автореферат диссертации по приборостроению, метрологии и информационно-измерительным приборам и системам, 05.11.11, диссертация на тему:Количественный анализ культуральных жидкостей штаммов-продуцентов промышленных антибиотиков различных классов методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии

На правах рукописи

АНТОНОВА СВЕТЛАНА ВЛАДИМИРОВНА

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ ЖИДКОСТЕЙ ШТАММОВ-ПРОДУЦЕНТОВ ПРОМЫШЛЕННЫХ АНТИБИОТИКОВ РАЗЛИЧНЫХ КЛАССОВ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Специальность 05.11.11 - хроматография и хроматографические приборы

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2009

003481717

Работа выполнена в Федеральном Государственном Унитарном Предприятии Государственном Научно-Исследовательском Институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Научные руководители: доктор химических наук Красиков Валерий Дмитриевич кандидат химических наук Тяглов Борис Владимирович

Официальные оппоненты: кандидат химических наук, профессор Гурковская Елена Александровна Московский Государственный Университет технологий и управления доктор фармацевтических наук Дегтерев Евгений Викторович ОАОЦХЛС-ВНИХФИ

Ведущая организация: Химический факультет Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится 10 ноября 2009 года в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 002.259.04 при Учреждении Российской академии наук Институте физической химии и электрохимии имени А.Н. Фрумкина по адресу: 119991, г. Москва, ГСП-1, Ленинский пр-т, д.31, корп. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института физической химии и электрохимии имени А.Н. Фрумкина.

Автореферат размещен на сайте: http://phyche.ac.ru Автореферат разослан 9 октября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Л.Н.Коломиец

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Современная биотехнологическая промышленность - наиболее перспективный, а зачастую и единственный способ получения целого ряда веществ, используемых в качестве лекарственных препаратов, сырья для химической и фармацевтической промышленности, а также пищевых и кормовых добавок. Основная доля продукции биотехнологического производства, как в количественном, так и в стоимостном выражении приходится на синтезируемые микроорганизмами низкомолекулярные соединения: аминокислоты, антибиотики, нуклеотиды, нуклеозиды и витамины. Неотъемлемой частью создания новых, более эффективных и экономичных биотехнологических процессов является разработка соответствующих аналитических методов, обеспечивающих контроль протекания этих процессов и качество получаемых продуктов.

Так при отборе перспективных штаммов — продуцентов биологически активных веществ, при оптимизации условий ферментации и контроле промышленных биотехнологических процессов необходимо решать задачи массового анализа получаемой продукции. Основные требования к аналитическим методикам контроля в биотехнологии, учитывая объем и характер выполняемой работы - экспрессность анализа, простота подготовки проб, и дешевизна, а главное возможность получения точных количественных результатов с погрешностью измерения не более 5%.

Простота и экспрессность метода обеспечивают его массовое использование, как при лабораторных исследованиях, так и в условиях производства; неточность и ненадежность метода, вообще не должны подлежать рассмотрению, а дороговизна метода сильно ограничивает его возможности.

Биотехнологические образцы, которые являются объектами анализа, представляют собой сложные смеси, которые содержат не только целевые продукты и их предшественники, но и компоненты исходной питательной среды и продукты их превращений. Биосинтез антибиотиков является вариантом метаболических процессов, которые протекают в клетке, однако небольшие изменения этих процессов приводят к весьма широкому набору полученных продуктов, поэтому антибиотики, как правило, образуются семействами, т.е. один и тот же штамм продуцирует два или несколько антибиотиков, близких друг к другу по структуре и свойствам [Гейл И., 1975; Овчинников Ю. А., Иванов В. Т., 1974; Франклин Т., Сноу Д., 1984]. Анализ дополнительно усложняется тем, что основой образца, является водная матрица, а общее содержание органических веществ может достигать 20-30%: Вследствие этого, непосредственное определение, даже одного компонента в биотехнологическом образце каким-либо спектральным аналитическим методом (спектрофотометрией, флуоресцентной спектроскопией и т.д.) в большинстве случаев, не позволяет получить достоверных результатов. При использовании хроматографических методов, как правило, удается добиться разделения и количественного определения компонентов со схожими характеристиками.

В настоящее время для анализа антибиотиков используется планарная хроматография (современная тонкослойная хроматография (ТСХ), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и капиллярный электрофорез (КЭ). Выбор того или иного метода определяется конкретной задачей, стоящей перед исследователем.

Количество научных статей как прикладного, так и обзорного характера, посвященных непосредственно определению антибиотиков в культуральных жидкостях (КЖ), оказалось незначительным. Так, хорошо известный журнал "Analytical Chemistry" выпускает специальные обзорные номера, посвященные аналитической химии, в том числе и хроматографии в конкретных областях исследования (вода, пищевые продукты и т.д.), однако этот перечень не включает биотехнологию. Журнал "Biotechnology. Bioscience and Bioengineering", издаваемый в Японии, в разделе "Analytical Chemistry" практически не публикует статьи, связанные с определением антибиотиков, а основная масса публикаций по прикладной хроматографии посвящена биомедицинским исследованиям. В частности эту тему охватывает журнал "Journal of Chromatography. Biomedical Applications". В .монографии "High Performance Liquid Chromatography in Biotechnology" антибиотикам, аминокислотам, витаминам и нуклеозидам, являющимися основными продуктами биотехнологических производств, уделено мало внимания. Таким образом, возникает некий парадокс: бурно развивающаяся и экономически

Лг?

эффективная отрасль промышленности - микробиологический синтез антибиотиков, аминокислот, нуклеозидов и т.п. - лишена аналитического обеспечения. Возможно, все это обусловлено тем, что основная часть биотехнологических разработок выполняется в исследовательских центрах крупных фирм, и применяемые при этом аналитические методы являются "know-how" этих фирм.

На сегодняшний день разработаны методы определения низкомолекулярных соединений, в так называемых биомедицинских образцах, однако, при этом не уделялось внимания биотехнологическим препаратам и разработке хроматографических методов их анализа, учитывающих специфику микробиологического синтеза. Особенно это относится к анализу антибиотиков в биотехнологических препаратах, что и определяет актуальность данной работы.

Цель и задачи исследования:

Целью данной работы являлась разработка количественных методов анализа КЖ штаммов - продуцентов антибиотиков разных классов, таких как: тилозин, вирджиниомицин, моеномицин, биалафос и фосфомицин с использованием количественной высокоэффективной тонкослойной хроматографии.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. На основе проведенных исследований подобрать условия для разделения КЖ изучаемых антибиотиков на ВЭТСХ пластинках «Сорбфил»

2. На основе проведенных исследований выбрать оптимальные условия визуализации и параметров детектирования изучаемых антибиотиков

3. Разработать условия для экспресс - анализа КЖ вирджиниомицина, моеномицина и биалафоса методом электроосмотической тонкослойной хроматографии (ЭО-ТСХ)

4. Проверить устойчивость антибиотиков на слое силикагеяя в процессе анализа.

5. Определить полноту экскретирования тилозина, вирджиниомицина, биалафоса и фосфомицина из клетки.

6. Обеспечить высокую точность результатов анализа (с погрешностью измерения менее 5,0%, что согласуется с нормативно-технической документацией (HTD), принятой на предприятиях микробиологической промышленности РФ)

Научная новизна

1. Предложены условия анализа для разделения компонентов КЖ штаммов-продуцентов исследованных антибиотиков на отечественных пластинках «Сорбфил». Показана селективность выбранных подвижных фаз для разделения исследуемых аналитов в КЖ.

2. Определены оптимальные условия нанесения обнаруживающих реагентов и проведения цветных реакций на хроматограммах для количественного определения моеномицина, биалафоса и фосфомицина. Показана устойчивость полученных комплексов визуализирующих агентов и антибиотиков во времени.

3. Предложены условия для экспресс - разделения компонентов КЖ штаммов-продуцентов моеномицина, вирджиниомицина и биалафоса методом ЭО-ТСХ. Показано, что используя метод ЭО-ТСХ и денситометрию можно получить информацию о содержании антибиотика в пробе КЖ в течение 15-35 мин

4. Для доказательства устойчивости антибиотиков на слое силикагеля в процессе анализа были проведены предвалидационные тесты. Показано, что исследуемые антибиотики не подвергаются деструкции в условиях проведения эксперимента, и только моеномицины устойчивы на тонких слоях силикагеля в течение 60 мин.

Практическая значимость

Разработанные методы были использованы для идентификации и анализа антибиотиков: тилозина, вирджиниомицина, моеномицина, биалафоса и фосфомицина в КЖ промышленных штаммов-продуцентов. Полученные сведения о накоплении сопутствующих антибиотикам метаболитов способствуют пониманию путей биосинтеза этих соединений в генетически модифицированных микроорганизмах и позволяют снизить и сузить уровень накопления этих примесей. На основе полученных данных о составе и содержании сопутствующих метаболитов могут быть сделаны прогнозы об «активации» путей биосинтеза целевых продуктов, что позволит оптимизировать процессы селекции и ферментации соответствующих штаммов-продуцентов.

На защиту выносятся следующие результаты и положения:

1. Разработка методов хроматографического разделения антибиотиков: тилозина, вирджиниомицина, моеномицина, биалафоса и фосфомицина в ЮК (пластинки «Сорбфил»),

2. Выбор оптимальных условий проведения цветных реакций при обработке хроматограмм обнаруживающими реагентами для последующего количественного определения моеномицинов, биалафоса и фосфомицина с помощью денситометрии.

3. Результаты изучения стабильности окрашенных комплексов образованных моеномицином, биалафосом и фосфомицином (на хроматограммах).

4. Разработка экспресс - методов анализа ЮК вирджиниомицина, моеномицина и биалафоса с помощью ЭО-ТСХ.

5. Результаты количественного определения антибиотиков и сопутствующих им в КЖ примесей промышленных штаммов-продуцентов, полученные с помощью валидированных методик.

Апробация результатов работы

Основные результаты работы были представлены: на Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматографические приборы» Научный совет по адсорбции и хроматографии РАН. Москва-Клязьма 14-18 марта 2005г.; Международной школе-конференции посвященной 100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна «Генетика микроорганизмов и биотехнология» Москва-Пущино 15-19 октября 2006 г.; Всероссийском симпозиуме «Хроматография в химическом анализе и физикохимических исследованиях» Научный совет по адсорбции и хроматографии РАН. Москва-Клязьма 23-27 апреля 2007г.; Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия» Научный совет по адсорбции и хроматографии РАН. Москва-Клязьма 14-18 апреля 2008 г.; Международной школе-конференции посвященной 40-летию создания ГосНИИгенегака Москва-Пущяно 21 -24 октября 2008 г.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, десяти глав обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Материал диссертации изложен на 163 страницах машинописного текста, содержит 50 рисунков и _29_таблиц, в списке цитируемой литературы 257 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Введение. Обоснована актуальность исследования, сформулированы цели и задачи, отражены научная новизна и практическая значимость работы.

2. Обзор литературы. Проведен сравнительный анализ различных хроматографических методов, необходимых для разделения антибиотиков различных классов в биологических образцах. Рассмотрены стационарные фазы для ТСХ, а также свойства и стратегии подбора подвижных фаз в ТСХ. Описаны методы обнаружения соединений на пластинках для ТСХ и их количественной оценки с использованием денситометрирования. Рассмотрены методы оценки погрешности измерения.

3. Техника и методика эксперимента. В этом разделе описаны методы получения стандартных образцов антибиотиков и пробоподготовка КЖ штаммов-продуцентов исследуемых антибиотиков.

В работе были использованы хроматографические высокоэффективные пластинки "Сорбфил" ПТСХ-АФ-В и ПТСХ-В-П-УФ, размер 10x10, 10x15 и 10x20 см, АО "Сорбполимер", изготовленные по технологии разработанной в ИВС АН СССР и хроматографические пластинки "Kieselgel 60", F 254, "Merck" (Германия). Перед экспериментом пластинки промывали и активировали.

В работе использовали следующие подвижные фазы (объемные соотношения компонентов):

- Тилозин: "А" этилацетат-диэтиламин (95.5 + 4.5);

"Б" изоамиловый спирт, насыщенный 2н водным аммиаком; "I" этанол-ацетонитрил-диэтиламин (100+100+1);

- Вирджиниомицин: "В" хлористый метилен-метанол (90+10);

"Г" хлороформ-метанол (95+5);

"Д"хлороформ-метилизобутилкетон-ледяная уксусная кислота (9+5+3); "Ж" хлороформ-метанол (98+2);

"II" диметилеульфоксид-вода-триэтаноламин (95+4+1);

- Моеномицин; "3" пропанол-1 -25%-ный водный аммиак (65+35);

"Ш" диметилсульфоксид-триэтаноламин-вода (90+5+5);

- Биалафос: "И" пропанол-2 -25%-ный водный аммиак (7+3);

"1У'диметилсульфоксид-диметилформамид-триэтаноламин-вода (85+5+2+8);

- Фосфомицин: "К" этанол -2%-ный водный раствор хлористого натрия-25%-ный водный

аммиак (15+2,5+2,5); "Л" пропанол-2 -этанол-25%-ный водный аммиак-вода (7+7+4+2); Установка, для проведения электроосмотической тонкослойной хроматографии состояла из 2-х блоков: высоковольтного выпрямителя PS-25, фирмы «Shandon» (Англия) (0-25 кВ, максимальный ток 1000 мкА) и горизонтальной (электрофоретической) камеры с охлаждаемым «предметным столиком» фирмы «LKB» (Швеция).

Для количественной обработки ТСХ хроматограмм использовались денситометры:

- Тилозин: Shimadzu CS-920 (Х-282нм), ДенСкан -02 (Х-282нм) и UVP8000 (Х-282нм);

- Вирджиниомицин: Shimadzu CS-920 (Х-230нм) и UVP8000 (>.-254нм);

- Моеномицин: Shimadzu CS-920 (А-510ям) и Camag TLC-Scanner 3 (Я-510нм);

- Биалафос: Shimadzu CS-920 (Х-530нм) и ДенСкан -01 (Х-530нм),

- Фосфомиции: Shimadzu CS-920 (А.-470нм) и Camag TLC-Scanner 3 (Х-470нм). Количественную обработку полученных результатов проводили на компьютере. Спектры поглощения антибиотиков на хроматограммах (in situ) регистрировали на

денситометрах: Shimadzu CS-920 и Camag TLC-Scanner 3.

В работе использовали жидкостной хроматограф: "Alliance", снабженный спектрофотометрическим детектором с фотодиодной матрицей и "Delta Prep 3000", снабженный спектрофотометрическим детектором 481 "Waters", (США). Прием и обработку данных производили с использованием программного обеспечения "Empower Pro". Условия проведения анализа представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Условия проведетм ВЭЖХ_

антибиотик Условия

Тилозин колонка ReproSil-Pur C18-AQ, 5 цш, 250 х 4.0 шт., температура колонки - 30° С. объем пнжекцт - J мкл, подвижная фаза: ацетонтрнл: 0.2 М раствор тетрабуткламмоний бромида: 0.2 М раствор ортофосфорной кислоты: вода (Super - 0) = 23 : 3 : 5 :69, скорость потока - 0,5 мл/мин, X - 28Зим.

В ирджиыиомиции колонка "Bondapac CIS" 4,6x250 мм, Smkm; объем инжекции - 5мкл. подвижная фаза: метанол - вода - трифторуксусиая кислота 65:35:0,1, скорость потока 1,5 мл/мин, X - 220 нм.

Моеномицин колонка ц-Bondapak С18 4,0 х 250 мм, 5 мкм, объем инжекции -10 шел. температура колонки 25°С.» подвижная фаза: ацетонитрил-метанол-в ода =1:4:5, скорость потока -1,3 мл/мин. X - 258 нм.

Биалафос колонка "ц-Bondapak - CIS" 4,6x250мм, 5,0 цт, объем инжекции - 10,0 мхл, подвижная фаза: раствор 20%-ного водного ацетонитрила, содержащего !0'3М сульфата меди, скорость потока - 0,5 мл/мин, X - 240 нм.

Для количественного определения фосфомицина методом КЭ был использован прибор "Model LC3D" (Agilent Technologies, США) со спектрофотометрическим детектором, снабженным фотодиодной матрицей и программным обеспечением «ChemStation». Разделение проводили на капилляре с рабочей длиной 50 см (общая длина 57 см) и внутренним диаметром 75 дм, при температуре - 30°С. Приложенное напряжение составляло 30 kV. Работай электролит: 15 тМ 4-гидроксибензойная кислота в 200 шМ боратном буфере рН 9,0-9,2.

В этой главе так же описаны методы исследования полноты экскретирования антибиотиков клетками, проведения биоавтографии и определения концентрации антибиотиков микробиологическим методами.

4. Результаты и обсуждение.

4.1. Количествепиое определение тилозина и сопутствующих ему макролидов в КЖ промышленных штаммов-продуцентов.

Тилозин (Tylosin) является продуктом штамма-продуцента Streptomyces fradiae.

Наряду с гилозином (А) при биосинтезе получаются и другие родственные продукты -дезмикозин (В), макроцин* (С), реломицин ф) и другие, которые, за исключением реломицина, имеют одинаковый спектр антимикробной активности и не являются токсичными. Для изучения биологической активности дезмикозина, реломицина и макроцина нами были синтезированы дезмикозин и реломицин (из тилозина), а макроцин был получен из КЖ экстракцией бутилацетатом и концентрированием, а затем выделен с помощью колоночной хроматографии низкого давления на силикагеле. Чистота полученных макролидов по данным ВЭЖХ составляла 92-95%. Изучение антимикробной активности проводили на тест - культуре Вас. зиЬМи. Было установлено, что величины активности дезмикозина, реломицина и макроцина составляют 0.95-1-0.05, 0.4±0.05 и 0.2±0.05 соответственно, за единицу была принята активность тилозина.

В нашей работе для разделения тилозинов в КЖ мы использовали рекомендованную в литературе элюирующую систему: этилацетат-диэтиламин (92+8), при этом в качестве стационарной фазы использовались ТСХ-пластинки "К1е5е^е1 60, Р254. Разделение макролидов проводили на ВЭТСХ-пластинках "Сорбфил", с помощью разработанной нами подвижной фазы: этилацетат-диэтиламин (95.5+4.5) - система «А». Время разделения составляет 20 мин при длине пробега фронта элюента 7 см (рис. 1).

Рис. 1. Хроматографическоеразделение образцов-стандартов и пробы КЖ Sir. Fradie на ТСХ-пчастинках «Сорбфил»: l-тилозин; 2-дезмикозин; З-рапомицин; 4-макроцин; 5-смесъ веществ-стандартов; б-проба КЖ. Элюент: система «А».

