автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Разработка биотехнологий получения иммобилизованных дрожжей и их применения в бродильных производствах

я

На правое рукописи

ОСС-С'-

СТЕПАНОВ НИКОЛАЙ АЛЕКСЕЕВИЧ

РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИЙ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ДРОЖЖЕЙ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ В БРОДИЛЬНЫХ ПРОИЗВОДСТВАХ

05.18 07 - Биотехнология пищевых продуктов (пивобезалкогольная,

спиртовая и винодельческая промышленности) 05 18 10 — Технология чая, табака и биологически активных веществ и субтропических культур

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва - 2007

003070965

Работа выполнена на кафедре «Биотехнология» в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московском государственном университете пищевых производств» и на кафедре «Химическая Этимология» Химического факультета Московского Государственного Университета им М.В Ломоносова

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Грачева Ирина Михайловна

кандидат технических наук, ведущий научный сотрудник Ефременко Елена Николаевна

Официальные оппоненты, доктор технических наук, доцент

Карпенко Дмитрий Валерьевич кандидат технических наук Морозов Анатолий Михайлович

Ведущая организация ГНУ Всероссийский научно-

исследовательский институт пищевой биотехнологии Россельхозакадемии

Защита состоится «29» мая 2007 г. в 12 00 часов в ауд Ш-101 на заседании Диссертационного Совета Д 212.148.04 при ГОУ ВПО Московский государственный университет пищевых производств по адресу. 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д 11

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО МГУПП

Отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенных печатью учреждения, просим направлять по адресу 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д 11, ГОУ ВПО МГУПП, ученому секретарю Совета.

Автореферат разослан «27» апреля 2007 г.

Ученый секретарь .

Диссертационного Совета, д.т н , доц Крюкова Е В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Во всех отраслях пищевой промышленности все большее значение приобретает проблема снижения себестоимости выпускаемой продукции с сохранением ее высокого качества и конкурентоспособности на рынке. Эта же проблема затрагивает и винодельческое производство

В России сегодня жесткие требования предъявляются к качеству вина, производимому внутри страны и импортируемому из-за рубежа Разработка новых технологий виноделия при использовании инновационных подходов, позволяющих увеличить объем производимой продукции при сохранении ее высокого качества является актуальным решением современных задач виноделия

Согласно известным публикациям, применение иммобилизованных клеток дрожжей во многих отраслях виноделия может обеспечивать повышение рентабельности производства и улучшение качества готовой продукции (Taillandier, 1994; Саришвили, 1996, Fumi, 1998, Silva, 2002, Tsakiris, 2004) Иммобилизованные дрожжевые клетки отличаются от свободных клеток повышенной устойчивостью к различным неблагоприятным условиям ведения процесса и возможностью их применения для получения готового продукта с более высоким содержанием этанола, в том числе в режиме непрерывных технологий, а также позволяют существенно упростить отделение готового продукта от биомассы дрожжей

Наибольшую популярность при разработке препаратов на основе иммобилизованных клеток дрожжей для виноделия в качестве носителя приобрел гель альгината кальция, несмотря на то, что его структура, как правило, характеризуется низкой механической прочностью в присутствии компонентов вина (фосфат-ионов и органических кислот) Кроме того, установлено, что в подобных гелевых системах массообменные процессы внутри массы геля существенно затруднены вследствие мелкопористой структуры матрицы, что неизменно приводит к постепенному отмиранию клеток во внутренних слоях гранул биокатализатора и снижению его продуктивности

Другой наиболее широко распространенной проблемой в виноделии при использовании иммобилизованных препаратов является накопление свободных клеток в вине в процессе брожения, вызывающее помутнение готового продукта и ухудшение его качества Существуют различные предложения по преодолению накопления свободных клеток в сбраживаемой среде (Klein, 1992, Divies, 1995, Yokotsuka, 1997), однако, одним из наиболее эффективных подходов к преодолению этой проблемы является использование новых носителей Так, применение для этих целей криогеля

поливинилового спирта (ПВС), обладающего макропористой структурой, высокими прочностными и массообменными характеристиками наряду с высокой химической стабильностью, представляется перспективным решением указанных проблем

Криогели ПВС формируются в результате замораживания концентрированных растворов ПВС, их выдерживания в замороженном состоянии в течение определенного времени и последующего оттаивания (Лозинский, 2002) В основе образования криогеля лежит структурирование полимера за счет образования множественных водородных связей Очевидно, что для клеток необходима оптимизация условий проведения криоиммобилизации и установление оптимального состава биокатализатора (концентрации клеток и полимера в грануле) для обеспечения высокой жизнеспособности и метаболической активности иммобилизованных клеток

В связи с этим, актуальной представляется разработка новой технологии получения высокоэффективного иммобилизованного биокатализатора с использованием криогеля ПВС в качестве носителя, позволяющей свести к минимуму накопление свободных клеток в среде при высокой продуктивности и стабильности функционирования иммобилизованных клеток

Исследование характеристик разработанного биокатализатора и условий его возможного применения в различных областях виноделия являются актуальными, так как направлены на повышение качества готового продукта при одновременном упрощении технологического процесса

Целью данной работы являлась разработка технологии получения нового высокоэффективного биокатализатора на основе клеток дрожжей, иммобилизованных в криогель ПВС, и исследование его свойств при использовании в производстве различных спиртосодержащих напитков

В ходе работы решались следующие основные задачи:

• выбор условий подготовки клеток дрожжей к криоиммобилизации на основе показателей метаболической активности клеток и их биохимических характеристик,

• оптимизация состава иммобилизованного биокатализатора по концентрации клеток и полимера, а также выбор условий формирования гранул биокатализатора,

• применение разработанного иммобилизованного биокатализатора в процессе шампанизации вина и исследование его свойств (продуктивность, операционная стабильность и стабильность при хранении),

• определение и сравнение основных характеристик готовой продукции (концентрации спирта, сахара, органических кислот и ароматических

веществ), производимой с использованием разработанного препарата иммобилизованных клеток и свободных клеток дрожжей,

• выяснение возможности применения разработанного биокатализатора на основе иммобилизованных в криогель ПВС клеток дрожжей для кислотопонижения вина, устранения винных недобродов и получения вина по красному и белому методам,

• оценка возможности использования разработанного иммобилизованного биокатализатора для получения биоэтанола из различных отходов сельского хозяйства и промышленности, в том числе и пищевой

Научная новизна работы. Получен новый биокатализатор на основе иммобилизованных в криогель ПВС клеток дрожжей для получения спиртосодержащих напитков Новизна разработки подтверждена заявкой на патент РФ на изобретение способа получения иммобилизованного биокатализатора для получения различных спиртосодержащих напитков (заявка № 2006113768, приоритет от 24 04 2006).

Показана важность выбора условий наращивания клеток для их иммобилизации в криогель ПВС. Установлено влияние концентрации клеток, носителя и условий формирования гранул биокатализатора на его конечные характеристики, в частности, пористость матрицы носителя и бродильную активность иммобилизованных клеток

Впервые показана возможность и перспективность использования одного и того же разработанного метода для получения биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток различных штаммов дрожжей, в частности, для применения в технологиях получения различных спиртосодержащих напитков, а также для получения биоэтанола из гидролизатов различных отходов промышленности и сельскохозяйственных культур

Практическая значимость работы. Разработанный биокатализатор перспективен, с точки зрения его эффективного использования для получения различных спиртосодержащих напитков вместо традиционно применяемых для этих целей свободных клеток дрожжей

Установлена возможность многократного использования биокатализатора при шампанизации вина по классической технологии, что может способствовать усовершенствованию существующего биотехнологического процесса с технологической, экологической и экономической точек зрения Разработан лабораторный технологический регламент на получение иммобилизованного биокатапизатора для шампанизации вина

Показано существенное улучшение ароматических характеристик красных, белых и игристых вин, приготовленных с применением иммобилизованных клеток, что было подтверждено высокими дегустационными оценками от экспертов производственной дегустационной комиссии отдела химии и биохимии вина Национального института винограда и вина «Магарач» (г Ялта, АР Крым)

Показана возможность успешного применения дрожжевых клеток, иммобилизованных по разработанному способу, в технологии производства биоспирта из отходов пищевых производств с выходом более 90% от теоретически возможного

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на следующих Международных конференциях и конгрессах Межд конференции «От фундаментальной науки - к новым технологиям Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок Экологически безопасные технологии» (Тверь, Россия, 2002), XII (Vitoria, Spain, 2004), XIII (Kingston, Canada, 2005), XIV Intern Workshop on Bioencapsulation (Lausanna, Switzerland, 2006), 2-ом (2003), 3-ем (2005), 4-ом Москов Межд конгрессах «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2007); Всерос симпозиуме с межд участием «Биотехнология микробов» (Москва, Россия, 2004), 9-ой и 10-ой Межд пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - Наука XXI века" (Пущино, 2005, 2006); Intern Congress on Bioprocessing in Food Production (Patras, Greece, 2006)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 3 статьи в журналах, 4 статьи в сборниках статей международных конференций, 7 тезисов докладов на международных конференциях и конгрессах, подана 1 заявка на патент РФ на изобретение

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 175 стр и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, содержащего 265 ссылок, и приложения Работа содержит 37 таблиц и 32 рисунка

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Экспериментальная часть

Объекты исследования. При проведении шампанизации вина в работе использовался штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae Шампанская-39, при сбраживании виноградных соков по красному и белому методам использовали следующие штаммы дрожжей S vim Каберне-5, Массандра-3,

Кокур-3, Ленинградская, Кислотопонижающая, 47-К. В экспериментах по устранению недобродов и биологическому кислотопонижению вина, а также для получения биоэтанола из отходов промышленности и сельского хозяйства использовались дрожжи S cerevisiae phv bayanus Все штаммы дрожжей были получены из коллекции Отраслевой Лаборатории Технологии Игристых вин ВНИИПБиВП (г Москва) и коллекции микроорганизмов НИВиВ "Магарач" (г Ялта, АР Крым, Украина)

Методы исследования. В работе для накопления биомассы клеток использовалась полусинтетическая среда (pH 5,6), спиртосодержащие среды на основе виноматериала (pH 3,0-7,0) и среда на основе солодового сусла (pH 5,2) Культивирование клеток осуществлялось при 15-30°С в аэробных условиях при постоянном перемешивании (220 об/мин) на термостатируемой качалке IRC-1-U Adolf Kunner G Apparaebau (Швейцария)

Подсчет общего количества клеток дрожжей в образцах вина проводили в счетной камере Горяева, используя световой бинокулярный микроскоп XS 910 (Корея) Жизнеспособность и метаболическую активность иммобилизованных клеток контролировали, определяя концентрацию внутриклеточного АТФ люциферин-люциферазным методом, используя реагент фирмы «Люмтек» (Россия) и люминометр Microluminometr 3560 New Honzons Diagnostics Co (США) Получение биокатализатора на основе дрожжей, иммобилизованных в криогель ПВС (марка 16/1, «Acros», Бельгия), осуществляли двумя методами 1) в лаборатории криохимии биополимеров ИНЭОС РАН, согласно ранее известной методике (Мартыненко, 2004), используя криогрануляционную колонну, заполненную гидрофобной жидкостью, 2) суспензию клеток в растворе ПВС распределяли по различным формам, используя дозатор, и замораживали при -20°С в воздушной среде, выдерживали в замороженном состоянии 14-18 ч, а затем размораживали при +2 - +8°С

Для шампанизации вина использовали белые сухие виноматериалы, которые смешивали с тиражным ликером для получения тиражной смеси с концентрацией сахарозы 22-24 г/л Брожение проводили в шампанских бутылках объемом 0,375 л или флаконах для анаэробных культур объемом 15 мл в анаэробных условиях при 15°С в течение 28-35 сут Для получения белых столовых вин использовали виноградный сок с концентрацией Сахаров 215 г/л, полученный из одной партии винограда сорта «Рислинг» Брожение проводили в специальных колбах с газоотводными трубками объемом 0,2 л при 20°С в течение 12 сут Для приготовления красных вин в работе использовали виноградный сок с концентрацией Сахаров 270 г/л, приготовленный из одной партии винограда сортов «Каберне-Совиньон» и «Саперави» Брожение вели в анаэробных условиях при 25°С в течение 20

сут Для кислотопонижения использовали виноградный сок, приготовленный из винограда сорта «Рислинг», содержащего 8,42 г/л яблочной кислоты, а также крыжовниковый сок, содержащий 15,1 г/л яблочной кислоты Процесс вели при 20°С в течение 7 сут. При проведении дображивания вина использовали виноматериал, содержащий 10,5 об % и 13,5 об % спирта Брожение вели в течение 20 сут при 20°С

Для измерения давления ССЬ в бутылках с шампанским использовали афрометр Определение жирнокислотного состава липидов дрожжевых клеток осуществляли методом газожидкостной хроматографии на приборе ЛХМ-8 МД Для определения массовой концентрации кислот использовали метод прямого титрования. Определение массовой доли сернистой кислоты проводили методом йодометрического титрования Определение органических кислот проводили методом жидкостной хроматографии на приборе «Цвет - 3006» с кондуктометрическим детектором. Определение концентрации различных Сахаров проводили методом газожидкостной хроматографии на приборе «КОНТРОН» с ультрафиолетовым детектором Для определения концентрации глюкозы в образцах вина использовали глюкозидазный метод с применением стандартного реагента фирмы «Импакт» (Россия) Определение спиртов проводили на газовом хроматографе «Цвет 3700» с пламенно-ионизационным детектором Анализ ароматических веществ осуществляли с помощью масс-спектрометрии на приборе НР-5988 А (США) и газовой хроматографии, используя прибор НР-5710 (США) с пламенно-ионизационным детектором Микрофотографии гранул криогеля ПВС, получали, используя сканирующий электронный микроскоп Jeol JSM-S300LV (Япония) и световой микроскоп Intel Play QX3 (США) Ферментативная обработка различных отходов промышленности и сельского хозяйства, использовавшихся для получения биоэтанола, проводилась на кафедре химической энзимологии Химического факультета МГУ им М В. Ломоносова

