автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.16, диссертация на тему:Теоретическое исследование роли полинуклеотидного контекста в возникновении мутаций

АКАДЕМИЯ. НАУК СССР Н ОРДЕНА ЛЕНИНА

СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ Новосибирский институт органической химии

На правах рукописи

УДК 678.088:(676.18+678.24)

Рогозин Игорь Борисович

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ ПОЯИНУКЛЕОГИДНОГО КОНТЕКСТА В ВОЗНИКНОВЕНИИ МУТАЦИЙ

05.13.16 (биол. науки) - Применение вычислительной техники, математического моделирования и математических методов в научных исследованиях

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

V /"'у «V

V -Р-" V 7 ^^

Новосибирск 1980

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО АН СССР, г. Новосибирск

Научные руководители: доктор биологических наук, зав.лаб. H.A. Колчанов

кандидат биологических наук, с.н.с. В.В. Соловьев

Институт цитологии и генетики СО АН СССР, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

зам. директора Н.П. Мертвецов Новосибирский институт биоорганической химии СО АН СССР, г. Новосибирск

кандидат технических наук, с.н.с. В.Д. Гусев

Институт математики СО АН СССР, г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Институт молекулярной генетики АН СССР

г. Москва

«"Tcf" (• (

Защита состоится "Уо " ЦШ^Щл^и^ » 1990 г.

на_ заседании специализированного совета по

защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при Новосибирском институте органической химии СО АН СССР (К 002.42.01) в конференц-зале института по адресу: 680090, г.Новосибирск, 90, проспект Академика Лаврентьева, 9.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института органической химии СО АН СССР

Автореферат разослан "_"_" 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат физико-математических наук В. И. Смирнов

. : Актуальность теш. Характерной особенностью геномов является наличие мутационной и рекомбкнационной изменчивости, поставляющей материал для эволюционного процесса. Вагность изучения этой проблемы определяется так ®е и тем, что .Некоторые мутации могут приводить к тягелкм нарувешшм "функции клеток, тканей, органов и организмов.

Появление новых методов генной инкенерии привело к быстрому накоплению информации о нуклеотидаых последовательностях, в которых произозли мутации и рекомбинации, что создало возможности для теоретического исследования этих явлений. Анализ распределения мутационных и рексмбкнационных событий по нужлеотидвки последовательностям показал, что во многих случаях эти события сосредоточены в определенных участках последовательностей. Исследование таких скоплений мутаций и рекомбинаций ("горячих" точек) показало, что такая неравномерность монет быть обусловлена структурой участков полинуклеотндиой последовательности (т.е. контекстными особенностями этих районов). В настоящее врзия усе есть ряд убедительных примеров больного значения особенностей контекста для вознжновения г.-утащ-й и ропоглбкнацнй. Изучение таких особенностей могет дать ценнуо информацию о молекулярных механизмах их возникновения.

Цели и задачи работы. Основная цель настоящей работа -комплексное теоретическое исследование роли контекстных закономерностей в возникновении мутаций и рекомбинаций, а также исследование молекулярных механизмов мутагенеза на основе анализа особенностей контекста в участках возникновения мутаций и рекомбинаций. Для достижения этой цели в настоящей работе ставились следущие задачи:

1. Создание базы данных мутационных и рекомбинационннх событий.

2. Разработка пакета программ для исследования структурно-функциональной организации последовательностей биополимеров. Разработка эффективных статистических методов для анализа роли контекста в возникновении мутаций и рекомбинаций.

3. Исследование с помощьо разработанных теоретических методов

связи различных особенностей контекста с мутационными и рексибинационными событиями.

Научная новизна результатов исследования. Разработан пакет программ анализа структурно-функциональной организации последовательно стней ДНК, РНК и белков "КОНТЕКСТ". Разработаны и реализованы на ЭВМ оригинальные и эффективные метода анализа роли контекста в возникновении мутаций, в том числа метода исследования свойств мутаций, методы анализа нвы^гчайности связи особенностей контекста с возникновением нутаций и рекомбинаций, методу выявления консенсусов "горячих" точек возникновения мутаций. Эти метода, основанные на статистических критериях, позволяют исследовать ыодэгулярше механизмы возникновения мутаций и рекомбинаций в нуклеотидкых последовательностях.