Для осуществления контроля степени гомогенности исследуемых соединений в индивидуальных пятнах, была предложена система «Б» - изоамиловый спирт, насыщенный 2н водным аммиаком. Обе системы обладали одинаковой селективностью, но при использовании системы «Б» продолжительность анализа составляла 80 мия при длине пробега фронта растворителя 7 см, что накладывало некоторые ограничения на ее использование в массовом анализе, (рис 2).

D J ООО

10 20 39

SO . М 7» 89 90

10 20 М 40 50 «I ТП 80 90

Rf-100

Рис. 2. Денситограмма разделения тилозина, дезмикозина и реломицина в системах «А» (а) и «Б» (Ь).

Дополнительная идентификация гомогенности соединений, полученных при разделении КЖ Sir. fradiae в системах «А» и «Б», была проведена с помощью метода ВЭЖХ. Установлено, что каждый из исследуемых антибиотиков практически не содержал примесей и элюировался в виде острого симметричного пика. В работе было показано, что компоненты нулевой КЖ остаются на старте и не мешают определению макролидов.

Количественное определение тилозина и сопутствующих ему в КЖ антибиотиков было выполнено на денситометре "Shimadzu CS-920" (Япония) при X = 282 нм, а так же на отечественном видеоденситометре "ДенСкан 02" (Россия) и аналогичной ему видеосистеме "UVP-8000" (США). При использовании видеоденситометров время сканирования хроматограммы (21 точка) составляло 3-5 мин., погрешность среднего измерения (с) менее 4,5%, при Р 0,95, п=5 (предел обнаружения составляет 0,3 мкг/пятне, а предел количественного определения 0,5 мкг/пятне, область линейного сигнала (площадь пика) 0,5-3,0 мкг/пятне, г=0,9985). Результаты количественного определения тилозина, реломицина и дезмикозина представлены в таблице 2.

Также было проведено определение величин денситометрических сигналов пятен сопутствующих тилозину макролидов при X = 282 нм и рассчитаны корректирующие

* Синтезируется в КЖ при пониженной степени аэрации.

нормировочные коэффициенты (фактор отклика Н), при этом величина денситометрического сигнала тилозина бьша принята за единицу {таблица 3).

Таблица 2.

Определение тилозина и сопутствующих ему макролидных антибиотиков (г'л) в пробах КЖ, различных партий (Str. fradiae, штамм Б45) выполненное методауи ВЭТСХ (I) и ЕЗЖХЩ), (п = 5; Р 0,95)_

Номер пробы КЖ Тилозин Дезмикозин Реломицпн

I 11 I 11 I 11

С, г/л е,% С, г/л е,% С, г/л £,% С, г/л £,% С, г/л е,% С, г/л е,%

1 2,4 4.3 2,3 2.3 0,4 3.9 0,4 2.8 - - -

2 3,0 2.8 3,0 3.1 0,6 4.7 0,5 4.9 0,1 3.8 0,1 4.9

3 1,9 4.0 2,0 3.3 0,1 3.4 0,1 4.5 0,1 3.6 0,1 3.5

4 5,1 3.5 5,2 1.7 ОЛ 2.0 0,2 1.7 0,2 4.2 0 Л 3.8

5 4,9 1.8 4,8 1.1 0,7 4.5 0,6 1.9 0,2 4.0 0 Л 1.7

6 5,3 3.2 5,3 1.9 0,4 4.9 0,3 2.3 - - - -

7 2,2 3.2 2,1 2.5 0,3 2.7 0,3 2.2 0,1 3 2 0,1 2.2

8 3,4 4.1 3,5 3.6 0,3 2.9 0,3 2.8 0Л 3.5 0,3 4.8

9 3,9 2.0 3,8 2.0 0,6 3.6 0,7 3.2 - - -

10 2,5 3.3 2,5 1.6 0,7 4.4 0,8 4.6 - - - -

1=0,99115 гЮ,98754 1=0,98106

Таблица 3.

Фактор отклика (F) макролидов-компанеитов КЖ штамма-продуцента тилозина, /. '2S2 нм, ВЭТСХ-пластинки "Спрбфил", денситометр "ShimadzuCS-920",(n-5; Г 0,95)

антибнотих Тилозин Дезмикозин Реломицин Макроции

F 1.00 1.17 0.98 0.95

3.2 3.9 2.8 3.7

Используя эту методику, было проведено исследование полноты экскретировация антибиотиков семейства тилозина в среду при этом установлено, что они полностью экскретируются клеткой; влияния аэрации на биосинтез макроцина, также были пайдены оптимальные условия аэрации при которых биосинтез макроцина - побочного продукта синтеза тилозина, был сведен к минимуму; изучены факторы влияющие на эффективность процесса экстракции макролидных антибиотиков из культуралыюй жидкости бутилацетатом. В завершение, была изучена устойчивость антибиотиков семейства тилозина, входящих в состав ветеринарных препаратов "Фрадизин-20" и "Фрадизин-40", в условиях длительного хранения при четырех различных температурных режимах (-20, -5, 28 и 37°С), и показано что, срок хранения препаратов "Фрадизин-20" и "Фрадизин-40" составляет 6 месяцев при 28°С.

4.1.1. Изучение влияния процесса культивирования продуцента тилозина на распределение антибиотика при экстракции бутилацетатом изКЖ.

В процессе предварительной очистки и концентрирования препарата тилозина бьша использована экстракция ЮК бутилацетатом. Установлено, что эффективность извлечения тилозина из КЖ с высоким содержанием антибиотика (до б г/л) может существенно снижаться по сравнению с аналогичной процедурой для КЖ с содержанием целевого продукта (до 2 г/л) (рис. 3).

Рис. 3. Эффективность экстракции тилозина (К,) из разных партий нашивного раствора с различным конечным содержанием антибиотика

Для выяснения причин снижения эффективности процесса (Кр*) экстракции тилозина из высокоактивных КЖ, исследовали влияние концентрации антибиотика на величину К,, на модельных системах. При введении тартрата тилозина в партии КЖ установлено, что с увеличением концентрации антибиотика происходит возрастание величины Кр. При введении в КЖ от 1,8 до 7,0 г/л тилозина величина Кр возрастала с 7.7 до 13.8, в то время как для КЖ с исходной концентрацией тилозина 5,1 г/л при достижении общей его концентрации -6,3 г/л величина Кр возрастала с 4.6 до 5.2, и затем до 6.6 при

"SC;-

№ W«, X,» *<*V КомММТряОИЯ 1Я.14МШЯ, MXlN<»

" Кр - коэффициент распределения

достижении содержания тилозина в образце 9,0 г/л.

Таким образом, снижение эффективности процесса экстракции вызвано не присутствием антибиотика в КЖ, а, очевидно, свойствами самой КЖ, определяемыми ходом процесса ферментации.

Чтобы исключить возможное влияние состава питательной ферментационной среды на величину Кр, проведена серия экспериментов по введению тартрата тилозина (до 6 г/л) в суспензию отдельных компонентов среды, а также в исходную ферментационную среду (до и после стерилизации). Результаты экспериментов показали, что ни отдельные компоненты, ни композиция среды в целом не влияли на уменьшение величины Кр при экстракции тилозина. Следовательно, изменение эффективности экстракции тилозина из партий КЖ с высоким содержанием антибиотика определяется только ходом процесса ферментации. Так, в процессе ферментации тилозина образуются: реломицин, макроцин, дезмикозин и др. Уровень накопления их в КЖ, очевидно, варьирует в зависимости от условий культивирования. По литературным данным, тилозинподобные вещества имеют существенно меньшую величину Кр: для тилозина 21-24, для дезмикозина - 6, для макроцина - 1.

При изучении влияния времени культивирования продуцента тилозина на эффективность его экстракции установлено два типа закономерностей изменения Кр, связанные с биосинтезом биомассы и различием в ходе биосинтеза тилозина (табл. 4).

Таблица 4.

Изменения величины Кр при экстракции тилозина из образцов КЖ, полученных на разных стадиях процесса

ферментации (п - 5; Р 0,95)

Номер опыта, конечное содержание тилозина, г/л Продолжительность культиви рованкя, ч

60 80 100 120 140 160 180 200

I 0,6 С, * г/л - - 0,3 0,3 0,4 0,5 0,5 0.6

К, - - 14,6 15,1 15,1 13,7 13,3 13 л

11 1,4 С, «г/л - 0,6 0,8 0,9 1,0 - 1,2 ■

к. - 12,2 10,7 11,6 10,9 - 10,8 -

П1 5,6 С, »г/л 0,3 0,6 1,4 2,2 2,8 - 4,2 5,5

к„ 14,6 15,4 12,1 9,2 7,7 - 5,6 4,2

IV 3,6 С, *гЛг 1,00 1,5 2,5 2,9 - 3,5 3,6 -

к. 10,8 8,4 7,6 7,4 - 6,8 6,5 -

V 5,2 С, 'г/л 0,7 1,0 1,3 2,3 3,0 3,9 4,3 5,1

к, 11,2 10,4 9,7 7,5 6,9 6,7 5,5 4,8

* С - концентрация антибиотика в КЖ

В период роста биомассы, но при отсутствии интенсивного антибиогикообразования (опыт I, II) величина Кр практически не изменялась и была достаточно высока 10-15. Во время интенсивного биосинтеза тилозина (опыты III - V) наблюдалось значительное снижение величины Кр с 10 - 15 до 6 - 4. Контроль за накоплением тилозина и его производных показал, что количество тилозинподобных веществ в ходе ферментации не превышало 15 - 20% от содержания тилозина. Сопоставляя закономерности изменения величины Кр в процессе ферментации (опыт II и III) с уровнем накопления тилозинподобных веществ (~20% от содержания тилозина) можно предположить, что значительное уменьшение Кр при экстракции из объектов с высоким уровнем накопления антибиотика связано с затруднениями перехода антибиотика в органическую фазу, вызванными накоплением биомассы и, вероятно, образованием неконтролируемых метаболитов.

Для повышения величины Кр было использовано «высаливание».

4.1.2. Изучение распределения антибиотика тилозина между нативным раствором и бутилацетатом в присутствии неорганических солей.

В первой серии экспериментов, проведенных на модельных растворах тартрата тилозина в воде, была изучена зависимость Кр от концентрации антибиотика в растворе (Рис. 4).

Из рисунка 4 видно, что с увеличением содержания антибиотика в растворе величина Кр возрастает. В изученном диапазоне концентраций зависимость Кр от содержания тилозина имеет линейный характер и переход молекулы тилозина из водной фазы в органическую облегчается в присутствии 0,5% хлористого натрия. Этот факт, очевидно, можно объяснить снижением степени гидратации молекулы антибиотика.

Было изучено влияние концентрации хлорида и сульфата натрия, а также сульфата

8

аммония на эффективность экстракции тилозина на модельных растворах (табл. 5). Показано, что с увеличением содержания соли происходит увеличение коэффициента распределения; при этом снижается содержание антибиотика в отработанном модельном растворе.

Рис. 4. Влияние концентрами тилозина в модельном растворе на величину К^ 1 - водный раствор тартрата тилозина; 2 - тартрат тилозина в 0,5%-ном растворе упористого натрия.

Однако, при введении этих солей в модельные растворы в концентрации более 5% в ряде случаев наблюдалось опалесценцих и выпадение осадка, поэтому оптимальной концентрацией соли была выбрана 5%. При работе с реальными КЖ введение ~ 10% вышеуказанных солей приводило к образованию плотного «промежуточного слоя», содержащего тилозин, что обуславливало ~ неизбежное повышение потерь на этой стадии.

дам—т». мут*»*

Таблица 5.

Влияние добавок солей на величину К„ при экстракции тилозина из модельного раствора (п=3, Р 0.95)

Концентрация соли, %

Значения Кр, при введении солей в модельный раствор тартрата тилозина, С = 4900 мкг/мл

Натрий хлористый

Натрий сернокислый Аммоний сернокислый

0(контроль)

0,5 1,0 5,0 10,0

20,9 22,1 25,4 45,9 109,3

21.3 24,7 28,9

54.4 121,0

21.4 28,1

32.5 72,3 136,0

Было установлено, что при введении хлористого или сернокислого натрия в количестве до 6 - 7% выпадения антибиотика в осадок не наблюдалось, при этом величина рН составляла 7,2. Однако при использовании сульфата аммония уменьшение значения рН с 7,2 до 6,5, приводило к необходимости подщелачивания. Результаты исследований влияния неорганических солей на Кр тилозина при экстракции из КЖ представлены в таблице 6. Из данных таблицы 6 следует, что с увеличением содержания соли происходило увеличение Кр и соответственно выхода тилозина, причем с увеличением концентрации антибиотика в исходной КЖ при равной концентрации соли значение Кр уменьшалось. Введение соли в концентрации 5% повышало Кр примерно в 2 раза и уменьшает содержание тилозина в отработанной КЖ на 40 - 50%, а это в свою очередь уменьшает неблагоприятное воздействие стоков производства на активный ил аэротенков очистных сооружений. Применение сульфата натрия в 5%-ной концентрации приводило к несколько большему увеличению значения Кр, однако, учитывая большую доступность и меньшую стоимость хлористого натрия, обосновывало использование последнего.

Таблица 6.

Влияние добавок солей на К„ тилозина при экстракции из КЖ бутилацетатом (п=3; Р 0,95)

Концентрация соли, % Значения Кр при введении различных солей

Исход ная концентрация тилозина, г/л

4,2 | 5,0 | 6Д 4,2 | 5,0 | 6,2 4,2 | 5,0 | 6,2

Нат] эий хлористый Натрий сернокислый Аммоний сернокислый

0(контроль) 5,5 4,7 3,6 5,6 4,8 3,8 - ■ - 3,6

0,5 5.6 4,9 4,2 6,0 5,1 4,3 - - 3,7

1,0 6,3 5,5 4,9 7.5 5,8 5,1 - - 3,8

3,0 8,3 7,0 5.9 8,9 7,8 7,6 - - 4,6

4,0 9,3 7,4 6,8 10,5 9,3 9.1 - - 5,4

5,0 10,5 8,5 7,4 11,2 10,8 9,7 - - 6,0

6,0 1М 9,5 «,2 12,4 11,9 11.7 - - 7,9

10,0 13,7 12,1 11,7 15,6 16,8 19,4 - - 10,0

Для проверки чистоты препарата был проведен анализ исходной КЖ, бутилацетатного экстракта и отработанной КЖ на наличие ионов натрия (потенциометрия, ЦЗЛ ПО

«Прогресс»), Данные анализа 5-ти опытов показали, что содержание контролируемого иона в отработанной КЖ не отличается от такового в исходной КЖ.

Таким образом, показано, что применение солей натрия в концентрации (до 5%) способствует повышению эффективности процесса экстракции, причем ионы натрия не переходят в органическую фазу и не снижают чистоты конечного продукта.

4.2. Анализ вирджиниомицинов в промышленных образцах КЖ.

Вирджиниомиципы (стафиломицины), продуцируемые культурой 51гер1отусгз \4rginiae представляют смесь семи макроциклических пептидлактонов, объединенных в два семейства М и 8. Семейство М включает в себя два антибиотика - У[М1] и У[М2], а семейство 5 насчитывает пять компонентов: У[81], Ур2], УрЗ], У[84] и У[85].

Образцы - стандарты вирджиниомицинов У[М2] и У[5(1-5)] не были доступны из коммерческих источников, поэтому их было необходимо выделить из КЖ и очистить. При выделении применялись мембранные методы, экстракция, переосаждение, жидкостная колоночная хроматография низкого давления на силикагеле и препаративная обращеянофазовая ВЭЖХ. Чистота полученных образцов стандартов составляла 96 ±2%.

Ранее определение вирджиниомицинов с помощью метода ТСХ проводилось при анализе кормов для животноводства и птицеводства, комбинированных лекарственных препаратов, а также при синтезе полусинтетических аналогов вирджиниомицинов, с помощью ТСХ-пластинок "ИеБе^е! 60, Рг54 " с применением подвижных фаз таких как: 1) хлористый метилен - метанол (9+1) - система «В»; 2) хлороформ - метанол (95+5) - система «Г»; 3) хлороформ-метилизобутилкетон-ледяная уксусная кислота (9+5+3) «Д». Однако ни в одной из работ не были представлены аналитические методики определения вирджиниомицинов, полученных с помощью микробиологического синтеза.

Для разделения вирджиниомицинов присутствующих в КЖ в качестве стационарных фаз мы использовали готовые стандартные пластинки " 60 Р254" - (I) а также

отечественные ВЭТСХ - пластины "Сорбфил", размером 10x15 см - (И). В качестве подвижной фазы применяли элюирующие системы «В», «Г» и «Д».

Было показано, что в случае подвижных фаз «В» и «Д», наблюдалось неудовлетворительное разделение компонентов КЖ уг^тае. В случае использования элюирующей системы «Г» было достигнуто разделение пятен У[М1], У[М2], а компоненты Б семейства эшоировались тремя пятнами. Доработку системы «Г» осуществляли, варьируя объемный процент хлороформа от 98 до 88% с шагом 0,5%, при этом было достигнуто полное разделение всех компонентов, входящих в состав обоих семейств при различных нагрузках на "дорожку", объемное соотношение хлороформа и метанола составляло - 98:2 (система «Ж»), Разделение было проведено за 25 мин, при длине пробега 7 см, (рис. 5).

я г—-—- Рнс. 5. Хроматографическоеразделение вирджиниомицинов на ВЭТСХ

' _, _.0_ -пластинках «Сорбфил». I- V [Щ; II- V[8]; Ш-смесь V[М] + У[5]: 1У-

„ « - о проба КЖ: 1- У [81]; 2-У [52]; 3-У [83]; 4-У [34]; 5-У [85]; 6-У [М1];

ч — • 7-V [М2] и 8-14-неизвестные компоненты КЖ. Элюент; система «Ж», и. о о - ' - о

I I - ! - • При подборе подвижной фазы также было показано, что „. - I ZZ ' концентрация метанола в элюенте, имеет существенное

° о - • - 2 влияние на геометрию пятен антибиотиков. Так, в случае

и ■ ' • —' - ' использования системы «Ж», пятна антибиотиков

_ о компактны и имеют круглую форму. • - Визуализацию пятен вирджиниомицинов на

» I * м

- хроматотограммах осуществляли с помощью

ультрахемископа при X = 254 нм; предел обнаружения 0,02 мкг/пятно. Количественное определение проводили на денситометре "БЫтаЛги СБ 920" при >.=230 нм. Предел количественного определения 0,05 мкг/пятно, область линейного сигнала от 0,05 до 2,0 мкг, г=0,9989. При анализе нулевой КЖ показано, что ее компоненты не мешают анализу.