При обработке всех экспериментальных данных рассчитывали средние значения и значения стандартного отклонения Все эксперименты проводились не менее чем в трех повторностях

Результаты и их обсуждение

1. Разработка способа получения иммобилизованного биокатализатора на основе дрожжевых клеток, иммобилизованных в криогель ПВС для шампанизации вина, и исследование его свойств

Иммобилизация дрожжей в криогель ПВС, согласно известному способу (Рис 1 А), включает в себя стадии накопления биомассы до глубокой

стационарной фазы роста (72ч) на виноматериале при 15°С, приготовление суспензии клеток в растворе полимера, ее замораживание в среде гидрофобной жидкости и размораживание гранул. Эти условия, как было установлено, негативно влияют на жизнеспособность иммобилизованных клеток Полученный при этом биокатализатор (Рис 1А) характеризуется бродильной активностью, существенно сниженной по сравнению со свободными клетками дрожжей, что приводит к необходимости дополнительной активации иммобилизованных клеток и последующей их обработки ауторегуляторным фактором (1-1 (Батраков, 1993) для устранения активного почкования иммобилизованных клеток В связи с этим в работе необходимо было подобрать такие условия подготовки и иммобилизации клеток дрожжей в криогель ПВС, при которых обеспечивалась бы максимальная жизнеспособность и метаболическая активность дрожжей в сформированном биокатализаторе

1.1. Выбор условий подготовки клеток дрожжей к иммобилизации в криогель ПВС

Разработка технологии получения нового высокоэффективного биокатализатора состояла из нескольких стадий (Рис 2)

На первой стадии была исследована кинетика роста клеток дрожжей на питательных средах разного состава и с разными значениями рН Основное внимание при культивировании клеток, которое проводили в аэробных условиях при разной температуре, уделялось величине удельной скорости роста клеток и максимальному выходу биомассы (Табл 1)

Таблица 1 Кинетические параметры, характеризующие рост дрожжевых клеток при _____различных условиях культивирования_

Температура "Среда Ц> ч"' Максимальное накопление биомассы, г/л

15°С А 0,11 ±0,01 6,3±0,6 6,5 ± 0,3

Б 0,12 ±0,02 5,8±0,8 6,6 ± 0,4

В 0,10 ±0,01 6,9±0,6 6,4 ± 0,3

Г 0,14 ± 0,02 4,9±0,8 15,0 ±0,5

20°С А 0,15 ±0,02 4,60 ± 0,3 6,8 ± 0,2

Б 0,16 ±0,03 4,30 ±0,1 6,9 ± 0,3

В 0,15 ±0,02 4,60 ± 0,3 7,0 ± 0,2

Г 0,18 ±0,01 3,85 ± 0,2 15,4 ±0,4

30°С А 0,22 ± 0,03 3,15 ±0,2 6,8 ±0,1

Б 0,19 ±0,01 3,65 ± 0,3 7,0 ± 0,2

В 0,22 ± 0,02 3,15 ±0,2 7,1 ± 0,2

Г 0,28 ±0,01 2,50 ± 0,1 15,4 ±0,3

а-Виноматериал с рН 3,0 (А), рН 5,0 (Б) и рН 7,0 (В), полусинтетическая среда рН 5,6 (Г)

А

Б

Рис. 1 Принципиальная схема получения биокатализатора на основе криогеля ПВС А) по ранее известному методу (Мартыненко, 2004), Б) по разработанному в работе методу

Рис 2 Общая схема проведения экспериментальных исследований в диссертационной

работе

Было установлено, что максимальные удельная скорость роста и уровень накопления биомассы дрожжей были получены на питательной полусинтетической среде (Рис 1Б).

Далее проверялось влияние примененных условий культивирования дрожжей (состава среды, температуры и длительности процесса) на сбраживание свободными клетками виноматериала при 15°С в течение 4 недель (Рис 3) Было показано, что бродильная активность дрожжей, выращенных на полусинтетической среде, практически не отличается от активности дрожжей, выращенных на виноматериале (Рис 3) Однако, анализ биохимических характеристик этих клеток выявил существующие между ними различия Было установлено, что удельная концентрация трегалозы в дрожжевых клетках, выращенных на полусинтетической среде почти на 120% и 30% выше, чем в клетках, культивирование которых проводили на виноматериале и солодовом сусле, соответственно (Табл 2) А это значит, что клетки, выращенные на полусинтетической среде лучше были подготовлены к преодолению стрессовой ситуации, возникающей при их криоиммобилизации, так как известно, что трегалоза в дрожжах выполняет роль протектора целостности клеток при неблагоприятных условиях культивирования

Брожение, сут Брожение, сут

Рис. 3. Динамика накопления С02 в процессе сбраживания виноматериала дрожжевыми клетками, предварительно выращенными при 30°С (а) и 20°С (б) Символы О и Т - обозначают дрожжевые клетки, культивировавшиеся на виноматериале с рН 5,0, рН 7,0 и рН 3,0, соответственно, символ V обозначает клетки, выращенные на полусинтетической среде (рН 5,6)

Высокий уровень внутриклеточного АТФ в дрожжевых клетках, выращенных на полусинтетической среде (Табл 2), также свидетельствовал о более благоприятном энергетическом статусе этих клеток, с точки зрения их последующей иммобилизации, в сравнении с клетками, выращенными на виноматериале Также было установлено, что величина удельной концентрации внутриклеточного АТФ имеет максимум в конце

логарифмической фазы роста. Эту фазу сочли оптимальной для иммобилизации клеток

Таблица 2. Содержание трегалозы и удельная концентрация внутриклеточного АТФ в дрожжах, выращенных на различных питательных средах в аэробных условиях

Среда для культивирования дрожжей Время культивирования, ч Трегалоза, мг/г сух биомассы [АТФ] х 10"|и моль/мг клеток

Виноматериал рН 3,0 24 72 0,116 0,119 7,8 1,7

Полусинтетическая среда рН 5,6 24 0,259 16,2

Солодовое сусло рН 5,2 24 0,197 15,7

Анализ жирнокислотного состава липидов биомассы дрожжей показал, что уровень ненасыщенности жирных кислот в клетках, выращенных при 20°С в 2 раза выше, чем в клетках, выросших при 30°С (Табл 3)

Таблица 3. Жирнокислотный состав дрожжевой биомассы, полученной при культивировании в различных условиях _

Жирные кислоты (длина углеродной цепи и количество двойных связей) Содержание в %

20°С 30°С

'А Б В Г А Б В Г

X С 10 0-14 0 3,99 0,63 3,99 0,88 1,22 1,17 14,69 12,87

С 14 1 0,30 0,18 0,30 0,42 0,08 н/о 0,42 н/о

С 15 0 0,64 0,34 0,65 ОДЗ 0 30 0,44 н/о 4,92

С 160 9,32 7,68 9,47 6,39 26,66 28,48 27,16 24,80

С 16 1 41,91 36,74 42,56 55,00 26,11 22,97 8,72 10,89

С 17 0 0,20 0,07 н/о 0,18 0,11 н/о н/о 1,16

С 18 0 3,20 4,22 3,46 2,53 25,12 25,34 19,02 6,51

С 18 1 38,74 48,8 37,98 33,51 19,51 21,20 16,30 19,19

£С 18 2-18 3 0,44 0,36 0,37 0,11 0,26 0,30 9,35 6,16

I С 20-23 1,26 0,98 1,22 0,75 0,63 0,1 4,34 13,5

Сумма ненасыщенных кислот 82,65 86,67 82,43 89,71 46,47 44,52 37,96 42,32

а) Виноматериал рН 3,0 (А), 5,0 (Б) и 7,0 (В), полусинтетическая среда рН 5,6 (Г), н/о - не обнаружено

Известно, что высокий общий уровень ненасыщенности мембранных липидов гарантирует поддержание проницаемости и текучести мембран, что, в свою очередь, обеспечивает хорошую адаптацию микроорганизмов к воздействию низких температур Последний факт крайне важен для последующей криоиммобилизации клеток и, поэтому температура 20°С была

принята как оптимальная для культивирования дрожжей перед иммобилизацией в криогель ПВС.

Ь2. Оптимизация процесса формирования биокатализатора

Следующая стадия разработки технологии получения биокатализатора состояла в оптимизации состава биокатализатора и условий проведения иммобилизации {Рис. 2). Ранее известный метод включения клеток дрожжей в криогель ПВС (Рис. 5 А) предполагал формирование гранул биокатализатора в среде гидрофобной жидкости (петролейного эфира), нежелательной для применения на производстве из-за своей пожароопасное™, а также токсичности для клеток. В связи с этим было решено изменить условия иммобилизации и проводить ее на воздухе. Такой подход был апробирован впервые.

С помощью -электронной микроскопии было проведено сравнительное исследование образцов иммобилизованных биокатализаторов, сформированных двумя разными способами (Рис. 4). Было показано, что макропоры носителя, полученного формированием на воздухе, имели существенно больший размер (до 50 мкм), чем поры носителя, сформированного по ранее известной методике (до 20 мкм) в среде гидрофобного растворителя. Такое изменение в структуре нового биокатализатора должно было способствовать улучшению массообменных процессов внутри гранул.

Рис. 4. Микрофотографии поверхности криогеяя ПВС, формирование которого проводилось в среде гидрофобной жидкости (Л) н в воздушной среде (Б).

В предварительных экспериментах было установлено, что введение 11ВС в гранулы в концентрации менее 10% приводит к формированию криогеля с пониженной механической прочностью, в результате чего

происходит его деформация и, как следствие этого, наблюдается выход клеток из матрицы носителя.

В работе была проварьирована концентрация полимера в составе получаемого биокатализатора в интервале от 10 до 17% с целью получения механически прочной матрицы с хорошими массообменными характеристи ками.

Ранее было показано, что при снижении концентрации клеток в биокатализаторе до 2% наблюдается снижение числа свободных клеток, накапливающихся в вине к концу брожения (Мартыненкой 200!). Однако, известно, что большая концентрация клеток обеспечивает более высокие скорости процесса брожения, при этом органолептические показатели готовой продукции существенно зависят от концентрации клеток, участвующих в процессе брожения (Ыдег-ВеЫг, 2004). В связи с чтим, концентрацию клеток в б и о катал и затор с варьировали от 2 до 10% (масс.). Оптимизацию состава биокатализатора проводили с помощью математического аппарата, соответствующего аддитивно-решетчатому методу описания объекта.

В качестве основных оптимизируемых функций при выборе соотношений компонентов биокатализатора были выбраны давление углекислого газа (Рис. 5А) и концентрация свободных клеток (Рис. 5Б), которые накапливались при шампанизации вина классическим методом. Исходя из составленного ортогонально-решетчатого плана, были рассчитаны оценки эффектов уровней каждого фактора данного процесса. Полученные зависимости целевых функций от исследуемых факторов на варьируемых уровнях фафичсски представлены иа Рис. 5,

Рис. 5. Зависимость давления ССь (Л) и концентрации свободных клеток (Б), накапливающихся в шампанском, от исходных концентраций дрожжевых кусток и полимера и составе биокачичизатора при его использовании в процессе сбраживания виноматернала в бутылках.

Было установлено, что оптимальной для формирования биокатализатора, применяемого для шампанизации вина, однозначно, является 10%-ная концентрация ПВС Окончательный вывод о том, что 10% концентрация клеток дрожжей в составе иммобилизованного препарата является лучшей, был сделан после дополнительных исследований характеристик получаемого шампанского (Табл 4)

Таблица 4. Характеристики шампанского, приготовленного в бутылках, с применением дрожжей, иммобилизованных в криогель ПВС____

Исходная концентрация клеток в биокатализаторе, % Давление СОг, кПа Свободные клетки, кл/мл вина Сахароза, г/л Спирт, об% Титруемая кислотность, г/л Дегустационная оценка

2а 450 (3,5 ± 0,3)х103 1,6 11,30 7,4 н/и

26 500 (3,1 ± 0,3)х103 1,4 11,60 7,3 8,70

106 540 (3,4 ± 0,4)х103 1,1 11,85 7,2 8,75

Свободные клетки 430 (1,0 ± 0,1)х107 1,8 11,0 7,4 8,60

а-Биокатализатор, сформированный по ранее известной методике, б-Биокатализатор, полученный по методике, разработанной в данной работе н/и-не исследовали

Анализ содержания основных ароматических веществ в шампанском, полученном с помощью свободных и иммобилизованных дрожжей (Табл 5), показал, что концентрации веществ, высокое содержание которых негативно отражается на качестве готового продукта (метанол, пропанол, изобутанол, уксусная кислота), были ниже на 10-17% по сравнению с шампанским, приготовленным с помощью свободных клеток дрожжей

Таблица 5. Содержание различных ароматических веществ в шампанском, приготовленном с использованием свободных и иммобилизованных клеток дрожжей

Вещества, мг/л Исходный виноматериал Шампанское

Свободные дрожжи Иммобилизованные дрожжи

Уксусный альдегид 673,7 549,1 500

Этилацетат 20,2 21,4 22,6

Метанол 22,4 24,71 14,11

Пропанол 9,8 9,8 8,0

Изобутанол 17,3 17,8 16,3

Изоамиловый спирт 141,2 122,6 107,4

Уксусная кислота 1207,9 838,2 688,2

Бутиленгликоль 1445,5 843 679

Фенилэтиловый спирт 152,1 126,5 81,9

Глицерин 16174,5 13603,8 12300

1.3. Исследование свойств разработанного биокатализатора и его применение для непрерывной шампанизации вина

Исследование операционной стабильности биокатализатора при многократном его использовании в процессе шампанизации вина в бутылках, а также стабильности биокаталитических характеристик иммобилизованных клеток после их длительного хранения в замороженном виде позволило установить после экстраполяции полученных данных (Рис 6), что расчетный период полуинактивации полученного биокатализатора составляет 360 сут, а период полуинактивации при хранении ~6,5 лет Экспериментальные данные по бродильной активности были подтверждены результатами исследований концентрации внутриклеточного АТФ в клетках иммобилизованных дрожжей

