автореферат диссертации по информатике, вычислительной технике и управлению, 05.13.09, диссертация на тему:Биологический индикатор мутагенности внешней среды

ТУЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На лра<т рукописи УДК 575.224.2; 575.27/.28

Воронов Виталий Вячеславович

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ИНДИКАТОР МУТАГЕННОСТИ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ

05. 13.09 - "Управление в биологических и медицинских системах (включая применение вычислительной техники)"

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученойстепени кандидата . биологических наук

Тула -1998

Работа выполнена в НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОМ ИНСТИТУТЕ НОВЫХ МЕДИЦИНСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ МЗ РФ

Научные руководители - доктор технических наук, профессор

-ЯшинА. А

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Зелинский Ю. П.

Официальные оппоненты - доктор биологических наук, профессор

Панфилов О. П. .

доктор биологических наук Чемерив Н. К.

Ведущая организация - Тульский Научно-исследовательский институт сельского хозяйства

Защита диссертации состоится 1998 г. в /У часов

на заседании диссертационного совета7 Д (5бЗ. 47. 05 при Тульском государственном университете (300600, г. Тула, лр. Ленина, 92, Тульский государственный университет), у ау^ '

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тул ГУ

Автореферат разослан "/" ЛОЯ^/?^ 1998 г.

Заверенный отзыв в 2-х экз. просим выслать но указанному адресу на имя ученого секретаря диссертационного Совета.

Ученый секретарь диссертационного ¿/Ъя .

Совета, д. м. н., проф. =Ю. Л. Веневцеваг

Общая характеристика работы

1. Актуальность темы -

Несмотря на появившееся в последнее врет ¡ большое количество работ по гнию природной среды мутагенами, достоверный ответ на вопрос об их влиянии на а может быть дан только на основе глубоких исследований. Число известных генных веществ велико и продолжает возрастал, [Stoltz, 1972]. Химические тени в настоящее время представляют собой обширною группу пщхэко тощих по структуре органических и неорганических соединений с видовой и й избирательностью. Часть этих агентов присутствуют в окружающей природе, из них являются продуктами человеческой деятельности.

В процессе жизнедеятельности: человек постоянно подвергается воздействию магнитных полей [Нефедов Б. И., Яшин А. А., 1994] . Таг; например, остается пл вопрос о генетических последствиях применении в медицине диагностических и ¡рапевтическлх приборов на основе лазеров я КВЧ-излучения. Между тем, их i на геном человека практически не изучено. При скрининге же мутагенов <яцей среда необходимо как можно более mimo охватывать все потенциальные ;нщ способные так или иначе оказывать свое влияние на наследственность. Так, гр, вр сих лор не известно о влиянии электромагнитных волн с выраженной ной составляющей яа процессы, происходящие г генетическом материале ов В. IL, 1995]. Таким образец стоит вопрос об исследовании суммарной ной активности всех средовых факторов. Для эффективного исследования ной ашштостя пфечислешшх факторов необходима разработка новых, более сных и чувствительных тест-систем, апробирование лх характеристик как в е решения задач скрининга мутагенности различных сред так и с помощью гвня заведомыми мутагенами (например, противоопухолевым препаратом таном).

Вопрос относительно механизма действия мутагенов на генетический материал гажен. Наиболее актуальной является сегодня проблема рака Общеизвестно, что мутагены проявляют и канцерогенную активность [Сейц И.Ф., Князев П. Г., 1986]. с этим, целесообразно разрабатывать и апробировать краткосрочные тесг-сисгемы чения соматических мутаций. Дня выявления соматических мутаций применяют тшн с использованием лимфоцитов человека, тест-системы, позволяющие ь точковые мутации в отдельных клетках, культивируемых invito и т. д.

Наиболее удобным методом скрининга мутагенов окружающей среды является метод соматической рекомбинации у Drosophila meiartogasler. Преимущества этого метода очевидны: быстрая смена поколений, отсутствие необходимости содержать большое число особей на умеренные средства, возможность экстраполяции экспериментальных данных на человека. Кроме того, данный метод весьма информативен, удобен и дешев, несмотря на то, что он обладает рядом ограничений, связанных с особенностями метаболизма дрозофилы. В настоящее время для скрининга мутагенов окружающей среды применяются линии у (yellow - жёлтое тело, ген находится в I хромосоме) и wsn (white singed - белые глаза, извише ыакрохега, гены находятся в I хромосоме). Основные ограничения при скрининге мутагенов окружающей среды на основе вышеназванной тест-системы-низкая чувствительность D. melanogaster к подициюшчесхим ароматическим углеводородам и ароматическим аминам и необходимость использования большого объёма выборки особей в исследованиях. Преодоление этих ограничений создало бы основу для разработки аналитических батарей, состоящих из гестерных линий, наиболее удобных для скрининга мутагенов окружающей среды.

Особую актуальность имеет решение указанных задач для промышленно развитых регионов. До сегодняшнего дня не проводилось никаких исследований по мутагенной активности питьевой вод ы г. Гулы различного происхождения, не была охарактеризована мутагенность коммунальных и промышленных стоков города. Между тем, биомониторинг водной среды является одной из основных составляющих в комплексе мониторинга окружающей среды [Майстренко В.Н., Хамитов Р.З., Будников Г. К., 1995].

Применение Drosophila melanogaster в тест-системах афинннга мутагенов окружающей среды сделает этот объект ещё более значимым в практике скрининга.

2. Целью настоящей работы явилось: создание тест-системы, оптимизирующей метод скрининга мутагенов окружающей среда на основе линий у и wsn Drosophila melanogaster.

Основные задачи исследования . ... -:

1) Изучение загрзоненностягенохсжсикангами водопроводной, подземных и грунтовых вод, а также сточных бытовых и промышкяных вод Тулы в зависимости от времени года,; вкпмтенив и характеристика спектра мутагенов, характерных для вод Туникой области в зависимости; от источников загрязнения;

2) . Характеристика .мутагенной активности .. широкого спектра

электромагнитных излучений: шгекгрошпштых волн с. выраженной . продольной составляющей, лазерных лучей, КВЧ-юлучениг, ..• ..

3) Определение чувствительности новой тест-системы у : теп vg (с применением в качестве, положительного контроля. супермугагена платинового ряда) .....

3. Научная новизна . " . '.

ервые была изучена сезонная мутагенная активность гольевой воды г. Тупы ..... ных источников, мутагенность сточных бытовых и промышленных вод Тулы, грвые в тест-системе у ад ВтоюрЫ1а пккто^аМег была изучена мутагенная ОСТЬ. ОКСОЛЛаПбШ. ;;

по изучено мутагенное действие злвпроиагтпных волн с выраженной [ьной составляющей, лазерных лучей, КВЧ-излучения. .

гдана тест-система у мгт оптимизирующая метод скрининга мутагенов . нощей среды на основе линий у и 1т £>• яы/ат%^ег.

4. Научно-практическая значимость работы Теоретическая значимость заключается в выявлении мутагенного эффекта у ;ионно считавшихся немутагенными факторов, выяснении механизма действия )к зиаткишых излучений на геном дрозофилы. ^ . ,,

Практическая значимость работа заключается в усовершенствовании методов . _ )ринга и скрининга канцерогенов на дрозофиле, более адекватной оценке . . . . иных свойств химических соединений водных объектов окружающей среды и , ерисшке геногохсичесгого загрязнения вод Тулы и области. .

