автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК ИЗ ГИДРОБИОНТОВ И ОТХОДОВ ИХ РАЗДЕЛКИ



На правах рукописи

НОВИКОВА МАРГАРИТА ВЛАДИМИРОВНА

Разработка технологии получения биологически активных добавок из гидробионтов и отходов их

разделки

Специальность 05.18.07. - Биотехнология пищевых продуктов по отраслям (рыбная)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук

Москва 2003

Работа выполнена в Федеральном Государственном Унитарном Предприятии «Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии».

Официальные оппоненты: доктор технических наук,

профессор Кислухина О.В.

доктор технических наук, профессор Ратушный A.C.

доктор технических наук Боева Н,П.

Ведущая организация Федеральное государственное

унитарное предприятие «Гипрорыбфлот»

Защита состоится: «26» сентября 2003 г, в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 212.150,03 при Московском Государственном Университете сервиса Министерства образования РФ по адресу: 141221 Московская обл.. Пушкинский район, п 'т Главная, д.99, ауд.3110 (3 корпус)

Сдиссе;- -... диотеке

Москоч'-'; - о з ни вере итета сервиса

Авторе.| разослан Л. 200;

Учены;, секретарь диссертационного Сов.. .

канднд. технических наук, доиент C^jT^tA—7 Н.Л. Султаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В связи с изменившейся сырьевой базой, снижением добычи традиционных объектов промысла актуальной задачей является разработка ресурсосберегающих технологий использования гндробионтов. Особенно остро стоит вопрос рационального использования отходов разделки беспозвоночных -кальмара, морского гребешка и других объектов промысла, поскольку, не представляя коммерческого интереса, отходы могут просто выбрасываться, создавая дополнительную нагрузку на экосферу.

Еще в начале 60-х годов прошлого столетия советскими учеными (Тарусов Б.Н., 1962г, Эмануэль Н.М., 1%3г и др) была обоснована теория, нашедшая развитие в последующих работах (Бурлаков» Е.Б., Храпова, 1974г, Журавлев А.И., 1932г) о том, что в основе всех патологий в живом организме лежат процессы свободно-радикального окисления, инициируемые неблагоприятными факторами окружающей среды.

В настоящее время значительная часть населения России проживает на территориях, относящихся к зонам экологического кризиса, и испытывает сочетанное воздействие неблагоприятных факторов внешней среды и дефицита макро- и микрояутриентов, обеспечивающих антиоксиданткую защиту организма против чужеродных для организма агентов - радиации и радионуклидов, тяжелых металлов, ксенобиотиков (Суханов Б.П., Королев A.A., 1991г, 1996г, Тугельян В.А., 1996, 1998, 2000 гг.). По мнению ученых, одним из путей решения проблемы, связанной с негативным влиянием на живой организм факторов внешней среды является алиментарная коррекция питания с применением биологически активных пищевых добавок (ЕАД). В сложившейся неблагоприятной экологической обстановке применение БАД для коррекции пищевого статуса и неспецн фи ческой резистентности организма является наиболее быстрым, экономически приемлемым и научно-обоснованным путем (Тугельян В.А., 1996, Княжев S.A., 1996 г., Спиричев В.Б., 1997 г).

Наиболее эффективными являются комплексные БАД природного происхождения, обладающие широким спектром действия: антирадикальным, антиоксидантным, радиопротехторн ым, имуннокоррегирующим и соответственно содержащие в своем составе компоненты антн оксидантного ряда - витамины, полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), аминокислоты, биогенные макро- и микроэлементы.

Создание таких БАД может быть осуществлено искусственным подбором необходимых компонентов, что трудоемко н не всегда оправдано. Другой путь - это использование для получения комплексных БАД соответствующего по химическому составу сырья. Таким сырьем могут служить беспозвоночные и отходы их разделки, а также молоки рыб, которые по тем или иным причинам не используются или недоиспользуются в пищевых или других целях. Проблема рационального использования беспозвоночных, особенно отходов их разделки остается нерешенной, хотя они представляют несомненный практический интерес как источники биологически активных веществ (БAB). Такой вывод базируется на имеющемся опыте применения-гадробяиншв "и ВАВ^ выделенных из них, в диетотерапии различных заболеваннЯДНБ МСХА

фонд научной литет

Тема актуальна, поскольку разработка соответствующей технологии позволяет решить проблему максимального сохранения природного сырья, охраны окружающей среды и здоровья населения.

Теоретической базой для проведения исследований, связанных с разработкой технологии получения БАД из гидробионтов и отходов их разделки явились работы Лагунова Л.Л. - основоположника технологии получения мидийного гидролизата (МИГИ-К), Рехиной Н.И., а также Кокоплянникова А.Г., Кудряшова Ю.Б., Гончзренко Е.Н., Пархоменко И.М., Рейзис А.Р. и других, ученых, внесших значительный вклад в оценку эффективности применения МИГИ-К в оздоровительных целях.

Целься, задачи исследований. Цель работы заключалась в научном обосновании целесообразности использования гидробионтов и отходов их разделки для получения комплексных БАД, разработке технологии их производства и применения.

Для достижения цели решались следующие основные задачи: 'Исследовать химический состав и разработать основные требования х сырью, предназначенному для получения БАД

•Изучить влияние различных факторов на характеристику МИГИ-К для оптимизации технологии получения и обоснования режимов с целью перевода его в лечебно-профилактическое и лечебное средство.

■Обосновать основные режимы модификации способа получения и свойств мидийного гидролизата

■Обосновать и разработать основные параметры технологического процесса получения БАД из новых видов сырья

•Обосновать и разработать комплексную технологию использования гидробионтов и отходов их разделки для получения пищевых и кормовых БАД ■Провести доклинические и клинические испытания БАД, анализ и обобщение результатов медико-биологических и клинических испытаний "Исследовать состав компонентов, ответственных за биологическую активность БАД

■Реализовать разработанные технологические и технические решения на предприятиях рыбной отрасли.

Научные положения, выносимые яа защиту:

1. Принципиальные технологические решения модификации способа получения и свойств мидийного гидролизата

2. Обоснование применения БАД в качестве компонента специализированных пишевых продуктов

3. Обоснование и разработка комплексной технологии получения БАД пищевого и кормового назначения из гидробионтов и отходов их разделки.

Научная новизна работы; ■Разработаны научно-практические основы рационального использования гидробионтов и отходов их разделки для получения БАД пищевого и кормового назначения, базирующиеся на уникальности биологически активных веществ исходного сырья и получаемых из него продуктов, а также на их медико-биологических и клинических испытаниях.

•Обоснована универсальность солянокислого гидролиза для получения БАД из белок- и углеводсодержашего сырья водного происхождения. ■Обоснована и экспериментально подтверждена целесообразность модификации технологии получения МИГИ-К лечебно-профилактического применения и как лекарственного средства «Ларетен».

•Экспериментально обоснованы основные технологические параметры получения ферме нтативно-кислотного гидролизата (МФК), Показана возможность модификации свойств гадролизатов путем применения для нейтрализации КОН и введением витамина С. •Впервые установлено, что гидролизаты из гидробионтов и отходов их разделки не токсичны, не оказывают мутагенного действия н обладают радиопротекторной, гемостимулируюшей и антистрессовой активностью. Показана канцеростатическая, антивирусная, гепатопротекторная и атерогенная активность гидролизатов из гидробионтов и отходов их разделки, способность оказывать положительное влияние на рост фибробластов, синтез ДНК и белка, а таюке на механизм включения в иммунный ответ иммуннокомпетентных клеток. •Показано, что гидролизаты из гидробионтов являются многокомпонентными системами, содержащими в своем составе заменимые и незаменимые аминокислоты, олигопептиды, ш-З ПНЖК, биогенные макро- и микроэлементы, в том числе селен, биологически активные таурин, каркозин, а также меданоидины. Установлено, что биологическая активность гидролизатов обеспечивается всем комплексом веществ, входящих в их состав. •Показано, что гидролизаты из гидробионтов могут применяться самостоятельно как Б АД, и как компонент рецептур лечебно-профилактических пищевых продуктов массового потребления. ■Разработана безотходная технология получения Б АД путем гидролиза сырья к использования побочного продукта • негидролизованного плотного остатка в качестве эффективной кормовой БАД.

Новизна технических решений подтверждена патентами РФ: №2017439 «Продукт из мяса мидий и способ его получения», №2042728 «Продукт из мяса мидий», №2093040 «Продукт из белок- и углеводосодержащего сырья водного происхождения и способ его получения», №2098106 «Способ лечения гепатитов», №2097982 «Кормовая добавка», №2183414 «Биологически активная добавка и способ ее получения», №2192149 «Биологически активная добавка и способ ее получения», №2191332 «Диетический продукт и способ его получения», Заявка № 2002103025/13 «Диетический продукт», Решение о выдаче патента от 10.06.03

Практическая значимость работы. На основании результатов исследований разработана н внедрена в производство нормативная документация на сырье: «Гонады кальмара мороженные для промышленной переработки», «Мясо черноморской рапаиы мороженное», «Рапана черноморская живая для промышленной переработки», технология получения «Гидролизат из мидий пищевой для лечебно-профилактического применения (МИГИ-К ЛП)», «Гидролизат из мидий пищевой для лечебно-профилактического применения (МФК -ЛП)», «Кормовая добавка Мидиум». На основании результатов меднко-биологическнх и клинических испытаний МИГИ-К ЛП утверждена ФСП на лекарственное средство «Ларетен». Разработаны исходные требования на линию по производству

гидролизатов. Качество продукции и практическая значимость разработок отмечено дипломами и медалями выставок, подтверждено награждением МИГИ-К ЛП золотой медалью РАЕН им. Мечникова «За практический вклад в укрепление здоровья нации».

Реализация результатов работы:

Новые технологические решения использованы для разработки исходных требования на линию производства гидролизаггов из гидробионгов, при подготовке нормативных документов, предусматривающих заготовку сырья, изготовление Б АД пищевого и кормового назначения, специализированных пищевых продуктов с включением в рецептуру БАД, а также фармстатьи на Ларетен - лекарственную форму мидийного гидролизата.

Разработанные технологии освоены ЗАО «Биопрогресс» (Московская обл., г. Щелково), НЭМБЦ (г. Анапа), Краснодарской биофабрикой, ФГНПП «Прибор» (г. Ногинск, Московской обл.), зверосовхозами «Родники» и «Салтыковский» (Московской обл.), Очаковским опытным мидийно-устричным рыбоконсервным комбинатом (г. Очаков, Николаевской обл., Украина), «Гипрорыбфлот-Экос» (Ивангород Ленинградской обл.).

На основании результатов медико-биологических и клинических испытаний совместно с сотрудниками ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ разработано Информационное письмо «Применение гидролизата из мидий (МИГИ-К ЛП, Ларетен) а лечении острых и хронических гепатитов у детей и подростков», предназначенное для практикующих врачей.

Апробапия работы. Результаты исследований доложены на заседаниях Ученого Совета ВНИРО 15.04,03. и 24,06.03., Всесоюзной конференции «Проблемы ликвидации последней аварии на ЧАЭС в агропромышленном производстве - пять лет спустя: Итоги, проблемы и перспективы», (г. Обнинск, 1991), Третьем Международном симпозиуме «Медицина и охрана здоровья», (г. Тюмень, 1992), на научно-практической конференции «Заболевания органов пищеварения у детей», (г. Саратов, 1993), Втором Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г. Москва, 1995), Международном симпозиуме по марикультуре (г. Небуг, 1995), на-международной научно- технической выставке-ярмарке идей и технологий «Будущее России», (г. Протвино, Московской обл., 1995), Первом Международном симпозиуме «Натуральные биокорректоры: питание, здоровье, экология», (г. Москва, 1997), на национальной специализированной выставке «Российские продукты питания» - 1997 (г. Москва, ЦВЗ), Первой научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской экологии», (г. Орел, 1998), на Втором Международном съезде «Актуальные вопросы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения», (г. Санкт-Петербург, 1998), Научно-практической конференции «Медицинская экология и экологически чистое предпринимательство», (г. Ногинск, 1999), Третьей Международной конференции «Повышение качества рыбной продукции - стратегия развития рыбообработки в XXI веке», (г. Калининград, 2001), Первой Международной конференции «Морские прибрежные экосистемы: водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки», (г. Москва, 2002).

Публикации. Основные результаты исследований по теме диссертации опубликованы в 44 работах, защищены 9 патентами РФ и 2 авторскими свидетельствами.

Структура я объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, методическую и экспериментальную части, выводы, список использованной литературы и приложения. Работа изложена на 271 стр. основного текста, содержит 90 табл., 45 рис., 620 литературных источников, из них 165 иностранных, 23 приложения, включающих нормативные документы, акты выпуска опытных партий продукции, исходные требования на линию по производству гидролизатов, копии патентов.

Содержание работы

Введение. Обоснована актуальность разрабатываемой проблемы.

В первой главе «Обзор литературы» приведены данные о состоянии сырьевой базы, показано наличие значительных отходов разделки беспозвоночных, которые по ряду причин не могут быть использованы для традиционных способов переработки, но представляют интерес как источники БАВ. Приводится характеристика и химический состав некоторых гидробнонтов, отходов их разделки. При этом отмечается, что сведения о химическом составе отходов разделки или очень ограничены, или полностью отсутствуют, что обусловливает необходимость проведения дополнительных исследований химического состава сырья с целью его классификации и определения возможности использования для получения гидролизатов.

Рассмотрены известные способы получения гидролизатов из различных вндов сырья н основные направления их использования. Рассмотрены вопросы, касающиеся роли БАВ в поддержании гомеостаза человека.

Обсуждается роль различных пищевых веществ с антиоксидангньш действием в ингибировании процессов свободно-радикального окисления, в том числе меланоидинов — продуктов ам инокарбоннльной реакции Майяра. Рассмотрено влияние различных факторов на процесс меланоидинообраэования. Отмечено, что такой процесс наблюдается и в случае переработки сырья гидролизом.

Приведены результаты медико-биологических испытаний пищевого МИГИ-К, отмечены его радиопротекторные и радиотерапевтические свойства, что является основанием для применения МИГИ-К в качестве БАД. Рассмотрена роль БАД в коррекции пищевого статуса, состояние производства БАД в стране. При этом отмечается необходимость поиска новых источников сырья для получения БАД широкого спектра действия, а также создания пищевых продуктов лечебно-профилактического назначения с использованием БАД. Согласно результатам анализа литературных источников обоснована актуальность решения основных проблем в создании БАД из гидробнонтов и отходов их разделки. Сформулированы цель и задачи исследования (Рис. 1).

Во второй главе «Экспернментальная часть» обоснован выбор объектов исследований, описаны схемы и методы анализа. При выборе сырья дяя получения БАД ориентировались на перспективность использования беспозвоночных и отходов их разделки, а также на возможность применения недоиспользуемых и неиспользуемых объектов, в частности молок лососевых и карпа.