В таблице 7 представлены результаты количественного определения У[М1] и У[51] вирджиниомицинов, выполненного на ВЭТСХ пластинках «Сорбфил». Определение вирджиниомицинов также проводилось методом ВЭЖХ. Данные, полученные обоими методами (е < 4,2%, п=5, Р 0,95), хорошо коррелируют.

Ю

аммония па эффективность экстракции тилозина на модельных растворах (табл. 5). Показано, что с увеличением содержания соли происходит увеличение коэффициента распределения; при этом снижается содержание антибиотика в отработанном модельном растворе.

Рис. 4. Влияние концентрации тилозина в модельном растворе на величину КР: I - водный раствор тартрата тилозина; 2 - тартрат тиюзина в 0,5%-ном растворе хлористого натрия.

Однако, при введении этих солей в модельные растворы в концентрации более 5% в ряде случаев наблюдалось опалесценция и выпадение осадка, поэтому оптимальной концентрацией соли была выбрана 5%. При работе с реальными КЖ введение - 10% вышеуказанных солей приводило к образованию плотного «промежуточного слоя», содержащего тилозин, что обуславливало неизбежное повышение потерь на этой стадии.

Таблица 5.

Влияние добавок солей на величину К0 при экстракции тилозина из модельного раствора (п=*3, Р 0.95)

Значения К,, при введении солей в модельный раствор тартрата тилозина.

Концентрация соли, % С = 4900 м кг/мл

Натрий хлористый Натрий сернокислый Аммоний сернокислый

0 (контроль) 20,9 21,3 21,4

0,5 22,1 24,7 28,1

1,0 25,4 28,9 32,5

5,0 45,9 54,4 72,3

10,0 109,3 121,0 136,0

Было установлено, что при введении хлористого или сернокислого натрия в количестве до 6 - 7% выпадения антибиотика в осадок не наблюдалось, при этом величина рН составляла 7,2. Однако при использовании сульфата аммония уменьшение значения рН с 7,2 до 6,5, приводило к необходимости подщелачивания. Результаты исследований влияния неорганических солей на Кр тилозина при экстракции из КЖ представлены в таблице 6. Из данных таблицы 6 следует, что с увеличением содержания соли происходило увеличение Кр и соответственно выхода тилозина, причем с увеличением концентрации антибиотика в исходной КЖ при равной концентрации соли значение Кр уменьшалось. Введение соли в концентрации 5% повышало Кр примерно в 2 раза и уменьшает содержание тилозина в отработанной КЖ на 40 - 50%, а это в свою очередь уменьшает неблагоприятное воздействие стоков производства на активный ил аэротенков очистных сооружений. Применение сульфата натрия в 5%-ной концентрации приводило к несколько большему увеличению значения Кр, однако, учитывая большую доступность и меньшую стоимость хлористого натрия, обосновывало использование последнего.

Таблица б.

Влияние добавок солей на К„ тилозина при экстракции из КЖ бутилацетатом (п=3; Р 0,95)

Концентрация соли, % Значения Кр при введении различных солей

Исходная концентрация тилозина, г/л

4,2 5,0 6Д 4,2 5,0 6Д 4,2 5,0 6,2

Нэт] >ий хлористый Натрий сернокислый Аммоний сернокислый

0(контроль) 5,5 4,7 3.6 5,6 4,8 3,8 - ■ - 3,6

0,5 5,6 4,9 4,2 6,0 5,1 4,3 - - 3,7

1,0 6,3 5,5 4,9 7,5 5,8 5,1 - - 3,8

3,0 8,3 7,0 5,9 8,9 7,8 7,6 - 4,6

4,0 9,3 7,4 6,8 10,5 9,3 9.1 - 5,4

5,0 10,5 8.5 7,4 11,2 10,8 9,7 - 6,0

6,0 11,5 9,5 8,2 12,4 11,9 11,7 - 7,9

10,0 13,7 12,1 11,7 15,6 16,8 19,4 - 10,0

Для проверки чистоты препарата был проведен анализ исходной КЖ, бутилацетатного экстракта и отработанной КЖ на наличие ионов натрия (потенциометрия, ЦЗЛ ПО

За основу элюента была взята двухкомпонентпая система пропанол-1 - 25%-ный водный аммиак (75+25). Изучена зависимость величин Rf моеномицинов от соотношения растворителей с шагом 2.5 объемных процентов. Из полученных данных установлено, что лучшей селективностью обладает подвижная фаза пропанол-1 - 25%-й водный аммиак (65+35), система «3». Время разделения 45-50 мин, длина пробега фронта элюента 7.0см, температура 20°С. Величина Rf в данной системе составляла 0,66 ± 0,03 для МА, 0,50 ± 0,03 для MB и 0,32 ± 0,03 для МС. Все пятна имели круглую компактную форму, (рис. 6). При анализе нулевой КЖ показано, что ее компоненты не мешают анализу.

Моеномицины А и С имеют полосы поглощения в УФ-области спектра, поэтому визуализацию пятен, принадлежащих к МА и МС, осуществляли с помощью ультрахемископа. Для визуализации пятен MB, а также МА и МС, использовали обнаруживающий реагент - смесь хлорсульфоновой и уксусной кислот (2+1).

Рнс. 6. Денситограмма разделения моеномицинов А,ВиСв КЖ: 1-А: 2-В; 3-С; 4-неидентифицированыый компонент. Денситометр "TLC Scanner J " фирмы "Camag" (Швейцария), X - 510 нм.

Рис. 7. Зависимость отношения денситометрический сигнал/шум (S/N) от, (а)-врсмски окспозиции хроматограммы в растворе обнаруживающего реагента, (Ь)-времени нагрева хроматограммы при 100°С; 1-моеномицин А; 2-моеномицин В: 3-моеномщин С (каждого 0.14 мкг/пятне)

Для выбора оптимальных условий проведения цветной реакции на хроматограмме и используя метод погружения, мы исследовали зависимость денситометрического сигнала моеномицина А от времени пребывания хроматограммы в растворе обнаруживающего реагента и времени термической обработки хроматограмм при 100 С. Было установлено, что оптимальными условиями для обработки хроматограмм являются: погружение хроматограммы в раствор смеси хлорсульфоновой и уксусной кислот (2+1) на 7 -10 е., высушивание при 20°С в течение 20 мин. с последующим выдерживанием при 100°С в течение 5-7 мин (рис. 7). При соблюдении этих условий моеномицины наблюдались в виде малиновых пятен на белом фоне. Показано, что окраска пятен была устойчива в течение 3 суток, при хранении хроматограмм в защищенном от света месте при 20°С. В качестве репера использовали пятно насыщенного раствора дихромата калия (V = 0.3 мкл и 0=3.5мм). Увеличение времени экспозиции при погружении и нагревании хроматограммы, более 10 сек. и 7 мин., соответственно, приводили к появлению темного фона и уменьшению отношения сигнал-шум (S/N).

С помощью денситометра были записаны спектры поглощения пятен (in situ) моеномицинов А, В и С. Спектры моеномицинов практически не отличались друг от друга и имели максимум X - 510 нм, поэтому, именно эта длина волны была выбрана для количественных измерений. Полученные градуировочные кривые, были линейны в диапазоне 0.02-0.15 мкг антибиотика в пятне, г=0,9908. Пределы обнаружения для МА, MB, и МС - 0.01 мкг в пятне, а пределы количественного определения 0.02 мкг в пятне.

Количественное определение моеномицинов были также выполнены с помощью ВЭЖХ. В таблице 9 представлены результаты, количественного определения МА - основного компонента КЖ, в образцах КЖ из различных промышленных партий методами количественной ВЭТСХ и ВЭЖХ.

Как видно из данных таблицы, результаты, полученные обоими методами, хорошо коррелируют друг с другом, г = 0,9895.

Были также рассчитаны величины факторов отклика (F) для моеномицинов А, В и С, которые, как видно из таблицы 10 в пределах погрешности эксперимента совпадают друг с другом.

Таблица 9.

Определение содержания моенамщина Л (г/л) в промышленных пробах ЮК из различных партий, выполненное __методами количественной ВЭТСХ и ВЭЖХ.___

Номер пробы ВЭТСХ ВЭЖХ

С, г/л £,% С, г/л £, %

1 1.80 2.4 1.83 2.5

2 175 2.0 1.73 3.7

3 1.41 3.9 1.38 3.9

4 1.96 3.7 1.98 3.4

5 1.71 4.3 1.70 2.6

6 1.26 3.3 1.26 3.4

7 1.12 4.8 1.15 3.0

11-5; Р 0,95; г = 0,9895

Таблица 10.

Факторы отклика (F) моеномицинов А, В и С (ВЭТСХ - пластинки «Сорбфил», Я il Они, денситометр "Shimadzu _CS920", п= 5, PO,95)_

антибиотик MA MB MC

F 1.0 1.03 1.04

е,% 1.6 2.2 3.2

4.4. Анализ бналафоса и сопутствующих ему предшественников в КЖ.

Антибиотик биалафос (ВА) [4-(гидроксиметилфосфоноил) - L-2-аминобутирил - L-аланил-Ь-алаНин] продуцируется Streptomyces hygroscopicus. КЖ помимо биалафоса содержит его предшественник - фосфинотрицин (FT) [L-2-амино - (4-гидро.ксиметилфосфоноил) -масляная кислота], L-аланин, Ь-аланил-Ь-аланин, и неидентифицированные короткие пептиды. Этот антибиотик обладает не только антибактериальной, но и гербицидной активностью. При использовании ВА как гербицида он со временем полностью разрушается под воздействием ферментов, выделяемых почвенными микроорганизмами, что делает его экологически чистым.

Ранее для определения ВА и FT использовали бумажную хроматографию, причем время разделения варьировалось от 8 до 15 часов. ТСХ осуществляли на слоях силикагеля «Kieselgel 60» и целлюлозы «Cellulose», фирмы «Merck». Величины Rf биалафоса представлены в таблице 11.

Таблица 11.

Система растворителей, v/v силикагель целлюлоза

н-Бутанол - уксусная кислота - вода (2+1+1) 0,42 0,65

и-Бутанол - метанол - вода (4+1+2) 0,21 0,41

Этанол - 25%-ный водный аммиак - вода (8+1+1) 0,65 0,43

Этанол - вода (4+1) 0,25 0,66

Пропанол-1 -пиридин-СН,С00Н-Н20 (15+10+3+10) 0,45 0,40

Время разделения варьировалось от 50 до 100 мин. Мы использовали вышеуказанные подвижные фазы для разделения исследуемых компонентов КЖ Str. hygroscopicus на отечественных ВЭТСХ - пластинках «Сорбфил». Однако полного разделения необходимых нам четырех аналитов не удалось. Дня разделения ВА и FT на отечественных ВЭТСХ пластинках "Сорбфил" с помощью схемы, предложенной фирмой «CAMAG» была разработана подвижная фаза: пропанол-2 - 25%-ный водный аммиак (7+3), система «И». Однако, пятно ВА частично накладывалось на FT («восьмерка»). Учитывая то, что в зоне локализации пятен ВА и FT система не давала "второго фронта", мы воспользовались методом бинарного элюирования. Используя этот метод (1i=65mm, Ь=70мм) нам удалось добиться полного разделения пятен ВА и FT, а также увеличить ARf пятен аланина и аланил - аланина. Компоненты нулевой КЖ не мешали анализу. Перед повторным элюированием высушенная хроматограмма выдерживалась при 60°С в течение 30 мин. Таким образом, полное время разделения составляло 170 мин при 20°С (рис. 8).

Рис. 8. Хроматографическое разделение компонентов КЖ Str. hygroscopicus на ВЭТСХ ~ пластинках *Сорбфил»: l-биалофос; 2-фосфинотрицин; 3 -t-аланш; 4 -Ъ-алант-1нзланин; 5 -смесь веществ - стандартов: 6 -КЖ Str. hygroscopicus. Бинарное элюирование Ii - 65, /2 = Ю.Насыщение камеры 1 час, t = 2(fC. Элюент: система «И».

о о а

о ос?

О О а

О О о

. ... а

> а з « » «

4.4.1. Выбор оптимальных условий проведения цветной реакции для визуализации пятен ВА и FT на хроматограммах.

В качестве обнаруживающего реагента для визуализации пятен ВА и FT, а также сопутствующих им в КЖ примесям (аминокислотам, пептидам) был выбран нингидриновый реактив. В работах В.Д. Красикова и соавт., проведено детальное изучение количественного определения аминокислот различных классов, при этом использован метод погружения, и разработаны оптимальные условия проведения цветной реакции на хроматограммах. Необходимо было выяснить являются ли ранее разработанные условия пригодными для визуализации пятен ВА и FT.

Модельные растворы ВА и FT в концентрации 1,5 мг/мл наносили па пластинки "Сорбфил" (п = 5) и хроматографировали в системе «И» (бинарное элюирование: Ь=65мм, Ь=70мм). После элюирования хроматограммы в течение 15 мин. высушивались на воздухе, а затем в сушильном шкафу при 60°С в течение 30 мин. для удаления с активного слоя сшшкагеля остаточных компонентов подвижных фаз. Затем было проведено изучение величины денситометрический сигнал /Шум (S/N) от:

- времени пребывания хроматограммы в кювете с раствором цингидринового реактива (рис. 9);

Рве. 9. Зависимость величины денситометрический сигнал/шум от времени пребывания хроматограммы в кювете с раствором нингидрииового реактива; Условия проведения цветной реакции: температура - 65°С. время -30 мин. I-FT: 2- ВА.

■ времени проведения цветной реакции (рис. 10);

Рис. 10.

Зависимость величины денситометрический сигнал/шум от времени проведения цветной реакции; экспозиция хроматограммы в кювете с раствором нингидрииового реактива - 20 сек.; температура проведения - 65°С: 1-ГГ; 2- ВА.

- температуры проведения цветной реакции в течение 30 мин. (рис. 11).

Рис. 11. Зависимость ветчины денситометрический сигнал'шум от температуры проведения цветной peaKifuu; экспозиция хроматограммы в кювете с растворам нингидрииового реактива - 20 сек.; время проведения цветной реакции - 30 мин.; 1-FT; 2- ВА.

т—I

а ю а к « » ф ;к> «i № MBIU

На основании полученных результатов было сделано заключение, что для визуализации пятен ВА и FT оптимальными условиями являются: время погружения хроматограммы в раствор нингидрииового реактива 17-20 сек; время проведения цветной реакции 30-40 мин; температура проведения цветной реакции 60-65°С. При соблюдении всех вышеперечисленных условий пятна ВА и FT на хроматограммах имеют малиновый цвет, а фон на хроматограмме отсутствует. При выдерживании хроматограммы при температуре выше 70° на их поверхности появляется темный фон, обусловленный образованием продуктов термического окисления или конденсации молекул нингидрина, что приводило к уменьшению отношения сигнал-шум (S/N).

Для выяснения стабильности окраски пятен нингидриновых комплексов ВА и FT на хроматограммах, нами было проведено исследование денситометрических сигналов пятен ВА и FT на зфоматограммах от времени. Регистрацию депситометрических сигналов пятен ВА и FT на хроматограммах проводили при температуре 20°С через следующие промежутки времени: 0; 0,5; 1,0; 3,0; 5,0; 7,0; и 9,0 часов (рис. 12).

1200 ВОО 4X30

Ö ю *•час

В перерывах между измерениями хроматограммы выдерживали в защищенном от света месте. В качестве реперной точки использовали денситометрическнй сигнал пятна насыщенного раствора бихромата калия, который был нанесен на необработанный участок хроматограммы (0,3 мкл). Из рисунка 11 видно, что окраска пятен на хроматограммах исследованных ВА и FT при температуре 20°С устойчива в интервале от 0,5 до 7,0 часов. При хранении хроматограммы в холодильнике при - 12°С окраска пятен ВА и FT стабильна в течение 24-30 часов.

Денситометрирование пятен ВА и FT проводили на видеоденситометре «ДенСкан 01» и «Shimadzu CS 920» при X = 530 нм. Пределы обнаружения ВА и FT 0.5 и 0.1 мкг/пятно соответственно. Область линейного сигнала для ВА 0.8-4.0 мкг/пятно, г = 0.9931, для FT 0.2-2.0мкг/шстно. В качестве реферепсного метода использовали ВЭЖХ.

Результаты количественного определения ВА и FT в различных образцах КЖ Str. hygroscopius выполненные методами ВЭТСХ и ВЭЖХ представлены в таблице 12.

Результаты, полученные методом ВЭЖХ, хорошо коррелируют с данными денситометрического анализа ВА, г = 0,9980. На рис. 13 представлена денситограмма КЖ Sir. hygroscopicus.

Таблица 12.

Количественное определение ВА и FT (г/л) в образцах КЖ Str. hygroscopius выполненное методами ВЭТСХ и

Номер пробы КЖ ВЭТСХ ВЭЖХ

С, г/л £,% С, г/л £,%

IBA 2.7 4.5 2.8 2.1

FT 2.0 3 2 2.0 2.7

2 ВА 3.9 4.0 4.0 2.0

FT 2.5 4.5 2.5 1.4

ЗВА 3.7 3.1 3.9 3.5

FT 1.6 4.3 1.7 4.2

4 ВА 3.5 4.3 3.7 3.7

FT 2.0 3.1 2.1 2.9

SBA 1.4 4.6 1.5 4.0

FT 06 5.0 0 5 2.9

6BA 2.9 3.3 2.9 3.3

FT 1.4 3.8 1.5 3.8

7 ВА 3.1 2.5 3.0 2.1

FT 1.4 3 1 1.3 2.9

n = 5; P 0,95, r = 0,9980

Рис. IX Денситограмма КЖ/;у1;гтшууж"ш\

1-биалофос: 2-фосфинотрицип; З-Ь-аланин; 4~Ь-аланил-Ь-аланин; 5-неидентифицированный продукт.

Для ВА и РТ были рассчитаны факторы отклика (Р) которые составляли для ВА - 1.0 а для РТ - 1.48 (п = 5; Р 0,95), денситометр «ЗЫтайги СБ 920», Х = 530 им.

4.5.1. Количественное определение фосфомицина в КЖ методом ТСХ.

Антибиотик фосфомицин (Ь — цис - 1,2 - эпоксипропилфосфоновая кислота)* продуцируется рядом штаммов актиномицетов. Его особенностью является наличие в молекуле С - Р связи, причем асимметрический атом углерода, связанный с фосфором, входит в состав эпоксидного кольца. Этот антибиотик получают двумя путями: химическим и микробиологическим синтезом. В настоящее время химическое производство фосфомицина в ряде стран приостановлено, поэтому большое значение приобретает совершенствование биотехнологического процесса. В России для получения фосфомицина была выбрана культура ЗяерЮтусез унесЬпогетЬ. При работе с продуцентами фосфомицина в качестве тест - культуры использовали Египта сагоЮ\ога.