Результаты рабош могут иметь значение для оптимизации мониторинга нощей среды и могут быть внедрены: в практику в виде методических ндаций и научных публикаций.

5. Внедрена? результатов исследовании . V

Результат исследования используются в работе сотрудников НИИ новых медицинских технологий, на медицинском факультете Тульского государственного университета, ш естественнонаучном факультете ТуАшко государственного педагогического университета, в курсе лекций Пущгекхого государственного университета.

6. Апробация работы

Апробация работы состоялась в НИИ новых медицинских технологий (1998 г.) Основные положения диссертации обсуждались на конференциях лаборатории биодаформигики, П открытой научной конференции молодых ученых г. Пущитао, IV Всероссийской конференции . «Болотовспге чтение», Ученом; совете НИИ канцерогенеза, на конференция* лаборатории методов скрининга канцерогенов НИИ канцерогенеза ОНЦ РАМН, на Ученом совете НИИ новых медицинских технологий МЗ РФ. По теме работы опубликованы две статьи; три тезиса докладов и методическая разработка.

7. Объем работы.

Диссертация изложена на 209 страницах машинописью, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, использованных в работе, 4 разделов собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. В работу включено 23 таблицы, 19 рисунков. Указатель литературы содержит ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов.

Содержание диссертации

1, Материалы и методы исследования

'; В каяестве модельных химических мутагенов использовались хах чистые

.1

вещества, тах и пробы естественных сред, подвергшихся антропогенному влиянию: Из последних, наследовались литьевая водопроводная вода, а также используемые для голья грунтовые и артезианские воды, загрязненные мутагенами; хроме того, тестировались образцы бытовых и промышленных сточных вод. В качестве химически индивидуального вещества тестировался новый противораковый препарат -оксоплатин, предоставленный Ингппугом канцерогенеза ОНЦ РАМН,' в виде растворов с концентрациями 1 г/ли 2 г/а. Дозировка для всех описанных веществ н образцов составляла ОД ил жидкости

стандартную пробирку диаметром 20 мм с питательной средой, что ¿етствует действующим методикам.

В качестве модельных физических мутагенов применялись громагннтные волны с различными характеристиками: электромагнитные ы с выраженной продольной составляющей, КВЧ-галученкг к го лучение й-неокового лазера. Дочнрозка осуществлялась модуляцией частоты ченнян времени экспозиции. Генератор продольных элгкгромзггегтных волн, лбогаяный В. П. Богдановым с хо;и--;гами в НИИ НМТ, дредсгалт^т собой ль Ге^ имлу;гьсно (г. * 4 • 10"6 с) генерирующий з плазменном разряд «а эте 15МГц(РЧ нзомеияокЯ 5л.^^пус,

нзфуюший выход лоисречнол -хадюьенхы ЭМП, л 1<ис.<г зхчч.чушй лличеся-ий р по нот. •о летгиметрор-ог..- лллттенй. и угором

.лкдается стояч ал волна на частот; примерке 625 МГп. Даже лрл с.иС*с«Дяом |де такого поля его нлирялгедаостъ ¡п раостс.-лзс.. С, 4не дол; ¿¿и лр-„-ш> 1 В/м. Облучат:« гелий-неоновым лазером проьодилось на основе рентного источника света комплексом ЛОК-1. Длина волны тлучешш 1вляла 0,6328 мкм, мощность излучения 2 мВт. Пробирки находились ка 'ОЯШМ 0,6 МОТ И'ЛО'ЕйЕСа ИЗЛуЧсННЛ.

Облучение генератором Г4 - !15 производилось тга расстоянии пробирок рпуса генератора 15 см в течешге 30 мин. Мощность галучеши во гсгх льсти ах была постоянной, а частота его модтащшг изменялась в пределах: V, = Тн, у2 = 37,0 ГГц, у3 = 36,5 ГГц, V, = 36,0 ГГц, у3 = 35,5 ГГц, у6 = 35,0 ГГц.

В работе использовались линии Огозор!и1а те\апо%а&ег у, теъп, у/Я/Е^, (любезно предоставленные Институтом канцерогенеза ОНЦ РАМН), ;оставлена Институтом биологии развития, г. Москва). ВгозорШа \ogaster линий уЯ1/112, те5п/Рм/К2 характеризуются резистентностью к цидам и чувствительностью к полиароматическим углеводородам. Линии у, используются в тесте по индукции соматического мозаицизма. Для кческого конструирования была использована линия у», характеризующаяся нем зачаточного крыла.

Мутагенность средовых факторов в соматических тканях определяли по частоте пятен уишвБ! при транс-положении маркерных генов (у++/+¥«11).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием <р -распределения Фишера <р= 2агшп"^р.

2. Результаты и обсуждение 2.1. Оптимизация гест-сисгем с использованием линий ЮшорАМа mdatlogaster у /у^ ^зпД^

Задачей Гг.; серии экспершентов было создание тест-систем для -скрининга мутагенов на. основе уже имеющейся тест-системы у, wsn и сравнения полученных тест-систем с исходной.

При разработке тест-системы с использованием особей нами была использована пиния полученная из лаборатории эмбриогенеза дрозофилы Института биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН (г. Москва). Для получения родительских особен, применяемых в тест-системе, нами была предложена и осуществлена следующая схема скрещивания (рис. 1)

Исхода из приведённой выше схемы, видно, что в ?2 возможен отбор гомозиготных сшоку/у; у^/у^ и ^емизиготных по у, гомозиготных по vg самцов

На нижеприведённой схеме (рис. 2), видно, что в возможен отбор гомозиготных самок уу япЛ? т; \glvg и гемизиготных по м> от, гомозиготных по ^ самцов -и» яг/У; При этом процент вылета самцов и самок, исходя из первой схемы,равен по 6,25%, из второй схемы-по 5%.

Ожидается, что регистрация мозаичных патен как на голове, нотуме, гумерусах и стерноппевре, так л на абдомене, позволит дифференцировать мутагены, требующие метаболической активации, от мутагенов, не требующих таковой. Перше будут действовать преимущественно на клетки абдомена, в ходе онтогенеза поздно (на стадии предкуколки) приступающие к делению, не затрагивая клетки производных имагинальных дисков, приступающие к делению ранее (через 15— 17 ч после выхода лнчкнкя из яйца).* Вторые' будут

Р: Р,:

У У

У +

4-+

уд

X

""уо"

. ¥

уд

уд

У У У

УВ

уд

уд

У У

22

у

I +

■зуд +

Рис 1. Схема получения линии уЛ^ ювагь и на производные имагиналъных дисков, я (если эти соединения п>ны) на производные гнёзд гистобластов абдомена:

Частоты соматического мозаицизыа, рассчитанные на 1 особь, ддя ена значимо выше, чем дл* остальных нссакдованных областей, как в случав шного, так и индуцированного мозаицжша. Следовательно, рассмотрение ена, несущего гораздо больше макрохет, чем прочие структуры, значительно тает разрешающую способность теста. Оно аналогично повышению объёма кк мух. Это позволяет сократить минимальный объём выборки, сократив мым время скрининга.