На основе разработанных методов проанализированы обширные ■ выборки спонтанных замен в ДНК. Показана реальность механизма репарационной коррекции гетеродуплексов ДНК, образугаихся по участкам прямых повторов и комплементарных палиндромов. Анализ оаибов ДНК-лолимэраз выявил выра&енные консенсусы "горячих" точек возникновения замен в ДНК. Различия в структуре консенсусов для разных ДНК-полимераз свидетельствует о том, что для разных лолимераз существуют разные локальные участки ДНК, вызывапаие повышенную частоту шибок при репликации ДНК. Получены статистические доказательства неслучайности связи спонтанных мутаций с -политрактами в соответствии с моделью дислокации матричной цепи.

Анализ мутаций, индуцированных 08-метилтуанином, выявил, что возникновение "горячих" точек возникновения замен обусловлено влиянием соседних нуклеотидов. Аналогичные результаты получены для предмутационных повреждений, вызванных воздействием ультрафиолетовых лучей.

Анализ соматический мутаций в 14 V-генах иммуноглобулинов выявил статистически достоверную связь соматических мутаций с такши механизмами, как репарационная коррекция гетеродуплексов ДНК и возникновение замен в результате ошибок ДНК-полимеразы.

Анализ рехомбинационных событий также выявил

статистически неслучайную связь особенностей контекста с точками рекомбинации во всех проанализированных случаях.

Теоретическая и практическая ценность. Разработанный пакет анализа последовательностей "КОНТЕКСТ" монет быть использован для решения широкого круга задач при изучении структурно-функциональной организации последовательностей биологических макромолекул, таких как поиск гомологичных последовательностей по Банкам данных биополимеров, анализ и поиск функциональных и рекомбинационных сайтов, поиск открытых рамок трансляции и т.д. Пакет программ "КОНТЕКСТ" используется во многих научно-исследовательских работах институтов АН СССР и других учереэдений, что подтверждается актами о внедрении.

Полученные в настоящей работе результаты о связи особенностей полинуклеотидного контекста с возникновением мутаций и разработанный пакет программ анализа связи контекста с возникновением мутаций могут быть использованы в дальнейшем при изучении молекулярных механизмов возникновения мутаций.

Апробация работы.. Материалы диссертации докладывались на Всесоюзных рабочих совещаниях "Теоретические исследования и банки данных в молекулярной биологии и генетике" (Новосибирск, 1984, 1886, 1388); на ¥-м съезде ВОГиС (Москва, 1387),- на V и VI-м Всесоюзных симпозиумах "Ыолежулярнке механизмы генетических процессов" Шосява, 1887,1990), на второй Всесоюзной конференции по теории эволюции (Москва, 1968); на Всесоюзной конференции "Математическое моделирование системы иммунитета и инфекционного процесса" (п.Кольцове, Новосибирской обл., 1989).

На разработки, сделанные в ходе выполнения диссертационной работы получены акты о внедрения в институты АН СССР и другие организации.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов. Объем диссертации 122 страницы текста, 89 рисунков, 19 таблиц. Общий объем 204 страницы.

Первая глава посвящена обзору литературы. В заключении к

этой главе содержится постановка основных задач исследования.

Вторая глава содержит описание теоретических методов анализа, использовавшихся в работе.

Третья глава посаяцека исследованию роли контекста в возникновении з&-.йн, к ах спонтанно возникших, так и индуцированных.

В четвертой главе рассматривается специализированный механизм мутагенеза - соматический гилермутагенез в '/-генах «слуноглобулинов.

В пятой главе рассматривается связь особенностей контекста с возникновением гомологичных и негомологичных рекс^бшаций.

В заключении обобщаются полученные результаты, рассматриваются перспективы развития ко.чгпьютеряой системы анализа связи контекста с мутациями.

ГЛАВА 2. КОМПЛЕКС МЕТОДОВ АНАЛИЗА ЮТАЦИОНШХ И РЕКОМБИНА-

ционных соштга

Описание терминов, использовавшихся в работе. В работе используются следукцие терлины:

"Горячей" точкой возникновения мутаций называется позиция последовательности, в которой мутации возникает с повышенной частотой относительно других позиций последовательности.

