автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Биомодификация маннансодержащего сырья в повышении выхода и биологической ценности продукции перепеловодства

На правах рукописи

Чигирина Наталья Анатольевна

БИОМОДИФИКАЦИЯ МАННАНСОДЕРЖАЩЕГО СЫРЬЯ В ПОВЫШЕНИИ ВЫХОДА И БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ ПРОДУКЦИИ ПЕРЕПЕЛОВОДСТВА

Специальность 05.18.07 - Биотехнология пищевых продуктов

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Воронеж 2006

Работа выполнена на кафедре микробиологии и биохимии ГОУ ВПО Воронежской государственной технологической академии

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор биологических наук,

профессор Корнеева Ольга Сергеевна

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук,

профессор Ковалева Тамара Андреевна

кандидат технических наук, доцент Полянских Светлана Владимировна

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: ООО «Биотехнологический центр - С»

г. Москва

Защита состоится «15» июня 2006 года в часов в конференц-зале на заседании диссертационного совета Д 212.035.04 при Воронежской государственной технологической академии по адресу: 394000, г. Воронеж, проспект Революции, 19.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВГТА.

Автореферат разослан 12 мая 2006 года.

Ученый секретарь ^

диссертационного совета О/С Глотова И.А.

ДтА

/(ПГ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Для обеспечения здоровья и нормальной жизнедеятельности организма человека необходимо полноценное сбалансированное питание. Одними из продуктов, уникальных по своей питательной ценности, которые способны восполнить и поддерживать в норме уровень •необходимых питательных веществ, являются перепелиные яйца и мясо.

Перепеловодство является перспективной отраслью яичного и мясного птицеводства. Эта отрасль позволяет обеспечить население высококачественными продуктами питания в кратчайшие сроки и с минимальными затратами

Известно, что качество мяса зависит от рациона кормления птицы Учитывая, что в рецептуру комбикорма для перепелов входит значительная доля растительного сырья, содержащего некрахмалистые полисахариды (маннаны), возникла научно обоснованная необходимость применения ферментных препаратов, гидролизующих эти полисахариды. В то же время известно, что образующаяся под действием р-маннаназы манноза обладает рядом функциональных свойств: участвует в синтезе гликопротеидов и гликолипи-дов, иммунных тел, относится к витаминоподобным сахарам.

Вопросам применения р-маннаназы в птицеводстве и изучению влияния маннозы на биохимические процессы в живом организме, а также на качество получаемых продуктов питания посвящены работы зарубежных ученых.

Однако в отечественной практике такие исследования отсутствуют.

В связи с этим поиск активных продуцентов Р-маннаназ и применение их в кормопроизводстве с целью повышения выхода и биологической ценности продукции перепеловодства являются актуальными вопросами биотехнологии.

Настоящая работа выполнялась в соответствии с научным направлением кафедры микробиологии и биохимии Воронежской государственной технологической академии по проблеме «Изыскание оптимальных условий биосинтеза микроорганизмами биологически активных веществ и изучение их физико-химических свойств» (гос. регистр. № 01930004491) и в рамках научно-технической программы «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники». Данная тема включена в координационный план РАН по программе «Микробиологический синтез и научные основы микробиологического получения практически ценных веществ».

Цель и задачи исследования. Цель диссертационной работы заключалась в разработке биомодифицированного корма для перепелов путем использования ферментного препарата р-маннаназы, позволяющего улучшить биологическую ценность мяса и увеличить мясную и яичную продуктивность перепелов.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

• выбор активного продуцента Р-маннаназы;

• оптимизация условий биосинтеза целевого фермента;

рос. национальна'

бшшштекх

С.-Петбрбург

__ОЭ 200^акт НЬО

• получение очищенного ферментного препарата |3-маннаназы и изучение его физико-химических свойств;

• определение рациональных условий гидролиза маннанов растительного сырья;

• исследование возможности применения маннозосодержащих гидро-лизатов для кормления перепелов;

• сравнительная характеристика продуктивных показателей перепелов, откармливаемых биомодифицированным комбикормом и стандартной кор-мосмесью, а также гистоморфологические исследования тканей;

• определение биологической ценности мяса;

• расчет экономической эффективности производства перепелиного мяса и яиц с применением маннозосодержащих гидролизатов.

Научная новизна. В настоящей работе впервые получен ферментный препарат эндо-1,4-|3-маннаназы Тг'юЬойегта Иашапит П14, способный гидролиювать некрахмалистые полисахариды (маннаны) растительного сырья до маннозы.

На основании результатов исследования гистоморфологических характеристик и биологической ценности мяса перепелов впервые теоретически обоснована и практически подтверждена эффективность применения маннозосодержащих гидролизатов в составе комбикорма.

Практическая значимость работы. Разработана новая технология получения комбикорма, включающая ферментативный гидролиз маннансо-держащего растительного сырья. Применение биомодифицированного комбикорма способствует улучшению переваримости кормов, увеличению мясной и яичной продуктивности перепелов, а также повышению биологической ценности мяса.

Проведена промышленная апробация полученного комбикорма в условиях перепелиного хозяйства ООО «Интерптица», подтвердившая целесообразность и практическую значимость результатов исследования.

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на конференциях различного уровня. Они были представлены на отчетных научных конференциях ВГТА (2002-2005 гг.), 8-ой 9-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино 2004, 2005); Московском Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (г. Москва, 2004, 2005 гг.); II Международной научно технической конференции «Прогрессивные технологии и оборудование для пищевой промышленности», посвященной 100-летию проф. Попова В.И. (г. Воронеж, 2004 г.); Международном форуме «Биотехнология и современность» (г.Санкт-Петербург, 2004, 2005 гг.)

Данная работа была представлена на конкурс молодых ученых, проходивший в рамках Третьего Московского международного конгресса

«Биотехнология: состояние и перспективы развития», отмечена дипломом за хорошую научно-исследовательскую работу.

Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано 15 работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов (3 главы), заключения, выводов, списка использованных источников, приложений и представлена на 150 страницах машинописного текста. Иллюстративный материал включает 37рисунков и 26таблиц. Библиография включае! 142наименований, в т. ч. 74иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Обоснована актуальность темы, определены цели и задачи исследований.

ГЛАВА 1. Обзор литературы. Представлена общая характеристика эндо-1,4-р-маннаназ, физико-химические свойства, способы выделения и очистки, а также их применение. Приведена структура маннанов различных видов растительного сырья и дрожжей.

Указано, что образующаяся в результате ферментативного гидролиза ман-ноза восстанавливает биохимические процессы в живом организме, обладает иммуностимулирующими, радиопротекторными свойствами и ги полип идем иче-ским действием

Представлены данные зарубежных ученых и отмечена перспективность применения препаратов Р-маннаназы в кормопроизводстве. Показано, что включение фермента в корм животных и птиц способствует улучшению усвояемости корма, ускорению роста, повышению яйценоскости кур. Отмечено, что в отечественной практике такие исследования отсутствуют.

Показано, что перепеловодство является перспективной отраслью птицеводства, позволяющей получать продукты с высокой питательной ценностью.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. Объекты и методы исследований. Основным объектом исследований служила чистая культура микроскопичекого гриба Trichoderma harzianum Fl/4, полученная из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ, Москва). Глубинное культивирование микроскопического гриба Trichoderma harzictmim FI14 проводили в качапочных колбах емкостью 750 смЗ, содержащих по 250 см1 питательной среды Чапека, в течение 72 ч при температуре 32 - 35 °С. В конце выращивания в отфильтрованной культуральной жидкости определяли активность фермента.

Для определения активности эндо-1,4-р-маннаназы использовали метод Сомоджи-Нельсона. Данный метод основан на определении скорости ферментативной реакции, которая устанавливается по количеству образующихся редуцирующих Сахаров. За единицу активности р-маннаназы прини-

мали такое количество фермента, которое гидролизует 1 мкмоль маннансо-держащих субстратов за I мин в стандартных условиях.

При подборе оптимального состава питательных сред для достижения максимального биосинтеза фермента использовали полнофакторный эксперимент с применением центрального композиционного рототабельного униформ планирован ия.

Для полумения ферментного препарата использовали различные органические растворители, а также ряд последовательных ионообменных колонок (DEAE-Toypearl, TSK- DEAE-5PW, TSK SP-5PW).

Молекулярную массу (3-маннаназы Trichoderma harziarrum FI 14 определяли с помощью электрофореза в 10 %-ном полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) согласно методу Лаэммли, а также методом гель-фильтрации на колонке Sephacryl S-200, уравновешенной 10 мМ Ыа-ацетатным буфером рН 4,0.

Аминокислотный анализ определяли на автоматическом анализаторе аминокислот ААА-339Т (Чехия).

Кинетические характеристики р-маннаназы изучали на высокоочищен-ном препарате. Определение константы Михаэлиса осуществляли по Диксону и Уэббу.

Проведение производственной апробации полученного биомодифициро-ванного корма для перепелов осуществляли в условиях ООО «Интерптица».

Из перепелов японской серой породы составили контрольную и две опытных группы. Опытные группы птицы (2 клетки по 35 голов) были сформированы по принципу аналогов (порода, возраст, живая масса). Опытные группы перепелов кормили полученным комбикормом с 35-дневного возраста в течение трех месяцев. Первая опытная группа получала биомодифициро-ванный корм ежедневно, а вторая - через день.

Рецептуры кормовых смесей для опытных и контрольной групп перепелов практически не отличались, кроме ввода в рацион кормления перепелам опытных ipynn манпозосодержаишх гидролизатов в различных дозах.

Исследования проводились в соответствии с «Рекомендациями по производству яиц и мяса перепелов».