Факт превышения частот соматического мозаицизма на абдомене цельно с таковыми на внеабдоминальных структурах связан с увеличением гсгва рассматриваемых макрохет (а следовательно, с повышением поста наблюдать пятно), а не с увеличением спонтанной частоты зизыа в этой линии. Таким образом, искажения картины мутагенной гости исследуемых веществ за счет наложения: дополнительной спонтанной ы рекомбинации на индуцированную не происходит. Это видно го яия спонтанных и индуцированных частот соматической рекомбинации на ене и производных нмаганальных дисков - голове, гумерусах, стерноплевре ме(Табл. 1).

Р:

5 П

ел

УВ

X

ч

уд

У9 .

^—X »

у/ ел

УВ

ур

:2

W 8Л V/ 8П

УУ 8Л ЧУ ♦ V»»!

УО УО УЭ

.«г :2

У/ 5Л ■+ 8Л V* 8П ЯП

УЯ*

УО

УУ8Г1 +

«У 8П

ДП V* 5П

УО

уа

уд

УО уд

42_

2и 5П уд . 2 *у уд

■ ЕП

" +

МУ-ь +

УЭ

Рис. 2. Схема получения линии отиЛд

Известно, что у гетерозигот на производных имапшальны

дисков частота мозаичных пятен у превышает частоту пятен т. Эт закономерность сохраняется и для производных имаганальных дисков гетерозигс уИ/Нюи* уцръ как для спонтанного, так и индуцированного мозаицизм (Табл. 1). Частота! же мозаичных пятен у и яп, полученные на абдоминальны макрохега, относятся друг к другу, как 1:1, и в случа Таблица 1. Индуцированные и спонтанные частоты мозаичных пятен и производных имагкнальных дисков и абдомена самок у—

Локаднзацкя в характер пятен Голова, гукерусы, вотум, сгервоолсвра Абломсв Всего вягев Пр< сю Р«« сан

Вариант Опыта У т Ри* У т Й.* 7 п В.*

Оижт—Д Чшящвш и 29 1.012 130 -11* 49 «г 273» 249■1&1 <1 91 3.750 144101 - 405

шмядих (вввютц 14$ 203 55.Ш 1.265. 263 77» 86.560 0.7Г7 4СЗ » 481 1 142.24о| 0.934 «2

.того, и в случае индуцированного мозаицкзии (Табл. 1). Однако указанная ерность не вносит искажений в результаты тестирования, поскольку ■ется сумма пятен у и от.

явление и характеристика мутагенности водопроьодгой, грунтовой, подземной, a также сточной (гамьгунальной и щръетп лгнной) воды Тулы и Тульской. области Для выявления мутагенной активности тульских вод были предпринята вания с использованием различных тестов на соматическую рекомбинацию у logaster, как классических, так и разработанных нами. Йс следования включали сак разовые замеры мутагенности вод, так и ее непрерывный многогодичный ir для учета сезонных и спонтанных: колебаний суммарной мутагенной юти.

Для определения я выявления динамики мутагенной активности питьевсй «одной воды Центрального района г. Тупы вами проводился в 1995 - 1998 гг. торинг с ^пользованием классического теста, на соматическую рекомбинацию ей. В 1998 г. производились разовые замеры мутагенизй активности )водной воды. Результаты этих экспериментов представлены в таблице 2. Из иных следует, что питьевая водопроводная вода Центрального района г. Тулы ввила статистически эначимэй мутагенной акшвностя на протяжении года, »вания в данной тест-сжтеме. Из чего следует, что типичные мутагены либо вук>т в питьевой воде (вследствие своей малой водорастворимости собирвютса jx отложениях, испаряются в атмосферу, разрушаются в водопроводной сета ошческой неустойчивости). Попытка концентрирования содержащееся в воде шьес веществ, проведенна* ¿¿гласно методике (В. Лейте, 1975), в июне - июне , показала отсутствие мутагенного эффекта при концентрировании в 103 раз 2). ' ¡ .

оде непрерывного наблюдения сезонной суммарной мутагенной активности эводной воды были обнаружены статистически значимые сезонные колебания явности соматического мозаициша в опытной и

контрольной сериях. Так, в осенние месяцы (с сентября по ноябрь) интенсивное] соматического мозавдизма как в опытной, так и в контрольной серии превышая таковую, наблюдаемую в другие сезоны, почтив 4 раза.

Вместе с тем, мониторинг мутагенной активности питьевой вод] представляет интерес с точки зрения анализа активности содержащихся в не ПАУ с помощью чувствительных к ним линий Вгозор1п1а те1сто%а&ег. В качеств таковых использовались линии у/Я ¡/Я] и яь^^. Результаты экспериментов и этих линиях прййгэзэгны в таблице 4. Эти данные свидетельствуют способности водопроводной воды индуцировать соматические мутации ; рекомбинации на уровне, статистически значимо отличающемся от спонтанног (в контроле) в системе генов у и от ВгозорЫЫ те\апо%айег при услови применения новых, сенситивных к ПАУ, пиний.

Большинство источников нецентрализованного водоснабжения жителей х Тупы находятся в неудовлетворительном состоянии В связи с этим, а также I данными городской администрации Тулы о повышенном загрязнении почв город тяжёлыми металлами и углеводородами, наш была определена мутагенна. активности грунтовых вед родников Центрального района г. Тулы в тест-систем на основе линий уи ш я Е>гозорЫа текто%а$ег. Результаты этих замероа отражены в таблице 3. Исходя из этих результатов, можно заключить, чп грунтовые воды ке проявляют мутагенной активности в классической тест системе с использованием гетерозигот .у+н-Аиот!. Вместе с тем, нельзя н< отметить различий в мутагенности вод различных родников. Так, вод Платоновского родника проявила в 3,6 раза большую мутагенную активность нежели вода Скуратовского родника.

Анализ подземных вод из артезианской скважины пос. Ясная Поляна проведённый на основе пиний уу.\чт Вгозор/и1а те1апо%а$1ег, также не выяви статистически значимых проявлений мутагенной активности, о чём можно судил исходя из результатов, представленных в таблице 5 . Однако в весенний перио; воды яснополянской скважины более чем вдвое мутагенны, нежели в легши месяцы.

Для более полной характеристики разрабатываемого набора тестов нами произведены испуганна способности бытовых и промышленных стоков вать мутации в различных тест-системах. В частности, при исследовании ых бытовых вод применялись тест-системы у и у Использование

тест-систем позволило не только выявить мутагенную активность ников, но и оптимизировать сами методы скрининга мутагенов. Результаты дования мутагенности сточных промышленных вод - см. таблицу 6.

Нами была исследована мутагенная активность бытовых коммунальных в города в процессе их очистки. Для этого были отобраны пробы воды из иного и вторичного отстойников коммунальных очистных сооружений г. , Результаты, характеризующие мутагенную активность бытовых сточных & классическом тесте соматического ыозалцизма на особях тавлены в таблице 7. Статистическая обработка этих данных показала ствие значимых отличий мутагенной аетивности бытовых стоков от ольных показателей на обеих стадиях очистки. Кроме того, способность 1ых стоков вызывать мутации не претерпевала, значительных изменений в ссе очистки, оставаясь всё время низкой (0,65% соматического мозанцизма юб из первичного отстойника и 0,63% - для вторичного).