Объектами исследований являлись мидии живые, охлажденные, замороженные в створке, варено-мороженое мясо черноморских, азовских, беломорских мидий естественной популяции и марнкультуры, относящихся к семейству Mytilidae, род Mytilus, вид M.eduiis и M.galioprovinciaHs. гонады (смесь икры и молок) командорского, рода Berryteutbris Magister, и атлантического, рода Yllex, кальмаров, мягкие ткани мактры сахалинской Spisula sachaliniensis, отходы разделки нескольких видов морского гребешка рода Chlamys, мускул (мясо) черноморской рапаны Rapana thomasiana grosse из семейства Murcidia gastropoda, молоки горбуши Oncorhynchus gorbuscha и карпа Cyprinus carpio, гидролизаты из указанного сырья, а также побочный продукт гидролиза (плотный остаток), и пищевые продукты, изготовленные с введением в рецептуры Б АД.

Рис. 1. Схема программно-целевой модели исследования

Исследовательская и экспериментальная части работы выполнены в лаборатории новых белковых продуктов ВНИРО, в цехе и лаборатории Очаковского опытного миднйно-устричного рыбоконсервного комбината, в производственной лаборатории биофабрики г, Краснодара, технологической экспериментальной станции Гяпрорыбфлот-Экос, а также в лаборатории эволюционной биохимии НИИ биохимии им. Баха.

Для характеристики сырья и гидролизатов применяли Следующие методы анализа:

- содержание общего азота - методом Кьельдаля с применением автоматического анализатора шведской фирмы «Тесаюг», модель 1030;

- содержание азота летучих оснований (АЛО) - дистилпяционным методом на автоматическом анализаторе шведской фирмы «Tecator», модель ¡030;

- содержание аминного азота - методом формольного титрования с применением автотитратора датской фирмы «Radiometr» марки рНМ-82;

- содержание липидов - экстракционным методом Фолча (Folch J. et al, 1957);

- содержание углеводов - колориметрическим методом по Сомоджи (Асатиани B.C., 1956);

- жирнокислотный состав липидов - методом ГЖХ на приборе GC - 17 фирмы Shimadzu;

- содержание влаги, NaCl и золы - по ГОСТ 7636-85;

- макро- и микроэлементный состав - методом атомноабсорбционной ионизационной спектрофотометрии на приборе АА - 670 фирмы Shimadzu и методом атомн о-эмисс ион н ой спектроскопии с индуктивно-связанной плазмой на приборе ЮАР - 9000 (США);

- содержание аскорбиновой кислоты - методом титрования с реактивом Тильмана (Березовский В.М., 1973; Митин И.Е., Голубкина H.A., 1987).

Для определения аминокислотного состава, содержания и фракционного состава низкомолекулярных. азотсодержащих компонентов (свободных аминокислот, аминов, пептидов) в гидролизатах применяли автоматический аминокислотный анализатор ААА-835 фирмы «Hitachi» с последующей компьютерной обработкой данных по программе Мультихром для Windows.

Содержание хлорорганических соединений (пестицидов) в сырье и гидролизатах определяли методом ГЖХ на приборе Cromatopac C-R4A фирмы «Shimadzu».

Для определения антирадикальной активности гидролизатов применяли спектрометрический метод (Glavind J., 1963), в нашей модификации со стабильным свободным радикалом дифекнл-пнкрил-гидразилом (ДФПГ), измеряя оптическую плотность образцов при длине волны 517 нм на сканирующем СФ фирмы «Shimadzu», модель UV-260. Антирадикальную активность рассчитывали по разности экстинций (ЛДФПГ) до н после внесения гидролизатов.

Креме того, проводили стандартный микробиологический анализ образцов гидролизатов как заложенных на хранение, так и полученных из различного сырья.

Токснко-биологические исследования и определение относительной питательной ценности (ОПЦ) гидролизатов проводили микро-методом с использованием тест-объекта инфузории Tetrackimena piriformis. Контролем служил казеинат натрия.

Для фракционирования меланондинов использовали метод гельхроматографии на колонках с TSK-гелями Тоуреаг! HW-40 и HW-50, предварительно откалиброванных по белкам с известными молекулярными массами. Использованные гели имеют следующие диапазоны разделения по молекулярным массам для белков: HW-40 разделяет белки с молекулярными массами от 100 до 10 000, HW-50 - от 500 до 80 000. В качестве элюента применяли 0,2М раствор NaCl к дистиллированную воду. На колонку (1,2 х 35 см, свободный объем 12 мл) наносили по 0,4 мл предварительно обезжиренного хлороформом образца (Остерман Л.А., 1985).

Оптическую плотность фракций объемом I мл, собранных при помощи автоматического коллектора, измеряли на СФ фирмы «Shimadzu», модель UV - 260 при длинах волн 400 и 420 нм.

Расчет содержания меланоидинов осуществляли по формулам, выведенным нами на основании стандартной кривой, при помощи компьютерной обработки исходных данных по программе Windows 98, Excel 97.

После построения графиков элюции, собранные фракции, соответствующие пикам, упаривали * на роторном испарителе, обессоливали и подвергали спектральному анализу в УФ-, видимой и ИК-областях спектра.

Спектры в УФ- и ИК-областях снимали на регистрирующем СФ фирмы «Вескшап», ИК-спектры на СФ М-80 (ГДР) и фирмы «Shimadzu» модель 1R-460 в интервале волновых чисел 40 000 - 400 см"' и температуре 120°С. Для снятия ИК-спектров использовали образцы в виде таблеток с КВг или раствора в этилегоспоргидрине. Параллельно образцы анализировали на хромато-масс-спектрометре (Х-МС-СФ) «Финниган» МАТ-4615 с автоматической системой обработки данных «Супер-ИНКОС» на базе ЭВМ «Нова-4». Анализ проводили в режиме прямого ввода при нафевакни образцов от 50°С до 450°С. Скорость сканирования 1 спектр/сек, диапазон регистрируемых масс 50-650 и 50-900, ионизирующее напряжение 70 В.

Наличие гетероциклических структур в составе меланоидинов (пиррольных, пиперидиновых, пиразиновых, фурановых и фенольных) определяли при помощи специфических качественных реакций (PaparieHo G.J., Janis М.А., 1966),

Антиоксидантную активность меланоидинов изучали полярографическим методом, используя систему окисления арахидоновой кислоты в присутствии ионов железа s качестве катализатора процесса окисления. Для проведения опытов применяли полярограф LP-7 (ЧССР) с ячейкой для амперометрического определения потребления кислорода конструкции Шол ьца-Островского. Об интенсивности окислительного процесса судили по скорости потребления Oj. Для сравнения антиокислительной активности МИГИ-К использовали «стандартные» меланоидины, полученные при нагревании смеси глицин: глюкоза - 1:4 при температуре 80°С в течение 21 часа.

Для препаративного выделения и фракционирования пептидов применяли метод колоночной лигандно- обменной хроматографии (Телегина Т.А., Павловская Т.Е., 1975). Фракционирование пептидов осуществляли на сефадексе G-15, который позволяет разделять пептиды с молекулярными массами до 1500. Колонка была откалибрована по ди- и трипептидам с молекулярными массами от 160 до 278. В качестве элюента использовали бидистиллиро ванную воду. Фракции, выходящие с колонки, анализировали на СФ UV-260 фирмы Shimadzu при длине волны 220 нм на присутствие пептидов и при длине волны 400 нм - на присутствие меланоидинов или комплексов меланоидинов с пептидами.

Для выделения летучих соединений применяли дистиляционно-зкстракционный метод (Likens S.T., Nikerson, 1964), фракционный состав определяли Х-МС-СФ анализом, используя для разделения капиллярную колонку с неподвижной жидкой фазой SE-30 (25 х 0,32 мм) в режиме программирования температуры от 50°С ДО 200°С со скоростью 7°С/мин, и от 200°С до 300°С со

скоростью 15°С/мин. Диапазон регистрируемых масс 33-450, скорость сканирования 2 сек/спектр.

О влиянии технологических параметров, состава и вида сырья, продолжительности и условий хранения на свойства гидролизатов судили по гемостимулирующим, радиопротекторным и антистрессовым свойствам образцов. Исследования были выполнены сотрудниками МРНЦ РАМН (г. Обнинск) под руководством д.б.н. проф. Коноплянникова А.Г, в биологических опытах на животных. Доклинические и клинические испытания проводились в специализированных медицинских учреждениях, in vitro н in vivo по методикам, принятым в медицине.

Определение биологической (радиозащитной и гемостимулнрующей) активности производили по утвержденным в 1975 г. Минздравом СССР «Методическим рекомендациям по вопросам определения численности кроветворных колониеобразующих единиц (КОЭ) с помощью тестов экзогенных и эндогенных селезеночных колоний». Методики широко применяются отечественными и зарубежными специалистами при изучении эффекта биологически активных соединений на уровне начальных звеньев кроветворной системы, которыми являются клетки стволового типа. Опыты проводили на мышах-гибридах Ft(CBAxC57B/6), которым в течение 5 суток вводили перорально Б АД из расчета 5 мл/кг массы тела. На 5-е сутки мышей подвергали общему у-облучению в дозе 6 Гр (аппарат ((Луч», мощность дозы 40 сГр/мин), На 9-е сутки после облучения животных забивали, селезенки взвешивали (так как масса селезенки обычно хорошо коррелирует с числом эндоколоний и служит поэтому дополнительным количественным показателем реакции кроветворной системы на стимулирующее воздействие), фиксировали в растворе Буэна и подсчитывали на их поверхности количество колоний с диаметром более 0,2 мм. Радиопрогекторную активность выражали в количестве КОЭ/селезенку, гемостимулирующую - в % ретикулошпов в периферической крови.

Для определения антистрессовой активности изучаемых препаратов применяли методику оценки массы и клеточности тимуса (при более углубленном изучении также и методики оценки состояния ДНК в тимоцитах и другие тесты), разработанную основателем учения о стрессе канадским ученым Г. Селье, применяющуюся в различных модификациях. В нашей работе использовали варианты создания стресса и оценки его эффекта, описанные в книге В.Н. Большакова с соав. (1984), выражая антистрессовую активность в массе тимуса.

Определение гемостимулнрующей активности отдельных образцов проводили сотрудники лаборатории фармакологии Научного центра экспертизы и госконтроля лекарственных средств Минздрава РФ. Активность определяли на фоне подавления иммунной системы, вызванного циклофосфаном. Животным (мыши-самцы линии СВА) опытных групп однократно внутрибрюшинно вводили 3 % раствор циклофосфана, а через 24 часа - подкожно испытуемый препарат в течение 4-х дней. На 7-е сутки после введения циклофосфана у животных определяли массу тела и относительную массу селезенки; последняя характеризует активность препарата, его способность восстанавливать лимфоиднуто ткань, поврежденную введением циклофосфана.

В третьей главе приведены результаты «Исследования химического состава сырья». Результаты анализа химического состава сырья позволили подразделить его на три группы по соотношению содержания белок: углеводы. К первой группе (табл. 1) сырья относятся гонады кальмара командорского, беломорские и черноморские мидии естественной популяции и мясо рапаны, с содержанием углеводов 3,65-4,85%. Соотношение белок: углеводы для этой группы сырья 3:1 -4:1. Ко второй группе с содержанием углеводов 2,28 - 3,32 % и соотношением белок: углеводы 5:1 - 6:1 можно условно отнести гонады атлантического кальмара, мидии марикультуры и мактру. К группе с минимальным содержанием углеводов 0,46 -0,93% относятся молоки рыб и мясо азовских мидий. Соотношение белок: углеводы для этой группы сырья 20:1 - 40:1.

Таблица I

Химический состав сырья, % __

Сырье Влага Белок, №6,25 Лнпнаы Минеральные в-ва Углеводы

Мнднн беломор. есгеств. искусств. 78,50 77.20 13,59 15,61 230 239 1,85 1,84 3,76 2,96

Мидии черномор. сстсств. ■скует 78,40 77,50 13,5« 15*56 2,67 232 1,72 134 3,65 2,98

Мидии азовские 76,40 17,93 2,87 1,87 0,93

Гонады кальмар* командорского 71,35 15>87 646 1,77 4;85

атлантического

шесеинмй выло* осенний *ыло* 72,82 70,40 1530 15,81 7,28 10,00 1,53 1,12" 3,07 2,67

Отходы раздел кя гребешка 83,19 11,25 «,81 1,92 2,83

Отходы разделки мактры 81,70 11,70 135 1,98 337

Мягкие ткани мактры целиком 82,10 11,60 0,93 2,05 332

Мясо рапаны весенний вылов

сырое вареное осенний вылов 73,20 74,28 20,71 21,25 0,48 0,67 130 1,52 4,41 2Д8

сырое вареное 75,18 71,40 17,56 21,02 0,52 1,67 1,61 134 5,13 437

Молоки лососевых 76,80 16,25 4,00 2*20 0.75

Молоки карпа 75,30 18,44 3,90 1,90 0,46

По литературным данным (Сафронова Т.М.,1980; Шнейдерман С.И., 1990) основную часть углеводов в беспозвоночных составляют моносахара, в основном, гексозы, а в молоках рыб - гликоген (Кизеветтер И.В., 1973).

В белках исследованных видов сырья содержатся все заменимые и незаменимые аминокислоты (табл. 2).

Таблица 2

Аминокислотный состав сырья, г/100г белка

л Амино- Черномор, мкаил Б*ломор, мяяяи Отходы {поделка гребешка Мясо Гепалы Мол ОГК МОЛАКИ

в/п кислота (август) (август) рапаны кальмар* лосмс&ых карпа

1. Асшрапюгам 6,13 6,31 7,58 7,40 8,22 5,73 7,67

2. Серии 1,75 1,90 4,00 3.74 4,34 4,05 5,39

3, Глутампн 10,97 10,83 10,17 11,89 13,16 5,66 7.54

4. Глицин 4,40 Я,91 11.01 4,88 гм 4,05 3,76

5. Алании 3,77 3,30 3,84 5,91 5,08 343 4,90

6. ГН<П|ДИН 1,09 1,18 1,11 1.01 1,88 1,00 1,19

7. Аргинин 4,62 3.03 5,45 7,09 4,50 13,67 4,87

а. Прилип гм 1,46 3,01 1,70 3,29 3,20

Сумма замен. 36,19 38,93 46,28 44,76 41,22 40,74 38,52

9, Июлейцни 2,52 2,71 2,25" 2.16 3.33 1.54 2,08

10. Лейпни 4,07 4,45 4,99 6,81 7,05 3,13 4,30

N. Метпонин + Цпстин ш 2,44 1,73 5,63 1,11 7,17 1,74

12. Феяилаланпн •■Тирозин 5,67 5,33 5,27 4,21 5,24 2Д5 4,87

13. Треонин 346 3,17 3,96 1.92 4,78 3,61 3,28

14. Валяй 1,91 2.97 2,52 5,92 3,99 5,25 5.71

15. Лнэдн 4.67 4,85 4,45 5,94 6,97 4,24 742

Сумма подмен. 15,93 25,92 25,17 33,59 31,47 27,77 2940

16. Тяурнн т «пр. 644 4.52 2,30 5,95 не опр. не опр.