о

^ 300

Т|д ~ 80 мес

40 60 >0 100 Время броженяя, сут

Время хранения, мес

Рис. 6. Кинетика накопления давления углекислого газа в бутылках а) при многократном использовании биокатализатора, б) при использовании биокатализатора после его длительного хранения в замороженном виде Стрелками показана замена сброженной среды на свежую того же состава

Известно, что начальная концентрация клеток дрожжей в процессе вторичной ферментации определяет скорость процесса брожения, поэтому было исследовано влияние концентрации иммобилизованного биокатализатора в среде на скорость сбраживания виноматериала в бутылках (Рис 7а) Конечный уровень давления С02 во всех образцах независимо от исходной концентрации иммобилизованных клеток был практически одинаковым (-500 кПа) после 28 сут брожения Однако, максимальная удельная скорость накопления этанола в сбраживаемом вине была установлена при введении в среду 18 г/л биокатализатора (Рис 76)

Именно использование этой концентрации позволило далее установить, что при проведении непрерывной шампанизации вина (Рис 8) продуктивность 1 г биокатализатора составляет 120 мл/сут за исследованный период времени, что в 4 раз больше, чем при шампанизации вина в бутылках (30 мл/сут) При этом качество шампанского, получаемого в непрерывном режиме, по основным характеристикам практически (Табл 6) не отличалось

от шампанского, приготовленного в бутылках с использованием того же биокатализатора (Табл 4)

Время брожения, сут Биоютализатор, г/л

Рис. 7. Кинетика накопления СОг в бутылках в процессе сбраживания виноматериапа (а) и зависимость удельной скорости накопления этанола в сбраживаемой среде от концентрации биокатализатора (б) Символы •, О, Т, V и ■ обозначают следующие концентрации биокатализатора в вине 0,45,0,9,9,18 и 36 г/л, соответственно

Брожение, сут

Рис. 8 Результаты проведения процесса резервуарной непрерывной шампанизации вина с применением клеток дрожжей, иммобилизованных в криогель ПВС

Таблица 6. Характеристики шампанского, приготовленного резервуарным непрерывным

способом с применением дрожжей, иммобилизованных в криогель ПВС

Продолжительность брожения, сут Давление С02, кПа Остаточная концентрация сахара, г/л Концентрация спирта, об % Титруемая кислотность, г/л ЗОг, мг/л

18 470 1,2 11,8 7,4 83,4

36 470 1,3 11,7 7,3 83,8

54 460 1,4 11,7 7,4 83,7

Для оценки механической прочности разработанного биокатализатора исследовали модуль упругости гранул (на сжатие) до и после их использования в процессе непрерывной шампанизации вина (Табл 7) Было установлено, что разработанный биокатализатор обладает существенно

улучшенными показателями механической прочности по сравнению с биокатализатором на основе Са-альгинатного геля

Экономические расчеты показали (Табл 8), что при использовании биокатализатора, предложенного в данной работе, для получения 10 л шампанского затраты, связанные с получением необходимого для этого количества препарата, будут в 2-17 раз меньше, чем при использовании для тех же целей известных сегодня сухих, суспензионных или иммобилизованных препаратов шампанских дрожжей

Таким образом, разработанный биокатализатор, несомненно, обладает высокой конкурентоспособностью на внутреннем и внешнем рынках, так как позволяет значительно удешевить производство шампанского

Таблица 7 Модуль упругости гелей и криогелей, полученных из различных полимеров

Носитель Диаметр гранул, мм Модуль упругости, кПа

Са-альгинатный гель (2,0% масс ), (Chang, 2001) 2,0 1,7±0,2

Криогель ПВС (10% масс ), полученный по ранее известной методике (Рис 1 А) 1,5-3,5 52,5±6,3

Криогель ПВС (10% масс ), полученный по разработанной технологии - до брожения - после использования в процессе непрерывной шампанизации вина 3,5-5 63,4±3,5 65,5±3,3

Таблица 8 Затраты на препарат дрожжевых клеток, количество которого необходимо

для шампанизации 10 л вина

Препарат Что собой представляет Дозировка, г (по сух веществам) Цена, руб

«Pasteur Champagne (Davis 595)», (Red Star Yeast Company LLC, США) Сухие шампанские дрожжи 3,5 15,50

«LALVIN ЕС 1118» (Lallemand, Канада) Сухие шампаские дрожжи 5 33,75

«Wyeast 4021» (Wyeast Laboratoncs, США) Жидкая культура шампанских дрожжей 7 44,40

«Immoferm» (Erbloh Getranketech Geisenheim, Германия) Высушенные иммобилизованные в Са-альгинатный гель дрожжи 4 159, 84

Разработанный в данной работе Дрожжи, иммобилизованные в криогель ПВС 4 8,10

2. Применение разработанного биокатализатора для решения различных технологических задач в виноделии

2.1. Получение вина по белому и красному методам при использовании свободных и иммобилизованных клеток дрожжей S. vini

Так как при шампанизации вина разработанный биокатализатор характеризовался эффективной работой, было решено апробировать его для реализации других задач в виноделии, в частности, для получения виноградных вин

Так же, как и ранее для шампанских дрожжей, была изучена кинетика роста винных дрожжей Полученная дрожжевая биомасса была иммобилизована по способу, разработанному для шампанских дрожжей Было показано (Рис 9), что концентрации спирта и сахарозы в полученном вине, приготовленном с использованием как иммобилизованных, так и свободных клеток разных штаммов винных дрожжей, практически одинаковы, немногим большая концентрация спирта и меньшая сахарозы отмечалась в пробах с вином, приготовленным с помощью иммобилизованных дрожжей

Рис 9. Динамика накопления этанола (а) и потребления сахарозы (б) при сбраживании виноградного сока свободными и иммобилизованными клетками дрожжей Дрожжевые штаммы 5 vim, использованные в этих экспериментах (свободные и иммобилизованные клетки обозначены черными и белыми символами, соответственно) Ф,0 - 47 К, T,V -Кокур-3, - Ленинградская, ♦,<> -Кислотопонижаюшая, А, А - Массандра-3

Анализ основных органических кислот в полученных винах не показал существенных отличий при использовании, как свободных, так и иммобилизованных клеток (Табл 9) Однако, более глубокий анализ качества полученного вина позволил установить, что, концентрации высших спиртов (пропанола, изобутанола, изоамилового спирта), метанола, и этилацетата, высокие концентрации которых нежелательны для вина, были меньше в 1,5150 раз в вине, полученном с использованием разных штаммов

250

14

0 2 4 6 S 10 Брожение, сут

0 2 4 6 8 10

Брожение, сут

иммобилизованных винных дрожжей по сравнению с вином, приготовленным при использовании тех же клеток в свободном состоянии (Табл 10)

Таблица 9 Концентрация органических кислот в белом вине, полученном с использованием разных штаммов свободных и иммобилизованных клеток дрожжей_

Кислоты, мг/л Штамм дрожжей S vim

47 К Кокур-3 Массандра-3 Ленинградская Кислотопо-нижающая

С И С И С И С И С И

Винная 3566 3326 3387 3355 3494 3264 3332 3337 3483 3438

Яблочная 1709 1375 1729 1842 1841 1939 1013 1896 1617 2139

Молочная 736 535 620 534 463 487 1288 575 427 525

Янтарная 1820 1512 1256 1285 1483 1252 1410 1276 1160 1137

Уксусная 391 371 377 398 3b8 357 421 389 415 422

Лимонная 83 66 64 54 57 57 61 60 73 64

Фумаровая 27 19 29 26 25 27 22 27 16 23

И - Иммобилизованные дрожжи, С-свободные клетки

Таблица 10. Содержание различных ароматических веществ в столовом белом вине, приготовленном с использованием различных штаммов свободных и иммобилизованных клеток винных дрожжей_

Основные ароматические компоненты вина, мг/л Штамм дрожжей S vim

47 К Кокур-3 Массандра-3 Ленинградская Кислотопо-нижающая

С И С И С И С И С И

Этилацетат 6,6 0,7 53,1 0,3 23,6 14,2 50,7 10,0 62,5 15,3

Метанол 18,6 12,0 57,6 12,0 34,2 21,6 60,6 22,8 51,0 35,4

Пропанол 4,5 2,5 31,3 3,5 11,0 8,3 25,3 6,0 25,3 9,2

Изобутанол 7,3 3,2 62,1 3,0 20,8 12,7 61,8 11,9 46,2 17,8

Изоамиловый спирт 60,4 33,0 410,2 31,0 162,7 114,2 422,1 90,8 417,5 134,6

Глицерин, г/л 11,3 9,0 9,1 9,1 12,3 13,9 9,9 11,6 9,9 9,7

Дегустационная оценка 7,80 8,00 7,80 8,00 7,60 7,70 7,80 7,90 7,65 7,80

И - Иммобилизованные дрожжи, С-свободные клетки

Дегустация образцов белых столовых вин, полученных с использованием свободных и иммобилизованных клеток винных дрожжей, показала преимущество использования клеток в иммобилизованном виде (Табл 10) Образцы вина, полученного с использованием иммобилизованных клеток дрожжей штаммов S vim «47К», «Кокур-3» и «Ленинградская», были оценены экспертами производственной дегустационной комиссии Национального института винограда и вина «Магарач» (г Ялта, АР Крым)

как образцы очень хорошего качества с развитыми сортовыми особенностями в букете и слаженным гармоничным вкусом (Табл 10)

Аналогичные результаты были получены и при использовании разработанного биокатализатора в технологии получения красных вин (Табл 11) Органолептическая оценка, также как и ранее для шампанских и белых вин, была выше у образцов вина, полученного при использовании иммобилизованных клеток Вина характеризовались хорошим качеством с развитым, характерным для красных столовых вин, богатым букетом и слаженным вкусом.

Таблица 11. Содержание различных ароматических веществ в столовом красном вине, приготовленном с использованием различных штаммов свободных и иммобилизованных клеток винных дрожжей_

Основные ароматические компоненты вина, мг/л Штамм дрожжей 5 мгт

47 К Каберне-5 Массандра-3

С И С И С И

Этилацетат 18,3 18,2 24,8 13,0 18,9 18,1

Метанол 29,0 28,6 52,4 27,0 48,6 46,8

Пропанол 37,9 34,6 31,35 9,7 38,9 37,7

Изобутанол 37,6 32,1 37,0 6,8 37,1 34,3

Уксусная кислота 125,0 91,0 315,0 104,0 216,0 175,9

Изоамиловый спирт 166,0 146,5 329,3 158,7 289,8 166,9

Глицерин, г/л 11000 10500 10700 10300 11000 10700

Дегустационная оценка 7,80 7,90 7,70 7,80 7,60 7,75

И - Иммобилизованные дрожжи, С-свободные клетки

2.2. Применение иммобилизованных в криогель ПВС клеток дрожжей 5. сегеуЫае рку ЬауапиБ для устранения винных недобродов и для биологического кислотопонижения вина, получаемого из различных плодово-ягодных соков

Учитывая то, что иммобилизованные дрожжи значительно устойчивее к воздействию различных ингибирующих веществ, чем свободные клетки, было решено испытать их для устранения винных недобродов

Было показано, что в результате дображивания виноматериалов с использованием иммобилизованного биокатализатора концентрация этанола (г/л) может быть увеличена на 6-28% от исходного уровня (Рис 10)

Также было апробировано использование иммобилизованных в криогель ПВС клеток дрожжей для кислотопонижения вина, получаемого из виноградного и крыжовникового соков Было установлено, что в результате спирто-яблочно-молочнокислого сбраживания соков с применением разработанного биокатализатора, получается вино с концентрацией этанола

45-86 г/л и пониженным содержанием яблочной кислоты на 18-23% от

Брожение, сут

Рис. 10. Кинетика дображивания виноматериалов с разной исходной концентрацией этанола свободными и иммобилизованными в криогель ПВС клетками дрожжей Свободные и иммобилизованные клетки дрожжей обозначены черными и белыми символами, соответственно, виноматериал с концентрацией спирта 10,5 об % и 13,5 об % обозначен, соответственно, круглыми и треугольными символами

8 а

о о

Рис.

Брожение, сут

2 4

Брожение, сут

11. Динамика накопления молочной кислоты и потребления яблочной кислоты в процессе спирто-яблочно-молочнокислого брожения с использованием иммобилизованных клеток дрожжей виноградного сока (А) и сока из крыжовника (Б) Кислоты обозначены символами • - яблочная, О- молочная

3. Применение разработанного биокатализатора для получения спирта из различных отходов

Так как клетки, иммобилизованные по предложенной в работе технологии, обладали высокой метаболической активностью и были успешно применены для решения разнообразных задач в виноделии, то была исследована возможность их применения для получения спирта из различных отходов сельского хозяйства и промышленности

В работе исследовалась возможность сбраживания растворов соевого порошка, как отхода пищевой промышленности с предобработкой растворов

сои а-галактозидазой и без нее (Табл 10) Также исследовалась возможность сбраживания иммобилизованными и свободными клетками дрожжей гидролизатов различных целлюлозосодержащих отходов (Табл 11)

Таблица 10. Динамика накопления этанола в растворах сои с ферментативной обработкой и без нее при проведении брожения с участием иммобилизованных и свободных клеток дрожжей в течение 24 ч_

Клетки дрожжей Раствор сои Этанол, г/л Выход спирта от теор возможного, %

Свободные Иммобилизованные Без ферментативной обработки 31,56 33,14 55,70 58,45

Свободные Иммобилизованные Обработанный а-галактозидазой 50,50 53,65 85,01 90,32

Таблица 11. Концентрация спирта, накапливающегося при сбраживании глюкозосодержащих сред, полученных после гидролиза различных целлюлозосодержащих отходов, свободными и иммобилизованными клетками

Отход Глюкоза, г/л Дрожжи Выход спирта от теор возможного, %

Багасса 18,5 Свободные Иммобилизованные 92,0 94,8

Пшеничная солома 24,0 Свободные Иммобилизованные 87,8 92,8

Неосветленные волокна свекловичного жома 13,0 Свободные Иммобилизованные 91,3 93,5

Пергамент 23,0 Свободные Иммобилизованные 93,0 93,6

Более полное сбраживание Сахаров наблюдалось в пробах при использовании иммобилизованных дрожжей независимо от исходной среды Было установлено (Табл 10 и 11), что концентрация этанола (г/л) в 4,5-10 раз была выше в пробах при сбраживании ферментативно предобработанной сои

Выводы

1 Разработана технология получения биокатализатора на основе иммобилизованных в криогель ПВС клеток дрожжей 5 сегеугяше Шампанская -39 для использования в технологии шампанизации вина

2 Установлено на основе биохимических характеристик клеток (концентрации внутриклеточного АТФ, содержанию трегалозы и жирнокислотному пулу липидов клеток), что целесообразно наращивание биомассы дрожжей для включения в криогель ПВС при 20°С до конца логарифмической фазы роста на полусинтетической питательной среде

3. Выявлена возможность использования разработанного иммобилизованного биокатализатора для шампанизации вина классическим

и непрерывным методами, обеспечивающими получение высококачественного продукта

4 Показана возможность многократного использования биокатализатора на основе иммобилизованных клеток дрожжей в процессе шампанизации вина Расчетные периоды полуинактивации биокатализатора при его эксплуатации и хранении при - 20°С составили 150 сут и ~ 6,5 лет, соответственно

5 Определена высокая эффективность использования разработанного иммобилизованного биокатализатора в технологии получения виноградных вин по красному и белому методам Установлено, что вина, приготовленные с использованием иммобилизованных клеток разных штаммов дрожжей S vim, характеризуются высоким качеством и по органолептическим характеристикам (вкус, букет, запах) превосходят вина, получаемые с использованием свободных клеток.