Ранее определение фосфомицина с помощью метода ТСХ проводилось при анализе готовых лекарственных форм (фарм. кинетика), а так же при контроле последней стадии синтеза этого антибиотика, при этом использовались стационарные фазы на основе силикагеля

" Ранее известен поя названием "фосфономицин'

Время депигментирования 60 мин., I - 20-25°С, скорость вращения качалки 80 об/мин.

Было показано, что активированные угли обладают лучшей депигментирующей способностью чем "ЫокшГ, однако они полностью сорбируют фосфомицин, поэтому в дальнейшей работе использовали Т1опвЦ" в количестве 1,0 % об.

Депигментированную КЖ штамма-продуцента фосфомицина очищали посредством мшфофилырации на установке "Мт^ап" на мембране "Бигароге" с размером пор 0,45 мкм, при этом выход составил 96 %.

Дальнейшую очистку полученного образца проводили с помощью метода ультрафильтрации на мембранах на основе полисульфона и регенерированной целлюлозы с номинальным порогом отсечения 5000 Ра; установка "Мш11ап". При использовании мембраны из полисульфона выход составил 29,3 %, в то время как фильтрование на мембраце из регенерированной целлюлозы было проведено с выходом 94,0 %. Фильтраты были упарены и трижды перекристаллизованы из смеси метанол-вода (7+3). Выход продукта составил 76% с чистотой продукта 99,5% (результаты неводного титрования, выполнено в Спб.ГУ).

4.5.3. Определение содержания фосфомиципа в КЖ методом КЭ.

Ранее метод КЭ для определения содержания фосфомицина в биотехнологических образцах не использовался, поэтому за основу была взята методика для анализа содержания антибиотика в биологических жидкостях при проведении фарм. кинетических исследований. Фосфомицин не имеет полос поглощения в видимой и ближней УФ области спектра, поэтому мы использовали метод непрямого УФ-детекшрования. Так, согласно ранее предложенной методики образец КЖ депротеипизировали ацетопатрилом, центрифугировали, надосадочную жидкость экстрагировали хлористым метиленом для удаления ацетонитрила. Полученную КЖ фильтровали, используя центрифужный ультрафильтрационный прибор "\licrocon УМЗ" с мембраной из регенерированной целлюлозы с номинальным порогом отсечения 3,0 Ша.

С целью умепыпепая потерь и сокращения продолжительности анализа пробы КЖ одной и той же ферментации подвергали ультрафильтрацаи, минуя стадию депротеинизации. Содержание неидентифицированных примесей в отфильтрованных образцах КЖ, прошедших стадию депротеинизации и не прошедших практически не отличалось, однако содержание фосфомицина в депротеинизированном образце КЖ было приблизительно на 10-15 % меньше, чем в пробе КЖ, не прошедшей стадию депротеинизации, таблица 16. Скорее всего, что часть антибиотика переходила в органическую фазу, содержащую ацетонитрил, хлористый метилен и небольшое количество воды, что приводило к потерям. Одновременно с КЭ и ВЭТСХ количественное определение содержания фосфомицина проводилось методом диффузии в агар с чувствительной тест-культурой ЕгунтШ сагоЮтга. Результаты экспериментов приведены в таблице 16.

Таблица 16.

Количественное определение содержания фосфомицина в КЖ 51г. \vedmorensis после использования различных

методов пробоподготовки.

Метод анализа Фосфомицин, г/л

Образец КЖ прошедший стадию депротеинизации Образец КЖ не прошедший стадию депротеинизации

КЭ" 0,51 0,61 0,70 0,55 0,71 0,78

ВЭТСХ" 0,49 0,62 0,67 0,57 0,70 0,79

Микробиологический метод* 0,52 0,60 0,71 0,56 0,68 0,80

* результат получен как среднее арифметическое двух независимых измерений ™п = 3,Р0.95

Таким образом, исключив стадию депротеинизации, занижающую результаты определения фосфомицина в КЖ в виду наличия потерь на стадии экстракции, мы сократили время пробоподготовки образцов КЖ для КЭ на 30-35 минут.

Узел ввода пробы на приборе капиллярного электрофореза "ЬС ЗБ", используемом в настоящей работе, рассчитан на минимальный объем образца 50 мкл. Время центрифугирования для получения такого объема отфильтрованной КЖ штамма-продуцента фосфомицина с помощью прибора "Мюгосоп УМЗ" составляло 40-45 мин. Для сокращения времени фильтрации был использован прибор "Мшгосоп УМ30", с мембраной из регенерированной целлюлозы и номинальным порогом отсечения 30 Ша; при этом время

4.5.1.2. Количественная обработка хроматограмм фосфомицина.

Количественную обработку хроматограмм осуществляли сразу же после проведения цветной реакции. Было установлено, что зависимость величин денситометрических сигналов фосфомицина линейна в диапазоне от 1,5 до 0,25 мкг в пятне. Предел обнаружения фосфомицина: 0,15 мкг в пятне. Градуировочный график был выполнен по пяти точкам веществ-стандартов, взятых в трех повторностях (1,5; 1,0; 0,75; 0,5 и 0,25 мкг в пятне), г = 0,9926.

Данные по определению содержания фосфомицина в нескольких партиях ЮК, представлены в таблице 14, параллельно концентрацию фосфомицина измеряли методом диффузии в агар. Как видно из таблицы 14, результаты измерений, которые мы получили методами денситометрии и диффузии в агар, хорошо коррелируют между собой.

Таблица 14.

Определение содержания фосфомицина в пробах КЖ (г/л), взятых га различных партий, выполненное методами

Номер пробы КЖ Денситометрический метод (Р 0.95; п - 5) Метод диффузии в агар

С, г/л е,% С, г/л'

1 0,92 5,2 0,80

2 0,86 4,6 0,90

3 1,05 5,7 1,00

4 0,74 5,7 0,70

5 0,91 4,6 0,90

6 1,10 5,4 1,20

7 0,73 3.6 0,80

8 1,01 5,0 0,90

•среднее арифметическое результатов двух измерений.

Известно, что культура Str. wedmorensis в определенных условиях может продуцировать биалафос и фосфинотрицин. Представлялось необходимым проверить КЖ, взятые из различных партий на содержание биалафоса и фосфинотрицина. Проведенное исследование показало, что в условиях культивирования фосфомицина, биалафос и фосфинотрицин не синтезируются.

4.5.1.3. Изучение влияния аэрации на уровень биосинтеза фосфомицина.

Известно, что одним из факторов при культивировании являются условия аэрации. Для изучения зависимости биосинтеза фосфомицина от степени аэрации ферментацию штамма Sir. wedmorensis проводили в колбах с объемами среды 30, 50 и 100 мл, а также в пробирках с объемом среды 5, 10 и 15 мл. Анализировали уровень биосинтеза антибиотика при различных условиях обогащения среды кислородом. Как видно из результатов таблицы 15 уровень биосинтеза фосфомицина практически одинаков в колбах и пробирках с различным объемом ферментационной среды. Это указывает на отсутствие чувствительности штамма к уровню аэрации при глубинном культивировании.

Таблица 15.

_Влияние аэрации на уровень синтеза фосфомицина (Р 0,95 ; п -У)._

Объем ферментационной среды, мл

Колбы

Пробирки

30,0

I

50,0

100,0

5,0

10,0

Т

15,0

0,88

0,90

Фосфомииив, гй1

0,87

0,98

0,93

0,95

4.52. Очистка КЖ штамма-продуцента фосфомицина в препаративных количествах.

Для проведения доклинических испытаний требовалось наработка фосфомицина полученного с помощью культуры Str. wedmorensis в препаративном количестве, поэтому бьша проведена очистка КЖ по следующей схеме: центрифугирование, депигментирование, микрофильтрация, ультрафильтрация и перекристаллизация.

На второй стадии были удалены пигменты, содержащиеся в КЖ, которые образуют на поверхности микро- и ультрафильтрационных мембран устойчивый "гель поляризации", что приводит к резкому уменьшению скорости фильтрации. Был проведен подбор сорбента и оптимальных условий депигментирования. Использовали сорбенты "Florosil", активированные угли ОА-Б и АС-0.4. Степень депигментирования определяли по оптической плотности КЖ при X = 450 нм. Варьировали содержание каждого сорбента от 1,0 до 4,0 объемных процентов.

17

Время депигментирования 60 мин., I = 20-25°С, скорость вращения качалки 80 об/мин.

Было показано, что активированные угли обладают лучшей депигментирующей способностью чем "Р1ого5Й", однако они полностью сорбируют фосфомицин, поэтому в дальнейшей работе использовали "ИопкЦ" в количестве 1,0 % об.

Депигментированную КЖ штамма-продуцента фосфомицина очищали посредством микрофильтрации на установке "Мт1ап" на мембране "Пигароге" с размером пор 0,45 мкм, при этом выход составил 96 %.

Дальнейшую очистку полученного образца проводили с помощью метода ультрафильтрации на мембранах на основе полисульфона и регенерированной целлюлозы с номинальным порогом отсечения 5000 Оа; установка "МтЦап". При использовании мембраны из полисульфона выход составил 29,3 %, в то время как фильтрование на мембране из регенерированной целлюлозы было проведено с выходом 94,0 %. Фильтраты были упарены и трижды перекристаллизованы из смеси метанол-вода (7+3). Выход продукта составил 76% с чистотой продукта 99,5% (результаты неводного титрования, выполнено в Спб.ГУ).

4.5.3. Определение содержания фосфомицина в КЖ методом КЭ.

Ранее метод КЭ для определения содержания фосфомицина в биотехнологических образцах не использовался, поэтому за основу была взята методика для анализа содержания антибиотика в биологических жидкостях при проведении фарм. кинетических исследований. Фосфомицин не имеет полос поглощения в видимой и ближней УФ области спектра, поэтому мы использовали метод непрямого УФ-детектирования. Так, согласно ранее предложенной методики образец КЖ депротеинизировали ацетошприлом, центрифугировали, надосадочную жидкость экстрагировали хлористым метиленом для удаления ацетонитрила. Полученную КЖ фильтровали, используя ценгрифужный ультрафильтрационный прибор "ГЛсгосоп УМЗ" с мембраной из регенерированной целлюлозы с номинальным порогом отсечения 3,0 Ша.

С целью уменьшения потерь и сокращения продолжительности анализа пробы КЖ одной и той же ферментации подвергали ультрафильтрации, минуя стадию депротеинизации. Содержание неидентифицировапных примесей в отфильтрованных образцах КЖ, прошедших стадию депротеинизации и не прошедших практически не отличалось, однако содержание фосфомицина в депротеинизированном образце КЖ было приблизительно на 10-15 % меньше, чем в пробе КЖ, не прошедшей стадию депротеинизации, таблица 16. Скорее всего, что часть антибиотика переходила в органическую фазу, содержащую ацетошприл, хлористый метилен и небольшое количество воды, что приводило к потерям. Одновременно с КЭ и ВЭТСХ количественное определение содержания фосфомицина проводилось методом диффузии в агар с чувствительной тест-культурой Еглта сагоШога. Результаты экспериментов приведены в таблице 16.

Таблица 16.

Качичестеенное определение содержания фосфомицина в АуА Л'гг. и>есЬпогегт'5 после использования различных

методов пробоподготовки.

Метод анализа Фосфомицин, г/л

Образец КЖ прошедший стадию депротеинизации Образец ЮК не прошедший стадию депротеинизации

КЭ' 0,51 0,61 0,70 0,55 0,71 0,78

ВЭТСХ" 0,49 0,62 0,67 0,57 0,70 0,79

Микробиологический метод' 0,52 0,60 0,71 0,56 0,68 0,80

" результат получен как среднее арифметическое двух независимых измерений " п = 3, Р 0.95

Таким образом, исключив стадию депротеинизации, занижающую результаты определения фосфомицина в КЖ в виду наличия потерь на стадии экстракции, мы сократили время пробоподготовки образцов КЖ для КЭ на 30-35 минут.

Узел ввода пробы на приборе капиллярного электрофореза "1.С ЗИ", используемом в настоящей работе, рассчитан на минимальный объем образца 50 мкл. Время центрифугирования для получения такого объема отфильтрованпой КЖ штамма-продуцента фосфомицина с помощью прибора "М1сгосоп УМЗ" составляло 40-45 мин. Для сокращения времени фильтрации был использован прибор "Мюгосоп УМЗО", с мембраной из регенерированной целлюлозы и номинальным порогом отсечения 30 Ша; при этом время

фильтрации составило 10 мин.

Анализ электрофореграмм одного и того же образца КЖ показал, что количество антибиотика и неидентифицированных примесей, присутствующих в КЖ, прошедших стадию ультрафильтрации через приборы УМЗ и УМ30, одинаковы; содержание антибиотика в фильтратах было также одинаковым (в пределах ±5%). Обе мембраны позволили весьма эффективно отсечь высокомолекулярные примеси, присутствующие в КЖ, наличие которых могло бы вызвать сбои в работе капилляра.

В процессе работы с ультрафильтрационными приборами УМЗ и УМЗО нами было обнаружено частичное испарение воды из нижних резервуаров устройств, причем количество испарившейся воды возрастало с увеличением времени центрифугирования. Так нами было установлено, что при использовании прибора УМЗО в течение 10 минут наблюдалось испарение воды на 7-10 %. Потеря массы прибора за счет испарения воды в процессе центрифугирования была измерена гравитометрически, использовали весы, имеющие точность ±0,0002 г. В дальнейшем при проведении анализов и расчетов вводилась поправка на испарение воды (фактор концентрирования).

В таблице 17 представлены результаты анализа фосфомицина в КЖ, полученные методами КЭ и количественной ВЭТСХ, которые хорошо коррелируют между собой.

Таблица 17.

Определение содержания фосфомицина в КЖ (г/л) различных мутантов методами капиллярного электрофореза и

количественной ВЭТСХ

Номер пробы Метод КЭ" Метод количественной ВЭТСХ"

С, г/л С, г/л е,%

1 1,09 1,11 2,8

2 1,08 1,03 3,6

3 1,10 1,11 2,7

4 1.13 1,09 3,6

5 1,07 1,12 2,8

6 1,00 1,05 4,9

•п = 5;Р0.95;

** результат получен как среднее арифметическое двух независимых измерений

Таким образом, нам удалось не только сократить время пробоподготовки на 45 мин, но и упростить методику проведения количественного анализа фосфомицина в КЖ методом КЭ.

4.5.3.1. Изучение кислотного гидролиза фосфомицина методом КЭ Основным продуктом деградации фосфомицина является Ь-1,2-диолпропанфосфоновая кислота (ДПФК). Известно, что трехчленные циклы являются нестабильными ввиду внутреннего напряжения и при величине рН меньше 5 в водных растворах протекает реакция с образованием диолов. Поэтому необходимо было синтезировать ДПФК и проверить эффективность разделения ДПФК и фосфомицина с помощью метода КЭ. Гидролиз стандартного образца антибиотика проводили с помощью растворов соляной кислоты, концентрацией 1,0 и 0,1 н. На рисунках 15 и 16 представлены электрофореграммы гидролизатов фосфомицина (1,0н и 0,1н соляная кислота, время гидролиза 20 мин, температура 20°С).

Рис. 1& Элаапрофореграмма гидролизата фосфомицина

Условия гидролиза: 1,0 н НС1; время 20 мин; нейтрализован раствором 2.0н водного аммиака до рН~9,0; исходная Ст=2,0г/л

Рис. 16. Электрофореграмм а гидролизата фосфомицина

Условия гидролиза: 0,1 н HCl; время 20 мин; нейтрализован раствором 2. Он водного аммиака до рН=9,0; исходная Ст=2.0 г/л

На представленных электрофореграммах видно, что пики фосфомицина и ДПФК хорошо разрешаются и имеют время удерживания 10,8 и 10,6 мин, соответственно. Было показано, что воздействие 1,0н соляной кислоты на фосфомицин в течение 20 мин приводит к практически полному размыканию эпоксидного цикла, в то время как 0,1 н соляная кислота гидролизует фосфомицин на 53 %.

В последующем, анализ 25 проб сливных КЖ штамма-продуцента фосфомицина из разных партий показал, что ДПФК в этих образцах не содержится.

4,6. Исследование полноты экскретирования антибиотиков из клетки.

Известно, что антибиотики, будучи вторичными метаболитами, в большинстве случаев полностью экскретируются во внешнюю среду. Однако, в некоторых случаях возможно лишь частичное экскретирование, например, моеномицин.

Для осуществления оценки полноты экскретирования тилозина, вирджиниомицина, ВА, FT и фосфомицина из клеток, КЖ штаммов-продуцентов антибиотиков центрифугировали, супернатант использовали для анализа. Осадок промывали 10'2 M Трис - НС1 (рН 8,5) буфером, центрифугировали, супернатант использовали для анализа. Эту операцию проводили еще два раза. Осадок, полученный на последней стадии, суспендировали в 10"2 M Трис-HCl (рН 8,5) буфере и обрабатывали на ультразвуковом дезинтеграторе 40 мин при 0°С с целью разрушения оболочек клеток. Затем центрифугировали, и супернатант использовали для анализа. На первой операции анализ осуществляли с помощью количественной ВЭТСХ, а на последующих микробиологическим методом, поскольку содержание антибиотиков в супернатанте было ниже предела их количественного определения методом хроматоденситометрии.

В сливной КЖ концентрации антибиотиков составляли: тилозин - 2,5 г/л, V[M1] и V[S1] - 2,9 и 1,0 г/л, ВА и FT - 2,0 и 0,5 г/л, а фосфомицина - 0,6 г/л. Супернатанты, полученные после первого, второго и третьего промывания биомассы и последующего дезинтегрирования антибиотиков не содержали. На основании полученных результатов было сделано заключение, что тилозин, V[M1] и V[S1], ВА и FT, а также фосфомицин полностью экскретаруется клетками по окончании ферментации.

4.7. Электроосмотическая - ТСХ

В методиках определения тилозина и сопутствующих ему в КЖ макролидов, представленных выше, время разделения варьировалось от 20 до 80 мин. В 2005 году В.Г. Березкиным и А. О. Балушкиным для разделения этих макролидов была использована ЭО-ТСХ в варианте «закрытого сорбционного слоя», время разделения составляло 5 мин., ТСХ -пластинки "Сорбфил" (ПТСХ-В-П-УФ) и элюирующая система: этанол - ацетонитрил -диэтиламин (100+100+1).

