермсн-а в среде, который обусловлен катаболитной репрессией.

Усиление секреции клетками гидролитических экстрацеллюларных ферментов л, действием ПАВ может объяснять улучшающее действие фосфагидов и других щевых ПАВ на качество хлеба. Раньше этот эффект обменяли лишь улучшением ологических свойств теста. Наши данные свидетельствуют, что имеется и другой их лад по цепочке : ПАВ -> дрожжи в тесте -> усиление секреции гидролаз и других рментов —> интенсификация гидролитических процессов —> формирование этветствующего биохимического состава —► качество хлеба.

Полученные данные явились основанием для испытания в качестве регулятора охимических процессов в тестоприготовлении аскорбил-6-пальмитата. Положи-кьный эффект достигал наибольшего значения при его добавлении к дрожжам и продолжительной инкубации до замеса (A.C. № 1630747), что подтверждает наши едыдущие выводы.

Для увеличения выхода ферментов из дрожжевой клетки недостаточно только 1лить их биосинтез и секрецию, необходимо также повысить проницаемость »точной стенки. Иначе ферменты могут оставаться в периплазме и не участпопать гидролизе высокомолекулярных субстратов. Для этого необходимо в первую гредь знать структуру клеточной стенки, чтобы найти способы воздействия на ее зницаемость. Известно, что химический состав клеточной стенки дрожжей родов :charomyces и Candida очень сходен - это глюканы, маннаны, хитин и белки, часто [занные ковалентно с полисахаридами. Состав белков и их локализация в клеточ-й стенке изучены очень плохо. До сих пор не определено, чему принадлежит 1-4-4813

основная структурирующая роль. Воздействие как протеиназ, так и карбогидролаз отдельности не нарушает полностью структуры клеточной стенки. Лишь так мощный комплекс суммы гидролаз, как "улиточный фермент" лизировал ее частич или полностью, увеличивая выход экстрацеллюларных ферментов из периплазмы по-видимому, из клетки.

Чтобы установить структурирующую роль белка в клеточной стенке на р. личных этапах развития дрожжевой клетки, в качестве инструмента исследован применяли протеиназу из Bacillus subtilis (субтилизин). Оказалось, что соотношен углеводов к белкам в клеточной стенке увеличивается по мере "старения" клетки, они в меньшей степени поддаются атаке протеиназами, чем в случае молодых клет< что свидетельствует о большем экранировании структурных белков полисахарида» Следовательно, в молодых делящихся культурах дрожжей можно применять агент действующие разрыхляюще на белки, для увеличения проницаемости клеточн стенки. Это было также ранее продемонстрировано в эксперименте с ß-меркаш этанолом.

Возможно также, что улучшающее действие протеаэ в хлебопечении свяэа также с их воздействием на клеточную стенку дрожжей и увеличением их прок цаемости для ферментов и субстратов.

2.2.3. Изучение влияния процессов ферментативного гидролиза на биохим ческий состав и качество хлеба. Определение путей управления этими процессами.

Для экспериментальной проверки научно-теоретических положений, выведи ных в результате проведенных исследований (разд. 2.2.1 и 2.2.2.) было выбра: хлебопечение. Тесто представляет собой сложную коллоидную систему (с вкл чёнными клетками дрожжей) с затруднённой диффузией, где идут интенсив» гидролитические и синтетические реакции как внутри дрожжевых клеток, так снаружи с использованием ферментов дрожжей и муки.

Прежде чем исследовать влияние таких внесенных гидролитических ферме тов, как глюкоамилаза или других биологически активных соединений, влияющих : активность гидролаз или усиливающих их секрецию дрожжами, необходимо бы изучить полную картину биохимических реакций в процессе тестоприготовления создать биохимическую модель "идеального хлеба". Для этого была разработа: специальная методика модельных систем.

Тесто в модельных экспериментах готовили из товаркой пшеничной муки 1-сорта среднего хлебопекарного качества по технологиям, принятым в нашей стране за рубежом. Так, например, в качестве одной из модельных систем неполно созревания теста использовали способ, применяемый на хлебозаводах Cnpi (вариант I). В качестве других модельных систем были взяты - безопарный (вариа: 2) и опарный (вариант 3) способы, а также на дрожжевом сыпучем полуфабрика (ДСП) 8-часовом и 48-часовом (варианты 4 и 5). Для оценки роли дрожжей гидролитических процессах при тестоведении готовили также соответствующие бе дрожжевые модельные образцы теста (варианты 1'. 2', 3', 4', 5'). Для сравнительно

чения биохимического состава пробы теста в конце созревания лиофилизировали аэмалывали до дисперсности муки.

В муке и высушенных образцах дрожжевого и бездрожжевого теста опре-яли общие и водорастворимые белки, свободные аминокислоты, протеолити-кую активность, липиды (свободные, связанные и прочносвязанные), групповой и рнокислотный составы липидов, активность липазы и липоксигеназы, содержание хмала, декстринов, моно- и дис&харидов, активность р-амилазы, нелетучие анические кислоты, а также активность каталазы и содержание восстановленного гатиона.

2.2.3.1. Изучение протеолиза и его влияния на белковый состав и пул свобод-к аминокислот.

Полученные данные показывают, что степень протеолиза во всех пробах теста

различной. Содержание общих белков в пробах, приготовленных по вариантам [ 2, уменьшалось на 0,87 и 0,6% по сравнению с содержанием их в муке. В [большей степени количество общих белков,уменьшалось в тесте, приготовленном ДСП (варианты 4 и 5) и было меньше их количества в муке на 1,75 и 1,94%. шаковое содержание общих белков в дрожжевом и бездрожжевом тесте свиде-ьствует о незначительном влиянии дрожжей на протеолиэ, что подтверждает утствие секреции протеаз дрожжами и указывает на ведущую роль собственных >теаз муки. По мере увеличения продолжительности контактирования муки с жжами в тесте отмечается накопление водорастворимых белков. Нами определя-ь изменение качественного и количественного состава свободных аминокислот в щессе тестоприготовления (табл. 3). Различное содержание свободных амино-лот в исследуемых пробах теста, по-видимому, связано с одновременно протека-;имн процессами накопления их в результате протеолиза, а также с потреблением дрожжами. Поскольку скорости потребления в зависимости от способа приго-леняя различаются, то можно выявить лимитирующие аминокислоты, дефицит

6л. 3. Изменение содержания свободных аминокислот а тесте.

именование слот Содержание свободных аминокислот, мг на 100 г с.а. а

муке тесте, приготовленном по вариантам

t 2 3 3" 4 5

ицин 9,55 7.20 6.08 2.96 27.52 20,78 26,34

1ЯНИН 21,45 15,85 32.47 26,50 105,61 88,66 93,53

1ЛИН 3,19 0,18 1,46 1,60 17,63 3,74 20,62

мцин 5,32 0.18 1,63 0,38 24,32 1,76 21,96

юлейцин 4,35 0.12 0,49 0,31 9,60 1,24 4,42

13ИМ 3.15 15.62 22,32 19,29 46.44 23,40 41,00

5ГНННИ 2.67 29,43 17,85 1,15 6,40 9,37 2,94

сгидии 8,75 18,35 26,30 19,49 39,62 46,66 46,40

розни 9,94 0,48 0,97 0.77 33,85 20,84 36,39

энилаланин 1,72 0,59 0,88 1,40 10,90 14,60 12,95

ктеии 0,57 5,16 3,66 3,06 5,60 15,62 18,02

•тисним 0,18 0,12 0,32 0.13 7,46 1,30 0,35

*рин + треонин + утамикэвая кислота гарагиновая кислота 51,69 45,30 61,11 78,50 120,30 64,00 85,00

ГЕГО 122,50 139,28 175,43 155,04 454,96 311,97 409,90

1-4*

которых оказывает влияние на микробиологические процессы и на пекарск1 свойства дрожжей.

По-видимому, для нормального протекания брожения теста и получения хле высокого качества указанные аминокислоты должны содержаться в полуфабрикат, в достаточном количестве. Этот вывод был подтвержден в опытах с добавленш метионина, что вызывало улучшение качества хлеба (табл. 6).

2.2.3.2. Изучение липолиэа и липндного комплекса.

Для исследования липидного комплекса определяли содержание свободны связанных и прочносвязанных липидов, групповой и жирнокислотный состав свободных и связанных липидов, а также активность липазы и липоксигеназ] Полученные данные (табл. 4) свидетельствуют о том, что при практически один ковом содержании липидов в муке и тесге, приготовленном различными способам происходит их перераспределение. Содержание свободных липидов в тесте умен шалось с увеличением продолжительности его созревания, количество связанных прочносвязанных липидов при этом увеличивалось.

Табл. 4. Изменение липидов муки при созревании теста.

Обьект исследования Содержание липидов

Общее количество, % на с.в. Свободных Связанных Прочносвязанных

% на с.в. % к общему колич. >о на с.в. % к общему колич. Уа на с. в. ' % к обще» колич.

Мука 2,13 1,55 72.76 0,48 22,54 0,10 4,69

Тесто, приготовленное по вариантам

1 2,15 0,94 43,72 1,00 46.51 0,21 9.77

2 2,14 0,8В 41,12 1,07 50,00 0,19 8.88

3 2,14 0,75 35,05 1,16 54,21 0,23 10,75

3' 2,15 0,73 33,95 ».17 54,42 0,25 11,63

4 2,13 0,57 26,76 1.26 59,15 0,30 14,08

5 2,14 0.48 22,43 1.31 61,21 0,35 16.36

Дрожжи не оказывали заметного влияния на изменение количесгвенног состава собственных липидов муки, о чем свидетельствуют одинаковое содержани свободных, связанных и прочносвязанных липидов в тесте, приготовленном н густой опаре с дрожжами и без добавления дрожжей (варианты 3 и 3'). Эт указывает на отсутствие секреции липаз дрожжами. Изменение свободных связанных липидов в процессе тестоприготовления, вероятно, происходит вследстви их взаимодействия со структурными компонентами теста. Продолжительност созревания полуфабри-катов оказывает влияние на степень их взаимодействия. ] процессе созревания теста изменяется и групповой состав липидов. Во всех проба: теста, приготовленных исследовавшимися способами, в свободных липндах п> сравнению с мукой отмеча-ется уменьшение полярных липидов, ацилглицероло! углеводородов и стеролов. Больше всего эти изменения происходили в тесте приготовленном на ДСП (варианты 4 и 5). Содержание триацилглицеролов в эти: пробах уменьшалось соответственно в 4 и 7 раз. На изменение группового состав; свободных липидов оказывали заметное влияние дрожжи, хотя известно, что они не секретируют липаз.

При изучении группового состава связанных липидов муки и теста отмечалось, то в процессе приготовления теста увеличивалась доля полярных липидов, моно- и иацилглицеролов, стеролов, жирных кислот, триацилглицеролов и углеводородов. Удержание полярных липидов и моноацилглицеролов в связанных липидах величивалось во всех пробах с увеличением продолжительности созревания олуфабрикатов.

Анализ жирнокислотного состава липидов муки и теста указывает на рансформацию свободных липидов в связанные п процессе тестоприготовления. Это ожет происходить благодаря увеличению доли белков (или улучшению доступа к им), способных образовывать липопротеидные комплексы, в процессе частичного ротеолиза или амилолиза.

Результаты определения кислотного числа свободных и связанных липидов уки и теста показали, что суммарное содержание свободных жирных кислот липи-эв (свободных и связанных) муки превышало суммарное содержание свободных :ирных кислот липидов теста. Суммарное количество свободных жирных кислот ипидов, извлекаемых из теста, было практически одинаковым и не зависело от 1 особа его приготовления.

Определение активности липазы выявило ее снижение во всех пробах теста по завнению с активностью липазы муки. Наибольшее сниженне отмечалось в тесте, риготовленном опарным способом (вариант 3). Самая высокая активность липазы ила отмечена в пробах 1 и 3*. Приведенные данные указывают на неблагоприятные :ловия для работы липазы муки в процессе тестоприготовления, особенно в рисутствии дрожжей.

2.2.3.3. Изучение амилолиза и углеводного состава.

Установлено, что содержание декстринов в тесте с добавлением дрожжей и без их увеличивалось по сравнению с их содержанием в мухе на 16-64%. Самое высокое эличество декстринов было в тесте, приготовленном по вариантам 1 и 3'. одержание крахмала изменялось незначительно по сравнению с содержанием его в утсе и не зависело от продолжительности созревания полуфабрикатов. Наибольшее шенение крахмала и декстринов наблюдалось при добавлении в тесто дрожжей абл. 5). В дрожжевом тесте отмечалось накопление таких сбраживаемых дрожжами осаров, как глюкоза, фруктоза и мальтоза. Содержание сахарозы уменьшалось, а >держание несбраживаемых арабинозы и ксилозы практически не изменялось, аиболыиее увеличение содержания мальтозы обнаружено в бездрожжевом опарном :сте (вариант 3'). В бездрожжевых пробах в конце выдерживания также установ-!НО накопление Сахаров, в основном мальтозы. Изменение содержания и состава [Харов в тесте указывает на различия протекания в нем амилолиза под действием р-шлазы. Уменьшение содержания Сахаров в дрожжевых пробах свидетельствует об ггенсивном потреблении их дрожжами. В пробах теста с добавлением дрожжей арианты I, 2, 3, 4 и 5) наибольшее содержание общих Сахаров к концу брожения >1Ло в опарном тесте (вариант 3) и составило 1,27%. Наличие моно- и дисахаридов в

1-5-4843

тесте (как сбраживаемых, так и несбраживаемых) имеет большое значение дл получения хлеба высокого качества. Сбраживаемые сахара необходимы дл активного метаболизма дрожжей и газообразования. В то же время все редуц! рующие сахара, как сбраживаемые, так и несбраживаемые (глюкоза, арабиноз; ксилоза) в процессе выпечки принимают участие в меланоидинообразовании. Брож< ние в опарном тесте идет гораздо интенсивнее, чем в тесте, приготовленном другим способами, и дрожжи используют в этом случае преимущественно мальтозу. Пр созревании теста в 1 варианте дрожжи не успевали сбродить достаточное количеств Сахаров, поэтому в тестовых заготовках установлено повышенное содержани мальтозы (0,72%) по сравнению с содержанием её в других пробах. Известно, что дл получения хлеба хорошего качества необходим интенсивный процесс брожения достаточное количество восстанавливающих Сахаров в тесте после расстойки, чт обуславливает такие показатели, как объем, окраска корки, вкус хлеба.