Расчет аминокислотного скора (табл. 3) показал, что из незаменимых аминокислот, в таких видах сырья, как молоки, мясо рапаны преобладают валин и лизни, в гонадах кальмара - лизин, треонин, лейцин, в мясе рапаны кроме того отмечено высокое содержание серусодержащих аминокислот. По содержанию незаменимых аминокислот мясо рапаны, гонады кальмара и молоки превосходят мясо мидий.

Характерной особенностью беспозвоночных и отходов их разделки является наличие таурииа, обладающего широким спектром биологического действия (Ярцев Е.И, и др., 1975).

Содержание таурина в образцах достаточно высоко - от 2,30 в мясе рапаны до б,54г/100г белка в беломорских мидиях (табл 2).

Все виды исследованного сырья характеризуются относительно низким содержанием шпидов (за исключением гонад кальмара содержание липидов в исследованных видах сырья не превышает 4,0%) и высоким содержанием ПНЖК (табл. 4), в т.ч. незаменимых - эйкозапентаеновой (Сг0;5) и докозагексаеновой (Сг1; «).

В исследованном сырье содержатся биогенные макро- и микроэлементы, в т.ч. Зе, Ре, Та, Си, Мп (табл. 5), играющие значительную роль а активации антирадикальной зашиты организма (Лобарева Л.С., 1995).

Содержание тяжелых металлов и пестицидов не превышает допустимых норм, регламентированных требованиями СанПиН 2.3.2.1078-01,

Таблица 3

Аминокислотный скор сырь«__

Нет* мен »мыс аминокислоты Шкала ФАО/ ВОЗ Вареное мясо мидий Гонады кдльмара Maco рапаны Отводы разделки гребешка Мояокп карпа

а продук те % к шкале в продук те шкал< в II ролу кте У. к шкал* я проду кте У. к шкале 8 проду кте У. к шкале

Шолейцин 4.0 1.71 68 333 83 2,16 54 2Д5 56 2,08 52

Лейцин 7,0 4,45 64 7,05 100 6,81 97 4,99 71 430 6)

М«тмоннн+- ЦНСТПК 33 1,49 71 1,Н 31 5,63 161 1,73 49 1.74 50

Ф(ннлал»пим + тирозин 6,0 533 89 534 96 4,21 70 5*27 88 4,87 81

Треонин 4,0 3,17 79 4,78 110 1,92 73 3,96 99 3,28 81

Вални 5,0 1,97 59 3,99 80 5,92 118 WI 50 5,71 114

Лизин 53 4,85 83 6,97 117 5,94 108 4,45 81 7,22 13t

Таблица 4

Содержание осяовньи жирных кислот в сырье, % от суммы.

Жирные Мшн Минин Ганааы Мясо Аэоаекпе Огневы разделкк

кислиты черном белом. кальмар» рапаъы МНДМП гребешка

18:2tü6 1,17 2,08 1,16 0,15 1,69 3,87

10:4(06 <i>3 2,18 1,76 - 1.1 3,28 4,04

20:5 юЗ 14,88 13,52 23,15 16,0 10,80 10,87

22:6 (йЗ 7,98 10,79 11,0 5,18 6,86 137

Сумма нононенасыш. 21,15 25,61 16,06 54,85 17,55 11,45

Сумма полнненасьШ- 34,07 48,15 41,23 33,09 27,61 49,31

Таблица 5

Содержание макро- я микроэлементов в сырье, мг/100 г

Muann беломорские Мидии черноморские Гонады кальмара Мидии •эовскне Отходы раздел кп гребешка

Ca 87,40 57,30 4,114 93,50 219,00

Cd О.ОЭО 0,094 не опред. 0,146 Не опред.

Cr ue onptn. 0,010 0,077 0,026 Не олреа.

С» 0.156 0384 0,047 0,102 0,51

Мв 413 слепы 26,81 53,60 26,00

Мо 0,730 МЮ 0,145 3310 0,150

«i 0,042 0,099 0,063 0,029 Не обиар.

Zu 2,66 732 16,73 10,50 10,01

Fe 15,700 173 2,916 2,49 6,80

К 48.70 ел еды 257,1 41,6 70,00

Na 350 340 1775 150 250

Р 170 145 129,1 120 20

Se 0.14] ] 0,1778 0,0358 не опред. 0,013

Результаты анализа химического состава гидробионтов и отходов их разделки и сопоставление полученных данных с химическим составом мяса мидий свидетельствуют о целесообразности использования новых видов сырья для получения БАД.

В главе 4 «Совершенствование технология получения МНГИ-К» изложены результаты опытов по изучению влияния отдельных параметров технологического процесса на характеристику гидролизата, в частности на биологическую активность. Проведением этих исследований преследовалась цель повышения биологической активности МИГИ-К пищевого н дальнейшего использования его как препарата лечебно-профилактического назначения (МИГИ-К ЛП), а затем хак лекарственного средства «Ларетен».

Действовавшим отраслевым стандартом, а затем нормативной документацией (ТУ 15-16-06-89) на пищевой гидролизат МИГИ-К предусматривалось проведение гидролиза в течение 24 часов при концентрации кислоты 8%. После нейтрализации гидролизат, отделенный от плотного осадка фильтрованием, концентрируется упариванием. При указанных режимах технологического процесса МИГИ-К содержал сухих веществ 29-32%, общего азота 2,0-2,4%, аминного азота 1,6-1,8%, при плотности 1,18-1 ДО г/см3 и рН 5,8-6,0. Содержание соли в МИГИ-К составляло около 20%, что для препарата лечебно-профилактического назначения крайне нежелательно. Кроме того, при концентрировании упариванием наблюдалось образование аморфного осадка, который снижал органолептическне показатели МИГИ-К, придавая ему мутность, что также неприемлемо для продукта лечебно-профилактического назначения. Поэтому нами были проведены опыты по уточнению отдельных параметров технологии МИГИ-К.

Расчет концентрации кислоты, необходимой для проведения гидролиза, осуществляли исходя из соотношения сухих веществ в сырье и 100% НС1 1:0,55. Для достижения необходимой концентрации кислоты в гндролизуемую массу добавляли соответствующее количество аоды. Гидролиз осуществляли при концентрации кислоты 8% (в соответствии с ТИ к ТУ 15-16-06-89), 7,5% и 7,0% в течение 24 часов.

Пробы, отбор которых проводили через каждые 2 часа гидролиза, нейтрализовали раствором ИаОН до рН 5,5 н фильтровали. Влияние концентрации кислоты и продолжительности гидролиза на характеристику гидролизата оценивали по величине антирадикальной активности. Кроме того, определяли зависимость ДДФПГ гидролизата от рН нейтрализации.

Установили, что ДДФПГ гидролизатов в значительной степени зависят от продолжительности гидролиза, в то время как концентрация кислоты оказывает незначительное влияние на этот показатель. При более высокой концентрации кислоты (8,0 и 7,5%) увеличение ДДФПГ гидролизата происходило быстрее, чем при концентрации кислоты 7,0%, однако к окончанию гидролиза величина ДДФПГ при изученных концентрациях кислоты выравнивалась.

Максимальная ДДФПГ гидролизатов наблюдалась при гидролизе в течение 18-20часов. При более длительном гидролизе (24 часа) отмечено снижение содержания сухих веществ в гидролизате и резкое понижение ДДФПГ (рис.2).

Величины таких показателей, как содержание общего и аминного азота, с увеличением продолжительности гидролиза свыше 20 часов проявляют тенденцию к

снижению, что может быть связано с гидролизом азотсодержащих компонентов до летучих соединений. На ДДФПГ значительное влияние оказывает рН нейтрализации, вне зависимости от продолжительности гидролиза. Оптимальной рН нейтрализации следует считать 5,4- 5,6 (рис.3).

Рис.2. Влияние концентрации кислоты и Рис. 3. Влияние продолжительности продолжительности гндролиза на ДДФПГ гидролиза и рН нейтрализации на гндролнэатов. содержание сухих веществ и

антирадикальную активность мидийного гидролнзата.

Как отмечено выше, при хранении пищевого МИГИ-К, отфильтрованного сразу после нейтрализации и затем концентрированного упариванием, наблюдается образование значительного, трудно отделимого осадка, вероятно за счет вторичных физических и химических взаимодействий компонентов, содержащихся в гидролизате. Поэтому в технологический процесс был включен этап созревания -выдерживания нейтрализованного до рН 5,5- 5,6 и упаренного до плотности 1,180-1,185г/см} нефильтрованного гидропизата при нерегулируемой (комнатной) температуре.

Результаты опытов позволили придти к заключению, что при созревании в результате физических и химических процессов происходит осветление гидролнзата за счет уплотнения непрогидролизовакного остатка, что позволяет избежать образования осадка в гидролизате при последующем длительном хранении. Кроме того, процесс созревания приводит к повышению ДДФПГ практически без изменения количества азотсодержащих и сухих веществ в гидролизате (табл. 6). При созревании изменяется ОПЦ гидролнзата (рис, 4), На первых стадиях созревания -3-5 суток ОПЦ снижается, по сравнению с исходным значением, затем в интервале 6-8 суток ОПЦ возрастает и достигает относительного максимума на 8-9 сутки. Выдерживание в течение 10-11 суток приводит к незначительному спаду и стабилизации этого показателя. Полученные результаты позволяют заключить, что процесс созревания можно ограничить 8-10сутками.

Возможно, что колебания ОПЦ, полученные в опытах с Tetrackimena piriformis, обусловлены изменением рН при созревании гидролнзата за счет протекания в кем вторичных реакций. На первом этапе созревания отмечено снижение рН с 5,5-5,6 при нейтрализации до рН 43-4,5. С незначительными колебаниями эта величина рН сохраняется в последующие сутки созревания.

Снижение рН при созревании гидролизата обусловило необходимость аведенюг в технологический процесс еще одной операции - «донейтрализация», т.е. повторное доведение рН гидролизата перед фильтрованием до 5,4-5,6.

Таблица 6

Влияние продолжительности созревания на характеристику упаренных __гндролизатов

Продолжительность Продолжительность Содержание,"/»

гидролиза созревания, сухнх в-ва Общий Амипный ДДФПГ

суток азот мот

18 час. После упаривания 32,05 1,87 1,26 0,320

5 32,01 1,87 1,23 0,330

7 30,99 1,86 1,21 0,380

30 суток 30,29 1,82 1,20 0,441

24 час. После упаривания 32,55 1,90 1,29 0,320

5 32,59 1.94 1,28 0,340

7 32,54 1,92 1,30 0,380

30 суток 32,49 1,93 1,29 0,440

После «донейтрализации» рН гидролизата остается стабильной при последующем длительном хранении.

Продожит»л иметь ГЯцролЩ1

» И «ш.

0,5 5 9 10 11 сутки

Рис, 4, Изменение ОПЦ в процессе созревания гидролизата

На основании проведенных опытов разработан усовершенствованный технологический процесс. В отличие от технологии получения пищевого МИГИ-К (ТУ 15-16-06-89) в разработанную схему внесены следующие изменения:

- уменьшена продолжительность гидролиза с 24 час до 18-20 час;

- снижена концентрация соляной кислоты в гидролизуемой массе с 8% до 7-7,5%;

- изменена последовательность отдельных операций, именно процесс созревания осуществляется до фильтрования гидролизата, без отделения осадка;

- снижена рН нейтрализации с 5,8-6,0 до 5,4-5,6;

- внесена дополнительная операция - донейтрализация гидролизата после созревания.

Обоснованность разработанных изменений технологических параметров получения гидролизата подтверждается практически идентичными показателями

биологической, активности и химического состава образцов 24 час. и 18 час. гидролиза и их стабильностью при длительном хранении (табл. 7).

Органолептические показатели, химический состав и биологическая активность гидролизатов, независимо от продолжительности гидролиза и температуры хранения, остаются стабильными в течение 2 лет.

Обшее количество микрофлоры при длительном хранении в гидролнзатах снижается, что, вероятно, связано с антимикробной активностью мелаиоидинов, о которой известно из литературных источников (Оиа^>а М. Е1 а1,1992) и через 2 года хранения не превышает 1 х 1 ОгКОЕ/г (табл. в).

Таблица 7

Влияние продолжительности и условий хранения

на характе рнстику гшцюлнэатов нз че рноморекнх мидий

. Показатели 24 часовой гидролиз 18 Ч»СО ВОЙ ГИДРОЛИЗ

2 года 2 года

исх. 22±5°С -Н>+ГС нсх. 22±5'С

РН 5,41 5,45 5,50 5,48 543 5.55

Плотность, г/см* . 1,185 1,186 1,186 . 1,139 1,183 1,179

Сухие вещества, % 35.77 35,69 35,70 32.10 29,90 29,72

Минеральные в-ва, % 17,79 17,43 17,11 15,13 15,00 15,02

Общий азот. % 2.00 1,34 1,30 1,77 1,73 1.74

АЛО.% 0,16 0.17 0,17 0,14 0,16 0,17

Амшошй азот, % 1,19 1,24 1,19 1.11 0.98 1,08

Антирадккальная активность, ДДФПГ 0,440 0,420 0.419 0,468 0,398 0,414

Радиопротекторная активность. КОЭ/еелюенку 4,8±0,2 4,«±0,3 4,6±0,8 4,4±0Д 4з±оа 4,6±0,6

Масса сележякя, мг - 43,0±16 48,0±8 - 47.4Ш 51,4±17

Таблица 8

Влияние продолжительности хранения а» микробиологически« показатели гидролщатов

Температу ра хранения

Продолжительность хранения, мес. плюс 6 плюс $°С нерсгулнр. (плюс 20±5*0

КМАФАиМ. КОЕ/г плесень, КОЕ/г КМАФАиМ, КОЕ/г плесень, КОЕ/г

6 6,46x10' 4.2X10* 6,46x10'' 4,2x10'

12 2,6x10* 3,6x10' 3,0x10' 3,0x10'

18 1x10^ отсут. 1,0* 10* 1,0x10'

24 1хЮ1 отсут. 1x10' отсут.

. 30 1x10' отсут. 2x10' отсут.

36 >100 отсут. >100 отсут

Из анализа литературных данных и результатов собственных исследований следует, что химический состав мидий подвержен сезонным колебаниям, а также зависит от места обитания, что в свою очередь может оказывать влияние на биологическую активность гидролизатов.