6 Установлена возможность использования разработанного биокатализатора для устранения винных недобродов с исходно высокой концентрацией этанола (10,5-13,5 об %) Определено, что после дображивания концентрация спирта в вине увеличивается на 6-28 %

7. Показано использование иммобилизованного биокатализатора, полученного согласно разработанному способу, для биологического кислотопонижения вина, полученного из различных плодово-ягодных соков

8. Выявлена высокая эффективность применения разработанного иммобилизованного биокатализатора на основе криогеля ПВС в технологии получения биоэтанола из ферметативных гидролизатов различного полисахаридсодержащего сырья. Выход конечного продукта составил более 90% от теоретически возможного Впервые была показана возможность эффективного сбраживания ферментативно обработанных соевых отходов пищевой промышленности

9 Экономическая оценка затрат на получение разработанного биокатализатора показала его высокую конкурентоспособность на внешнем и внутреннем рынках, так как его применение по сравнению с известными зарубежными иммобилизованными и сухими препаратами дрожжей позволяет удешевить производство шампанского в 1,9-19 раз

Список работ по теме диссертации 1. Степанов Н.А , Мартыненко Н Н, Грачева И.М, Ефременко Е Н Применение иммобилизованных клеток дрожжей для производства спиртосодержащих напитков II Изв вузов Пищевая технология, 2006 № 6, с 45-47

2. Efremenko E., Stepanov N, Martmenko N., Gracheva I Cultivation conditions preferable for yeast cells to be immobilized into polyvinyl alcohol) and used in bottled sparkling wine production // Chemlnd ChemEngin Quart, 2006 V 12 (1), p 18-23

3. Stepanov N.A.. Efremenko EN Perspective heterogenous biocatalyst for the wine fermentation // In book Biocatalysis and Biocatalytic Technologies (Ed Zmkov GE), Nova Science Publishers lnc , N -Y , 2006, p 67-75

4 Степанов H.A.. Мартыненко H H, Ефременко Е Н Оптимизация условий получения активного биокатализатора для шампанизации вина на основе дрожжевых клеток, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта // Межд конференция «От фундаментальной науки — к новым технологиям Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок Экологически безопасные технологии», Тверь, Россия, 15 ноября, 2002 с 100-102

5 Stepanov N. A.. Efremenko Е N. Different approaches to the prevention of cell release from biocatalyst used for preparation of sparkling wine // XII Intern Workshop on Bioencapsulation, Vitona (Spam), 24-26 September, 2004, p 190193

6 Stepanov N. A, Efremenko E N. Highly active immobilized yeast for secondary wine making // XIII Intern Workshop on Bioencapsulation, Kingston, Canada, 24-26 June, 2005, p 65-66

7. Stepanov N.. Efremenko E. Optimization of sparkling wine production with immobilized biocatalyst // XIV Intern Workshop on Bioencapsulation, Lausanna, Switzerland, 5-7 October, 2006, p 313-316

8 Ефременко E H, Степанов H.A , Мартыненко H H, Грачева И M Способ получения иммобилизованного биокатализатора и биокатализатор для производства спиртосодержащих напитков. // Заявка на патент РФ на изобретение № 2006113768, приоритет от 24 04 2006

9 Ефременко Е.Н, Степанов Н.А., Мартыненко Н Н, Грачева И М Биокатализатор на основе иммобилизованных клеток дрожжей для шампанизации вина // 2-й Москов Межд конгресс «Биотехнология — состояние и перспективы развития», Москва, 10-14 ноября, 2003, с 234

10 Степанов Н. А, Ефременко Е Н. Получение биокатализатора на основе поливинилового спирта для производства игристых вин с обеспечением минимального выхода клеток из матрицы носителя // Всерос симпозиум с межд участием «Биотехнология микробов», Москва, Россия, 20-23 октября, 2004, с 84.

11 Степанов Н.А., Ефременко Е Н, Мартыненко Н.Н, Грачева И М Биокаталитическая система на основе иммобилизованных дрожжей для

шампанизации вина // 3-й Моек Межд конгресс «Биотехнология -состояние и перспективы развития», Москва, 14-18 марта, 2005, с 214.

12 Степанов Н. А.. Ефременко Е H, Мартыненко H H Иммобилизованный биокатализатор с улучшенными характеристиками для получения игристых вин // 9-я Межд пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - Наука XXI века", Пущино, 18-22 апреля, 2005, с 364

13 Степанов Н. А.. Мартыненко H. Н., Ефременко Е. Н. Иммобилизация дрожжей в криогель поливинилового спирта - эффективный подход к улучшению биотехнологии получения вина И J 0-я Пущинская школа-конференция молодых ученых, Пущино, 18-21 апреля, 2006, с 397.

14 Stepanov N. A.. Martinenko N N, Efremenko Е N Multipurpose biocatalyst for production of Alcoholic beverages. // Intern Congress on Bioprocessing in Food production, 18-21 June, Patras, Greece, 2006, p 173.

15.Степанов H А. Сенько О. В, Спиричева О В, Лозинский В И, Синицын А П , Ефременко Е Н. Применив клеток дрожжей и мицелиальных грибов, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта для получения этанола из различного сырья // 4-й Моек Межд конгресс «Биотехнология — состояние и перспективы развития», Москва, 12-16 марта, 2007, 308

ч

Подписано в печать 2 б". ОЦ 2007 года Заказ № 33. Формат60х90/16. Усл. печ. л. .Тираж ¿ОО экз. Отпечатано на ризографе в отделе оперативной печати и информации Химического факультета МГУ

Введение

Список сокращений

Глава I. Обзор литературы

1.1. Применение иммобилизованных дрожжевых клеток в виноделии и используемые при этом методы иммобилизации дрожжей

1.1.2. Производство шампанских вин

1.1.2.1. Получение шампанских вин по классической технологии

1.1.2.2. Получение шампанских вин резервуарным способом

1.1.3. Иммобилизованные биокатализаторы для производства виноградных вин

1.1.4. Применение иммобилизованных дрожжевых клеток для биологического кислотопонижения вин

1.1.5. Применение иммобилизованных клеток дрожжей для возобновления вялотекущего или остановившегося брожения и устранения недобродов

1.1.6. Иммобилизованные дрожжи в плодово-ягодном виноделии

1.1.7. Стабильность препаратов иммобилизованных клеток дрожжей при хранении

1.2. Криогель поливинилового спирта как носитель для иммобилизации клеток

1.3. Возможности использования иммобилизованных клеток дрожжей в технологии производства биоэтанола

1.4. Мониторинг метаболической активности клеток, используемых в виноделии в свободном и иммобилизованном виде

Глава И. Материалы и методы

2.1. Материалы

2.1.1. Химические реактивы

2.1.2. Материалы

2.1.3. Микроорганизмы

2.2. Методы

2.2.1. Хранение культур дрожжей

2.2.2. Культивирование клеток и накопление биомассы

2.2.3. Иммобилизация клеток дрожжей в криогель ПВС

2.2.4. Определение рН

2.2.5. Сбраживание шампанских виноматериалов свободными и иммобилизованными клетками дрожжей «классическим методом»

2.2.6. Определение массовой концентрации кислот методом прямого титрования

2.2.7. Определение давления СОг в бутылках

2.2.8. Определение количества клеток методом прямого микроскопирования

2.2.9. Определение биохимических характеристик дрожжевых клеток

2.2.10. Сбраживание виноградных соков свободными и иммобилизованными клетками дрожжей для получения белых и красных столовых вин

2.2.11. Устранение недобродов и биологическое кислотопонижение вин иммобилизованными клетками дрожжей

2.2.12. Анализ спиртов, Сахаров, органических кислот и ароматических веществ

2.2.13. Определение концентрации глюкозы

2.2.14. Определение концентрации внутриклеточного АТФ биолюминисцентным методом

2.2.15. Электронная и световая микроскопия образцов гранул

2.2.16. Определение кинетических параметров роста свободных клеток и брожения, катализируемого свободными и иммобилизованными клетками

2.2.17. Определение общего и свободного диоксида серы методом йодометрического титрования

2.2.18. Определение периодов полуинактивации биокатализатора

2.2.19. Обработка гранул биокатализатора с целью подавления функции размножения у иммобилизованных клеток дрожжей

2.2.20. Определение сухого веса биомассы дрожжей и биокатализатора

Глава 3. Результаты и обсуждения 62 3.1. Разработка способа получения иммобилизованного биокатализатора на основе дрожжевых клеток, иммобилизованных в криогель ПВС, и изучение его характеристик

3.1.1. Выбор условий подготовки клеток дрожжей к иммобилизации

3.1.2. Разработка подходов к созданию высокоэффективного биокатализатора на основе иммобилизованных клеток дрожжей

3.1.2.1. Исследование различных способов подавления роста клеток в процессе шампанизации вина при использовании иммобилизованных дрожжей

3.1.2.2. Оптимизация процесса формирования биокатализатора 80 3.2 Применение разработанного биокатализатора в процессе шампанизации вина и исследование свойств биокатализатора 89 3.2.1. Получение игристых вин бутылочным способом

3.2.2. Исследование возможности многократного использования биокатализатора на основе иммобилизованных клеток дрожжей в процессе бутылочной шампанизации вина

3.2.3. Получение шампанского резервуарным периодическим и непрерывным способом

3.2.4. Исследование свойств разработанного биокатализатора 103 3.2.4.1. Стабильность биокатализатора при хранении 103 3.2.4.2 Влияние формы биокатализатора на его метаболическую активность 107 3.3. Применение разработанного биокатализатора в технологии получения различных видов вин

3.3.1 Получение белых столовых вин при использовании свободных и иммобилизованных клеток дрожжей

3.3.2. Применение разработанного биокатализатора в технологии приготовления красных столовых вин

3.3.3. Применение иммобилизованных в криогель ПВС клеток дрожжей для устранения недобродов

3.3.4. Применение иммобилизованных в криогель ПВС клеток дрожжей для биологического кислотопонижения вин 124 3.4 Применение разработанного биокатализатора для получения спирта из различных субстратов

3.4.1. Применение иммобилизованных в криогель клеток дрожжей в технологии получения спирта из отходов переработки сои

3.4.2. Применение разработанного в данной работе иммобилизованного биокатализатора в технологии получения спирта из различного целлюлозосодержащего сырья 13 0 Выводы 137 Список литературы 140 Приложение

Во всех отраслях пищевой промышленности все большее значение приобретает проблема снижения себестоимости выпускаемой продукции с сохранением ее высокого качества и конкурентоспособности на рынке. Эта же проблема затрагивает и винодельческое производство.

Отечественный рынок вина за минувший год увеличился почти на 12%. Для сравнения: пивной сегмент, считающийся одним из наиболее динамичных на рынке напитков, подрос всего на 10%. Вино в России становится все более популярным. Испания, Франция, ЮАР, Венгрия, да и сама Россия демонстрируют заметную активность в предложении своей винной продукции. Производители игристых и других вин, стараются удержать свой сегмент, несмотря на все происходящие на российском алкогольном рынке изменения.

За последние несколько месяцев поставки вина в Россию сократились в связи с введением с 1 апреля 2006 г запрета на ввоз алкоголя со старыми акцизными марками. Кроме того, серьезные претензии предъявляются к винам, производящимся внутри страны или поставлявшимся из стран СНГ.

Что же касается вин, импортируемых из стран «классического виноделия» (Франции, Испании, Италии), они долгое время оставались предметом спроса лишь у потребителей с высокими требованиями к вкусу и букету вина. Однако, за последние 5-6 лет с развитием спроса на качественные товары число актуальных и потенциальных потребителей сортов дорогого вина значительно увеличилось. Об этом свидетельствует почти экспоненциальный рост объемов российского винного рынка. Компании-импортеры, следуя за развитием спроса, начали не только завозить все более широкий ассортимент вин разных ценовых категорий, но и размещать в Европе и странах Нового света заказы на розлив вин под собственными торговыми марками.

Для решения проблем, связанных с качеством винодельческой продукции и увеличением ее конкурентоспособности, необходима разработка новых технологий виноделия при использовании инновационных подходов, например, основанных на применении иммобилизованных клеток.

На сегодняшний день уже четко установлено, что иммобилизованные дрожжи могут успешно использоваться во многих отраслях виноделия, обеспечивая при этом как повышение рентабельности производства, так и улучшение качества готовой продукции [1-19].