При проведении исследований определяли: живую массу перепелов, сохранность поголовья, потребление кормов, яйценоскость птицы, мясную продуктивность, массу внутренних органов, категорийность тушек.

Оценку аминокислотной сбалансированности и биологической ценности мяса перепелов проводили по следующим показателям: аминокислотный скор продуктов; ко-эффицисш различия аминокислотного скора; биологическая ценность пищевого белка

При определении химического состава мяса были проанализированы следующие показа ¡ели: массовая доля влаги по ГОСТ 23637, массовая доля белка но Къельдалю, массовая доля жира - путем экстрагирования этиловым эфиром, массовая доля золы сжиганием органических веществ в муфельной печи при температуре 500-700 °С до постоянной массы.

Все определения проводили не менее чем в трех повторностях трех серий экспериментов. В диссертации представлены средние результаты серии экспериментов, обеспечивающие 95 % точности по статистическим критериям

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

ГЛАВА 3. Получение ферментного препарата Р-маннаназы и исследование его физико-химических свойств.

Выбор активного продуцента р-маннаназы. Из 39 штаммов микро-мицетов был выбран ТпсИос1егта Иаг:1апит РП4, обладающий наибольшей активностью р-маннаназы.

Проведенные токсикологические исследования во Всероссийском научно-исследовательском ветеринарном институте патологии, фармакологии и терапии (НИВИПФиТ) показали отсутствие общей токсичности у препарата Р-маннаназы, что дает возможность его дальнейшего практического применения.

Влияние различных источников углерода и азота на биосинтез р-маннанат. Изучение биосинтеза р-маннаназы при росте продуцента Тг Иапшпит на различных источниках углерода показало, что хороший рост

гриба обеспечивали такие углеродные субстраты, как мальтоза, лактоза и раффиноза, что объясняется физиологическими потребностями продуцента, но значительный синтез

р-маннаназы был обнаружен при введении в состав питательной среды маннозы, глюкозы и фруктозы (рис.I). На среде с крахмалом и дуль цитом накапливалось минимальное количество биомасс-сы гриба, что сопровождалось минимальным уровнем активности Р-маннаназы.

Учитывая, что манноза (эпимер глюкозы), обеспечивающая наиболее высокий уровень биосинтеза р-маннаназы (162,8 ед /см1), является дорогостоящим и дефицитным углеводом, направленный биосинтез фермента можно осуществлять и на среде с глюкозой, использование которой в составе питательной среды также способствовало биос и тезу активной р-маннаназы (149,7 ед/см1).

щ - активность фермента,%

от максимальной Г1- биомасса,% от максимальной

Рис. 1 Влияние источников углерода на росг 7> Иаг:1апит и синтеч (3 — маннашны

100-

А, %

60-

40'

20-

I S

- S

г

Наиболее активный синтез фермента обеспечивало содержание глюкозы в среде в концентрации 4 %.

При изучении влияния источников азота на биосинтез р-маннаназы использовали различные минеральные соли (рис. 2.).

Проведенные опыты показали, что гриб хорошо растет на всех испытанных вариантах сред, однако внесение того или иного азотного источника оказывает различное влияние на уровень маннаназной активности. Положительное влия-ие на биосинтез р-маннан-зы оказывал нитрат натрия. Из всех прочих солей высокий уровень биосинтеза фермента обеспечивали аммонийные соли фосфорной кислоты. Наименее пригодным оказался хлорид аммония, который подавлял синтез фермента почти на 50 %.

Факторы, влияющие на биосинтез ft-маннанаш Tr. harzianum. Интенсивному образованию ферментов способствует ряд условий, среди которых величина рН, температура культивирования и аэрация процесса занимают важное место. Было установлено, что максимальный биосинтез наблюдался при рН 4,0 и температуре 35 °С. Наибольшее значение маннаназной активности было получено при соотношении 0,7 объема воздуха на один объем среды, что соответствовало 200 см3 среды.

Подбор оптимальных условий глубинного культивирования Р-маннаназы. Для исследования взаимодействия факторов, влияющих на процесс биосинтеза р-маннаназы микроскопического гриба Tr. harzianum Fil, были применены математические методы планирования эксперимента. Для исследования применяли полный факторный эксперимент 25 с использованием центрального композиционного ротатабельного униформ-планирования.

В результате статистической обработки экспериментальных данных получено уравнение регрессии, адекватно описывающее изучаемый процесс под влиянием исследуемых факторов.

У = -3982.405 + 63.278 ■ lemp + 44.503 • time + 239.863 ■ ph+\49.002-с+ 2438.913 • п --0.310-//me2 -29.690- ph1 -19.190-с2 -3098.120-я2 -0.018-temp"

Рис. 2. Влияние источников азота на биосинтез Р-маннаназы микроскопического гриба 7>. 1шг-:шпипг, А - активность фермента, % от максимальной

Полученная математическая модель исследуемого процесса, позволяет рассчитать активность фермента и корректировать уровень биосинтеза в зависимости от условий.

В результате оптимизации условий биосинтеза р-маннаназы активность фермента была увеличена почти в 2 раза и составила 320 ед/см3.

Получение очищенного ферментного препарата р-машшнты. Известно, что для получения ферментных препаратов широко используют осаждение органическими растворителями - этанолом, ацетоном, изопропанолом.

Для изучения условий осаждения и влияния природы органических растворителей на полноту осаждения р-маннаназы мы использовали этанол 96,5 %, изопропанол 98 %, химически чистый ацетон.

Максимальный выход р-маннаназы (89 %) был получен в случае осаждения этанолом при его концентрации в смеси 66,0 % (в объемном соотношении культуральная жидкость : этанол -1:2) при рН 4,5.

Схема получения очищенного препарата р-маннаназы представлена в табл. 1. В результате был получен ферментный препарат с удельной активностью 271,5 ед/мг белка, степень очистки составила 24,2 раза.

Таблица I

Схема получения очищенного препарата Р-маннаназы

Стадия очистки Объем, см3 Белок Активность Степень очистки, раз Выход, %

mi /см3 Общий, мг Общая, см' Удельная, ед/мг белка

'Зкстракт из кулыуральной жидкости 1700 2.68 4570 51000 11,2 1 100

Ионообменная ^ хроматография! DEA1-целлюлоза 160 2,13 340,2 31680 93 8.3 62

TSK ОПАЬ-5PW 40 1.7 67,4 7440 110.3 9.8 14,6

ISK SP-5PW 15 0,48 7.2 1955 271.5 24.2 1,8

Ma ¡екулярная масса и ачиношаититй актов молщыы /{-мшпшшиы. Молекулярная масса р-маннаназы, определенная методом гель-филырации, составила 103 кДа. а методом электрофореза в 10 % ПАГ с 0,1 % ДСП - 50 и 56 кДа. Это позволило утверждать, что данный фермент имеет субъединичную структуру и является димером (рис. 3).

Сопоставляя качественный и количественный состав аминокислот очищенной р-маннаназы Tr. harzianum FI 14, можно отметить характерное преобладание дикарбоновых аминокислот, содержание которых значительно превышает содержание остальных. В составе аминокислот преобладают ас-парагиновая (1,7 %) и глутаминовая кислоты (4,2 %), что и определяет, по всей вероятности, «кислую» природу фермента. Это также косвенно указывает на их присутствие в активном центре фермента.

я Рис. 3. Элекл рофорез с ДСП

Р-маннаназы ? 1 - целлюлаза (94,5 кДа);

i 2 - бычий сывороточный белок (66,2

* кДа);

3 - яичный альбумин (45 кДа),

4 - карбоангидраза (31 кДа);

5 - ингибитор трипсина (21,5 кДа); й 6 - лизоцим (14,4 кДа);

5 7 - Р-маннаназа

4

6

Исследование влияния рН и температуры на активность р-маннаназы. Для определения рН-оптимума действия р-маннаназы проводили гидролиз галактоманнана в интервале рН 3,0 - 7,0. Результаты исследования показали, что оптимум рН лежит в пределах 4,0 - 5,0.

Наиболее интенсивным действием р-маннаназа обладала при температуре 60 °С, что свидетельствует о довольно высоком температурном оптимуме и делает перспективным ее применение в биотехнологии.

Исследование кинетики кислотной и термической инактивации р-маннаназы. Для биотехнологии исследование рН- и термостабильности

ферментов представляет определенный интерес.

Нами была изучена кинетика кислотной и термической инактивации очищенной Р-маннаназы.

Инактивацию р-маннаназы Tr. harzianum F114 прово-дили в интервале рН 2,0 - 8,0 в 0,1 М ацетатном (в кислой зоне рН) и в фосфатном (в щелочной зоне рН) буфере. Раствор фермента инкуби-ровали при температуре 50-80 °С. В процессе инактива-ции

контролировали измене-ние маннаназной активности. По истечении определенных

10

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

-50

-60

-70 ■

-80

% ч

Рис 4 Динамика инактивации р-маннаназы при рН 4,0 и различных значениях температуры Л - активность фермента, % от максимальной

промежутков времени отби-рали пробы из инкубацион-ной среды и определяли активность. Динамика инактивации фермента показала, что наибольшая стабильность фермента наблюдалась в области рН 4,0 - 5,0 при 50 °С. В этом интервале через 24 ч инкубации фермент инактивирован на 60 %, интенсивнее инактивация наблюдалась в сильнокислой среде. При температуре 60 "С за 14 ч инкубации остаточная активность составила при рН 4,0 - 5.0 около 50 %, при рН 2,0-10 %. Повышение температуры до 80 °С приводило к более ре'.кой инактивации фермента: за 3 ч инкубации при рН 2,0, 4,0 и 5,0 остаточная активность составляла 12 %. 38 %. 35% соответственно (рис. 4).