Для экспрессного анализа вирджиниомицинов в КЖ мы также применяли ЭО-ТСХ, в качестве подвижной фазы использовали смесь «высококипящих» растворителей «II», разделения выполнялись (здесь и далее) на ВЭТСХ - пластинках «Сорбфил» (ПТСХ-П-В-УФ). На пластинке размером 2.5 х 9.7 см размечали три дорожки по следующей схеме (рис. 17)*.

Ряс. 17. Схема нанесения образцов и стандартов на пластинку 1-я «дорожка» образцы - стандарты St и St; 2-я *дорожка* образец - стандарт St и проба S; 3-я #дорожка» пробы Su S, Объем наносимых образцов - О.Змкч.

В работе использовалась одноуровневая градуировка (один образец -стандарт и одна опытная проба). Обработка результатов проводилась в условиях п =3, Р 0.95.

После нанесения образцов на пластинку на нее с помощью пульверизатора наносился элюент. Температура пластинки измерялась до и после разделения с помощью Pt-Ir термистора PYE-Therm-74, фирмы РУЕ(Англия), она составляла 18±2 С и 25±2°С соответственно. Охлаждение «предметного стола» камеры осуществлялось с помощью инертного низкотемпературного теплоносителя 0-5°С. Время разделения: 5,0 мин. при 5 kV и величине тока 950цА. Скорость миграции хроматографических зон (мм/мин): V[S1]-1.0; V[M1H.8; V[M2]-9.6; n = 3, P 0.95.

Ti

" Эта же схема нанесения использовалась при разделении других антибиотиков.

Для экспресс-анализа моеномицина А в предсливной КЖ методом ЭО-ТСХ была разработана подвижная фаза «III»: диметилсульфоксид - триэтаноламин - вода (90+5+5), позволяющая осуществлять разделение моеномицинов А, В и С в течение 5 мин., при 5 kV и величине тока 800 цА. Визуализацию и количественную обработку пятен моеномицина А проводили такими же методами как и в случае классической ВЭТСХ. Время анализа составило 30 мин.

Как уже было показано выше время бинарного разделения Б А и FT составляет -170 мин. Для уменьшения времени анализа была использована метод ЭО-ТСХ и разработана подвижная фаза «IV»: диметилсульфоксид - диметилформамид - триэтаноламин - вода (85+5+2+8). Разделение было проведено в течение 10 мин, при 4.0 kV, величине тока 700 рА и температуре 17-25°С. Визуализацию и количественную обработку пятен ВА и FT проводили согласно методике использованной нами в случае классической ВЭТСХ. Время анализа составило 40-45 мин.

Результаты количественного определения вирджиниомицинов Ml и S1, моеномицина А, биалафоса и фосфинотрицина в образцах КЖ, взятых из промышленных партий представлены в таблице 18.

4.8. Предвалидационпые тесты.

Согласно нормативам GLP [Good Laboratory Practice] неотъемлемой частью современного количественного анализа является валидация (оценка пригодности) используемых аналитических методик, которая включает в себя следующие характеристики: специфичность, линейную зависимость, правильность (точность), предел обнаружения, предел количественного определения, пригодность системы.

Молекулы исследуемых антибиотиков: тилозина, вирджиниомицинов, моеномицинов и биалафоса а также сопутствующих им в КЖ соединения имеют сопряженные двойные связи, а трехчленный цикл молекулы фосфомицина обладает стерическими напряжениями, поэтому эти вещества могут быть нестабильными*. Для доказательства устойчивости антибиотиков на слое силикагеля были проведены следующие тесты:

1. Проведена двумерная хроматография исследуемых антибиотиков, показано, что все аналиты после двумерного элюирования дают только одно пятно. Дополнительная идентификация гомогенности соединений, полученных при разделении, была проведена с помощью метода ВЭЖХ и КЭ. Установлено, что каждый из исследуемых антибиотиков практически не содержал примесей и элюировался в виде острого симметричного пика.

2. Проведена хроматография растворов одних и тех же проб антибиотиков в следующие промежутки времени: 5, 30, 60, 240 и 360 мин., при этом установлено, что антибиотики элюируются одним пятном, при этом интенсивность этих пятен не изменяется (в качестве репера использовали пятно насыщенного раствора дихромата калия).

3. Проведено нанесение пробы антибиотиков на пластинки, после чего проводилось элюирование этих пластинок через: 5, 30, 60, 240 и 360 мин. Было обнаружено, что тилозин, вирджиниомицины, БА и фосфомицин проявляются одним пятном и интенсивность этих пятен не изменяется, а моеномицины устойчивы только в случаях, когда пятна выдерживались на пластинке 5,30 и 60 мин. При выдерживании моеномицинов на пластинке более 60 мин они приобретали желтый цвет, хроматографировались, несколькими хроматографическими зонами различной интенсивности.

Полученные таким образом экспериментальные данные свидетельствуют о том, что исследуемые антибиотики не подвергаются деструкции в условиях проведения эксперимента, и только моеномицины устойчивы на тонких слоях силикагеля в течение 60 мин., по истечении этого срока их молекулы подвергаются деструкции (скорее всего окислению сопряженных диеновых систем).

После обработки пятен моеномицина, ВА (FT) и фосфомицина обнаруживающими реагентами окраска пятен этих антибиотиков на хроматограммах устойчива в течение: 3 суток, 7 часов и 1.5 часов соответственно.

* Наличие стабильности водных и водно-спиртовых растворов при комнатной температуре в течение нескольких суток описано в литературе.

Таблица 18.

Определение содержания аирджиниомицинов VM1 и VSJ, моепомицина А, биалафоса и фосфипотрицииа в КЖметодами ЭО-ТСХ,

антибиотик Вирджиниомицин,1X = 230 нм Моеномицин А 2Х = 510нм Биалафос 2Х = 530 нм Фосфинотрицин 2Я.® 530 нм

V[M, V[S,1

Номер пробы КЖ 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

С, г/л 3.3 3.7 3.0 1.9 2.2 1.0 1.4 1.1 0.7 0.6 1.7 1.1 1.9 1.7 2.4 2.6 3.3 4.0 3.2 2.8 1.4 2.6 2.1 1.7 1.9

е,% 4.5 4.3 3.2 4.6 3.8 4.9 4.7 4.8 5.2 5.1 3.9 4.6 4.2 5.3 4.9 4.9 4.4 2.5 3.1 3.9 3.8 2.9 3.9 4.5 4.5

п = 3, Р 0.95

1 - денситометр «UVP 8000»;

2 - денситометр «Sbimadzu CS-920».

Таблица 19.

Погрешность результатов анализа [РгесЬюп]стандартных растворов тшози/ш, вирджиниомицииа Ml, моеномга&ша А, биачафоса, и фосфомицина, выполненных в __течение одного дня-(?) [Iniraday assay/ и через пять дней-flf) flnterday assay], денситометр «Shimadzu CS-920»._

антибиотик Тилозин Х-282 нм, г»0.99115 Вирджиниомицин Ml X - 230 нм, г - 0.9989 Моенол Х-510 нм ицин А г = 0.9906 Биалафос Х- 530 нм, г = 0.9931 Фосфомицин \ - 470 нм, г = 0.9926

С", мкг 0.5 1.0 1.5 2.0 2,5 3.0 0.05 0.1 0.5 1.0 1.5 2.0 0.02 0.04 0.06 0.09 0.12 0.15 0.8 1.1 1.5 2.0 3.0 4.0 0.25 0.5 0.75 1.0 1.25 1.5

е,% 1 4.8 3.5 2.4 2.0 1.3 1.1 3.1 4.0 3.9 4.1 2.6 1.3 4.9 3.8 3.6 3.0 2.7 2.9 5.1 4.9 3.3 3.1 3.4 1.8 4.1 4.3 2.9 2.1 2.0 1.5

II 5.2 2.8 2.0 2.3 1.8 1.4 3.9 4.2 4.0 3.5 2.2 1.8 3.5 3.7 3.0 2.4 2.0 1.8 4.9 3.8 2.4 2.7 1.9 1.7 3,8 3.4 2.4 2.0 2.3 1.2

г (1 и 11) г = 0.988530 = 0.99124 г = 0.9846 г = 0.98833 г = 0.99104

* С - содержание антибиотика в пятне, мкг.

Таблица 20.

Погрешность измерения содержания стандартных образцов тилозина, вирджиниомицииа М1, моепомицина А. биалафоса, и фосфомицина, выполненных в различных

антибиотик Тилозин 1 X = 282 нм,1X — 254 нм, г = 0.99115 Вирджиниомицин Ml 'X = 230 hm,!X = 254 нм, г = 0.9989 Моеномицин А 'Х = 510нм,'Х = 510нм, г -0.9906 Биалафос 1 Х = 530 нм, 4Х = 530 нм, г-0.9931 Фосфомицин 'Х-470 нм,3 X = 470 нм, г = 0.9926

С*, мкг 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 0.05 0.1 0.5 1.0 1.5 2.0 0.02 0.04 0.06 I 0.09 0.12 0.15 0.8 1.1 1.5 2.0 3.0 1 4.0 0.25 0.5 0.75 1.0 1.25 1.5

1 3.9 3.0 2.8 1.8 1.1 1.1 3.8 3.5 4.9 3.5 3.0 2.7 4.2 4.6 3.4 3.2 2.1 2.0 3.2 3.7 2.7 1.8 1.4 1.1 3.8 3.7 2.4 3.0 1.9 2.1

II 4.6 4.3 3.0 2.3 1.4 1.2 4.4 4.0 4.0 4.2 2.4 2.4 2.1 2.0 1.4 1 1.1 1.0 1.0 2.8 2.6 2.0 1.8 1.4 ¡ 1.3 2.6 2.0 1.8 1.4 1.4 1.1

г (1 и 11) ■ г = 0.98933 г ■= 0.99094 т = 0.98021 г = 0.98097 г = 0.98256

п = 5, Р 0.95;

* С - содержание антибиотика в пятне, мкг;

1 - денситометр «Shimadzu CS-920»;

2 - видеоденситомстр «UVP 8000»;

3- денситометр «Camag TLC scanner 3»;

4- видео денситометр «ДенСкан 01».

4.9. Валидация методик количественного определения антибиотиков методом хроматодеиситометрии.

Разработанные нами подвижные фазы для разделения исследуемых антибиотиков являются весьма селективными, величины ARf » 0.05. Гомогенность соединений в пятнах, принадлежащих отдельным компонентам была подтверждена данными ВЭЖХ и КЭ после элюции последних из соответствующих хроматографических зон.

Таким образом, показана специфичность разработанных методик, поскольку они позволяют достоверно определять как исследуемые антибиотики, так и примеси как в КЖ, так и в других биологических препаратах (после соответствующей пробоподготовки).

Было установлено, что аналитические области методик, в пределах которых соблюдается линейная зависимость, охватывает интервал: для тилозина от 0.5 до 3.0 мкг/пятне (включая эти пределы); для вирджиниомицина от 0.05 до 2.0 мкг/пятне; для моеномицина от 0.02 до 0.150 мкг/пятне; для биалафоса от 0.5 до 4.0 мкг/пятне; и для фосфомицина от 0.25 до 1.5 мкг/пятне.

Правильность (точность) [Precision] разработанных методик, в пределах аналитической области, иллюстрируют результаты, представленные в таблице 19; показана хорошая внутрилабораторная воспроизводимость результатов. Следует отметить, что согласно нормативно-технической документации (HTD), принятой на предприятиях микробиологической промышленности РФ, е не должна превышать 5.5%*. Была проведена работа по сравнению результатов на межлабораторную воспроизводимость, таблица 20. Из таблицы 20 видно, что результаты, полученные на межлабораторных испытаниях хорошо коррелируют друг с другом.

Пределы обнаружения антибиотиков составляют: для тилозина 0.3 мкг; для вирджиниомицина 0.03 мкг; для моеномицина 0.01 мкг; для биалафоса 0.5 мкг; и для фосфомицина 0.15 мкг в пятне.

Пределы количественного определения антибиотиков: для тилозина 0.5 мкг/пятне (S/N=30); для вирджиниомицина 0.05 мкг/пятне (S/N=12); для моеномицина 0.02 мкг/пятне (S/N > 30); для биалафоса 0.8 мкг/пятне (S/N=12); и для фосфомицина 0.25 мкг/пятне (S/N=l 5).

Было проведено исследование зависимости селективности разделения от значения объемного содержания растворителей и установлено, что величины ARf тилозина, дезмикозина, реломицина и макроцина практически не изменяются (±0.05, п =5, Р 0,95) в интервале соотношений этилацетат - диэтиламип от 93.5 до 96.5% v/v. Температура в интервале от 15 до 28°С и время насыщения камеры от 30 до 120 минут также ке оказывают влияния на величины A Rf (±0.05, п =5, Р 0,95).

Величины ARf вирджиниомицинов VM1, VM2 и VS1 практически не изменяются (±0.05, п =5, Р 0,95) в интервале соотношений хлороформ - метанол от 93.5 до 97.0% v/v. Температура в интервале от 20 до 26°С и время насыщения камеры от 20 до 90 минут также не оказывают влияния на величины A Rf (±0.05, п =5, Р 0,95).

Величины ARf моеномицинов практически не изменяются (±0.05, п =5, Р 0,95) в интервале соотношений пропанол-1 - 25%-ный водный аммиак от 62.5 до 70.0% v/v. Температура в интервале от 18 до 30°С и время насыщения камеры от 30 до 120 минут также не оказывают влияния на величины A Rf (±0.05, п =5, Р 0,95).

Величины ARf ВА практически не изменяются (±0.05, п =5, Р 0,95) в интервале соотношений пропанол-2 - 25%-ный водный аммиак от 67.5 до 73.5% v/v. Температура в интервале от 15 до 28°С и время насыщения камеры от 60 до 120 минут также не оказывают влияния на величины A Rf (±0.05, п =5, Р 0,95).

Величины ARf фосфомицина практически не изменяются (±0.05, п =5, Р 0,95) в интервале соотношений этанола и пропанола-2 от 6.5 до 7.5% v/v. Температура в интервале от 18 до 25°С и время насыщения камеры от 30 до 120 минут также не оказывают влияния на величины ARf (± 0.05, п = 5, Р 0.95).

* Марков В. Л., Варшавский А. Е. Наука и высокие технологии в России на рубеже третьего тысячелетия //М.: Наука. 2001. 635 с.

Использование ВЭТСХ пластинок «Сорбфил» различных партий также не вызывает изменений селективности разделения. Таким образом, получепные результаты свидетельствуют о пригодности разработанных нами методик количественного определения исследуемых антибиотиков, так и сопутствующих им в КЖ примесей.

4.10. Валидалия метода количественного определения фосфомицина методом капиллярного электрофореза.

Для определения области линейной зависимости были использованы растворы стандартных образцов фосфомицина в концентрациях 25, 100, 200, 500 и 1000 мг/л и произведена регистрация электрофореграмм этих растворов (5 независимых экспериментов). Было установлено, что отклик детектора линеен в области исследуемых концентраций (р=0,99944). Предел количественного определения - 25мг/л. Аналитическая область методики находится в пределах от 25 до 1000 мг/л фосфомицина. Внутрилабораторная воспроизводимость результатов количественного определения фосфомицина, полученных в течение одного дня и через 7 дней (Р 0,95; п=5), показана в таблице 21.

Таблица 21.

Погрешность результатов определения стандартных растворов фосфомицина, полученных в течение одного дня [Intraday assay J и через 7 дней -(II) [Interday assay J fn - 5, P 0,95, r - 0.99944).

1 I "

Фосфомицин, г/л 0,025 ~ 0,10 0,50 1,00

с, %

5,0 2,3 1,5 1,0

6,6

3.5

2.6 1,4

Из таблицы 21 видно, что результаты хорошо воспроизводятся.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о пригодности методики для

количественного определения фосфомицина в КЖ методом КЭ.

Выводы:

1. Предложены методики количественного определения тилозина, вирджиниомиципа, моеномицина, биалафоса и фосфомицина в КЖ штаммов-продуцентов методом количественной ТСХ на пластинках «Сорбфил». Показана возможность их использования для массового анализа этих соединений в КЖ и контроля промышленных процессов.

2. Изучены условия для проведения количественного определения исследованных антибиотиков. Найдены оптимальные условия проведения цветных реакций на хроматограммах и определено время устойчивости интенсивности окраски пятен моеномицина, биалафоса и фосфомицина. Выбраны условия денситометрирования исследованных антибиотиков.

3. Изучена устойчивость антибиотиков на слое силикагеля в процессе анализа. Показано, что исследуемые антибиотики не подвергаются деструкции в условиях проведения эксперимента. Однако отмечено, что моеномицины устойчивы на тонких слоях силикагеля только в течение 60 мин.

4. Предложены методики количественного экспресс-анализа вирджиниомиципа, моеномицина и биалафоса в КЖ методом ЭО-ТСХ. Показана возможность анализа этих антибиотиков в КЖ в течение 15-35 мин.

5. Изучена полнота экскретирования макролидов, вирджиниомицинов, биалафоса и фосфинотрицина а также фосфомицина из клетки. Установлено, что исследуемые антибиотики по окончании ферментации полностью экскретируются из клетки в среду.

6. Проведена валидация предложенных нами методик количественного определения исследуемых антибиотиков в КЖ методом количественной ТСХ. Полученные результаты свидетельствуют о пригодности методик для количественного определения исследуемых антибиотиков в КЖ. Показано, что погрешности измерений составляют менее 5,0%

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

Материалы диссертации опубликованы в 2-х статьях и 7-ми тезисах докладов на

конференциях и симпозиумах.

1. Табаков В.Ю., Емельянова Л.К., Антонова. C.B., Воейкова Т.А. Влияние гена бактериального гемоглобина vhb на эффективность процесса межродовой конъюгации Esherichia coli - Streptorayces и продукцию антибиотиков у стрептомицетов. //Генетика. 2001. N. 3. Т. 37. С. 422-425.

2. Красиков В.Д., Тяглов Б.В., Антонова C.B., Барсуков Е.Д., Воейкова Т.А. Хроматоденситометрическое определение антибиотика тилозина в ферментационных растворах // Материалы Всероссийского симпозиума «Хроматография и хроматографические приборы» Научный совет по адсорбции и хроматографии РАН. Москва-Клязьма 14-18 марта 2005. С. 219.

3. Балушкин А.О, Тяглов Б.В., Антонова C.B., Барсуков Е.Д., Воейкова Т.А. , Березкин В.Г. Использование электроосмотической ТСХ для разделения ветеринарных антибиотиков тилозина, реломицина и дезмикозина, продуцируемых культурой Str. Fradiae. // Тезисы международной школы-конференции посвященной 100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна «Генетика микроорганизмов и биотехнология» Москва-Пущино 15-19 октября 2006. С. 31.