Табл. 5. Изменение содержания моно- и дисахаридов при созревании теста

Сахаров мука с добавлением дрожжей без добавления дрожжей

1 2 3 4 5 V 2' 3' 4' 5'

Арабиноза следы 0,084 0,025 0,026 0,023 0,044 0,092 0,022 0,064 0,025 0,04

Ксилоза 0,032 0,029 0,029 0,036 0.031 0,034 0,033 0,026 0,028 0,026 0,04

Фруктоза 0,035 0.045 0,065 0,078 0.067 0,054 0,218 0,203 0,259 0,212 0,26

Глюкоза 0,042 0,097 0,135 0,282 0.110 0.116 0,125 0,258 0,320 0,311 0,68

ВСЕГО моносахаридов 0,129 0,255 0.254 0,422 0,231 0,248 0,468 0,509 0,643 0,573 1,04

Сахароза 0,324 0,075 0,067 0,105 0,077 0,073 0,137 0,137 0,147 0,149 0,14

Мальтоза 0,182 0,716 0,613 0,508 0,556 0,689 1,020 1,055 1,105 1,037 1,05

Мальтотриоза - . 0,083 0,175 0,104 0,087 0,035 0,092 0,185 0,128 0,09

ВСЕГО олигосахаридов 0,506 0,791 0.763 0,769 0,747 0,849 1,183 1,284 1,437 1,314 1,33

ВСЕГО Сахаров 0,635 1,046 1,017 1,271 0,978 1,097 1,651 1,793 2,080 1,807 2,38

Данные по определению амилолитической ахтивности показали, что спосо приготовления теста незначительно влияет на изменение активности Р-амилаз1 Самая высокая активность |)-амилазы была в тесте, приготовленном однофазным способами (варианты 1 и 2).

Результаты наших исследований подтверждают имеющиеся данные литератур о том, что дрожжи быстрее сбраживают глюкозу, чем мальтозу, так как мальтоза я транспортируется внутрь дрожжевой клетки. Для сбраживания мальтозы необход! мо, чтобы дрожжи адаптировали свой ферментный аппарат, а это требует времени замедляет процесс формирования качества теста. Для накопления глюкозы интенсификации тестоприготовления нами было проверено влияние добавления тесто гомогенной глюкоамилазы, выделенной из Егн1отусор.н'5 хр. 20-9, на качеси хлеба. Результаты этих исследований приведены в табл. 6 и описаны в разд. 2.2.3.5.

2.2.3.4. Изучение роли некоторых фосфогидролаз в обмене полифосфатов нуклеиновых кислот у дрожжей.

Фосфогндролаэы играют очень важную роль в метаболизме всех живы организмов, так как на основе реакций гидролиза и синтеза фосфоэфирных, фосф( диэфирних и фосфоангидридных связей базируется вся энергетика клетки, актив]

>вание молекул в биохимических превращениях и структурирование информацнон-лх молекул - ДНК и РНК (синтез, гидролиз, репарация и т.п.). У всех дрожжей фавне с АТФ имеются "реликтовые" энергетические системы - полифосфаты, кото-л<> впоследствии в процессе эволюции были частично или полностью вытеснены гергетнкой на базе АТФ.

Было проведено исследование на модельном объекте - синхронизированной /льтуре дрожжей ЗсЫгояассЬаготуса рогпЬс (синхронизировали стационарно-азным методом с индексом синхроности 0,75-0,78) для выявления закономерностей корреляции между полифосфатным обменом, синтезом и деградацией нуклеиновых ислот и активностью ферментов полнфосфатного обмена.

Известно, что у дрожжей ЗассИаготуссз сагЬЬегдепя^я биосинтез высокополи-ерных фракций полифосфатов тесно связан с биосинтезом полисахаридов их леточггок стенки - маннаиа и глюкана. Установление закономерностей указанных роцессов может способствовать поиску путей регулирования проницаемости клоачной стенки для секретируемых гидролаз и применению этих путей на практике в иотехнолопш и пищевой промышленности.

Фосфорный обмен у дрожжей изучался ранее лишь на массовых хультурах, оэтому представляет значительный интерес изучение поведения фосфорных соеди-ений и ферментов, участвующих в их обмене как бы в одной клетке на разных тапах ее развития в период деления, так и во время последующего роста и подготов-;и к новому делению, сопровождаемого усиленными биосинтетическими процессами.

Нами экспериментально было доказано, что только накопление солераствори-юй фракции полифосфатов (степень полимерности «20) у Зс/ч'го.чассЬаготусе.'у ротЬс (рямо коррелирует с аккумуляцией в клетках нуклеиновых кислот, что может видетельствовать в пользу взаимосвязи этих двух биосинтезов. Установлено, что в (ериод между двумя делениями клеток дупликация ДНК происходит в короткий (ромежуток времени (15 мин.) непосредственно перед делением при одновременном :нижении содержания РНК (хотя до этого уровнь тотальной РНК постоянно растёт). 5ысказано предположение о том; что в этот период для биосинтеза ДНК могут ^пользоваться продукты частичного гидролиза РНК.

Показано, что в этот период наблюдается два максимума удельной активности шрофосфатазы (КФ 3.6.1.1.), совпадающие по времени с точками наиболее активного синтеза РНК и ДНК, что может указывать также на взаимосвязь этих процессов, /дельная активность полифосфатазы (КФ 3.6.1.11) была максимальной сразу же тосле окончания деления клеток дрожжжей и затем снижалась до минимума к аачалу нового деления, что коррелировало с накоплением суммарных полифосфатов.

Самая высокополимерная фракция полифосфатов (степень полимерностн «260) имела минимальное количественное значение сразу же после деления клеток, которое затем резко зкспонециально возрастало к моменту нового деления. Можно заключить, что именно в этот период происходит активный биосинтез полисахарид-ных компонентов клеточной стенки, связанный с накоплением этой фракции. Это хорошо согласуется с выводами исследований структуры клеточной стенки (разд.

1-5*

2.3.2.) о нарастании доли углеводного компонента в клеточной стенке дрожжей п мере старения клеток. Можно предположить, что именно в этот период клеточног цикла сразу после деления клеточная стенка будет максимально чувствительна атаке протеиназами и увеличивать свою проницаемость. Поскольку в хлебопечение или в других микробиологических производствах мы имеем дело не с синхрошшмк а массовыми культурами, то в среде всегда найдутся молодые клетки, подвержеипы подобному воздействию. Учитывая, что в молодых культурах дрожжей, на лота рифмической стадии развития преобладают делящиеся клетки, можно прогнози ровать в данном случае большой эффект от воздействия протеиназ. В хлебопеченш также можно повысить эффект воздействия протеиназ, используя активно деля щиеся дрожжи, и усилить этим выход из клеток' ферментов, что в оптимальныз условиях приводит к ускорению формирования необходимого биохимического соста ва теста и качества хлеба.

2.2.3.5. Определение путей регулирования биохимического состава теста к качества хлеба.

За модель "идеального" хлеба, обладающего наилучшими органолептическими качествами, нами был принят биохимический состав созревшего теста, приготовленного опарным способом. На основе полученных результатов исследования биохимических характеристик созревшего теста добавляли ряд веществ, которые могут воздействовать на гидролитические процессы в тесте, на метаболизм дрожжей И влиять, соответственно, на биохимический состав, свойств и качество хлеба. Исследовали влияние лимитирующих аминокислот, гомогенной глюкоамилазы, конкана-валина-А, ц-АМф и глюкозы, а также деионизации водопроводной воды на качество хлеба. Тесто для этого готовили безопарным способом. Результаты исследований представлены в табл. 6.

Добавление в тесто 15,4 ед. глюкоамилазы (на 100 г теста или 0,0002%), выделенной нами из культуральной жидкости Епйотусорв/ж 20-9, улучшало качество хлеба по всем показателям: увеличивались удельный обьем хлеба (на 18,6%), формо-Табд. 6. Влияние на камество хлеба добавления в тесто веществ, регулирующих метаболизм дрожжей (безопарный способ, дистиллированная вода).

Показатели качества хлеба с добавлением

Наименование контроль диетил глюкоами глюкоза ц-АМФ метионин аскорбил- Кон-А

показателя (на водо- лирова лаза 15,4 1% от 0,00165% 0,002% б-лальмитат 0,01%

провод- нная ед / 100 массы + глюкоз от массы 0,1% от от массы

ной воде) вода г теста муки 1% теста массы муки теста

Кислотность, град. 2,4 2,3 2,4 2,2 2,3 2.4 2.6 2,2

Влажность, % 42,5 42,0 42,5 42,0 42,5 42,5 42,5 42,0

Пористость, % 81 82 83 79 80 84 83 83

Н:Д 0,52 0,56 0,64 0,49 0,60 0,51 0,50 0,65

Уд. обьем, смЗ/100г 317 344 376 320 358 383 391 359

Структурно-меха-

ническая характе- ДН общ 82 71 87 73 76 92 112 75

ристика мякиша. ЛН пл 55 47 54 45 45 63 74 49

ед. прибора АН упр 21 24 33 28 31 29 38 26

Балльная оценка , баллы 78,8 82,0 88,3 78,3 84,7 89,9 83,0 83,2

/

ончивость (Н:Д) подового хлеба (па 23%), пористость (на 3%), ДНобщ (на б%), ДНунр 22%), балльная оценка увеличивалась на 9,5% по сравнению с контрольными эбами, что приближало качество к "идеальному". Улучшались такие важные "анолепгические показатели, как окраска корки, цвет мякиша и запах хлеба, ^гчшающий качество хлеба эффект при добавлении этого фермента объясняется степенным гидролизом крахмала и накоплением в тесте глюкозы, которая сбражи-;тся дроткжами. Прн этом в тесте сохраняется определенный постоянный уровень окозы. Добавление в тесто вместо глюкоамнлазы глюкозы в количестве 1% от ссы муки не давало такого улучшающего эффекта и даже было установлено которое ухудшение качества хлеба. По-видимому, это ухудшение происходило за зт глюкозного эффекта (катаболитной репрессии). Это говорит о важности посте-нного образования в тесте глюкозы в ходе брожения по принципу "подпитки" и ее пользование дрожжевыми клетками по мере необходимости.

Известно, что лектины связываются с поверхностью дрожжевых клеток (их цепторамн) н способны блокировать секрецию некоторых ферментов. Однако в ших экспериментах конканавалин-А практически не влиял на качество готового еба.

Добавление в тесто ц-АМФ, способного к снятию катаболитной репрессии, [есте с 1% глюкозы вызывало улучшение качества хлеба по таким показателям, как елышй объем хлеба, формоустойчивость (Н+Д) подового хлеба и структура 'ристости (табл. 6). Прн этом наблюдалось укрепление теста. Эти данные указы-ют, что ц-АМФ приводит к снятию репрессии и интенсивному биосинтезу в 'ожжах адаптивных ферментов, необходимых для усвоения других источников ггания, кроме глюкозы.

Как уже указывалось выше (разд. 2.2.2.), очень хорошие результаты дала >едварительная обработка дрожжей аскорбнл-6-пальмитатом, который обладает !лым спектром эффектов (витаминным, антиоксидантным, антимутагенным и >верхностно-активным) (A.C. Na 1630747). Эта добавка была теоретически ¡основана исходя из результатов изучения механизма регуляции синтеза и !креции амилолитических ферментов дрожжами. Из табл. 6 видно, что самым "пшш по качеству был хлеб, приготовленный с добавлением в тесто меткошша. золне вероятно, что метионин играет двоякую роль в формировании качества ie6a. С одной стороны, как нами было установлено, он является лимитирующей ■шнокислотой в общем пуле амипокислот, потребляемых дрожжами, с другой ■ороны, метионин, возможно, также участвует в востановлении глутатиона, 1ляющегося активатором протеаз.

Анализируя результаты биохимических исследований можно заключить, что \я получения хлеба хорошего качества необходимо, чтобы в тесте , накопился эстаточный пул свободных аминокислот - метионин, изолейцин и лейцин, лимити-утощих метаболизм дрожжей. Для этого следует активировать протеазы муки, чего ожно достичь снижением концентрации NaCl, внесением глутатиона или других 1-6-4843

активаторов, внесением восстановителей глутатиона типа меркаптанов ил тиоамино-кислот, либо вводом в рецептуру источников нужных аминокислот. Кром этого для более интенсивного брожения при созревании теста необходи постоянный во времени уровень глюкозы, чего можно добиться введение глюкоамилазы.

Таким образом, на основании проведенных исследований можно заключит что добавлением определенных биологически активных соединений можно регум ровать биохимический состав теста и, соответственно, качество хлеба. Добавлени ферментных препаратов дает хороший эффект, но удорожает производство хлеба 1 повышает риск его загрязнения, поэтому была поставлена задача не только разра ботки производства ферментных препаратов глюкоамилазы, по и создания новы: генно-инженерных штаммов ^ассЛаготусе« сегеушае, способных к синтезу и секре ции этого фермента.

2.2.4. Получение генетическими методами новых штаммов пекарских дрожже! ВассЬаготусев сегетй1ае, способных к синтезу и секреции глюкоамилазы и други: ферментов гидролитического действия.

2.2.4.1. Получение глюкоамилаэных штаммов пекарских дрожжей и испытани« их в хлебопечении.

В процессе приготовления хлеба ведущая роль в формировании качества при надлежит дрожжам ВассЬатотусез сетеп$1ае. Эти дрожжи не способны расщепляй крахмал муки до легко сбраживаемого субстрата - глюкозы из-за отсутствия генетической системы синтеза амилолитических ферментов. В связи с этим, в хлебопекарной промышленности проводят этап предварительного осахаривания крахмала муки солодом или коммерческими препаратами амилолитических ферментов. Однакс эти добавки не обеспечивают полного гидролиза крахмала, могут янться факторами загрязнения конечного пищевого продукта из-за своей химической неоднородности и их применение приводит к удорожанию технологии.