Исходными данными в работе являются нуклеотидные последовательности с возникшими в них мутациями (рис.1}. Анализируются к ах сами позиции, в которых наблюдались мутации, так и окрукагсдае их нуклэотиды. В этом случае позицию мутации с охруващиш нуклеотидами будем называть сайтом мутирования (рис.1а). Несколько сайтов мутирования можно выровнять относительно позиции мутирования и представить в виде набора выравненных последовательностей (рис.16). Набор выравненных последовательностей мокно описать консенсусом, т.е. последовательностью, составленной из нухлэотидов, наиболее часто ветречащихся в определенных позициях сайтов мутирования (рис.1в) (Соловьев и др., 1987). Для однобуквенннх обозначений определенных групп нуклеотидов, встречаэдихся в позициях сайтов мутирования, используется номенклатура (Согп1еЬ-Во*авд,1984), представленная в таблице 1.

a) G AAA

G С A G

ATTAGACGTC GGAGTCTTA TGGAGGCGA TTCGGGTTAT ATTGCGGCGG

1 10 20 30 40 60

б) последовательность сайта • G А С G Т G A G T С G A G G С G G T T A B) G R N К N

число мутаций в сайте 2 1 4 1

Рис. 1. Разные способы представления позиций мутирования, а) Последовательность, в которой произошли мутации. Так в позиции 7 наблюдается две мутации С->С и т.д. Сайты мутирования подчеркнуты (длина сайта в данном случае 5 нукле-отидов). Звездочкой обозначена позиция мутирования в каждом сайте, б) Выборка сайтов, сфазированных относительно позиции мутирования. Число мутаций в сайте означает число мутаций, которые наблюдаются в центральной позиции сайта (позиции фазирования), мутации в остальных позициях данного сайта не учитываются, в) Консенсус выборки сайтов мутирования. Все сайты мутирования совпадают с консенсусом ОЮПС.

Таблица 1. Номенклатура однобухвенного обозначения определенных групп нуклеотидов (Согп1вП-Во«<1оп, 1984)

Номер Одно- Группа Интерпретация

букв. КОД нуклеотидов

1 А А аденин

2 т Т тимидин

8 в G гуанин

4 с С цитозин

Б в G ИЛИ А пурины (большие)

6 У Т ИЛИ С пиримидина (малые)

7 и А ИЛИ С амино (поло«.заряд)

В к G ИЛИ Т кето (отриц. заряд)

9 V А ИЛИ Т слабые взаимодейств.

10 8 G ИЛИ с сильные взаимодейст.

11 В Т ИЛИ G ИЛИ с

12 V А ИЛИ G ИЛИ с

13 Н А ИЛИ Т ИЛИ с

14 0 А ИЛИ Т ИЛИ G

15 N любой

В работе используются следующие характеристики полинуклеотидного контекста:

Участок, совпадающий с определенным консенсусом (см.описание консенсуса выие).

Повтор длины L с К различиями - это два участка последовательности, имещих длину L нуклеотидов каждый и различаются по К нуклеотидам.

Олигонуклеотид длины L - это короткая нуклеотидная последовательность длины L с определенным нуклеотидным составом. Например, последовательность "ATTAGGACA" содержит следующие олигонуклеотиды длины Б - "АГГАО", bttagg", "TAXJGA", -AGGAC-, "C-GACA".

Политракт - это последовательность, состоящая из одинаковых нуклеотидов. Например, последовательность "ATCCCCCGATIAT" содержит поли-С тракт длиной б и короткий поли-Т тракт длиной £ нуклеотида.

Функциональные возможности пакета программ "КОНТЕКСТ".

Основная цель данной работы состояла в исследовании роли полинуклеотидного контекста в возникновении мутаций и рекомбинаций. Необходимо было разработать комплекс методов, реализованных в виде пахета программ, который позволял бы выявлять общие особенности полинуклеотидного контекста. Данная задача была решена в рамках пакета программ "КОНТЕКСТ". Ниже дается краткое описание некоторых программ, использовавшихся в работе.