Чтобы убедиться в реальности отсутствия мутагенности у бытовых ах вод, нами была испытана нх способность вызывать мутапяк вновой; чувствительной тест-системе - ф/т; vg. Результаты этого , исследования гавлены в таблице 8. В результате была выявлена мутагенность (более чем гфевышакяцая котрольные Л %ази,~ статистически значимая на" 1% :)>-бытовых сточных вод Тулы, не распознаваемая классической тест-

В отношении промышленных стоков с помощью стандартного теста з> выявить отдельный всплеск мутагенности (2£2% «идагаческого (измалрохив 0,60% в контроле - значимо на 1% уровне) в стоках-Тульского Яного завода В целом же уровень

Табшша 2. Тестирование питьевой водопроводной воды Центрального р-на г. Тулы на индуцирование соматичеосих мутаций в тест-яистеме у шл у : гетерозиготных самок у + +/+■ у> т ОгозорШа те\апо%1х&ег

Вариант опыта: Самок рпягеи,% Критерий Фишера

У яг у,т Е

I П | ш 1 IV V VI VII

Вода,12.09-95 515 | 1,36 1 1,55 0,00 2£1 1,70 < 1,96

Контроль, 12.09.95 504 | 0,40 0,99 0,00 139

Вода, 20.09.95 556 0,18 1,80 0,18 2,16 0,04 < 1,96

Контроль, 20.09.95 500 1,40 0,80 0,00 2^0

Вода, 4.10.95 510 0,98 137 0,00 235 0,07 < 1,96

Контроль, 4.10.95 496 0,81 1,41 0,20 2,42

Вода, 6.11.95 520 1,15 2^0 0,00 3,65 0,97 < 1,96

Контроль, 6.11.95 499 1 1,40 1,20 0,00 2,60

Вода, 19.12.95 501 | 1,00 \ 0,60 0,00 1,60 0,03 < 1,96

Контроль, 19.12.95 502 | 0,40 1,19 0,00 1,59

Вода, 18.01.96 500 0,20 0,60 0,00 0,80 0,0 <1,96

Контроль, 18.01.96 500 \ 0,40 0,40 0,00 0,80

Вода, 27.02.96 510 ! 1,18 039 0,00 1,57 0,03 < 1,96

Контроль, 27.02.96 502 1 0,60 0,99 0,00 1,59

Г н, ; Ш IV - V VI г уп - г

Вода, 1б.035б,_ 500 0,20 ОДО 0,00 0,40 0,81 <1,96

Контроль, 16.03.96 510 0,59 0,20 0,00 0,79

Вода, 6.04.96 504 0,19 1,00 0,00 1,19 1,96

Контроль, 6.04.96 500 0,60 1,00 0,00 1,60

Вода, 17.05.96 506 0,20 0,20 0,00 0,40 1,60 < 1,96

Контроль, 17.05.96 492 0,41 0,81 0,00 1,22

Вода, 8.07.96 506 0,00 0,40 0,00 0,40 1,26 <1,96

Контроль, 8.07.96 469 0,43 0,64 0,00 1,07

Вода, 12.10.96 490 0,40 0,21 0,21 0,82 0,28 < 1,96

Контроль, 12.10.96 504 0,20 0,79 0,00 0,99

Вода, 15.11.96 480 0,00 0,63 0,00 0,63 ' 0,33 <1,96

Контроль, 15.11.96 497 0,20 0,60 0,00 0,80

Вода, тсримеси концентрированы в 1000 раз, У/98 819 0,37 0,1з 0,00 ио 1,04 < 1,96

Контроль, У/98 500 0,80 0,80 0,20 1,80

Обозначения в таблице итерий Фишера - критерий достоверности, для 5% уровня значимости шинное значение критерий Фишера равно 1,96; для 1% уровня значимости шнчтое значение критерия Фишера равно 2,58.

В контроле к питательной среде вещества не добавлялись

Таблица 3. Авалю мутагенной активности грунтовых вод Центрального р-на г. Тулы в тесте на индукцию соматических мутаций и рекомбинаций у гетерозиготных самок у++/Нгеп В. те1апо%аяег ~

Самок" (ап-)^ р пятен, %

Вариант опыта: У т У, т 2 Критерий Фишера

Скуратовский родник 333 озо 0,00 0,00 0,30 1,00 <1,96

Платоновский родник 376 • 0,80 0,27 0,00 1,07 038 <1,96

Контроль' 489 ' 0,82 0,00. 0,00 0,82 ■ —

Таблица 4.. Тестирование питьевой водопроводной воды Центрального р-на г. Тулы на индуцированнеломатических мутаций в тест-системе у жет Л/ Лг у гетерозиготных самок у + +/+ м/ ¡п/Я/Я^ 1>гозорЫ1а те1апо%а&ег

Вариант опыта: Самок (шт.). р пятен, % Критерий Фишера

у 5П у,™ 2

Вода, весна 1996 503 0,80 1,19 0,00 ¿99 3,081 >2,58

Контроль, весна 1996 506 0,20 0,00 0,00 0,20

Таблица 5. Анализ мутагенной активности питьевой воды артезианский

скважины (Ясная Поляна) в тесте на индукцию соматических мутаций н

Вариант опыта: Самок (шт.) . р пятен; % - Критерии Фишера

У ли У.5П Е

Ясная Поляна, Ш-14196 507 7 0,78 сао ОДО 1,18 0,06 <1,96

Ясйая Поляна, IV-У/96 446 0,22 0,45 0,00. 0,67 0,88 < 1,96 ,

Контроль 491 0,41 -0,81 0,00 1,22 -г."

Таблица б. Мутагенная активность промышленных стоков некоторых яприятийг. Тулы в тесте на индукцию соматических мутаций и рекомбинаций у гетерозиготных самок Х>. melanogaster

Самок (шт.) р пятен, % Критерий Фишера

Вариант опыта: У 5» Б

ТОЗ, май-июнь 1997 513 0,58 1,75 О,'.-- -Ч52 2,61 >2,58

ТОЗ, июль 1997 503 0,20 0,99 0,00 1,19 1,01 < 1,96

НПО «Базальт», ноябрь 1997 306 0,65 озз 0,00 0,98 0,60 < 1,96

Контроль 504 0,20 0,40 0,00 0,60 —

СОЗ, май-июнь 1998, концентрированы в 100 раз 657 0,46 0,46 0,15 1,07 0Д2 < 1,96

Контроль 500 0,20 0,80 0,00 1,00 —

Таблица 7. Мутагенная активность бытовых стоюв г. Тулы (отстойники коммунальных очистных сооружений) в тесте на индукцию соматических мутаций и рекомбинаций у гетерозиготных самок ЦгояорЬЬ те!апо§сшег

Вариант опыта: Санок (шт.) р пятен, % Критерий Фишера

У у, м

1-ичн. отстойник 459 0,44 од 0,00 0,65 0,60 < 1,96

П-ичн. отстойник 478 0,21 0,42 0,00 0,63 0,65 < 1,96

Контроль 501 0,60 0,40 0,00 1,00 —

соматического ыозаицизма приближался к значению 1% - 1,19% для ТОЗа и 0,98% для НПО «Базальт», что статистически неотличимо от контроля. Как видно из результатов этого анализа, основными загрязнителями в промышленных стоках являются различные тяжёлые металлы, спонтанными сбросами которых и объясняется, вероятно, всплеск мутагенной активности Спонтанный характер появления пиков загрязнения тяжёлыми металлами подтверждается и данными тульской администрации о загрязнении рек. В пользу спонтанного характера этих, пиков и против предположения о недостаточной чувствительности теста говорят и наши данные по промышленным стокам, примеси в которых были сконцентрированы в 100 раз. Статистически значимой мутагенной активности в этих образцах не обнаружено.