4. Тяглов Б.В., Сизова И.А., Малахова И.И., Антонова C.B., Барсуков Е.Д., Красиков В.Д. Количественное определение гербицида нового поколения - гербиаса хроматографическими методами. // Материалы Всероссийского симпозиума «Хроматография в химическом анализе и физикохимических исследованиях» Научный совет по адсорбции и хроматографии РАН. Москва-Клязьма 23-27 апреля 2007, С. 132133.

5. Воейкова Т. А., Тяглов Б. В., Антонова C.B., Барсуков Е.Д., Сизова И. А., Малахова И. И., Красиков В. Д. Анализ макролидных, тетрациклиновых и пептидных антибиотиков методом тонкослойной хроматографии // Биотехнология. 2008. N. 2.08. С. 74-87.

6. Воейкова Т. А., Антонова C.B., Тяглов Б. В., Красиков В.Д., Малахова И. И. Определение моеномициновых антибиотиков методом электроосмотической тонкослойной хроматографии. // Материалы Всероссийского симпозиума «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия» Научный совет по адсорбции и хроматографии РАН. Москва-Клязьма 14-18 апреля 2008, С. 121.

7. Воейкова Т. А., Антонова C.B., Тяглов Б. В., Красиков В.Д., Малахова И. И. Определение антибиотиков семейства моеномицина в культуральной жидкости. // Материалы Всероссийского симпозиума «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия» Научный совет по адсорбции и хроматографии РАН. Москва-Клязьма 14-18 апреля 2008. С. 122.

8. Воейкова Т. А., Антонова C.B., Тяглов Б. В., Чурбанов В.Г. Исследование процесса экстракции антибиотика тилозина из культуральной жидкости бутилацетатом. // Материалы Всероссийского симпозиума «Хроматография и хромато-масс-спеюрометрия» Научный совет по адсорбции и хроматографии РАН. Москва-Клязьма 14-18 апреля 2008. С. 119.

9. Воейкова Т. А., Антонова C.B., Тяглов Б. В., Барсуков Е.Д., Сизова И. А., Малахова И. И., Красиков В. Д. Экспресс-анализ гербиаса в культуральных жидкостях методом электроосмотической тонкослойной хроматографии. // Тезисы международной школы-конференции посвященной 40-летию создания ГосНИИгенетика. Москва-Пущино 21-24 октября 2008. С. 29.

Подписано в печать:

07.10.2009

Заказ N° 2658 Тираж - 150 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

1. Введение.

2. Литературный обзор.

2.1. Обоснование выбора метода для анализа антибиотиков.

2.2. Стационарные фазы в ТСХ.

2.3. Подвижные фазы в ТСХ.

2.4. Стратегия выбора и оптимизации подвижных фаз в ТСХ.

2.5. Обнаружение соединений на хроматограммах.

2.6. Количественная обработка результатов методом денситометрии.

2.7. Инструментальные способы измерения.

2.8. Электроосмотическая ТСХ (ЭО-ТСХ).

2.9. Анализ погрешности определения в ТСХ.

3. Техника и методика проведения эксперимента.

3.1. Приборы и материалы.

3.2. Реактивы.

3.3. Приготовление стандартных образцов антибиотиков и проб КЖ.

3.3.1. Тилозин.

3.3.1.1. Экстракция тилозина бутилацетатом.".

3.3.1.2. Экстракция тилозина бутилацетатом с добавлением неорганических солей.

3.3.2. Вирджиниомицин.

3.3.3. Моеномицин.

3.3.4. Биалафос.

3.3.5. Фосфомицин.

3.4. Подготовка хроматографических пластинок.

3.5. Хроматографические системы, используемые в работе и их приготовление.

3.6. Подготовка хроматографической камеры.

3.7. Приготовление обнаруживающего реагента.

3.7.1. Раствор нингидринового реактива.

3.7.2. смесь хлорсульфоновой и уксусной кислот (2+1, v/v).

3.7.3. Растворы для визуализации фосфомицина.

3.8. Нанесение стандартных образцов и проб КЖ на хроматографическую пластинку.

3.9. Нанесение стандартных образцов и проб КЖ на хроматографическую пластинку для ЭО-ТСХ.

3.10. Элюирование хроматограмм.'.

3.11. Электроосмотическая - ТСХ.

3.12. Обработка хроматограммы обнаруживающим реагентом.

3.12.1. Нингидриновым реактивом.

3.12.2. Смесью хлорсульфоновой и уксусной кислот.

3.12.3. Обработка хроматограммы растворами I и II для визуализации фосфомицина.

3.13. Количественная обработка хроматограмм.

3.14. Исследование степени экскретирования антибиотика клетками.

3.15. Определение содержания антибиотиков методом диффузии в агар.

3.16. Проведение биоавтографии.

3.17. Определение содержания тилозина методом ВЭЖХ.

3.18. Определение содержания вирджиниомицинов методом ВЭЖХ.

3.19. Определение содержания моеномицинов методом ВЭЖХ.

3.20. Определение биалафоса и сопутствующих ему в КЖ веществ методом ВЭЖХ.

3.21. Очистка культуральной жидкости штамма-продуцента фосфомицина в препаративных количествах.

3.21.1. Центрифугирование культуральной жидкости.

3.21.2. Депигментирование культуральной жидкости.

3.21.3. Мембранные методы очистки КЖ штамма-продуцента фосфомицина.

3.21.3.1. Микрофильтрация.

3.21.3.2. Ультрафильтрация.

3.22. Количественное определение фосфомицина методом капиллярного электрофореза.

4. Результаты и обсуждение.

4.1. Количественное определение тилозина и сопутствующих ему макролидов в КЖ.

4.1.1. Изучение влияния процесса культивирования продуцента тилозина на распределение антибиотика при экстракции бутилацетатом из КЖ.

4.1.2. Изучение распределения антибиотика тилозина между нативной КЖ и бутилацетатом в присутствии неорганических солей.

4.2. Анализ вирджиниомицинов в промышленных образцах КЖ.

4.3. Хроматографическое определение моеномицинов в образцах КЖ из различных промышленных партий.

4.4. Анализ биалафоса и сопутствующих ему предшественников в КЖ.

4.4.1. Выбор оптимальных условий проведения цветной реакции для визуализации пятен ВА и FT на хроматограммах.

4.5. Фосфомицин.

4.5.1. Количественное определение фосфомицина в ЮК методом ТСХ.

4.5.1.1. Визуализация пятен фосфомицина на хроматограмме.

4.5.1.2. Количественная обработка хроматограмм.

4.5.1.3. Изучение влияния аэрации на уровень биосинтеза фосфомицина.

4.5.2. Очистка КЖ штамма-продуцента фосфомицина в препаративных количествах.

4.5.3. Определение содержания фосфомицина в КЖ методом капиллярного электрофореза.

4.5.3.1. Подготовка пробы КЖ для проведения анализа методом КЭ.

4.5.3.2. Оптимизация пробоподготовки образцов КЖ.

4.5.3.3. Изучение кислотного гидролиза фосфомицина методом КЭ.

4.6. Исследование полноты экскретирования антибиотиков из клетки.

4.7. Электроосмотическая ТСХ.

4.8. Предвалидационные тесты.

4.9. Валидация методик количественного определения антибиотиков методом хроматоденситометрии.

4.10. Валидация метода КЭ.

5. Выводы.

Актуальность работы

Современная биотехнологическая. промышленность — наиболее перспективный, а зачастую и единственный способ получения целого ряда веществ, используемых в качестве пищевых лекарственных препаратов, сырья для, химической и фармацевтической промышленности, а также и кормовых добавок. Основная доля продукции биотехнологического производства, как в количественном, так и в стоимостном выражении приходится на синтезируемые микроорганизмами низкомолекулярные соединения: аминокислоты, антибиотики, нуклеотиды, нуклеозиды и витамины. Неотъемлемой частью создания новых, более эффективных и экономичных биотехнологических процессов является разработка соответствующих аналитических методов, обеспечивающих контроль протекания этих процессов и качество получаемой продукции.

Так при отборе перспективных штаммов - продуцентов биологически t активных веществ и экспресс - анализа при оптимизации условий ферментации и контроле промышленных биотехнологических процессов необходимо решать задачи массового' анализа получаемой продукции. Основные требования1 к аналитическим методикам контроля в биотехнологии, учитывая объем и характер' выполняемой работы -экспрессность анализа, - простота подготовки проб, и дешевизна, и возможность получения точных количественных результатов с погрешностью измерения не более 5%.

Простота и экспрессность метода обеспечивают его массовое использование, особенно при клинических и лабораторных исследованиях, а также в условиях производства; неточность и ненадежность метода, вообще не должны подлежать рассмотрению, а дороговизна метода сильно ограничивает возможности. Возвращаясь к вопросу о достоверности и надежности метода, следует отметить, что требования, предъявляемые к аналитической хроматографии, например, в биохимии и биотехнологии существенно различаются. Так, в биохимии приемлемым считается метод, обеспечивающий погрешность измерения не более 15% и воспроизводимость 90% [1] . Аналогичные требования предъявляются к хроматографическим методам на стадии создания штаммов-продуцентов антибиотиков. Однако, на этапе оптимизации процесса ферментации необходима более высокая точность анализа — погрешность измерения не должна превышать 5%. То же самое требование предъявляется к аналитической хроматографии при разработке стадии выделения и очистки антибиотика, поскольку 10-15 процентная погрешность измерения может привести к выпуску препарата недостаточной чистоты или к чрезмерно высоким потерям, что неприемлемо в условиях крупнотоннажного производства. Так, например, на Степногорском Химическом заводе для производства антибиотика тилозина использовались ферментеры емкостью 10м3.

Хроматографические методы, которые мы собираемся использовать для разделения и количественного определения антибиотиков, будут рассмотрены в литературном обзоре.

Биотехнологические образцы, которые являются объектами анализа, представляют собой сложные смеси, содержащие компоненты исходной питательной среды и продукты их превращений. Анализ дополнительно усложняется тем, что основой образца, является/ водная матрица, общее содержание органических веществ может достигать 20-30%.

Вследствие этого, непосредственное определение, даже одного компонента в биотехнологическом образце каким-либо спектральным аналитическим методом (спектрофотометрией, флуоресцентной спектроскопией и т.д.) в большинстве случаев, не позволяет получить достоверных результатов. Хроматографические методы, так или иначе, обеспечивают частичное фракционирование образца непосредственно в процессе анализа. Кроме того, при использовании хроматографических методов, как правило, удается добиться разделения и количественного определения компонентов со схожими характеристиками.

Биосинтез антибиотиков является вариантом метаболических процессов, которые протекают в клетке, однако небольшие изменения этих процессов приводят к весьма широкому набору полученных продуктов. Необходимо отметить, что благодаря сравнительно высокой молекулярной массе антибиотиков субстратная специфичность ферментов, участвующих в их биосинтезе, по-видимому, менее строгая, чем в случае других биохимических реакциях. Так, определенный фермент может катализировать одну и ту же реакцию, протекающую на неодинаковых субстратах. При этом один и тот же промежуточный продукт биосинтеза (предшественник) может служить субстратом для нескольких ферментов. Подобное снижение субстратной специфичности приводит к синтезу продуктов, имеющих одинаковую структуру, но различающихся степенью окисления или насыщения определенных фрагментов молекулы. По этой причине антибиотики, как правило, образуются семействами, т.е. один и тот же штамм продуцирует два или несколько антибиотиков, близких друг к другу по структуре и свойствам [2-4].

В настоящее время для анализа антибиотиков используется планарная хроматография - современная тонкослойная хроматография (ТСХ) или высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и капиллярный электрофорез (КЭ). Выбор того или иного метода определяется конкретной задачей, стоящей перед исследователем [5-8].

Количество научных статей обзорного характера, посвященных непосредственно определению антибиотиков в культуральных жидкостях (КЖ) штаммов-продуцентов, оказалось незначительным. Так, хорошо известный журнал "Analytical Chemistry" выпускает специальные обзорные номера, посвященные аналитической химии, в том числе и хроматографии в конкретных областях исследования (вода, пищевые продукты и т.д.), однако этот перечень не включает биотехнологию. Журнал "Biotechnology. Bioscience and Bioengineering", издаваемый в Японии, в разделе "Analytical

Chemistry" практически не публикует статьи, связанные с определением антибиотиков, а основная масса публикаций по прикладной хроматографии посвящена биомедицинским исследованиям. В частности эту тему охватывает журнал "Journal of Chromatography. Biomedical Applications". В монографии "High Performance Liquid Chromatography in Biotechnology" антибиотикам, аминокислотам, витаминам и нуклеозидам, являющимися основными продуктами биотехнологических производств, уделено мало внимания [9]. Таким образом, возникает некий парадокс - бурно развивающаяся и экономически эффективная отрасль промышленности -микробиологический синтез антибиотиков, аминокислот, нуклеозидов и т.п. -лишена аналитического обеспечения. Возможно, все это обусловлено тем, что основная^ часть биотехнологических разработок выполняется в исследовательских центрах крупных фирм, и применяемые при этом аналитические методы являются "know-how" этих фирм.

Для решения поставленной в работе задачи г - прямого разделения и количественного определения-антибиотиков различных классов - в качестве базового метода нами был выбран метод ВЭТСХ, а ВЭЖХ и КЭ использовали как сравнительные.

На сегодняшний день (согласно публикациям) разработаны методы определения самых разнообразных веществ, в так называемых биомедицинских образцах, однако, при этом не уделялось внимания биотехнологическим образцам' и разработке хроматографических методов анализа, учитывающих их специфику. Особенно это относится к анализу в биотехнологических образцах низкомолекулярных соединений, что и определяет актуальность данной работы.

Цель и задачи исследования: Целью данной работы являлась разработка количественных методов анализа КЖ штаммов - продуцентов антибиотиков разных классов, таких как: тилозин, вирджиниомицин, моеномицин, биалафос и фосфомицин с использованием количественной высокоэффективной тонкослойной хроматографии.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. На основе проведенных исследований подобрать условия для разделения КЖ изучаемых антибиотиков на ВЭТСХ пластинках «Сорбфил»

2. На основе проведенных исследований выбрать оптимальные условия визуализации и параметров детектирования изучаемых антибиотиков

3. Разработать условия для экспресс - анализа КЖ вирджиниомицина, моеномицина и биалафоса методом электроосмотической тонкослойной хроматографии (ЭО-ТСХ)

4. Проверить устойчивость антибиотиков на слое силикагеля в процессе анализа.

5. Определить полноту экскретирования тилозина, вирджиниомицина, биалафоса и фосфомицина из клетки.

6. Обеспечить высокую точность результатов анализа (с погрешностью измерения менее 5,0%, что согласуется с нормативно-технической документацией (HTD), принятой на предприятиях микробиологической промышленности РФ)

Научная новизна

1. Предложены условия анализа для разделения компонентов КЖ штаммов-продуцентов исследованных антибиотиков на отечественных пластинках «Сорбфил». Показана селективность выбранных подвижных фаз для ч

разделения исследуемых аналитов в КЖ.

2. Определены оптимальные условия нанесения обнаруживающих реагентов и проведения цветных реакций на хроматограммах для количественного определения моеномицина, биалафоса и фосфомицина. Показана устойчивость полученных комплексов визуализирующих агентов и антибиотиков во времени.

3. Предложены условия для экспресс - разделения компонентов КЖ штаммов-продуцентов моеномицина, вирджиниомицина и биалафоса методом ЭО-ТСХ. Показано, что, используя метод ЭО-ТСХ и денситометрию можно получить информацию о содержании антибиотика в пробе КЖ в течение 15-35 мин. . 4. Для доказательства устойчивости антибиотиков на слое: силикагеля в процессе: анализа были проведены предвалидационные тесты. Показано, что исследуемые антибиотики, не подвергаются деструкции: в условиях проведения эксперимента, и только моеномицины: устойчивы на? тонких слоях силикагеля в течение 60 мин:

Практическая значимость Разработанные методы были использованы для идентификации и анализа, антибиотиков: тилозина, вирджиниомйцина, моеномицина, биалафоса и фосфомицина.в КЖ промышленных штаммов-продуцентов.

Полученные сведения- о накоплении сопутствующих антибиотикам метаболитов способствуют пониманию путей биосинтеза этих соединений в генетически модифицированных микроорганизмах и позволяют снизить и, сузить уровень накопления этих примесей.

На основе полученных данных о составе и содержании сопутствующих метаболитов могут быть сделаны, прогнозы об «активации» путей биосинтеза целевых продуктов, что позволит оптимизировать процессы селекции и<ферментации соответствующих штаммов-продуцентов.

На защиту выносятся следующие результаты и положения: Г. Разработка методов хроматографического разделения; антибиотиков: тилозина, вирджиниомицина, моеномицина^ биалафоса и, фосфомицина в КЖ (пластинки «еорбфил»). 2: Выбор оптимальных условий проведения цветных реакций при обработке хроматограмм: обнаруживающими реагентами для последующего количественного определения моеномицинов;, биалафоса.и фосфомицина . с помощью денситометрии. 3. Результаты изучения стабильности окрашенных комплексов образованных моеномицином, биалафосом и фосфомицином: (на хр оматогр аммах).

4. Разработка экспресс - методов анализа КЖ вирджиниомицина, моеномицина и биалафоса с помощью ЭО-ТСХ.

5. Результаты количественного определения антибиотиков и сопутствующих им в КЖ примесей промышленных штаммов-продуцентов, полученные с помощью валидированных методик.

Апробация результатов работы Основные результаты работы были представлены на:

- Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматографические приборы» Научный совет по адсорбции и хроматографии РАН. Москва-Клязьма 14-18 марта 2005 г.;

- Международной школе-конференции посвященной 100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна «Генетика микроорганизмов и биотехнология» Москва-Пущино, 15-19 октября 2006 г.;

- Всероссийском симпозиуме «Хроматография в химическом анализе и физикохимических исследованиях» Научный совет по адсорбции и хроматографии РАН. Москва-Клязьма 23-27 апреля 2007 г.;

- Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия» Научный совет по адсорбции и хроматографии РАН. Москва-Клязьма 14-18 апреля 2008 г.;

- Международной школе-конференции посвященной 40-летию создания ГосНИИгенетика 21-24 октября 2008 г.

Публикации

Материалы диссертации опубликованы в 2-х статьях и 7-ми тезисах докладов на конференциях и симпозиумах.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

5. ВЫВОДЫ.