Программа "PLAYS" предназначена для различных манипуляций с последовательностями. С ее помощью можно производить объединение произвольного набора последовательностей в одну последовательность, редактирование, печать последовательности и т.д. Важной функцией этой программы, использовавшейся в настоящей работе является поиск политрактов различных типов и участков потенциальной z-ДНК.

Программа "HABOR" предназначена для формирования наборов сфазированных последовательностей в формате пакета программ "КОНТЕКСТ". Программа использовалась для построения наборов последовательностей, в которых произошли рекомбинационные события (гомологичные и негомологичные рекомбинации).

Программа "REPEAT" осуществляет быстрый поиск

несовершенных повторов различных типов в нужлеотидных последовательностях. При поиске повторов используются оценки содержания повторов в некоторой случайной последовательности (см. обзор: Соловьев и др., 1987).

Программа "TRACT", предназначена для выявления неслучайно часто встречающихся олигонуклеотидов длиной от 2-х до 6-ти нуклеотидов в группе последовательностей.

Комплекс программ анализа связи полинуклеотидного контекста с возникновением мутаций.

В диссертации разработан комплекс методов анализа мутационных и рекомбинационных событий. Программы комплекса предназначены для выявления особенностей полинуклеотидного контекста, связанных с возникновением мутаций и рекомбинаций. Входной информацией для них являются полинуклеотидные последовательности с указанием локализации и вида наблюдавшихся в них мутаций или рекомбинаций. При анализе контекста используется расширенное описание нуклеотидов в 15-ти буквенном алфавите (табл.1).

Для выявления "горячих" точек мутирования была написана программа, реализугазя подход, приведенный в работе (Topal et al., 1988). Распределение мутаций по нуклеотидннм позициям оценивалось исходя из распределения Пуассона.

Алгоритм постороения набора консенсусов, характеризующих "горячие" точки мутирования,' основывается на предполоаении, что участки с различными комбинациями нуклеотидов могут иметь сходные высокие частоты мутирования в определенной позиции каждого участка (например, по причине сходства -некоторых особенностей геометрии ДНК, благоприятствущих появлению мутаций и т.д.). Целью алгоритма является построение такого набора консенсусов сайтов "горячих" точек мутирования, что влияние всех остальных позиций (не входящих в консенсусы) на частоту возникновения мутаций в "горячих" точках отсутствует (естественно, в рамках данной математической модели). Так, например, появление "горячих" точек мутирования в последовательности, взятой из работы (Kunkel, 1885Ы обусловлено консенсусами GC и SR, где G и S - позиции "горячих" точек мутирования, соответственно. Алгоритм работает с последовательностью, в которой наблюдались замены,

причем для работы алгоритму необходимо наличие "горячих" точек мутирования.

Анализ корреляций нуклеотидов в сайтах "горячих" точек мутирования используется для выявления таких оснований в выборке сайтов, которые связаны между с собой и влияют на частоту возникновения мутаций в центральной позиции сайтов "горячих" точек.

Для проверки различных гипотез о механизмах возникновения мутаций в молекулах ДНК нами разработан метод статвесов. Он позволяет оценивать неслучайность связи замен с различны™ факторами контекста. Если вероятность Р(0<9 )<Q (где в -

OJiy ч •

малое число) , то считаем, что имеет место достоверная связь исследуемых мутаций с рассматриваемыми факторами полинуклеотидного контекста с уровнем значимости Q. Метод статвесов применяется для анализа связи мутаций с повторами в соответствии с моделью репарационной коррекции гетеродуплексов, формирующихся по участкам комплементарных палиндромов и прямых повторов в ДНК (рис.2а) (Ripley, Glickaan, 1983; Колчанов и др., 1985); для анализа связи мутаций с политрактами в соответствии с моделью дислокации матричной цепи (рис.26) (Kunkel, Alexander, 1888); для анализа неслучайности связи мутаций с консенсусами (рис.2в).