Нами установлено, что величина ДДФПГ гидролизатов изменяется как в Пределах одного сезона к места добычи мидий, так и различается в зависимости от района их обитания (табл.9).

Из приведенных данных следует, что по химическому составу гидролизаты, приготовленные из мяса мидий Азовского, Белого и Черного морей различаются незначительно.

Таблица 9

Химический состав н характеристика гидролиэатов, полученных ид мяса мидий различны» районов обитания_

Районы лова мидий

Азовское Бело« Черное мор«

Показатели море море

Продолжительность гидролиза

24 час. 24 чае. 18 час. 22 час. 24 час.

1. Химический состав, %

Сухие вещества 32,77 31,50 33,11 31,79 30,66

Общий азот 1,6 1,90 2,00 1,70 1,80

Амшшый азот 1Д4 1,25 0.94 U5 1,31

АЛО 0.15 0,16 0,24 0,20 0,1 S

РН 5.1 5,00 4,85 4,85 5,05

Плотность, г/см1 1,183 i.i g: 1,191 1.185 1,180

2. Активность:

ДЦФПГ 0,200 0,450 0,439 0,446 0,402

гемостимулиругсщая, %

регшеулоцитов 2,83±0,31 3,62±0,21 3,67*0,40 3,68*0,21 3,83±0,43

радиопротекторная,

КОЭ/селезенку 2,5±0,3 4,S±0,2 4,3±0,2 4,2±0,б 4,б±0,В

Некоторые колебания химического состава образцов могут быть связаны с различиями в степени упаривания гидролнзатов, судя по содержанию в них сухих веществ. Колебания в величине антирадикальной активности гидролнзатов из беломорских и черноморских мидий незначительны. Обращает на себя внимание очень низкая биологическая активность — гемостимупирующая, радиопротекторная, антирадикальная гидролиэата из азовских мидий - она более чем в 2 раза ниже, чем в остальных, образцах. О низкой активности МИГИ-K из азовских мидий свидетельствуют и результаты определения радиопротекторной активности, полученные в МРНЦ РАМН и МГУ (Гончаренко E.H. и др., 1995), а также антивирусная активность, определение которой проводилось в НИИЭМ им. Пастера (БичуринаМА. идр., 1995).

Предположительно, зто может бьтть связано с различиями в содержании биологически активных компонентов, образующихся а процессе гидролиза сырья, в частности в содержании меланондинов, что в свою очередь может быть обусловлено различиями в химическом составе сырья, например в содержании углеводов, участвующих в меланоидинообразованин - в мясе азовских мидий содержание углеводов практически в Э раза ниже, чем в мясе беломорских и черноморских мидий (табл. 1),

Полученные данные были учтены при разработке требований к сырью, предназначенному для получения БАД (глава 7).

На основании проведенных опытов была разработана и утверждена НД на опытную партии гидролизата лечебно-профилактического применения (МИГИ-К ЛП), ТУ 15-1098-90, в соответствии с которой осуществлена наработка опытно-

L

промышленных партий МИГИ-К ЛП из черноморских и беломорских мидий разных сезонов добычи. Данные статистической обработки показателей наработанных партий (табл. 10) были использованы затем при разработке НД на МИГИ-К ЛП (1516-28-94), утвержденной после проведения клинических испытаний н действующей в настоящее время.

Таблица 10

Данные статистической обработки отдельных показателей гидролизатоя из мяса черноморских и беломорских мидий ___п-1

Л МИГИ-К К1 МИГИ-К из Повеем

п/п Покяэателн черноморских беломорских партиям

миднй мкний

1 Количество партий МИГИ-К 16 11 27

2 Сухие вещества, % 31,82* 1,16 33,42* 0,59 32,47± 0,84

3 Минеральные вещества. 17,93* 0,73 17,98* 1,15 17,82* 1,31

в том числе ИаС1,% 15,6*1,3 15,5±0,8 15.7*0,7

4 Общий азот, % 1,86*0,10 2,1 [± 0,06 1,96*0,12

5 Амвнвый азот, % 1,19* 0,05 1,42*0,10 1,28* 0,41

6 Азот летучих .оснований, % 0,16*0,01 0,16*0,01 ' 0,16*0,01

7 Лнтиршшкальная 0,335* 0,012 0,400* 0,039

активность, ДДФПГ 0,385*0,064

В главе 5 изложены результаты «Модификации технологии получения мидийного гидролнзата биотехнологнческн м способом».

Наиболее трудоемким процессом в переработке мидий является отделение мяса от створки, который осуществляется бланшированием моллюска паром или горячей водой для раскрытия створок, с последующим отделением мяса вручную или механическим способом. Проведением опытов по модификации способа получения медийного гидролнзата преследовалась цель упрощения технологического процесса за счет исключения этих этапов - взамен бланширования мидий была введена ферментативная обработка сырья (мидий в створке) лротосубтшшном ГЗх для перевода мяса в растворимое состояние.

Модификация технологии мидийного гидролнзата заключается в следующем: мидию в створке загружают в ферментер, добавляют воду, массу прогревают до температуры 42 ± 2 °С, затем вводят фермент, контролируя визуально процесс ферментолиза. Жидкую фракцию (ферментированный субстрат) отделяют от створки, прогревают при температуре 90 ± 2 °С для инактивации фермента и подвергают солянокислому гидролизу в соответствии с ТИ на МИГИ-К.

Лабораторными опытами, проведенными на охлажденных беломорских, живых, охлажденных и замороженных в створке черноморских мидиях, с последующей проверкой установленных режимов в производственных условиях Краснодарской биофабрики и опытной технологической станции в Иаангороде установлено, что оптимальная концентрация протосубтилина ГЗх при активности 78-90 «а/т, составляет 0,6-0,4 % к исходному сырью, время ферментолиза -20-30 мни, инактивация фермента достигается прогреванием массы при температуре 90 ± 2 "С в течение не менее 30 мин. Поскольку содержание сухих веществ в ферментированном субстрате не превышает 10 %, перед проведением кислотного

гидролиза его необходимо концентрировать путем упаривания до содержания сухих веществ ~ 18%, что позволяет более точно рассчитать количество кислоты, необходимой для концентрации ее в гидролизуемой массе 7-8%. Для достижения этой же концентрации кислоты при гидролизе неупаренного субстрата расход кислоты значительно увеличивается, а степень гидролиза белка повышается.

Необходимость концентрирования ферментированного субстрата перед проведением кислотного гидролиза подтверждается данными определения ДДФПГ ферме нтативно-кислотно го гидролизата (МФК).

Таблица 11

Влияние режимов гидролиза на характеристику МФК нэ охлажденных

беломорских мидий

№ образца Время гидролиза, час Плотность, г/см3 Содержание сухих В-В. */ч Обганй мот» % Аминный азот, % Литнрадикальная активность, А ДФГГГ

К 1,133 32,77 1.67 U4 0,300

1 14 1,193 30.08 1.19 0,86 - 0,281

16 1,180 28,36 1,08 0,81 0,287

1$ 1,176 27,67 1,06 0,81 0.297

20 1,172 26,30 1,03 0,78 0.244

22 1,195 30,44 Мб 0,88 0,241

24 1.185 29,22 1,19 0,89 0Д31

2 14 1,190 27,97 0,72 0,49 0,070

16 1,197 30.06 0,70 0,51 0,078

13 2,220 32,37 0,84 0,58 0,138

20 1,187 29,69 0,72 0,50 0.135

22 1.175 26,21 0,65 0,47 0,071

24 2,000 29,78 0,74 0,55 0,090

Примечали«: К - контроль (МИГИ-К ЛП)

1 - гндролизат из упаренного субстрата (фермектолямта) 2 - гидролиэат нэ неупаренного субстрата

Судя по величине ДДФПГ (табл.11) оптимальная продолжительность кислотного гидролиза составляет 16-18 час. Результаты лабораторных опытов по отработке режимов получения МФК из беломорских охлажденных и черноморских живых и мороженых мидий одного сезона добычи, показали, что обработка сырья протеолитическим ферментом, затем кислотой приводит к повышенной степени гидролиза белка (рис. 5) и к снижению содержания общего азота в готовом шдролизате.

Эти данные подтверждены результатами анализа опытно-промышленных партий МФК из черноморских живых и мороженных мидий (табл. 12).

В МИГИ-К ЛП и МФК, приготовленных из одного и того же сырья -черноморских мидий марикультуры, отмечены и некоторые различия в аминокислотном составе (табл. 13) - сумма аминокислот в МФК ниже, чем В МИГИ-К ЛП, что соответствует и более низкому в МФК содержанию общего азота.

Таблица 12

Характеристика МФК из черноморских живых н мороженых мидий

Образна РН Плотность, г/см^ Сухие в-м % Общий »от, V* Амнннийкют

% к общему азоту, */%

миги-клп 5,47 1,186 30,1 1,93 1,22 63Д0

МФК из жввых мидий 3,56 1,198 29,4 1,62 1,26 75,30

МФК из мороженых мнднй 5,57 1,192 30,5 1,61 1,22 75,70

14 16 16 го 22 Вр*мя пшрмшмч час

^иштнроиммго еуйстрт

"-«аеданн« обакч пап • МФК п уцфвмют фериппнронмютк субетрт

~сОЫр*Лтм * МФК мз упври»«*п

Ряс. 5. Изменение содержания общего н амииного азота в МФК 8 зависимости от продолжительности кислотного гидролиза ферментированного субстрата

Аминокислотный состав МИГИ-К ЛИ и МФК из черноморских мидий, мг/10Ф г гид рол им та

Таблица 13

Мп/п Наименование мшяокщедоги МИГИ-КЛП МФК

1 Аспарагвновая кислота 2,79 2,19

2 Треонин 1,32 0,84

3 Серия 1,29 0,92

4 Глутамнновая кислота 3,80 3,14

5 Гласив иг 1,61

6 Алании 1,50 1,54

7 Цастин 0,10 0.64

8 Валнн 0,88 0,85

9 Метиоиий 1,05 0,71

10 Изолейцнн 0,77 0,72

и Лейцин ив 1,28

12 Тирозин 0,90 0,62

13 Феннлапанин 1,08 0,88

14 Лизин 1,84 1,87

15 Гнстилин 0,40 0,31

16 Аргинин 2,40 1,49

17 Пролнн 2,30 0,87

Сумма 25,72 20,48

С целью разработки НД на МФК проведена статистическая обработка данных, характеризующих МФК по отдельным показателям. Для обработки данных взятье те

партии гндролизата, которые были получены из предварительно упаренного ферментированного субстрата, без учета состояния мидий - сырца,

Биотехкологической модификацией способа получения мидийиого гндролизата предполагалось создание единой НД на мидийный гидролиззт. Однако, МФК по химическому составу, биологической активности {табл. 14) и органолептическим показателям - вкусу, запаху, что подтверждено данными Х-МС-СФ анализа летучих компонентов, обнаруженных в гидролизатах, заметно отличается от МИГИ-К ЛП. Поэтому на МФК (опытную партию), была разработана и утверждена НД (ТУ 15-16-33-94), как на самостоятельный продукт.

Таблица 14

Сравнительная характеристика МФК н МИГИ-К ЛИ

Показатели МФК МИГИ-К ЛП

рН 5,6±0,2 5,б±0,2 *

Плотность, г/см' 1,185±0,001 1,185±0,007

Сухие вещества, % 29г00±|,20 32,47±0,S4

Общий азот, % 1,47±0,1б 1.96Ш2

Аминный азот, % 0.87±0,13 U8±0,41

Соль, % 17,41 ±0,50 17,28±1,31

Содержание меяаноидинов, мг/мл Г фракция П фракция Сумма % к сухим веществам 7,1S±2,S 34,54*7,10 41,72±8,32 14,13±1,46 2ДЗ±1,26 40,72+5,57 42,95±5,30 11,32±U8

Биологическая активность Рааиозащнтная КОЭ/селезеняу Масса селезенки, мг Гемостимулирующая % выхода ретикулшттов Аятирадикальная ДДФПГ 2,61 ±0,42 44,12±2,85 3,18±0,33 0,249±0,040 4,45±0,5 45,98±1,54 0,38i±0,064

Изменение НД на МИГИ-К, разработка модификации технологии получения мидийного гядролизата (МФК) обусловили необходимость проведения доклинических и клинических испытаний гидролвдатов. «Результаты доклинических и клинических испытаний мнднйных гидролкзатов» представлены в главе 6. Биологическими испытаниями, проведенными сотрудниками МРНЦ РАМН на мышах-гибридах, установлена гемостимулирующая и радиопротекторная активность МИГИ-К ЛП. Подтверждением радиопротекторных и радиотерапевтических воздействий МИГИ-К ЛП являются результаты опытов, проведенных Челябинским Госуниверситетом на мышах, подвергнутых радиационному воздействию Sr90 в дозе ЗООмкКи/кг (оптимальная саркомогенная доза), или внешнему фракционному облучению до набора суммарной дозы ЮГр. Установлено, что введение в рацион МИГИ-К ЛП увеличивает продолжительность жизни животных и смещает ira более поздние сроки развитие лейкозов {рис, 6-9). Гемостимулирующее действие МИГИ-К ЛП доказано опытами in vitro, проведенными НИИ детской гематологии на клетках -

кроветворных предшественниках, выделенных нз пуповкнной крови новорожденных. По мнению исследователей МИГИ-К ЛП может быть рекомендован как эффективная добавка к лечебным темостимулирующим препаратам, значительно повышающая их действие в достаточно низкой концентрации (рис, 10,11).

too ГГ • О

И ; о

JO- • О > ° • о

3S ■ »J • О

♦ с° f A •Sr-90 ffjO OSi+МИГИ-КЛП

-

в 100 :м км «и

Рис.6. Динамика гибели животных а экспериментальных группах

Рис.7. Динамика смертности животных, погибших огг костных опухолей

Рис. 8. Динамика гибели животных с лейкозами Рис. 9. Динамика смертности животных в в экспериментальных группах группах с внешним гамма облучением .

Исследованиями in vitro, проведенными в институте иммунологии МЗ РФ, установлено, что МИГИ-К ЛП эффективно влияет на синтез белка и ДНК в эпителии кожи человека, ускоряет рост фибробластов (рис. 12, 13), что позволяет использовать его в различных областях медицины для ускорения репаративных процессов кожи, слизистой оболочки различных органов и тканей. МИГИ-К ЛП обеспечивает механизм включения в иммунный ответ иммунокомпетентных клеток t

bunpim

t ) 4 ) « Г «

р1эв«денкя препарата Chut« tomt* Сюпде ДНК

Рис. 10 Влияние МНГИ-К ЛП на 5ффектл8 кость ионироынм кроветворных _предмествснишда (ЭК на 10*5)._

Рис. 12. Влияние МИГИ-K ЛП на синтез бели и ДНК в кулктурах клеток каши человека. __

Ср*Дм* и ит «не s им ость ф/туорвои»*Цм*

i/i«

PuHiAtHM прйчрна

1лм ,1/it i/un i/iwt Раэведекик првпврат» uu-двс . № nu-Dk

1/1И

Рис. 11. Влшнне МИГИ-K ЛП на величину пролнфератмного потенциала _кроцтаорньи прсдштспиииикоа (ПП)._

Янс. ) 3. Влияние МИГИ-К ЛП на экспрессию антигенов H LA _macea I II ь культурах эпителии._

и механизм специфического иммунного ответа на генетически чужеродную информацию.