Иммобилизованные дрожжевые клетки обладают рядом преимуществ перед свободными клетками (повышенная устойчивость клеток к различным токсичным веществам и неблагоприятным условиям), и их использование дает возможность получать готовые продукты с высоким содержанием этанола, возможность использования непрерывных технологий, а также позволяет легко отделить сброженный субстрат от клеток дрожжей [20-22].

В настоящее время разработано большое количество технологий иммобилизации дрожжей, применяемых для производства различных спиртосодержащих напитков, и используемых при этом носителей [21-22].

Наибольшую популярность при разработке биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток для виноделия в качестве носителя приобрел гель альгината кальция, несмотря на то, что формирующаяся гелевая структура характеризуется гетерогенным размером пор, невысокой механической прочностью, особенно в присутствии компонентов вина (фосфат-ионов и органических кислот) [20,22-23].

Кроме того, установлено, что в подобных гелиевых системах условия для активного метаболизма клеток соблюдаются лишь в приповерхностных слоях. Снабжение иммобилизованных клеток субстратами и отвод метаболитов внутри массы геля существенно затруднен вследствие мелкопористой структуры матрицы и, как следствие, возникновение диффузионных ограничений, приводящих к постепенному отмиранию этой части иммобилизованной популяции [24].

Однако все же наиболее широко распространенной проблемой в виноделии является накопление свободных клеток в вине в процессе брожения, вызывающее помутнение готового продукта и сводящее к нулю все преимущества применения иммобилизованных клеток [1-3,25-27]. Согласно литературным данным, существуют различные предложения по преодолению проблемы накопления свободных клеток в сбраживаемой среде при использовании иммобилизованных биокатализаторов [28-31], однако, удачных решений до сих пор нет.

Одним из возможных подходов к решению выше указанной проблемы может стать использование носителей, инертных по отношению к продуктам метаболизма дрожжей, обеспечивающих благоприятные условия для массообмена, характеризующихся более высокой механической прочностью в винных средах и способных обеспечить минимальное накопление свободных клеток в процессе брожения.

Поливиниловый спирт (ПВС), являясь синтетическим полимером тоннажного производства, относится к числу наиболее привлекательных полимеров для использования в качестве носителя для иммобилизации микроорганизмов [25,32-34].

Применение криогеля ПВС, обладающего макропористой структурой, высокими прочностными и массообменными характеристиками и высокой химической стабильностью [35-40], целесообразно при разработке новых высокоэффективных биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток дрожжей для виноделия.

Криогели ПВС образуются в результате замораживания концентрированных растворов ПВС, их выдерживания в замороженном состоянии и последующего оттаивания [41-42]. Очевидно, что необходима оптимизация условий проведения процесса иммобилизации и установление оптимального соотношения компонентов биокатализатора для обеспечения высокой жизнеспособности и метаболической активности иммобилизованных клеток.

В связи с этим, актуальной представляется разработка новой эффективной технологии получения иммобилизованного биокатализатора с использованием условий, предотвращающих выход клеток из матрицы носителя при одновременном сохранении высокой метаболической активности иммобилизованных клеток. Данная разработка может быть осуществлена при использовании именно криогеля ПВС для получения биокатализатора и при дальнейшей оптимизации условий его применения в различных областях виноделия.

Таким образом, разработка и исследование характеристик биокатализатора на основе иммобилизованных в криогель ПВС клеток дрожжей являются актуальными, так как направлены на повышение качества готового продукта при одновременном сокращении некоторых длительных стадий, присутствующих в технологическом процессе при использовании «классических» подходов, основанных на применении суспензии свободных клеток дрожжей.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АТФ-аденозинтрифосфат ДМСО - диметилсульфоксид

ГХ-ПИД - газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектором

ИНМИ РАН - Институт Микробиологии Российской Академии Наук

НИВиВ «Магарач» - Национальный Институт Виноградарства и Виноделия «Магарач»

ПВС - поливиниловый спирт

ОС - одноатомные спирты

С - концентрация клеток в момент времени t, г/л

Co-начальная концентрация клеток, г/л ц - удельная скорость роста, ч'1 td - время удвоения биомассы, ч

выводы

1. Разработана технология получения биокатализатора на основе иммобилизованных в криогель ПВС клеток дрожжей S. cerevisiae Шампанская -39 для использования в технологии шампанизации вина.

2. Установлено на основе биохимических характеристик клеток (концентрации внутриклеточного АТФ, содержанию трегалозы и жирнокислотному пулу липидов клеток), что целесообразно наращивание биомассы дрожжей для включения в криогель ПВС при 20°С до конца логарифмической фазы роста на полусинтетической питательной среде.

3. Выявлена возможность использования разработанного иммобилизованного биокатализатора для шампанизации вина классическим и непрерывным методами, обеспечивающими получение высококачественного продукта.

4. Показана возможность многократного использования биокатализатора на основе иммобилизованных клеток дрожжей в процессе шампанизации вина. Расчетные периоды полуинактивации биокатализатора при его эксплуатации и хранении при -20°С составили 150 сут. и ~6,5 лет, соответственно.

5. Определена высокая эффективность использования разработанного иммобилизованного биокатализатора в технологии получения виноградных вин по красному и белому методам. Установлено, что вина, приготовленные с использованием иммобилизованных клеток разных штаммов дрожжей S. vini, характеризуются высоким качеством и по органолептическим характеристикам (вкус, букет, запах) превосходят вина, получаемые с использованием свободных клеток.

6. Установлена возможность использования разработанного биокатализатора для устранения винных недобродов с исходно высокой концентрацией этанола (10,5-13,5 об.%). Определено, что после дображивания концентрация спирта в вине увеличивается на 6-28 %.

7. Показано использование иммобилизованного биокатализатора, полученного согласно разработанному способу, для биологического кислотопонижения вина, полученного из различных плодово-ягодных соков.

8. Выявлена высокая эффективность применения разработанного иммобилизованного биокатализатора на основе криогеля ПВС в технологии получения биоэтанола из ферметативных гидролизатов различного полисахаридсодержащего сырья. Выход конечного продукта составил более 90% от теоретически возможного. Впервые была показана возможность эффективного сбраживания ферментативно обработанных соевых отходов пищевой промышленности.

9. Экономическая оценка затрат на получение разработанного биокатализатора показала его высокую конкурентоспособность на внешнем и внутреннем рынках, так как его применение по сравнению с известными зарубежными иммобилизованными и сухими препаратами дрожжей позволяет удешевить производство шампанского в 1,9-19 раз.

1. Fumi M.D., Trioli G., Colagrande О. Immobilization of Saccharomyces cerevisiae in calsium alginate gel and its application to bottle-fermented sparkling wine production. I I Am. J. Enol. Vitic.1998 V. 39. P. 267-272.

2. Silva S., Ramon-Portugal F. Vinification de vin moelleux en utilisant des levures incluses. // Revue des Oenologues. 2002 V. 104. P. 23-26.

3. Мартыненко H. H., Грачева И.М. Иммобилизованные шампанские дрожжи. Физиолого-биохимические особенности и участие в шампанизации вин. (Обзор). // Прик. биохим. микробиол. 2003. Т. 39. с. 439-445.

4. Хорошилова В. Разработка способа производства хереса с использованием иммобилизованных клеток дрожжей. Автореферат дис. канд. техн. наук. М.: МТИПП. 1981.25с.

5. Саришвили Н., Панасюк А., Столярова Е. Использование иммобилизованных дрожжей в виноделии // Хран. и перераб. сельхозсырья. 1996. №3. С. 40-44.

6. Саришвили Н. Технология красных сухих вин с использованием иммобилизованных дрожжей. // Пищ. пром-сть. 1990. №12. С. 37-38.

7. Саришвили Н., Панасюк А., Кузьмина Е., Лилье М., Персианов В. Новое в технологии красных выдержанных вин. // Хран. и перераб. сельхозсырья. 2001. №3. С. 7-8.

8. Bardi Е., Koutinas A. Immobilization of yeasts on delignified cellulosic material for room temperature and low-temperature wine-making. // J. Agric. Food Chem. 1994. V. 42. P. 221-226.

9. Bardi E.P., Koutinas A., Psarianos K., Kanellaki M. Volatite by-products formed in low-temperature wine-making by immobilized yeast cells. // Process Biochem. 1996. V. 32. P. 579-584.

10. Tsakiris A., Sipsas V., Bekatorou A., Mallouchos A., Koutinas A. A. Red wine making by immobilized cells and influence on volatile composition. // Agric. Food Chem. 2004. V. 52. P.1357-1363.

11. Гарабедян M., Сакова M. Производство на бели вина с имобилизирани дрожди. 4.1. Подбор на подходящи носител и щам дрожди за имобилизиране. // Лозарство и Винарство. 1991. V. 40. С.13-15.

12. Гарабедян М., Сакова М., Андонова Г. Производство на бели вина с имобилизирани дрожди. Ч. 2. Технология за производство бели вина с имобилизирани дрожди. // Лозарство и Винарство. 1993. V.42. С. 6-7.

13. Yajima M., Yokotsuka К. Volatile compound formation in white wines fermented using immobilized and free yeast. // Am. J. Enol. Viticult. 2001. V.52. P. 210-218.

14. Розина JI. Разработка технологии вин специального типа с использованием иммобилизованных клеток дрожжей. Автореферат дисс. канд. техн. наук. М.: ВНИИПБ. 1991.25 с.

15. Ciani M. Continuous deacidification of wine by immobilized Schizosaccharomyces pombe cells: Evaluation of malic acid degradation rate and analytical profiles. // J. Appl. Bacterid. 1995. V. 79. P. 631-634.

16. Maicas S.The use of alternative technologies to develop malolactic fermentation in wine. //Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. V. 56. P. 35-39.

17. Silva S, Ramon-Portugal F., Silva P., Texeira M. F., Strehaiano P. Use of encapsulated yeast for the treatment of stuck and sluggish fermentations. // J. Int. Sci. Vigne Vin. 2002. V. 36. P. 161-168.

18. Саришвили H., Рейтблат Б. Микробиологические основы технологии шампанизации вина. // М.: Пищевая Промышленность. 2000. 364 с.

19. Kourkoutas Y., Bekatorou A, Banat I. М., Marchant R., Koutinas A. A. Immobilization technologies and support materials suitable in alcohol beverages production: a review. // Food Microbiol. 2004. V. 21. P. 377-397.

20. Nedovic V., Willaert R. Applications of cell immobilization biotechnology. // Springer Pbsh. Ser.: Focus on biotechnology. V.8B. 2005. 573p.

21. Мартыненко H. Совершенствование ремюажа (иммобилизованные дрожжи). // Виноделие и Виноградарство. 2003. №3. С. 14-16.

22. Синицын А., Райнина Е., Лозинский В., Спасов С. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. // М.: Изд-во МГУ. 1994. 288 с.

23. Divies С., Cachon R., Cavin J. F., Prevost H. Theme-4-Immobilized cell technology in wine production. // Crit. Rev. Biotechnol. 1994. V. 14. P. 135-153.

24. Divies Ch. Les possibilites d'emploi des germes fixes en oenologie. // Bulletin de О. I. V. 1981. V.54. P.843-857.

25. Tataridis P., Ntangas P., Voulgaris I., Nerantzis E.T. Production of sparkling wine with immobilized yeast fermentation. (WITY System) using the grape variety Debina // Electron. J. Sci.Technol. 2005. V. 1. P. 13-25.

26. Yokotsuka Т., Yajima M., Matsudo T. Production of bottle-fermented sparkling wine using yeast immobilized in double-layer gel beads or strands. // Am. J. Enol. Viticult. 1997, V. 48. P. 471-481.

27. Chibata I. Immobilized microbial cells with polyacrylamide gel and carrageenan and their industrial applications. In: Immobilized microbial cells. (Ed. Venkatasubramanian K.). ACS Symp. Series 106. Washington DC. 1979. P. 187-202.

28. Синицын А. П., Райнина E. И., Бачурина Г. П., Махлис Т. А., Гусаков А. В., Ефремов А.Б. Использование иммобилизованных клеток микроорганизмов для получения этанола. // В сб.: Иммобилизованные клетки в биотехнологии. Пущино. 1987. С. 140-149.

29. Efremenko E., Spiricheva O., Varfolomeyev S., Lozinsky V. Rhizopus oryzae fungus cells producing L(+)-lactic acid: kinetic and metabolic parameters of free and PVA-cryogel-entrapped mycelium. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. V. 72. P. 480-485.

30. Lozinsky V. I., Plieva F. M. Polyvinyl alcohol) cryogels employed as matrices for cell immobilization. 3. Overview of recent research and developments, Enzyme Microb. Tech. 1998. V. 23. P. 227-242.

31. Urushizaki F., Yamaguchi H., Nakamura K., Numajiri S. Swelling and mechanical properties of polyvinyl alcohol) hydrogels. // Int. J. Pharm. 1990. V. 58. P. 135-142.

32. Lozinsky V. I., Zubov A. L., Titova E. F. Swelling behaviour of polyvinyl alcohol) cryogels employed as matrices for cell immobilization. // Enzyme Microb. Techn. 1996. V. 18. P. 561-569.

33. Shubhangi G. Gholap J., Jog P., Badiger M. V. Synthesis and characterization of hydrophobically modified polyvinyl alcohol) hydrogel membrane. // Polymer. 2004. V. 45. P. 5863-5873.

34. Лозинский В. И. Криогели на основе природных и синтетических полимеров: получение, свойства и области применения. // Успехи химии. 2002. Т.71. № 6. С. 559-585.

35. Lozinsky V. I., Domotenko L. V., Vainerman E. S. Study of cryostructurization of polymer systems. VII. Sructure formation under freeazing of polyvinyl alcohol) aqueous solution. // Colloid Polym. Sci. 1986. V. 264. P. 19-24.

36. Yokoyama F., Masada I., Shinamura Т., Irawa Т., Monobe K. Morphology and structure of highly elastic polyvinyl alcohol) hydrogel prepared by repeated freezing-and-melting. // Colloid Polym. Sci. 1986. V. 264. P. 595-601.