й

.. ... 23. Выявление и ^араиперисгика мутагенного действия.......-

электромагнитных излучений

Для ииштагомшсх^носта комплекта тестов выявлять

^ .4 . ...... , -

мутагенный эффект электромагнитных излучений нами были использованы электромагнитные волны с выраженной продольной составляющей, излучение неонового лазера и КВЧ-излучение, находящие применение в технике я медицине.

Нами был изучены коротковолновые излучения в диапазоне частот 35,0 -37,5 ГГц (шесть точек с интервалами по 0,5 ГГц), облучение проводилось генератором Г4 - 115 на расстоянии пробирок от корпуса генератора 15 см в течение 30 мин. Мощность излучения во всех шести опытах была постоянной. Результаты этих 'опытов ^представлены в таблице 9. Во всех рассмотренных случаях частоты соматического мутагенеза статистически значимо не превышали контрольные. Вместе с тем, частоты индуцированной КВЧ соматической рекомбинации варьировали в достаточно широких пределах - от 0,67% до 1,56%, в раде случаев отмечены частоты мозавдизма, вдвое меньшие контрольных (при 35,5 ГГ£0.' Однако" говорить" о «аншмутагшезе» здесь нельзя, поскольку статистической значимостью эти отлитая не . обладали (Табл. 9).

Другой вид электромагнитных волн;'тестированный нами на способность [уцировать соматический мутагенез - электромагнитные волны с выраженной »дольной составляющей, представляющие собой распространяющиеся зоны ииеского, вакуума. Это сравнительно недавно открытые волны, а потому [>екг их воздействия на геном и мутагенная опасность малоизучены. В связи с м нами было предпринято исследование мутагенных свойств двух видов дольного .поляризационного излучения - Е-вода и К-црт* ^ генерируемых шем Герца, *

Согласно полученным данным (Табл. 10), заметные результаты были аружены при варианте облучения Е-10. Процент мозаичных пятен превышал троль в 24> раза. После математической обработки полученных результатов 5л. 10) мы црлшш к выводу, что достоверная оценка соматического аицизмэ. н варианте Е-10 безусловно показывает мутагенный эффект, по в ысокой дозе (критерий Фишера = 2Д0 > 1,96). По данным таблицы, можно гать, что вариант К-10 не индуцирует мутаций в тест-системе у wsn (0,512 < " • ' v

Все виды облучения способствовали проявлению различных типов ■фозов. При этом проверенные варианты облучения не обладали каким-либо фательным действием. А само число морфоэов незначительно превышало овые показатепи- Тест на выживание среди личинок показал гибель около 1/4 5ей после воздействия в варианте Е-10. Проводившиеся за ходом онтогенеза ведения от личинки (1 стадия) до вылета имаго выявили что существенных фжек после облучения не произошло. Время прохождения всех стадий лежит в зелах нормы и не отличается от контроля.

При изучении изменения частот соматической рекомбинации под явием индуцированного воздействия' низкоэкергетическпм лазерным учением (2 мВт, к = 0,6328 мкм) наблюдался мутагенный эффект у личинок зой и третьей (но не второй!) стадий развития при малой продолжительности /чения (до 180 с включительно). При продолжительности облучения 300 с шмого мутагенного эффекта

зарегистрировано не было. Результаты данного теста - см. таблицу 11. ,

^.Чувствительность тест-системы у vgк охсогглягину • • При изучения мутагенного эффекта оксоппатина в тест-системе у тгеп удалось выявить его статистическую значимость' Лекарство, несомненно, обладало мутагенным действием, индуцируя соматическую рекомбинацию с частсг.;~3й?345% (1 г/л) и 88^2% (2 г/л). Данная величина сшгзггвкеки достоверно (р < 0,01) превосходит показатели мутагенной активности веществ, взятых в качестве контроля.

Применяя линия у к ягал к исследованию мутагенности раствора оксоплагина концентрацией 2 г/л, был обнаружен следующий эффект: частота возникновения мозаичных пятен на внеабдоминапьных структурах (голове, нотуме, гумерусах, стерноппевре) превышала контрольную в 55,02 раза, та абдоминальным структурам - в 31,60 раза. В сумме частота возникновения пятен на особи превышала контроль в 37,93 раза.

Вместе с тем, для раствора оксоплагина (2 г/л) частота мозаицкзма в расчёте на 1 макрохету составила 2,01% в тест-системе у топ (выборка 566 особей) и 0,92% в тест-системе у тшг (выборка 625 особей), не имея при этом статистически значимых различий (критерий Фишера = 1,59 < 1,96). Таким образом, частоты индуцированного мозанцязма в указанных тест-системах статистически неразличимы, и искажения картины мутагенной активности исследуемых веществ за счет наложения спонтанной частоты рекомбинации на индуцированную не происходит. Частоты же, полученные в тест-системе у угап отличаются большей точностью, поскольку просмотрено большее число макрохет. Результаты проведённого исследования представлены в таблицах 1 и 12.

ца9. Тестирований генератор КВЧ-вблн на индуцирование соматических: " мутаций в гесг-системеу тезп у гетерозиготных самок Г)го5срЫ1ате1апоёа!Лег

инг опыта: Самок, шт. рпяген,%

частота гченш^ГГц У 5и У, £ Критерий Фишера

37,5 520 0,77 0,58 0,19 .1,54 0,220 < 1,96

онгроль I 509 0,79 0,39 0,20

[I. 37,0 510 0,78 0,78 0,00 1,56 0,637 < 1,96

онгроль II 510 0,59 0,59 0,00 1,18

Ш. 36,5 497 0,00 0,40 0,40 0,80 1,549 <1,96

энтроль III 500 0,60 0,00 0,00 0,60

IV. 36,0 504 0,40 0,79 0,00 1,19 0,556 <1,96

онгроль IV 500 0,60 1,00 0,00 1,60

V. 35,5 446 0,22 0,45 0,00 0,67 \ 0,876 < 1,96

.'онгроль V 491 0,41 0,81 0,00 1,22

VI. 35,0 494 0,00 1,21 0,00 1,21 1,037 <1,96

онгрольVI 500 0,20 0,40 0,00 0,6

1блица 10 Тестирование генератора электромагнитных волн с выраженной продольной составляющей на индуцирование яатических мутаций в тест-системе у \vsft у гетерозиготных самок у-н-/+\узп ВгозоркИа те1атю2аз1ег

Вариант опыта; Само»; шт. рпяген,% Критерий Фишера

У ЯП у, от г

Е-10 517 0,56 2,51 - 0,19 3,28 2,20 > 1,96

К-10 474 0,58 1,27 0,00 1,69 0,51 < 1,96

Контроль 539 0,42 0,74 0,00 1,30

• I? ч

Таблица 11. Тестирование лазерного излучения на индуцирование соматических мутаций в тест-систем е у \vsri у гетерозиготных самок у++/-ну8п , находящихся в различных личиночных возрастах