В опытах in vitro и in vivo, проведенными в Санкт-Петербургсхом НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера под руководством д.м.н. Бнчуриной МЛ. установлено, что МИГИ-К ЛП обладает способностью ингибировать вирусы гриппа серотипов A (H1N1), А (№N2) и В, оказывать антитоксическое воздействие при инфецированни животных токсигенным штаммом вируса гриппа, стимулировать образование -¡»-интерферона даже в разведении водой 1:800, профилактическое и лечебное антивирусное действие в отношении вируса простого герпеса. Показана также способность МИГИ-К ЛП снижать инфекционный титр вируса ВИЧ-1.

Исследованиями Всесоюзного (ныне Украинского) научного центра радиационной медицины доказано, что МИГИ-К ЛП способствует выведению радионуклидов и тяжелых металлов из организма животных.

На основании результатов доклинических исследований Фармакологическим комитетом МЗ СССР был» принято решение (20.12.90, протокол № 19) о проведении широких клинических испытаний МИГИ-К ЛП.

Номенклатурной комиссией Фармакологического комитета на лекарственную форму МИГИ-К ЛП было утверждено название «Ларетен», которое далее по тексту будет применяться наряду с МИГИ-К ЛП. В соответствии с требованиями МЗ СССР к лекарственным средствам в НД на «Ларетен» в отличие от МИГИ-К ЛП внесены дополнительные показатели: подлинность, количество сухого остатка н сульфатной золы.

С целью определения области применения и эффективности лечебно-профнлактического действия, МИГИ-К ЛП и ({Ларетен» были испытаны в различных специализированных учреждениях России и Украины. В проведении этих исследований принимали участие: НИИ скорой помощи им. Склифосовского, детский санаторий «Бимлюк», Московский Онкологический НИИ им. ПА. Герцена, ГУ НИИ питания РАМН, Московский НИИ глазных болезней им. Гельмгольца РАМН, МОНИКИ им. Владимирского, Институт хирургии им. Вишневского, НИИ медико-биологических проблем, ЦНИИ спорта, ЦНИИ эпидемиологии Госкомэпиднадзора, Московский областной НИИ акушерства и гинекологии, поликлиническое отделение г. Анапы, санаторий-профилакторий Челябинского Госуниверситета я другие медицинсхне учреждения разного профиля.

На основании результатов клинических испытаний сделано заключение о том, что МИГИ-К ЛП может быть рекомендован в качестве пищевой Б АД повышающей общую резистентность и физическую выносливость организма, оказывающей иммуномодулирующее, атерогенное, гипотензивное, гипохолесгеринемическое действие, обладающей противовоспалительной и антивирусной активностью, способностью интенсифицировать процессы регенерации тканей, ускоряющей выздоровление при различных заболеваниях, благоприятно действующей в условиях повышенного радиационного фона и других антропогенных экологических нагрузок.

По результатам клинических испытаний МИГИ-К ЛП разработана и утверждена действующая НД (ТУ 15-16-28-94), а также информация для потребителей. В соответствии с требованиями Фармкомитета с целью разработки

Фармакопейной статьи предприятия (ФСП) на лекарственное средство Ларетен в течение 3 лет проводили исследования по стабильности 5 партий из черноморских и 5 партий из мяса беломорких мидий препарата.

Качество Ларетена оценивали по показателям и методикам, включенным в проект ФСП. Установлена стабильность Ларетена по основным показателям в течение 3 лет хранения при нерегулируемой температуре.

Результаты клинических испытаний и анализа препарата на стабильность позволили разработать и утвердить ФСП (решение Фармкомитета от 11.10.2000г. регистрационное удостоверение №001262/01-2002 от 03.04.2002г.), а также утвердить инструкцию по медицинскому применению Ларетена.

Исследованиями МФК, проведенными in vitro в институте иммунологии МЗ РФ, был установлен стимулирующий эффект на синтез белка и ДНК в эпителии кожи человека и механизм включения в иммунный ответ иммужжомпегентных клеток (рис 14, 15). У МФК отмечены два пика стимуляции синтеза белка и ДНК -при разведении в 6 раз, затем при разведении в 9 раз, но в меньшей степени, чем МИГИ-К ЛП, что еще раз подтверждает наше предположение о различиях в составе МИГИ-К ЛП и МФК, обусловленных разными технологическими режимами получения этих препаратов.

Разведения препарата

—~ Снят вина. —I— Саян* ЛШС

Рис. 1 4. Влияние МФК на синтез белка и ДНК в культурах эпителиальных «леток кожи человека

срддиш нмгаиои»ност> »пуврюцмщии_■

Т90 -fl __-

ras -ТОО -

are -eso -его -еоо «те seo

Квкграль 1/Ю 1/1ÜO 1/1* i/lOT l/IMf 1/Ш 1/104«

Разведения препарата

Ш38 Я1Д-ЛВС ШШ HU-DR

Рис. 15. Влияние МФК на экспрессию антигенов HLA класса I и П в культурах эпителия кожн - человека.

После изучения острой токсичности на модели экспериментальных животных, выполненного НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, по решению Фармкомитета были проведены клинические испытания МФК. Установлено, что МФК положительно влияет на клеточное и гуморальное звено иммунитета, а также на фагоцитарную активность нейтрофилов, способствует нормализации уровня ^ в при комплексной терапии вторичных и мму но дефицитных состояний, сопутствующих различным хроническим соматическим заболеваниям у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС, а также других контингентов больных с аналогичной патологией.

На основании результатов клинических испытаний утверждены ТУ 9662-08100472124-97 «Гидролизат из мидий пищевой для лечебно-профилактического применения (МФК-ЛП)».

В главе 7 «Модификация свойств мидийного гидролиза та» приведены результаты опытов по получению МИГИ-К ЛП калиевой формы и МИГИ-К ЯП, обогащенного витамином С.

Основываясь на данных о биологической активности калия, а также на некотором отрицательном отношении потребителей к наличию в МИГИ-К ЛП поваренной соли, образующейся в технологическом процессе, нами были проведены опыты по замене ИаОН, используемой при нейтрализации гндролизата, на КОН.

Результаты изучения радиозащитной и гемостимулирующей активности МИГИ-К ЛП К-формы на мышах-гибридах, получавших в течение 4-х дней перорально препарат в количестве 5 мл/кг массы тела, затем облученных дозой 6 Гр и подвергнутых забою через 8 суток после облучения, показали что МИГИ-К ЛП К-. формы обладает высокой биологической активностью. Длительное потребление гидролизата К-формы не вызывает каких-либо проявлений хронической токсичности, что подтверждено гистологическими исследованиями внутренних органов и тканей животных.

Мониторинговыми исследованиями, проводимыми ГУ НИИ питания РАМН, у значительной части населения России выявлен дефицит витамина С, являющегося одним из наиболее сильных антиоксидантов.

При изучении возможности усиления биологической активности МИГИ-К ЛП и МФК ЛП за счет внесения в них витамина С, установлено, что витамин С достаточно стабилен в процессе хранения образцов в течение 2,5 лет при нерегулируемой (комнатной) температуре, не оказывает влияния на физико-химические и органолептические показатели гидролизатов. В результате синергизма радиозащитная активность гидролизатов с добавлением витамина С в количестве 0,25-0,6% повышается в 1,5-2 раза (табл. 15).

Таблица 15

Влияние витамина С на радиозащктяую активность гидролизатов

Наименование образцов Масса селезенки, мг КОЭ/селезенку

МИГИ-К ЛП 44±1,8 3,4±0,5

МИГИ-К ЛП+витамин С 54,2±4,1

Витамин С 38,3±2,1 1,4±03

МФК-ЛП 39,3±2,8 2,0±03,

МФК-ЛП+витамин С 43,9±5,1 4,7±1,2

После проведения исследований, показавших отсутствие хронической токсичности, МИГИ-К ЛП + витамин С был испытан в отделении профпатологии МОНИКИ им. М,Ф. Владимирского на группе больных с метаболическими нарушениями, включающими гипертоническую болезнь, ИБС, сахарный диабет второго типа, нарушение липидного обмена в виде гиперлипидемии, нарушение функции печени (жировой гепатоз), объединенных в Х-си ядром, при сопутствующем диагнозе: панкреатит, дисбакгериоз кишечника, хронический холецистит. Установлено, что препарат оказывает положительный эффект на показатели липидного обмена, улучшает функцию печени при жировом гепатозе. Выявлено иммуномодулирующее действие препарата, проявляющееся главным образом в нормализации показателей клеточного звена иммунитета н фагоцитарной системы.

МИГИ-К ЛП + витамин С оказывает положительное действие на микрофлору кишечника за счет уменьшения патогенной микрофлоры и подавления избыточного роста бактерий. Влияния на присутствие бифидобактерий и лактобацилл не отмечено.

В работе изложены результаты опытов, проведенных АО «Парацельс» по успешному применению МИГИ-К ЛП и МИГИ-К ЛП К-формы в терапевтической косметологии для повышения лифтинга кожи, а также в качестве контактной среды при ультразвуковой терапии остеохондроза, кокартроза и гонартроза позвоночника, выполненных клиникой УВД, г. Рязань.

Рис, 16. Технологическая схема получения гидролизатов.

На основании проведенных исследований разработана комплексная схема получения Б АД способом кислотного гидролиза (рис. 16), предусматривающая предобработку сырья (мидий в створке) протеолнтическнм ферментом, а также модификацию свойств гидролизатов путем применения для нейтрализации КОН и внесения витамина С.

Результаты анализа сырья, определения биологической активности, доклинических и клинических испытаний мидийных гидролизатов послужили основанием для разработки основных требований к сырью, предназначенному для получения Б АД: сырье должно содержать белок и углеводы в соотношении 3:1-6:1, содержание липкдов не должно превышать 4-6 %, по количеству токсикантов (тяжелых металлов и хлорорганнческих соединений) соответствовать требованиям СанПиН 2,3.2.1078-01.

Этим требованиям соответствуют такие виды сырья, как гонады командорского кальмара, отходы разделки морского гребешка, мягкие ткани макры, мясо черноморской рапаны.

В главе 3 «Обоснование включения других видов сырья в технологический процесс производства гидролизатов» приведены результаты опытов по разработке режимов получения н характеристика гидролизатов из гонад кальмара, мяса черноморской рапаны, отходов разделки морского гребешка, мактры, из молок лососевых рыб и карпа.

Изучением возможности включения в технологический процесс производства гидролизатов других видов сырья преследовалась цель получения Б АД, которые по своей активности были бы близки активности МИГИ-К ЛП с учетом того, что в последние годы добыча мидий значительно сократилась.

Гидролиз указанных видов сырья осуществляли по технологической схеме, (рис. 16) разработанной для мидийных гидролизатов, изменяя отдельные параметры процесса.

При отработке режимов гидролиза ориентировались на такие показатели, как химический состав, выход гндролизата и его биологическая активность.

В ходе проведения опытов по разработке режимов получения гндролизата из гонад кальмара установили, что при содержании липндов в сырье выше 6% (в отдельных партиях гонад количество липидов превышало 10-12%) технологический процесс осложняется, поскольку образующаяся иа поверхности гидролизной массы жирная пленка затрудняет фильтрацию. Изменения отдельных параметров технологического процесса получения гндролизата из жирного сырья (повышение концентрации кислоты, варьирование продолжительности гидролиза) положительных результатов не дали. Наиболее оптимальные параметры процесса, позволяющие получать гидролизат из гонад кальмара с высокой биологической активностью - концентрация кислоты 7,0 % продолжительность гидролиза 16-18 час. Режимы получения гидролизатов из мяса рапаны, мактры, отходов разделки морского гребешка соответствовали режимам технологической инструкции на МИГИ-К ЛП.

Гидролнзаты из молок горбуши, полученные при тех же режимах, имели низкую биологическую активность, на уровне гндролизата из мяса азовских мидий, в которых соотношение белок: углеводы составляло 20:1. Поскольку содержание углеводов в молоках меньше 1%, с цепью повышения биологической активности

гидролизата изучалась возможность введения в гидролизную массу на различных стадиях технологического процесса угле во дсодержащих добавок - глютина, морской капусты, глюкозы или их смеси в количестве 4-10% к массе сырья. Продолжительность гидролиза варьировали от 18 до 24 час.

Таблица 16

Влияние введения угдеводсодержащих компонентов на выход и биологическую активность гидролизах из молок лососевых

Кол-во н вид добавки, */• Время гидролиза, час Выход гкнролюата, % Биологическая активность

масс» селезеюсн, мг КОЭ/еелезеяку

Молоки, контроль 22 71,6 50,2 ±2,4 2Д±0,3

Молоки, контроль 1S 70,0 46,7±2,0 2,0±0д

Глюкоза 5% 22 75,2 52,«2,1 3,0±0,3

Морская капуста 2% 22 74,3 39.9±2.0 2¿±0,3

Морская капуста 4% 22 77,2 45,4±4Д 2.5±0,4

Морская капуста 5% Глктм5% 24 82,6 61,ttt3,5 2,6±0,4

Плотин 5% 18 82,0 48,3±2,1 2¿±0,3

Морская капуста 10% 20 76,0 5 8,3 ±3,8

Контроль 46,012,3 l,í±0,3

Поскольку активность гидролизатов из молок горбуши, вне зависимости от углеводосодержащих добавок и продолжительности гидролиза, оставалась достаточно низкой, (табл. 16) посчитали возможным принять технологические режимы, применяемые для получения гидролизатов из других видов сырья - мидий, рапаны, отходов разделки гребешка, мактры. Эти же режимы приняты для получения гидролизата из молок карпа.

Анализ химического состава гидролизатов из различных видов сырья показал, что в них, так же как в исходном сырье, содержатся все заменимые и незаменимые аминокислоты, таурин, кроме гидролизатов из молок (табл. 17), ш-3 ПНЖК (табл. 18), биогенные макро- и микроэлементы. Количество тяжелых металлов и пестицидов не превышает допустимых уровней. Химический состав и биологическая активность гидролизатов стабильны при длительном хранении образцов.