37. Вудворд Д. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы.// М.: Мир. 1988. 215 с.

38. Kourkoutas Y., Kanellaki М., Koutinas A. A., Tzia. С. Effect of fermentation conditions and immobilization supports on the wine making. //J. Food Eng. 2005. V 69. P. 115-123.

39. Peinado R. A., Moreno J. J., Villalba J. M., Gonzalez-Reyes J. A., Ortega J. M., Mauricio J. C. Yeast biocapsules: A new immobilization method and their applications. // Enzyme Microb. Tech. 2006. V. 40. P. 79-84.

40. Verbelen P. J., De Schutter D. P., Delvaux F., Verstrepen K. J., Freddy R. Delvaux. Immobilized yeast cell system for continuous fermentation applications. // Biotechnol. Lett. 2006. V. 28. P. 1515-1525.

41. Kourkoutas Y., Kanellaki M., Koutinas A. A., Tzia. C. Effect of storage of immobilized cells at ambient temperature on volatile by-products during wine-making. // J. Food Eng. 2006. V 74. P. 217-223.

42. Мартыненко H. H. Разработка технологии дрожжей для бутылочной и резервуарной шампанизации вин. Дисс канд. техн. наук. М.: МГУПП, 2001.182 с.

43. Мартыненко Н. Совершенствование ремюажа (иммобилизованные дрожжи). // Виноделие и Виноградарство. 2003. №3. С.14-16.

44. Столярова Е. Разработка технологии выдержанных вин на основе использования иммобилизованных дрожжей. Автореферат дисс. канд. техн. наук. М.: РАСХН. 1995. 23 с.

45. Ramon-Portugal F., Silva S., Taillander P., Strehaiano P. Immobilized yeast: actual oenologic utilizations. // Wine Internet Tech. J. 2003. V. 1. P. 1-7.

46. Кишковская С., Иванова E., Пикарь H., Панькова В., Согоян К. Р. Яблочнокислое брожение в жемчужных винах, вызываемое иммобилизованными в нем дрожжами Schizosaccharomyces acidodevoratus. II Виноград и Вино России. 1999. №4. С. 23-24.

47. Nedovic V. A., Durieuxb A., Van Nedervelde L., Rosseels P., Vandegans J., Plaisant A., Simon J. Continuous cider fermentation with co-immobilized yeast and Leuconostoc oenos cells. // Enzyme Microb. Technol. 2000. V. 26. P. 834-839.

48. Silva S., Ramon-Portugal F., Andrade P., Abreu S., Fatima Texeira M., de Strehaiano P., Malic acid consumption by dry immobilized cells of Schizosaccharomyces pombe. II Am. J. Enol. Viticult. 2003. V. 54. P. 50-55.

49. Totsuka A., Takashima K., Nishioko Y., Takanishi T. Removal of sulphur compounds from wine by immobilized yeasts // Amer. J. Enol. Viticult. 1990. Vol.41. №2. P. 188.

50. Кишковский 3., Яковенко H. Использование иммобилизованных микроорганизмов в технологии вин.// Обз. инф. Сер. 15. ЦНИИНТЭИпищепром.1991. №5. С. 1-30.

51. Groboillot A., Boadi D., Poncelet D., Neufeld R. Immobilization of cells for application in the food industry. // Critical Rev. Biotech. 1994. V.14. P. 75-107.

52. Norton S., Vuillemard J. Food bioconversions and metabolite production using immobilized cell technology. // Critical Rev. Biotech. 1994. V.14. P. 193-224.

53. Kuz'micheva I. M., Plotnikova V. V., Grits N. V., Leont'ev V. N. Effects of immobilization on yeast metabolism. //. Appl. Biochem. Microbiol. 1998. V 34. P. 227232.

54. Ramakrishna S. V., Prakasham R. S. Microbial fermentations with immobilized cells. // Curr. Sci. 1999. V. 17. P 87-100.

55. Nedovik V., Willaert R. Fundamentals of cell immobilisation biotechnology. // Springer Pbsh. Ser.: Focus on biotechnology. V.8A. 2004. 550p.

56. Guisan J. M. Immobilization of enzymes and cells. // New York: Humana Press Inc. 2006. 449 p.

57. Wijffels R. H., Buitelaar R. M., Bucke C., Tramper J. Immobilization cells: basics and applications. // Elsevier Science. 1996. 864 p.

58. Bardi E., Koutinas A. Immobilization of yeast on delignified cellulosic material for room temperature and low temperature wine making // J. Agric. Food Chem. 1994. V. 42. P. 221-226.

59. Bardi E. P., Bakoyianis V., Koutinas A. A., Kanellaki M. Room temperature and low temperature wine making using yeast immobilized on gluten pellets. // Process Biochem. 1996. V. 32. P. 425-430.

60. Bakoyianis V., Koutinas A. A., Agelopoulos K., Kanellaki M. Comparative study of kissiris, y-alumina, and calcium alginate as support of cells for batch and continuous wine making at low temperature. // J. Agric. Food Chem. 1997, V. 45. P. 4884-4888.

61. Iconomou L., Kanellaki M., Voliotis S., Agelopoulos K., Koutinas A. A. Continous wine making by delignified cellulosic materials supported biocatalyst. // Appl. Biochem. Biotechnol. 1996. V. 60. P. 303-313.

62. Loukatos P., Kiaris M., Ligas I., Bourgos, G., Kanellaki M., Komaitis M., Koutinas A. A. Continuous wine making by y-alumina-supported biocatalyst. // Appl. Biochem. Biotechnol. 2000. V. 89. P. 1-13.

63. Monsan P., Durand G., Navarro J. M. Immobilization of microbial cells by adsorption to solid supports. // Methods in Enzymology. 1987. V.135. P. 307-318.

64. Klein J., Ziehr H. Immobilization of microbial cells by adsorption. // J Biotechnol. 1990. V. 16. P. 1-15.

65. Divies C., Lenzi P., Beaujeu J., Herault F. Process of producing a dehydrated polysaccharide gel containing microorganisms for preparing fermented drinks. // Patent USA №5389532. 1995.

66. Charpentier M. Dehydrated polysaccharide gel containing microorganisms, a sugar and polyol for producing fermented drinks. // Patent USA № 6033887.2000.

67. Park J. K., Chang, H. N. Microencapsulation of microbial cells. // Biotechnol. Adv. 2000. V. 18. P 303-319.

68. Borglum G. B. Immobilization of microorganisms in gelled carrageenan. // Patent USA №4347320. 1982.

69. May K. Immobilized biocatalysts. // Patent USA № 4518693.1985.

70. Smidsrod O., Skjak-brak G. Alginate as immobilization matrix for cells. // Tibtech. 1990. V. 8. P. 71-78.

71. Laca A., Garcia L. A., Diaz. M. Analysis and description of the evolution of alginate immobilized cells systems. //J. Biotechnol. 2000. V. 80. P. 203-215.

72. Martinsen A., Skjak-Brak G., Smidsrod O. Alginate as immobilization material: I. Correlation between chemical and physical properties of alginate gel beads. // Biotechnol Bioeng. 1989. V.33. P. 79-89.

73. Martinsen A., Storro I. and Skjak-Break G. Alginate as Immobilization Material: III. Diffusional Properties. // Biotechnol. Bioeng. 1992,39,186-194.

74. Gilson Ch., Thomas A. Calcium alginate bead manufacture: with and without immobilized yeast. Drop formation at a two fluid nozzle. // J. Chem. Techn. Biotech. 1995. V. 62. №3. P. 227-232.

75. Amsden В., Turner N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. // Biotechnol. Bioeng. 1999. V. 65. P. 605-610.

76. Li X. The use of chitosan to increase the stability of calcium alginate beads with entrapped yeast cells. //Biotechnol. Appl. Biochem. 1996. V.23. P. 269-272.

77. Ciesarova Z., Domeny Z., Smogrovicova D., Patkova J., Sturdik E. Comparison of ethanol tolerance of free and immobilized Saccharomyces uvarum yeasts. // Folia Microbiologika. 1998. V. 43. №1. P. 53-59.

78. Яковенко H. Получение виноматериалов и вин с использованием ковалентно иммобилизованных ферментов и дрожжей. Дисс канд. техн. наук. М.: МТИПП, 1984.107 с.

79. Jirku V. Energy status of starving yeast cells immobilized by covalent linkage. // Biotechnology Letters. 1989. V. 11. P. 45-58.

80. Valuev L. I., Chupov V. Plate N. A. Covalent immobilization of microorganisms in polymeric hydrogels. // J. Biomater. Sci. Polim. Ed. 1993. V 5. P. 37-48.

81. Jirku V. Covalent immobilization as a stimulus of cell wall composition changes. // Cell. Mol. Life Sci. 1995. V. 51. P. 569-571.

82. Lemonnier, J., Duteurtre B. Un progres important pour le champagne et les vins de "methode traditionnelle". // Rev. Fr. Oenol. 1989. V. 121. P. 15-26.

83. Restall J., Hebbs D. Making Sparkling Wines. // Trans-Atlantic Publications. 1995. 1441. P

84. Stevenson. Т. World encyclopedia of champagne and sparkling wine. // Wine Appreciation Guild. 2003.320p.

85. Liger-Belair G. Uncorked: The science of champagne. // Princeton University Press. 2004.160 p.

86. Juhlin R. 4000 Champagnes. // Flammarion. 2005. 384 p.

87. Зыбцев Ю. Шампанское и другие вина Франции. // BBPG. 2001. 304с.

88. Уляницкий Д. Винные войны. // Food&Drinks. 2006. №10 С. 50-54.

89. Косюра В. Т., Донченко Л. В., Надыкта В. Д. Основы виноделия. // М.: ДеЛи принт. 2004.440с.

90. Коваленский К., Слезко Г., Ксенжук Н. Технология и техника виноделия. // ИНКОС. 2004. 560 с.

91. Jakson R. S. Wine science: principles, practice, perception. // Academic Press. 2000. 654 P

92. Прида И.А. Механизация и автоматизация ремюажа при производстве игристых вин бутылочным способом // Виноделие и виноградарство СССР. 1985. №3. С. 37-39.

93. Martin P., Hardy G. Disposit de manipulation automatique notamment pour le traitement du vin selon la methode champenoise. // Patent FR № 2473546.1981.

94. Martin P., Hardy G., Contu D., Lorran T. Appts. for rotation of champagne bottles in confined space has chassis formed from articulating arms operated by jacks raises and pivots cases. // Patent FR №2691474.1993.

95. Hardy G. Synthese des connaissances et de l'utilisation des levures agglomerantes en methode champenoise // Industrie delle Bevande. 1991.20. P. 31-36.

96. Bach H.P. Agglomerierende Sekthefen // Das Deutsche Weinmagazin. 1996. №2. P. 18-21.

97. Bidan P., Divies Ch., Dupuy P. Procede perfectionne de preparation de vins mousseux. // Patent FR №2432045.1980.

98. Lallement A. Les levures incluses pour la prise de mousse // Revue denol. Technl vitivinia et oehologues. 1990.V. 58. P. 29-31.

99. Loureiro V. Portuguese contribution on immobilized yeast cells for sparkling wine production. // Industrie delle Bevande. 1990. V.19. P. 501-503, 506.

100. Krasny S., Malik F., Minarik E. Einsatz immobilisierter Zellen in der Weinbereitung. Verwendung immobilisierter Hefen bei der sekundaren Garung. // Die Wein-Wissenschaft. 1992. V.47. P. 53-55.

101. Malik F., Pach L., Halama D., Bales V. Charakterisierung einiger Eigenschaften immobilisierter Weinhefen. I. Mechanische Eigenschaften immobilisierter Zellen. // Mitteilungen Klosterneuburg. 1990. V.30. P. 205-208.

102. Malik F., Smogrovicova D., Halama D., Pach L. Charakterisierung der Eigensehaften immobilisierter Weinhefen. 2. Untersuchung zur Respiration immobilisierter Zellen. // Mitteilungen Klosterneuburg. 1991. V.40. P. 209-212.

103. Malik F., Pach L., Halama D., Vollek O., Pach L. Charakterisierung der Eigenscheften immobilisierten Weinhefen. Technologische Eigenschaften immobilisier Hefe. // Mitteilungen Klosterneuburg. 1991. V. 41. P. 11-13.

104. Millies K.D. Schaumweinherstellung nach der "Methode Champenoise" mit Hilfe von immobilisierten Hefen. // Getrankeindustrie. 1991. V 4. P. 78-83.

105. Millies K.D. Versuche mit immobilisierten Hefen. // Die Weinwirtschaft Technologie. 1991. Bd.37. №2. S. 18-22.

106. Hill F. Verfahren zur Herstellung immobilisierter Hefen fur die Sektgarung // Patent DE №3908997.1990.

107. Link S. Minikugeln mit Alginat. // Der Deutsche Weinbau. 1995. V. 5. P. 14-15.

108. Bach H. Immobilisierte Hefen zur Schaumweinbereitung im Vergleich.// Der Deutsche Weinbau. // Der Deutsche Weinbau. 1991. V. 32. P. 1264-1268.

109. Quetsch K. Immobilisierte Biokatalysatoren fur die traditionelle Sektherstellung. // Der Deutsche Weinbau. 1990. V. 45. P. 465-469.

110. Troost G., Bach H.P., Rhein O.H. Sekt, Schaumwein, Perlwein. Handbuch fur Lebensmitteltechnologie. // E.U. Verlag. 1995. 620 p.

111. Colagrande O., Silva A., Fumi M. Recent application of biotechnology in wine production// Biotechnology Progress. 1994.V. 10. P. 2-18.

112. Trioli G., Fumi M.D., Dallavalle L. Trattamente del lievito immobilizato in alginato per la produzione dello spumante classico. // Industrie delle Bevande. 1990. V. 19. P. 478^80.

113. Гарабедян M. Приложение на имобилизирани бактерии и дрожди. // Лозарство и Винарство. 1989. Г. 38. №2. С. 4-5.