Метод статвесов применяется также .для анализа статистической связи особенностей контекста с рекомбинационными событиями. Данный подход разработан, для выявления различных особенностей контекста, находящихся на варьирующем расстоянии от позиции рекомбинации в наборе

С a RGYV

А С ***»

Т-А 5*..GTTTT..3' 5*..GGGTTCAC..3*

a) G-C + в) + j,

Т G -» Т*А б) G AT

G-C АА

Б*..А-Т..З'

Рис. 2. а) Возникновение замены при репарационной коррекции шпелечной структуры в ДНК; б) возникновение замены при дислокации матричной цепи; в) пример совпадения сайта "горячей" точки с консенсусом Rcnrv, где G - позиция мутирования (совпадения отмечены звездочками). ,

последовательностей и неслучайно связанных с возникновением этих событий. Особенности контекста выявляются с помощью пакета программ "КОНТЕКСТ".

Анализ связи олигонухлеотидов с рекомбинационными событиями. Данный подход разработан для выявления олигонуклеотидов, находящихся на варьирующем расстоянии от позиции рекомбинации в наборе последовательностей и неслучайно связанных с возникновением этих событий. Этот подход имеет сходство с описанным выше, только вместо метода статвесов используется критерий Фишера.

База данных мутационных событий содержит описание мутаций и рекомбинаций в молекулах ДНК с известными полинуклеотидными последовательностями.

ГЛАВА 3. АНАЛИЗ ОДИНОЧНЫХ И МНОЖЕСТВЕННЫХ ЗАМЕН.

Для исследования роли контекста в возникновении замен было выбрано 11 нухлеотидных последовательностей, в каждой из которых наблюдалось от 3 до 11 спонтанно возникших мутаций (табл.2). Рассматривались последовательности только из геномов, имеющих двухцепочечную ДНК.

Анализ модели репарационной коррекции гетеродуплексов для спонтанно возникших замен проводился с помощью метода статвесов. Во второй колонке таблицы 2 приведены значения вероятностей Р(9<«сл), характеризующих связь возникших мутаций с повторами, для всех исследованных

последовательностей. Для последовательностей ессо12 и pol наблюдается явная связь спонтанных мутаций с повторами, то есть вероятность Р(в<ы ) получить по случайным причинам

W1

значение статвеса V, большее, чем для реальных мутаций в этом случае весьма мала и составляет 0.01. Это является аргументом в пользу реальности этого механизма в геномах как про-, так и эухариот.

Анализ замен, возникших в результате ошибок ДНК-полимераз

Частоты и специфичность мутаций, которые , произошли при репликации ДНК In vitro различными ДНК-полимеразами в гене lacZa E.coll изучались в работах Кункела (Kunkel, 1986а; Kunkel, 1985b, Kunkel, Alexander, 1939). Нами был проведен анализ неслучайных корреляций нужлеотидов в сайтах "горячих"

Таблица 2. Результаты анализа выборки спонтанных мутаций

Краткое наименование последовательности P(V<y ) СЛ для модели репарационной коррекции для дислокации матричной цепи для встречаемости консенсусов SH или АС

ессо12 0.01 _ 0.10

pol 0.01 0.27 0.84

ecphoft 0.10 - -

саус 0.27 0.43 0.10

clecOS 0.2S 0.01 C.1S

ecunce 0.40 0.Ё7 -

reca 0.45 0.01

ospr 0.63 - -

albern 0.65 - 0.03

resnvx O.SO — 0.42

lexa - 0.23 —

Примечание:

Анализ связи консенсуса S3 с сайтами мутирования прово-ился для эукариотических генов, в случае прокариотических генов использовался консенсус АС, взятый из работы (Shaapor, Dunn, 1987). Черточка обозначает отсутствие мутаций, возникновение которых могло объясняться исследуемым механизмом.

точек мутирования, который показал, что консенсус SH (где S -позиция мутирования) является консенсусом большинства "горячих" точек появления оиибок при репликации эукариотическими ДНК-полимеразами.

Для проверки значимости консенсуса SH, наш проведено исследование неслучайности его сходства с сайтами спонтанных мутаций. Анализ проводился с помощью метода статвесов. Результаты анализа приведены в четвертой колонке таблицы г. Можно видеть, что для последовательностей mlhsrn и ессо12 получены крайне низкие значения Pti<y„„l, что явно

GJ1

свидетельствует о неслучайности сходства консенсусов sm и АС с сайтами мутирования в последовательностях mlhsrn и ессо12, соответственно. Эти результаты свидетельствуют о неслучайной

связи мезду консенсусами "горячих" точек возникновения ошибок ДНК-полимераз и позициями возникновения спонтанных мутаций, что является аргументом в пользу того, что мутации в последовательностях аНизгп и ®ссо12 возникли как оаибки репликации ДНК.