Исследованиями in vitro и in vivo установлено, что гидролизаты из гонад кальмара (Кальмарин), мяса рапаны (Рапанин), отходов разделки морского гребешка (Гремарин), мактры и молок лососевых и карпа обладают гемостимулируюшей и радиопротекторной активностью, не оказывают отрицательного воздействия на внешний вид, массу тела животных и гистологию внутренних органов, восстанавливают лимфондную ткань и иммунитет, поврежденные введением животным циклофосфана, стимулируют синтез белка и ДНК, как это показано на примере кальмарнна (рис. 18,19).

Таблица 17

Амииоквслотный состав гидролиэатов, r/lOOr белка

Наименование я минокн слот ы МИГИ-К ЛИ Гремаркн Кальмарин Рапаннн Мактра Гндролизат 111 молок лососевых Гндролизат из молок карповых

Аспарагнновяя кислота 7,93 10,54 £,20 731 2,14 3,61 7,67

Треонин 4,83 ззо 3,17 3,76 331 5,73 3,28

Серии 5.47 4,26 3,97 3,89 3,26 4,05 539

Глутаминован кислота 13,07 12,90 837 12,12 10,95 5,66 734

Глицин 6,40 7,12 2,15 11,40 7,13 4,05 3,76

Алании 5Т44 5,54 3,41 4,68 3,54 ззз 4,90

Цнстнн 0,56 0,73 0,63 0,20 0,68 0,28 0,49

Вал «и 430 230 637 230 230 5,25 5,71

Метионня 2^55 2,00 1,74 2,04 2,10 0,94 1,25

Июлей цнн 3,79 2,05 2,90 2,44 2,16 134 2,08

Лейцин 6,28 5,11 4,41 5,34 4,91 3,13 430

Тирозин 231 2,20 1,84 1,91 2,28 135 3,16

Феннлаланвк 339 2,07 2,61 231 2,09 1,48 1.71

JThjhk 8,41 339 5,26 6,19 3,59 4,24 7,22

Гистндин 1.19 1,02 1,33 1,25 1,12 1,00 1,19

Аргинин из 7/11 2,83 5,93 7,41 13,67 4,87

Лролин 3,88 3,82 234 3,95 3,85 3,29 3,20

Та урин 4,01 3,91 53 2,30 935 - -

Сумма: 85?14 80,07 65,03 7932 ' 72,47 62,60 67,72

Таблица 18

Соацпмии« основных жирных кислот, % от суммы

Кислота МИГИ-КЛП Рапанян Кальмарин Гндролнэат ю молок лососевых Гнлроднмт и молок карпа

С 16:0 17,24 3,7 3,8 18,8 32,13

С I6;Ictri№7a>5a>3 6,65 3,5 3,4 13,4 4,24

С 18:0 4,16 2,1 - 16,0 8^2

С 18:l<B9<o7tü5íoj 13,73 27,8 27,8 2,5 41,36

С 20:1<в9«7«5 6,63 18J 1S.0 18,0 11,18

С 18;2«6»3 1,73 . 3,2 - 0¿ 0,66

С 20:2о>6 0,36 7,0 7,0 1,6 0,54

С20:4«6ФЗ 1,06 10,2 - - М7

С20:5аЗ 6,02 16,0 26,0 5,6 -

С22-.Ш 1,68 8,0 12,0 U -

мононенасыпсккые ЗМ2 46,6 49Л 33,? 61,02

о «ляненасыщенные 17,68 30J 45,0 9,0 2,67

касыгаеяные 28,59 1М 3,0 54,8 36¿7

КшАшх. (тыончм)

7 i ■ i'

в-4 -

3 -2 -

1 . ■_... ■ ■■■,-1.1

о I" |-1 ■ ' I ■ ' '■ )-1 I I I i ...... 1'......1

Контроль 1 % i 4 0'«Т в • 10

Разведения првтрята —— Смит 6*лк* 1 ' Сшм ДНК

Рис. 16, Влияние Кальмарииа на синтез белка и ДНК в культурах эпителиальных клеток кожи

человека

На основании проведенных исследований разработана и утверждена НД на БАДКальмарин (ТУ 9283-004-00038155-01), БАД Рапанин СГУ 9283-089-004721-2499), получены Регистрационные удостоверения Минздрава РФ. На БАД Гремарнн разработан проект НД.

Ср«джя икт» нсивяостк флуор*ец*нции

72Л -а ■ '

Х,лрмь 1/Ю 1/ЧМ 1/1Т 1/1И 1/1«« 1/1И 1/1011

Развсдеяия препарата

Н ки-лвс Е2Ш миь-вк

Рис. 17. Влияние Кальмарина на экспрессию антигенов НЬА класса I и П в культурах эпителия

кожи человека.

Проведенные исследования позволяют заключить, что солянокислый гидролиз является универсальным способом получения Б АД из гидробионтов и отходов их разделки, что подтверждают результаты «Сравнительной характеристики гидролизатов из различных видов сырья», приведенные в главе 9,

Гидролизаш из исследованных видов сырья по содержанию сухих веществ, общего азота, липидов и минеральных веществ (табл. 19), близки МИГИ-К ЛП. В значительной мере это достигается концентрированием гидролизатов до плотности 1,175-1,185 г/см3.

Заметные колебания наблюдаются в содержание меланоидинов: от 30Д±4,8мг/мл вгидролизате из молок лососевых до 50,5 ± 8,5мг/мл в Кальмарине.

Радиопротекторная активность гидролизатов, полученных из различного сырья, колеблется от 2,9±0,20 у гидролизата из молок лососевых, до 7,0±0,90 у Кальмарина. Гемости мупирующая активность гидролизатов находится в пределах от 2,$>±0,3 % до 6,6±1,1 %, наиболее низкая отмечена у гидролизатов из молок лососевых и МФК ЛП, наиболее высокая - у МИГИ-К ЛП + витамин С. Из образцов, которые были проанализированы, наиболее высокая антистрессовая активность выявлена у рапанина и кальмарина (табл. 19).

Гндролизаты - это многокомпонентные системы, поэтому точно и однозначно определить, какие вещества в их составе отвечают за тот или иной вил биологической активности, весьма проблематично. Если исходить из теории о том, что основополагающим фактором всех патологий являются процессы свободно-радикального окисления и перекисного окисления липидов (ПОЛ), инициируемые неблагоприятными внешними воздействиями на организм, в тл, облучением, которому подвергались животные в экспериментах, то радиопротекторную и гемостимулирующую активность гидролизатов можно, по-видимому, соотнести с наличием а их составе таких компонентов, как аминокислоты, таурин, дипептнд карнозин, ПНЖК, биогенные макро- и микроэлементы, поскольку известно, что под воздействием указанных компонентов происходит обрыв реакции свободно-радикального окисления н ПОЛ, восстановление разрушенных структур клетки и активация ферментов антирадикальной защиты организма (Ярцев Е.И. и др., 1975, Болдырев А.А., 1998).

Таблица 19

Химический состав и биологическая активность гидролизатов на различит видов сырья_

Наимеиовакпе обрашов Химический состав, % Сум»» МСЛаИО-каинов, мг/мя Биологическая активность

Суш« Общи II »ют Лнпиды Минера Л Lltl.lt В-ВЯ Ради опротектория я, КОЭ/селезсику Гемостшмулнру-ющан, регнь-ула-ННТЫ, % Антистрессовая, масса тимуса, мг

МИГИ-К ЛП 32,4710,84 1,9610,1 2 0,210,05 16,5Ю,2 42,9515,30 4,4510,05 3,2010,21 32,6012,8

МИГИ-К ЛП+вит. С 31,81 ±0,45 1,8610,1 5 0,210,05 15,310,2 44,7114,91 4,9010,8 6,611,1 не опред.

МИГИ-К ЛП КОН-форма 32,5110,92 1,8710,1 3 0,110,09 16,0810,2 39,5516,4 4,1010,5 5,410.12 не опред.

Кальмарин 32,6010,42 2,0410,3 3 0,210,0« 16,511,1 50,518,50 7,010,90 4,310.4 45,014,0

Рапаннн 29,011,10 2,010,20 0,310,09 16,511,8 40,812,60 4,910,4 3.6610,12 51,013,0

Гремарнн 28,411,65 1.85Ю.1 0 0,210,07 16,212,1 40,911,62 6,010,5 4.610.3 не опред.

МФКЛП 29,111,20 1,7110,1 6 0,110,09 17,2±3,5 41,7218.32 3,810,4 2,910,3 не опред.

Гидролизат из мактры 29,011,40 1,8210,3 0 0,110,07 17,411,2 40.0415,30 5,2 ±0,3 3,810,1 не опред.

Гидролизат из молок карпа 31,211,10 2,0310,3 0,110,03 15,510,7 42,1012,5 6,510,3 4,810,4 32,70±1,9

Гидролизат из молок лососевых 30,612,0 2,0110,2 0,210,09 15,911,6 30,214,8 2,910,2 2,910,4 33,112,0

Гемостимулирующая активность может быть обусловлена наличием в гидролизатах, помимо перечисленных выше компонентов, Fe, Zn, Ni, Cu, Se.

Гипотензивный и атерогенный эффект в определенной степени может быть связан с наличием в гидролизатах таурнна, ПНЖК, К, Са, Mg.

Гнпохолестеринемическое действие гидролизатов может обеспечиваться присутствием ю-3 ПНЖК, ионами Сг, К и других компонентов (Гичев Ю.Ю., Гичев Ю.П., 2001). По некоторым данным (Choi Y.S. et al, 1989) ш-3 ПНЖК способны подавлять активность ГМГ-КоА редуктазы, одного из ключевых ферментов синтеза холестерина. Изомеры лииолевой кислоты (Bartsotelli Е,, Berra В., 1994) ингибируют развитие эпидермальной и преджелудочной опухолей, включаются в состав клеточных липидов и тем самым создают защиту клеток от активных кислородных метаболитов (АКМ). Возможно, это в какой-то мере объясняет увеличение продолжительности жизни облученных животных до гибели от развития злокачественных опухолей.

Известно, что широким спектром биологического действия обладают меланоидины, поэтому нами была предпринята попытка соотнести биологическую активность гидролизатов с содержанием в них меланоидинов.

Объектами исследования служили образцы гидролизатов МИГИ-К ЛП, приготовленные из черноморских и беломорских мидий естественной популяции и марикультуры как наиболее изученные. Для сравнения анализировали гидролизаты, приготовленные из рыбы, мускула морского гребешка и пишевые соусы промышленной выработки (соевый, китайский, вьетнамский, корейский), которые близки по химическому составу и органолептическим показателям, но отличаются от МИГИ-К ЛП величиной антирадикальной активности (табл. 20).

При изучении фракционного состава меланоидинов гель-фильтрацией на колонках с TSK-Toypearle HW-40 установили, что меланоидины МИГИ-К ЛП подразделяются на три основные фракции, две из которых представлены высокомолекулярными веществами с молекулярными массами свыше 10000 Da, а третья фракция - с молекулярными массами около 1000 Da. В остальных образцах гидролизатов обнаружено по одной • две фракции окрашенных веществ, которые по скорости элюции с колонки, т.е. по молекулярным массам, значительно отличаются от меланоидинов МИГИ-К ЛП.

Таблица 20

Наименование образка Антйряднкальная активность, ДДФПГ

Соевый 0,023

Корейский 0,026

Китайский 0,090

Вьетнамский ОД 32

Рыбяый 0,064

№ Гребешка 0,141

МИГИ-К 0.326

МИГИ-К ЛП:

на черноморских мидий 0,400± 0,060

из беломорских мидий 0,41010,065

Поскольку содержание высокомолекулярных веществ (рис. 20) в первой и второй фракциях относительно невелико, при последующих анализах меланоидинов

МИГИ-К ЛП эти две фракции были объединены (фракция I). Содержание меланошшнов в МИГИ-К ЛП составляет 11,92±1,58 % к количеству сухих веществ, при этом меланоидины высокомолекулярной фракции содержатся в количестве

Рнс. 20 Профиль згоцин миамймых гмд(ч>лнэатоа с Т$К-геял Н'Л'-43

ИК - спектральный анализ показал, что высокомолекулярная фракция меланоидинов представлена ассоциатами низкомолекулярных веществ ароматического и гетероциклического характера (рис. 21)- В составе меланоидинов Х-МС-СФ- анализом обнаружено присутствие фенолов, виразиновых, пиридиновых и фурановых структур,

4000 400 см"1

Рис. 21 ИК-спекгры первой и второй фракции меланоидинов МИГИ-К,

Антноксидантная активность МИГИ-К ЛП, определенная полярографическим методом, ниже активности а-токоферола, но сравнима с антиоксидантной активностью «стандартных» меланоидинов. При этом антноксидантная активность низкомолекулярной фракции несколько выше, чем высокомолекулярной (табл. 21).

При сопоставлении данных, характеризующих содержание меланоидинов в гидролизатах с их биологической активностью, четкой зависимости не выявлено,

хотя следует отметить, что количество меланоидинов оказывает определенное влияние на радиопротекторные свойства гидролизатоз.

Таблица 21

Антиоксидантнак активность меланоидинов

Антиоксидант Потребление кислорода, нг-атомов Ог/мин

а-токоферол 0,33

«Стандартный» меланоидин 0,60

меланоидины МИГИ-К ЛП

фракция 1 0,69

фракция II 0,76

Контроль (без антиоксиданта) 5,58

Радиопротекторная и гемостимулирующая активность - предположительно две конкурирующие величины - там, где высокая радиопротекторная активность (гидролизат из мактры, гремарин, рапанин, МФК ЛП, гидролизах из молок карпа, МИГИ-К ЛП, кальмарин), гемостимулирующая активность относительно низкая, и

1. Гидролизат из молок лососевых

2. МИГИ-К ЛПК-форма

3. Гидролиз« из мактры

4. Гремарин

5. Рапанин

6. МФКЛП

7. Гидролизат из молок карпа

8. МИГИ-К ЛП

9. МИГИ-К ЛП +• витамин С

10. Кальмарин

наоборот (рис. 22).

КЧ Я* М 4Л 4LH 4» «¿1 Я.Ч

CWpWBMHt м*п*ницин«- MTVNn ■Рикопрвтеггорнм акшим^ть. КОЗДчяектсг ОГсмопниулируцщай % вшншя рспкумит*

Рис,22. Зависимость рааиопротскторной и гемостимулнруюшей активности гидролизам™ от

содержания меланоидинов

В МИГИ-К ЛП содержатся низкомолекулярные азотистые соединения, относящиеся к группе биогенных компонентов: олигопептиды, таурин, карнозин, (3-аланин и другие, не обнаруженные в образцах из растительного сырья (табл. 22).

Анализ олигопептидов методом гельхроматографии и Х-МС-СФ показал, что пептиды МИГИ-К ЛП содержат от 2 до б аминокислотных остатков, с преобладанием ди- и трипептидов. Содержание пептидов составляет в сумме около lO'W/мл гидролизата. Дипептид карнозин известен как антиоксидант, иммуномодулятор, радиопротектор и канцеростатик (Морозов В.Г. и др., 2002).