Вариант опыта Самок просмотре ' Частоты пятен, р (Го) Критерий Фишера

но, пгг. У sn У, sn S

Контроль 620 0,81 ^ 0,96 0,00 1,77 -

j Лазер 4 с, личинка I I стадии 540 : 1,66 2,41 0,19 4,26 2,53>1,96

! Лазер 4 с, личшгкк | П стадии 51В 0,39 0.20<1,96

' Лазер 4 с, лячкнкч ЕПстадкн 497 0,40 1 --1 0,1'0 л "i t 0.5 !<'.,:? 6

Лазер'50 с. личинки I стазия 4SI 1,25 3,74 0.2 i 5,20 _____ 3.18>1,96 ;

\ Лазер 50 с. лачвниа П стадия 500 1,40 1,00 0,00 2,40

Лазер 30 с, личвчки Ш СТЗДЕИ 0,93 2,61 0,1 я 3,72

: Лаадр ISO с, лачках:: I стадии 507 1 1,18 1,18 0,2û 2,56 0,90<i,9ô

Лакр ИОс.лачинхн Q я алии 521 ; 0,58 1,53 0,00 2,11 0,42 <1,96

Лазер 140с,лач1шгн Щ ПйДИН 509 : 1,96 1,96 0,21 4,13 2,3 7>1,96

Лазер 300 с, лячвнхк I стадии 486 1,03 2,06 0,20 3,29 1,б2<1,95

Лазер 300 с, лэтихки П стадии 507 ! 0,39 1,98 0,00 2,37 0,70<1,9б

Лазер 300 с, липши Ш стадии 510 ; 0,59 0,98 0,00 1,57 0,10< 1,96

Таблица 12. Мугагеншг свойства оксоплатинав тесте на индукцию соматических мутаций и рекомбинаций у гетерозиготных самок y++/+wsn D. melanogaster

Вариант опыта: Самок (шт.) р пятен, % Критерий Фишера

У sn S

Оксоплатин, 1 г/л 533 8,44 15,01 23,45 13,03 > 2,58

Оксоплатин, 2 г/л 566 40,99 47,53 88,52 36,68 > 2,58

Контроль 501 0,60 0,40 1,00 » _

Выводы и рекомендапин

1. Воды, используемые для питья, - питьевая водопроводная, подземная и

вая в классическом тесте на мутагенность не проявили активности как в к пробах, так и при непрерывном скрининге. При помощи чувствительных кароматичесхим углеводородам линий удалось показать возможность сения питьевой водопроводной водой неперманенгного мутагенного га. Полученные данные по соматической рекомбинации в сопоставлении с татами химического анализа вод Тульской области позволяют »пожить, что основными мутагенными загрязнителями бытовьЬс и тленных стоков являются неорганические ионы, главным образом, ы и тяжёлые металлы. В качестве же возможного мутагенного загрязнителя ыхвод можно предположить полиаромагнческие углеводороды. Выявлены ые колебания спонтанной мутагенной активности. С помощью геских и вновь разработанных тестов на соматический мутагенез у Ма тйсто&а&ег выявлен факт наличия мутагенной активности бытовых и фомышленных стоков г. Тулы, постоянная на низком уровне для бытовых вая спонтанная для промышленных.

2. В ходе исследований охарактеризовано мутагенное действие ряда змагнишых излучений различных частот на ЪгохорЫЫ те1апо%а&ег. на возможность индукции соматического мозаяцизма электромагнитными и с выраженной продольной составляющей, а также лучом нергетичесшго гелий-неонового лазера. Установлена закономерность иного эффекта гелий-неонового лазера ¡а зависимости от стадии развития и (отсутствие эффекта на II стадии) н низкая мутагенная эффективность ьных экспозиций лазерному излучению. Продемонстрировано отсутствие иного эффекта для КВЧ-излучения в д иапазоне 35,0 - 37,5 ГГц.

3. Разработаны и апробированы новые, более скоростные и етельные теста на мутагенную активность с использованием выведенных иннй у, я те яг; В новой тест-системе у теяг частоты мозаичных фи ищукции супермутагенами платинового ряда в 1,61 раза выше, чем в стеме у чгап.

при том же объёме выборки. Использование тест-системы у т^аг уд позволяет сократить количество просматриваемых особей в 3,5 раза.

4. На основе полученных выводов рекомендуется внедрить в практику экологического скрининга тест-систем определения мутагенной активности средовых факторов с помощью индукции соматического мозаицизма у Бгозср1аЬ те1опо%{Шег у V?, т/т у, ткгеп.

Список рабог. опубликованных до тем« диссертагош

1. Богданов В. П., Воронов В. В., Сидоров Р. А., Яшин Л. А. Исследование методом соматической рекомбинации дрозофил, подвергшихся действию продольных волн//Веспмкдав1Ьсмедицгакжтествга>ло^^ №3-4.-С. 6-9.

2. Воронов В/В., Вблкова Е. М., Аверьянов В. В. Использование методов биоиндикалия объектов окружающей среды в тучно-исследовательской работе . Тез', докл. П Международной конференции по экологическому образованию "Между школой и университетом", Тула: 1996. -С. 116-117.

3. Воронов В. В., Сидоров Р. А. Экологические аспекты генетических исследований // Тез. докл. П Открытой городской конференции молодых учёных, Пущино: 1997.-С. 163-164.......

4. Афромеев В. П., Богданов В. П., Воротов В. В., Хадарцев А. А., Яшин А. А. Исследование мутаций у ВголорЬИа тквюдикг .при воздействии неиснширующих -квантов энергии радиочастотного диапазона И Электродинамика и техника СВЧ и КВЧ. -1997. -т. 5, - № 4. —С. 26 - 30. ■

5. Воронов В. В., Сидоров .Р. А. Мониторинг мутагенной активности вод Тульской области// Тез. докл. IV Всероссийской конференции «Болотовские чтения», ТУла: 1997,-С. 25 - 26.

6. Воронов В. В.*" Методические рекомендации для лаборагорно-полевого практикума по генетике. - Тула: Изд-во ТГПУ им. Л. Н. Толстого, 1998.

Подписано в печать Формат бумаги 60x84/16 . < Офсетная печать. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 80 экз.

Заказ Отпечатано с оригинал-макета в ТППО



Тульский государственный университет

На правах рукописи УДК 575.224.2;575.27/.28

Воронов Виталий Вячеславович

Биологический индикатор мутагенности внешней среды

Специальность 05.13.09 - «Управление в биологических и медицинских системах (включая применение вычислительной техники)»

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

доктор технических наук, профессор Яшин АЛ. кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Зелинский Ю.П.