Анализ модели дислокации матричной цепи. Реальность этого механизма подтверждается анализом выбораи спонтанных мутаций (третья колонка табл.2). Анализ модели дислокации матричной цепи показал, что возникновение мутации в соответствии с этой моделью могло произойти в гсно п1ас05 (ген АТФ-азы митохондрий: дрожжей), о чем свидетельствует низков значение Р(8<9 )=0.01 (табл.2). Такое гагахое значение обусловлено тем, что три из четырех мутаций могут возникнуть в соответствии с моделью дислокации матричной цепи. Возможность реализации модели дислокации матричной цепи мокет быть связана со спецификой репарационных систем митоходрий дроэжей и требует дополнительных исследований.

ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ СОМАТИЧЕСКИХ МУТАЦИЙ В У-ГЕНАХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

Для анализа была взята выборка из 14 У-генов, в которых выявлено 164 соматические мутации (таб.8). При исследовании модели репарационной коррекции было показано, что в И из 14 У-генов значение Р(Й<УСД) меньше О.ВБ. Вероятность такого события по случайным причинам в соответствии с критерием биномиального распределения равна 3.7"Ю-5. Столь низкое значение вероятности является весомым аргументом в пользу этого механизма возникновения соматических мутаций. Однако, анализ индивидуальных мутаций показал, что этот механизм не объясняет возникновение всех наблюдаемых в этих генах соматических мутаций.

Анализ контекста, окружающего точки, для которых наблюдалось наибольшее число соматических мутаций в последовательности УМ13, выявил новую закономерность. Подавляющая часть "горячих" точек мутирования имела консенсус 1КГ*¥, при этом, сайт мутирования характеризовался наличием нуклеотида е. Результаты анализа значимости консенсуса ЛОТУ в 14 У-генах приведены в таблице 8 с использованием метода

Л

Таблица 3- Результаты анализа У-генов иммуноглобулинов. .

Краткое наименование р(* * «сл> для репарационной коррекции Р№ < V ) сл для модели дислокации матричной цепи Р« < ¿сл> для встречаемости консенсуса кете

УН1 0.11 —■ 0.23

УМ2 0.13 0.16 0.44

УНЗ 0.07 - 0.83

УК4 0.12 — -

тв 0.07 0.02 0.52

УКВ 0.1В — 0.18

УИ7 О.ЗБ 0.88 0.14

УИ8 0.45 0.78 0.22

УМ8 0.18 0.29 0.16

УМ10 0.01 0.70 0.43

УМ11 0.08 0.65 >0.01

УМ12 0.63 0.12 0.08

УИ13 0.24 0.94 >0.01

УМ14 0.21 0.86 >0.01

Примечание:

■ Черточка обозначает отсутствие мутаций, возникновение которых могло объясняться исследуемым механизмом.

статвесов. Можно видеть, что для 9 из 14 У-генов значение

Р(в<в 1 меньше 0.25. Вероятность такого события, вычисленная сл _

исходя из биномиального распределения, равна 2 • ю . Столь низкое значение вероятности показывает, что консенсус нспш связан с возникновением соматических мутаций в исследованных генах.

Сходные результаты получены нами при анализе ошибок репликации эукариотиче схкх ДНК-полимераз: статистически неслучайные закономерности наблюдались в соседних с сайтом мутирования позициях, консенсус сайта мутирования НИ (позиция мутирования - а). Можно предположить, что консенсус ЛОТИ может способствовать возникновению ошибок ДНК-полимеразы, которая функционирует при репликации или репарации ДНК в районах У-генов.

Анализ модели дислокации матричной цепи проводился с помощью метода статвесов. Результаты анализа приведены в

таблице 3. Моано видеть, что для гена шз характерно крайне

низкое значение РГЗ-с'З „) равное 0.02 (табл.3). Это

ил

свидельствует о неслучайности связи политрактов с мутациями в соответствии с механизмом дислокации матричной цепи в этом гене. Для остальных генов связи мутаций с политрахтами выявлено не было. Это указывает на то, что механизм дислокации матричной цепи не вносит значимого вклада в соматический гипер-лутагенез.