В начале XX веха для производства хлебопекарных дрожжей дорогое зерновое сырье было заменено отходом свеклосахорного производства - мелассой. Однако дрожжи, выращенные на медассной среде, обладают р-фрукгофураноэндазной активностью )КФ 3.2.1.26.) и имеют низкий уровень мальтазной 1КФ 3.2.1.20.) активности. Переключение на сбраживание мальтозы происходит крайне медленно, что иногда приводит к запаздыванию поднятия теста. В результате совершенствования процесса экстракции сахара из сахарной свеклы и под влиянием используемых в сельском хозяйстве удобрений и пестицидов питательная ценность и доброкачественность мелассы стала в последнее время резко снижаться.

Исследованиями, приведенными в разделе 2.2.З.6., продемонстрирована эффективность применения ферментного препарата глюкоамилазы на ход технологического процесса и качество хлеба. Однако этот препарат дорог.

Перспективным является направление получения методами генной инженерии гтаммов дрожжей Saccharomyces cercvisiac, обладающими глюкоамилазнои актив-остью н, соответственно, способностью к сбраживанию крахмала.

Впервые в нашей стране была достигнута экспрессия гена глюкоамилаэы из accharomyccs diastaticus (единственного вида дрожжей, обладающего такой снособ-остыо) в геноме дрожжей Saccharomyces ccrevisiac в 198Ö г. в лаборатории "Оптими-ация экспрессии генов" ВНИИГенетики я селекции промышленных мнкроорганиз-гов под руководством C.B. Беневоленского. Полученный штамм дрожжей, имея ряд ¡реимуществ, lie обладал достаточно хорошими хлебопекарными свойствами. Была [оставлена задача получить аналогичные штаммы на основе промышленного штамма •Ь 408 с высокими производственными показателями или на основе вновь созданного ими генетическими методами штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ У-1320 с шеокой инвертазной и мальтаэной активностями, превышающего штамм № 408 по слебопекарным свойствам (A.C. №4852331).

Кроме того, стояла задача получения штаммов пекарских дрожжей с генами других амилолитических ферментов методами генной инженерии и оптимизации :оставов питательных сред для культивирования полученных штаммов. Новый штамм пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ У-1534 с глюкоамилазкой активностью и хорошими хлебопекарными свойствами был получен методами гибридизации й тетрадного анализа по методу Джонстона и Мортимера (A.C. №1742320) Для получения новых штаммов применяли такжо методы случайной выборки спор, получения дыхательно дефицитных вариантов, отпечатков на селективных средах, определения типа спаривания и трансформации дрожжей.

Для полученных штаммов появилась возможность замены традиционной среды для культивирования дрожжей - мелассного сусла - на крахмалосодержацую среду. Установлено, что концентрация крахмала в такой среде не должна превышать 2,0%. Разработано 2 состава сред для культивирования глюхоамилазкых дрожжей: среда, содержащая (%): крахмал - 2, дрожжевой экстракт - 0,2, мелассу - 2, как активатор необходимых для хлебопечения ферментных систем и днаммония фосфат - 0,2; среда, содержащая (%): крахмал - 1,5, диаммоний фосфат - 0,2 и кукурузный экстракт - 1,2 в качестве источника азота и ростовых факторов. Биомасса, выращенная на обеих средах, обладала хорошими пекарскими свойствами.

Экспериментально установлено, что путем введения дополнительных плазмид-¡шх генов в штаммы глкжоамилазных дрожжей можно повысить утилизацию крахмала и, соотвтственно, увеличить съем биомассы при увеличении концентрации крах-мала. Получены варианты штаммов с изменным промотором гена глюкоамилаэы и дополительным геном а-амилазы (К.Ф. 3.2.1.1.]. Получение таких remioL инженерных штаммов позволит повысить концентрацию крахмала в разработанной среде.

Было показано экспериментально (табл. 7), что штаммы, обладающие способностью к синтезу и секреции амилолитических ферментов, благодаря интенсификации гидролитических процессов в гестнрпготоплспич и постепенному накоплению 1-й-

дополнительного субстрата (подпитки) без катаболитной репрессии особенно эффе тивно применять при ускоренных технологиях хлебопечения, переработке муки пониженными хлебопекарными свойствами и при этом получать хлеб повышенно качества: увеличенного удельного объема, пористости, с улучшенными структур« механическими свойствами мякиша.

Другой возможной областью применения новых штаммов дрожжей мож

, . , _ „ . быть утилиз

Табл. 7. Влияние типа дрожжей на показатели качества хлеба

при различных технологиях приготовления. Чия крахмала

сточных вод< картофелепер« рабатывакмцш и крахмалов точных прон: водств. Так, н< пример, сто ные воды фаС рики "Колосс в Москве сс держат 1-1,5', крахмала, чт позволяет снм мать до 30 к прессованных дрожжей с 1 м

стока. В этом случае накопленную биомассу можно использовать как кормовую до бавку, при этом будет решаться экологическая проблема очистки крахмало содержащих сточных вод.

2.2.4.2. Получение вариантов генно-инженерных штаммов пекарских дрожжей обладающих комплексом амилолитических ферментов.

Разработанная крахмалосодержащая среда содержит меньше сухих веществ, чем мелассное сусло, поэтому съём биомассы с единицы объёма ферментера получается ниже. Полученные штаммы глюкоамилазных дрожжей большую концентрацию крахмала усвоить не могут. Повысить усвояемость крахмала можно только путем введения дополнительных ферментных систем. С этой целью изучалось влияние на утилизацию крахмала добавления амилолитических ферментов (Глюкаваморин ПОХ - активность 800 ед/г и Амилосубтилин ПОХ - активность 550 ед/г) непосредственно в среду (полная среда + 4,0% крахмала) перед засевом штамма У-1534. Кроме того, проверялись полученные во ВНИИГенетики лабораторные штаммы дрожжей Saccha/omyces cerevisiae, несущие дополнительные гены а-амилазы [КФ 3.2.1.1.1 и пуллуланази {КФ 3.2.1.41.) на плазмидах. Через 18 часов роста на качалке в культуроло ге Г; жидкости определяли остаточный крахмал. Добавление ферментов в

Показатели Безопарный способ Большая густая опаоа Густая опаоа Жидкая опаоа

Штамм У-1534, выращенный на крахмальной сре де

1 Удельный объём, смЗ/lOO г хлеба 320 331 337 291

2 Влажность, % 43,1 43,8 43,3 42,5

3 Кислотность, град. 2,9 2,3 2,9 3,1

4 Пористость, % 83 83 83 79

Штамм У-1534 на среде с некондиционным крахмалом

1 Удельный объём, смЗ/ЮО г хлеба 312 354 323 314

2 Влажность, % 43,5 43,5 43,5 43,5

3 Кислотность; град. 2,7 2,5 2,6 2.3

4 Пористость, % 81 82 81 80

Производственный штамм ЛВ-7 на меласснои среде

1 Удельный объём, смЗ/100 г хлеба 328 316 31В 311

2 Влажность, % 44,1 43,6 43,4 43,5

3 Кислотность, град. 3,1 2,6 3 2.7

4 Пористость, % 83 83 81 80

реду и введение плазмидных генов в штамм повышало его амилолитическую ктивность и, соответственно, увеличивало выход биомассы (табл. 8).

абл. 8. Влияние введения дополнительных ферментов и плазмидных генов амилолитических ферментов на накопление биомассы и утилизацию крахмала.

№ колбы Штамм Дополнительные ферменты или гены Тигр, клеток.мл Остаточный крахмал

1 У-1534 без добавок 2,00 х 10?8 1,25

2 0.5 мл ГлА 6,40 х 10Í8 0,24

3 0.75 мл ГлА 7,40 х 10t8 0,07

4 0.5 мл аД 5,15 х 10t8 0,60

5 1.0 мл аД 5,75 х 10Í8 0,41

6 0.5 ил ГлА + 0.5 мл аА 7,40 х 10Í8 0,17

7 0.5 мл ГлА + 1.0 мл аА 6,00 х 10Í8 0,29

8 0.75 мл ГлА + 0.5 мл аА 9,55 х 10t8 -

9 У-1534 0.75 мл ГлА + 1.0 мл аА 7,45 х 10t» -

10 603 - 2,56 x 10Í6 3,88

11 603/Ри1 пуллуланаэа 7,35 x 10t6 2,83

12 603/Дт'| а-амилаза 8,15 x I0t6 2,65

13 601 - 2,48 x 10Í7 1,61

14 601/Ри) пуллуланаза 4,88 x 10t7 0,82

15 618 - 2,85 x 10t7 1,48

16 618/Ат! а-амилаза 5,08 x 10Í7 0,89

В связи с этим, была поставлена задача введения дополнительных генов в штаммы пекарских дрожжей методами генной инженерии. В работе использовали интег-ративные -плазмиды, сконструиро

ванные

отрудником ВНИИГенетики Д.Г. Козловым. Установлено, что при введении ополннтельных генов на плазмидах значительно повышаются все показатели ачества дрожжей, особенно сьём биомассы на крахмалосодержащей среде. Годобные штаммы перспективны в тех случаях, когда необходимо нтенсифицнровать амилолиз (например, в хлебопечении, пивоварении или нетпитании) или провести его до конца (например, в спиртовой промышленности [ли утилизации крахмала сточных вод).

2.2.5. Получение, характеристика ферментного препарата липазы, продуцируо-юй микроскопическим грибом ЯЛугорш огугае, разработка способов его применения биотехнологии.

2.2.5.1. Получение ферментного препарата "Липоризин ГЗх" и характеристика лпазы.

ферментный препарат "Липоризин ГЗх" получали из кулътуральной жидкости юсле 48-56 часового роста мукорового гриба КЬугория огугае методом распылвтель-юй сушки с убывающим градиентом температуры от 140 до 70" С по технологии, >азработаниой совместно с А.Ю. Кривовой. Технология апробировалась в опытно-[ромышленных условиях на Бердском биохимическом заводе и на производственном тевде Института фитопатологии в Голицыно. Полученный при этом препарат имел дпазную активность в среднем 50000 ед/г препарата.

Для дальнейшего изучения характеристик ферментного препарата белок пере->саждали органическими растворителями (этанол, нзопропанол и т.п.). Полученный 1-7-4843

очищенный препарат липазы плохо растворялся в воде, что свидетельствует о е относительно высокой гидрофобности. Однако добавлением детергентов, таких к< "Твин-40" (1:1 по весу) можно было увеличить его растворимость почти в 2 раза.

Полученный ферментный препарат хорошо гидролизовал низкомолекулярш субстраты, такие как трибутирин и триацетин. Если принять активность в первс случае за 100%, то во втором случае она была равной 97%, затем резко снижалась увеличением молекулярного веса субстрата (7% с трикаприлином и 2% с триоле ном).

По-видимому, это связано с растворимостью субстрата и его доступом липазе, так как в 2-х фазной системе нужна еще дополнительная активация липаз которая наступает при ее конформационном изменении на границе раздела фаз. 1 исключено, что присутствующие примеси протеиназ и других гидролаз эстеразно типа могут принимать участие в гидролизе низкомолекулярных сложных эфиров. Г крайней мере, в литературе имеются такие данные в случае химотрипсина.

Методом гель-фильтрации была определена молекулярная масса около 600 дальтон. Температурный оптимум для липазиой активности, равнялся 35*С. рН-Опт мум суммарного ферментного препарата по липазиой активности равнялся 6 Липаза стабильна в интервале рН 5,0-8,0.

2.2.5.2. Разработка методов иммобилизации липазы.

Были исследованы различные методы иммобилизации липазы: физичесм химические и физико-химические, для того чтобы выбрать самый оптимальный.

Осуществляли сорбцию липазы на гранулированный мелкопористый алюмос лнкат (средний диаметр шарика 4мм, средний диаметр пор 60 А, что соответству расчетному диаметру молекулы липазы). Способность к сорбции увеличивалась понижением рН. При рН 6,0 на алюмосиликат сорбировалось до 30% ферментнс препапата по белку, а при рН 8,0 почти в 2 раза меньше. Однако по липазн активности в первом случае сорбировалось 55% липазы, а во втором случае - 71 Учитывая, что при рН 8,0 белка садится в 2 раза меньше, липазная активность п этом в 1,3 раза выше, можно сделать вывод о селективной сорбции липазы ферментного препарата на алюмосиликат в этих условиях.

Несмотря на высокий процент выхода сорбированной липазы (около 70! прочность связывания оставалась низкой. Эксперименты по десорбции иммобили: ванной липазы в процессе гидролитической реакции показали, что ко втор реакции гидролиза триацилглицеролов остается около половины исходной липазн активности, а к 3-й - около трети.

Была осуществлена попытка закрепления фермента на поверхности алюмос ликата бомбардировкой электронами и у-излученнем в разных режимах и соот! шениях. Предварительные результаты показывают, что в оптимальных услови имеется лишь незначительная потеря активности иммобилизованного фермента, кратность использования увеличивается до 6, что свидетельствует об образован более прочных связен между белком и амомоснлпкатом во время бомбардиров!

[сследовали также и химические методы иммобилизации липазы. Для иммобили-зции были применены различные носители: сефароза, полиакриламид, силохром, люмосиликаты и силикагели как не модифицированные, так и с привитыми руппами, такими как СЫВг-, амино-, карбокси-, эпокси-, диаладегид- и БН-группы.

Подбирались оптимальные условия для иммобилизации путем ковалентного вязывания, для чего в отдельных случаях применяли глутаровый диальдешд. Резуль-аты исследований представлены а табл. 9.

Носители вели себя по-разному. Так, в случае БН-силохрома, иммобилизова-ось много белка (до 37%), но при этом не иммобилизовалась или инактивировалась лпаза, в случае же аминоснликагеля и эпоксисилнкагеля иммобилизовалось мало уммарного белка (4 и 1,3%), но при этом на носителе находилось соответственно юловина и четверть исходной липазной активности. Для оценки и выбора лучшего юситаля было введено понятие индекса аффинности носителя к липазе, который шределяется расчетным путем (частное от деления двух отношений - "иммобилизо-|анная липазная активность/исходный суммарный белок"). Значение индекса от 0 до свидетельствует об отсутствии сродства носителя к липазе, либо о её частичной или

Табл. 9 Зависимость содержания белка и липазной активности при

иммобилизации ферментного препарата липазы на различных носителях.