114. Сакова М. Производство на естественно пенливи вина с имобилизирани дрожди. Ч. 1. Избор на щам дрожди и на носител за имобилизиране. //Лозарство и Винарство. 1996. №.45. С. 11-14.

115. Busova К., Magyar J., Janky F., Csillag F. Inhibition of cell release in champagne production with immobilized yeast. // Acta Alimentaria. 1993. V. 22. P. 63.

116. Busova К., Magyar J. Effect of immobilized yeasts on the quality of bottle-fermented sparkling win. // Acta Alimentaria. 1994. V. 23. P. 9-23.

117. Godia F., Casas C., Sola S. Application of immobilized yeast cells to sparkling wine fermentation. // Biotechnology Progress. 1991. V.7. P. 468-470.

118. Горина В., Бурьян H., Палик 3. Использование иммобилизованных дрожжей в производстве шампанского бутылочным способом. // Виноградарство и Виноделие СССР. 1990. №6. С. 60-66.

119. Согоян К.Р., Горина В.А. Альгинат натрия из черноморской бурой водоросли рода Cistofera как носитель иммобилизованных дрожжей для получения игристых вин бутылочным способом. // Виноград и вино России. 1998 №3 С. 17-19.

120. Рейтблат Б. Научное обоснование и разработка технологии шампанизации вина на основе регулирования физиологии и метаболизма дрожжей. Автореф. дис. докт. техн. наук. М.: ВНИИПБиВП. 1997. 68 с

121. Горина. В. Особенности использования иммобилизованных дрожжей в производстве игристых вин бутылочным способом. // Виноградарство и Виноделие «Магарач». 2000. № 3. С. 22-24.

122. Бурьян Н. Микробиология виноделия. // Ялта.: Магарач. 2002.431 с.

123. Палик 3. Совершенствование технологии производства игристых вин бутылочным способом на основе использования иммобилизованных дрожжей. Дисс. канд. техн. наук. Ялта.: ИВиВ «Магарач», 1992. 180 с.

124. Fumi, М., Trioli G, Colagrande О. Preliminery assessment on the use of immobilized yeast cells in sodium alginate for sparkling wine processes// Biotechnol. Lett. 1987 V. 9. P. 339-342.

125. Klein J., Vorlop K.D., Steinert H.J. Biocatalysator und Verfahren zu Seiner Herstellung.// European patent №0173915.1992.

126. Divies C., Lenzi P., Beaujeu J., Herault F. Process of producing a dehydrated polysaccharide gel containing microorganisms for preparing fermented drinks. // Patent USA №5389532,1995.

127. Pundle A., Prabhune A., SivaRaman H. Immobilization of Saccharomyces uvarum cells in porous beads of polyacrylamide gel for ethanolic fermentation. // Appl. Microbiol. Biotech. 1988. V. 29. P. 426-429.

128. Мартыненко H. H., Грачева И. M., Эль-Регистан Г. И., Зубов A. JL, Лозинский В. И. Способ получения биокатализатора для производства спиртосодержащих игристых напитков. Патент РФ №2239658,2004.

129. Батраков С., Эль-Регистан Г., Придачина Н., Ненашева В., Козлова А., Грязнова М., Золотарев А. Тирозол ауторегуляторный фактор di Saccharomyces cerevisiae. II Микробиология. 1993. Т. 62. № 4. С. 633-638.

130. Беспалов М., Колпаков А., Лойко Н., Дорошенко Е., Мулюкин А., Козлова

131. A., Варламова Е., Курганов Б., Эль-Регистан Г. Функции аутоиндукторов анабиоза микроорганизмов при создании метаболического блока в клетке. // Микробиология. 2000. Т. 69. №2. С. 217-223.

132. Колпаков А., Ильинская О., Беспалов М., Куприянова-Ашина Ф., Гальченко

133. B., Курганов Б., Эль-Регистан Г. Стабилизация ферментов аутоиндукторами анабиоза, как один из механизмов устойчивости покоящихся форм микроорганизмов. // Микробиология. 2000. Т.69. №2. С. 224-230.

134. Эль-Регистан Г. Роль мембранотропных ауторегуляторных факторов в процессах роста и развития микроорганизмов. Дисс. д.т.н. М. 1988.493.

135. Fumi М. D., Bufo М., Trioli G., Colagrande О. Bulk sparkling wine production by external encapsulated yeast bioreactor. // Biotechnol. Lett. 1989. V. 11. P. 821-824.

136. Cantarelli C., Lanzarini G. Biotechnology applications in beverage production. // London: Elsevier. 1989. 257 p.

137. Ciani M., Rosini G. Sparkling wine production by cell-recycle fermentation process // Biotechnol. Lett. 1991. V.13. P. 533-536.

138. Domeny Z., Smogrovicova D., Gemeiner P., Sturdik E., Patkova J., Malovikova A. Continuous secondary fermentation using immobilised yeast. // Biotechnol. Lett. 1998. V. 20. P. 1041-1045.

139. Брусиловский С., Мельников А., Мержаниан А., Саришвили H. Производство Советского шампанского непрерывным способом. // М.: Пищевая промышленность. 1977.233 с.

140. Сторчевой Е. Научное обоснование и разработка технологии шампанизации вина в условиях сверхвысокой концентрации дрожжей. Автореферат дис. .канд. техн. наук. Тбилиси: НИИ садоводства, виноградарства и виноделия МСХ ГССР. 1981.24 с.

141. Саришвили Н. Разработка и промышленное освоение технологии Советского шампанского непрерывным способом.// М.: ВНИИВиВ «Магарач». 1982. 66 с

142. Авакянц С. Игристые вина. // М.: Агропромиздат. 1986.272 с.

143. Boulton R. В., Singleton V. L., Bisson L. F., Kunkee R. E. Principles and practices of winemaking. // New York: Chapman & Hall. 1996. 604 p.

144. Приве Й. Вино. // М. БММ АО. 2003.256 с.

145. Агентство «Агрофакт». Потребление вина в мире постепенно растет, Франция уступает США лидирующие позиции. // Крестьянские ведомости (Газета агробизнеса). 22.04.2006.

146. Оз К. Винная энциклопедия. // BBPG. 2005.416 с.

147. Пономарев В.Ф. Основы виноделия. // М: Мир. 2004. 176с.

148. Moreno-Arribas М. V., Polo М. С. Winemaking biochemistry and microbiology: current knowledge and future trends. // Crit. Rev. Food Sci Nutr. 2005. V. 45. P. 265286.

149. Агеева H.M. Физико-химические и биотехнологические основы повышения качества и устойчивости вин к помутнениям. Автореферат, д.т.н. Краснодар. КубГТУ. 2001.48 с.

150. Персианов В.И. Разработка технологии выдержанных вин на основе интенсификации биохимических процессов. Автореферат канд. техн. наук. М.: ВНИИПБиВП. 2001.25 с.

151. Бурьян Н. Микробиология виноделия. Ялта.: Магарач. 2002.431 с.

152. Bakoyianis V., Kanellaki М., Kalliafas A., Koutinas A. Low temperature wine-making by immobilized cells on mineral kissiris.// J. Agric. Food Chem. 1992. V. 40. P. 1293-1296.

153. Bakoyianis V., Капа K., Kalliafas A., Koutinas A. Low temperature continuous wine-making by kissiris-supported biocatalyst: volatile by-products.// J. Agric. Food Chem. 1993. V. 41. P. 465-468.

154. Iconomopoulou M., Psarianos K., Kanellaki M,, Koutinas A. Low temperature and ambient temperature wine making using freeze-dried immobilized cells on gluten pellets. // Process Biochem. 2002. V.37. P. 707-717.

155. Bardi E., Koutinas A. Immobilization of yeast on delignified cellulosic material for room temperature and low temperature wine making // J. Agric. Food Chem. 1994. V. 42. P.221-226.

156. Iconomopoulou M., Kanellaki M., Psarianos K., Koutinas A. Delignified cellulosic material supported biocatalyst as freeze-dried product in alcoholic fermentation. // J. Agric. Food Chem. 2000. V. 48. P. 958-961.

157. Iconomopoulou M., Kanellaki M., Soupioni M., Koutinas A. Effect of freeze-dried cells on delignified cellulosic material in low temperature wine-making. // Appl. Biochem. Biotechnol. 2003. V. 104. P. 23-36.

158. Kourkoutas Y., Komaitis M., Koutinas A., Kanellaki M. Wine production using yeast immobilized on apple pieces at low and room temperature. // J. Agric. Food Chem. 2001. V. 49. P. 1417-1425.

159. Kourkoutas Y., Koutinas A., Kanellaki M., Banat I., Marchant R., Continuous wine fermentation using a psychrophilic yeast immobilized on apple cuts at different temperatures. // Food Microbiol. 2002. V. 19 P. 127-134.

160. Kourkoutas Y., Douma M., Koutinas A., Kanellaki M., Banat I. M., Marchant R., Room and low temperature continuous wine-making using yeast immobilized on quince pieces. // Process Biochem. 2003. V. 39 P. 353-360.

161. Kourkoutas Y., Komaitis M., Koutinas A. A., Kaliafas A., Kanellaki M., Marchant R., Banat I. M. Wine production using yeast immobilized on quince biocatalyst at temperatures between 30 and 0°C. // Food Chem. 2003. V. 82 P. 353-360.

162. Mallouchous A., Reppa P., Aggelis G., Kanellaki M., Koutinas A., Komaitis M. Grape skins as a natural support for yeast immobilization. // Biotechnol. Lett. 2002. V. 24. P. 1331-1335.

163. Mallouchos A., Komaitis M., Kourkoutas Y., Kanellaki M. Evolution of volatile byproducts during wine fermentations using immobilized cells on grape skins. // J. Agric. Food Chem. 2003. V. 51. P. 2402-2408.

164. Mallios P., Kourkoutas Y., Iconomopoulou M., Koutinas A. A., Psarianos C., Marchant R., Banat I. M. Low-temperature wine making using yeast immobilized on pear pieces. // J. Sci. Food Agric. 2004. V. 24. P. 1331-1335.

165. Mallouchos A., Skandamis P., Loukatos P., Komaitis M., Koutinas A., Kanellaki M. Volatile compounds of wines produced by cells immobilized on grape skins. // J. Agric. Food Chem. 2003. V. 51 P. 3060-3066.

166. Mallouchous A., Komaitis M., Koutinas A., Kanellaki M. Wine fermentations by immobilized and free cells at different temperature on volatile by-products. // Food Chem. 2003. V. 80. P. 109-113.

167. Tsakiris A., Bekatorou A., Psarianos C., Koutinas A. A., Marchant R., Banat I. M. Immobilization of yeast on dried raisin berries for use in dry white wine-making. // Food Chem. 2004. V. 87. P. 11-15.

168. Plessas S., Bekatorou A., Koutinas A. A., Soupioni M., Banat I. M., Marchant R. Use of Saccharomyces cerevisiae cells immobilized on orange peel as biocatalyst for alcoholic fermentation. // Bioresource Technol. 2007. V. 98. P. 860-865.

169. Ciani M., Ferraro L. Enhanced glycerol content in wines made with immobilized Candida stellata cells. //Appl. Environ. Microb. 1996. V. 62. №1. P. 128-132. 9 (229)

170. Ciani M., Ferraro L. Combined use of immobilized Candida stellata cells and Saccharomyces cerevisiae to improve the quality of wine. // J. Appl. Microbiol. 1998. V. 85. P. 247-254.

171. Зинкевич Э. Л. Возможности кислотопонижения в сусле и вине. // Food&Drinks. 2004. №11 С. 95-96.

172. Davis С. R., Wibowo D. J., Lee Т. Н., Fleet G.H. Growth and metabolism of lactic acid bacteria during and after malolactic fermentation of wines at different pH. // Appl. Environ. Microbiol. 1986. V. 51. P. 539-545.

173. Dharmadhikari M. Some issues in malolactic fermentation acid reduction and flavor modification. // Vineyard and Vintage View, 2002 V. 17. P. 4-6.

174. Liu S.-Q. Malolactic fermentation in wine beyond deacidification: A review. // J. ApJJ. Microbiol. 2002. V. 92. P. 859-601.

175. Кишковская С. Дрожжи рода Schizosaccharomyces и их роль в технологии виноделия. // Итоги Науки и Техники. ВИНИТИ. Серия «Химия и Технология Пищевых Продуктов». 1992. №8. 76 с.

176. Таран Н. Г., Султанова О. Д., Присак Л. Г. Биологическое кислотопонижение виноградных сусел с использованием дрожжей рода SchiroSaccharomyces. II Виноград и вино России. 1999 № 2 С 17-25.

177. Husnik J. I., Volschenk H., Bauer J., Colavizza D., Luo Z., van Vuuren H. J. J. Metabolic engineering of malolactic wine yeast. // Metabolic engineering. 2006. V. 8. P. 315-323.

178. Taillandier P., Gilis M., Strehaiano P. Deacidification by Schizosaccharomyces: interactions with Saccharomyces. // J. Biotechnol. 1995. V. 40. P. 199-205.

179. Eliseeva G. S., Nagornaia S.S., Zherebilo О. E., Podgorskii V. S., Ignatova E. A. Biological deacidification of wines using lactic-acid bacteria and yeasts. // Appl. Biochem. Microbiol. 2001. V. 37. P. 487-493.

180. Herrero M., Laca A., Garcia L. A., Dfaz M. Controlled malolactic fermentation in cider using Oenococcus oeni immobilized in alginate beads and comparison with free cell fermentation. I I Enzyme Microb. Tech. 2001. V. 28. P. 35-41.

181. Durieux A., Nicolay X., Simon J.-P. Continuous malolactic fermentation by Oenococcus Oeni entrapped in LentiKats. //Biotechnol. Lett. 2000. V. 22. P. 1679-1684.

182. Agouridis N., Bekatorou A., Nigam P., Kanellaki M. Malolactic fermentation in wine with Lactobacillus casei cells immobilized on delignified cellulosic material Hi. Agric. Food Chem. 2005. V.53. P 2546 -2551.