Мояно предположить следупную схему возникновения соматических мутаций в генах кклуноглобулянов. Роль инициирующего фактора в возникновению! соматических мутаций играет нарушение нормальной структуры хроматина в У-районах генов ижуяоглобулинов, происходящее в ходе их пэре стройки (например при объединении V-, о- н 1-сегментов. при генной конверсии, класс-переключении и т.д.). Освобождение ДНК от нуклеоссм приводит к ее ложально?лу плавлению и форшфованию гетеродуплексов и шпилечных структур, которые могут подвергаться репарационной коррекции, с другой стороны, такой район в значительной степени экспонирован для клеточных нуклеаз, которче могут поврездать ДНК У-районов. Дальнейшая репарация с ошибками (бсобенко в ноте сайте) приводит к появлению точяовых замен.

глава 5. анализ реюсушщюшш событии.

в этой главе приведены результаты анализа рекомбинационных событий в геномах эукариот. Анализ районов кроссинговера в РНК-овом геноме полиовируса и кне^генах мши выявил статистически неслучайную связь районов кроссинговера с полипуриновыми трактами, которые локализуются вблизи этих районов. Анализ районов класс-переключения генов иммуноглобулинов и районов транслокаций с-аус гена выявил сходную картину распределения в них консервативных участков, неслучайно связанных с точками, рекомбинаций.

ВЫВОДЫ

1. Разработана система компьютерного анализа мутационных и рекомбинационвых событий. Она включает в себя базу данных мутационных событий и пакет програда их анализа, использующих

статистические критерии неслучайности связи особенностей полизухлеотидного контекста с возникновением мутаций.

2. Анализ выборок стаций, возникших в результате ошбок работы эукариотичеCKia а-, р- и ц-ДНК-полиыераз в ходе репликации, выявил статистически зпачкдш консенсусы "горячих" точек мутирования. Обобщенный консенсус "горячих" точек для всех исслэдовавяихсн ДНК-полклараз ккеет вид EJ, где в - позиция "горячей" точки. Для ряда "горячих" точек этих выборок выявлена неслучайная связь с политраатаки в соответствии с моделью дислокащи матричной цепк.

8. Проведен анализ представительной выборки спонтанно возникших мутаций в последовательностях про- и эукариот. Для ряда мутаций выявлена статистически неслучайная связь с повтораш в соответствии с моделью репарационной коррекщж гетеродуплексов ДНК. Показана статистически неслучайная связь мутаций в гене АТФ-азы митохондрий дроназй с политракта&м в соответствии с моделью дислокации матричной цепи. Для стаций в последовательностях гена гесА Б.coll и D-пзтяд митохондрий человека показана статистически достоверная связь с консенсусами "горячих" точек возникновения мутаций как оаибок ДНК-полжераз, что явно свидетельствует о том, что мутации в эти::, двух последовательностях могли возникнуть в ходе репликации с ошибками,

4. Анализ выборки замен, индуцированных 06-кетилгуа1шн:о?г, и прздмутационных поврегдений, вызванных воздействием ультрафиолетовых лучей, выявил статистически неслучайную связь "горячих" точек возникновения замен и предмутационных повреждений с нуклеотидами, раеполагапдашся вблизи этих "горячих" точек.

6. Для представительной выборки соматических мутаций в v-генах иммуноглобулинов проанализирован ряд молекулярных механизмов, мутагенеза. Для ряда мутаций в v-генах выявлена статистически достоверная связь с повтораш? в соответствии с механизмом репарационной коррекции гетеродуплексов ДНК. Для мутаций в одном v-гене выявлена статистически достоверная связь мутаций с политрактом в соответствии с моделью дислокации матричной цепи. Для многих сайтов возникновения мутаций показано статистически неслучайное сходство с

консенсусом Езта (где о - позиция котирования), что является весошм аргументом в пользу реальности механизма возникновения мутаций в результате сшибок работы некоторых ДНК-полимераз. Эти результаты явно свидетельствуют о том, что в соматический гиперргутагенез вносят вклад различные механизмы возникновения мутаций в Y-генах.