Тула - 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

i ввЕДьи;;^.........................................................................4

% МУТАГЕНЫ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ.................................12

2. 1 Химические мутагены окружающей среды...............................Л2

2.1.1. Подихлорированиые даоксины, дабетофуракы и бифенилы..............13

2.1.2. Полицш'лйческие ароматические углеводороды

и их проговодиые.......................................................................25

?..1.3. Хлорорганические пестициды.................... ..................................29

?.. Í.4. Нигрозамивы........................... ..............................................31

2.1.5. Тяжёлые металле".......................................................................33

2.1.6, ЗЦугагенные лекарственные средства

(на примере препаратов шатаны)................................................. .36

2.2. Физические мутагены окружающей среды............................38

2.3. Принципы экологического мониторинга мутагенного загрязнения окружающей среды.............................................................71

2.4. Экологическая обстановка в Тульском регионе........................,М4

3 ТЕСТ-СИСТЕМЫ СКРИНИНГА МУТАГЕНОВ..........................104

3.1. Тест-системы скрининга мутагенов у микроорганизмов...........104

3.1.1. Реверсии от ауксотрофноста кпрототрофноети.......... ..................104

1.1.2. Мутации к резистентности.......................................................106

3.1.3. Скрининг-тесты на обратные мутации у бактериофагов..................10b

3.1.4. Тесты шкршые мутации........................................................107

3.1.5. Скрннжг-методы, использующие тршефоршф^щий фактор.........108

3.1.6. Грибььаскомицеты тс^с гест-системы душ выявление

и учёта рецессивных мутаций.................... ...................................109

3.2. Тест-системы скрининга мутагенов в культурах клеток мдгжшштающих.................................................................113

3.3. Тест-системы для определения мутаций in vivo

в половых клетках.......................................................................................117

3.3.1. Mus másenlas......................... ............................................117

3.3.2. Drosophiia melanogaster,........................................................ i ¿У

3.4. Выявление и учёт рецессивных.мутаций у растений............. 126

3.5. Методы учета аберраций хромосом..........................................127

3 5.1. Методы учёта двлвщт к ¿^ж-йсщйй. .......................................1.^8

ЗЛ2. Метода учёта шшерсий..................... ...................................131

3.5.3. Методы учёта транс локаций................... .................................132

3.5.4. Методы учёта мутаций с использованием мобильных гшежчесжж элементов............................................................ 134

4 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.............................................137

5 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ......................................147

5.1 Выявление и характеристика мутагенности водопроводной, грунтовой, подземном, а также сточной (бытовой н промышленной) воды Тулы и Тульской области..,ЛЛ1

5.2 Выявление и характеристика мутагенного действия

6.3 Оптимизация тест-систем с использованием линий Drosophiia melanogaster y/vg. wsn/vg. Чувствительность

тест-системы v who к окшшштитгу.,.....................................1би

i „ дг i * * r* » ...............172

7 7 ) i« / ' - .............................................................166

Щ r" : ° i .' » t _ ................................................................igg

9 i ¥. i^iA.............................................................................201

1 ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Несмотря на появившееся в последнее время большое количество работ по загрязнению природной среды мутагенами, достоверный ответ на вопрос об их влиянии на человека может быть дан только на основе глубоких исследований. Число известных канцерогенных веществ велико и продолжает возрастать [143]. Химические канцерогены в настоящее время представляют собой обширную группу широко варьирующихся по структуре органических и неорганических соединений с видовой и тканевой избирательностью. Часть этих агентов присутствует в окружающей природе, многие из них являются продуктами человеческой деятельности.

Поскольку люди в повседневной жизни подвергаются воздействию множества факторов окружающей среды, изучение индуцированных мутаций привлекает всё большее внимание широкой общественности. Относительно мало известно о возникновении индуцированных мутаций под влиянием химических веществ и неионизирующих излучений, имеющихся в окружающей среде. Проблема оценки степени риска для человеческой популяции, обусловленного мутагенными факторами, включает следующие вопросы: 1) каким образом данный фактор действует на генетический материал; 2) насколько широко подвергается человеческая популяция воздействию этого фактора; 3) каково вероятное увеличение частоты мутаций по сравнению с частотой спонтанных мутаций; 4) каковы долговременные последствия увеличения частоты мутаций для популяции; 5) какова та степень увеличения числа мутационных повреждений, которые мы готовы терпеть в обмен на диагностическое и терапевтическое применение рентгеновских лучей, СВЧ-, КВЧ- приборов, некоторых лекарственных средств и другие блага цивилизации.

То, что химические вещества способны вызывать мутации, было установлено ещё в 20-х годах нашего века [123]. В 1942 году Ауэрбах и Робсон [63] получили неопровержимые положительные результаты, индуцировав с

помощью азотистого иприта мутации у дрозофилы. Независимо от них Олкерс (1943) получил положительные результаты, Oenothera - при применении уретана - широко использовавшегося медикамента, который считался хорошим снотворным для детей и у которого впоследствии были обнаружены канцерогенные свойства. Рапопорт описал мутагенное действие карбонильных соединений. Люэрс и Бартельмесс (1955) впервые рассмотрели вопросы, посвященные практическим перспективам химического мутагенеза, касающимся генетического здоровья человечества. В 1961 году Конан и Вальски описывают хромосомные аберрации в лимфоцитах людей, подвергшихся воздействию азотистого иприта. Рёрборн в 1965 году обобщает данные по химическому мутагенезу и ставит ряд наиболее важных вопросов, позволяющих осознать возможную угрозу для популяции человека. Вскоре после этого было основано общество по изучению мутагенов окружающей среды [104, 145]. По данной теме регулярно проводятся конференции, на которых определяется круг вопросов, требующих незамедлительного решения [91]. Тестирование мутагенных эффектов проводится на самых разнообразных организмах. Генетическое значение большинства из этих эффектов (геномных мутаций, хромосомных разрывов и аберраций, точковых мутаций) очевидно. Значение других («липкости» хромосом или хромосомных «пробелов») оценить трудно. Некоторые вещества нарушают функции системы микротрубочек, необходимой для образования веретена во время митоза, в общем генетические эффекты химических веществ более разнообразны, чем генетические эффекты как ионизирующих, так и неионизирующих излучений. Самыми сильными из обнаруженных до сего дня мутагенов считаются алкилирующие агенты, к которым относятся азотистый иприт, этиленаминовые соединения и эфиры метилсульфоновых кислот. Многие из этих веществ используются при лечении злокачественных опухолей или в ситуациях, когда необходимо подавить иммунную реакцию или процесс пролиферации клеток. Другая группа мутагенов, применяемая в терапевтических целях, включает антиметаболиты нуклеиновых кислот и акридиновые соединения. Одно из самых

распространенных соединений, воздействующих на человека и проявивших мутагенность на микроорганизмах, является кофеин. Широко применяемые в качестве положительного контроля в тестах на мутагенность нитриты используются в качестве консервантов мяса. Изониазид (используется для лечения туберкулёза) демонстрирует мутагенную активность на бактериях с использованием теста в хозяине-посреднике. При исследовании полинуклеотидов in vitro этот препарат ингибировал транскрипцию [110], а в клетках китайского хомячка, культивируемых in vitro, снижал пострепликативную репарацию.

В отношении соматических мутаций спонтанный уровень мутирования в клетках сомы невысок, но частота мутаций в них может резко возрасти под влиянием веществ с мутагенными свойствами. Несмотря на то, что существование соматической мутации ограничено длительностью жизни особи, её последствия могут быть чрезвычайно серьёзны. Например, соматическая мутация в клетках стенок сосудов является причиной возникновения атеросклеротических бляшек [81]. Размножение мутантных клеток лежит в основе красной волчанки и даже приводит к развитию болезни Дюпюитрена [82]. Соматические мутации вызывают генетические изменения, порождающие рак. Такая взаимосвязь между канцерогенезом и мутагенезом ясно прослеживается для трёх классов агентов: химических канцерогенов; различного рода излучений; вирусов.