Носитель Им моб. белок Активность Им моб. белок Иммоб. акт. Индекс аффинности носителя к липазе

носитель мг/г C.B. Иммоб. белок Е/мг Исходи, белок % Исходи, акт. %

С В - Сефароза 2,1 0,6 14 6 0,43

Эпокси сефароза 33,6 0,1 67 2 0,03

А ми носефароза 2,4 1,2 24 9 0,38

Полиакриламид 116,0 0,1 58 4 0,07

Ами носил охрой 21,0 0,5 62 14 0,23

Эпоксисилохром 4,3 6,0 9 36 4,00

Эпоксисилохром 8 присутствии Теин-20 0,3 17.7 8 19 2,38

Днальдегирсилохром 4,4 0,9 26 19 0,73

о>Аминоф&нилсилохром 2.5 0,8 18 2 0.11

р-А ми нофенм леи покром 4,3 0,3 30 1 0,03

Алюмосиликат (0,5 мм) 4,1 0.7 35 21 0,60

Алюмосиликат (0,5 мм) 1,7 3,5 15 41 2,73

А миносил и нагель 0.6 21,3 4 54 13,50

Элоксисиликагель 0,4 65,0 1 23 23,00

Н-силохром 4,9 37

полной инактивации. При значениях, больших 1, сродство возрастает и иммобилизуется преимущественно липаза.

Из табл. 9 видно, что введение детергентов при иммобилизации хотя и улучшало растворимость ферментного препарата, однако ухудшало аффинность и в результате снижало эффект иммобилизации.

На основе полученных данных мы остановились для более детального исследования на следующих перспективных носителях: аминосиликагель, эпоксисиликагель, алюмосиликат и эпоксисилохром. Были изучены и оптимизированы концентрационные зависимости, рН-зависимости. Так, например, было показано, что макси-1-7*

мальное количество липазы связывается на эпоксисилохроме при рН 6,0, а н. эпоксисиликагеле при рН 7,5.

При иммобилизации липазы оптимумы рН сдвигались в щелочную область ] достигали 8,0. Также увеличивался ее температурный оптимум с 35 до 40" С.

2.2.5.3. Исследование областей применения липаз.

Ферментные препараты липазы не находят пока еще широкого применения 1 промышленности России из-за отсутствия их производства. Область их возможной применения не ограничивается только введением в состав моющих средств ши хлебопечением, где их можно использовать в качестве регуляторов биохимические процессов. Иммобилизация липаз открывает новые возможности для их широкоп применения в биотехнологии, жиропереработке, биоорганическом синтезе, при уело вии разработки технологий непрерывных процессов гетерогенного катализа ка] гидролиза, так и синтеза.

Нами была продемонстрирована возможность расщепления триацилглицероло! в однофазных системах для низкомолекулярных субстратов и в двухфазных система: для высокомолекулярных. Этот процесс, ведущийся при температуре около 30'С I нормальном атмосферном давлении, значительно менее энергоемкий, чем существу ющий ныне процесс расщепления жиров до глицерина и жирных кислот пр> температуре 230-260"С и давлении 2,5-5,0 МПа. Перспективен он и в области синтез« сложных эфиров. Так, нами был осуществлен процесс синтеза восков в микроводио! системе (гексане). Для синтеза жирных кислот С16_18 и жирные спирты С12.ц растворяли в гексане в эквимолярном соотношении и инкубировали с препарато» липазы в течение 15-20 часов при ЗО'С. Выход восков был практически коли чественным. В настоящее время разрабатывается способ непрерывного синтез« восков на иммобилизованной липазе.

Имеются предварительные положительные результаты по липазному синтез! аскорбил-6-пальмитата, который обладает, как было показано нами, витаминной антиоксидантной, антимутагенной и поверхностной активностью и может применять ся как регулятор биохимических процессов как в тестоприготовлении (А.С.№ 163074" (разд. 2.2.З.6.), так и в других областях пищевой промышленности.

2.3. Создание нового поколения термостойких полимер-минеральных сульфо катионитов - катализаторов кислотного гидролиза.

2.3.1. Научно-теоретическое обоснование необходимости создания термостой ких полимер-минеральных сульфокатионитов.

Разработка биотехнологических процессов ферментативного гидролиза без условно имеет большое будущее во многих отраслях промыгг\енностн, но эт! прогрессивные технологии очень наукоемкие и требуют высокой технологнческо!" культуры производства и высокого образовательного ценза работников. Кроме того они пока еще относительно дороги и требуют определенного урошш разпитш экономики и соответствующей инфраструктуры. Поэтому, несмотря на очевидные преимущества разрабатываемых технологий, гидролиз крахмала, гидролиз жиров

тгез воскоп и других сложных эфнров, гидролиз целлюлозы и белков чаще дцествляют путем гомогенного кислотного катализа. В большинстве случаев в -:естве катализатора - донора протонов применяется серная кислота, которую •ем необходимо отделить от реакционной массы и утилизировать, что создает ределенные технологические и экологические затруднения. Для интенсификации Чествующих технологий гидролиза, очевидно, необходимо перевести их на гетеро-шый кислотный катализ, при котором кислота прочно связана с твердым сителем, что позволяет сделать процессы непрерывными, менее энергоемкими и злогически безопасными.

Применение для этой цели существующих катнонитов лимитируется их невы-гай термостойкостью: уже при 120"С они начинают разрушаться. Кроме того, они еют свойство набухать или сжиматься в растворителях, а их гранулометрический л'ав неблагоприятен с точки зрения гидродинамики для ведения непрерывных оцессов в проточных реакторах колонного типа. Из-за мелкодисперности происхо-г унос гранул из зоны реакции, происходит спекание и окисление полимерной новы при высоких температурах, имеются также трудности с отделением вязких одухтов реакции и другие проблемы.

Поиски новых дешевых источников сырья для синтеза термостойких полиме-в, прививка к ним ионогенниых групп, разработка технологий фиксирования этих \ъфополимеров на минеральные носители с развитой поверхностью и определен-[м гранулометрическим составом позволяют, прежде всего, повысить термостабиль-сть катнонитов и снизить вероятность протекания вышеуказанных процессов, им целям по комплексу физико-химических свойств соответствуют полимеры с стемой сопряженных связей (ПССС).

В то же время набор различных структур ПССС и минеральных носителей вт основание говорить о возможности получения на их базе новой серии термо-эйких катализаторов кислотного типа с заданными физико-химическими свойства-[ и разработать на их основе новые химические процессы с решением ряда кнологических и экологических проблем.

2.3.2. Разработка технологии производства термостойкого сульфокатионита на нове сульфополифениленкетона на минеральном носителе.

Ранее работами А.Ф.Лунина, С.В.Мещерякова и других было показано, что иболее подходящими полимерами для создания нового поколения сульфокатиони-п являются полимеры с системой сопряженных связей (ПССС), получаемых [сокотеммпратурнон поликонденсацией из относительно дешевого сырья (фталевый гидрид, фталевая кислота, ацетон, нафталин, ацетилацетон, уксусная кислота, ленноиая кислота, ацетофенон).

Получаемые ПССС имеют ярко выраженный характер, способны к привитию ногетшх групп и обладают рядом важных свойств, как термостойкость (до 250*С), мичсскли устойчивость к агрессивным средам, радиационная устойчивость.

электропроводимость, парамагнетизм, способность к ингибированню полимери з ционных и окислительных процессов.

Был разработан способ проведения поликонденсацин на поверхности мин рального носителя (алюмосиликат, цеолит, силикагель) с заданным гранулометр] ческнм составом. Методика получения термостойкого сульфокатионита реакторны методом включает в себя следующие стадии, представленные на схеме (рис. 3):

Рис. 3, Схема получения полимер-минеральных сульфокатионитов.

Учитывая тот факт, что фталевый ангидрид и фталевая кислота способн подвергаться термической высокотемпературной поликопденсации, а также наличг их крупнотоннажного производства, они были выбраны в качестве объектов д) детального изучения закономерностей термической поликонденсации и сульфиров ния полученных продуктов.

Полифениленкетон и его сульфопроизводное образуются по следующи реакциям:

СПФК на мин ралыгом носителе п лучил название "Фт лосорб" (ФС). На о нове предварительнь исследований и лаб раторных испытан! для синтеза ФС 61 сконструирован произведён реакт< объемом 0,5 м3, кот рый установлен ] Московском жировс

комбинате. Разработана также технологическая схема производства ФС (рис. ■ которая может быть применима и для других мономеров.

оХ>-

о

г

-со.

,о с—

г

-со2-н2о

-О с-он

Сг-он о

фталевый ангидрид полифенилеккетон (ПФК) фталевая кислота

|Н25 04

О

\

Б03И п

сульфополифеииленкетон (СПФК)

О

С

При проведении процесса нанесения Г1ССС оказалось, что степень дегндрата-(и АС существенно влияет на количество фиксированного полимера. Как видно из

данных, приведенных в табл. 10,

Табл. 10. Влияние степени дегидратации алюмосиликата на количество адсорбированного полимера.

емпература Количество десорбмро- Количество полимера иа

|рогрева, "С ванной волы, % (масс.) носителе, % (масс.)

150 1.3 2.4

250 2.1 3.5

350 3.5 8.7

физически адсорбированная вода препятствует адсорбции полимера, а ее удаление при *)50°С приводит к максимальному количеству полимера, фиксированного на поверхности носителя.

Изучали влияние времени и температуры полнкоиденсации на количество зразующихся ПССС с целью получения нерастворимых полимеров, адсорби-эванных на поверхности алюмосиликатов. Найдено, что подогрев реакционной ассы до 450°С в течение 3 ч после 1 часа предварительной пропитки приводит К 5разованию нерастворимых полимеров.

При поаышении температуры выше 500'С количество водорода в полимерах езко уменьшается. По-видимому, при этих температурах происходят процессы, риводящие к образованию высокомолекулярных систем, не способных к реакциям лектрофильного замещения, какой является сульфирование.

Из данных, приведенных в табл. 11, видно; что при температуре нанесения олимера 350°С фиксируется только 5,8% полимера, растворимого в серной кислоте, оторый при сульфировании частично вымывается с поверхности алюмосиликата и [в позволяет достичь существенных значений статической обменной емкости (СОЕ).

Табл. 11. Элементный состав полифениленкетона, нанесенного

на алюмосиликат марки АС-37 при различных температурах.

Температура, 'С Элементный состав, % (масс.) Найдено в органической части, % Статическая обменная емкость, мг-экв/г по МаС1

неорганическая органическая Н С

350 94.17 5.83 11.14 87.61 0.09

450 86.69 13.31 12.11 54.55 0.24

500 85.2 14.8 3.94 60.58 0.03

550 83.81 16.19 2.42 69.87 0.02

Полимер на носителе, полученный при 450'С, не вымывается с поверхности 1люм0снликата при сульфировании, сохраняет свойства полифениленкетона. Скол ранул черного цвета говорит о том, что полимер равномерно заполняет поры носителя.

2.3.3. Разработка способа получения полимер-минеральных термостойких ;ульфокатионитоп на основе отходов химической и гидролизной промышленности.

Экспериментально показано, что в ряде случаев для поликонденсации на минеральном носителе в качестве сырья можно использовать отходы химического производства, такие как поливиниловые спирты, кубовые остатки дистилляции нафталина, а также лигнин - отход гидролизной промышленности. Если в случае

нафталина и других возгоняющихся мономеров можно использовать описанную В! ше технологию, то с лигнином и полипиниловым спиртом требуется ее модификаци

Для поликонденсации образец измельченного лигнина, предоставленный ш Санкт-Петербургской Лесотехнической Академией, растворяли в диоксане, отделя/ осадок и пропитывали гранулированный АС полученным раствором. После отгонки

Рис. 4. Принципиальная схема получения органо-минерального сульфокатионита. 1 реактор нанесения полимеров на минеральный носитель, 2 - дефлегматор, 3 - воздуходув* 4 - газовые горелки, 5 - люк для загрузки, 6 - ёмкость для носителя, 7 - ёмкость д фталевого ангидрида, 8 - ёмкость для несульфированной композиции, 9 - ёмкость для ко центрированной Н^БО,), Ю - ёмкость для 50%-ной ^БОф 11 - ёмкость для дисти лированной воды, 12 - резервуар для олеума, 13 - резервуар для щёлочи, 14 - реакт сульфирования, 15 - ёмкость для сульфокатионита, 16 - резервуар для концентрирован ^ЭО/), 17 - нейтрализатор, 18 - водный дистиллятор.

юксана проводили те же манипуляции, что и в случае ФС. Синтезированный ¿льфокатионит был назван "Липюсорбом" (ЛС).

Применение отходов для производства термостойких катионитов может зна-ггельно снизить производственные затраты и частично решить экологические эоблемы, связанные с утилизацией этих отходов.

2.3.4. Исследование физико-химических и химических свойств "Фталосорба", шгносорба" и других термостойких полимер-минеральных сульфохатионнтов.

Все полученные типы сульфокатиоиитов оказались близки по своим физико-[мнческпм и техническим параметрам. Внешне они представляют гранулы черного !ета диаметром 2-6 мм в зависимости от гранулометрического состава исходного шерального носителя. Насыпная масса варьирует в интервале 650-720 кг/м3, а .ельная поверхность - 200-300 м2/г. Гранулы не меняются в объеме в любых раст-рителях, очень прочны и при испытании яа механическую прочность гдерживают нагрузку 2,5-3,0 МПа. Полная статическая объемная емкость (ПСОЕ) 1ла в пределах 1,5-2,5мг-зкв/г {по №ОН).

Все сульфокатиониты были устойчивы к агрессивным средам и радиации, не [зывали коррозии металлов, являлись ингибиторами полимеризационных процессов не были токсичны, что подтверждено экспериментально в лаборатории токсико-гии и исследования побочного действия лекарственных препаратов.