Определение субстратной специфичности р-маннанаш. Как было отмечено ранее, субстратом для Р-маннаназы служит манннансодержащее природное сырье, представленное, главным образом, глюкоманнанами, 1а-лактоманнанами и галактоглюкоманнанами. В связи с этим нами была исследована гидролитическая активность выделенного очищенного ферментного препарата по отношению к различным маннанам

Для количественной оценки способности р-маннаназы гидролизовать те или иные субстраты был проведен анализ кинетических параметров Кт н Утах.

Данные табл.2 свидетельствуют о том, что р-маннаназа Тг кат'апит проявляет химическое сродство как к 1—»4, так и 1—»З-Р-гликозидной связи в представленных субстратах. Наибольшее сродство фермент проявляет к глю-команнанам.

Таблица 2

Значения кинетических параметров р-маннаназы Тг. каг:1апит при гидролизе различных субстратов

Субстрат К.т. мМ Х/шач, мкМ/мин на ум белка

1 алактомаинап 0,65 4.6

1 люкомапнан 0,55 5,7

п-11Ф-Р-маннопиранозид 0,58 3,4

Р-1,3-мет илмашюбиоза 0,90 1.6

р-1.4-мстилманпобиоза 0,60 2.0

ГЛАВА 4. Биодеструкция маннанов растительного сырья Исследование ферментативного гидролиза маннанов. Отечественные ученые указывают, что оценка качества комбикорма для птицы только по питательным веществам недостаточна, необходимо учитывать и переваримость отдельных компонентов.

Следует отметить, что в последнее время проявляется большой интерес-исследователей к широкому использованию в комбикормах птицы кукуруш, пшеницы и гороха, содержащих значительное количество некрахмалистых

полисахаридов, скармливание которых оказывает отрицательное влияние ни физиологическое состояние и продуктивность птицы.

Гак. в зерне пшеницы содержание некрахмалистых полисахаридов составляет (г) 75-106, кукурузе - 55-117, соевом шроте - 180-227, горохе - 120296, пшеничных отрубях - 220-337, ячмене - 135-172. Эти соединения не перевариваются в желудочно-кишечном тракте птицы, проходя через пищеварительный тракт, выносят ценные питательные вещества из организма. Одними из таких питательных веществ являются маннаны, локализованные во внешних слоях клеточной стенки растений. Структурный элемент маннана манноза - эпимер глюкозы, обладает ростовыми, иммуностимулирующими, радиопротекторными свойствами и гиполипидемическим действием.

Поэтому перспективным является получение маннозосодержащих гид-ролизатов ферментативным путем. Ферменты повышают доступность питательных веществ воздействию пищеварительных ферментов птицы и тем самым оказывают положительное влияние на продуктивность птицы и использование корма.

В связи с этим нами исследован процесс гидролиза маннансодержащего сырья спиртоосажденным препаратом р-маннаназы с активностью 2100 ед/г. На рис. 5 представлена динамика гидролиза маннансодержащего сырья, входящего в состав комбикорма для перепелов: кукурузы, гороха и пшеницы. Содержание маннанов в указанных компонентах кормосмеси составляет (%): в горо хе 17-18, кукурузе - 10-12, пшенице 7.

Гидролиз 25 %-ных растворов сырья проводили при оптимальных условиях действия фермента (температура 60 °С, рН 4,5). Об эффективности гидролиза судили по количеству редуцирующих веществ в пересчете на манншу. Во всех случаях вносили одинаковое количество фермента (15 ед на 1 г субстрата).

Как видно, исследуемая нами р-маннназа гидролизовала все виды указанного сырья. Наибольшая степень гидролиза была отмечена для гороха 92 %. Гидролиз кукурузы и пшеницы протекал менее эффективно, степень

6 8 10

продолжительность, ч

-пшеница

■горох

- кукуруза

Рис 5 Дииамика ферментативного гид-роли »а маннансодсржащих субстратов С'1 - степень I идролиза маннанов, %

гидролиза составила 87 % и 80 % соответственно. Это, очевидно, можно объяснить различным строением маннанов, входящих в состав сырья

Для выбора оптимального состава комбикорма нами был проведен гидролиз смеси с различным соотношением маннансодержащих компонентов (табл. 3). Эффективность гидролиза оценивалась по количеству образовавшейся маннозы. (рис. 6). Как видно из данного рисунка, наибольшая степень гидролиза наблюдалась в третьем варианте с соотношением кукуруза: пшеница: горох - 3,7: 1,6: 1,0. В дальнейшей работе использовали указанный вариант соотношений ингредиентов.

Таблица 3

Варианты рецептур комбикорма для перепелов

Содержание. %

Ингредиент Вариант

1 2 3 4 5

Кукуруза 45 20 36,9 30,1 41,17

Пшеница 13,5 46,94 16 22.4 16.33

Горох 12,4 5,7 К) 7 8,6

В ! 00 г кормосмеси содержится: обменной

энергии (ккал) 276.2 294.8 273.8 277.1

протеина 17,5 19.46 20.72 18.63

клетчатки 3,6 3.82 4,63 3.93

кальция 2,81 2,81 2,84 2.82

фосфора 0.75 0.86 0.82 0.77

натрия 0,35 0,35 0,35 0.35

, !

12 1 4 Ч ^ Варианты

Рис 6 Зависимость степени деструкции маннанов от соотношения маннанасочср-жащих компонетов комбикорма для перепелов.

Выбор оптимшьных уаювий гидролиза маннансодержащего сырья.

Для выбора оптимальных условий гидролизу подвергалась 25 %-ная смесь, состоящая из кукурузы, гороха и пшеницы.

По результатам проведенных экспериментов были построены диаграммы влияния параметров процесса на степень гидролиза маннансодержа-щих субстратов (рис. 7). Проведенные исследования позволили установить, что рациональными параметрами процесса гидролиза, как видно из рис. 7 являются: дозировка ферментного препарата 15 ед/г, температура 60 °С, продолжи! ел ьность 3,5-4 часа. При таких условиях степень гидролиза маннанов 'достигала 95,0 %

I -( = 40 "С, П -44,8% 2-1-М)"С, СТ = 73,4 %

ч-1-бо"с а =<ш)%

4 - I = 70 "С а - 80 6 %

I - С - 5 едД. С Г = 48,9 %

2-е-- 10 сдЛ, СТ = 73,6 %

3-С= !5ед/|.С1 =95 0%

4 ~ С = 20 ед/т, СГ = 84,3 %

5 - С - 25 ед/|. СГ = 76,3 %

1 -рН = 3,0,СГ =57.5%

2 - рН = 3,5, СТ = 80,0 %

3 - рН = 4,0, СГ = 84,2 %

4 - рН = 4,5, СТ - 95,0 %

5 - рН = 5.0, СГ = 68,5 %

Продолжи геньносгь процесса, ч

Рис 7 Влияние дснировки фермойного препарата (С, ед/г), 1емпературы (I, °С) и про-д(>лжиимыюс1и процесса (т. ч) па степень гидролиза маннанов

Технология получения маннозосодержащих гидролизатов. Установленные рациональные параметры процесса гидролиза маннанов растительного сырья, входящего в комбикорм для перепелов, послужили основой для разработки технологии получения кормосмеси, включающей маннозосодержащие гидролизаты. Блок-схема получения биомодифицированного комбикорма для перепелов представлена на рис. 8.

Рис. 8 Блок-схема получения биомодифицированного комбикорма для перепелов

ГЛАВА 5. Использование маннозосодержащих гидролизатов в составе комбикорма для перепелов

Изучение влияния маннозосодержащих гидролизатов на продуктивные показатели перепелов. Полученный нами биомодифицированный комбикорм для перепелов использовали в научно-хозяйственном опыте для изучения его влияния на продуктивные показатели птицы. Опыт проводили на перепелах с 35-дневного возраста в течение 3-х месяцев.

Используемые кормосмеси по набору ингредиентов и питательности практически не отличались, кроме ввода перепелам опытных групп в кормосмеси маннозосодержащих гидролизатов в различных дозах, в соответствии со схемой опыта. Состав полноценного комбикорма для перепелов приведен в табл. 4.

Таблица 4

Состав кормовых смесей для перепелов, %_

Ингредиент Процентное содержание

Кукуруза 36,9

Пшеница 16,0

Горох 10,0

Жмых подсолнечный 18,0

Дрожжи 5,0

Мел 6,7

Соль 0,5

Минеральный премикс 0,4

1 равий 0,5

Рыбная мука 6,0

Исследованиями установлено, что поедаемость кормосмесей перепелами подопытных фупп была неодинаковой. Перепела опытных групп поедали корма меньше по сравнению с аналогами контрольной группы на 4,1 - 3,0 % (при постоянном вводе гидролизата) и на 3,5 - 2,4 % (с чередующимся его введением).

На рис. 9 представлена зависимость интенсивности яйценоскости от количества маннозосодержащих компонентов в кормосмеси. Следует отметить, что максимальная интенсивность яйценоскости (82 %) наблюдалась в случае кормления перепелов комбикормом, степень гидролиза маннанов которого достигала наибольшей величины (94 %).

Масса яиц также увеличивалась на 1,0 - 0,5 %в группах с постоянным вводом гидролизатов. Интенсивность яйценоскости опытных групп повышалась на 2,16 %.

Полученные данные позволяют косвенно суди!ь о позитивном влиянии маннозы в составе комбикорма на интенсивность яйценоскости птицы.