Загрязнение окружающей среды биологически активными соединениями может повышать онкологическую заболеваемость и непрямым путём. Присутствие в окружающей среде мутагенов приводит к высокому уровню мутирования и соответствующему отбору в популяциях микробов и вирусов. В результате возникают активные штаммы, эффективно вырабатывающие канцерогенные продукты.

Многие соединения, попадая в окружающую среду, превращаются в более токсичные, чем исходные (например, при хлорировании воды в процессе водоподготовки, в ходе отбеливания бумажной массы хлором). При этом таких

соединений для воды описано примерно 1400. Многие авторы [12] указывают на опасность действия ряда химических веществ на население через питьевую воду и необходимость мер по охране водоёмов. Комитет экспертов США ещё в 50-х годах в докладе конгрессу отмечал, что токсические вещества в больших концентрациях сбрасываются в водоёмы и сильно их загрязняют. Всемирная организация здравоохранения [34] указывает на необходимость изучения не только токсического, но и канцерогенного, тератогенного и мутагенного действия химических веществ на организм через питьевую воду. Канцерогенное действие на теплокровных животных в экспериментальных условиях при поступлении в организм с питьевой водой оказывают мышьяк, селен, цинк, радий, палладий и иттрий, а при поступлении в организм другими путями - хром, бериллий, свинец, ртуть, кобальт, никель, серебро, церий, тантал, диспрозий, гадолиний, уран, платина, празеодим. Одним из таких путей может быть кумуляция этих соединений тканями рыб, что создаёт угрозу заболевания раком людей через рыбные продукты, потребляемые в пищу. Так, например, в опытах с радужной форелью описано мутагенное действие сульфида цинка [116]. Эти данные приводят к мысли о необходимости создания биологических индикаторов мутагенности водной среды.

В процессе жизнедеятельности человек постоянно подвергается воздействию электромагнитных полей. Так, например, остаётся открытым вопрос о применении в медицине диагностических и физиотерапевтических приборов на основе лазеров и КВЧ-излучения. Между тем их влияние на геном человека практически не изучено. При скрининге же мутагенов окружающей среды необходимо как можно более полно охватывать все потенциальные компоненты, способные так или иначе оказывать свое влияние на наследственность. Так, например, до сих пор не известно о влиянии электромагнитных волн с выраженной продольной составляющей на процессы, происходящие в генетическом материале [6]. Таким образом, стоит вопрос об исследовании суммарной мутагенной активности всех средовых факторов.

Вопрос относительно механизма действия мутагенов на генетический материал очень сложен. Наиболее актуальной является сегодня проблема рака. Общеизвестно, что многие мутагены проявляют и канцерогенную активность [54]. В связи с этим целесообразно разрабатывать и апробировать краткосрочные тест-системы для изучения соматических мутаций. Для эффективного исследования мутагенной активности перечисленных факторов необходима разработка новых, более экспрессных и чувствительных тест-систем, апробирование их характеристик как в процессе решения задач скрининга мутагенности различных сред, так и с помощью воздействия веществами (например, противоопухолевым препаратом оксоплатином), заведомо мутагенными в других тест-системах.

Для выявления соматических мутаций применяют тест-системы с использованием лимфоцитов человека, тест-системы, позволяющие выявлять точковые мутации в отдельных клетках, культивируемых in vitro и т. д.

Наиболее удобным методом скрининга мутагенов окружающей среды является метод соматической рекомбинации у Drosophila melanogaster. Преимущества этого метода очевидны: быстрая смена поколений, возможность содержать большое число особей на умеренные средства, возможность экстраполяции экспериментальных данных на человека. Кроме того, данный метод весьма информативен, удобен и дешев, несмотря на то, что метод обладает рядом ограничений, связанных с особенностями метаболизма дрозофилы. В настоящее время для скрининга мутагенов окружающей среды применяются линии у (yellow - жёлтое тело, ген находится в I хромосоме) и wsn (white singed - белые глаза, извитые макрохеты, гены находятся в I хромосоме). Основные ограничения при скрининге мутагенов окружающей среды на основе вышеназванной тест-системы - низкая чувствительность D. melanogaster к полициклическим ароматическим углеводородам и ароматическим аминам и необходимость использования большого объёма выборки особей в исследованиях. Преодоление этих ограничений создало бы

основу для разработки аналитических батарей, состоящих из тестерных линий, наиболее удобных для скрининга мутагенов окружающей среды.

Особую актуальность имеет решение указанных задач для промышленно развитых регионов. До сегодняшнего дня не проводилось никаких исследований по мутагенной активности питьевой воды г. Тулы различного происхождения, не была охарактеризована мутагенность коммунальных и промышленных стоков города. Между тем, биомониторинг водной среды является одной из основных составляющих в комплексе мониторинга окружающей среды [33].

Применение Drosoph.Ua melanogaster в тест-системах скрининга мутагенов окружающей среды сделает этот объект ещё более значимым в практике скрининга.

Цель и задачи диссертации

Целью диссертации является создание тест-системы, оптимизирующей метод скрининга мутагенов окружающей среды на основе линий у и мбп Бг080рЫ1а melanogaster.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

- изучение загрязненности генотоксикантами водопроводной, подземных и грунтовых вод, а также сточных бытовых и промышленных вод Тулы в зависимости от времени года, выявление и характеристика спектра мутагенов, характерных для вод Тульской области в зависимости от источников загрязнения;

характеристика мутагенной активности широкого спектра электромагнитных излучений: электромагнитных волн с выраженной продольной составляющей, лазерных лучей, КВЧ-излучения;

- определение чувствительности новой тест-системы у \vsri (с применением в качестве положительного контроля супермутагена платинового ряда)

Научная новизна

Впервые была изучена сезонная мутагенная активность питьевой воды различных источников, мутагенность сточных бытовых и промышленных вод г. Тулы.

Проведено исследование мутагенной активности оксоплатина в тест-системе у лузп Drosoph.Ua т.е\апо%а$1ег.

Было изучено мутагенное действие электромагнитных волн с выраженной продольной составляющей, лазерных лучей, КВЧ-излучения.

Создана тест-система у \узп оптимизирующая метод скрининга мутагенов окружающей среды на основе линий у и хубп В. melanogaster.

Научно-практическая значимость работы

Теоретическая значимость заключается в выявлении мутагенного эффекта у традиционно считавшихся немутагенными факторов, выяснении механизма действия электромагнитных излучений на геном дрозофилы.

Практическая значимость работы заключается в усовершенствовании методов мониторинга и скрининга канцерогенов на дрозофиле, более адекватной оценке мутагенных свойств химических соединений водных объектов окружающей среды и характеристике генотоксического загрязнения вод Тулы и области.

Результаты работы могут иметь значение для оптимизации мониторинга окружающей среды и могут быть внедрены в практику в виде методических рекомендаций и научных публикаций.

Внедрение результатов исследования Результаты исследования используются в работе сотрудников НИИ новых медицинских технологий, на медицинском факультете Тульского государственного университета, на естественнонаучном факультете Тульского государственного педагогического университета, в курсе лекций Пущинского государственного университета.

Апробация работы

Апробация работы состоялась в НИИ новых медицинских технол