Была установлена и изучена стереоспецифичность полученных сульфокати-итов при воздействии на непредельные соединения в модельных реакциях в ниавтоклавах под инертным газом. Образцы катионитов и чистые минеральные сители в качестве контроля выдерживались с олеиновой кислотой (с примесью 5% \ьмитиновой кислоты в качестве маркера) при 210"С в течение 6 часов, затем годом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) оценивали коли-:твенно появление элаидиновой кислоты (гранс-изомера исходного продукта) и зиционных изомеров олеиновой кислоты.

Полученные результаты представлены в табл. 12. Из данных таблицы видно, > сульфокатиониты, несульфированные ПССС и носители по-разному действуют олеиновую кислоту, вызывая в разной степени геометрическую или позиционную >мерню, что указывает на их более или менее выраженную стереоспецифичность.

"Лишосорб" (на цеолите) и "фталосорб" (на цеолите) полностью не вызывали миграции двойной связи, ни перехода цис-конфигурации в транс, что свидетель-ует о высокой стереоспецифичности конденсированного сульфолигнина и сульфо-мфеннленкетона. Минеральные носители в чистом виде ие обладали стереоспецн-чностью, вызывая образование как позиционных, так и геометрических изомеров соотношении, свойственном термодинамическому равновесию под действием ена (20% цис- и 80% транс-изомеров). Однако они оказывали влияние на стере-ецифичность нанесённых на них ПССС (сравнить позиции 5 и 14. табл. 12). лфирование ПССС в одних случаях практически не влияло на их стсреосшщи-

Табл. 12. Изомеризация олеиновой кислоты в присутствии различных термостойких сульфокатиоиитов и соответствующих несульфированных ПССС и минеральных носитегвй

№ Катализатор Время реакции, ч Пальмитат (%П) Олеат <%0) Эландат (У»Э) Продукты миграции (%П.М.) Э/О

1 АШНЦ-АцС 5 8,79 17,01 65,26 ! 89,41 3.83

2 АШНЦ-Ац 6 6,47 17J3 64,48 ! 113.20 3.63

3 АШНЦ-ААС 6 8,37 17j31 66,54 i 74,14 3,84

4 АШНЦ-© 1, 6,76 22,40 70,27 0,57 3.13

5 АШНЦ-ФС 6 7,27 16,25 76,48 0 4,70

С Цеокар-Ф б 6,06 30,26 63,68 0 2.10

7 Цеокар-ФС 6 8,53 21,60 62,26 762,08 2.88

8 АШНЦ-НС 6 7,96 17,94 68.63 547.02 3.82

9 АШНЦ-АФС б 10,09 18,88 64,21 682,11 3,40

10 АШНЦ-П8С б 5,12 27,82 67,06 0 2.40

11 АШНЦ-ПЗ б 6,55 27,03 66,29 0,08 2,44

12 Лигносорб 6 5,09 94,91 0 0 -

13 АШНЦ-МАС 6 7,00 15,85 69,28 786,10 4,37

14 Цеолит-ФС 6 7,89 92,11 0 0 -

15 АШНЦ б 8,86 18,58 66,34 621,01 3,50

16 Ueokap-3 6 8,23 17,65 68,99 512,07 3,90

Обозначения:

АШНЦ - алюмосилихат шариковый натрий-цеолировьнный

Цеокар-3 и Цеолит - марки цеолированного алюмосиликата

Лигносорб - лнгник поликонденсированный на аломосиликати и сульфированный

Ац и АцС - на основе ацетона (несульфированный и сульфированный)

ААС - на основе ацетилацетона (сульфированный)

<3> и ОС - на основе фталевого ангидрида (кесульфмрованиии и сульфированный)

НС - на основе нафгалина (сульфированный)

А ОС - на основе ацетофенона (сульфированный)

MAC - на основе г; алей нового ангидрида (сульфированный)

ГШ и ПБС - на основе поливиниловых спиртов (несульфирог-анный и сульфированный)

фичность (позиции 1 и 2), а в других случаях вносило существенный вклад (пози 4 и 5; 10 и 11).

На основе полученных данных были выбраны два сульфокатионита: "Ли сорб"-(ЛС) и "Фгалосорб" (ФС), наиболее перспективные в качестве доноров прото для гидролитического кислотного катализа при работе с ненасыщенными соед! ниями. При работе с предельными соединениями можно использовать в принц все типы сульфокатиоиитов.

2.3.5. Исследование каталитических свойств сульфокатиоиитов в реакс гидролиза, синтеза и применение продуктов реакции.

Оценку каталитичесих свойств сульфокатиоиитов проводили в стационар условиях в миннавтоклавах объемом 5 мл, в запаянных ампулах объемом 5 м реакторе объемом 50 мл в периодическом режиме, а также на лаборатории пилотных установках непрерывного действия в реакторах с неподвижным с/ катализатора.

2.3.5.1. Изучение каталитической активности "Фталосорба" и "Лигносорба" в кциях этерификации жирных кислот одноатомнымн высшими спиртами.

Обширные области применения природных восков (типа пчелиного, рмацета, ланолина и т.п.) и их синтетических аналогов и исчезающие источники растительного и животного происхождения определяют большой интерес шков-органиков к поиску новых, экономически выгодных и экологически чистых щессов их получения.

Одним из таких процессов может быть этерификация указанных кислот выс-ми спиртами в присутствии "Фталосорба" и "Лигносорба". Поэтому нами проведе-исследования перспективности применения таких сульфокатионитов в качестве ализаторов в реакциях этерификации стеариновой кислоты индивидуальными :ококипящимн спиртами от Сю До С]д и фракцией спиртов С2[-С2д.

О О

II II

Н-С-ОН + И>-ОН К-С-О-й- ( где: к = сг/; к = С10.С2а

В качестве катализатора использовали модификации "Фталосорба" и ппосорба" на алюмосиликате (АС-37) и силикагеле (КСКГ).

Этерификация проводилась на установке периодического действия с отгоном до и продувкой реакционной массы инертным газом. Контроль за ходом реакции тцествляли по изменению кислотного числа реакционной массы и путем анализа зб на газожидкостном хроматографе "Хром-5" с пламенно-ионизационным ектором.

Оптимальные условия проведения процесса определены на примере этерифи-(ии стеариновой кислоты тетрадеканолом. Максимальная степень превращения :лоты 97% получена при 180*С, зквимолярном соотношении реагентов, времени ггакта Зч, количестве катализатора 30% (масс.).

В этих условиях проведен ряд опытов по сравнению каталитической активен сульфокатионитов с соответствующими носителями и с термическим процессом. Результаты приведены на рис. 5. Оба полимера обладали практически одинаковой каталитической активностью, лишь носитель вносил незначительный вклад на ранних стадиях катализа. Степень превращения кислоты в присутствии сульфокатионитов на 20% выше, чем в присутствии чистых носителей и значительно пыше (на 30%) результатов термического процесса.

Зависимость выхода тетрадецилстеарата от времени в процессе этерификации стеариновой кислоты тетрадеканолом при мольном соотношении кислота : спирт - 1:1, температуре 180*С. 1 - ФС м ЛС на КСКГ, 2 - ОС и ЛС на АС-37, 3 - 30% КСКГ. 4 - 30% АС-37, 5 - термический процесс.

100

20

05

время, ч.

5

О

2

В этих условиях пров» депа серия экспериментов п определению влияния длин алкильной цепи спиртов и выход сложных эфиров. этой серии использовали м( .дификацви сульфокатионитс на АС и индивидуальна спирты от С10 до С1б, а так» фракцию спиртов С21-С (рис.6). ФС и АГ давал близкие результаты.

Как видно из приведенных данных, степень превращения кислоты на 2-4 повышается с увеличением длины алкильной цепи спирта. В то же время замечен; что выход сложных зфиров чётных спиртов выше, чем у нечётных. Это, очевидн< связано с различиями в значениях энергии Гиббса, которые у чётных спиртов выш чем у идущих за ним нечетных. Из этого можно сделать вывод, 'по чётные спирт имеют более высокую внутреннюю энергию, чем последующие нечётные. Поэтом для чётных спиртов требуется меньшая энергия активации, и этим можно объяснит их большую реакционную способность в реакции этерификации.

Анализ данных табл. 13 показывает, что выход сложных эфиров увеличиваете с повышением молекулярной массы этерифицирующегося спирта. Эту зависимое] можно объяснить различным отношением спиртов к конкурирующей реакции д| гадратации.что подтверждается значениями йодных чисел, убывающими с 11 до 2 повышением массы спирта от Сю до С15, а в случае этерификации стеариновс кислоты фракцией кислот С21-С26 непредельных соединений в продуктах реакции £ обнаружено.

Табл. 13. Характеристика сложных эфиров, полученных при этерификации стеариновой кислоты различными спиртами при 180'С, времени 3 ч, соотношении спирт : кислота - 1:1, в присутствии 30%(масс.) сульфокатнонита.

№ Сложные Степень превра- Характеристика эфироа

п/п эфиры щения кислоты, % Кислотное число Йодное число. Температура

мг КОН / г г йода / г плавления, *С

1 Децилстеарат 93 8 10 40

2 Додецилстеарат 95 7 • 7 43

3 Тетрадецилстеарат 95 6 3 44

4 Гексадецилстеарат 97 3 2 53

Сложные эфиры стеари-

5 новой кислоты и фракции 98 3 - 68

спиртов С21-С26

6 Ундецилстеарат 90 12 11 42

7 Тридецилстеарат 92 9 6 44

в Пентадецилстеарат 93 7 5 . 48

Рис. Выход сложных эфиров в реакции этерификации стеаринооой кислоты чётными и нечётными жирными спиртами СЮ - С15. | | - каталитический процесс о - термическим процесс

Высокая эффективность ФС и АС в синтезе сложных эфиров по сравнению с >мическими процессами дает, основание предложить непрерывную технологию ^учения таких эфиров на установках с реактором проточного типа. .

Для этой цели была разработана лабораторная установка получения сложных иров (аналогов природных восков) с реактором объёмом 0,05 л, работающим в киме прямотока, с непрерывной подачей сырья в виде расплава. Для сравнения проведены эксперименты, как в присутствии сульфокатионитов, так и на :тых носителях. Результаты приведены в табл. 14.

Тгбл. 14. Характеристика непрерывного процесса этерификации стеариновой кислоты гексадеканолом в проточном реакторе при 1 ВО'С, мольном соотношении кислота: спирт - 1:1

Объёмная Степень Характеристика эфиров

Катализатор скорость, 1/ч превращения Кислотное число. Йодное число. Температура

кислоты, % мг КОН / г г йода / 100 г плавления, 'С

или ПС на АС-37 0.1 98 3 4.8 53

0.2 96 7 3.8 53

АС-37 0.1 72 20 3.4 53

0.2 68 32 2.8 54

Как видно из приведенных данных, ФС и ЛС показывают высокую эффектив-:ть в данном процессе. Выход сложных эфиров на 26% выше, чем п присутствии трального носителя. Полученные эфиры без последующей очистки имеют харак-истики аналогов природных восков. Полученные сложные эфиры стеариновой :лоты и сложных спиртов были испытаны в качестве противозадирных и противо-юсных добавок индустриальных масел, вкачестве компонента пластических масс основе диацетата целлюлозы, в качестве свечной массы в производстве свечей.

2.3.5.2. Испытание сложных эфиров в качестве добавок к индустриал!,ным •лам.

Сложные эфиры стеариновой кислоты и децилового спирта (СД), сложные яры стеариновой кислоты и тетрадецецилового спирта (СТД) и сложные эфиры ариновой кислоты и синтетических жирных спиртов С2|-С26 были испытаны в естве присадок, положительно влияющих на противозадирные и противоизнос-з свойства масляных систем, содержащих дисульфид молибдена МоБ^ В качестве ового было выбрано остаточное масло селективной очистки (И-Т-А-460) из нистых нефтей (ПС-28) с 1,5% содержанием дисульфида молибдена марки ДМ-1.

Исследования проводились на четырехшариковой машине ЧШМ-32. Было :азано, что введение 1,5% СД и СТД в масло, приводит к уменьшению износа тцихся поверхностей (соответственно на 37 и 35,4% по площади пятна износа) и кому повышению противозадирных свойств.

2.3.5.3 Испытание сложных эфиров в качестве пластификаторов биодеграда-ъных пластмасс.

Сложный эфир стеариновой кислоты и фракции спиртов С21-С26 (аналог линого воска) был испытан в качестве компонента пластических масс на основ«'

даацетата целлюлозы (биодеградабелыше этролыше композиции разработаны лаборатории на кафедре "Органическая химия" Московской Государствен! Академии прикладной биотехнологии с целью определения его модифицируют действия.

Полученные результаты показывают, что аналог пчелиного воска эффективе] качестве структурной смазки этрольных композиций и его введение улучш перерабатываемость материала, заметно повышает эластичность системы как водных, так и в жирных средах. Повышается саннтарно-химическая добро чественность материала, что проявляется в заметном снижении миграции низ; молекулярных веществ в среды, моделирующие пищевые продукты.

С учетом выпуска модифицированного этрола потребность в аналоге пчелиж воска по предварительным данным составит 4,5 т/год.

2.3.5.4. Изучение каталитической активности "Фталосорба" и "Лигносорба' гидролизе жиров.

Процесс гидролиза сложноэфирной связи в гриацилглицеролах с целью по. чения карбоновых кислот и глицерина требует катализаторов кислотного типа высоких температур, либо еще более высоких температур и давления при бескс тактном способе расщепления жиров в производстве глицерина и жирных кислот.

Реализованные в промышленности гомогенные процессы гидролиза эфиров контактах Петрова и Твитчела сопровождаются рядом технологических и эко.

Рис. 7. Зависимость степени превращения рафинированного подсолнечного масла от времони гидролиза в автоклаве при 210'С, соотношение катализатор: вода : масло 2:1:1 (ФС - ФС на цеокар«, ФС2 - ФС на на алюмосиликате, ЛС - ЛС на цеолите, К - термический процесс. Степень превращения определяется кислотностью реакционной массы, выраженной в % олеиновой кислоты.

гических проблем. Бесконтактный же метод гидролиза по технологии "МашопГ и

О "ЬигдГ характеризует

СН-С-ОЯ СН —ОН высокими энергетическ

I I ми затратами (Т= 260"

СН-С-ОЯ +ЗНО СН-ОН +3 к-с-ои „ ,

+ J . -г р = 5,0 МПа,).