Внесение гидролизата в комбикорм, способствовало также достоверному повышению живой массы перепелов. В конце научно-хозяйственного опыта

5 73

4

100

150

200

И Интенсивность яйценоскости, % ■ Степень гидролиза, %

* ..........Iй

Рис. 9. Влияние гидролизатов разной степени деструкции на интенсивность яйценоскости перепелов

предубойная живая масса была больше в опытных группах по сравнению с аналогами контрольной на 11,0 % в первой опытной фуппе и на 5,8 % во второй экспериментальной группе, а масса потрошеной тушки - на 9 % и 5 % соответственно.

Результаты эффективности применения полученных гидролизатов в составе комбикорма для перепелов представлены в табл. 5.

Таблица 5

Влияние маннозосодержащихгидролизатов на продуктивность перепелов

Группа

Показатели Контрольная Опытная

первая вторая

Средняя живая масса, г

самки 197 234 218

самцы 190 224 213

Масса потрошеной тушки, г самки 151 177 166

самцы 143 166 162

Убойный выход, % 64,4 66,8 66,0

Полученные результаты свидетельствует об эффективности применения разработанного биомодифицированного корма в развитии птицеводства.

Оценка химического состава и биологической ценности мяса перепелов. Первостепенную роль в определении пищевой ценности продуктов имеет его химический состав. Из данных табл. 6 видно, что мясо опытной группы перепелов отличалось высоким содержанием белков и меньшим содержанием влаги.

Таблица 6

Химический состав мяса перепелов

Мясо перепелов Массовая доля, % ')нср| С1 ичсская ценность, кДж/10()|

Влага Белок Жир Зола

Контрольная фуппа 61,8 18,6 18.5 0.8 1000

Опытная Iруппа 60,3 20,2 18.7 0.8 1041

Сравнительный анализ белков перепелиного мяса показал, что они характеризуются достаточно высоким уровнем общего содержания незаменимых аминокислот.

В табл. 7 приведены данные соответствия перепелиною мяса сбалансированному питанию по аминокислотному составу.

Из представленных данных видно, что 100 г перепелиного мяса удовлетворяют среднесуточную потребность человека в животных белках на 44 %, обеспечивало потребность организма в незаменимых аминокислотах на 28 % и более

Таблица 7

Содержание незаменимых аминокислот в мясе перепелов

Наименование аминокислот Белок по шкале ФАО/ВОЗ, мг/г белка Группа перепелов

контрольная опы гная

Валин 50 50,0 54.7

Изолейцин 40 45.4 44,5

Лейцин 70 87,5 91,1

Лизин 55 79,0 68,5

Мстионин+цистин 35 26,5 57,1

Грсонин 40 38,8 45,0

Фенилаланин 60 49,0 64,8

Триптофан 10 17,0 16.2

При определении биологической ценности продуктов особое значение придается не только абсолютным количествам отдельных аминокислот, но и их соотношению, поскольку диспропорция в аминокислотном балансе пищевых продуктов может привести к нарушению белкового обмена в организме человека.

Для полной характеристики биологической ценности перепелиного мяса были рассчитаны такие показатели, как аминокислотный скор, коэффициент утилитарности, коэффициент сопоставимой избыточности, коэффициент различия аминокислотного скора. По данным табл. 8 можно судить об увеличении показателей аминокислотных скоров в опытном образце мяса перепелов.

Таблица 8

Аминокислотный скор мяса перепелов

Наименование аминокислот

Группа перепелов валин \ изолейцин к я ж 4> ц лизин метионин +цистин треонин фенилаланин +тирозин I СО о ь с я &

Контрольная 112.4 152,5 131,0 156,4 84,8 105,0 91,6 192

Опытная 109.2 111,5 130,7 125,6 163,0 113,1 108,0 162.1

Снижение КРАС и показателя сопоставимой избыточности при повышении биологической ценности и коэффициента утилитарности белка говорит о высокой биологической ценности мяса перепелов, получавших биомо-дифицированный комбикорм (табл. 9).

Таблица 9

Показатели биологической ценности мяса перепелов

1 рупны перепелов Показатели

КРАС,% ВЦ,% коэффициент утилитарности сопосшвимая избы 1 очное 1Ь. мг

Контрольная 33,3 66,7 0,53 15,9

Оньп пая 19.5 80,5 0,94 9,7

Таким образом, применение биомодифцированного корма для перепелов приводит к увеличению биологической ценности мяса на 13,8 %, что способствует обеспечению населения пищевыми продуктами, соответствующими физиологическим потребностям в пищевых веществах и энергии.

Гиапоморфологичеекие исследования печени и мышечной ткани перепелок. С целью обоснования целесообразности применения биомодифицированного комбикорма для перепелов были проведены гистоморфологические исследования ткани печени и мышц.

В препаратах печени от перепелок, откармливаемых стандартной кор-мосмесью, наблюдалась диффузная жировая дистрофия различной степени тяжести. Жировые включения были, в основном, сходными по величине и располагались неравномерно по всей массе органа.

Гистоструктура печени перепелов, получавших биомодифицирован-ный комбикорм, отличалась от структуры печени перепелов контрольной группы обильным скоплением жировых клеток. Жировые включения были в основном сходными по величине и располагались диффузно по всей массе органа (рис. 10).

ЩШ-ЙЙЁ6

ШШШ

Рис. 10. Струю ура ткали печени перепелов'

а - контрольная фуппа; 6-опытная группа.

Мышечная ткань перепелов, откармливаемых кормами с маннозосо-держащими компонентами, состояла из плотно расположенных друг к другу мышечных волокон с тонкими, местами практически не выявляемыми, прослойками рыхлой соединительнотканной стромы. Соединительная ткань была в виде тончайшей сеточки.

При гистоморфологических исследованиях мышечной ткани наблюдалась фрагментация мышечных волокон, что, вероятно, связано с нарушениями в обменных процессах. Мышечная ткань состояла из продольных, плотно расположенных друг к другу волокон с тонкими прослойками рыхлой соединительнотканной стромы. Пучки мышечных волокон по толщине были неравномерными (рис. II).

Рис. 11 Структура мышечных волокон перепелов: а кот-рольная группа; б- опытная группа.

Морфометрические характеристики мышечной ткани и печени перепелов. Для изучения морфометрических характеристик мышечной ткани и печени перепелов были проведены исследования диаметра ядер гепатоцитов (клеток печени) и диаметра мышечных клеток. Кроме того, было выведено процентное соотношение жировых включений и паренхимы печени (табл. 10).

При морфометрии мышечных волокон мяса контрольной группы перепелов было установлено, что диаметр волокна составлял 427,2±27,3 мкм, а диаметр мышечных волокон мяса перепелов, получавших биомодифицированный комбикорм, составлял 546,7 + 40,3 мкм, что больше по сравнению с началом откорма на 6,83 % и 36,7 % соответственно.

Таблица 10

Процентное соотношение жировых включений и паренхимы печени перепелов

Показатель группа

до начала эксперимента контрольная опытная

Жировые включения, % 21,2+6,8 73,9+5,9 61,2+6,3

Паренхима печени. % 78,8±7,4 26,1 ±3,1 38,1 ±7,6

Диаметр ядра гепатоцитов, мкм 10!,3±П,4 94,3±10,8 ! 48,7+2 J ,0

Таким образом, применение маннозосодержащих гидролизатов в рационе кормления перепелов способствовало усиленному развитию мышечкой ткани, а также усилению функциональной активности печени. Кроме того, в печени перепёлок данной группы ярко просматривалось отложение жировых включений, но отрицательное влияние интенсивного откорма на структуру и функцию органа сказывалось в гораздо меньшей степени, что свидетельствовало о наиболее качественном генезе «деликатесной» печени и соответственно качественной продукции.

Экономическая эффективность использования гидролизатов при npouseodcmee перепелиного мяса и яиц. Оценивая уровнь рентабельности при реализации контрольного и опытного вариантов по производству перепелиного мяса и яиц, учитывали разницу между выручкой от реализации и затратами на их производство. Разница составила 6,86 %.

Полученные данные подтверждают экономическую целесообразность применения маннозосодержащих гидролизатов в составе комбикорма для перепелов.

ВЫВОДЫ

1. Проведен скрининг микроорганизмов продуцентов р-маннаназы и выбран микромицет Tr. harzianum FI 14, обладающий высокой биосинтетической способностью.

2. Методом математического планирования эксперимента определен состав питательной среды и оптимальные условия биосинтеза Тг. harzianum F1 14, обеспечивающие высокую активность целевого фермента.

3. Разработана эффективная схема очистки ферментного препарата, позволяющая получить высокоочищенный фермент эндо-1,4- Р-маннаназы с удельной активностью 271,5 ед/мг белка и степенью очистки 24,2. Установлено, что фермент является димером с молекулярной массой 100 кДа.

4. Исследование физико-химических свойств и кинетики кислотной и термической инактивации Р-маннаназы позволили установить, что наибольшую стабильность фермент проявляет при рН 4,0-5,0 и температуре 50 С.

5. Определены рациональные режимы гидролиза маннанов растительного сырья: температура 60 °С, дозировка фермента 15 ед/г субстрата, продолжительность 3-4 часа.

6. Разработана технологическая схема производства биомодифициро-ванного комбикорма, включающая ферментативный гидролиз труд-ногидролизуемых некрахмалистых полисахаридов.

7. Исследована возможность применения маннозосодержащих гидролизатов для кормления перепелов.

8. Установлено, что применение биомодифицированного комбикорма способствует увеличению мясной и яичной продуктивности перепелов на 2,2 % и 14,0 % соответственно, а также повышению биологической ценности мяса на 13,8 %.