В составе липидов МИГИ-К ЛП, количество которых не превышает 0,ЗУо, обнаружено присутствие алкоксиглицеридов и эфиров липидов, обладающих радиопротекторными, антибактериальными и иммуиомодулирующими свойствами. (Ether Lipids, 1983).

Таким образом, наличие в МИГИ-К ЛП таких составляющих, как меланоидиньЕ, ПНЖК, низкомолекулярные азотсодержащие компоненты, в т.ч. заменимые и незаменимые аминокислоты, таурин, олнгопептнды, в т.ч. карнознн, биогенные макро- и микроэлементы, обеспечивает высокую биологическую активность гндролизата. Этот вывод можно отнести и к проявлению активности гидролизатов из других видов беспозвоночных и отходов их разделки, на том основании, что химический состав исходного сырья по содержанию основных компонентов близок химическому составу мяса мидий, и гидролизатов -соответственно МИГИ-К ЛП.

Таблица 22.

Низ комоле куля рвые азотсодержащие соединения в составе гидролизатов, ______ ___м г/100 мг азота _

Соединение МИГИ-К ЛП т мялий Соус

черноморских беломорских китайский вьетнамский соевый

Фосфосерин 0,012 0,040 - -

Таурин 0,195 0,253 -

фосфоэтансдамии 0,030 0Г047 - 0,038

Аспарагиновая кислота 2,773 4,780 4,729 6,900 2,120

Треонин 2,288 1,072 2,370 0,680 0.868

Серии 2,302 1,126 2,211 0,750 1,056

Глутаминовая кислота 5,357 5,621 9,080 1.460 2,603

Саркозии 0,078 0,079 - 0,012 0,015

Глицин 2,934 3,988 1,300 4.150 1,156

Алании 0,642 0,767 1,473 0,390 1,711

Валив 1,072 1,349 0,630 1,320 0,454

Цистин 0,050 0,050 - - .

Мстионш 0,883 1,103 0,930 0,950 1,268

Цистатяонин 0,010 0,020 - . -

Изолейшш 0,660 0,824 0,610 1,071 0,341

Лейцнн 2,511 1,138 1,040 1.191 0,635

Тирозин 0,416 0.717 0,210 0,750 0,124

Фенилаяанин 2,408 1.120 0,771 1,290 2,844

О-алания 0,064 0,067 - - -

р-аминоизо-масляная 0,100 0,074 0,100 0,110 -

Ц-амкномасляная 0,263 0,176 0,060 0,120 0,031

Этанояамкн 0,110 0,121 0,050 0,014 0,018

Орнитин 0,062 0,079 0,020 0,017 0,063

Лнэин 1,634 2,243 1,810 0,510 1,507

Гистидии 0,296 0,411 0,320 0,440 -

Карвсзин 0,201 0,163 - - -

Аргинин 1,544 2,035 0,820 2,090 0,292

Оксипролнн 0,568 0,677 0,640 1,040 0.616

Про лин 1,379 1,138 0,750 2,380 3,802

В свете решения задач, изложенных в «Концепции государственной политики в области здорового питания» актуальной задачей является создание пищевой продукции массового потребления с направленным биологическим действием, обогащенной аминокислотами, ПНЖК, минеральными веществами за счет

широкого применения БАД. О перспективности применения гидролизатов, в частности МИГИ-К ЛП, в качестве компонента различных пищевых продуктов с целью придания им лечебно-профилактических свойств свидетельствуют результаты опытов, представленные в главе 10 «Гидролнзаты как компоненты пищевых продуктов лечебно-профилактического применения».

Благодаря тому, что гидролизаты имеют форму жидкости, они хорошо сочетаются с различными пищевыми компонентами, что подтверждено результатами разработки рецептур таких продуктов, как «Ветчина диетическая», «Паштеты рыбные», «Крем икорный», «Хлебцы Богородские», безалкогольные напитки.

, Основу «Ветчины диетической» составляет рыбный фарт, в рецептуру вводятся гонады кальмара, характеризующиеся высокнм содержанием ПНЖК, и МИГИ-К ЛП. В готовом продукте содержится более 17% белка, около 7% липидов и 2,6% минеральных веществ. Более 40% от суммы жирных кислот приходится на долю эйкозапенгае новой, докозагексаеновой и арахидоновой ш-3 ПНЖК.

Продукт отличается высокнм содержанием незаменимых аминокислот -валина, лизина, метионина + цистина, треонина (табл. 23), т.е. тех аминокислот, которые превалируют в МИГИ-К ЛП и гонадах кальмара.

Таблица 23

Амннокислотный скор «Ветчины диетической»_

Незаменимые аминокислоты Содержание в продукте Шкала Ф АО/ВОЗ % к шкале

Изолейцин 3,22 4,0 31

Лейцин 6,60 7,0 94

Метионин+цисгин 3,77 3,5 108

Фекилаланни+тироэ ин 6,02 6,0 100

Треонин 4,09 4,0 102

Валин 7,90 5,0 158

Лизин 7,85 5,5 143

С целью расширения ассортимента пищевой продукции с лечебно-профилактическими свойствами нами разработаны рецептуры паштетов рыбных с внесением в них МИГИ-К ЛП и гидролизатов модифицированной формы, которые вводили в рецептуры в количестве 5 нли 7%. Паштеты, приготовленные на основе рыбного фарша, содержали 15-17% белка к около 5% жира. Результаты опытов на животных показали, что паштеты обладают высокой биологической активностью (табл. 24), не проявляют токсичности и не оказывают негативного воздействия на морфологию и гистологию внутренних органов животных.

При разработке рецептуры «Крема икорного» ориентировались на возможность использования для его приготовления икры минтая 4 и 5 степени зрелости, поскольку с увеличением степени зрелости в икре повышается содержание всех незаменимых аминокислот и ПНЖК (Лав Р.М, 1974), Введение в рецептуру МИГИ-К ЛП обогащает продукт макро- и микроэлементами и придает хорошие органолептические показатели. Утверждена НД на «Крем икорный питательный для лечебно-профилактичекого применения», ТУ 9266-088-0472124-98.

Совместно с сотрудниками ФГНПП «Прибор» разработана рецептура изделий из круп сухих брикетированных «Хлебцы Богородские» с введением в их состав МИГИ-К ЛП, утверждены и согласованы с МЗ РФ изменения к ТУ 9196-002-

0750426-98, выпушена партия продукта. Совместно с фирмой «Ост-Аква» разработана и утверждена НД на несколько видов безалкогольных напитков, с введением в рецептуру МИГИ-К ЛП.

Таблица 24

Биологическая активность паштетов

Л» п/п Группа Масс* селезенки, мг коэ/ Селезенку

1 Контроль, паштет 39,2 ±1.7 1,9*0,3

2 Паштет + МИГИ-К ЛП 5% 45,4*1,9 5,5*0,6

3 Паштет + МИГИ-К ЛП 7% 45,2±1.8 4,9*0,5

4 Контроль(виварный рацион) 38, ¡¡±2,1 1,8*0,2

5 Паштет + вит С, 1% 37,7*3,0 1,6*0,2

6 Паштет + МИГИ-К ЛП 5% + вит. С, 1 % 45,3*2,0 4,7*0,4

7 Паштет + МИГИ-К ЛП (К-форма) 5% 41,б±гЗ 2,6*0,3

8 МИГИ-К ЛП 45,8*2,0 5,4*0,5

9 МИГИ-К ЛП (К-форма) 42.2*1,8 3,2±0,4

Таблица 25

Раднозащитные и гемостимулнруюшее действие «Хлебцев Богородских»,

№ п/п Группа Масса селезенки, мг КОЭ/селезенку

1. Хлебцы №1 47,9±2,1 2,8±0,3

2. Хлебцы №2 49,8 ±2^ 4,1 ±0,5

3. Хлебцы контроль 45,2 ±2,0 2,0 ±0,2

4. Препарат МИГИ-К ЛП 51,0±2,4 4,4±0,5

5. Контроль (виварный рацион) 41,1*2,1 1,7*0,2

Таблица 26

Радиозащитное и гемостимулирующее действие безалкогольных напитков.

№ п/п Группа Масса селезенки, мг КОЭ/селезенку

1. «Байкал» с МИГИ-К ЛП 54,1-2,4 6.2-0,4

2, «Цитрусовый» с МИГИ-К ЛП 53,2-2,7 5,7-0,4

3, «Байкал», контроль 45,0-2,1 1,9-0,2

4. «Цитрусовый», контроль 44,3-1,9 1.Е-0.2

5. Препарат МИГИ-К ЛП 56,4-2,8 7,1-0,5

Данные определения биологической активности (табл. 24-26) разработанных продуктов обосновывают перспективность их применения для массового потребления в зонах с неблагоприятной окружающей средой, с повышенным радиационным фоном и на предприятиях с вредными условиями труда.

В главе 11 «Решение проблемы комплексного использования продуктов гидролиза» приведены результаты использования побочного продукта гидролиза -плотного остатка в качестве кормовой Б АД.

В осадке, в зависимости от вида исходного сырья и влажности (степени отделения гидролизата), содержится около 2% азотистых веществ, 10-16% липидов, 6-10% минеральных веществ (табл. 27).

Таблица 27

Химический состав осадков, образующихся при гидролизе различных видов сырья, %

№ п/п Вид сырья Содержание

Вооы Общего зота Лнпнаов Минеральных в-в

1. Гонады кальмара 48,9-50,0 2,16-2,52 14,2-16.5 6,84-10,3

2. Мактра 51,2-54,0 2,05-2,29 4.5-6,0 5,0-8,0

3. Мидии 34,5-57,3 1,3-2,8 9,9-17,8 11,8-22,8

4. Отходы разделки

морского гребешка 50,1-56,2 2,50-2,61 3,6-4,4 73-15,6

5. Молоки лососевых 48,2-51,3 2,25-3,0 4,7-4,9 3,2-3,6

б. Ралана 42,2-48,4 2,15-2.45 4,5-5,0 9.4-10,1

Наиболее изученным является осадок - побочный продукт производства МИГИ-К ЛП, получивший товарное название Мидиум.

Биологическими опытами на крысах, проведенными МГУ, было установлено, что введение Мидиума в рационы значительно повышает выживаемость животных при облучении сублетальной дозой 7 Гр, оказывает общее стимулирующее воздействие и увеличивает продолжительность жизни после облучения.

На базе зверосовхозов «Родники» и «Салтыковский» Московской области проведены опыты по применению Мидиума в качестве кормовой БАД на большом поголовье (более 5 тыс. голов) норок. Установлено, что введение в рационы норок Мидиума в количестве 2-4 г на одну голову в сутки повышает выживаемость щенков н живую массу молодняка, способствует получению более качественных шкурок по таким показателям, как длина, ширина, площадь, масса, густота волосяного покрова и коэффициент использования полуфабриката.

Аналогичные результаты были получены и в опытах на голубых песцах.

Рис, 23. Схема комплексного использования продуктов гидролиза

Разработана и утверждена НД, наставления по применению Мидиума в качестве кормовой БАД в пушном звероводстве.

Установлено, что введение Мидиума в количестве 10% в стандартные корма мальков радужной форели и молоди при выращивании товарной рыбы оказывает положительное влияние на индивидуальный и среднесуточный прирост массы и - выживаемость рыбы, способствует заживлению некротических повреждений кожных покровов и плавников. Отмечена тенденция увеличения содержания липидов как в теле молоди, так и в мышечной ткани товарной форели.

На основании проведенных исследований разработаны основные направления комплексного использования продуктов гидролиза (рис. 23).

Выводы.

1. Теоретически и на основании собственных исследований показана уникальность химического состава и обоснована целесообразность использования гндробионтов, в частности, беспозвоночных и отходов их разделки, для получения биологически активных пищевых добавок широкого спектра действия.

2. Разработана универсальная технологическая схема солянокислого гидролиза для получения БАД из белок и углеводо-содержащего сырья водного происхождения.

3. Обоснованы требования к сырью, предназначенному для получения БАД и режимы гидролиза применительно к определенному виду сырья, с учетом его химического состава.

4. Обоснована и экспериментально подтверждена целесообразность модификации технологических режимов получения мидийного шдролизата, предназначенного для лечебно-профилактического применения (МИШ-К ЛП) и в качестве лечебного препарата «Ларетен». Установлена оптимальная продолжительность гидролиза (18-20 часов) и созревания не менее 7 суток при нерегулируемой температуре, определен оптимум рН 5,4-5,6 нейтрализации и продолжительность хранения гидролизата 2 года вне зависимости от температурных условий.

5. Разработана модификация способа производства мидийного гидролизата, основанная на ферментативно-кислстной обработке сырья, что позволяет использовать для гидролиза мидии охлажденные и мороженные в створке. Отделение мяса от створки достигается путем обработки сырья протеолитическим ферментом протосубтилииом ГЗХ, добавляемым из расчета 0,4-0,5% к сырью. Экспериментально обоснованы основные технологические параметры получения ферментативно-кислотного гидролизата (МФК-ЛП).

6. Научно обоснована и экспериментально подтверждена возможность модификации свойств гидролизатов путем применения для нейтрализации КОН и введения в гидролизат витамина С, в количестве, обеспечивающем суточную потребность в нем с учетом дозы потребления гидролизата, рекомендуемой медиками.

7. Установлено, что гидролизаты из гидробионтов и отходов их разделки не токсичны, не оказывают мутагенного действия и обладают, хотя и в различной степени, раяиопротекторной, гемоетимулирующей я антистрессовой активностью.

8. Показана канцеростатичесхая, антивирусная, гепатопротекторная, гипотензивная и атерогенная активность гидрапизатов из гидробионтов и отходов их разделки, а также способность выводить из организма радионуклиды и тяжелые металлы, оказывать положительное влияние на рост фибробластов, синтез ДНК и белка, на механизм включения в иммунный ответ иммунокомпетентных клеток.

9. Показано, что кислотные гидролизаты являются многокомпонентными системами, содержащими в своем составе заменимые и незаменимые аминокислоты, олнгопептиды, <о-3 ПНЖК, биогенные макро- н микроэлементы, в том числе селен, биогенные компоненты (таурик, карнозин), а также продукты реакции Майяра (меланоидины), обладающие широким спектром биологической активности - антимикробной, гепариноподобной, ранозаживляющей. Доказано, что биологическая активность гкдрояизатов обеспечивается всем комплексом веществ, входящих в их состав,

Ю.Установлен фракционный состав меланоидинов в гндролизатах: в первую фракцию входят компоненты с молекулярными массами свыше 10 тыс. Оа, во вторую * ннзкомолекулярные вещества с молекулярными массами около 1 тыс. Оа. Содержание меланоидинов составляет не менее 10% к сухим веществам гидролизата, или от 30,2 ± 4,8 до 50,5 ± 8,5мг/мл,

11 .Показано, . что гидролизаты из гидробионтов могут применяться самостоятельно как БАД, и как компоненты рецептур пищевых продуктов лечебно-профилактического назначения для массового потребления в регионах с неблагополучными экологическими условиями, в том числе в зонах с повышенным радиационным фоном.