енгс"°оя СНгОН Оценку эффекта

:ти различных модификаций синтезированных сульфокатионитов в процессе ролиза масел проводили в стационарных условиях, в автоклаве ёмкостью 5 мл. В [естве объекта для исследований использовали рафинированое и дезодориро-шое подсолнечное масло с остаточным кислотным числом 0,5 мг КОН/г. Загрузку оклава производили в соотношени катализатор:масло:вода =2:1:1 (масс.). Техноло-:еские парамегры процесса приняты близкими к существующему в нашей стране умышленному автоклавному методу гидролиза жиров (Т=200-210'С, время контак-6 ч). Найдено, что степень гидролиза подсолнечного масла достигает максималь-■о значения 85% за 6ч как в присутствии катализаторов, так и без них (рис. 7). ЛС цеокаре имел каталитическую активность, идентичную с ФС на цеокаре. Для того, >бы оценить эффективность испытуемых катализаторов в сравнении с термичес-ч процессом и минеральными носителями, принято время контакта 2 ч. В1 этих копиях осуществлена их "тренировка", состоящая в том, что одну и ту же порцию гализатора после каждого опыта в гидролизе масла, отмывали спирто-эфирной эсыо, высушивали до постоянной массы и затем снова вовлекали в процесс фолиза. Данные этих исследований приведены на рис. 8. Оказалось, что при огократном использовании

с. 8. Зависимость каталитической активности катализаторов в гидролизе подсолнечного масла от времени при многократном использовании (ФС-1 - ФС на Цеокаре, ФС-2 - ФС на алюмосиликате, К - термический процесс)

30=-

5 6 7 Время, ч

[неральных носителей в процессе гидролиза подсолнечного масла, наблюдается метное снижение их активности (до10%). Это явление, по-видимому, связано с лимеризацией непредельных кислот, протекающей на поверхности носителей, и степенным блокированием активных центров алюмосиликатов от цикла к циклу. У С" и "ФС" в этих же условиях наблюдается повышение активности. Это ъясняется, очевидно, вымыванием низкомолекулярной части полимерной основы акционной массой, деблокированием пор носителя, а также ингибирующей особностью системы сопряжения, препятствующей полимеризационным процессам адсорбционном слое катализатора.

Рассматривая данные, полученные при гидролизе подсолнечного масла, в авненни с промышленными процессами, можно сделать вывод о перспективности

применения термостойких сульфокатионитов типа "АС" и "ФС" в этом процессе, ч приведет к значительному снижению энергозатрат (температура - с 260 до 210' давление - с 5 до 2 МПа), времени контакта и упрощению технологии. В то ж.е врет процесс гидролиза масел на термостойких сулъфокатионитах дает еще од преимущество по сравнению с процессами "Мааиош" и "1лндГ, а именно, повыша концентрацию глицерина в глицериновой воде, что, в свою очередь, приводит значительному сокращению энергозатрат на её выпаривание. На рис. 9 приведе! результаты гидролиза подсолнечного масла в виде зависимости концентрац] глицерина в глицериновых водах от соотношения "вода :масло". Анализ данш показывает, что в присутствии сульфокатионитов можно проводить процесс гидролиза с достаточно высокой степенью превращения триацилглицеролов (до 90' с уменьшением количества воды до 30-35% по сравнению с промышленнь процессом. Особенно наглядно это иллюстрируется сравнением концентращ глицерина в глицериновой воде при термическом и каталитическом гидролизе за 4 (кривые 4 и 5 на рис. 9). Аналогично ФС вел себя и АС.

Рис. 9. Зависимость содержания глицерина & глицериновой воде от соотношения вода: масло (Теор. - теоретический выход, ФС-2 - ФС на алюмосиликате, К - термический процесс)

100% I

90%

80% 70% 60% 60% 40% 30% 20% 10% 0%

10 20 30 40 50 Соотношение вода: масло, %

60

Следовательно, анализируя полученные данные по гидролизу подсолнечног масла на термостойких сулъфокатионитах, можно говорить о перспективности и использования в проточных реакторах.

Процесс гидролиза растительных масел в присутствии "Фталосорба" рекомен дован для внедрения на Московском жировом комбинате.

2.3.5.5. Изучение каталитической активности "Фталосорба" и "Лйгаосорба" i гидролизе дрожжевых фосфолипидов - отходов производства БВК.

Одной из технологических стадий при производстве белково-витаминны: концентратов в биотехнологии является извлечение микробного жира паприна и: дрожжей рода Candida. Это производство многотоннажное, поэтому стоит задач«

илизации побочных продуктов БВК. Многие фракции дрожжевых ляпндов нашли ое применение п различных отраслях промышленности. Из 7000 т дрожжевых >сфолипидов, производимых сейчас в нашей стране, используется лишь 5000 т, а 00 т пока не находят применения. С другой стороны, в стране имеется большой фнцит отдельных жирных кнслот, глицерина, холина и других компонентов, одящих в состав фосфолипидов. Поэтому была поставлена задача разработки особа гидролиза дрожжевых фосфолипидов с применением сульфокатионитов для лучения глицерина, жирных кислот и некоторых биологически активных единений, как например, холин, серии, коламин.

Сначала проводили исследование процесса гидролиза суммарных дрожжевых эсфолипидов в периодическом режиме без перемешивания в мшшавтоклавах. При дролизе в присутствии сульфокатионитов происходило их расщепление и расслое-ге реакционной массы на водную фракцию, содержащую аминоспирты, инозит и ицерин, и верхнюю масляную фракцию с жирными кислотами и продуктами лурасщепления. Было показано, что для полного расслоения реакционной массы в де гидролиза при !00"С, требуется не менее 30% сульфокатионита(по массе) и оло 16 часов времени. В присутствии 100% ФС или ЛС расщепление происходит за часа, а при 300% сульфокатионита фосфолипиды расщеплялись за 1 час. Вода во ех случаях была в избытке (1:9). Повышение температуры до 190°С приводило к лному (до равновесного состояния) расщеплению фосфолипидов даже при низких тцентрациях сульфокатнонита и воды.

Анализ полученных данных после оптимизации показывает, что лучше всего юводить гидролиз фосфолипидов при 130'С в течение 18 часов. В этом случае дролнз полный и расслоение фаз полное.

Успешно проведенное каталитическое расщепление фосфолипидов в этических условиях в присутствии термостойких сульфокатионитов ФС и ЛС илось предпосылкой для разработки непрерывного процесса. Для этого применили :актор колонного типа с электрообогревом. Поскольку исследования проводили при мосферном давлении, то максимальная температура процесса равнялась 100°С.

Исследовали влияние скорости пропускания 10% раствора фосфолипидов в >де и способов его подачи в колонну: верхняя подача и вытеснение (подача снизу), оказано, что при вытеснении гидролиз идет эффективней на 20%. В настоящее >емя ведется работа по внесению конструктивных изменений, позволяющих 1ботать под давлением, повышению эффективности процесса.

2.3.5.6. Изучение каталитической активности термостойких сульфокатионитов в дролизе ди- и полисахаридов.

В пищевой промышленности и биотехнологии осуществляют гидролиз ди- и >лисахаридов для получения глюкозо-фруктозного сиропа, сиропа гидролнзоианной [ктозы, глюкозного сиропа и высокоосахаренных полисахаридов. Для этого сиропы эносахаридов получают ферментативным или кислотным гидролизом. Ц"\),ю эк,и 1Стн исследований было применение термостойких сульфокатиопмтоп как ал:.Т"р-

нативного способа получения моносахаридов на основе более эффективного экологически безопасного гетерогенного катализа.

В качестве объектов гидролиза изучали сахарозу, лактозу и инул! (полифруктозан из топинамбура) и растворимый крахмал. Гидролиз проводили nf атмосферном давлении и температуре 100"С. Было показано, что расщеплен! гликозидной связи осуществляется довольно эффективно в присутствии "Фтал сорба" и "Лигносорба" в качестве катализатора. Основными факторами, влияющим на скорость и глубину гидролиза, являются концентрация субстрата в водно растворе, длительность и температура процесса и количество катализатора, ф вносили в количестве 0; 25; 50; 100 и 150% от массы углевода. Продолжительное! гидролиза была в интервале 30-150 минут. Степень гидролиза гликозидной связ монотонно возрастала в исследуемом интервале времени, а скорость гидролиз убывала по мере достижения равновесного состояния.

Увеличение концентрации ФС приводило также к - увеличению скорост расщепления Сахаров. Максимальное значение степени превращения Сахаров пр 100'С, продолжительности гидролиза 150 минут и концентрации ФС 150% был следующими: 96% для сахарозы, 74% для лактозы, 50,6% для инулина и (при 60'С 45,9% для крахмала (24 час.). Полученные данные говорят о принципиальной возмож кости создания технологии гидролиза ди-, олиго- и полисахаридов с использование) непрерывного процесса гетерогенного катализа на базе новых термостойки: полимер-минеральных сульфокатионитов.

Экспериментально доказана возможность эффективного применения получен ных гидролизатов в хлебопечении и замена ими сахара в некоторых рецептурах.

3. Заключение.

На основе выполненных исследований, анализа полученных данных и теоретя ческого обобщения можно заключить, что гидролитические процессы, столь широкс распространённые в биотехнологии, пищевой промышленности и химии с использованием ферментативного и химического кислотного катализа могут быть значительнс интенсифицированы. Как показано в настоящей работе, это достигается применением комплекса приёмов регулирования этих процессов с использованием разрабатываемых новых технологий гидролиза и синтеза при переходе на гетерогенный непрерывный катализ на базе иммобилизованных ферментов или нового поколения термостойких полимер-минеральных сульфокатионитов, не имеющих аналогов в мире. Главной целью и направленностью представленной работы, помимо интенсификации существующих гидролитических процессов и разработки новых технологий гидролиза и синтеза, является также ресурсосбережение и экологическая безопасность. Эти направления, как и возможные области практического применения результатов исследований настоящей работы, приведены на схеме (рис. 10).

Теоретическое обобщение результатов исследования и литературных данных позволило разработать химическую универсальную модель, описывающую процессы

гидролитических процессов.

Получение генно-инженерными методами штаммов дрожжей, синтезирующих глюкоамилазу и другие гидролазы

Производство ферментных препаратов

Производство термостойких полимер-минеральных сульфокатиоиитов — . катализаторов гидролиза с одновременной утилизацией отходов гидролизной и химической промышленности, таких как лигнин, кубовые остатки дистилляции нафталина и др.

Производство хлеба

Регулирование гидролитических и микробиологических процессов а тестоприготовлении

Формирование качества хлеба экзогенными и эндогенными ферментами-гидролазами, эффекторами и регуляторами дрожжевого метаболизма (напр. аскорбил-6-лальмнгаг)_

Производство дрожжей

Замена мелассы в питательной среде на крахмал

Очистка крахма-лосодержащих сточных вод с одновременным накоплением кормовой биомассы

Гидролиз Сахаров и полисахаридов

Производство сиропов для других

отраслей пищевой промышленности и биотехнологии из:

- сахарозы, — лактозы,

- инулина,

- крахмала и др.

Переработка жиров на основе новых технологий непрерывного гетерогенного катализа

Гидролиз жиров до глицерина и жирных кислот

Дорасщепление гудрона дистилляции жирных кислот

Синтез аналогов природных восхов (пчелиного, спермацета и др.)

Гидролиз дрожжевых фосфолипидов ■ отходов микробиологической промышленности (БВК)

Синтез асхорбил-б-п&льмитата и других сложных эфиров

кислотного гидролиза, синтеза и переэгерификации многих соединений эфирн природы со связями типа сложнозфириой, пептидной, амидной, ангидридной тиоэфирной (рис. И). Ддя ГЛИКОЗИДНОИ, ГЛИКОЗИЛИМИННОЙ (М-ГЛНКОЗИДНОЙ) И ТИОГЛ1

Рис. 1 1. Обобщённа я химическая модель лроцессоо слабокислотного гидролиза,

силтеза и перетарификации эфирных связей. ( О - гетероатом: О, N или 5; А' = Н либо отсутствует в случае, если С — О или 5/

в -У)

Я

I перегруппировка ■—

V Д - С * С ■ Л

■л I * 2

Ж

к я

д 1 ■О; II С X \ | \ в - д\ 2

Ю- II

д -/ II С

муклоофилимя атака катализаторы -доноры протонов

н

де протонизлция

Н^О и др. к-ты

Я • ЯС^Н (сульфо-

катиониты н сульфо-орг. кислоги) Н^О (при высоких

Г , Р) ферменты-гидролази

присоединение

V«

■О: X К ' С • <3 • К

о

' 4 /-—\ Я, н©

пере — группировк<

перегруппировка

©

:0: расщепление

/

Гидролиз сложного эфира (от А к 3): Синтез сложного эфира (этерификация, от 3 к А):

Перезгерификация сложного эфира (типа алкоголиза-глицеролнза, от А к 3): Гидролиз пептидной (амидной! связи (от А к 3); Синтез (от 3 к А): ПереэтеРисЬикаиия сложного эфира (типа аминолиза, от 3 к А): Аммонолиз сложного эфира (как частный случай аминолиза):

Гидролиз, синтез и переэтерификаиия тиоэфиров

1*1 и 1*2 = алкилы (или их производные); = Н.; в = О ; X - отсутствует

Я], и Я3 = алкилы (или их производные); в = О ; X - отсутствует

и — алкилы (или их производные); в =■ N ; и X Н

^ и = алкилы (или их производные); Э = N ; X = Н

и (?2 = алкилы (или их производные); С = М;1?зиХ = Н идентичны сложным эфирам (в = Б)

зндной связи разработана и приведена в работе другая химическая модель гидро-за, аналогичная представленной на рис. 11. Их объединение в одну модель, в прин-пе, возможно, но нецелесообразно из-за громоздкости и меньшей наглядности.