9. Гистоморфрлошческие исследования печени и мышечной ткани перепелов, получавших биомодифицированный комбикорм, свидетельствовали об усиленном развитии мышечной ткани и наиболее качественном генезе «деликатесной» печени.

10. В результате анализа экономической эффективности производства перепелиного мяса и яиц показан рост общего уровня рентабельности на 6,86 %.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Чигирина, U.A. Перспективы применения ß-глкжаназы и маннаназы в биотехнологии [Текст] / H.A. Чигирина, О.С. Корнеева // Материалы XL1 отчетной научной конференции за 2002 год, ч. 1. - Воронеж. -2003.-С.

2. Корнеева, О.С. Оптимизация условий культивирования микроскопического гриба Trichoderma harzianum [Текст] / О.С. Корнеева, H.A. Чигирина // Материалы XLII1 отчетной научной конференции за 2004 год, ч.1. - Воронеж. -2005. - С. 136.

3. Чигирина, H.A. Сравнительная характеристика кислотного и ферментативного гидролиза маннансодержащего сырья [Текст] / H.A. Чигирина // Материалы XL1I отчетной научной конференции за 2003 год, ч. 1. - Воронеж. - 2004. - С.75.

4. Чигирина, H.A. Очистка ß-маннаназы из Trichoderma harzianum [Текст] / H.A. Чигирина, О.С. Корнеева, Т.В. Мальцева, И.В. Чере-мушкина // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов: Межрегиональный сборник научных работ. Выпуск. 6-Воронеж. - 2004. С. 174-177.

5. Корнеева, О.С. Получение технических препаратов карбогидраз [Текст] /О.С. Корнеева, И.В. Черемушкина, Т.В. Мальцева, H.A. Чигирина // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов: Межрегиональный сборник научных работ. Выпуск. 7 - Воронеж.-2005. С. 100-103.

6. Корнеева. О.С Влияние компонентов углеродного и азотного питания на биосинтез маннаназы и ß-глкжаназы микроскопическими грибами Trichoderma harzianum [Текст] / О.С. Корнеева, H.A. Чигирина , Т.В. Мальцева// 8-ая Путинская школа-конференция молодых ученых «Биология-наука XXI века». - Пущино. - 2004. - С. 287.

7. Чигирина, H.A. Кислотная и термическая инактивация ß-маннаназы Trichoderma harzianum [Текст] / H.A. Чигирина, Т.В. Мальцева, О.С. Кор-

неева, И.В. Черемушкина // 9-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология-наука XXI века». - Пущино. - 2005. - С. 368.

8. Корнеева, О.С. Биосинтез ß-маннаназы грибом Trichoderma harzianum при глубинном культивировании [Текст] / О.С. Корнеева, H.A. Чигирина // Вестник ВГТА. - 2004. № 9. - С.54-57.

9. Корнеева, О.С. Карбогидразы: особенности структуры и биокатализа [Текст] / О.С. Корнеева, Т.В. Мальцева, H.A. Чигирина // Материалы И Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - Москва. -2003. - 4.2. - С. 194.

10. Чигирина, H.A. Деструкция сырья растительного и микробного происхождения ферментами [Текст] / H.A. Чигирина, Т.В. Мальцева // Материалы III Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - Москва. - 2005. - 4.2. -С. 164-167.

11. Чигирина, H.A. Ферментные препараты в биотехнологии [Текст] / H.A. Чигирина, О.М. Омельченко, Т.В. Мальцева, И.В. Черемушкина, О.С. Корнеева // Тезисы докладов V международного форума «Биотехнология и современность». - С.-Петербург. - 2004. - С. 23-24.

12. Корнеева, О.С. Деструкция маннансодержащего сырья микробного и растительного происхождения ферментами [Текст] / О.С. Корнеева, И.В. Черемушкина, H.A. Чигирина Т.В. Мальцева // Тезисы докладов VI международного форума «Биотехнология и современность». -С.-Петербург. - 2005. - С. 30-31.

13. О.С. Корнеева, Возможности применения мультиэюимного комплекса из Trichoderma harzianum [Текст] / О.С. Корнеева, H.A. Чигирина // Материалы II международной научно-технической конференции «Прогрессивные технологии и оборудование для пищевой промышленности». - Воронеж. - 2004. - С. 103.

14. Чигирина, H.A. Ферментативный способ деструкции полисахаридов с целью применения их в биотехнологии [Текст] / H.A. Чигирина, О.С. Корнеева // Хранение и переработка сельскохозяйственного сырья. Принята к печати.

15. Чигирина, H.A. Разработка биомодифицированных кормов для перепелов [Текст] / H.A. Чигирина, О.С. Корнеева // Мясная индустрия. -2006. -№3. С. 43-45.

»11^8

Подписано в печать 06.05.2006 Формат бум. 60x90 1/16 Бум. лм мн. ап. Усл. П.л. 1.0 Тираж 100 заказ № 250

394000. Воронеж, пр. Революции 19, ВГТА ОПиТС

Введение. i ф

Глава 1. Микробная деструкция маннанов растительного сырья и практическое применение полученных гидролизатов

1.1 Маннаны растительного сырья и их характеристика.

1.2 Ферментативный гидролиз маннансодержащего сырья.

1.2.1. Продуценты р-маннаназы.

1.2.2. Факторы, влияющие на биосинтез маннаназ при культивировании продуцентов.

1.2.3. Получение очищенных препаратов Р-маннаназы и их физико-химические свойства.

Ф ф 1.3. Функциональные свойства маннозы.

1.4. Практическое применение препаратов Р-маннаназ.

1.4.1 Использование Р-маннаназы с целью получения биомодифицированного корма.

1.4.2. Перепеловодство как перспективное направление применения Р-маннаназы.

Актуальность работы. Для обеспечения здоровья и нормальной жизнедеятельности организма человека необходимо полноценное сбалансированное питание. Одними из продуктов, уникальных по своей питательной ценности, которые способны восполнить и поддерживать в норме уровень необходимых питательных веществ, являются перепелиные яйца и мясо.

Перепеловодство является перспективной отраслью яичного и мясного птицеводства. Эта отрасль позволяет обеспечить население высококачественными продуктами питания в кратчайшие сроки и с минимальными затратами.

Известно, что качество мяса зависит от рациона кормления птицы. Учитывая, что в рецептуру комбикорма для перепелов входит значительная доля растительного сырья, содержащего некрахмалистые полисахариды (маннаны), возникла научно обоснованная необходимость применения ферментных препаратов, гидролизующих эти полисахариды. В то же время известно, что образующаяся под действием (З-маннаназы манноза обладает рядом функциональных свойств: участвует в синтезе гликопротеидов и гли-колипидов, иммунных тел, относится к витаминоподобным сахарам.

Вопросам применения Р-маннаназы в птицеводстве и изучению влияния маннозы на биохимические процессы в живом организме, а также на качество получаемых продуктов питания посвящены работы зарубежных ученых.

Однако в отечественной практике такие исследования отсутствуют.

В связи с этим поиск активных продуцентов Р-маннаназ и применение их в кормопроизводстве с целью повышения выхода и биологической ценности продукции перепеловодства являются актуальными вопросами биотехнологии.

Настоящая работа выполнялась в соответствии с научным направлением кафедры микробиологии и биохимии Воронежской государственной технологической академии по проблеме «Изыскание оптимальных условий биосинтеза микроорганизмами биологически активных веществ и изучение их физико-химических свойств» (гос. регистр. № 01930004491) и в рамках научно-технической программы «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники». Данная тема включена в координационный план РАН по программе «Микробиологический синтез и научные основы микробиологического получения практически ценных веществ».

Цель и задачи исследования. Цель диссертационной работы заключалась в разработке биомодифицированного корма для перепелов путем использования ферментного препарата Р-маннаназы, позволяющего улучшить биологическую ценность мяса и увеличить мясную и яичную продуктивность перепелов.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

• выбор активного продуцента Р-маннаназы;

• оптимизация условий биосинтеза целевого фермента;

• получение очищенного ферментного препарата Р-маннаназы и изучение его физико-химических свойств;

• определение рациональных условий гидролиза маннанов растительного сырья;

• исследование возможности применения маннозосодержащих гидро-лизатов для кормления перепелов;

• сравнительная характеристика продуктивных показателей перепелов, откармливаемых биомодифицированным комбикормом и стандартной кормосмесыо, а также гистоморфологические исследования тканей;

• определение биологической ценности мяса;

• расчет экономической эффективности производства перепелиного мяса и яиц с применением маннозосодержащих гидролизатов.

Научная новизна. В настоящей работе впервые получен ферментный препарат эндо-1,4-Р-маннаназы Trichoderma harzianum F114, способный гидролизовать некрахмалистые полисахариды (маннаны) растительного сырья до маннозы.

На основании результатов исследования гистоморфологических характеристик и биологической ценности мяса перепелов впервые теоретически обоснована и практически подтверждена эффективность применения маннозосодержащих гидролизатов в составе комбикорма.

Практическая значимость работы. Разработана новая технология получения комбикорма, включающая ферментативный гидролиз маннан-содержащего растительного сырья. Применение биомодифицированного комбикорма способствует улучшению переваримости кормов, увеличению мясной и яичной продуктивности перепелов, а также повышению биологической ценности мяса.

Проведена промышленная апробация полученного комбикорма в условиях перепелиного хозяйства ООО «Интерптица», подтвердившая целесообразность и практическую значимость результатов исследования.