1. Предложены методики количественного определения тилозина, вирджиниомицина, моеномицина, биалафоса и фосфомицина в КЖ штаммов-продуцентов методом количественной ТСХ на пластинках «Сорбфил». Показана возможность их использования для массового анализа этих соединений в КЖ и контроля промышленных процессов.

2. Изучены условия для проведения количественного определения исследованных антибиотиков. Найдены оптимальные условия проведения цветных реакций на хроматограммах и определено время устойчивости интенсивности окраски пятен моеномицина, биалафоса и фосфомицина. Выбраны условия денситометрирования исследованных антибиотиков.

3. Изучена устойчивость антибиотиков на слое силикагеля в процессе анализа. Показано, что исследуемые антибиотики не подвергаются деструкции в условиях проведения эксперимента. Однако отмечено, что моеномицины устойчивы на тонких слоях силикагеля только в течение 60 мин.

4. Предложены методики количественного экспресс - анализа вирджиниомицина, моеномицина и биалафоса в КЖ методом ЭО-ТСХ. Показана возможность анализа этих антибиотиков в КЖ в течение 15-35 мин.

5. Изучена полнота экскретирования макролидов, вирджиниомицинов, биалафоса и фосфинотрицина а также фосфомицина из клетки. Установлено, что исследуемые антибиотики по окончании ферментации полностью экскретируются из клетки в среду.

6. Проведена валидация предложенных нами методик количественного определения исследуемых антибиотиков в КЖ методом количественной ТСХ. Полученные результаты свидетельствуют о пригодности методик для количественного определения исследуемых антибиотиков в КЖ. Показано, что погрешности измерений составляют менее 5,0%

1. Гейл И. Молекулярные основы действия антибиотиков. // М.: Мир. 1975. 465 с.

2. Овчинников Ю. А., Иванов В. Т., Шкроб А. М. Мембранноактивные комплексоны. //М.: Наука. 1974. 328 с.

3. Франклин Т., Сноу Д. Биохимия антимикробного действия. // М.: Мир. 1984. 432 с.

4. Количественный анализ хроматографическими методами. / Под ред. Кац Э.//М.: Мир. 1990. 313 с.

5. Шаршунова М., Шварц В., Михалец Ч. Тонкослойная хроматография в фармации и клинической биохимии. / Под ред. Березкина В.Г. // М.: Мир. 1980. ч.1. ч.2. 621 с.

6. Hand book on Thin-Layer Chromatography / Ed. Sherma J., Fried. B. // Marcel Dekker Inc. N-Y. 1991. V. 55. 1170 p.

7. Красиков В. Д. Основы планарной хроматографии. // Химиздат. СПб. 2005. 231 с.

8. High Performance Liquid Chromatography- in Biotechnology / Ed. W.S. Hancock. // John Willey and Sons Inc. N-Y. 1990. 564 p.

9. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии. / Под ред. Хенмена. А. // М.: Мир. 1988. с. 649.

10. Hand Book of Thin Layer Chromatography. / ed. by Sherma. J. // Chromatographic Sci. Series. 1996. V. 60. 990 p.

11. Tyihak E., Minksovics E. Trend in overpressured Thin layer chromatography. // J. Planar. Chromatogr. 1991. V. 4. P. 288-294.

12. Fenimore D. C., Davis С. M. HPTLC. // Anal. Chem. 1998. V. 53. P. 253260.

13. Planar Chromatography. Modern Thin-Layer Chromatography. // Camag. Muttenz. 2008. 56 p.

14. Grinberg N. G. Modern Thin-Layer Chromatography. // Marcel Dekker. London. N-Y. 1990.490 р.15. FDA. Bull.//1994. 546 р.

15. Camag Bibliogr. Service. // 1981. N. 2. P. 2-5.

16. Руководство по капиллярному электрофорезу. / Под ред. Волощука А. М. // М.: ЦНИИТЭИ полиграфия. 1996. 231 с.

17. Analytical Capillary Electrophoresis and HPLC in Biotechnology / ed. by Horvat C. // Marcel Dekker. N-Y. 1995. 474 p.

18. Capillary Electrophoresis: Theory and Practice. / ed. by P. Camillen // CRC Press. Boca Raton. Fl. 1993. 371 p.

19. David K. Lloyd. Capillary electrophoretic analyses of drugs. //J. Chromatogr.1. A. 735. 1996. P.29-42.21. ТУ 26-11-17-89.

20. Тяглов Б.В., Дегтерев E.B., Малахова И.И., Красиков В.Д., Помазанов

21. B.В. Способ, разделения аминокислот в биологических жидкостях // Патент РФ №2078342. 1997.

22. Camag Bibliography Service // Camag CD-ROM disk. Version 108. 2005.

23. Оборудование для ТСХ. // Каталог НТЦ «Ленхром». Санкт-Петербург. 2009. (http://www.lenchrom.spb.ru').27. «Merck». Catalog 2007-2008. // Merck. Darmstadt. 2008.

24. Baner К., Gros L., Saurev W. Thin-Layer Chromatography. // Merck. Huthig Buch. Verlag. Gmb. H. Haidelberg. 1991. 166 p.

25. Jost W., Michali H., Herbert H., Sorbent won DC und HPTLC chromatographia // GIT Fuchz. Lab. 30. 1991. P. 307-313.

26. Малахова И. И. Количественная высокоэффективная тонкослойная хроматография аминокислот. // Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. Санкт-Петербург. 2003. 165 с.

27. Frey H., Zeeloff К., Quantitative Dunnschicht-Chromatographie. // VCH. Weinheim. 1992. 420 p.

28. РФ Патент № 1736541. 1993.

29. Degterev E. V., Tyaglov В. V., Malakhova I. I., Krasikov V. D. Quantitative analysis of L-tryptophan in fermentation broth // J. Planar Chromatogr. V. 13. 2000. P. 194-199.

30. Degterev E. V., Tyaglov В. V., Malakhova I. I., Krasikov V. D. Quantitative analysis of L-lysine, L-threonine, L-homoserine and cobalamines in fermentation broth. // J. Planar. Chromatogr. V. 13. 2000. P. 217-220.

31. Degterev E. V., Tyaglov В. V., Malakhova I. I., Krasikov V. D. Quantitative analysis of L-serine in cultural fluids. // J. Planar. Chromatogr. V. 13. 2002. P. 197-204.

32. Chmel K. Einflub der geschichte des kieselgel in der D. C. // J. Chromatogr. V. 97. 1974. P. 131-140.

33. Toushstone J. C. Practice of Thin-Layer Chromatography. // John Willey and Sons. N-Y. 1992. 270 p.

34. Kowalik G., Rogosz K., Kowalska T. Separation of ethanolamine esters // J.Assoc. Off. Anal. Chem. V. 82. 1999. P. 297-305.

35. Hauclc H. E., Jost W. Packing and Stationary Phases in Chromatographic Techniques. // Marcel Dekker. N-Y. 1990. 251 p.

36. Hauck H. E., Jost W. RP-stationary phases // Chromatographic. V. 27. 1986. P. 3-12.41. «Macherey-Nagel». Catalog. //Macherey-Nagel. Duren. 1997. 105 p.

37. Хроматография в тонких слоях. / Под ред. Шталя Э. // М.: Мир. 1965. 508с.

38. Junchen D. Thin-Layer Chromatography. // Camag. Muttenz. 1988. 247 p.

39. Trappe W. // Biochem Z. V. 305. 1940. P. 150.

40. Snyder L. R. Classification of the solvent properties // J. Chromatogr. Sci. V. 16. 1978. P. 223.

41. Saunders D. L., Snyder L. R. // Anal. Chem. V. 46. 1984. P. 470-480.

42. Meger V. R. Praxis der Hochdruskflussigkeits-Chromatographie. // Frankfurt. 1988.360 s.48. «Camag» http://www.camag.com.

43. Nyiredy S. Z., Evdelmeier C. A., Meier B. TLC mobile phase optimization procedure using the "PRIZMA" model. // Planta Med. 1985. P. 241-252.

44. Chrom Book 2004. // Merck. Darmstadt. 2004. 187 p.

45. Treiber L. R. Quantitative TLC and its Industrial Application. // Marcel Dekker. N-Y. 1987. 370 p.

46. Jork H., Winner H. Quantitative Auswertung von Dunnschicht-Chromatographie. // GIT Verlag. Darmstadt. 1985. 140 s.

47. Государственная фармакопея СССР. XI-e изд. // M.: Медицина. 1987. Вып. 1. 334 с.

48. Jork Н., Funk W., Fisher W., Wimmer H. Thin-Layer Chromatography. Reagents and Detection Methods. // VCH. Verlag .Weinheim. 1990. 464 p.

49. Postaire E., Sarbuch C., Regnault C. New method of derivatization by overpressure derivatization system // J. Planar Chromatogr. V. 3. 1990. P. 247-252.

50. Материалы и оборудование для ТСХ. // Каталог ЗАО «Сорбполимер». Краснодар. 2009. 46 с. (http://www.sorbfil.com).

51. High Speed TLC-scanner «Shimadzu CS-920». // Shimadzu. Kioto. 1983. 48 P

52. Kreuzig F. // Chromatographia. V. 13. 1980. 238-246.

53. Kreuzig F. //J. Chromatogr. V. 142. 1977. P. 441-447.

54. Tyaglov В. V., Sizova I. A., Zvenigorodskii V. I., Quantitative chromatographic determination of moenomycin antibiotics. // J. Planar Chromatogr. V. 10. 1997. P. 200-204.

55. Pachaly P., Dunnschicht-Chromatographie inder Apotheke. // Wissenschaftlich Veriagsges. Gmb.H. Stuttgart. 1995. 450 s.

56. Кирхнер Ю. Тонкослойная хроматография. // M.: Мир. Т. 1. 1981. 640 с.

57. Ахрем А. А., Кузнецова А. И. Тонкослойная хроматография. // М.:1. Наука. 1964. С. 71-124.

58. Instrumental Thin-Layer Chromatography / ed. By D. Janchen. // Camag. Muttenz. 1983. P. 54.

59. Jork H. // Dtsch. Apoth. Ztg. V. 102. 1967. P. 1263.

60. Jork H. // J. Pharmac. Belg. 1963. P. 213-219.

61. Camag Bibliogr. Service. // Camag. 1998. V. 81. P. 2-3.

62. Крешков А. П. Основы аналитической химии. // M.: Химия. 1965. 414 с.

63. Kubelka P., Munk М., Techn Z. // Phys. 193l.V. 12. P. 539.

64. Kortum G. Reflectionsspectroschie. // Spinger Verlag. Berlin. 1969. P. 414.

65. Camag TLC-Scanner III. // Camag. Muttenz. 2000.

66. Тяглов Б. В., Тарасов А. П., Дегтерев Е. В., Крылов В. М., Новицкий А. П., Полубенцева М. И., Малахова- И. И., Красиков В. Д. Видеоденситометр "Денсискан-1" для количественной тонкослойной хроматографии. // Биотехнология. 1992. N. 5. С. 44-47.

67. Ford Т. S., Radin N. S., Quantitation of thin-layer chromatograms with an Apple II computer based video-densitometer.7/ Anal. Biochem. 1985. V. 150. P. 359-363.

68. Pongor S. Iligh-speed video-densitometry principles and applications. // J. Liquid Chromatogr. V. 5. 1982. P. 1583-1595.

69. Lenkeyi В., Csanyi J., Nanasi P. Rapid determination of sucrose and fructose in biological samples by video densitometry. // J. Liquid. Chromatogr. 1986. V. 9. P. 1869-1875.

70. Papp S., Toth E., Polak B. Polyamine analysis in series of samples by OPLC. // Proceedings of International Symposium on TLC with special Emphasis on OPLC. Szeged. Hungary. 1984. P. 67.L

71. Proceedings of 8 International Symposium on Instrumental Planar Chromatography. //Interlaken. Swizerland. Exibition Section. 5-7 April 1995.

72. Полубенцева M. И., Иванов К. В., Новицкий А. П. Особенности алгоритмов обмера, используемых в компьютерном видеоденситометре "ДенСкан-04". // Материалы 2ой школы-семинара "Количественная

73. ВЭТСХ. Проблемы и их решения". 25-26 февраля 2002. Санкт-Петербург. С. 9-17.79. http://www. i-m.de

74. Ebel S. The chromatographic uncertainly principles. // Chromatographia. 1987. V. 20. P. 123-134.

75. Руководство по современной тонкослойной хроматографии. / Под ред. Ларионова О. Г. // Москва. 1994. С. 180.

76. R.L.M Synge. Disc Faraday Soc. 1949. №7. P. 164.

77. Ролдугин В.И. Химическая энциклопедия. Т. 5. // Изд-во Большая Российская энциклопедия. М.: 1998. Под ред. Зефирова. Н.С. С.847.

78. Nurok D., Frost М.С., Chenoweth D.M. // J. Chromatographya. 2000. V. 903. P. 211.

79. KnoxJ.H, Grant J.H.// Chromatographia. 1987. V.24. P.135.

80. Melanson J.E., Baryla N.E., Lucy C.A. // Trends in analytical chemistry. 2001. V.20. P. 365.

81. Духин С.С. Электропроводность и электрокинетические свойства дисперсных систем. // 1975.

82. Дамаскин Б., Петрий О. Введение в электрохимическую кинетику. // М.: Высшая школа. 1983.

83. Stol R., Рорре II., Kok W.T. // Analytical Chemistry. 2003. V. 75. Р.5246.

84. Kaiser R. E. Simple and Instrumentalized High Perfomance Planar Chromatography. // HFC-Hyper Card Course-Paper Version. I.F.E.A.R. Bad Duerkheim. 1996. 157 p.

85. Ebel S., Glaser E. // J. High. Resolut. Chromatogr. Commun. 1979. V. 2. P. 36-48.

86. Kaiser R. E. Instrumental HPTLC. // Huthing. Heidelber. 1980. P. 179.

87. Либ Г., Шенигер В. Синтез органических препаратов из малых количеств веществ. // М.-Л.: Госхимиздат. 1957. 267 с.

88. Hamill R. L. //Antibiot. Chemotherapy. 1961. V.l 1. N 5. P. 328-340.

89. Whaley H. A., Patterson E. L., Dorubush A. C. // Antimicrobial Agents

90. Chemotherapy. 1963. V. 5. N 1. P. 45 48.

91. Аксенова И. А. Тилозин. Производство и применение продуктов микробиологических производств. Обзор. Информ. // М.: ВНИИСЭНТИ Минмедбиопрома СССР. 1988. Вып. 2. С. 8-17.

92. Тяглов Б. В., Жданов В. Г. // Биотехнология. 1988. №4.С. 548.98. ТУ СССР №59102-76.

93. US Patent N. 3 674 866. 1972.

94. ЮО.Моррисон Р., Бойд Р. Органическая химия. // М.: Мир. 1974. С.842-843.изменить

95. Балушкин А. О. Новые варианты электроосмотической тонкослойной хроматографии. // Дисс. канд. хим. наук. Москва. 2005. 139 с.

96. Мультихром. Система для сбора и обработки хроматографических данных. Руководство пользователя. // Амперсенд. 2007.

97. WinCats. Planar Chromatography Manager. // CD. Camag. Version 1.4.2.

98. Дмитриева B.C. Расчет биологической активности антибиотиков и концентрации витамина В12 с применением таблиц.//Центральное бюро технической информации. М. 1958.

99. Waters 2695. Separations Module. Quick Stared Guide. // Waters. 54 p.

100. Empower PDA Softweare. Getting Started Guide. // Waters. 136 p.

101. Aligent Capillary Electrophoresis System/ User Guide. // Aligent Technology. 2000. 270 p.

102. Aligent ChemStation. Understanding Your ChemStation. // Aligent Technology. 2003. 290 p.109. "Microcon". Centrifugal Filter Devices. Manual Instruction.

103. Baltz R.H., Seno E.T., Genetics of Streptomyces fradiae and tylosin biosynthesis.//Ann. Rev. Microbiol. 1988. V.42. P. 547-574.

104. Ш.Донев Д. Тилозин. // Изд-во Института по контролю ветеринарных препаратов. София. 2006.48 с.

105. Biot А. // Biotechnology of Industrial Antibiotics. /Ed.: E.J. VanDamme // Marcel Dekker. N-Y. 1984. 720 p.

106. Baltz R.H., Stonesifer J. Phenotypic changes associated with loss of expression of tylosin biosynthesis. // J. Antibiot. 1985. V. 38. P. 12261236.

107. Baltz R.H., Seno E.T., Wild G. M. Genetic and biochemistry of Tylosin production. // J. Antibiot. 1993. V. 46. P. 131-140.

108. Confino M., Varzharova M. Thin-layer chromatographic analysis of products containing tylosine. // Proc. 6th Int. Symp. Instrum. Planar Chromatogr. Interlaken., Inst. Chromatogr., Bad Dtirkheim, FRG, 1991. P. 57 -59.

109. Vega M., Geshe E., Garcia G., Saelzer R. Screening of antibiotic residues in poultry meat. // J. Planar Chromatogr. 1990. V.3 P. 437-438.

110. Markakis P.K., Microbiological method for determining macrolides in animal feeds in the presence of other drugs by thin-layer chromatography detection. // Assoc. Off. Anal. Chem. 1996. V.79. P. 1263-1268.

111. Gafner J.L. Identification and semiquantitative estimation of antibiotics added to complete feeds, premixes, and concentrates. // J. Assoc. Off. Anal. Chem. 1999. V. 82. P. 1 8.

112. Roets E., Quintens I., Kibaya R., Hoogmartens J. Quantitative determination of olaquindox in animal feed. // J. Planar Chromatogr. 2001. V.14. P. 347349.

113. Nowakowska J., Halkiewicz J., Lukasiak J. W. The retention behavior of selected macrocyclic antibiotics on polyamide TLC plates. // J. Planar Chromatogr. 2001. V.14 P. 350-354.

114. Nowakowska J. Analysis of selected macrocyclic antibiotics by HPTLC with non-aqueous binary mobile phases. // J. Planar Chromatogr. 2004. V.17. P. 200-206.

115. Nowalcowslca J. Normal and reversed-phase TLC separation of some macrcyclic antibiotics with non-aqueous mobile phases. // J. Planar Chromatogr. 2005. V.18. P. 455-459.

116. Gray P, P., Bhuwapathanapun S. The use of recombinant DNA techniques to study tylosin biosinthesis. // Biotechnol. Bioerig. 1980. V. 22. N 9. P.1785-1804.

117. Видеоденситометр «ДенСкан 2». Техническое описание. // Ленинград. НТЦ «Ленхром». 1991.471 с.