в. Анализ отношния синонимических и несинонимических замен показал, что наблюдаемая кластеризация соматических ■ мутаций в гипэрвариабелышх районах и&муноглобулииов связана с отбором клонов в~лимфоцитов на повышенную изменчивость в гипервариабэльных районах. С другой стороны, показано, что в 4 из 10 исследовашихся У-геиов наблюдается статистически значимая кластеризация в гипервариабельных районах повторов и участков, совпадающих с консенсусом пота. Тахнн образом, неравномерность распределения соматических мутаций по v-генагл могет быть обусловлена кая частично-направленным характером механизмов возникновения соматических мутаций, тая и зслональной селекцией В-лшфоцитов.

7. Анализ районов кроссинговера в РНК-овои геноме полиовируса и iaic-генах мьган выявил статистически неслучайную связь районов кроссинговера с подипуриновими трактами, которые локализуются вблизи этих районов.

8. Анализ районов класс-переключения генов иммуноглобулинов и районов транслокаций о-яус гена выявил сходную картину распределения в них консервативных участков, неслучайно связанных с точками рекомбинаций.

9. Таким образом для большинства исследованных случаев, принадлеяащих к различным классам мутационных событий, показана неслучайная связь с особенностями полинуклеотидного контекста. Это свидетельствует о значительной роли полинуклеотидного яонтехста в возникновении мутационных событий.

Основное содержание диссертации представлено в следу тих работах:

1. Колчанов H.A., Соловьев В.В., Рогозин И.Б. Молекулярный механизм соматического гипермутагенеза в генах иммуноглобулинов. II Доклады Академии наук СССР.- 1966.- Т.

.281, t; 4. - С. 994-999.

2. Соловьев B.B., Рогозин И.Б. Пакет программ контекстного анализа последовательностей ДНК, PHR и белков "КОНТЕКСТ". I. Поиск гдаологий и функциональных сайтов. - Новосибирск, 1986. - 70 с. (Препринт/Ин-т цитологии и генетики СО АН СССР).

8.Рогозин И.Б..Колчанов H.A., Соловьев В.В., Среднева Н.Е. Компьютерная система для исследования роли пэлияуклеотндного контекста в возникновении мутаций // Компьютерный анализ структуры, функции и эволюции генетических макромолекул. Проблемы интеллектуализации : сб.науч.трудов йн-та цитологии и генегкки СО АН СССР - Новосибирск, 1987. - С.90-110.

4. Соловьев В.В., Рогозин Я.Б,, Колчанов H.A. Соматический гнперглутагенез в ккмуноглобулиновых генах. I. Связь со>«атических мутаций с повтора»!. Метод статвесов // Молекулярная биология.- 1889.- Т.23, Вал.8. - С.783-784.

8. Рогозин И.Б., Соловьев В.В. Соматический гиперг^утаге-нез в кг.!уш>глобу липовых генах. II. Свойства соматических мутаций к клональная селекция // Молекулярная биология. -1989. - Т.88, Вап.З. - С.735-802.

6. КоЬсЬакоу H.A. .Balovyov V.V., Hogoala I.B. FecularltSes of iEsaacglebEliß gcss ctmcturop us в fc«sis for sosatlcs outetion eacrgaacc// FEE3 Lett.- 1SG7.- Y.214, Is 1.- P.07-31.

7. Колчаков H.A., Рогозин И.Б.. Соловьев B.B. Теоретический анализ механизмов возникновения спонтанных и индуцированных мутаций в ДНК па основа повторов // Генетика.-1889.- T.XKV, И 8.- С. 1690-1683.

8. Рогозин И.Б., Колчанов H.A., Среднева Н.Е. Теоретический анализ класс-переключения шкуноглобулиновах генов // Тезисы докл. VH Всесоюзного симпозиума по молекулярным механизмам генетических процессов, Москва, март 1990 г. -М., 1990. - С.49-50.

9. Среднева Н.Е., Рогозин И.Б., Колчанов H.A. Метод статвесов для анализа функциональных характеристик нуклзотидаых последовательностей // Тезисы докл. III Всесоюзного совещания по теоретическим исследованиям и банкам данных по молекулярной биологии и генетике, Новосибирск, июль 1988 г. -Новосибирск, 1988. - С.85-86. fT")