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на конференциях различного уровня. Они были представлены на отчетных научных конференциях ВГТА (2002-2005 гг.), 8-ой 9-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино 2004, 2005); Московском Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (г. Москва, 2004, 2005 гг.); II Международной научно технической конференции «Прогрессивные технологии и оборудование для пищевой промышленности», посвященной 100-летию проф. Попова В.И. (г. Воронеж, 2004 г.); Международном форуме «Биотехнология и современность» (г.Санкт-Петербург, 2004, 2005 гг.)

Данная работа была представлена на конкурс молодых ученых, проходивший в рамках Третьего Московского международного конгресса

Биотехнология: состояние и перспективы развития», отмечена дипломом за хорошую научно-исследовательскую работу.

Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано 15 работ.

Структура И объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов (3 главы), заключения, выводов, списка использованных источников, приложений и представлена на 149 страницах машинописного текста. Иллюстративный материал включает 36 рисунков и 28 таблиц. Библиография включает 142 наименований, в т. ч. 74 иностранных.

выводы

1. Проведен скрининг микроорганизмов - продуцентов Р-маннаназы и выбран микромицет Tr. harzianum, обладающий высокой биосинтетической способностью.

2. Методом математического планирования эксперимента определен состав питательной среды и оптимальные условия культивирования Tr. harzianum F114, обеспечивающие высокую активность целевого фермента.

3. Разработана эффективная схема очистки ферментного препарата, позволяющая получить высокоочищенный фермент эндо-1,4- Р-маннаназы с удельной активностью 271,5 ед/мг белка и степенью очистки 24,2. Установлено, что фермент является димером с молекулярной массой 100 кДа.

4. Исследование физико-химических свойств и кинетики кислотной и термической инактивации Р-маннаназы позволили установить, что наибольшую стабильность фермент проявляет при рН 4,0-5,0 и температуре 50 °С.

5. Определены рациональные режимы гидролиза маннанов растительного сырья: температура 60 °С, дозировка фермента 15 ед/г субстрата, продолжительность 3-4 часа.

6. Разработана технологическая схема производства биомодифицирован-ного комбикорма, включающая ферментативный гидролиз трудногидроли-зуемых некрахмалистых полисахаридов.

7. Исследована возможность применения маннозосодержащих гидролизатов для кормления перепелов.

8. Установлено, что применение биомодифицированного комбикорма способствует увеличению мясной и яичной продуктивности перепелов на 2,2 % и 14,0 % соответственно, а также повышению биологической ценности мяса на 13,8 %.

9. Гистоморфологические исследования печени и мышечной ткани перепелов, получавших биомодифицированный комбикорм, свидетельствовали об усиленном развитии мышечной ткани и наиболее качественном генезе «деликатесной» печени.

10. В результате анализа экономической эффективности производства перепелиного мяса и яиц показан рост общего уровня рентабельности на 6,86 %.

1. Автандилов, Г. Г. Медицинская морфометрия Текст. / Г.Г. Ав-тандилов.-М.: Медицина. 1990.—223 с.

2. Антипова, JI.B. Методы исследования мяса и мясных продуктов Текст. / JI.B. Антипова, И.А. Глотова, И.А. Рогов. М.: Колос, - 2001. - 376 с.

3. Анулов, О.В. Галактоманнаны семян бобовых отечественной флоры Текст. / О.В. Анулов Автореферат на соискан. учен. степ. канд. б. наук. -Москва, 2003.

4. Бадаева, Д.М. Целловиридин Г20Х в комбикормах для бройлеров Текст. / Д.М. Бадаева Автореферат на соискан. учен. степ. канд. с/х. наук. -Сергиев Посад, 2000.

5. Березин, И.В. Исследования в области ферментативного катализа и инженерной энзимологии. Избранные труды Текст. / И.В. Березин М.: Наука. - 1990.-384с.

6. Бовина, Е.В. Структура маннана дрожжей Candida Maltosa Текст. / Е.В. Бовина, В.В. Дерябин, А.В. Ланге, С.В. Яроцкий // Прикладная биохимия и микробиология. 1986. -т.22. - вып. 5. - С. 578-583.

7. Болотников, И.А. Физиолого-биохимические основы иммунитета сельскохозяйственной птицы Текст. / И.А. Болотников, Ю.В. Конопатов. -СПб: «Наука». 1987. - с. 64-69.

8. Бондаренко, С.П. Содержание перепелов Текст. / С.П. Бондарен-ко. М.: ООО «Издательство ACT», 2003. - 93с.11 .Варфоломеев, С.Д. Биокинетика: Практический курс Текст. / С.Д. Варфоломеев, К.Г. Гуревич. М.: ФИР-ПРЕСС, 1999. - 720с.

9. Варфоломеев, С.Д. Кинетические методы в биохимических исследованиях Текст. / С.Д. Варфоломеев, С.В. Зайцев. М.: Изд-во МГУ, 1992. -343с.

10. Власенко, Е.Ю. Гидролиз растительных глюкоманнанов препаратами целлюлаз из Trichoderma reesei и р-маннаназы из Bacillus subtilis Текст. / Е.Ю. Власенко, А.И. Синицын, Б.Д. Щербухин, А.А. Клесов // Биотехнология. 1985. - № 6. - С. 76-83.

11. Грачев, Ю.П. Математические методы планирования экспериментов Текст. / Ю.П. Грачев. М.: Пищ. пром-ть. 1979. - 192с.

12. Грачева, И.М. Технология ферментных препаратов Текст. / И.М. Грачева. М.: Агропромиздат. - 1987. - 335с.

13. Диксон, М Ферменты: в 3-х т. Текст. / М. Диксон, Э. Уэбб М.: Мир. - 1982. - 1118с.

14. Довгань, Н. Влияние ферментов на процессы пищеварения и усвоение питательных веществ в организме птиц Текст. / Н. Довгань, В. Дорда // Птицеводство. 1989. - № 2. - С. 25-26.

15. Домашняя птица: куры, гуси, утки, индейки, цесарки, перепела и голуби. М.: ACT, Ростов на Дону: Феникс. - 1999. - 416с.

16. Дудкин, М.С. Введение в химию углеводов // Издательское объединение «Вища школа». 1976. - 176 с.

17. Дудкин, М.С. Гемицеллюлозы Текст. / М.С. Дудкин, B.C. Громов, Н.А. Ведерников, Р.Г. Каткевич, Н.К. Черно. Рига: Зинатне. - 1991. - 488с.

18. Егоров, А.В. Состав и структура макромолекулы галактоманнана семян Gleditsia ferox Текст. / А.В. Егоров, Н.М. Местечкина, В.Д. Щербухин

19. Прикладная биохимия и микробиология. 2004. - т.40. - вып. 3. — С. 370375.

20. Егоров, А.В. Изучение структуры замещенных Р-маннанов семян бобовых и синтез их биологически активных сульфатированных производных Текст. / А.В. Егоров Автореферат на соискан. уч. ст. канд. б. наук. -Москва, 2004.

21. Егоров, И.И. Научные основы питания Текст. / И.И. Егоров // Птицеводство.- 2000. -№ 1.-С. 10-12.

22. Егоров, И.И. Ферменты фирмы БАСФ помогают птицеводам Текст. / И.И. Егоров, Ш. Имангулов, Б. Авдонин, А. Кузнецов // Комбикорма. 2002. - № 7. - С. 39-40.

23. Ермаков, А.И Методы биохимических исследований растений Текст. / А.И. Ермаков. JL: Агропромиздат Ленинградское отделение. -1987.-430с.

24. Жаринов, А.И. Краткие курсы по основам современных технологий переработки мяса. Курс 1.Эмульгированные и грубоизмельченные продукты Текст. / А.И. Жаринов. Москва, 1994. - с. 100-122.

25. Жеребцов, Н.А. Биохимия: Учебник Текст. / Н.А.Жеребцов, Т.Н. Попова, В.Г. Артюхов. Воронеж: Изд-во Воронежского гос. Университета. - 2002. - 696с.28.3аболотников, А. Справочник птицевода Текст. / А. Заболотни-ков. -М.: Моск. Рабочий. 1978. — 177с.

26. Коваленко, А.Г. Молекулярный вес и некоторые особенности строения дрожжевых полисахаридов, обладающих антивирусными свойствами Текст. / А.Г. Коваленко, С.К. Воцелко // Прикладная биохимия и микробиология. 1977. - т. 13. - вып. 1. — С. 46-54.

27. Кретович, B.JI. Основы биохимии растений Текст. / B.JI. Крето-вич. М.: Высшая школа. - 1986. - 547с.

28. Кретович, B.JI. Ферментные препараты в пищевой промышленности Текст. / B.JI. Кретович. -М.: Пищ. пром-ть. 1975. - 535с.

29. Левахин, В. Воздействие ферментных препаратов на обмен энергии в организме цыплят-бройлеров Текст. / В. Левахин, Г. Левахин, А. Ми-рошников // Весник Российской академии с/х наук. — 2002. С. 84-85.

30. Ленинджер, А. Основы биохимии Текст. / А. Ленинджер М.: Мир. - 1985. 2тома.

31. Липатов, Н.Н. Принципы и методы проектирования пищевых продуктов, балансирующих рационы питания Текст. / Н.Н. Липатов // Известия вузов. Пищевая технология. 1990. - №6. — с. 5-10.

32. Липатов, Н.Н некоторые аспекты моделирования аминокислотной сбалансированности пищевых продуктов Текст. / Н.Н. Липатов // Пищевая и перерабатывающая промышленность. 1985. - №4. - с. 48-52.

33. Магнус, Я.Р. Эконометрика. Начальный курс: Учебник Текст. / Я.Р. Магнус, П.К. Катышев, А.А. Пересецкий. М.:Дело. - 2000. - 400с.