183. Bisson L.F. Stuck and sluggish fermentations. // Am. J. Enol. Vitic. 1999. V. 50. P. 107-119.

184. Alexandre H., Charpentier C. Biochemical aspects of stuck and sluggish fermentation in grape must. // J. Ind. Microbiol. Biotech. 1998. V. 20. P. 20-27.

185. Blateyron L., Sablayrolles J. M. Stuck and slow fermentations in enology: statistical study of causes and effectiveness of combined additions of oxygen and diammoniumphosphate. //J. Biosci. Bioeng. 2001. V. 91. P. 184-189.

186. Specht G. Overcoming stuck and sluggish fermentations. // Practical Winery and Vineyard. September 2003. P 1-5.

187. Мехузла H., Панасюк А. Технология плодово-ягодных вин. // M. Пищевая промышленность. 1984.240 с.

188. Литовченко А., М., Тюрин С. Т. Технология плодово-ягодных вин. // Профессия. 2004. 234 с.

189. Валуйко Г. Г. Справочник виноделия. // Профессия. 2005. 589 с.

190. Ли Э., Пигготт Д. Спиртные напитки. Особенности брожения и производства. // Профессия. 2005. 544 с.

191. O'Reilly A., Scott J. Use of an ion-exchange sponge to immobilise yeast in high gravity apple based (cider) alcoholic fermentations. // Biotechnol. Lett. 1993. V.15. №10. P. 1061-1066.

192. Scott J. A. O'Reilly A. M. Co-immobilization for controlled flavour development in an alcoholic cider beverage. // Process Biochem. 1996. V. 31. P. 111-117.

193. Панасюк А., Линецкая А., Толстикова И., Шур И., Черных О. Пути совершенствования производства плодово-ягодных вин. // ЦНИИТЭИПищепром. Серия 1. Винодельческая промышленность. 1980. №.7. С. 1-36.

194. Wzorek W., Bugajewska A., Bonin S., Mateusiak S. Badania nad ciagla winiarska z wykorzystaniem drozdzy immobilizowanych na szkle piankowym.// Przem. Ferment. Owoc. Warz. 2000. V. 43. P. 13-15.

195. Duteurtre В., Ors P., Hennequin D. Les levures inccluses development semi-industiel // Le vigneron champenois. // Le Vigneron Champenois. 1987. V. 106. P. 595— 602.

196. Duteurtre D., Ors P., Hennequin D. Point sur le development industriel des levures immobilisees en Champagne. // Industrie delle Bevande. 1991. V. 20. P. 23-25.

197. Lallement A. Fermentation and the methode Champenoise // Brewers Guardian. 1998. V. 4. P. 31-35

198. Ramon-Portugal F., Strehaiano P., Silva S., Teixeire F. Enological applications of dry immobilized yeasts // X International Simposium on Yeasts 27 August 1 September 2000, Arnhem. The Netherlands, P. 367-368.

199. Лозинский В. И., Вайнерман Е. С., Рогожин С. В. Способ получения иммобилизованных клеток микроорганизмов. // А.С. СССР № 1400071.1986.

200. Watase М., Nishinari К., Nambu М. Anomalious increase of the elastic modulus of frozen poly(vinil alcohol) gels. //Cryo-Lett. 1983. V.4. P. 197-200.

201. Рогожин С. В., Лозинский В. И., Вайнерман Е. С., Домотенко Л. В., Мамцис А. М., Иванова С. А., Штильман М. И., Коршак В. В. Нековалентное криоструктурирование в полимерных системах. // Докл. АН СССР. 1984. Т.278. № 1.С. 129-133.

202. Trieu Н. Н., Qutubuddin S. Poly(vinyl alcohol) hydrogels. 1 .Microscopic structure by freeze-etching and critical point drying techniques. // Colloid Polym. Sci. 1994. V. 272. P. 301-309.

203. Trieu H. H., Qutubuddin S. Polyvinyl alcohol) hydrogels. 2. Effect of processing parameters on structure and properties. // Polymer. 1995. V.36. P. 2531-2538.

204. Лозинский В. И., Вакула А. В., Зубов А. Л. Применение криогелей поливинилового спирта в биотехнологии. IV. Обзор литературных данных. // Биотехнология. 1992. №4. С. 5-14.

205. Свириденко Ю. Я., Абдуллаева Л. В., Райнина Е. И., Ефременко Е. Н. Иммобилизованные дрожжи для сбраживания молочной сыворотки. // Пищ. пром-сть. 1994. №8. С. 6-7.

206. Кевбрина М. В., Рябоконь А. М. Пушаева М. А. Образование ацетата свободными и иммобилизованными клетками термофильной гомоацетогенной бактерии Thermoanaerobacter kivui из смесей газов, содержащих СО. // Микробиология. 1996. Т. 6. С. 753-757.

207. Efremenko Е. N. Biocatalystic systems based upon the immobilized cells degrading parathion and p-nitrophenol. In: Biocatalysis and Biocatalytic Technologies. (Ed. Zaikov G. E.) // Nova Science Publishers, Inc. New-York. 2006. P. 23-27.

208. Rainina E. I., Efremenko E. N. Simonian A. L., Wild J., Varfolomeev S. D. The development of a new biosensor based on recombinant E.coli for the detection of organophosphorus neurotoxins. // Biosens. Bioelectron. 1996. V. 11. P. 991-1000.

209. Gray K. A., Zhao L., Emptage M. Bioethnaol. // Curr. Opin. Chem. Biol. 2006. V. 10. P. 141-146.

210. Fulton L. Driving ahead—biofuels for transport around the world. // Renewable Energy World. 2004. V. 7. P. 180-189.

211. Pessoa J. A., Roberto I. C., Menossi M., das Santos R. R., Filho S. O., Penna Т. C. Perspectives on bioenergy and biotechnology in Brazil. // Appl. Biochem. Biotechnol. 2005. V. 121-124. P. 59-70.

212. Rakos C. Hotting up -The wood pellet heating market. // Renewable Energy World. 2004. V. 7. P. 152-161

213. Zervos A., Lius. Ch., Schrafer O. Tomorrow's world: 50% renewables scenario for 2040. // Renewable Energy World. 2004. v. 7

214. Панцхава E. С., Пожарнов В. А. В перпективе Россия крупнейший поставщик биотоплива на мировой рынок. // Коммерческая биотехнология (интернет журнал) 20.07.2005.

215. Mojovic L., Niciolic S., Rakin M., Vukasinovic M. Production of bioethanol from corn meal hydrolyzates. // Fuel. 2005. V. 85. P. 1750-1755.

216. Kim S., Dale В. E. Global potencial bioethanol production from wasted crops and crop residues. // Biomass and Bioenergy. 2004. V. 26. P. 361-375.

217. Sun Y., Cheng J, Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a review. // Bioresour. Technol. 2002. V. 83. P. 1-11.

218. Bebic Z., Jakovljevic J., Baras J. The corn starch hydrolyzate as a fermentation substrates for ethanol production. // Hem. Ind. 2000. V. 54. P. 5-9.

219. Samejima H., Nagashima M., Azuma M. Semicommercial production of ethanol using immobilized microbial cells. // Enzyme Eng. V. 434. 1984. P. 394-405

220. Rebros M., Rosenberg M., Stloukal R., Kristofikova L. High efficiency ethanol fermentation by entrapment of Zymomonas mobilis into LentiKats. // Letters in Applied Microbiology. 2005. V. 41. P. 412-416.

221. Babtista С. M. S. G., Coias J. M. A., Oliveira А. С. M., Rocha J. M. S., Dempsey M. J., Lanningan К. C., Benson P. S. Natural immobilization of microorganisms for continuous ethanol production. // Enzyme Microb. Tech. 2006. V 40. P. 127-131.

222. Nigam J. N. Continuous ethanol production from pineapple cannery waste using immobilized yeast cells. // J. Biotechnol. 1999. V. 72. P. 197-202.

223. Бачурина Г. П. Биоконверсия гидролизатов растительного сырья в этанол иммобилизованными бактериями Zymomonas mobilis. И Дисс. на соиск. степени к.б.н. 1998. Москва. 153 с.

224. Nursevin Oztop Н., Yasemin Oztop A., Karada Y., Isekver Y., Saraydin D. Immobilization of Saccharomyces cerevisiae into acrylamide-sodium acrylate hydrogels for production of ethyl alcohol. // Enzyme Microb. Technol. 2003 V.32. P. 114-119.

225. Andersen J. Process Eng. Aspects. Immobilized cell sistem. // Rugby. 1986. p. 153-176.

226. Фрунджян В. Г. Биолюминесцентная АТФ-метрия в клинической и санитарной микробиологии. // Дисс. на соиск. степени к.х.н. 1999. Москва. 152 с.

227. Гусев М. В. Микробиология. // М.: Академия. 2006.456 с.

228. Угарова Н.Н., Фрунджян В.Г. Применение биолюминесцентной АТФ-метрии в биоаналитических целях. // Метод, разработка к спецкурсу "Прикладная энзимология". М.: Изд. МГУ, Хим. факультет. 2003.45 с.

229. Дементьева Е. И., Кутузова Г. Д., Люндовщих И. А., Угарова Н. Н. Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата. // Патент РФ на изобретение № 2164241. 2001.

230. Градова Н. Б., Бабусенко Е. С., Горнова И. Б. Лабораторный практикум по общей микробиологии. // М.: ДеЛи. 2004.144 с.

231. Chuanbin L., Лап X., Fengwu В., Zhiguo S. Trehalose exstraction from Saccharomyces cerevisiae after microwave treatment. // Biotechnol. Techn. 1998. V. 12. P. 941-943.

232. Варфоломеев С. Д., Калюжный С. В. Биотехнология. Кинетические основы микробиологических процессов. // М.: Высшая школа. 1990.296 с.

233. Яровенко В. JL, Маринченко В. А., Смирнов В. А., Устинников Б. А., Цыганков П. С., Швец В. Н., Белов В. Н. Технология спирта. // М.: Колосс-Пресс. 2002. 464 с.

234. Кутолин С.А., Писиченко Г. М. Химия воды и микробиология. // Новосибирк: СГУПС. 2002. 134 с.

235. Егорова Н.С. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. // М.: Изд. МГУ. 1995.224с.

236. Reed G., Peppier Y. J. Yeast technology. // Wesport. AVI. 1973.454 p.

237. Бабьева И. П., Голубев В. И. Методы выделения и идентификации дрожжей. // М.: Пищевая промышленность. 1979.120 с.

238. Scheper Т., Henzler Н. J., Kieran P. М., Kretzmer G., Macloughlin P. F., Malone D. M., Schumann W. Influence of stress on cell growth and product formation. // Springer-Verlag Telos 1st Edition. 2000.190 p.

239. Kates M., Baxter R. Lipid composition of mesophilic and psychrophilic yeasts as influenced by environmental temperature. // Can. J. Biochem. Physiol. 1962. V. 40. P. 1213-1217.

240. Quinn P. J. The fluidity of cell membranes and its regulation. // Porg. Biophys. Mol. Biol. 1981. V. 38. P. 1-104.

241. Argtielles J. C. Physiological roles of trehalose in bacteria and yeasts: a comparative analysis. // Arch. Microbiol. 2000. V. 174. P. 217-224.

242. Tang M., Waring A. J., Hong M. Trehalose-protected lipid membranes for determining membrane protein structure and insertion. // J. Magnetic Resonance. 2007. V. 184. P. 234-239.

243. Aranda J. S., Salgado E., Taillandier P. Trehalose accumulation in Saccharomyces cerevisiae cells: experimental data and structured modeling. // Biochem. Eng. J. 2004. V. 17. P. 129-140.

244. Бирюков В. В., Кантере, В. М. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза. // М.: Наука. 1985.292 с.

245. Jakson R. S. Wine tasting: a professional handbook. // Academic Press. 2002.291 P

246. Нужный В. П. Вино в жизни и жизнь вине. // Воронеж: Модек. 2001. 396 с.

247. Pimentel D., Patzek Т. W. Ethanol production using corn, switchgrass, and wood; biodiesel production using soybean and sunflower. // Nat. Res. Resear. 2005. V. 14. P. 65-76.

248. Грачева И. М., Кривова А. Ю. Технология ферментных препаратов. // М: Элевар. 2000. 512 с.

249. Ballesteros M., Oliva J. M., Negro M. J., Manzanares P., Ballesteros I. Ethanol production from paper material using a simultaneous saccharification and fermentation system in a fed-batch basis. // World J. Microb. Biot. 2002. V. 18. P. 559-561.

250. Martin C., Galbe M., Wahlbom F., Hahn-Hagerdal В., Jonsson L. J. Ethanol production from enzymatic hydrolysates of sugarcane bagasse using recombinant xylose-utilising Saccharomyces cerevisiae. II Enzyme Microb. Tech. 2002. V. 31. P. 274-282.

251. Love G., Nigam P., Barron N., Singh D., Marchant R., McHale A. Ethanol production at 45°C using preparation of Kluyveromyces marxianus IMB3 immobilized in calcium alginate and kissiris. // Bioprocess Engineering. 1996 V. 15. p. 275-277.

252. Goksungur Y., Zorlu N. Production of ethanol from beet molasses by Ca-alginate immobilized yeast cells in a packed-bed bioreactor. // Turk. J. Biol. 2001. V. 25 p. 265275.

253. Amutha R., Gunasekaran P. Production of ethanol from liquefied cassava starch using co-immobilized cells of Zymomonas mobilis and Saccharomyces diastaticus. И J. Biosci. Bioeng. 2001. V. 92. p. 560-564.

254. Nigam J.N., Gogoi В. K., Bezbaruah R.L. Short communication: alcoholic fermentation by agar-immobilized yeast cells. // World J. Microbiol. Biotech. 1998. V. 14. p. 457-459.

255. Sakurai A., Nishida Y., Saito H., Sakakibara M. Ethanol production by repeated batch culture using yeast cells immobilized within porous cellulose carriers. // J. Biosci. Bioeng. 2000. V. 90. p. 526-529.