Модель свидетельствует о единстве гидролитических и синтетических процес-а и взаимопревращений по типу нуклеофильных замещений с механизмом огих органических соединений (в том числе и биологического происхождения) в мических и биохимических реакциях, катализируемых как ферментами, так и мическими катализаторами. Эта модель позволяет прогнозировать существование вых реакций, например, алкоголиз пептидной связи и т.п. Исходя из универсаль-стн законов природы, изучения и теоретического обобщения закономерностей фолнтических процессов в живых, биотехнологических и химических системах, жно заключить, что все химические постулаты действительны и для ферментатив-го гидролиза. Катализ, как химический, так и ферментативный, осуществляется по л же законам и тем же путем, различаясь лишь специфичностью и эффектив-стью, и во всех случаях его можно интенсифицировать, опираясь на знание этих сономерностей.

Новые данные подтверждают,что и ферменты гидролиза, такие как сериновые отеиназы и липазы, построены по сходному функциональному типу. Отличаясь по рвичной структуре, они имеют практически идентичный по пространственной нфигурации активный центр из трех аминокислот: серин—гистидин—аспарагиновая слота. Более того, показано, что химотрипсин может гидролизовать в определён-[х условиях не только пептидную, но и сложноэфирную связь. Опираясь на эти учные данные и разработанную универсальную химическую модель, был предска-г тонкий механизм функционирования липазы и протеииазы (рис.12). На рис. 12 едставлен молекулярный механизм работы липазы. Для протеииазы механизм ентичен, учитывая общность структур пептидной и сложнозфирной связи и яный механизм гидролиза, что видно из обобщённой химической модели (рис. 11).

Высказывается предположение, что функционирование сульфокатионитов в фолитических процессах может быть сходным с ферментативным, однако отсут-ше высокой специфичности связывания с субстратом, присущей ферментам, не эволяет сульфокатионитам достичь высокой активности. Сульфокатиониты, обла-ощие по данным наших исследований наибольшей стереоспецифичностью, такие (С "Фталосорб" и "Лигносорб", отличались наивысшей гидролитической и синтети-:кой активностью, что позволяет рассматривать их как синтетические модели иродных гидролаз. Дальнейшие исследования в этом направлении, создание новых дификацнй полимерной основы термостойких сульфокатионитов, обладающих \ьшей специфичностью к субстрату и являющихся по сути искусственными фер-птами, продолжаются.

4. Выводы.

Впервые очищена до гомогенного состояния глюкоамилаза Епс!отусор';1:; ьр. 20-9. гановлено, что это гликопротеин с молекулярной массой 53000 дальтон. Определе-

ны химические, кинетические характеристики и субстратная специфичность глк амилазы. Показано, что белковая часть фермента состоит из 473 аминокислот (41 дальгон), а углеводная часть - из 27-28 гексозных остатков (8,5% от общей массы).

Экспериментально доказано, что гидролиз крахмала, независимо от происхождения, осуществляется глкжоамилазой полностью с инверсией продукте! гидролиза и накоплением только глюкозы в (3-аномерной форме. Показано, что се и тирозин играют определённую роль в каталитической активности.

Разработан для промышленного использования способ выделения выс< очищенного ферментного препарата глюкоамилазы из ЕпЫотусорзгя яр. 1 Применение гомогенной глюкоамилазы в хлебопечении в модельных эксперимег дало положительные результаты при формировании качества хлеба.

2. Разработана и апробирована в промышленных условиях технология фермент! препарата липазы из ЯЛ/гория огугае "Липоризин ГЗх". Изучены характерист липазы и её субстратная специфичность.

Изучены различные способы иммобилизации липазы на органически} минеральных носителях. На основе экспериментальных данных, используя но! показатель - индекс аффинности, были выбраны четыре наиболее перспектив1 носителя, с которыми связывается преимущественно только липаза (аминосилг гель, эпоксисиликагель, алюмосиликат и эпоксисилохром). Определены характер тики иммобилизованной липазы. Установлено, что при иммобилизации происхо сдвиг оптимума рН в щелочную область (8,0)- и увеличивается температур! оптимум липазы с 35 до 40"С.

Осуществлен синтез восков в микроводной системе на основе липазного кг лиза, что подтверждает принципиальную возможность разработки промышленн непрерывного синтеза аналогов природных восков на основе гетерогенного катал с применением иммобилизованных липаз.

3. Проведено комплексное изучение гидролитических процессов, протекающих I приготовлении теста, и биохимического состава хлеба, произведенного по различи технологиям, а также определена роль различных факторов и регуляторов, влш щих на эти процессы и формирование качества хлеба. Показан положительн эффект внесенной глюкоамилазы из Епйотусор$1з «р. 20-9 в модельных экспе ментах. На основе полученных результатов и их теоретического обобщения опис. биохимическая модель "идеального" хлеба и определены пути направленного регу рования микробиологических, гидролитических и других биохимических процео для формирования заданного биохимического состава и качества хлеба.

4. Проведены исследования по изучению механизмов регуляции синтеза и секрет глюкоамилазы и а-амилазы дрожжеподобным грибом ЕпдотусорзгБ яр. 20-9. На ос: вании полученных данных и их теоретического обобщения предложена концепц апробация которой на практике в хлебопечении дала хорошие результаты и поз лила разработать новый способ приготовления хлеба, основанный на предварите ной обработке дрожжей аскорбил-6-пальмитатом (А.С. № 1630747).

12. Механизм функционирования липазы на молекулярном уровне, прогнозируемый на >ве универсальной химической модели гидролитических процессов по принципу двойного 1еофильного замещения (см» продолжение).

^^ / Сф 152 12.2^ЕСТР41 8 Слоит» аДО отчего ми» 1^-0-0-1*2

12.3.ги щща» ( \ АО» Г (/ Сар 152 ПЛ. . Т /{ Сер 152

12.5. [Гг6э жшэ» 12А. (^^^вш^ __/ с«ю"

12.7./" £?г<а диш» (г<Ш«..... V ^—" \л г___ / ДГ 1ц 152 1 К, ____^ 12.8. Ц«263 ша. ОчЬ

12.1. Активный центр липазы в конформации соответственно данным рентгено-структурнс анализа. Аспарагиновая кислота неионизирована благодаря гидрофобному окружению. 12 Субстрат попадает в активный центр сначала за счёт гидрофобных взаимодействий, а зат ориентируется с помощью Гис-263 (12.3.). 12.4. Протонизация эфира за счёт протона Асп-1 с образованием катиона оксония. 12.5. Образование карбкатиона с последующей 1 нуклеофильной атакой (12.6.). В качестве нуклеофила выступает Сер-152 липазы. Он прис< диняется к субстрату с образованием катиона оксония. 12.7. Перегруппировка и образован нового катиона оксония. 12.8. Вытеснение спирта (продукт 1) с расщеплением связи и I нуклеофильная атака молекулой воды образовавшегося ацилфермента. 12.9. Присоединен нового нуклеофила, образование нового катиона оксония. 12.10. Внутримолекулярная nef группировка с образованием нового катиона оксония. 12.11. Расщепление связи и вытео ние Сер-152 липазы. 12.12. Депротонизация и выход продукта 2 (ацила) из фермента последующей ионизацией (12.13.).

__Т ff с« ш 12,10. f*0 263 / y ЛШ >--- y) T if C.p 162 •

12.xi. ■ Гю 265 / Y ша* r^œèSr* \ toi 176(t «Т—!^. хуУ 1 Т fi Сц 152 12.12. Гмс 263 / у шала» T f C.p 162

гглъ. ^ U-C?——-sf Y y\ ^^ / Cep 152

На основе теоретических обобщений и экспериментальных исследований научно основана необходимость создания 1-ешга-инженернымн методами новых штаммов карских дрожжей, способных к синтезу и секреции глюкоамилазы. Такой штамм ccharomyccs ccrcvisiac ВКПМ У-1534 был создан (A.C. № 1742320) и разработаны ставы сред для культивирования новых дрожжей, предусматривающие замену лассы на крахмал.

Сделано научно-практическое обоснование применения нового штамма глюко-шлазных дрожжей для интенсификации гидролитических процессов при ускорен-IX способах производства хлеба, а также для утилизации крахмала отходов карто-;леперерабатывающих производств с одновременной очисткой крахмалосодер-1ЩИХ сточных вод.

Разработаны научные основы технологии получения и применения не имеющих алогов в стране и за рубежом термостойких полимер-минеральных сульфокатнони-в на базе фталевого ангидрида, нафталина, лигшчга и некоторых других отходов [мической промышленности путем их поликонденсации на минеральном носителе с следующим сульфированием. Показана перспективность их применения в качестве тализаторов высокотемпературных процессов гидролиза, синтеза и переэтери-1кации различных соединений эфирной природы (жиров, восков, фосфолипидов, [- и полисахаридов как сахароза, лактоза, инулин и крахмал). Изготовлена опытно-юмышленная установка для производства этих сульфокатионитов на Московском яровом комбинате.

Изучены физические, химические и физико-химические характеристики получен-ix сульфокатионитов с заданным гранулометрическим составом. Показана их высо-[Я механическая прочность, химическая и радиационная устойчивость, термоста-гльность (до 250*С), высокая пористость с рвзвитой поверхностью (Эуд = 250-350 !/г) и относительно высокая полная обменная емкость (* 2 мг-экв/г).

Установлена стереоспецифнчность полимер-минеральных сульфокатионитов в >зиционной и цис-транс изомеризации непредельных соединений. "Фталосорб" (на :нове фталевого ангидрида) и "Лигносорб" (на основе лигнина) обладали наиболь-им эффектом стереоспецифичности, сохраняя интактной пространственную шфигурацию субстрата и не вызывая позиционной изомеризации непредельных ic- жирных кислот.

Установлена эффективность применения полимер-минеральных сульфокатионитов качестве катализаторов реакций гидролиза сложных эфиров монокарбоновых 1СЛОТ (жиров) при температуре 213"С с высокой степенью инверсии (до 98%) в ^прерывном режиме (проточной колонне). При этом одновременно достигается шженне энергозатрат, упрощение существующей технологии и повышение (держания глицерина в глицериновой воде (до 20-25%). Процесс рекомендован к ¡едрению на Московском жировом комбинате.

Установлена эффективность полученных сульфокатионитов в качестве катализато-зв синтеза аналогов природных восков (типа пчелиного, спермацета и т.н.) in

стеариновой кислоты и высших спиртов (Сю-С2б) при эквимолярном соотношеии температуре 180°С, с высокой степенью конверсии (до 98%) в непрерывном режиме Показана возможность применения полученных восков в качестве противон носких и противозадирных присадок индустриальных масел, пластификатор' биоде-градабельных пластмасс для упаковки пищевых продуктов и свечной масс Процесс рекомендован к внедрению на Московском жировом комбинате. 10. На основе полученных экспериментальных данных и теоретического обобщен! выявленных закономерностей гидролитических процессов в живых, биотехнолог ческих и химических системах сформулирована концепция единого мехаииз] кислотного гидролиза как химического, так и ферментативного.

Предложена универсальная химическая модель процессов гидролиза, синтеза переэтерификации соединений эфирной природы (липидов, белков, амидов, тиоэф ров и т.п.). На основе предложенной модели описан химизм функционировав сериновых липаз, протеииаз и сульфокатионитов в гидролитических реакциях i молекулярном уровне.

Модель позволяет прогнозировать ход реакций гидролиза, синтеза переэтерификации, оптимизировать их и определять пути их интенсификации к, при химическом, так и ферментативном катализе в биотехнологии и различна отраслях пищевой и химической промышленности.

5. СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Кулаев И.С., Крашенинников И. А., Тырсин Ю.А. Нуклеиновые кислот высокомолекулярные полифосфаты • и некоторые ферменты полифосфатного обме! в синхронизированной культуре дрожжей Schizosaccharomyces pombe. Микробиология, 1973, T.XLII, №4, с.613-619.

2. Kulaev I.S., Krasheninnlkov I.A., Tyrsin Y.A. Nucleic acids, high molecu! polyphospates and some enzymes of polyphosphate metabolism in synchronized culture Shizosaccharomyces pombe. // Nucleic acid abstracts, 1974, c. 144.

3. Лущик T.A., Тырсин Ю.А., Яровеико B.B., Разаренова Н.Ф., Грачева И.1 Выделение и очистка глюкоамилазы Endomycopsis sp. 20-9. // Кристаллическ! ферменты. Тезисы Всесоюзного совещания, Вильнюс, 1975, с.71-72.

4. Грачева И.М., Лущик Т.А., Тырсин Ю.А., Пинчукова Е.Е. Очистка и свойст: глюкоамилазы Endomycopsis sp. 20-9. // Биохимия, 1977, т.42, №9, с. 1603-1609.

5. Тырсин Ю.А. Дрожжевые белки. Выделение и характеристика. 1 // Издан) МТИПП, 1978а, 59 с.

6. Тырсин Ю.А. Дрожжевые липиды. Выделение и характеристика. // Издан! МТИПП, 19786, 21 с.

7. Тырсин Ю.А. Аминокислоты. Изучение свойств и определение аминокислотно состава дрожжевых белков. // Издание МТИПП, 1978в, 47 с.

8. Тырсин Ю.А. Нуклеиновые кислоты дрожжей. Фракционирование и количестве ное определение. // Издание МТИПП, 1978г, 49 с.

9. Грачева И.М., Яровеико В.В., Тырсин Ю.А., Филиппова. Р.Л., фалунина З.Г Гайденко В.П. Концентрирование глюкоамилазы на ультрафильтрационном модул // Научные основы технологии промышленного пр-ва ветеринарных биологическ! препаратов. Тезисы Всесоюзной конференции, Москва, 1978, с.50-51.

10. Яровенко В.В., Тырсин Ю.А., Филиппова Р.Л., Фалунина З.П., Гайденко В.! Мембранное разделение растворов глюкоамилазы. // Научные основы технолога

юмышлеиного пр-ва ветеринарных биологических препаратов. Тезисы Всесоюзной |нференции, Москва, 1978, с.205-207.

.Tyrsin Y.A. Phospholipides des huiles vegetales. // Издание НИЛП, тезисы научной |нференции, Алжир, Бумердес, 1979, с.41.

. TyTsin Y.A. Chimie des Corps gras.// Издание НИЛП, Алжир, Бумердес, 1980а, 80 с. . Tyrsin Y.A. Recueil des Travaux pratiques sur la chimie des graisses. // Издание ЛАП, Алжир, Бумердес, 1980b, 30 с.