34. Малофеева, Ю.Н. Влияние экзогенных ферментов на модификацию слизистых веществ в тесте и качество ржано-пшеничного хлеба Текст. /

35. Ю.Н. Малофеева, И.В. Матвеева, Т.А. Юдина, К. Оганесян // Хлебопечение России. 2003, № 3 С. 26-36.

36. Методические рекомендации по кормлению перепелов. — М.:НПО «Комплекс». 1989. - 43с.

37. Ольшанская, Г.П Влияние МЭК-СХ-2 в составе ячменно-пшеничных кормосмесей на яичную продуктивность перепеловТекст. / Г.П. Ольшанская. Автореферат на соискан. учен. степ. канд. с/х. наук. Омск, 2005.

38. Пигарев, М.Д. Перепеловодство Текст. / М.Д. Пигарев, Г.Т. Афанасьев. М.: Росагропромиздат. 1989. - 102с.

39. Покровская, Н.В. Действие ферментных препаратов микробного происхождения на полисахариды с Р-(1-3) и Р-(1-4) связями Текст. / Н.В. Покровская, Н.А.Тиунова, Е.В. Белова // Микробиологическая промышленность. 1976. - № 6. - С.26-28.

40. Путнам, Ф. Денатурация белков Текст. / Ф. Путнам. М.: Мир. -1984.-24с.

41. Родионова, Н.А. Некоторые физико-химические свойства и субстратная специфичность эндо-1,4~Р-глюканазы Geotrichum candidum Текст. / Н.А.Родионова, Н.В.Васильева, Л.И. Мартинович, A.M. Безбородое // Биохимия. 1990. - т.55. - вып. 4. - С. 613-624.

42. Родионова, Н.А. Геммицеллюлозы зерна злаков и ферменты, катализирующие их расщепление Текст. / Н.А. Родионова, Л.В. Капрельянц, П.В. Середницкий, АЛО. Килимник // Прикладная биохимия и микробиология. 1992. -т.28. - вып. 5. - С. 645-664.

43. Рубан, Б.В. Птица и птицеводство Текст. / Б.В. Рубан. Харьков: «Эспада». - 2002. - 520с.

44. Рубин, А.Б. Биофизика: В 2-х т. Т. 1: Теоретическая биофизика Текст. / А.Б. Рубин. М.: Книжный дом «Университет». — 1999. - 448с.

45. Руппель, Г.Л. Выращивание перепелов на мясо с использованием в кормосмесях ферментных преператов. Автореферат на соискан. учен. степ, канд. с/х. наук. — Омск, 2003.

46. Рухлядева, А.П. Методы определения активности гидролитических ферментов Текст. / А.П. Рухлядева, Г.В. Полыгалина. М.: Легкая и пищевая промышленность. - 1981. -288с.

47. Сахаутдинова, С.М. Гемицеллюлозы различных органов растения кукурузы Текст. / С.М. Сахаутдинова Автореферат на соискан. учен. степ, канд. с/х. наук. — Уфа, 1966.

48. Сирвидис, В. Влияние МЭК на питательную ценность комбикормов Текст. / В. Сирвидис // Комбикорма. 1999. № 2. - С.22.

49. Скоупс, Р. Методы очистки белков Текст. / Р. Скоупс М.: Мир. -1985.-358с.

50. Слюсаренко, Т.П. Лабораторный практикум по микробиологии и пищевых производств Текст. / Т.П. Слюсаренко. М.: Легкая пром-ть. -1984.-208с.

51. Степаненко, Б.Н. Химия и биохимия углеводов (полисахариды): Учеб. Пособие для ВУЗов Текст. / Б.Н. Степаненко. М.: Высшая школа. -1978.-256с.

52. Сулейманов, С.М. Методы морфологических исследований Текст. / С.М. Сулейманов. Воронеж. - 2000. - 63с.

53. Супрунов, Д. Обогащение комбикормов ферментным комплексом для цыплят-бройлеров Текст. / Д. Супрунов // Комбикорма. — 2000. № 1. -С.47-48.

54. Сургутский, В.П. Химия пищевых продуктов Текст. / В.П. Сургутский. — Красноярск: Гротеск 1997. - 317с.

55. Тетеркин, A.JI. Продуктивные признаки перепелов течение 32-недель продуктивного периода Текст. / A.JI. Тетеркин // Мат.науч.практ. конф. «Наука — птицеводству Ивановской области». Сергиев Посад Иваново .-2002.-С. 170-176.

56. Тишенков, П.И. Биотехнологические основы использования микробных ферментных препаратов в кормопроизводстве и кормлении животных Автореферат на соискан. учен. степ. д. б. наук. Боровск, 2004.

57. Хесин, Я. Е. Размеры ядер и функциональное состояние клеток Текст. / Я.Е. Хесин. М.: Медицина. - 1967. - 423с.

58. Чепурной, И.П. Питание и здоровье человека Текст. / И.П. Чепур-ной. М.: Медицина. 2003. - 208 с.

59. Шарков, В.И. Химия гемицеллюлоз Текст. / В.И. Шарков, Н.А. Куйбина. М.: Мир.- 1976. - С. 66-67.

60. Шлегель, Г. Общая микробиология Текст. / под ред. Е.Н. Кондратьевой. М.: Мир.- 1987. - 567с.

61. Щербухин, В.Д. Галактоманнаны отечественной флоры Текст. /В.Д. Щербухин // Прикладная биохимия и микробиология . 1993. - т.29. - вып. 6.-С. 803-813.

62. Ademark, P. Softwood hemicellulose-degrading enzymes from Aspergillus niger: Purification and properties of a beta-mannanase Text. / P. Ademark, A. Carga, J. Medve, T. Drakenberg, F. Tjerneld, H. Stalbrand. J. Biotechnol. -1998.-vol. 63.-p. 199-210.

63. Akino, Т. Characterization of three beta-mannanase of an alkalophilic Bacillus sp. Text. / T. Akino; N. Nakamura; K. Horikoshi J. Agric. Biol. Chem. - 1988. - vol. 52. - p. 773-779.

64. Araki, T. Purification and characterization of an endo-beta-mannanase from Aeromonas sp. F-2 Text. / T. Araki J. Fac. Agric. Kyushu Univ . - 1983. -vol. 27. - p. 89-98.

65. Araki, T. Purification and characterization of a novel exo-beta-mannanase from Aeromonas sp. F-25 Text. / T. Araki, M. Kitamikado. J. Bio-chem. - 1992. - vol. 91. - p.l 181-1186.

66. Arcand, N. P-Mannanase of Streptomyces lividans 66: sequence of the man A gene and characterization of the enzyme Text. / N. Arcand, D. Kluepfel, R. Morosoli, F. Shareck. J. Biochem. - 1993. - vol. 290. - p.857-863.

67. Bedford M.R. The use of enzymes in poultry diet Text. / M.R. Bedford, A.J. Morgan // World poultry Sc. J. 1996. - vol. 52. - p.61-68.

68. Beguin, P. Molecular biology of cellulose degradation Text. / P. Beguin. //Ann. Rev. Microbiol. 1990.-vol. 44.-p.219-248.

69. Beldman, G. Adsorption and kinetic behavior of purbfed endoglucanases and exoglucanases from Trichoderma viride Text. / G. Beldman, F.Voragen, F. Leeuwen. J: Biotechnol. Bioeng. 1987. - vol. 30, № 2. - p. 251-257.

70. Bewley, J.D. Molecular cloning of a cDNA encoding a (l->4)-beta-mannan endohydrolase from the seeds of germinated tomato (Lycopersicon esculen-tum) Text. / J.D. Bewley; R.A. Burton, Y. Morohashi; G.B. Fincher. Planta . 1997. -vol. 203.-p. 454-459.

71. Bhikabhai, R. Isolation of cellulolytic enzymes from trichoderma reesei QM-9414 Text. / R. Bhikabhai, G. Johansson, G. Petersson. Appl. Biochem. -1987. - vol. 6, № 5-6. - p. 336-345.

72. Cavanagh, K. Measurement of caprine plasma beta-mannanase with a p-nitrophenyl substrate Text. / K. Cavanagh, RW. Dunstan, MZ. Jones // Am. J. Vet Res. 1993. - vol. 44. - p. 681-684.

73. Charrier, M. Mannan-degrading enzymes purified from the crop of the brown garden snail Helix aspersa Mfjller (Gastropoda Pulmonata) Text. / M. Charrier, C. Rouland. J. Exp. Zool. -2001. - vol. 290. - p. 125-135.

74. Christgau, S. Expression cloning, purification and characterization of a beta-l,4-mannanase from Aspergillus aculeatus Text. / S. Christgau, S. Kaup-pinen; J. Vind, L.V. Kofod; H. Dalboge J. Biochem. Mol. Biol. Int . - 1994. -vol. 33.-p. 917-925.

75. Chen, Y. Study on the production of beta-mannanase by Bacillus M50 Text. / Y. Chen, J. Long, L. Liao, Y. Zhang, J. Yang. Chengdu: Chengdu Institute of Biology.- 2000. - vol. 40. - p. 62-68.

76. Cui, F. Production of neutral beta-mannanase by Bacillus subtilis and its properties Text. / F. Cui, J. Shi, Z. Lu. — Beijing: Institute of Microbiology.— 1999.-vol. 39.-p. 60-63.

77. Dekker, R.F. Bioconversion of hemicelluloses: aspects of hemicellulase production by Trichoderma reesei QM-9414 and enzymatic saccharification of hemicellulose Text. / R.F. Dekker. Biotechnol. and Bioengineer. - 1993. - vol. 25.-p. 1127-1146.

78. Dekker R.F. The hemicellulase group of enzymes Text. / R.F.Dekker. -Polysaccharides in food. London. 1979. -p.93-108.