118. GDS 8000 System. Manual Instruction. // Polo Alto. California. USA. 2000. 120p.

119. Хроматография. Практическое приложение метода. / Под ред. Хефтмана Э.//М.: Мир. 1986. 350 с.

120. Тяглов Б. В., Антонова С.В., Чурбанов В. Г. Горизонты биотехнологии // Материалы Всесоюзной конференции. Степногорск. Изд-во ПО «Прогресс». 19-23 июня 1991. С. 220.

121. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках // М.: Изд-во МГУ. 1994. 500 с.

122. Huber G. Antibiotics./ Ed. Hahn F.E. // Sprinder. Verlag. Berlin. 1989. 284 p.

123. Патент НРБ N. 20697. МКИ. С. 12. d. 9Л6. // Бюл. Открытия. Изобретения. 1975. №6.

124. US Patent N. 2137201. А. 1984.

125. Макухина А. М. Производство и применение тилозина для ветеринарных целей. Обзорн. информ. Cep.VI. //М.: Главмикробиопром. 1984. С. 19-26.

126. Коренман И. М. Экстракция в анализе органических веществ. // М.: Химия. 1977. С. 38-60.

127. Островский М. В., Этингов Е. Д. Изучение условий равновесия при экстракции олеандомицина. // Антибиотики. 1977. № 7. С. 588-589.

128. Медведева В. И., Жуковская С. А., Жарова Н. И. Изучение распределения олеандомицина между нативным раствором и бутилацетатом в зависимости от условий биосинтеза. // Антибиотики. 1978. № 12. С. 1073-1079.

129. Ныс П. С. Равновесное распределение слабых электролитов в системе органический растворитель вода. // Антибиотики. 1978. № 6. С. 493499.

130. Евр. Патент N. 0045157. МКИ. С. 07. Н. 17/08. 1982.

131. US Patent N. 4362881. МКИ С. 07. D. 313/00. 1984.

132. Васильева Луканова Б., Атанасова Т.//Химия и индустрия (НРБ). 1980. Т. 52. № 7. С. 290 - 291, 300 - 302.

133. А. С. СССР №1119343. 1982.

134. ЧССР. Патент. N. 214350. 1984.

135. Sommer. P. A premeimnary report of antibiotic N899 a streptogramin-like substance. //Antibiot. Chemother. 1955. V. 5. P. 632-639.

136. Crooy P., De Keys R. Preparation and properties of derivatives of virginiamycins. // J. Antibiotics. 1972. V. 25. P. 371-376.

137. Boon B.and Devart R. Metods for identification and assay of virginiomycin in animal feeds. //Analyst, 1974. V. 99. P. 19-27.

138. US Patent 3.325.359. 1967.

139. Deutshes Patentschrift. N 1.061.482. 1969.

140. Deutshes Patentschrift. N 1.066.706. 1970.

141. Nowakowska J., Lukasiak W., Hakiewicz J. Determination of' virdginiamycine in premixes. // J. Planar Chromatogr. 2005. V. 18. P. 350354.

142. Gossel F., Bline P., Biot. A. HPLC determination virdginiomycin in stafac, premixes and animal feeds. //Analyst. 1991. V. 116. P. 1373-1379.

143. Cocito C., Kaji A., Virdginiamycin Ml inhibitor of acceptor site of ribosoms. //Biochemie. 1971, V.33. P. 763-769.

144. Kingshan P., Kolpak M., Le Fevre J.J. Biosynthesis of antibiotics of virdginiomycin family. //Am. Chem. Soe. 1983. V.105, P. 5106-5114.

145. Sato K., Shida Y., Hakazawa H. Isolation of virdginiamycine Ml by dropletcounter-current chromatography. // J. Chromatogr. 1988. V.454, P. 387-394.

146. Van der Haeghe H., Parametiev G.J. Structure of factor S of staphylomycin. // Am. Chem. Soe. 1960. V. 82. P. 4414-4420.

147. Sharma N.K., Bogten N., Auteunis M.J. Izolation of factor M and factor S from acommerical feed additive formulation. // Bull. Soc. Chim. Belg. 1988. V.97. N3, P. 185-192.

148. US Patent. N.4.762.923. 1988.

149. Флавомицин. Временное наставление по применению. // Hoechst. B.R.D. 1995. 15 р.

150. Van Heijenoort J., Derrien M. Spaltung von Moenomycine A. // FEBS Lett. 1978. V. 89. P. 141-146.

151. Weizel P. Vevfahren zur herstellug von hydriertem moenomycin // Angew Chim. 1981. V. 93. P 130-141.

152. WeizelW.//Angew Chem. 1981. V. 93. P 130-141.

153. BDR Patentschrift N 1.235.726. 1977.164. НРБ Патент,N 31014. 1981.

154. Welzel P., Kunisch W., Shulbert Т., Muller'D. Moenomycin A. Structural studies and preparation of simple derivatius. // Tetrachedron. 1993. V. 39. P. 1583-1591.

155. US Patent N 3.439.597. 1975.

156. US Patent N3.563.497. 1977.

157. Welzel P., Witteler F., Muller D. Moenomycin A. Spaltung des antibiotikums mit trisluoressigasure -2-propanol. // Tetrachedron. 1992. V. 38. P. 97-104.

158. Welzel P., Muller D., Remer W. Structure of antibiotic Moenomycin A. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1981. V. 20. P. 121-123.

159. BDRPatentschriftN 478.239. 1969.

160. Welzel P., Witteler F., Hermsdorf L. Die ringgrosse das Galacturosaure-bausteins im antibiotikum moenomycin A. // Tetrachedron. 1994. V. 40. P. 113-125.

161. USSR Patent N 193.518. 1982.

162. US Patent N3.674.866. 1979.

163. Postaire E., Sarbuch C., Regnault C. New method of derivatization by overpressure derivatization system. // J. Planar Chromatogr. 1990. V. 3. P. 247-252.

164. Kondo Y., Shamura Т., Ogawa J. // Science Reports of Meiji Seika Kaisha (Japan). 1973. V. 13. P. 34-41.

165. Ogawa Y., Tsuruka Т., Inouye S. // Science Reports of Meiji Seika Kaisha (Japan). 1973. V. 13. P. 42-48

166. Кабачник М.И., Шальнев Ю.Б., Промоненков B.K. и др. Методы получения и биологическая активность фосфинотрицина и его производных // Итоги науки и техники. Органическая химия. 1989. Т. 8. С. 110-142.

167. Anzai Н., Murakami Т., Imai S. Transcriptional regulation of bialaphos biosynthesis in Streptomyces hygroscopicus. // J. Bacteriol. 1987. V. 169. N. 8. P. 3482-3488.

168. Bayer E., Gugel K.N., Haegele K. et al. Metabolic products of microorganisms. Phosphinothricin and phosphinothricylalanyine // Helv. Chim. Acta. 1972. V. 55. P. 224-239.

169. Ogawa Y., Joshida H. New antibiotic SF-1293. IV. Total synthesis of antibiotic SF-1293 // Meiji Seika Kenkyu Nempo. 1973. V. 13. P. 54-59.

170. Suzuki A., Tsuruoka Т., Mizutani K. New synthesis of 2-amino-4-hydroxy-4-(methylphosphinoyl) butyric acid and some analogs // Meiji Seika Kenkyu Hempo. 1981. N. 20. P. 33-38.

171. Заявка 3544375 ФРГ. MICH A 0 I N 57/20.

172. Заявка 3544376 ФРГ. МКИ A 0 IN 57/20.

173. Natchev J. Total synthesis and enzyme substrate interaction of D-, DL-and L-phosphinotricine, "Bialophos" (SF-1293) and Its cyclic analogues // Soc. Perkin Trans I. 1989. V. 1. P. 125-131.

174. Заявка 2236599 ФРГ. МКИ С 07 F 9/30.

175. Пат. 3832394 США. МКИ С 07 F.

176. Sadaaki М.М. Herbiace (mw-801, BF-1293). Common name: bialaphos. A new herbicide // Jap. Pest. Inform. 1984. N 45.P. 27-30.

177. Masakadzu I. Meiji herbiace // Chem. and Chem. Ind. 1985. V. 38, N. 7. P. 562-564.

178. Murakami Т., Anzai H., Imai S. The bialaphos biosynthesis genes of Streptomyces hygroscopicus molekylar cloning and characterization of the gene chister. // Mol. Gen. Genet. 1966. V. 205. P. 42-50.

179. Промоненков В.К., Коваленко Л.В., Шальнев Ю.Б. Фосфинотрицин. // Обзор, инф. Сер. Химические средства защиты растений. М.: НИИТЭБШ. 1987.

180. Freund R.K., Croor S.L. Antagonist activity of Phosphorus-containing glutamate analogs in the perforant path. //Brain Herb. 1984. V.291. P. 150153.

181. Пат. 2147291 Франции. МКИ С 07F 9/00.

182. Пат. 1356723 Великобритании. НКИ С 2А'.

183. Пат. 975317 Канады. НКИ С 2А.

184. Camag Bibliogr. Service. 1993. V. 76. P. 11.

185. Sherma J. Thin-layer chromatography. // Anal. Chem. 1988.V.60. P.74R-98R.

186. Poole C.F. Recent advances in chromatography. // Anal. Chem. Acta. 1989. V. 216. P. 109-145.

187. Planar Chromatography 2002. Modern Thin-Layer Chromatography. // Camag. Muttenz. 2002. 40 p.

188. Lautie J.P., Stankovie V. Automated multiple development TLC of phenylurea herbicides in plant. // J. Planar Chromatogr. 1996. V.9. P.113-116.

189. Matysik G., Wojtasik E. Automated multiple development HPTLC analysis of Frantgula Authraguinones. // J. Planar Chromatogr. 1994. V. 7. P. 34-38.

190. Krasikov V. D., Malakhova I. I., Degterev E.V., Tyaglov B.V. Planar chromatography of indastrial amino acids. // J. Planar Chromatogr. 2004. V. 17. P. 113-121.

191. Bhushan R. Amino acids and their derivatives. Hand Book of Thin-Layer Chromatography. / Ed: Sherma J., Fried B. // Chromatographic Sci. Series. N-Y. 1991. V. 55. P. 353-387.

192. Dammertz W., Renger В. Validation and quality assurance in planar chromatography. // Proceedings of the International Symposium on Planar Chromatography Separation «Planar Chromatography 2002». May 11-13 2002. Heviz. Hungary. P. 11-16.

193. Ferencz-Fodor K., Vegh Z., Renger В., Zeller M. Validation and quality assurance of planar chromatographic procedures in pharmaceutical analysis. // J. Assoc. Off. Anal. Chem. 2001. V. 84. P. 1265-1276.

194. Ebel S. The chromatographic uncertainly principles. // Chromatographia. 1987. V. 20. P. 123-134.

195. Даванков B.A. , Наврашил Дж., Уолтон X., Лигандообменная хроматография. // М.: Мир. 1989. 427 с.

196. Gruska Е., Levin S., Gilon С. Separation of amino acids on reversed-phase columns as their cooper (II) complexes. // J. Chromatogr. 1982. V.235. P. 401-413.

197. Cande M., Foucault A. Ligand exchange chromatography of amino acids on cooper (II) modified silica gel with ultraviolet spectrophotometric detection at 210 nm. //Anal. Chem. 1979. V. 51. P. 459-467.

198. Foncault A., Roset R. Ligan exchange chromatography on cooper (II) modified silica gel- improvements and use for screening of protein hydrolyzates andquantitation of dipeptides and amino acids. // J. Chromatogr. 1984. V. 317. P. 41-49.

199. Федорова A. M., Музыченко Л. А. Селективное определение аминокислот методом обращенофазовой ВЭЖХ. // Сб. Микробиологическая промышленность. Отечественный передовой опыт. 1988. Вып. 10. С. 9-13.

200. Демина Н. Г., Румянцева Н. Ф., Полануер Б. М., Шолин А. Ф. Влияние температуры, рН и солевого состава на стабильность глутамина в модельных растворах.//Биотехнология. Г992. N. 1. С. 53-55.

201. Gunetileke K.G., Anwar R.A. Studies on the biosynthesis of fosfomycin. //J. Biol. Chem. 1968. V.243. P.5570-5576.

202. Машковский М.Д. Лекарственные вещества. // M.: Новая волна. 2008. 1206 с.

203. US Patent. N. 4.222.970.1980.

204. Jap Patent. N. 4148692. 1992.

205. Itoh N., Kusaka M., Hirota T. Microbial production of antibitic fosfomycin by a stereoselective epoxidation and its formation mechanism. // J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. V.43. P.394-401.

206. Aisaka К., Ohshiro Т., Uwajima Т. Optimum culture conditions of cis-propenylphosphonate to fosfomycin by Cellvibrio gilvus. // J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1992. V.36. P.431 -435.

207. Jap Patent. N. 01037296. 1989.

208. US Patent. N. 3.639.590. 1972.

209. US Patent. N. 3.914.231. 1975.

210. Rogers Т.О., Birnbaum J. Biosynthesis of fosfomycin by Streptomyces fradiae. //J. Antimicrob. Agents Chemother. 1974. V.5. P. 121 132.

211. Seto H., Hidaka Т., Kuzuyama T. Studies on the biosynthesis of fosfomycin. 2. Conversion of 2-hydroxypropyl-phosphonic acid to fosfomycin by blocked mutants of Streptomyces wedmorensis. // J. Antibiot. 1991. V.44. P.1286 -1288.

212. Kuzuyama Т., Hidaka Т., Kamigiri K. Studies on the biosynthesis of fosfomycin. 4. The biosynthetic origin of the methyl group of fosfomycin. // J. Antibiot. 1992. V.45. P.1812 1814.

213. Kuzuyama Т., Hidaka Т., Imai S. Studies on the biosynthesis of fosfomycin. 5. Cloning of genes for fosfomycin biosynthesis. // J. Antibiot. 1993. V.46. P.1478 —1480.

214. Hidaka Т., Goda M., Kuzuyama T. Cloning and nucleotide sequence of fosfomycin biosynthetic genes of Streptomyces wedmorensis. // J. Mol. Gen. Genet. 1995. V.249. P.274 280.

215. Hidaka Т., Kuzuyama Т., Seto H. Studies on the biosynthesis of fosfomycin. // J. Actinomycetol. 1994. V.8. P.41 46.

216. Seto H., Kuzuyama T. Bioactive natural products with carbon-phosphorus bonds and their biosynthesis. // J. Nat. Prod. Rep. 1999. V.16. P.589 586.

217. Kuzuyama T. Fosfomycin biosynthesis and self-resistance mechanism of theproducing organism Streptomyces wedmorensis.//J. Actinomycetol. 1998. V.12. P.71 -74.

218. Shafer H., Vandenheuvel W.J., Ormond A.R. Characterization of phosphonomycin by microchromatographic and related techniques. // J. Chromatogr. 1970. V.52. P.lll-117.

219. Junichi Shoji, Toshiyuki Kato, Hiroshi Hinoo. Production of fosfomycin (phosphonomycin) by Pseudomonas Syringae. // J. Antibiot. 1986. V.34. P.1011-1012.

220. Chromatography of antibiotics. / Ed. Wagman G.H., Weinstein M.J. // N-Y. Amsterdam. Oxford. Elsevier. 1984. 504 p.

221. European Pharmacopea. 2000. T.4. P.268.

222. Gazzani G., Stoppini G., Gandini C. Determination of fosfomycin in biological fluids by capillary electrophoresis. //J. Chromatogr. 1992. V.609. P.391-394.

223. Bilted A., Panneti G. Determination of fosfomycin in chicken plasma by liquid chromatography. // J. Chromatogr. 1993. V.36. P.311-316

224. Aisaka K., Ohshiro Т., Uwajima T. Optimum culture conditions of cis-propenylphosphonate to fosfomycin by Cellvibrio gilvus. // J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1992. V.36. P.431 -435.

225. Life Science Catalogue 2002-2003. Millipore. // Millipore Corporation. Bedford. USA. 2003.256 р.

226. Analytical Capillary Electrophoresis and HPLC in Biotechnology / Ed: C. Horvat. // M. Dekker N-Y. 1995. 474 p.

227. Arbige M.V., Bulthius B.A., Schults J. Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria: biochemistry, physiology and molecular genetics. // American Society for Microbiology. Washington. D.C. 1993. P.871-895.

228. Baillet A., Pianetti G.A. Fosfomycin determination in serum by capillary zone electrophoresis with indirect UV detection. // J. Chromatogr. 1993. V.616. P.311-316.

229. Foret F., Fanali S., Ossicini L. Indirect photometric detection in capillary zoneelectrophoresis. // J. Chromatogr. 1989. V. 470. P.299-308.

230. Pianetti G.A. Determination of alkylphosphonic acids by capillaiy zone electrophoresis using indirect UV detection.// J. Chromatogr. 1993. V.630. P.371-377.

231. Mercier J. P., Morin Ph., Dreux M. Capillary electrophoresis separation of alkylphosphonic acid monoesters with indirect ultraviolet detection.// J. Chromatogr. A. 1997. V. 779. P.245-252.

232. Shihabi Z.K. Therapeutic drug monitoring by capillary electrophoresis.// J. Chromatogr. A. 1998. V. 807. P.27-36.

233. Min-Jie Xie, Yu-Qi Feng, Shi-Lu Da. Capillary electrophoresis and open tubular capillary electrochromatography using a magnesia zirconium coated capillary. // J. Analytica Chimica Acta. 2001. V. 428. P.255-263.

234. Leveque D., Gallion C., Tacral E. Determination of fosfomycin in biological fluids by capillary electrophoresis.// J. Chromatogr. B. 1994. V. 655. P.320-324.

235. Stewart G. H. Evaporation in TLC // J. Chromatogr. Sci. 1970. V. 8. P. 129141.

236. Krans L., Koch A. Dunncshicht-Chromatographie. //Springer. Verlag. N-Y. London. 1996. 205 s.

237. Sun S. W., Fabry H., Maillols H. Test procedure validation for the TLC assay of degradation products in pharmaceutical formulation // J. Liquid Chromatogr. 1994. V. 17. P. 2495-2509.

238. Lazaric К., Cucek В., Faus G. HPTLC method for determination of parabens. Stability test//J. Planar Chromatogr. 1999.V. 12. P. 86-89.

239. Renger B. Quantitative planar chromatography as a tool in pharmaceutical analysis // J. Assoc. Off. Anal. Chem. 1993.V, 76. P. 7-15.

240. Gunetileke K.G., Anwar R.A. Studies on the biosynthesis of fosfomycin. //J. Biol. Chem:; 1968. V.243. P.5570-5576.

241. Марков В. JI., Варшавский А. Е. Наука и высокие технологии в России на рубеже третьего тысячелетия. // М.: Наука. 2001. 635 с.