12.Разработан способ рационального использования побочных продуктов кислотного гидролиза (плотный остаток), которые являются эффективными биологически активными кормовыми добавками.

13.Раэработанная технология получения пищевых и кормовых БАД из гидробионтов и отходов их разделки, а также рекомендации по их применению, позволяют решить проблему максимального сохранения природного сырья, охраны окружающей среды и здоровья населения, что дает большой социальный и экономический эффект, о чем свидетельствует промышленный выпуск МИГИ-К ЛП и МФК ЛП рядом предприятий, а также спрос потребителей этих продуктов.

14.На основании проведенных исследований разработана, утверждена и сертифицирована НД на сырьё, БАД и пищевые продукты лечебно-профилактического применения.

По материалам диссертации опубликованы следующие основные работы:

1. Рехина Н.И., Терентьев В.А., Новикова М.В. И Др. / Меланоидин-осодержащнй препарат МИГИ-К из мидий и некоторые его характеристики. // Биологические науки,-1991,-Х°10. -С. 47-51.

2. Рехина Н.И., Новикова MB, и др. / Гидрсшизат из мидий как средство повышающее радиорезистентность организма II Тезисы докладов Всесоюзной конференции «Проблемы ликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС в агропромышленном производстве - 5 лет спустя: итоги, проблемы, перспективы», Т. 2, Обнинск, 1991, - С. 53.

3. Руднев М.И., Малюк В.И., Атаманюк Н.П., Рехина Н.И., Новикова М.В. и др. / Влияние мидийного гидролизата МИГИ-K на содержание и распределение Csl37 в организме крыс И Сб. «Проблемы радиационной медицины», Киев, «Здоровье», 1992,- С. П4-И8.

4. Рехина Н.И., Новикова М.В. и др. / Гидролизат из мидий как биологически ценный продукт // Материалы республиканской научной конференции «Эколого-гигиенические проблемы питания населения»,Киев. 1992.-С. 104,

5. Рейзис А.Р., Дрондина А.К., Никитина Т.С., Вязгина Е.В., Рехина Н.И., Новикова М.В. и др. / Клиническая эффективность и интерферон -стимулирующее действие нового отечественного препарата Ларетен (вирамид) при вирусных гепатитах у детей I! Материалы Научно практической конференции «Заболевания органов пищеварения у детей», Саратов, 1993. - С. 121.

6. Рехина Н.И., Новикова М.В. и др. / Ферментированный субстрат как основа для получения пищевого биологически активного продукта нз мидий // Мат. Международной Научно-практической конференции «Прикладная биотехнология на пороге XX! века», 13-15.04.95. Москва. - С. 115.

7. Рейзис А.Р., Дрондина А.К., Никитина Т,С„ Вязгнна Е.В., Рехина Н.И., Новикова М.В. и др. / Иммуномодулирующее действие и клиническая эффективность мидийного гидролизата МИГИ-K ЛП (Ларетен) при вирусных гепатитах у детей // II Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», 10-15,04.95. Москва.-С. 191.

8. Рехина Н.И., Новикова М.В. и др. / МИГИ-K ЛП - пищевой продукт лечебно -профилактического применения // там же - С. 243.

9. Рехина Н.И., Новикова. М.В. и др. / Пищевой продукт из мидий для лечебно -профилактического применения // «Рыбное хозяйство».- 1995.- №4,- С. 53-56,

10. Ре хина H.H., Новикова М.В. и др. / Эффективность использования мидийного гидролизата (МИГИ -К ЛП) при радиационных воздействиях // Материалы Международной научно- технической конференции «Птца, экология, человек», 04-06.12.95. - Москва. - С. 150.

11.Новикова М.В. Технология производства пищевого продукта из отходов разделки кальмара// «Новые технологии». -1996.- №1. - С. 14-15.

12.Новикова М.В. / Сборы технологических проб И Сб. «Промысловые аспекты биологии командорских кальмаров и рыб склонсообществ западной части Берингова моря», М., 1996. - С. 19.

П.Новикова М.В., Беседина Т.В. / Технологические исследования гонад командорского кальмара П Сб. «Промысловые аспекты биологии командорских кальмаров и рыб склонсообществ западной части Берингова моря» М., 1996.-С. 138-142.

|4.Рехина Н.И., Новикова М.В., Беседина Т.В. / Клинические испытания МИГИ-К ЛП (обзор) И Труды ВНИРО «Технология рыбных продуктов» М., 1997. - С. 93-99.

15.Лагунов Л.Л., Рехина Н.И., Новикова М.В. и др. /Пищевой продукт из мидий для лечебно-профилактических целей // Труды ВНИРО «Технология рыбных продуктов», М., 1997. - С.87-92.

16.Новикова М.В., Рехина H.H. и др. t Биологически активные компоненты гидролизатов разного происхождения // Труды ВНИРО «Технология рыбных продуктов», М., 1997. - С. 100-108.

17.Рехина Н.И., Новикова М.В. и др. / Меланоидинообразование в процессе гидролиза бе л ко во- углеводного сырья Н Труды ВНИРО «Технология рыбных продуктов», М., 1997. - С. 108-122.

18.Пархоменко И.М., Платонов AT., Новикова М.В. и др. / Экспресс-метод определения антиокислительной активности радиопротекторов и других биологически активных веществ природного происхождения // III съезд по радиационным исследованиям, тезисы докладов, 14-17.10., Москва - Пущино. 1997, т. 2.'С. 205-206.

19.Новикова М.В. и др. / Мидийный гидролизат (МИГИ-K ЛП) как биокорректор И Тезисы докладов и сообщений Первого международного симпозиума «Натуральные биокорректоры; питание, здоровье, экология», Москва. 2426.11.97. • С. 18-19.

20.Беседина Т.В., Коняхина Л.Н., Рехина RH., Новикова М.В. и др. / Мидиум -биологически активная кормовая добавка // Труды ВНИРО «Технология рыбных Продуктов», 1997. - С. 189-198.

21.Горенков Р.В., Любченко П.Н., Новикова М.В. и др. / Гепатопротекторный эффект препарата из морских моллюсков (МИГИ-K ЛП) у рабочих с токсическими повреждениями печени // Тезисы докладов и сообщений Первого международного симпозиума «Натуральные биокорректоры: питание, здоровье, экология», Москва, 24-26.11,97. - С. 37-38.

22.Новикова М.В., Рехина Н.И., Беседина Т.В. и др. / Пищевой лечебно-профилактический продукт из мидий как антиоксидант и радиопротектор // Материалы Ш Международного симпозиума «Медицина и охрана здоровья», 16-19.09.97., Тюмень. - С. 14-17.

23.Новикова М.В., Рехина Н.И. и др. / Пищевая биологически активная добавка из мидий // Medicina altera. -1998, апрель. - С.26-28.

24.Новикова М.В., Рехина Н.И., Беседина Т.В. и др. / Пищевая биологически активная добавка из мидий /7 «Вопросы питания».- 1998,- №!. - С, 10-13.

25.Новикова М.В., Рехина Н.И. и др. / Противолучевая эффективность мндийного гидролизата (МИГИ-K ЛП) // Тезисы докладов Первой Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской экологии», Орел, 1998.-С.8-9.

26.Новикова М.В. / Лечебно-профилактические продукты из гидробионтов // «Рыба и море продукты». -1999,- Xsl. - С35.

27.Новикова М.В. и др. / Биологически активная пищевая добавка из гонад кальмара // Материалы 3 Международной научно-технической конференции «Пища, экология, человек», Москва, 1999. - С. 57-58,

28.Новнкова М.В. и Др. / Использование биотехнологии с целью комплексной переработки гидробионтов и получения биологически активных пищевых добавок // Там же - С. 58-59.

29.Телегина Т.А., Новикова M.B, I Меланоидины мидийного гидропизата: содержание и антиокислительная активность //Там же - С. 59-60.

30.Горенков Р.В., Новикова М.В., Беседина Т.В. / Опыт использования пищевой биологически активной добавки из мидий в клинике профпатологии // Гастробюллетень, СПб 2000.- Вып. 1-2. - С.23.

31.Новикова М.В. и др. / Применение мидийного гидролизата и мидиума в качестве биологически активных добавок в корм норкам и голубым песцам // Тез. Всероссийской научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». Щелково. 2000. -С300-302.

32.Новикова М.В. и др. / Лечебно-профилактические продукты из гидробионтов И Тез. докладов научно-технического симпозиума «Современные средства воспроизводства и использования водных ресурсов». СПб. 2000. Т.З. - С.49-50,

33.Novikova M.V. et al. / Biotechnology in development of new food additives for medical - prophylactic usage // Emahrungs Forschung. -2000. - V. 45, №3. -P. 196197;

34.Новикова M.B. и др. / Лечебно-профилактические продукты и биологически активные пищевые добавки из гидробионтов и отходов их разделки // Труды международного форума по проблемам науки, техники и образования. Москва. 3-7.12.01. Т.З. - С.122-124.

35.Новикова М.В. и др. / Биологически активные добавки из гидробионтов // «Ваше питание» №2,2001. - С.34.

36.Новикова М.В. и др. ««Биологически активные пищевые добавки из отходов разделки беспозвоночных» // Материалы III Международной конференции «Повышение качества рыбной продукции - стратегия развития рыбопереработки в XXI веке». 3-8.09.01. Калининград. -

С.99-100

37.Рехина Н.И., Новикова М.В. и др. / Секрет здоровья и успеха - в мидийном гидролизате d «Наука и технологии в промышленности»,- 2001.- №1. - С.46,

38.Новнкова М.В. и др. / Биологически активная добавка из черноморской рапаны// «Рыбное хозяйство» №1,2002. - С.53-54,

39.Новикова МБ. / Гидробионты и отходы их разделки как перспективное сырье для получения биологически активных добавок // В кн. «Материалы первой международной конференции», «Морские прибрежные экосистемы:водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки».2б-30.08.2002 г. Москва - Галицыно. Изд-во ВНИРО, 2003. - С. 161-164.

40.Абрамова Л.С., Новикова М,В. / Гидролизаты как компоненты пищевых продуктов лечебно-профилактического применения Н. «Материалы первой международной конференции», «Морские прибрежные экосистемы;водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки». 2630.08.2002 г. Москва - Голицыно. Изд-во ВНИРО, 2003. - С,73.

41 .Новикова MB. и др. / Применение побочных продуктов гидролиза в качестве кормовых Б АД И Там же - С.85.

42.Хлебников В.И., Новикова М.В., Дмитриенко С.Ю. / Потребительские свойства мясных кулинарных изделий, в состав которых входит кальмарин // Тезисы международного симпозиума «Федеральный и региональный аспекты

государственной политики в области здорового питания», 2002 г. Кемерово -С.302-303,

43.Хлебников В.И., Новикова М.В., Дмитриенко С.Ю. / Потребительские свойства мясных кулинарных изделий, выработанных с мидийным гидролизатом // Тезисы международного симпозиума «Федеральный и региональный аспекты государственной политики в области здорового питания», 2002 г. Кемерово - C.303-30S.

44.Новикова М.В. / Морепродукты а диетотерапии» // Энциклопедия традиционной медицины, 2002,Изд-во «Сопричастность» - С,372-379.

45.Авторское свидетельство №565425 от 21 марта 1977г. / Способ производства пищевой зернистой икры и подобных продуктов // Новикова М.В. и другие, указанные в описании.

46.Авторское свидетельство №1080269 от 15 ноября 1983 г. / Способ получения белкового продукта из сырья водного происхождения // Новикова М.В, и другие, указанные в описании.

47.Патент РФ №2098106 / Способ лечения гепатитов Н Рейзис А.Р., Дрондина А.К., Никитина Т.С., Вязгина Е.В., Рехина H.H., Новикова М.В., БесединаТ.В. и др.

48.Патент РФ №2097982 / Кормовая добавка // Беседина Т.В., Новикова М.В., Квартникова Е.Г., Коняхина Л.Н. и др.

49.Патент РФ №2183414/ Биологически активная добавка и способ ее получения // Новикова М.В., Беседина Т.В., Чимиров Ю.И.

50.Патент РФ №2043728 ( Продукт из мяса мидий // Рехина Н.И., Новикова М.В., Коноплянников А.Г.

51.Патент РФ №2017439 / Продукт из мяса мидий и способ его получения И Лагунов ЛЛ., Рехина Н.И., Новикова М.В., Беседина Т.В. и др.

52.Патент РФ №2093040 / Продукт из белок- и углеводосодержавдего сырья водного происхождения и способ его получения И Рехина Н.И., Буга СЛ., Королев А.Н., Коноплянников А.Г., Новикова М.В. и др.

53.Патент РФ №2193332 / Диетический продукт и способ его получения // Новикова М.В., Абрамова Л.С., Чимиров Ю.И.

54.Патент РФ №2 [92149 / Биологически активная добавка и способ ее получения II Новикова М.В, Беседина Т.В., Чимиров ЮЛ.

55.3аявка №2002103025/13 / Диетичесхий продукт II Новикова М.В., Чимиров Ю.И., Родина Т.В. Приоритет от 07,02.2002. Решение о выдаче патента or 10.06.2003

От автора

Выражаю искреннюю благодарность руководству 8НИРО: директору х.г.н. Котеневу Борису Николаевичу, зам. директора к.х.н. Абрамовой Любови Сергеевне, зав. отделом д.т.н. проф. ПодкорытовоЙ Антонине Владимировне за веру в мой научный потенциал, помощь и поддержку в выполнении и оформлении работы.

Сердечную благодарность выражаю всем, кто был лричастен к выполнению настоящих исследований: к.т.н. Рехиной Н.И., к.т.н. Бес единой Т.В., к.т.н. Терентьеву В.А., к.т.н. Чимирову Ю.И..,) Королеву А. Щ ПаренковоЙ Л.Ю., к.т.н. Шевцову В.К., к.б.н. Телегиной Т.А., а также к.т.н. Гершунской В.В„ Родиной Т.В., Зеленихиной Г.С., Борку Д.А., принимавших участие в оформлении работы.

Искреннюю благодарность выражаю всем сотрудникам НИИ и медицинских учреждений, принимавших непосредственное участие в проведении доклинических и клинических испытаний БАД, а также всем, кто способствовал практической реализации результатов исследований - ген. директору АО «Биопрогресс» Албулову А.И., ген. директору ФДГУП «Гипрорыбфлот-Экос» Бойкову Ю.А., д.с./х.н Кваргниковой Е.Г. (НИИПЗК).

Подп. в печать 06.08.03 Объем 3.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ ВНИРО, 107140, Москва, 8. Красносельская, 17