79. Draper, N.R. «Ridge analysis» of Response Surfaces Text. / N.R. Draper // Technometrics. 1963. - № 4,5. - p. 3-18.

80. Dulson, J. Mannanse from Lactuca sativa: Metabolic requirements for production and partial purification Text. / J. Dulson, J.D. Bewley. J. Phytochemis-try. - 1989. - vol. 28. - p. 363-369.

81. Eriksson, K.E Mutants of the white rot fungus Sporotrichum pulverulentum with increased cellulose and P-glucosidase production Text. / K.E. Eriksson, S.C. Johnsrug. Enzyme microbial. Technol. - 1983. - vol. 6. — p. 425-429.

82. Fagerstam, L.G. The 1,4-P-glucan cellobiohydrolases of Trichoderma reesei QM-9414. A new type of cellulolytic synergism Text. / L.G. Fagerstam, L.G. Pettersson. FEBS Lett.- 1980. - vol. 119. - p. 97-100.

83. Feng, Y.Y. Kinetics of P-mannanase fermentation by Bacillus licheni-formis Text. / Y.Y. Feng, Z.M. He, L.F. Song, S.L. Ong, J.Y. Hu, Z.G. Zhang, W.J. Ng // Biotechnology Letters. 2003. - vol. 25. - p. 1143-1146.

84. Gherardini, D.C. Purification and characterization of a cell-associated, soluble mannanase from Bacteroides ovatus Text. / F.G. Gherardini, A.A. Salyers // J. Bacteriol. 1987. - vol. 169. - p. 2038-2043.

85. Halmer, P. De novo synthesis of mannanase by the endosperm of Lac-tuca sativa Text. / P. Halmer J. Phytochemistry. - 1989. - vol. 28. - p. 371-379.

86. Halmer, P., Bewley, J.D., Thorpe, T.A. Enzyme to break down lettuce endosperm cell wall during gibberellin- and light-induced germination Text. / P. Halmer, J.D. Bewley, T.A. Thorpe. Nature. - 1975. - vol. 258. - p. 716-718.

87. Halmer, P., Bewley, J.D. Mannanase production by the lettuce endosperm Text. / P. Halmer, J.D. Bewley. Planta. - 1987. - vol. 144. - p. 333340.

88. Hashem, A.M. Production and properties of beta-mannasase by free and immobilized cells of Aspergillus oryzae NRRL 3488 Text. / A.M. Hashem, A.M. Ismail, M.A. EL-Refai, A.F. Abdel-Fattah. Cairo: National Research Centre. - 2001. -vol. 105.-p. 115-130.

89. Johnson, K.G. Microbial degradation of hemicellulotic materials Text. / K.G. Johnson, M.C. Silva, C.R. MacKenzie, H. Schneider, J.D. Fontana. -Applied Biochem. and Biotechnol. 1998. - vol. 20/21. - p. 245-258.

90. Kataoka, N. Isolation and characterization of an active mannanase-producig anaerobic bacterium Clostridium tertium KT-5A from lotus soil Text. / N. Kataoka, Y. Tokiwa // Appl Microbiol 1998. - vol. 84. - p. 357-367.

91. Li, W. Purification and characterization of an endo-beta-1,4-mannanase from Bacillus subtilis BM9602 Text. / W. Li, Z. Dong, F. Cui. Beijing: Institute of Microbiology. - 2000. - vol. 40. - p. 420-424.

92. Lowry, O.H. Protein estimation with folin phenol reagent Text. / O.H. Lowry, N.J. Resebrough, A.L. Farr, R.J. Randell. J. Biol.Chem. - 1951. -vol.193. № 1. — p.265-275.

93. H.McCleaiy, B.V. beta-D-Mannanase Text. / B.V. McCleaiy. J. MethodsEnzymol.- 1988.-vol. 160.-p. 596-610.

94. McCleary, B.V. Modes of action of beta-mannanase enzymes of diverse origin on legume seed galactomannans Text. / B.V. McCleary. J. Phyto-chemistry.- 1979.-vol. 18.-p. 757-763.

95. McCleary, B.V. Prification of a beta-mannanase enzyme from lucerne seed by substrate affinity chromatography Text. / B.V. McCleary. J. Phyto-chemistry. - 1978. - vol. 17. - p. 651-653.

96. Park, G.G. Purification and some properties of beta-mannanase from Penicillium purpurogenum Text. / G.G. Park, I. Kusakabe, Y. Komatsu, H. Koba-yashi, T. Yasui, K. Murakami. J. Agric. Biol. Chem. - 1987. - vol. 51. — p. 2709-2716.

97. Perlin, A.S. The action of p-glucanases on p-glucans of mixed linkage Text. / A.S. Perlin. Advance in enzymic hydrolysis of cellulose and related materials. - 1963. -p. 185-195.

98. Politz, O. A highly thermostable endo-(l,4)-P-mannanase from the marine bacterium Rhodotermus marinus Text. / O. Politz, M. Krah, K.K. Thomsen, R. Borriss. Appl Microbiol Biotechnol. - 2000. - vol. 53.-p. 715-721.

99. Puis, J. a-Glucuronidase in two microbial xylanolytic systems Text. / J. Puis, O. Schmidt, C. Granzow. Enzyme Microbiol. Technol. - 1987. - vol. 9. -p. 83-88.

100. Reese, E.T., Shibata, Y. beta-Mannanases of fungi Text. / E.T. Reese, Y.Shibata.-Can. J. Microbiol. 1965.-vol. 11.-p. 167-181.

101. Sachslehner, A. Efficient production of mannan-degrading enzymes by the basidiomycete Sclerotium rolfsii Text. / A. Sachslehner, D. Haltrich, G. Gubitz, B. Nidetzky, KD. Kulbe // Appl Biochem Biotechnol 1998. - vol. 70. - p. 939-953.

102. Somogyi, M.J. Determination of reducing sugar Text. / M.J. Somo-gyi. J. Biol.Chem. - 1952. - vol.195. - p. 19-28.

103. Talbot, G. Purification and characterization of themostable beta-mannanase and alpha-galactosidase from Bacillus stearothermophilus Text. / G. Talbot, J. Sygusch. J. Appl. Environ. Microbiol. - 1990. - vol. 56. - p. 3505-3510.

104. Tamaru, Y. Purification and characterization of an extracellular man-nanase from a marine bacterium, Vibrio sp. strain MA-138 Text. / Y. Tamaru; T. Araki, H. Amagoi; H. Mori, T. Morishita. J. Appl. Environ. Microbiol. - 1995. -vol. 61.-p. 4454-4458.

105. Tenkanen, M. Production, purification and characterization of an esterase liberating phenolic acids from lignocelluloses Text. / M. Tenkanen, J. Schuseil, J. Puis, K. Poutanen. J. Biotechnol. - 1991. - vol. 18, № 1-2. - p. 69-83.

106. Whitaker, J.R. Determination based on difference in adsorbance at 235 and 280 nm Text. / J.R. Whitaker, P. Granum Analyt. Biochem. - 1980. -vol. 109.-p. 156-159.

107. Wong, K.K. Purification of a third distinct xylanase from xylanolytic system of Trichoderma harzianum Text. / K.K. Wong, L.U. Tan, J.N. Saddler. -Can. J. Microbiol. 1986. - vol. 32. - p. 570-576.

108. Wu, J. Purification and properties of beta-D-mannanase from Nocar-dioform actinomycetes Text. / J. Wu, B. He. Institute of Microbiology. - 2000. - vol. 40. - p. 69-74.

109. Xu, B. Endo-beta-l,4-Mannanases from blue mussel, Mytilus adulis: purification, characterization, and mode of action Text. / B. Xu, P. Hagglund, H. Stalbrand, J.C. Janson. J. Biotechnol. -2002. - vol. 18. - p. 267-277.

110. Xu, B. Cloning and expression in Pichia pastoris of a blue mussel (Mytilus edulis) (3-mannanase gene Text. / B. Xu, D. Sellos, JC Janson // Eur. J. Biochem. 2002. - vol. 269. - p. 1753-1760.

111. Yamaura, I. Purification and some properties of an endo-l,4-beta-D-mannanase from a marine mollusc, Littorina brevicula Text. / I. Yamaura, Y. No-zaki, T. Matsumoto, T. Kato. J. Biotechnol. - 1996. - vol. 60. - p. 674-676.

112. Yamazaki, N. Isolierung und Eigenshaften einer 1,4-Mannanase aus Aspergillus niger Text. / N. Yamazaki, M. Sinner, H.H.Dietrichs. -J.Holzforshung. 1976. - vol. 30. - p. 101-109.

113. Yang, W. Purification and characterization of a beta-mannanase from Bacillus licheniformis Text. / W. Yang, Q. Tong, Q. Shen. Microbiology. -1995.-vol. 22.-p. 338-342.

114. Yasushi, M. Purification and characterization of konjak glucomannan degrading enzyme from Clostridium butyricum Text. / M. Yasushi, N. Nobuyoshi. J. Biosci., Biotechnol. and Biochem. - 1997. - vol. 61, № 10. - p. 1739-1742.

115. Zakaria, M.M. Purification and characterization of an endo-l,4-beta-mannanase from Bacillus subtilis KU-1 Text. / M.M. Zakaria, S. Yamamoto, T. Yagi. FEMS Microbiol. Lett. - 1998. - vol. 158. - p. 25-31.

116. Zhang, J. Operational and storage stability of P-mannanase from Bacillus licheniformis, Text. / J. Zhang, M. He, Z. He. -Biotechnology Letters. -2002.-vol. 24.-p. 1611-1613.