. Создать и внедрить высоэффективную технологию и оборудование, основнные на риодических и непрерывных процессах для производства ферментных препаратов, также разработать способы применения в различных отраслях. // Отчёт о НИР 4ТИПП/; № гос.регистр. №76047502 - М., 1980,-225 с.

. Тырсин Ю.А., Гернет М.В. Регуляция биосинтеза и секреции амилолитических грментов у Endomycopsis sp. 20-9. // Регуляция микробного метаболизма факторами ешней среды. Тезисы международного симпозиума ФЕМО, Пущнно, 1983, 143-144.

. Эльхаддад М.А., Тырсин Ю.А., Пучкова Л.И., Незнанова H.A. Влияние хлебопе-рных дрожжей Saccharomyccs cerevisiae на биохимический состав пшеничного ста. // Пути совершенствования технологических процессов и оборудования для i-ва, хранения продуктов питания. Тезисы Всесоюзлой конференции, Москва, 1984, >8-59.

. Эльхаддат М.А., Тырсин Ю.А., Пучкова Л.И. Превращение свободных амино-[слот в бродяшем тесте. // Торговля и снабжение - Сирия, Дамаск, 1984, №22, март, 13-44.

. Эльхаддад М.А., Тырсин Ю.А., Пучкова Л.И., Роговских И.В., Незнанова H.A. Ко-чественные и качественные изменения белков и свободных аминокислот пшенич-iro теста. // Депонированные научные работы, ВИНИТИ, - М.,1984, №7, с. 102-103. . Эльхаддад М.А., Тырсин Ю.А., Пучкова Л.И., Незнанова H.A. Влияние способа шготовления пшеничного теста на изменения количественного и качественного става липидов. // Депонированные научные работы, ВИНИТИ, - М.,1984, №7, 103-105.

. Эльхаддад М.А., Тырсин Ю.А., Пучкова Л.И., Роговских И.В., Незнанова Н.А няние длительности тестоведения на качество хлеба. // Хлебопекарная и конди-рская промышленность, 1984, №10, с.33-35.

. Калебина Т.С., Тырсин Ю.А., Тимохина H.A., Кулаев И.С. Литическое действие риновой протеиназы Bacillus brevis на клетки Candida utilis: зависимость от стадии 'Ста и фазы почкования дрожжей. // Доклады Академии Наук СССР, 1985, т.280, 6, с. 1469-1472.

. Эльхаддад М.А., Тырсин Ю.А., Пучкова Л.И., Незнанова H.A. Влияние способа >иготовления пшеничного теста на образование нелетучих органических кислот. // тонированные научные работы, ВИНИТИ, - М., 1985, №6, с.128-130. . Тырсин Ю.А., Эльхаддад М.А. Роль дрожжей Saccharomyces ccrcvisiae в формиро-нии биохимического состава пшеничного теста и качества хлебопродуктов. // »временные проблемы биохимии и физикохимической биологии. Тезисы I Всесо-)ной конференции молодых ученых, - М., 1985, с.46.

. Грачева И.М., Гернет М.В., Мосичев М.С., Тырсин Ю.А., Индисова Г.Е. Бнотехно-гические аспекты получения ферментных препаратов. // Тезисы съезда Всесоюзно биохимического об-ва, Киев, 1985, с.27.

. Тырсин Ю.А. Биохимические основы биосинтеза нуклеиновых кислот, болков, [инокислот и жиров. // Издание МТИПП, 1985, 48 с.

26. Tyrsin Y.A., Gomari A., Kruglov V.N., Mirzaev A.M. Propriétés physicomechar.iques la ceramique contenante du soapstock. // Сборник м-лов научной конференции Ш1/ №5, Алжир, Бумердес, 198а, с.105-106.

27. Салнй А.Л., Незнанова H.A., Тырсин Ю.А., Талантов В.Н., Трандина М.В. Срави тельная оценка хлебопекарных дрожжей на специализированных и спиртовых 3ai дах. // Тезисы 7 научной конференции молодых ученых МТИПП, декабрь 1988, c.4f

28. Тырсин Ю.А., Мещеряков C.B., Железная Л.Л., Борисенко А.Е. Разработка Text логического процесса по увеличению выхода жирных кислот из гудрона и выда рекомендаций по созданию новой технологии пр-ва жирных кислот, глицерш пищевых ПАВ, восков, низкокалорийных иищевых жирозаменителей с применени нового термостабнльного катализатора "Фталосорб". // Отчет о НИР /МТИПП/; П> 2-1/80 01090014271, -М., 1989, 66 с.

29. Tyrsin У.А., Mechtcheriakov S.V., Khagourov A.A., Jeleznaia L.L. Nouveau catalyse thermostable dans le trailmenl des corps gras. // Revue Française des Corps Gras, v.: 1986, №3/4, c.181.

30. Мещеряков C.B., Телавн M., Железная Л.Л., Тырсин Ю.А. Синтез бегениловс эфира стеариновой кислоты. // Тезисы докладов И Всесозного совещания по хим ческнм реактивам, Ашхабад, т.1, 1909, с.32.

31. Tyrsin Y.A., Mechtcheriakov S.V., Khagourov A.A.. Jeleznaia L.L. Nouveau catalyse thermostable dans le traitment des corps gras. // Actes du Congrès internatioi "Chevicul" pour letude des corps gras. Angers,France, ТошеЗ, 1989, с. 1210-1216.

32. Mechtcheriakov S.V., Tyrsin Y.A., Jeleznaia L.L., Mkrtchan V.R., Karachanov R„ Hagourov A.A. Catalytic processes for fat transformation. // Proceedings of 5th Con юпсе on Applied Chemistry Unit Operation and Processes, Balatonfured, Hungary, v 1989, c.219-222.

33. Mescheriakov S.V., Tyrsin Y.A., Telavi M., Hagurov A.A., Yusov S.M., Jeleznaia L Natural waxes analogs. Synthesis on the heat resistant organomineral ion exchan catalyst. // Proceedings of the 10th International Congress on Chemical Engineer» Chemical Equipment, Design and Automation. Praha, Czechoslovakia, 1990, c.84-88.

34. Tyrsin Y.A., Mescheriakov S.V., Hagurov A.A. Influence of policonjugated bon system of new thermostable organomineral catalysts on fatty acids cis-trans isomerisati during lipids transformations. // Proceedings of the 33rd IUPAC Symposium Macromolecules, Montreal, Canada, 1990. Session 2.10.5.

35. Mescheriakov S.V., Tyrsin Y.A. Hagurov A.A., Mkrtchan V.R., Jeleznaia L.L. Con lation of morphological and plxysicochemical properties of some polyconjugated sulp! polymers on the mineral carrier with esterification catalyst activity. // Proceedings of t 33rd IUPAC Symposium on Macromolecules, Montreal, Canada, 1990, Session 1.3.9.

36. Tyrsin Y.Â., Mescheriakov S.V.. Khagurov A.A, Zeleznaia L.L., Yusov S.M. Creazione una technologia di trattamento dalle sostanze grasse sulla base di nuovi catalizzati scambiatori di ioni organominerali termostabili. // Atti di 1 Congresso Nazionale Chimica degli Alimenti, Messina, Italia, 1990, c.438.

37. Mesheriakov S.V., Zeleznaia L.L., Tyrsin Y.A, Hagurov A.A. New thermostat siilphocationite on the basis of the polimer with conjugated double bonds. // Proceedin of the Vlth Symposium on ion exchange, Budapest. Hungary, 1990, c.218.

30. Круглов М.Г., Тырсин Ю.А., Диденкул A.C. Керамическая масса для изготовлен строительного кирпича (с добавлением соапстока ). A.C. 1662984 СССР AI (54),Кл 04 ВЗЗ/00; (21) 4601565/33;(22) 01.11.88;(46) 15.07.91; Бюл. 26, 1991. 39. Талантов В.Н., Тырсин Ю.А., Салий A.A., Незнанова H.A., Пучкова Л.И., Юлдаш У.Р. Трандина М.В. Способ производства хлеба из пшеничной муки. // A.C. 16307 СССР (51)5 кл.А21Д2/22; (21) 4680751/13; (22) 18.04.89; (46) 28.02.91; Бюл. 8, 1991.

Алексеева М.Г., Тырснн Ю.А., Кантере В.М. Новые штаммы пекарских дрожжей, лизирующие отходы картофелеперерабатывающих производств. // Материалы чной конференции, посвященной 60-летию МТИПП "Научное обеспечение хране-и переработки растительного сырья в промышленности". Тезисы докладов, ч.1, :ква, 1991, с.14-15.

Пашамов Е.Р., Тырсин Ю.А. Изучение процесса каталитического гидролиза саха-ы, лактозы и инулина. // Материалы 13 конференции молодых ученых и цналистов, посвященной 60-летию МТИПП, Москва, 12-14 июня, 1991, с.67. Тырсина Е.Г., Россихина О.Г., Тырсин Ю.А., Абилев С.К. Аскорбилпальмнтат -имутаген мембранного действия. // Доклады академии наук СССР (Генетика) 8, №4, 1991, с.992-994.

Tyrsin Y.A., Mescheriakov S.V., Zeleznaia L.L., Mkrtchan V.R., Razumov V.V. Thennole ionexchanging materials on the basis of policonjugated polimers. // Proceedings of tUPAC International Symposium Polimer Materials, Melbourne, Australia, 1991, c.448. Tyrsin Y.A., Mescheriakov S.V., Zeleznaia L.L., Mkrtchan V.R., Hagurov A.A. Ion îanging thermostable polymers immobilized on mineral carriers. // Proceedings of the I European Technical Symposium on Polimides and HighTemperature Polymers, itpellier, France, 1991, c.PIV-2.

ryrsin Y.A., Lushin A.M., Zeleznaia L.L., Hagurov A.A., Mescheriakov S.V. Lignin and i wastes utilisation for ion exchanging organomineral catalysts production. // eedings of the Symposium IUPAC Recycling of Polimers Science and Technology, bella, Spain, 1991, c.118.

Евдокимов А.Ю., Фукс И.Г., Мещеряхов C.B., Тырсин Ю.А. Химическая пере->тка жиров с целью их использования в качестве компонентов топлив и сма-[ых материалов. Нефтепереработка и нефтехимия, №5, 1992, с.40-45. Полякова Н.В., Шишкина Л.Н., Тырсин Ю.А. Влияние аскорбиновой кислоты и ее (водных на перекисное окисление липидов in vitro и in vivo. Материалы 4-й |)еренции "Биоантиоксндант" института химической физики РАН, Москва, 2-4 я 1992, с.114-115.

>еневоленский C.B., Кантере В.М., Тырсин Ю.А., Талантов В.Н., Алексеева М.Г. и icero - 8 чел. Штамм дрожжей Saccharomyces ceievisiae ВКПМ У-1534 - продуцент [ассы на крахмале, используемый в хлебопечении. // A.C. 1742320 по заявке 52333/13(079867) от 19.07.90, Бюл."Открытия и изобретения" N223, 1992. Беневоленский C.B., Кантере В.М., Тырсин Ю.А., Талантов В.Н., Алексеева М.Г. и icero - 8 чел. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ У-1320, исполь-ый в хлебопечении. // A.C.,положительное решение от 5.03.91, по заявке № 331/13(079873) от 19.07.1990.

лексеева М.Г., Беневоленский C.B., Каптере В.М., Сарсенова С .Ж., Тырсин Ю.А. •ченне нового штамма хлебопекарных дрожжей, обладающего способностью к езу и секреции глюкоамилазы. // Биотехнология, №1, 1992, с.33-35. 'ырсин Ю.Л., Мещеряков C.B., Азнаурьян М.П., Елошвили Н.Г., Назаров A.B., ович Н.М. Использование отходов масложирового производства для приго-!ния пластичных смазок. // Известия вузов "Пищевая технология", № 1-2, 1993. ырсин Ю.А., Кривова А.Ю., Волошина Т.Ю., Мещеряков C.B. Переэтерификация ib с применением липазы, иммобилизованной на минеральном носителе. // стия вузов "Пищевая технология", № 1-2, 1993.

ырсин Ю.А., Юсов С.М., Мещеряков C.B. Исследование гидролиза подсолнеч-масла в присутствии термостойких полимерминеральных сульфокатионитов. // ггия вузов "Пищевая технология", № 1-2, 1993.

54. Тырсин Ю.А., Мещеряков С.В., Виноградова О.Н. Влияние полимеров с систе] сопряженных связей на цис-транс изомеризацию жирных кислот. // Известия ву "Пищевая технология", Ns 1-2, 1993.

55. Тоски Т.Г., Габоии М.Ю., Леркер Д., Капелла П., Мещеряков С.В., Тырсин К Оксиды холестерина. Биологическое действие и аналитический контроль. // Из) тия вузов "Пищевая технология", № 1-2, 1993.

56. Тырсин Ю.А., Юсов С.М., Мещеряков С.В. Синтез сложных эфиров в при< ствии термостойких полимермиперальных сульфокатионитов. // Известия ву "Пищевая технология", Ns 1-2, 1993.

57. Tyrsina E.G., Rossikhina O.G., Tyrsin Y.A, Abilev S.K. Ingibition of the N-Methyt Nitro-N-Nitrosoguanidine by Ascorbic Acid and Ascorbyl Palmitate. // Mutation resea 1993 (в печати).

58. Tyrsin Y.A., Mescheriakov S.V. Polymer-mineral Composites as Catalysts of H Temperature Transformation of Lipids. // Proceedings of the 3-d European Techr Simposium on Polyimides "Polyimides and high performance polymers", Montpel France, 1-3 june, 1993, c.PV-3.

59. Tyrsin Y.A., Mescheriakov S.V., Hagurov A.A., Toschl G.N., Gabonl V.P., Carapeli Capella P. Ion exchanging thermostable catalyst In the vegetable oil hydrolysis. // Rei Itallana delle Sostance Grasse, 1993, № 70, c.223-248.

60. Алексеева М.Г., Кантере B.M., Талантов B.H., Соловьева Т.Ю., Тырсин Ю.А. К] малосодержащая среда для нового штамма пекарских дрожжей со встроенным ге глюкоамилазы. // Прикладная биохимия и микробиология, 1993, т.29, №2, с.78.